+

WO1990006371A1 - ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α et 1β ET EN THERAPEUTIQUE - Google Patents

ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α et 1β ET EN THERAPEUTIQUE

Info

Publication number
WO1990006371A1
WO1990006371A1 PCT/FR1989/000634 FR8900634W WO9006371A1 WO 1990006371 A1 WO1990006371 A1 WO 1990006371A1 FR 8900634 W FR8900634 W FR 8900634W WO 9006371 A1 WO9006371 A1 WO 9006371A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibodies
ache
antibody
monoclonal antibodies
conjugates
Prior art date
Application number
PCT/FR1989/000634
Other languages
English (en)
Inventor
Yveline Frobert
Jacques Grassi
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Priority to DE199090900216T priority Critical patent/DE399024T1/de
Publication of WO1990006371A1 publication Critical patent/WO1990006371A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1021—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against cytokines, e.g. growth factors, VEGF, TNF, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to anti-interleukin monoclonal antibodies, and in particular anti-interleukin 1 ⁇ and 1 ⁇ antibodies, to their production process, to anti-interleukin 1 ⁇ and 1 ⁇ / acetylcholinesterase monoclonal antibody conjugates, to enzymo-immunometric tests (EIA) for detecting and quantifying interleukins 1a and 1 ⁇ using said antibodies and / or conjugates and for various other applications of said antibodies and / or conjugates, in particular for therapeutic applications.
  • EIA enzymo-immunometric tests
  • Lymphokines are powerful pharmacological agents which result from the interaction between lymphocytes and the specific antigen which sensitizes them; they can modify, induce or suppress the functions of many cell types; they also play an essential role during inflammatory reactions and in the phenomena of bone resorption, fibrosis and chemotaxis. In addition, they are involved in the control of hematopoiesis and the regulation of immune responses. Lymphokines are produced by T cells, however it is known that some of them such as interleukin-1 can be produced by non-leukocyte cells.
  • Interleukin-1 (cf. IMMUNOLOGY, Jeanêt BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3rd Edition 1986) is a mediator which constitutes a biological signal for the presentation of the antigen associated with the histotope, which marks the monocyte-T lymphocyte cooperation.
  • the activity of IL-1 is traditionally measured in a proliferation test of mouse thymocytes C3H / HeJ (resistant to LPS) in the presence of PHA (I ⁇ g / ml). In the absence of IL-1, the thymocytes stimulated by the PHA are blocked in the Go / G1 phase. They can however divide if interleukin-2 is added, which suggests that the main action of IL-1 is the induction of interleukin-2 synthesis.
  • Human IL-1 is a glycoprotein with a molecular weight estimated at 18 kDa, with a major contaminant at 15 kDa.
  • two peptide fractions of molecular weights 2 and 4 kDa which exhibit the biological activity of IL-1 were isolated from normal urine.
  • IL-1 appears to be produced by a wide variety of cell types excluding T cells, such as monocytes, macrophages, keratinocytes, astrocytes, melanocytes, mesangial cells, B lymphoblasts.
  • T cells such as monocytes, macrophages, keratinocytes, astrocytes, melanocytes, mesangial cells, B lymphoblasts.
  • IL-1 participates in the activation of B cells, stimulates the proliferation of fibroblasts and synoviocytes, raises the body temperature by acting on thermoregulatory centers and induces the production of proteins of inflammation by hepatocytes.
  • An IL-1 gene encoding a precursor of 270 amino acids has recently been cloned. Plasmids containing this gene induce the production of a carboxy-terminal peptide of 156 amino acids, having the activities of IL-1. While in the aforementioned reference, the hypothesis of a family of molecules of neighboring structure was put forward, DINARELLO [J. CLIN. IMMUNOL.
  • IL-1 represents an important family of biologically active proteins derived from mononuclear cells, which are involved in inflammatory reactions and in immune responses.
  • Two distinct species of human IL-1 have been identified: IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ [MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641-647]; these two species have the same molecular weight, similar biological effects and the same receptors on target cells [WOOD et al., J. IMMUNOL. (1985),
  • Patent Applications also describe anti-IL-1 ⁇ and / or anti-IL-1 ⁇ antibodies.
  • the OTSUKA PHARMA-CEUTICAL 267 611 European Patent Application describes monoclonal anti-IL-1 ⁇ antibodies and monoclonal anti-IL-1 ⁇ antibodies.
  • the affinity constant of these antibodies is of the order of 3.6 ⁇ 10 -8 M / l.
  • the European Patent Application IMMUNEX 245,052 describes more particularly a method of detecting the inflammation during which IL-1 intervenes, comprising (a) the reaction of a sample of biological fluid possibly containing IL- 1 with a first antibody specific for a first antigenic site characteristic of IL-1 and (b) detecting the reaction between the first antibody and IL-1.
  • the antibodies more particularly described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 15A4) and a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 7B4).
  • the antibodies described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 15A4) and a monoclonal antibody which reacts specifically with IL-1 ⁇ (monoclonal antibody called 7B4).
  • the antibodies described in this IMMUNEX Application are a monoclonal antibody which reacts specifically with
  • European Patent Application DAINIPPON 220 063 describes an antibody directed against IL-1, said antibody being used in particular in the context of a competitive method or an immunometric method.
  • This antibody only makes it possible, within the framework of these assays, to obtain sensitivities of the order of 0.1 ng / ml for the competitive method and of the order of 0.2 ng / ml for the immunometric method.
  • French Patent No. 83 13389 in the name of the Applicant, has proposed conjugates in which an antibody, an antigen or a hapten is covalently linked to acetylcholinesterase, for the production of enzymoimmunoassays, thanks to the properties of the enzyme, carrying out enzyme assays of very small quantities, of the order of a nanogram.
  • the anti-PS1 monoclonal antibodies present in the supernatants of hybridoma cultures bind to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the corresponding biotinylated component of the PSI; - This biotinylated antigen strongly binds avidin, which itself binds the labeled AChE to biotin; - the activity of the fixed AChE is measured by the colorimetric method of ELLMAN.
  • the Authors have shown that the AChE system significantly improves the detection limits of monoclonal antibodies. This screening method applies perfectly to the quantitative determination of different PS1 polypeptides by competition.
  • the present invention has therefore given itself the aim of providing means suitable for enabling the performance of highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests, of detection and quantification of IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , these means also being capable of therapeutic applications and in vivo diagnostic applications.
  • the subject of the present invention is monoclonal antibodies specific for IL-1 ⁇ and 1 ⁇ , which result from the immunization of mammals, in particular rodents, and more particularly of mice, with IL-1 ⁇ or -1 ⁇ as appropriate, which specifically recognize natural or recombinant IL-1 ⁇ or natural or recombinant IL-1 ⁇ , which show practically no cross-reaction between the two IL-1, characterized in that said monoclonal antibodies have a dissociation constant of less than 5.10 - 10 , in that they consist of several groups which recognize distinct regions of IL-1 ⁇ or -1 ⁇ , in that the antibodies of certain groups are capable of binding in a compatible manner with all the antibodies of the other groups, to know : - anti-IL-1 ⁇ antibodies are made up of three groups (A, B and C) which recognize three distinct regions of interleukin-1 ⁇ , all the antibodies in a group being capable of binding in a compatible manner with all those of the other two groups but not being compatible with another antibody of the same group;
  • - anti-IL-1 ⁇ antibodies are made up of four groups (A, B, C and D), the first two (A and B) having a behavior similar to that of anti-IL-1 ⁇ antibodies, including group antibodies C are compatible with a single antibody from each of the first two groups and whose antibodies from the fourth group (D) are incompatible with any of the antibodies from the first three groups, and do not bind to the recombinant native IL-1 ⁇ , recognize a modified interleukin-1 ⁇ , and react with an IL-1 ⁇ -AChE conjugate;
  • anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ antibodies recognize the IL-1 ⁇ or 1 ⁇ / acetylcholinesterase (AChE) conjugates.
  • the monoclonal antibodies specific for interleukins-1 ⁇ and 1 ⁇ are obtained from mammals such as, in particular, rodents, and more particularly mice, which are immunized by appropriate injections of interleukin- 1 ⁇ or -1 ⁇ , then spleen cells of immunized mammals are fused, according to an appropriate technique, with mammalian myeloma cells of the same species, the resulting hybridomas are cultured and those in the supernatants of which were detected anti-interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ antibodies, as the case may be, are subcloned to obtain cell lines secreting anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies or anti-IL-1 ⁇ , according to the interleukihe against which they were directed.
  • the interleukin-1 ⁇ or -1 ⁇ used to immunize the abovementioned mammals can be both a purified natural interleukin and a recombinant interleukin.
  • hybridomas used to obtain the anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies in accordance with the invention were the subject of a deposit dated December 8, 1988 with the NATIONAL COLLECTION OF CULTURES OF MICROORGANISMS (CNCM) held by the INSTITUT PASTEUR.
  • the deposited hybridomas are identified by the following numbers: I-823, I-824, I-825, I-826, I- 827, 1-828, 1-829.
  • the present invention also relates to conjugates of acetylcholinesterase and of anti-IL-1 ⁇ or -1 ⁇ monoclonal antibodies or of fragments of these antibodies, in particular of Fab 'fragments.
  • the present invention further relates to a process for producing Fab 'fragments of anti-interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ monoclonal antibodies in accordance with the present invention.
  • said monoclonal antibodies are treated with pepsin in an acid medium, to obtain fragments F (ab ') 2 which are isolated by chromatography on a molecular sieve, then these fragments F (ab') 2 are subjected to a controlled reduction process, by an appropriate reducing agent such as, in particular, ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA), to provide a Fab 'fragment which is purified by passage through a column chromatography column.
  • an appropriate reducing agent such as, in particular, ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA)
  • the present invention also relates to a method for producing AChE conjugates and anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies and AChE conjugates and fragments of said monoclonal antibodies, in particular Fab 'fragments , which is characterized in that at least one incorporated or natural thiol group- ment present in the antibody or one of its fragments, is coupled to at least one maleimido group incorporated in AChE, via an appropriate coupling agent such as, in particular, an ester of N-succinimide such as N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
  • an appropriate coupling agent such as, in particular, an ester of N-succinimide such as N-succinimidyl-4- (N-maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
  • the present invention further relates to enzyme immunoassays by competition for the detection of Il-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in cell culture supernatants and in biological fluids, characterized in that a monoclonal antibody anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ according to the invention, used as first antibody, and IgG, carried by an appropriate solid support, used as second antibody, are brought into contact with conjugates of IL-1 -AChE, which play the role of tracers, and of interleukin-1-1 ⁇ or -1 ⁇ , after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
  • the present invention also relates to highly specific and sensitive enzymo-immunometric tests for the detection of Il-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in cell culture supernatants and biological fluids, characterized in that antibodies monoclonal (mAb) anti-IL-1 ⁇ and / or anti-IL-1 ⁇ according to the invention and carried by an appropriate support, are brought into contact with IL-1 ⁇ or -1 ⁇ and with the Acm-AChE conjugate , after which the AChE activity is revealed by any appropriate means.
  • mAb monoclonal
  • IL-1 ⁇ or -1 ⁇ is added to the antibody simultaneously with the conjugate Acm-AChE and the two monoclonal antibodies react simultaneously with IL-1 ⁇ or - 1 ⁇ .
  • the IL-1 ⁇ or -1 ⁇ is first introduced and reacts with the antibody, then the Acm-AChE conjugate is then introduced and the activity
  • AChE is revealed by any appropriate means.
  • the suitable supports are in particular microtiter plates or supports in the form of particles allowing the fixing of said antibodies.
  • the subject of the present invention is, moreover, a kit for carrying out immunoenzymatic tests by competition in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
  • At least one bottle containing appropriate doses of anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibody and / or anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibody;
  • the present invention also relates to a kit for carrying out the enzymo-immunometric tests in accordance with the invention, characterized in that it comprises:
  • the present invention further relates to agents for therapeutic purposes, characterized in that they consist of, or comprise as active constituents, anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies and / or anti-IL antibodies -1 ⁇ and / or their fragments, co to the invention, alone or conjugated or hybrid or associated with other substances.
  • a particularly advantageous therapeutic application of said anti-IL-1 ⁇ and anti-IL-1 ⁇ monoclonal antibodies is their activity of inhibiting IL-1.
  • the present invention also relates to diagnostic agents capable of being used for in vivo diagnosis, characterized in that they comprise anti-IL-1 ⁇ antibodies and / or anti-IL-1 ⁇ antibodies or their fragments , associated with an antigen and / or a hapten and / or another antibody or antibody fragment, and / or labeled with stable or radioactive labels.
  • FIG. 4 the in vitro release of IL-1 ⁇ ( ⁇ , ⁇ ) and IL-1 ⁇ ( ⁇ , ) established by specific EIAs in the supernatants of unstimulated human monocytes, lymphocytes and neutrophils ( ⁇ , ⁇ ) and stimulated by LPS ( ⁇ , ), purified by centrifugal elutriation.
  • EXAMPLE 1 Implementation of the tests in accordance with the invention; preparation of reagents (monoclonal antibodies and conjugates) and reagent selection parameters.
  • the acetylcholinesterase (AChE) obtained from the electric eel Electrophorus electricus was purified by affinity chromatography by the method described by MASSOULIE and BON [Eur. J. BIOCHEM (1976), 68, pages 531-539].
  • the tetrameric form of the enzyme, or G4 form has been used to label interleukins and antibodies.
  • AChE activity was measured using the colorimetric method of ELLMAN et al. [BIOCHEM. PHARM. (1961), 7, pages 88-95].
  • An ELLMAN unit is defined as the quantity of enzyme producing an increase in absorbance of 1 DO at 25 ° C, for 1 minute, in 1 ml of medium and for an optical step length of 1 cm; it corresponds to approximately 8 ng of enzyme and to 7.32 enzymatic units (one enzymatic unit corresponds to the quantity of enzyme which hydrolyzes 1 ⁇ mol of acetylcholine at 25 ° C. for 1 minute).
  • AChE concentrations were determined enzymatically using a catalytic constant of 4.4 x 10 7 moles h -1 per site and a molecular mass of 80 kDa for the catalytic subunit.
  • a detection limit of 1.8 attomole (10 -18 mole) of enzyme can be calculated for the G4 form (i.e. the amount of AChE which produces an increase in absorbance of 0.01 DO for 1 hour, in 20 ⁇ l of ELLMAN medium, for a step length of 0.5 cm.
  • Anti-interleukin-1 ⁇ and 1- ⁇ antibodies were produced in Biozzi High Responder (HR) mice using the following immunization process: on day 0, 15 ⁇ g of recombinant interleukin la or 1 ⁇ emulsified in Freund's complete adjuvant was injected into the pad of one leg. The mice were treated with aspirin (0.1 mg / day) to avoid side effects such as hyperthermia. A first booster injection (in the pad of a paw) was administered on day 21 and the mice were bled a week later. The presence of murine anti-interleukin antibodies in the corresponding sera was checked by testing their capacity to fix interleukin-1-AChE conjugates.
  • HR Biozzi High Responder
  • mice received an intravenous booster injection (7 ⁇ g of interleukin) 3 and 2 days before the fusion.
  • Corresponding mouse spleen cells were fused with NSI mouse myeloma cells, as described in the article by GRASSI et al. cited in the preamble.
  • the interleukins 1a and 1 ⁇ were covalently coupled to AChE via a heterobifunctional reagent, namely N-succinimidyl-4- (N- maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) using a known technique for labeling bovine acid growth factor (aFGF) and rat pro-lactin.
  • SMCC N-succinimidyl-4- (N- maleimido-methyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • aFGF bovine acid growth factor
  • rat pro-lactin bovine acid growth factor
  • This method involves the reaction of a thiol group (previously introduced into interleukins) with a maleimido group incorporated into the enzyme after the reaction with SMCC.
  • the interleukins were thiolated by reaction of their primary amine groups with N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate (SATA)
  • AChE Maleimido groups were introduced into AChE (form G4) by reaction with SMCC; if not used immediately, the AChE-SMCC preparation can be frozen at -80 ° C and stored without losing its reactive properties, for at least several weeks.
  • the thiolated interleukins were coupled to the preparation of AChE-SMCC (form G4) by mixing the two reagents immediately after they were isolated by molecular sieve chromatography or as soon as they were thawed. At this stage, a molecular ratio (SH-interleukin / G4-SMCC) of 50/1 was used.
  • Monoclonal antibodies have been purified from ascites fluids by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate, according to a technique described in the prior art. The purity of the preparation was checked by polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing and reducing conditions. Two different labeling methods were used to couple purified mAbs to AChE.
  • Biotin has been covalently linked to mAbs as defined above by reaction of an activated biotin N-hydroxysuccinimide ester (IBF, France) with the primary amino groups of the antibodies.
  • the activated ester was dissolved in anhydrous dimethylformamide and added to an alkaline solution of the antibody to be labeled: 40 ⁇ l of a 5 mg / ml solution of biotin ester in DMF, to 1 mg of was added.
  • antibody dissolved in 2 ml of 0.1M borate buffer, pH 8.5. After 30 minutes at room temperature, 2 ml of EIA buffer (which will be defined later) was added. This preparation was used to determine the "binding compatibility" of the various mAbs without undergoing further purifications. It was stored frozen at -20oC.
  • Acm Fab 'fragments were covalently coupled to AChE via the SMCC using a technique derived from that described by ISHIKAWA et al. [J. IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327] for labeling antibody fragments with other enzymes.
  • the principle of the method used is very similar to that used to label the interleukins, which has been described above, except that, in the present case, the thiol groups involved in the coupling reaction are naturally present in the Fab 'fragments obtained by reduction of the corresponding F (ab') 2 fragment.
  • Fragments F (ab ′) 2 were obtained by treatment of Acm with pepsin in an acid medium (acetate buffer pH 4.3). They were isolated from the crude preparation treated with pepsin, by chromatography on molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of 0.5 m Biogel equilibrated in 0.1 M phosphate buffer, pH 6, containing 5.10 -3 M EDTA. The purity of fraction F (ab ') 2 was verified by polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing denaturing conditions. These measurements showed that more than 80% of the total protein content was composed of fragments of F (ab ') 2.
  • Fragments F (ab ') 2 were reduced in the presence of 0.1M ⁇ -mercaptoethylamine ( ⁇ MEA) at 37 ° C for 1 hour.
  • ⁇ MEA ⁇ -mercaptoethylamine
  • the excess ⁇ MEA was removed by chromatography on a molecular sieve on a column (30 x 1.5 cm) of Sephadex G25, as described above for the thiolated interleukins.
  • the concentration of Fab 'fragments was measured by UV spectrometry using the extinction coefficient at 280 nm, 1.48 g - 1 . L cm -1 and as molecular weight 46000.
  • the content of thiol groups in the Fab 'preparation was determined by reaction with DTNB, as for the thiolated interleukins. Depending on the mAb used, values of between 1 and 4 SH groups have been found per molecule of Fab '.
  • AChE form G4
  • SMCC cyclopentadiene carboxylate
  • the coupling of the enzyme with Fab 'fragments was carried out by mixing the AChE-SMCC preparation (immediately after it was isolated by chromatography on molecular sieve or thawed) with an excess of Fab 'fragments. Usually a molar ratio of 50 is used at this stage (i.e. thiol groups of Fab '/ G4-SMCC). After reaction for 3 hours at 30 ° C, the G4-Fab 'conjugates were isolated by chromatography on molecular sieve on a 0.5 m Biogel column.
  • the conjugate was eluted in the form of a single homogeneous peak, the corresponding fraction was collected and stored in the frozen state at -20oC. No significant loss of enzymatic activity was observed during the entire coupling process. The stability of the conjugates proved to be excellent because they could be stored either in the frozen state at -20o C, or in the lyophilized state, or in the liquid state at + 4oC, without losing their enzymatic or immunological properties. . 5. SCREENING OF CULTURE SURNANTANTS:
  • the presence of anti-interleukin-1 antibodies in supernatants of hybridoma cultures was detected using an enzyme immunoassay similar to that described above.
  • the culture supernatants were incubated in microtiter plates coated with a second anti-mouse IgG antibody, together with conjugates of interleukin 1-AChE.
  • the anti-interleukin 1 mAbs optionally present in the supernatants bind simultaneously to the IL-1-AChE conjugate and to the solid phase, which results in the indirect immobilization of the AChE activity on the plates.
  • the presence of AChE on the solid phase was further revealed (after a washing step) by adding the substrate and measuring by colorimetry.
  • the preparation and characteristics of the second solid phase antibody are well known; 50 ⁇ l of each supernatant present on the microtitration plates comprising 96 wells, were transferred under sterile conditions into microtitration plates of the same dimensions, coated with the second antibody. 50 ⁇ l of conjugate ford interleukin 1-AChE (1 ELLMAN unit / ml) dissolved in EIA buffer were then added and the mixture was allowed to react overnight at + 4 ° C. At the end of this first reaction period, the plates were washed thoroughly before adding 200 ⁇ l of ELLMAN reagent to each well.
  • the binding compatibility of two different mAbs on a single molecule of Interleukin-1 was determined in an immunometric test in which one of the mAbs was immobilized on a solid phase while the other was labeled with biotin molecules .
  • These tests were carried out as follows: all the dilutions were carried out in EIA buffer and 100 ⁇ l of a solution at 100 ng / ml of recombinant interleukin-1 ⁇ or 1 ⁇ were added to wells of microtitration plates coated with one of the Acm. After one hour of reaction at room temperature with stirring, 100 ⁇ l of a 10 ⁇ g / ml solution of another biotin-labeled mAb were added.
  • Monoclonal antibodies from culture supernatants or ascites fluids were first tested in a competitive immunoassay using IL-1-AChE conjugates as tracers.
  • immunometric tests were developed involving the simultaneous use of anti-interleukin mAbs, either coating a solid phase or marked with AChE.
  • All the reagents used in the immunoassay were diluted in the EIA buffer mentioned above, the composition of which is as follows: 0.1 M phosphate, pH 7.6, containing 0.4 M NaCl, 10 -3 M EDTA, 0.1% BSA and 0.01% sodium azide. All the concentrations mentioned in the immunoassays refer to the concentration of the reagents in the "initial volume" (50 ⁇ l for the competition test, 100 ⁇ l for the immunometric test) before mixing with the other reagents.
  • the working dilutions of the mAbs were determined beforehand by carrying out antibody dilution curves from culture supernatants or ascites fluids.
  • Immunometric tests were carried out in microtiter plates comprising 96 wells, coated with one of the monoclonal antibodies. The coating was carried out exactly as described above for the second antibody in solid phase. Briefly, the wells of the microtitration plates were filled with 200 ⁇ l of a 10 ⁇ g / ml solution of mAb dissolved in 5 ⁇ 10 -2 M phosphate buffer, 7.4 mH. After allowing the reaction to occur overnight at room temperature, the plates were washed thoroughly with 10 -2 phosphate buffer, pH 7.4 containing TWEEN 20, 0.05%. The solid phase was then saturated by adding 300 ⁇ l of EIA buffer to each well for at least 4 hours at room temperature. Plates were stored at 4 ° C in this saturation buffer until that they be used. When stored under these conditions, no changes in their fixing properties were observed for at least a period of four months. The immunometric tests were carried out using two different procedures.
  • the first protocol (called “Simultaneous Protocol") consisted in adding 100 ⁇ l of interleukin-1 in solution (introduced in the form of a recombinant standard or a sample) into wells of microtitration plates, together with 100 ⁇ l of Acm-AChE conjugates (usually at a concentration of 10 ELLMAN units / ml).
  • the two antibodies (the solid phase antibody and the antibody labeled with AChE) react simultaneously with interleukin-1.
  • interleukin-1 is dissolved standard recombinant in the corresponding diluent, i.e. culture medium, plasma or serum.
  • AChE fixed to the solid phase was determined by adding 200 ⁇ l of ELLMAN reagent.
  • a second protocol (called “sequential protocol”) consists in reacting interleukin-1 and the Acm-AChE conjugate separately.
  • first incubation period 200 ⁇ l of interleukin-1 (introduced in the form of a standard or sample) dissolved in EIA buffer or any other appropriate diluent (culture medium, plasma, etc.) .) react with the solid phase.
  • EIA buffer or any other appropriate diluent (culture medium, plasma, etc.) .
  • the plates are washed before adding 200 ⁇ l of Acm-AChE conjugate (usually at 10 ELLMANN units / ml) dissolved in EIA buffer.
  • the plates are washed again and the AChE activity is revealed as described above.
  • Standard curves "imprecision profiles" were established by performing all the measurements (non-specific fixation as well as standard measurements) eight times. For each dose, the precision was expressed in terms of coefficient of variation (CV%) and was plotted as a function of the dose logarithm.
  • MDC minimum detectable concentration
  • An immunoreactive substance detected by immunometric tests in biological media has been characterized by fractionating samples by molecular sieve chromatography using FPLC equipment and a Superose 12 column equilibrated with EIA buffer. Standard recombinant IL-1 and samples were injected in a volume of 500 ⁇ l and at a flow rate of 24 ml / hour and then 0.8 ml fractions were collected. At the end of the chromatography, 100 ⁇ l of each of the fractions was tested by implementing the IL-1 ⁇ and / or IL-1 ⁇ test as described above.
  • Mononuclear leukocytes (lymphocytes and monocytes) and polymorphonuclear (neutrophils) from peripheral blood were obtained by centrifugation on FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMICALS) and were then subjected to countercurrent centrifugal elutriation to allow the production of lymphocytes, pure monocytes and neutrophils.
  • FICOLLPAQUE PARMACIA FINE CHEMICALS
  • the elutriation buffer consisted of a saturated PBS solution from Dulbecco supplemented with 0.25% BSA and 2 mM EDTA.
  • the platelets were washed after half an hour of elutriation, at the injection rate.
  • the fractionation of mononuclear leukocytes was carried out as follows: pure lymphocytes were obtained by increasing the flow rate from 8 to 20 ml / min.
  • the mouse whose serum had the highest titer in the enzyme immunoassays was selected for fusion.
  • the corresponding spleen cells were fused with NSI myeloma cells as described above.
  • One week after the fusion approximately 500 wells presented hybridomas which were actively multiplying for the two interleukins.
  • the presence of anti-interleukin mouse antibodies was verified in all the culture supernatants by testing their capacity to fix the corresponding IL-1-AChE conjugate. In a primary screening, 90 and 116 strongly positive culture supernatants were detected for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ respectively.
  • the corresponding hybridomas were subcloned by limiting dilutions in order to obtain a cell line secreting antibodies, stable, unique for each culture. Finally, 36 and 11 cell lines were respectively stabilized for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ . All the clones were characterized by a number preceded by the letter ⁇ or ⁇ according to the interleukin against which they had been directed. They were cultured as ascites tumors and the monoclonal antibodies were purified from ascites fluid by precipitation with caprylic acid and ammonium sulfate. The isotypes were determined from ascites fluid by the OUCHTERLONY double diffusion technique. All of the mAbs were IgGs having a K light chain, with IgG 1 being by far the most common (see Tables I and II below).
  • Example 1 The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1.
  • the solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed.
  • the mAbs with the same definition have been grouped into three categories (A to C). All mAbs are in the IgG 1 subclass except mAb 100 (group A) and mAbs 50 and 176 (group B) which are IgG 2 .
  • Example 1 The binding compatibility tests were carried out as described above in Example 1. The solid circles indicate couples for which a simultaneous binding of the mAbs immobilized in solid phase and of the labeled mAbs was observed. To clarify the presentation, mAbs with the same type of fixation have been grouped into four categories (A to D). The IgG subclass of each mAb is mentioned in the last column. Culture supernatants as well as ascites fluids have been used in competitive enzyme immunoassays involving IL-1-AChE conjugates as tracers. In most cases (except for the ⁇ 26 and ⁇ 54 clones), standard curves could be established using recombinant IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ as standards.
  • One of its essential aims is to develop immunometric tests at two sites for both IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , so that it is necessary to determine which pairs of MAbs which could be attached simultaneously to each interleukin.
  • These binding complementarity studies were carried out using immunometric tests in which one of the mAbs was immobilized on the solid phase while the other was labeled with biotin molecules.
  • labeling with biotin was chosen because it is a completely simple which allows the marking of a large number of AMC
  • Tables I and II above present the results of these additional tests for IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ respectively.
  • IL-1 ⁇ we see that there are three groups of mAbs which recognize epitopes which are found in three different regions of the molecules of IL-1 ⁇ . These groups, which have been designated by A, B and C, contain 10, 25 and 1 monoclonal antibodies, respectively. All the mAbs of a group have a binding compatible with all the mAbs of the other two groups, while they do not bind simultaneously to each other or with mAbs of the same group. In the case of IL-1 ⁇ , the situation is less clear. In fact, there are four different groups.
  • the mAbs which gave the best results were marked and the tests were continued. with them using the corresponding immobilized mAbs.
  • the antibodies ⁇ 5, ⁇ 29, ⁇ 100, ⁇ 147 (group A), ⁇ 176, ⁇ 39 (group B), and ⁇ 101 (group C) were successively labeled and tested.
  • FIG. 1 summarizes the main characteristics of the tests for detecting IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ in the case of an overnight incubation at 4 ° C. and d 'a simultaneous process.
  • the two tests seem very sensitive because minimum detectable concentrations lower than 4 pg / ml could be calculated for each interleukin by using a period of 30 minutes for the enzymatic measurement. Increased sensitivity is observed when the enzymatic reaction (revelation step) lasts longer. In such a case, minimum detectable concentrations below 2 pg / ml can be obtained (see Table IV below).
  • the identity between the substance detected in the culture supernatants (or the intracellular extracts of cells) and the recombinant IL-1 used to establish the standard curves is confirmed by three types of control experiments. The first is represented by the dilutions of samples in culture medium, which gave dilution curves parallel to the standard curves. This is shown in Table V below, which presents the results of two different tests relating to IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , carried out at different dilutions. Similar results were obtained with all of the samples tested.
  • Samples A and B were diluted as indicated in Table V and tested for IL- la and IL-1 ⁇ by EIA. Both the dilutions and the standard curve were made in culture medium (RPMI + 10% fetal calf serum). The raw data were multiplied by the dilution factor before being listed in the Table, in order to clearly show the parallelism between the standard curve and the dilution curves of the samples.
  • Sample A supernatant of alveolar macrophages in a culture stimulated by TNF ⁇ .
  • Sample B intracellular extract of alveolar macrophages in culture.
  • the third experiment consisted in the analysis of culture supernatant after fractionation by chromatography on molecular sieves; this analysis shows that the immunoreactive substance is eluted in the form of a single homogeneous peak, as already indicated above, which corresponds exactly to the peak observed with the recombinant interleukins.
  • FIG. 7 shows different chromatographic profiles obtained for supernatants of stimulated alveolar macrophages, both in the test for detecting IL-1 ⁇ and in the test for detecting IL-1 ⁇ . Similar results have been observed with other culture supernatants or with intracellular extracts. Taken as a whole, all these data clearly indicate that the two tests effectively allow a quantitative determination of interleukins 1 in these environments.
  • EXAMPLE 4 Measurement of IL-1 ⁇ and iL-1 ⁇ in plasma and serum.
  • JURKAT cells for example (cell line derived from a human T lymphoma) secrete IL-2 when they are stimulated by IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ in the presence of phytohemagglutin (PHA) ).
  • Certain anti-IL-1 ⁇ or anti-IL-1 ⁇ antibodies are capable of inhibiting the effect of IL-1 either because they recognize the site involved in the binding with the receptor or because the formation of the IL-1 complex - antibody disrupts the biological process.
  • the anti-IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ antibodies according to the invention (10 ⁇ g / ml) are incubated in the presence of IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ (10 ng / ml) for 18 hours at 4 ° C. .
  • a control is carried out by incubating IL-1 ⁇ or IL-1 ⁇ (10 ng / ml) without antibodies under the same conditions.
  • results are expressed as a percentage of inhibition compared to two controls, one is carried out in the absence of IL-1 (PHA alone) and represents 100% inhibition, the other is carried out in the absence of antibody. and represents 0% inhibition.
  • IL-1 ⁇ acts on cells via a membrane receptor with which it specifically binds.
  • Monoclonal antibodies can inhibit the binding of IL-1 ⁇ to receptors if they recognize the part of the IL-1 ⁇ molecule involved in the complex. By inhibiting the binding with the receptor they also inhibit the biological effect.
  • the iodine-labeled IL-1 is incubated for one hour at 4 ° C. with the antibodies at a concentration of
  • the mixture is brought into contact with EL4 cells (murine Thymoma cell line) for 8 hours at + 4 ° C.
  • the cells are then washed with an appropriate buffer and the fixed radioactivity is measured with a solid scintillation counter (multigramma LKB). The results are expressed as a percentage of inhibition relative to a control (100% binding) for which the IL-1 ⁇ labeled with iodine 125 has not been incubated with an antibody.
  • EXAMPLE 6 Demonstration of the sensitivity of the monoclonal antibodies in accordance with the invention; comparative test with tests using the antibodies of the prior art.
  • Example 2 above shows that in the optimal reactions of the tests in accordance with the invention, the minimum detectable concentrations are less than 2 pg / ml (see in particular Table IV).
  • Example 1 the sensitivity of the tests was. characterized by the dose of IL-1 which induces a statistically significant reduction in the fixation observed in the absence of competitor (Bo), that is to say
  • MEDGENIX immunoradiometric assay: anti-IL-1 ⁇ antibody labeled with iodine 125
  • the curve is obtained as visible in FIG. 9, which includes the concentrations of IL-1 ⁇ on the abscissa in pg / ml and on the ordinate the radioactivity bound (in cpm) and which shows that the detection limit is of the order of 15 pg / ml.
  • the sensitivity of the immunometric tests is calculated as the dose of IL-1, which corresponds to non-specific binding + 3 standard deviations (with a confidence rate of 99%). This therefore corresponds to a significantly lower sensitivity than that of the tests in accordance with the invention, as specified above, which is of the order of 2 pg / ml.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Anticorps monoclonaux anti-interleukines-1. Les anticorps concernés sont des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β. L'invention concerne également des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1α/AChE et des conjugués anticorps monoclonaux anti-IL-1β/AChE, ainsi que des conjugués AChE-fragments des anticorps. Lesdits anticorps monoclonaux et conjugués présentent de nombreuses applications: tests enzymo-immunométriques, agents de diagnostic, agents à visées thérapeutiques.

Description

ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α ET 1β, ET EN THERAPEUTIQUE.
La présente invention est relative à des anticorps monoclonaux anti-interleukines, et notamment anti- interleukines 1α et 1β, à leur procédé de production, à des conjugués anticorps monoclonaux anti-interleukines 1α et 1β/acétylcholinestérase, à des tests enzymo-immunomé- triques (EIA) de détection et de quantification des interleukines la et 1β utilisant lesdits anticorps et/ou conjugués et à diverses autres applications desdits anticorps et/ou conjugués, notamment à des applications thérapeutiques.
Les lymphokines sont de puissants agents pharmacologiques qui résultent de l'interaction entre les lymphocytes et l'antigène spécifique qui les sensibilise ; elles peuvent modifier, induire ou supprimer les fonctions de nombreux types cellulaires ; elles jouent aussi un rôle essentiel au cours des réactions inflammatoires et dans les phénomènes de résorption osseuse, de fibrose et de chimiotactisme. De plus, elles interviennent dans le contrôle de l'hématopoïèse et la régulation des réponses immunitaires. Les lymphokines sont produites par les lymphocytes T, étant cependant connu que certaines d'entre elles telles l'interleukine-1 peuvent être produites par des cellules non-leucocytaires.
L'interleukine-1 (cf. IMMUNOLOGIE, JeanFrançois BACH, Ch. XIII, pages 425-426, 3ème Edition 1986) est un médiateur qui constitue un signal biologique de la présentation de l'antigène associé à l'histotope, qui marque la coopération monocytes-lymphocytes T. L'activité de l'IL-1 est traditionnellement mesurée dans un test de prolifération de thymocytes de souris C3H/HeJ (résistantes au LPS) en présence de PHA (Iμg/ml). En l'absence d'IL-1, les thymocytes stimulés par 1a PHA sont bloqués en phase Go/G1. Ils peuvent cependant se diviser si l'on ajoute de l'interleukine-2, ce qui suggère que l'action principale de l'IL-1 est l'induction de la synthèse de l'interleukine-2.
L' IL-1 humaine est une glycoprotéine de poids moléculaire estimé à 18 kDa, avec un contaminant majeur à 15 kDa. En outre, deux fractions peptidiques de poids moléculaires 2 et 4 kDa qui présentent l'activité biologique de l'IL-1 ont été isolées de l'urine normale.
L' IL-1 semble être produite par une grande variété de types cellulaires à l'exclusion des lymphocytes T, tels que les monocytes, les macrophages, les kératinocytes, les astrocytes, les mélanocytes, les cellules mésangiales, les lymphoblastes B.
Les effets biologiques de l'IL-1 ne se limi- tent pas à l'induction de la synthèse de l'IL-2. L'IL-1 participe à l'activation des cellules B, stimule la prolifération des fibroblastes et des synoviocytes, élève la température corporelle par action sur les centres thermorégulateurs et induit la production de protéines de l'inflammation par les hépatocytes . Un gène de l'IL-1 codant pour un précurseur de 270 amino-acides a récemment été clone. Les plasmides contenant ce gène induisent la production d'un peptide carboxy-terminal de 156 aminoacides, ayant les activités de l'IL-1. Alors que dans la référence précitée, l'hypothèse d'une famille de molécules de structure voisine était avancée, DINARELLO [J. CLIN. IMMUNOL. (1985), 5, pages 285-297] et OPPENHEIM et al. [IMMUNOL. TODAY (1986), 9, pages 45-46] ont montré que l'IL-1 représente une famille importante de protéines biologiquement actives dérivées de cellules mononucléaires, qui sont impliquées dans des réactions inflammatoires et dans des réponses immunes. Deux espèces distinctes d' IL-1 humaines ont été identifiées : l'IL-1α et l'IL-1β [MARCH et al., NATURE (1985), 315, pages 641- 647] ; ces deux espèces ont le même poids moléculaire, des effets biologiques similaires et les mêmes récepteurs sur les cellules-cibles [WOOD et al., J. IMMUNOL. (1985),
134, pages 895-903 et KILIAN, J. IMMUNOL. (1986), 136, pp. 4509]. Jusqu'à présent, la présence de l'IL-1 dans des milieux de culture et dans des fluides biologiques est essentiellement mesurée, comme indiqué plus haut, à l'aide de bio-essais tels que le test de co-stimulation de thymocytes murins ou la lignée cellulaire EL4 de thy- mome de souris. Ces méthodes, qui utilisent les propriétés d'activation des lymphocytes de l'IL-1, ont cependant leurs limites : elles ne permettent pas d'établir la distinction entre l'IL-1α et l'IL-1β et la présence d'autres substances actives telles que l'IL-2, les lectines et les facteurs de croissance, peut interférer avec le bioessai.
FERRUA et al. [J. OF IMMUNOL. METH. (1988)
114, pages 41-48] signalent que l'existence d'IL-1 recombinante et le développement de la technologie des hybridomes ont permis à plusieurs équipes de Chercheurs [GAFFNEY et al., 1987 ; KASAHARA et al., 1987 ; KENNEY et al., 1987 ; KOICHIRO et al., 1987] de mettre au point des immuno-essais sandwich n'utilisant pas d'isotopes, pour la détection d'IL-1α et d' IL-1β avec une limite de détection comparable à celle de la plupart des tests biologiques, et proposent à leur tour une méthode de détection de l'IL-α et de l'IL-1β ; cette méthode utilise deux immuno-essais enzymatiques sandwich par colorimétrie, séparés, qui permettent une détection de l'IL-1α et de l'IL-1β à des taux inférieurs à la picomole. Cependant, les anticorps mis en oeuvre sont des anticorps polyclo- naux de lapin ou de mouton.
Il est cependant clair qu'il serait préférable de pouvoir tirer parti des propriétés des anticorps monoclonaux et notamment de leurs plus grandes spécificité et sensibilité pour déterminer séparément l'IL-1α et l'IL- 1β. TANAKA et al. [EUR. J. IMMUNOL. (1987), 17, pages 1527-1530] ont proposé de doser l'IL-1α et l'IL-1β produites in vitro par des cellules mononucléaires de sang périphérique à l'aide d'un immuno-essai enzymatique sandwich qui utilise un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal : des billes de polystyrène revêtues d' IgGl monoclonaux anti-IL-1α humaine ou d' IgGl anti-IL- 1β humaine de lapin sont incubées avec de l'IL-1α recombinante humaine, de l'IL-1β recombinante humaine ou des surnageants de culture de cellules mononucléaires puis, après le lavage, avec des conjugués Fab' anti-IL-1α humaine/peroxydase ou du conjugué Fab' anti-IL-1β humaine/peroxydase purifié, par affinité, le second anticorps mis en oeuvre étant un anticorps polyclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β de lapin.
D'autres Demandes de Brevets décrivent également des anticorps anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β.
La Demande de Brevet européen OTSUKA PHARMA- CEUTICAL 267 611 décrit des anticorps monoclonaux anti- IL-1α et des anticorps monoclonaux anti-IL-1β. La constante d'affinité de ces anticorps est de l'ordre de 3,6.10-8 M/l.
La Demande de Brevet européen IMMUNEX 245 052 décrit plus particulièrement une méthode de détection de l'inflammation au cours de laquelle l'IL-1 intervient, comprenant (a) la réaction d'un échantillon de fluide biologique contenant éventuellement de l'IL-1 avec un premier anticorps spécifique d'un premier site antigénique caractéristique de l'IL-1 et (b) la détection de la réaction entre le premier anticorps et l'IL-1. Les anticorps plus particulièrement décrits dans cette Demande IMMUNEX sont un anticorps monoclonal qui réagit spécifiquement avec l'IL-1α (anticorps monoclonal dénommé 15A4) et un anticorps monoclonal qui réagit spécifiquement avec l'IL-1β (anticorps monoclonal dénommé 7B4). Cependant, les anticorps décrits dans cette
Demande ne permettent pas de doser des concentrations en interleukines inférieures au nanogramme/ml.
La Demande de Brevet européen DAINIPPON 220 063, pour sa part, décrit un anticorps dirigé contre l'IL-1, ledit anticorps étant notamment utilisé dans le cadre d'une méthode par compétition ou d'une méthode immunométrique. Cet anticorps ne permet d'obtenir, dans le cadre de ces dosages que des sensibilités de l'ordre de 0,1 ng/ml pour la méthode par compétition et de l'ordre de 0,2 ng/ml pour la méthode immunométrique.
De manière générale, tous les anticorps de l'Art antérieur ne présentent pas une affinité suffisante, pour leur application dans des dosages très sensibles d' IL-1 (de l'ordre du picogramme).
Le Brevet français Nº 83 13389, au nom de la Demanderesse, a proposé pour la réalisation de dosages enzymoimmunologiques, des conjugués dans lesquels un anticorps, un antigène ou un haptène est lié par covalence à l'acétylcholinestérase, ce nouveau conjugué permettant, grâce aux propriétés de l'enzyme, la réalisation de dosages enzymoimmunologiques de quantités très faibles, de l'ordre du nanogramme.
GRASSI et al. ont décrit [ANAL. BIOCHEM. (1988), 168, pages 436-450] une application de conjugués conformes a ce Brevet, constitués par des antigènes marqués par l'acétylcholinestérase, au criblage d'anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines périphériques du photosystème 1 (PSI), qui est un complexe de membrane. Les Auteurs ont également testé cette méthode dans des immunoessais par compétition, ce qui leur a permis de quantifier de façon très précise des polypeptides de PSI dans différents extraits biologiques. Le test immunoenzy- matique comprend, pour le criblage d'une série d'anticorps monoclonaux aptes à reconnaître les différents polypeptides qui composent les deux classes de polypeptides dont est constitué le PS1, les trois étapes suivantes :
- les anticorps monoclonaux anti-PSl présents dans les surnageants des cultures d'hybridomes se fixent à la phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte du composant biotinylé correspondant du PSI ; - cet antigène biotinylé fixe fortement l'avidine, qui fixe elle-même l'AChE marquée à la biotine ; - l'activité de l'AChE fixée est mesurée par la méthode colorimétrique d'ELLMAN. Les Auteurs ont montré que le système à l'AChE améliore de façon très sensible les limites de détection des anticorps monoclonaux. Cette méthode de criblage s'applique parfaitement à la détermination quantitative de différents polypeptides du PS1 par compétition.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des moyens propres à permettre la réalisation d'essais enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection et de quantification d'IL-1α et d'IL-1β, ces moyens étant en outre susceptibles d'applications thérapeutiques et d'applications diagnostiques in vivo .
La présente invention a pour objet des anticorps monoclonaux spécifiques des IL-1α et 1ß, qui résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de ron- geurs, et plus particulièrement de souris, par des IL-1α ou -1β selon le cas, qui reconnaissent spécifiquement les IL-1α naturelles ou recombinantes ou les IL-1β naturelles ou recombinantes, qui ne présentent pratiquement pas de réaction croisée entre les deux IL-1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux ont une constante de dissociation inférieure à 5.10-10 , en ce qu'ils se composent de plusieurs groupes qui reconnaissent des régions distinctes des IL-1α ou -1β, en ce que les anticorps de certains groupes sont aptes à se lier de façon compatible avec tous les anticorps des autres groupes, à savoir : - les anticorps anti-IL-1α se composent de trois groupes (A, B et C) qui reconnaissent trois régions distinctes de l'interleukine-1α, tous les anticorps d'un groupe étant aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes mais n'étant pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe ;
- les anticorps anti-IL-1β se composent de quatre groupes (A, B, C et D) dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des anticorps anti-IL-1α, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes, et ne se lient pas à l'IL-1β native recombinante, reconnaissent une interleukine-1β modifiée, et réagissent avec un conjugué IL-1β-AChE ;
et en ce que lesdits anticorps anti-IL-1α et anti-IL-1β reconnaissent les conjugués IL-1α ou 1β/acétyl- cholinestérase (AChE).
Ces anticorps ne présentent pratiquement pas de réaction croisée (<0,01 %) entre les deux IL-1.
Les anticorps monoclonaux spécifiques des in- terleukines-1α et 1β, conformes à l'invention, sont obtenus à partir de mammifères tels que, notamment, des rongeurs, et plus particulièrement des souris, qui sont immunisés par des injections appropriées d'interleukine- 1α ou -1β, puis des cellules de rates des mammifères immunisés sont fusionnées, selon une technique appropriée, avec des cellules de myélome de mammifères de la même espèce, les hybridomes résultants sont mis en culture et ceux dans les surnageants desquels ont été détectés des anticorps anti-interleukine-1α ou 1β, selon le cas, sont sous-clonés pour obtenir des lignées cellulaires sécrétant des anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β, selon l'interleukihe contre laquelle ils ont été dirigés.
L'interleukine-1α ou -1β mise en oeuvre pour immuniser les mammifères susdits, peut être aussi bien une interleukine naturelle purifiée, qu'une interleukine recombinante .
Les hybridomes mis en oeuvre pour l'obtention des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β conformes à l'invention ont fait l'objet d'un dépôt en date du 8 Décembre 1988 auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR. Les hybridomes déposés sont identifiés par les N° suivants : I-823, I-824, I-825, I-826, I- 827, 1-828, 1-829.
La présente invention a également pour objet des conjugués d' acétylcholinestérase et d' anticorps monoclonaux anti IL-1α ou -1β ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'.
La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1α ou 1β conformes à la présente invention. Conformément à ce procédé, lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F (ab' ) 2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel,notamment, que la β-mercaptoéthylamine (βMEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β et de conjugués d'AChE et de fragments desdits anticorps monoclonaux, notamment de fragments Fab', qui est caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturelle- ment présent dans l'anticorps ou l'un de ses fragments, est couplé à au moins un groupe maléimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-succinimide comme le N-succinimidyl-4- (N-maléimido-méthyl) cyclohexane-1- carboxylate (SMCC) .
La présente invention a, en outre, pour objet des tests immunoenzymatiques par compétition de détection de l'Il-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biologiques, caractérisés en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β conforme à l'invention, utilisé comme premier anticorps, et des IgG, portées par un support solide approprié, utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d'IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-1-1α ou -1β, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
La présente invention a également pour objet des tests enzymo-immunométriques hautement spécifiques et sensibles, de détection de l'-Il-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérisés en ce que des anticorps monoclonaux (Acm) anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β conformes à l'invention et portés par un support approprié, sont mis en contact avec de l'IL-1α ou -1β et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
Selon un mode de mise en oeuvre de ces tests enzymo-immunométriques, l'IL-1α ou -1β est ajoutée à l'anticorps simultanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec l'IL-1α ou -1β.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de ces tests enzymo-immunométriques, l'IL-1α ou -1β est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité
AChE est révélée par tous moyens appropriés.
Les supports appropriés sont notamment des plaques de microtitration ou des supports sous forme de particules permettant la fixation desdits anticorps.
La présente invention a, de plus, pour objet un kit pour la réalisation des tests immuno-enzymatiques par compétition conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
. une série de plaques de microtitration revêtues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin antisouris ;
au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1β ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'IL-1α et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1β et d'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d' IL-1α et/ou d'IL-1β.
La présente invention a également pour objet un kit pour la réalisation des tests enzymo-immuno- métriques conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend :
. une série de plaques de microtitration revêtues d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonaux anti-IL-1β ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou 1β ;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β. La présente invention a, de plus, pour objet des agents à visées thérapeutiques, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β et/ou leurs fragments, co à l'invention, seuls ou conjugués ou hybrides ou associés avec d'autres substances.
Conformément à l'invention, une application thérapeutique particulièrement intéressante desdits anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β est leur activité d'inhibition de l'IL-1.
La présente invention a également pour objet des agents de diagnostic aptes à être mis en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-1α et/ou des anticorps anti- IL-1β ou leur fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention, dans le premier desquels il sera fait référence aux dessins annexés dont les Figures 1 à 7 représentent respectivement, par des courbes :
- La Figure 1 : l'effet non-spécifique de plasma sur des courbes standard d'un immunoessai d'IL-1α, dans le cadre d'une comparaison entre deux couples différents d'anticorps monoclonaux.
- La Figure 2 : l'évolution de la courbe étalon de l'IL-1β en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation). - La Figure 3 : l'évolution des "profils d'imprécision" dans le test relatif à l'IL-1β en fonction du temps dévolu à la réaction enzymatique (étape de révélation).
- La Figure 4 : la libération in vitro d' IL- 1α (♢, ♦) et d'IL-1β (■,
Figure imgf000014_0001
) établie par les EIA spécifiques dans les surnageants de monocytes, lymphocytes et neutrophiles humains non stimulés (♢, ■) et stimulés par le LPS (♦,
Figure imgf000014_0002
), purifiés par élutriation centrifuge.
- La Figure 5 : la répartition de l'immunoréactivité de l'IL-1α à la suite d'une chromotagraphie sur tamis moléculaire "SUPEROSE 12" de surnageant de culture ou de plasma.
- La Figure 6 : la limite de détection d'un kit de l'Art antérieur, utilisant une méthode de dosage de l'IL-1α par compétition.
- La Figure 7 : la limite de détection d'un kit de l'Art antérieur, utilisant une méthode immunoradiométrique de dosage de l'IL-1β.
II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et dessins sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Mise en oeuvre des tests conformes à l'invention ; préparation des réactifs (anticorps monoclonaux et conjugués) et paramètres de sélection des réactifs.
1. PURIFICATION ET CONTROLE DE L'ACETYLCHOLINESTERASE :
L'acétylcholinestérase (AChE) obtenue à partir de l'anguille électrique Electrophorus electricus, a été purifiée par chromatographie d'affinité par la méthode décrite par MASSOULIE et BON [Eur. J. BIOCHEM (1976), 68, pages 531-539]. La forme tétramère de l'enzyme, ou forme G4, a été utilisée pour marquer les interleukines et les anticorps. L'activité AChE a été mesurée à l'aide de la méthode colorimétrique d'ELLMAN et al. [BIOCHEM. PHARM. (1961), 7, pages 88-95]. Une unité ELLMAN est définie comme étant la quantité d'enzyme produisant une augmentation de l'absorbance de 1 DO à 25°C, pendant 1 minute, dans 1 ml de milieu et pour une longueur de pas optique d'1 cm ; elle correspond à environ 8 ng d'enzyme et à 7,32 unités enzymatiques (une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 μmole d' acétylcholine à 25°C pendant 1 minute). Les concentrations d'AChE ont été déterminées par voie enzymatique en utilisant une constante catalytique de 4,4 x 107 moles h-1 par site et une masse moléculaire de 80 kDa pour la sous-unité catalytique. A partir de ces valeurs, une limite de détection de 1,8 attomole (10-18 mole) d'enzyme peut être calculée pour la forme G4 (c'est-à-dire la quantité d'AChE qui produit une augmentation d' absorbance de 0,01 DO pendant 1 heure, dans 20 μl de milieu de ELLMAN, pour une longueur de pas de 0,5 cm.
2. IMMUNISATION ET PROCESSUS DE PRODUCTION D' HYBRIDOMES :
Des anticorps anti-interleukine-1α et 1-β ont été produits chez des souris de race Biozzi High Responder (HR) en utilisant le processus d'immunisation suivant : au jour 0, 15 μg d'interleukine recombinante la ou 1β émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund ont été injectés dans le coussinet d'une patte. Les souris ont été traitées par de l'aspirine (0,1 mg/jour) pour éviter les effets secondaires tels que l'hyperthermie. Une première injection de rappel (dans le coussinet d'une patte) a été administrée au jour 21 et les souris ont été saignées une semaine plus tard. La présence d'anticorps anti-interleukine murins dans les sérums correspondants a été contrôlée en testant leur capacité de fixer des conjugués interleukine-1- AChE. Ces tests ont été réalisés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, en mettant en oeuvre le même processus que celui qui sera utilisé ultérieurement pour cribler les surnageants de cultures d' hybridomes. On a choisi pour chaque interleukine-1, la souris présentant le titre le plus élevé dans l'immunoessai-enzymatique, pour la préparation d'anticorps monoclonaux. A ce stade, des titres compris entre 1/1000 et 1/10000 ont été obser- vés. Les souris sélectionnées ont reçu une injection intraveineuse de rappel (7μg d' interleukine) 3 et 2 jours avant la fusion. Des cellules de rate des souris correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de souris NSI, comme décrit dans l'Article de GRASSI et al. cité dans le préambule.
3. MARQUAGE D' INTERLEUKINES PAR L'AChE :
Les interleukines la et 1β ont été couplées par covalence à l'AChE par l'intermédiaire d'un réactif hétérobifonctionnel, à savoir le N-succinimidyl-4- (N- maléimido-méthyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) , en mettant en oeuvre une technique connue pour le marquage du facteur de croissance acide bovin (aFGF) et de la pro- lactine de rat. Cette méthode comprend la réaction d'un groupe thiol (préalablement introduit dans les interleukines) avec un groupe maleimido incorporé dans l'enzyme après la réaction avec le SMCC. Les interleukines ont été thiolées par réaction de leurs groupes aminé primaire avec du N-succinimidyl-S-acétyl-thioacétate (SATA) dans un milieu alcalin.
- Incorporation de groupes thiols dans les interleukines :
10 μl d'une solution à 2,7 mg/ml de SATA dans du diméthylformamide (DMF) anhydre sont ajoutés à 100 μg d' interleukines la ou 1β dissoutes dans 200μl de tampon borate 0,1 M, pH 8. Le mélange réagit pendant 30 minutes à 25ºCC avant que lui soient ajoutés 200μl d'une solution d' hydroxylamine 1 M, pH 7. Au bout d'une nouvelle durée de réaction de 30 minutes à 25°C, les réactifs en excès
(SATA et hydroxylamine) sont éliminés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne Sephadex G25 (15 x 1 cm.) équilibrée par un tampon phosphate 10-1 M, pH 6, contenant 5.10-3 M d'EDTA. Avant et pendant la chromatographie, l'éluat est maintenu sous un courant continu d'azote pour éliminer l'oxygène dissous et éviter une éventuelle oxydation des groupes thiols. Des fractions contenant des interleukines thiolées sont réunies. La concentration des interleukines est évaluée par spectrométrie U.V. en supposant que le coefficient d'extinction à 280 nm est de lg-1L cm-1 et que le poids moléculaire est de 17000. Leur teneur en groupes thiols a été déterminée par colorimétrie (à 412 nm) après réaction avec de l'acide 3-5' dithiobis nitrobenzoïque (DTMB) 0,5 mM. Ces mesures ont fait apparaître qu'environ un groupe thiol a été incorporé par molécule d' interleukine.
Incorporation de groupes maleimido dans l'AChE et couplage avec les interleukines thiolées :
Des groupes maleimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec du SMCC ; si elle n'est pas utilisée immédiatement, la préparation d'AChE- SMCC peut être congelée à -80°C et être conservée sans perdre ses propriétés réactives, pendant au moins plusieurs semaines. Les interleukines thiolées ont été couplées à la préparation d'AChE-SMCC (forme G4) en mélangeant les deux réactifs immédiatement après qu' ils ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire ou dès qu'ils ont été décongelés. A ce stade, on a utilisé un rapport moléculaire (SH-interleukine/G4-SMCC) de 50/1. Après réaction pendant 3 heures à 30°C, l'interleukine qui n'a pas réagi est éliminée par chromatographie sur une colonne (90 x 1.5 cm) de Biogel A 0,5 M. Les conjugués sont conservés à l'état congelé à - 20ºC. Aucune perte d'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage. Il ne s'est pas produit de modification significative des propriétés immunologiques ou enzymatiques des conjugués, dans ces conditions de conservation, en l'espace d'une année. 4. MARQUAGE D'ANTICORPS MONOCLONAUX par l'AChE :
Des anticorps monoclonaux (Acm) ont été purifiés à partir de fluides ascitiques par précipitation par de l'acide caprylique et du sulfate d'ammonium, selon une technique décrite dans l'Art antérieur. La pureté de la préparation a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes et réductrices. Deux méthodes de marquage différentes ont été utilisées pour coupler des Acm purifiés à de l'AChE.
4.a) Marquage d'Acm par la biotine
La biotine a été liée par covalence à des Acm tels que définis ci-dessus par réaction d'un N-hydroxy- succinimide ester de biotine activé (IBF, France) avec les groupes aminé primaire des anticorps. L'ester activé a été dissous dans du diméthylformamide anhydre et ajouté à une solution alcaline de l'anticorps à marquer : on a ajouté 40μl d'une solution à 5mg/ml d'ester de biotine dans du DMF, à 1 mg d'anticorps dissous dans 2 ml de tampon borate 0,1M, pH 8,5. Au bout de 30 minutes à la température ambiante, on a ajouté 2 ml de tampon EIA (qui sera défini plus loin). Cette préparation a été utilisée pour déterminer la "compatibilité de fixation" des différents Acm sans subir d'autres purifications. Elle a été conservée à l'état congelé à -20ºC.
4. b) Marquage covalent de fragments Fab' par l'AChE
Des fragments Fab' d'Acm ont été couplés par covalence à l'AChE par l'intermédiaire du SMCC en mettant en oeuvre une technique dérivée de celle décrite par ISHIKAWA et al. [J. IMMUNOASSAY (1983) 4, pages 209-327] pour le marquage de fragments d'anticorps par d'autres enzymes. Le principe de la méthode mise en oeuvre est très semblable à celui utilisé pour marquer les interleukines, qui a été décrit plus haut, à ceci près que, dans le cas présent, les groupes thiols impliqués dans la réaction de couplage sont naturellement présents dans les fragments Fab' obtenus par réduction du fragment F(ab')2 correspondant.
. Préparation de fragments F(ab')2 :
Des fragments F(ab')2 ont été obtenus par traitement d'Acm par de la pepsine en milieu acide (tampon acétate pH 4,3). Ils ont été isolés de la préparation brute traitée par la pepsine, par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de Biogel A 0,5 m équilibrée dans du tampon phosphate 0,1M, pH 6, contenant 5.10-3M d'EDTA. La pureté de la fraction F(ab')2 a été vérifiée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dans des conditions dénaturantes non réductrices. Ces mesures ont montré que plus de 80 % de la teneur totale en protéines étaient composés de fragments de F(ab')2.
. Préparation de fragments Fab'
Des fragments F(ab')2 ont été réduits en présence de β-mercaptoéthylamine 0, 1M (βMEA) à 37°C pendant 1 heure. La βMEA en excès a été éliminée par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne (30 x 1,5 cm) de Sephadex G25, comme décrit précédemment pour les interleukines thiolées. La concentration en fragments Fab' a été mesurée par spectrométrie U.V. en prenant pour coefficient d'extinction à 280 nm, 1,48 g- 1 . L cm-1 et comme poids moléculaire 46000. La teneur en groupes thiols de la préparation de Fab' a été déterminée par réaction avec le DTNB, comme pour les interleukines thiolées. Selon l'Acm utilisé, on a trouvé des valeurs comprises entre 1 et 4 groupes SH par molécule de Fab'.
. Incorporation de groupes maleimido dans l'AChE et
couplage avec des fragments Fab'
Des groupes maleimido ont été introduits dans l'AChE (forme G4) par réaction avec le SMCC, suivie de purification. Le couplage de l'enzyme avec des fragments Fab' a été réalisé par mélange de la préparation AChE- SMCC (immédiatement après qu'elle a été isolée par chromatographie sur tamis moléculaire ou décongelée) avec un excès de fragments Fab'. On utilise habituellement un rapport molaire de 50 à ce stade (c'est-à-dire groupes thiols de Fab' /G4-SMCC). Après réaction pendant 3 heures à 30°C, les conjugués G4-Fab' ont été isolés par chromatographie sur tamis moléculaire sur une colonne de Biogel A 0,5 m. Le conjugué a été élue sous la forme d'un seul pic homogène, la fraction correspondante a été recueillie et conservée à l'état congelé à -20ºC. Aucune perte significative de l'activité enzymatique n'a été observée pendant la totalité du processus de couplage. La stabilité des conjugués s'est avérée excellente car ils ont pu être conservés soit à l'état congelé à -20º C, soit à l'état lyophilisé , soit à l'état liquide à +4ºC, sans perdre leurs propriétés enzymatiques ou immunologiques. 5. CRIBLAGE DES SURNAGEANTS DE CULTURE :
La présence d'anticorps anti-interleukine-1 dans des surnageants de cultures d' hybridomes a été détectée en mettant en oeuvre un test immunoenzymatique analogue à celui décrit plus haut. Les surnageants de culture ont été incubés dans des plaques de microtitration revêtues d'un second anticorps IgG anti-souris, conjointement avec des conjugués d' interleukine 1-AChE. Pendant cette étape, les Acm anti-interleukine 1 éven- tuellement présents dans les surnageants se lient simultanément au conjugué IL-1-AChE et à la phase solide, ce qui entraîne l'immobilisation indirecte de l'activité AChE sur les plaques. La présence de l'AChE sur la phase solide a en outre été révélée (après une étape de lavage) par addition du substrat et mesure par colorimétrie. La préparation et les caractéristiques du second anticorps en phase solide sont bien connues ; 50 μl de chaque surnageant présent sur les plaques de microtitration comportant 96 puits, ont été transférés dans des conditions stériles dans des plaques de microtitration de mêmes dimensions, revêtues du second anticorps. 50μl de conju gué interleukine 1-AChE (1 unité ELLMAN/ml) dissous dans du tampon EIA ont alors été ajoutés et on a laissé réagir le mélange pendant une nuit à +4°C. A la fin de cette première période de réaction, les plaques ont été soigneusement lavées avant d'ajouter 200μl de réactif d'ELLMAN dans chaque puits. A ce stade les puits contenant de l'activité AChE liée à la phase solide ont développé une forte coloration jaune qui indique la présence d'anticorps anti-IL-1 dans le surnageant correspondant. L'absorbance à 414 nm de chaque puits a été mesurée 30 minutes ou une heure plus tard en utilisant un lecteur automatique de plaques (TITERTEK, Finlande). Ce processus de criblage permet une sélection très rapide et efficace des hybridomes attendu que des quantités d'Acm de l'ordre du nanograme sont facilement détectées, le criblage de 2 000 surnageants ne requérant pas plus de 4 heures de travail pour une personne.
6. DETERMINATION DE LA COMPATIBILITE DE FIXATION POUR
CHAQUE PAIRE D'Acm
La compatibilité de fixation de deux Acm différents sur une seule molécule d' Interleukine-1 a été déterminée dans un test immunométrique dans lequel l'un des Acm a été immobilisé sur une phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine. Ces tests ont été effectués comme suit : toutes les dilutions ont été réalisées dans du tampon EIA et 100 μl d'une solution à 100 ng/ml d'interleukine-1α ou 1β recombinante ont été ajoutés à des puits de plaques de microtitration revêtus de l'un des Acm. Au bout d'une heure de réaction à la température ambiante sous agitation, 100 μl d'une solution 10 μg/ml d'un autre Acm marqué à la biotine, ont été ajoutés. Après une nouvelle période de 3 heures de réaction à la température ambiante sous agitation, les plaques ont été soigneusement lavées. La présence éventuelle d'anticorps marqués à la biotine sur la phase solide a été ensuite révélée par addition d'un mélange d'avidine et d'AChE biotinylée. Une fixation non spécifique d'AChE sur la phase solide a été évaluée dans des expériences témoins au cours descruelles 100 μl de tampon ont remplacé l'interleukine-1. Lorsque l'on a obtenu une fixation simultanée des Acm immobilisés sur la phase solide et des ACM marqués à la biotine, il s'est développé une forte couleur jaune après addition du réactif d'ELLMAN.
7. ESSAIS IMMUNOENZYMATIOUES DE DETECTION DE L'IL-1α ET DE L'IL-1β
Deux types différents d'EIA pour les interleukines-1α et 1β ont été développés.
Des anticorps monoclonaux provenant de surnageants de culture ou de fluides ascitiques ont tout d'abord été testés dans un immuno-essai par compétition en utilisant des conjugués IL-1-AChE comme traceurs. Dans une deuxième étape, ont été développés des essais immunométriques impliquant l'utilisation simultanée d'Acm anti-interleukines, soit revêtant une phase solide, soit marqués par de l'AChE. Tous les réactifs utilisés dans l'immuno-essai ont été dilués dans le tampon EIA dont il a été question plus haut, dont la composition est la suivante : phosphate 0,1 M, pH 7,6, contenant 0,4 M NaCl, 10-3 M EDTA, 0,1 % BSA et 0,01 % azide de sodium. Toutes les concentrations mentionnées dans les immuno-essais se réfèrent à la concentration des réactifs dans le "volume initial" (50 μl pour l'essai par compétition, 100 μl pour l'essai immunométrique) avant mélange avec les autres réactifs.
- Immuno-essais par compétition utilisant des conjugués IL-1-AChE.
Des immuno-essais par compétition classiques utilisant des Acm comme premiers anticorps et des conjugués IL-1-AChE comme traceurs, ont été réalisés comme décrit dans la Littérature en relation avec les haptènes ou les antigènes. Ces essais ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits, revêtues d'un second anticorps constitué par des IgG de lapin anti-souris. Ce second anticorps en phase solide assure une séparation entre les fractions liées et les fractions libres du traceur pendant le cours de l'immunoréaction spécifique. Le volume total de la réaction était de 150 μl, chaque composant (traceur, Acm et IL-1 recombinante) a été ajouté en un volume de 50 μl . Les conjugués IL-1-AChE ont été utilisés à une concentration de 1 unité ELLMAN/ml. Les dilutions de travail des Acm ont été déterminées au préalable en réalisant des courbes de dilution d'anticorps à partir de surnageants de culture ou de fluides ascitiques. La sensibilité des tests a été caractérisée par la dose d'IL-1 soit qui induit une diminution de 50 % de la fixation observée en l'absence de compétiteur (B/Bo = 50 %) , soit qui induit une diminution statistiquement significative de la fixation observée en l'absence de compétiteur (Bo), soit Bo-3 déviations standard (taux de confiance 99 %).
- Essais immunométriques utilisant des conjugués Acm¬
AChE.
Des essais immunométriques ont été réalisés dans des plaques de microtitration comportant 96 puits, revêtues de l'un des anticorps monoclonaux. Le revêtement a été réalisé exactement comme décrit plus haut pour le second anticorps en phase solide. En bref, les puits des plaques de microtitration ont été remplis de 200 μl d'une solution à 10 μg/ml d'Acm dissous dans du tampon phosphate 5 x 10-2M, mH 7,4. Après avoir laissé la réaction se produire pendant une nuit à la température ambiante, les plaques ont été soigneusement lavées avec du tampon phosphate 10-2, pH 7,4 contenant du TWEEN 20, 0,05 %. La phase solide a alors été saturée en ajoutant dans chaque puits 300 μl de tampon EIA pendant au moins 4 heures à la température ambiante. Les plaques ont été conservées à 4° C dans ce tampon de saturation jusqu'à ce qu'elles soient utilisées. Lorsqu'elles ont été conservées dans ces conditions, il n'a pas été observé de modifications de leurs propriétés de fixation pendant au moins une période de quatre mois. Les essais immunométriques ont été réalisés en utilisant deux processus différents.
Le premier protocole (dénommé "Protocole simultané") a consisté à ajouter 100 μl d' interleukine-1 en solution (introduite sous la forme d'un standard recombinant ou d'un échantillon) dans des puits de plaques de microtitration, conjointement avec 100 μl de conjugués Acm-AChE (habituellement à une concentration de 10 unités ELLMAN/ml). Dans cette méthode, les deux anticorps (l'anticorps en phase solide et l'anticorps marqué par l'AChE) réagissent simultanément avec l'interleukine- 1. Selon la nature de l'échantillon à tester, on dissout 1'interleukine-1 recombinante standard dans le diluant correspondant, c'est-à-dire du milieu de culture, du plasma ou du sérum. Dans toute la mesure du possible, tous les diluants utilisés doivent être dépourvus d' interleukine-1α ou 1β. Pour le plasma ou le sérum, ceci est possible en sélectionnant les fluides individuels pour lesquels les tests immunométriques ne pourraient pas détecter de quantités significatives d'IL-1α ou d'IL-1β. Lorsque les EIA sont réalisés dans ces milieux, on utilise de l'immunoglobuline de souris (introduite à une dilution de 1/20 dans de l'ascite d'ERLICH) ajoutée pendant l'immuno réaction pour neutraliser les anticorps humains anti-souris présents dans ces fluides. Une fixation non spécifique a été évaluée dans des puits séparés dans lesquels 100 μl de tampon ou d'un diluant approprié avaient été ajoutés à la place de l'interleukine-1 recombinante. La réaction a alors eu lieu pendant des périodes de temps variables à différentes températures, sous agitation ou sans agitation. A la fin de cette étape d'immunm-réaction, les plaques ont été soigneusement lavées en utilisant un tampon phosphate-Tween. L'activité
AChE fixée à la phase solide a été déterminée par addition de 200 μl de réactif d'ELLMAN.
Un second protocole (dénommé "Protocole séquentiel") consiste à faire réagir l'interleukine-1 et le conjugué Acm-AChE séparément. Au cours d'une première période d'incubation, 200 μl d'interleukine-1 (introduite sous forme d'étalon ou d'échantillon) dissous dans du tampon EIA ou tout autre diluant approprié (milieu de culture, plasma, etc...) réagissent avec la phase solide. A la fin de cette première incubation, les plaques sont lavées avant d'ajouter 200 μl de conjugué Acm-AChE (habituellement à 10 unités ELLMANN/ml) dissous dans du tampon EIA. Après une seconde période de réaction, les plaques sont lavées à nouveau et l'activité AChE est révélée comme décrit plus haut.
Des "profils d'imprécision" de courbes standard ont été établis en réalisant toutes les mesures (fixation non spécifique aussi bien que mesures standards) à huit reprises. Pour chaque dose, la précision a été exprimée en termes de coefficient de variation (CV %) et a été mise sous forme de courbe en fonction du logarithme de la dose.
La sensibilité des essais immunométriques a été caractérisée par leur "concentration détectable minimum" (MDC) qui correspond à la concentration d' IL-1 produisant une augmentation statistiquement significative de la fixation observée en l'absence d'IL-1 recombinante standard. La MDC a été calculée comme étant la dose d'IL- 1 qui correspond à la fixation non spécifique + 3 déviations standard (avec un taux de confiance de 99 %).
8. TESTS FPLC
Une substance immuno-réactive détectée par des essais immunométriques dans des milieux biologiques (surnageant de culture, plasma) a été caractérisée en fractionnant les échantillons par chromatographie sur tamis moléculaire à l'aide d'un équipement FPLC et d'une colonne de Superose 12 équilibrée par du tampon EIA. On a injecté de l'IL-1 recombinante étalon et des échantillons sous un volume de 500 μl et à un débit de 24 ml/heure puis on a collecté des fractions de 0,8 ml. A la fin de la chromatographie, on a testé 100 μl de chacune des fractions en mettant en oeuvre le test IL-1α et/ou IL-1β comme décrit plus haut.
9. PREPARATION D'ECHANTILLONS DESTINES A ETRE SOUMIS A
DES EIA POUR LA DETECTION D' IL-1α ET D'IL-1β
- Surnageants de cellules elutriées.
Des leucocytes mononucléaires (lymphocytes et monocytes) et polymorphonucléaires (neutrophiles) de sang périphérique ont été obtenus par centrifugation sur du FICOLLPAQUE (PHARMACIA FINE CHEMICALS) et ont été ensuite soumis à une élutriation centrifuge à contre-courant pour permettre l'obtention de lymphocytes, de monocytes et de neutrophiles purs. Pour ce faire, on a injecté des celIules mononucléaires ou polymorphonucléaires dans une chambre de séparation d'un rotor élutriateur de BECKMAN
(JE-6), à un débit de 8 ou 20 ml/minute respectivement, à une vitesse constante du rotor de 2 500 tours/minute. Le tampon d' élutriation était constitué par une solution saturée de PBS de Dulbecco supplémentée par 0,25 % de BSA et 2mM d'EDTA. Les plaquettes ont été lavées après une demi-heure d' élutriation, au débit d'injection. Le fractionnement de leucocytes mononucléaires a été réalisé comme suit : des lymphocytes purs ont été obtenus en augmentant le débit de 8 à 20 ml/min. 50 ml de milieu ont été collectés à chaque étape, centrifugés (350 x g, 10 min.) et le culot de cellules a été lavé une fois dans une solution isotonique et finalement remis en suspension dans le milieu d'incubation (RPMI 1640 avec de la L-glu- tamine, 7,5 % de sérum bovin foetal et penstrep) . Des fractions de lymphocytes purs (monocytes, < 0,5 %) ou des fractions de monocytes enrichis (lymphocytes, < 20%) ont été collectées et ajustées à 10 x 106 ou 1 x 106 cellules/ml, respectivement. Les neutrophiles ont été débarrassés de monocytes contaminants en augmentant le débit de 20 à 25 ml/min en utilisant des paliers de 0,25 ml/min et en collectant des fractions de 5 ml. Des neutrophiles purs ont alors été collectés en une fraction unique en arrêtant le rotor. La fraction de neutrophiles a été lavée une fois dans une solution isotonique et finalement remise en suspension dans le milieu d'incubation à 20 x 106 cellules/ml. Des incubations ont été réalisées dans des tubes de culture en propylène de 12 x 75 mm à 37° C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Des comptages de cellules différentiels de leucocytes ont été réalisés par :
1) cytométrie en flux en utilisant des caractéristiques de dispersion de lumière à angle aigu et à angle droit,
2) par coloration non spécifique à l'estérase et au colorant de WRIGHT,
3) par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine et
4) par analyse au microscope en contraste de phases, pour la contamination des plaquettes.
La viabilité des cellules a été établie en routine à l'aide du test d'exclusion au bleu trypan dans chaque expérience et a été supérieure à 95 %. Des cellules ont été cultivées aussi bien en l'absence qu'en présence de 5 μg/ml de lipopolysaccharide (LPS) ; les cultures cellulaires ont été réalisées en présence de 0,1 μm d'indométhacine. A différents intervalles de temps, les milieux de culture ont été centrifugés (600 x g, 10 min., 4° C) et immédiatement congelés à - 20° C jusqu'à la mesure de l'IL-1α et de l'IL-1β en utilisant des EIA sélectifs. EXEMPLE 2 : Caractérisation d'anticorps monoclonaux anti-
IL-1 et réalisation d'essais immunométriques
Pour chaque interleukine, la souris dont le sérum présentait le titre le plus élevé dans les essais immunoenzymatiques, a été sélectionnée pour la fusion. Les cellules de rate correspondantes ont été fusionnées avec des cellules de myélome de NSI comme décrit plus haut. Une semaine après la fusion, environ 500 puits présentaient des hybridomes qui se multipliaient activement pour les deux interleukines. La présence d'anticorps de souris anti-interleukine a été vérifiée dans tous les surnageants de culture en testant leur capacité à fixer le conjugué correspondant IL-1-AChE. Dans un criblage primaire, 90 et 116 surnageants de culture fortement positifs ont été détectés respectivement pour l'IL-1α et l'IL-1β. Les hybridomes correspondants ont été sous-clo- nés par des dilutions limitantes pour obtenir une lignée cellulaire sécrétant des anticorps, stable, unique pour chaque culture. Finalement, 36 et 11 lignées cellulaires ont été stabilisées respectivement pour l' IL-1α et l'IL- 1β. Tous les clones ont été caractérisés par un nombre précédé par la lettre α ou β selon l'interleukine contre laquelle ils avaient été dirigés. Ils ont été cultivés en tant que tumeurs ascitiques et les anticorps monoclonaux ont été purifiés à partir de fluide ascitique par précipitation par de l'acide caprylique et du sulfate d' ammonium. Les isotypes ont été déterminés à partir du fluide ascitique par la technique de double diffusion d'OUCHTERLONY. Tous les Acm étaient des IgG possédant une chaîne légère K, la sous-classe IgG1 étant de loin la plus commune (cf. Tableaux I et II ci-après).
Figure imgf000029_0001
Les tests de compatibilité de fixation ont été réalisés comme décrit plus haut dans l'exemple 1. Les cercles pleins indiquent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués. Pour clarifier la présentation, les Acm présentant la même définition ont été groupés en trois catégories (A à C). Tous les Acm sont de la sous-classe IgG1 sauf l'Acm 100 (groupe A) et les Acm 50 et 176 (groupe B) qui sont des IgG2.
TABLEAU II : RESULTATS DES TESTS DE COMPATIBILITE DE FIXATION POUR LES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI IL- 1β.
Figure imgf000030_0001
Les tests de compatibilité de fixation ont été réalisés comme décrit plus haut dans l'exemple 1. Les cercles pleins indiquent des couples pour lesquels on a observé une fixation simultanée des Acm immobilisés en phase solide et des Acm marqués. Pour clarifier la présentation, les Acm présentant le même type de fixation ont été groupés en quatre catégories (A à D). La sousclasse d'IgG de chaque Acm est mentionnée dans la dernière colonne. Des surnageants de culture aussi bien que des fluides ascitiques ont été utilisés dans des essais immunoenzymatiques par compétition impliquant des conjugués IL-1-AChE comme traceurs. Dans 1a plupart des cas (sauf en ce qui concerne les clones β26 et β54), des courbes standard ont pu être établies en utilisant l'IL-1α et l'IL-1β recombinantes comme étalons. Lorsqu'elle est définie en termes de B/Bg = 50 %, la sensibilité de ces essais est comprise entre 4 et 100 ng/ml. Dans les meilleurs cas, la concentration minimale détectable de 1 ng/ml a pu être calculée. Tous les Acm se sont avérés être très spécifiques de l'interleukine contre laquelle ils avaient été dirigés car on n'a pu mesurer qu'une réactivité croisée inexistante ou très faible entre l'IL-1α et l'IL-1β. On trouvera à titre indicatif dans le tableau III qui va suivre, les caractéristiques de quelques-uns de ces essais par compétition pour l'IL-1α, ainsi que les résultats obtenus avec des anticorps polyclonaux de mouton ou de lapin.
TABLEAU III : PRINCIPALES CARACTERISTIQUES DES
ESSAIS IMMUNOENZYMATIQUES PAR COMPETITION POUR L' IL-1α EN UTILISANT SOIT DES ANTICORPS POLYCLONAUX SOIT DES ANTICORPS MONOCLONAUX ET DES CONJUGUES D' IL-1a-AChE.
Figure imgf000032_0001
* B/Bo : 50 % correspond à la dose qui induit une diminution de 50 % de la fixation du traceur observée en l'absence de compétiteur.
La présente invention a pour l'un de ses buts essentiels de développer des essais immunométriques en deux sites aussi bien pour l'IL-1α que pour l'IL-1β, en sorte qu' il convient de déterminer quelles sont les paires d'Acm qui pourraient se fixer simultanément à chaque interleukine. Ces études de complémentarité de fixation ont été réalisées à l'aide de tests immunométriques dans lesquels l'un des Acm était immobilisé sur la phase solide tandis que l'autre était marqué par des molécules de biotine. A ce stade, le marquage par la biotine a été choisi car il s'agit d'une méthode tout à fait simple qui permet le marquage d'un grand nombre d'Acm
(plus de 40) en quelques minutes. En outre, l'utilisation subséquente d'un mélange d'avidine et d'AChE marquée par la biotine permet une détection sensible d'anticorps biotinylés immobilisés sur la phase solide.
Les tableaux I et II ci-dessus présentent les résultats de ces tests complémentaires pour l'IL-1α et l'IL-1β respectivement. Dans le cas de l'IL-1α, on voit qu'il existe trois groupes d'Acm qui reconnaissent des epitopes qui se trouvent dans trois régions différentes des molécules d'IL-1α. Ces groupes, qui ont été désignés par A, B et C, contiennent respectivement 10, 25 et 1 anticorps monoclonaux. Tous les Acm d'un groupe présentent une fixation compatible avec tous les Acm des deux autres groupes, tandis qu'ils ne se fixent pas simultanément entre eux ou avec des Acm du même groupe. Dans le cas de l ' IL-1β, la situation est moins claire . En fait , on observe quatre groupes différents. Dans les deux premiers groupes (dénommés A et B, contenant respectivement 4 et 3 Acm) on observe un comportement logique, analogue à celui observé pour l'IL-1α (cf. Tableau II). Le troisième groupe (C) contient deux Acm qui sont compatibles uniquement avec un Acm des groupes A et B (β 28 et β 36 respectivement). Enfin, le groupe D contient 2 Acm qui ne permettent l'immobilisation d'aucun des autres Acm en phase solide. Après avoir déterminé tous les couples possibles d'Acm présentant une fixation compatible, il s'agit à présent de sélectionner pour chaque interleukine le couple présentant les propriétés optimales en vue de développer un essai immunométrique sensible, spécifique et fiable. Cette sélection doit être réalisée en utilisant des conjugués covalents Acm-AChE (et non des Acm marqués à la biotine) car ils permettent une détection plus sensible des interleukines. Dans le cas de l'IL-1β, comme il n'existait que 29 possibilités différentes, cette sélection a été facile à réaliser et il a été pro posé de choisir de préparer les 9 conjugués Acm-AChE correspondants. Ceci s'est avéré cependant plus difficile dans le cas de l'IL-1α car la préparation de 36 conjugués Acm-AChE aussi bien que la vérification des 570 possibilités différentes existantes représente un travail considérable. C'est la raison pour laquelle il a été procédé différemment : au cours d'une première étape, quelques conjugués Acm-AChE ont été préparés et ont été ensuite testés contre toutes les phases solides pertinentes. Au vu des résultats correspondants, les Acm qui ont procuré les résultats les meilleurs (c'est-à-dire la fixation la plus importante de conjugués Acm-AChe pour une dose donnée d' interleukine) ont été marqués et on a poursuivi les tests avec eux en utilisant les Acm immobilisés corres- pondants. Ainsi, les anticorps α5, α29, α100, α147 (groupe A), α176, α39 (groupe B), et α101 (groupe C) ont été sucessivement marqués et testés.
Ce processus a permis de mettre en évidence un petit nombre de couples qui permettent une détermination plus sensible de chaque IL-1. Pour l'IL-1α, les résultats les meilleurs ont été obtenus en utilisant soit αlOl (en tant que phase solide ou traceur) ou des traceurs du groupe A avec des phases solides du groupe B. Dans le cas de l'IL-1β, un couple composé de β79 comme phase solide et de β70-AChE comme traceur s'est avéré significativement supérieur à tous les autres couples. Une sélection finale du couple optimal a été réalisée en tenant compte non seulement de l'intensité du signal mais également d'autres critères incluant l'absence de réactivité croisée avec d'autres interleukines ou des substances apparentées, un taux de fixation non spécifique, une influence non spécifique exercée par les milieux biologiques (plasma ou sérum). Les critères de spécificité ne sont pas essentiels car tous les couples testés présentent une réactivité croisée très faible avec les autres interleukines (IL-1α ou IL-1β et IL-2). Toutefois, la se lection de couples présentant une faible fixation non spécifique est importante car ceci a une influence critique sur la sensibilité du test. De même, il est nécessaire de minimiser les effets non spécifiques dûs aux milieux biologiques afin de renforcer la validité des mesures réalisées dans ces milieux. Enfin, les couples suivants ont été sélectionnés : α185 en phase solide + α29-AChE pour IL-1α et β79 en phase solide + β70-AChE pour IL-1β. Dans le cas de l'IL-1β, ce choix a été réalise essentiellement parce que ce couple est caractérisé par une fixation non spécifique très faible et est très peu sensible aux effets non spécifiques. Cette dernière caractéristique est représentée à la figure 1 annexée et le tableau IV résume les principales caractéristiques des tests de détection d'IL-1α et d' IL-1β dans le cas d'une incubation d'une nuit à 4° C et d'un processus simultané. Les deux essais semblent très sensibles car des concentrations minimales détectables inférieures à 4 pg/ml ont pu être calculées pour chaque interleukine en utilisant une période de 30 minutes pour la mesure enzymatique. Une sensibilité accrue est observée lorsque la réaction enzymatique (étape de révélation) dure plus longtemps. En pareil cas, des concentrations minimales détectables inférieures à 2 pg/ml peuvent être obtenues (cf. tableau IV ci-après).
Figure imgf000036_0001
L'évolution des courbes étalons en fonction du temps dévolue à la mesure enzymatique est représentée à la figure 2 annexée.
Cette augmentation de sensibilité est accompagnée d'une augmentation de la précision de la mesure dans la partie inférieure de la courbe étalon, comme le montre la figure 4 qui présente l'évolution des "profils d'imprécision" en fonction du temps. Les meilleurs résultats (en termes de sensibilité) ont été obtenus en utilisant une immuno-réaction pendant une nuit à + 4º C ; toutefois, des courbes étalon excellentes ont été obtenues en utilisant des périodes de réaction de plus courte durée (de 3 à 5 heures à + 4°C). Dans tous les cas, on a observé des concentrations minimales détectables infé- rieures à 10 pg/ml. La réalisation des essais à la température ambiante ou à 37° C n'a eu aucune incidence sur leurs résultats.
EXEMPLE 3 : Mesure de l'IL-1a et de l'IL-1b dans des milieux de culture.
La détermination des deux interleukines dans les surnageants de cultures stimulées a été réalisée à l'aide de courbes étalons. Il y a lieu d'observer que la présence de sérum de veau foetal 10 % dans le milieu de culture a induit une diminution significative de la fixation non spécifique sans altérer la pente des courbes étalons.
Ces tests ont révélé que les essais permettent effectivement de détecter des substances immuno-réactives IL-1-like dans les surnageants de cultures, l'apparition de cette immuno-réactivité étant en relation avec la stimulation des cellules. Un exemple typique est présenté à la figure 4 annexée dans laquelle on a dessiné, en fonction du temps, les variations des concentrations d' IL-1α et d' IL-1β dans les supernageants de leucocytes elutriés humains (monocytes, lymphocytes ou neutrophiles) stimulés par 5 μg/ml de lipopolysaccharide. Pour confirmer la validité des mesures effectuées, les mêmes échantillons ont été testés à l'aide d'un bio-essai basé sur la mesure de la libération de PGE2 par des fibroblastes stimulés aussi bien par l'IL-1α que par l'IL-1β. Les courbes étalons correspondantes sont présentées à la figure 5 annexée. Les résultats obtenus, représentés à la figure 6, confirment qualitativement les résultats des mesures immunométriques, ce qui démontre la spécificité des immuno-essais.
L'identité entre la substance détectée dans les surnageants de culture (ou les extraits intracellulaires de cellules) et l'IL-1 recombinante utilisée pour établir les courbes-étalons est confirmée par trois types d'expérimentations de contrôle. Le premier est représenté par les dilutions d'échantillons dans du milieu de culture, lesquelles ont donné des courbes de dilution parallèles aux courbes-étalons. C est ce que montre le tableau V ci-après, qui présente les résultats de deux différents tests relatifs à l'IL-1α et à l'IL-1β, réalisés à différentes dilutions. Des résultats similaires ont été obtenus avec tous les échantillons testés.
TABLEAU V : DEMONSTRATION DU PARALLELISME ENTRE LA COURBE ETALON ET LA COURBE DE DILUTION DES ECHANTILLONS.
Figure imgf000038_0001
Les échantillons A et B ont été dilués comme indiqué dans le tableau V et testés pour y détecter l'IL- la et l'IL-1β par EIA. Les dilutions aussi bien que la courbe étalon ont été réalisées dans du milieu de culture (RPMI + 10 % de sérum de veau foetal). Les données brutes ont été multipliées par le facteur de dilution avant d'être énumérées dans le Tableau, afin de faire apparaître clairement le parallélisme entre la courbe-étalon et les courbes de dilution des échantillons.
Echantillon A : surnageant de macrophages alvéolaires dans une culture stimulée par TNFα.
Echantillon B : extrait intracellulaire de macrophages alvéolaires en culture.
Ces résultats sont également confirmés par des expériences de récupération qui démontrent que des quantités connues d'IL-1 recombinante introduites dans des échantillons peuvent être effectivement mesurées. Pendant la totalité des expérimentations réalisées dans des milieux de culture, le taux de récupération était compris entre 86 % et 93 %.
La troisième expérimentation a consisté en l'analyse de surnageant de culture après fractionnement par chromatographie sur tamis moléculaire ; cette analyse montre que la substance immuno-réactive est éluée sous la forme d'un pic unique homogène, comme déjà indiqué plus haut, qui correspond exactement au pic observé avec les interleukines recombinantes. C'est ce que montre la figure 7 où sont présentés différents profils chromatographiques obtenus pour des surnageants de macrophages alvéolaires stimulés, aussi bien dans le test de détection de l'IL-1α que dans le test de détection de l'IL-1β. Des résultats similaires ont été observés avec d'autres surnageants de culture ou avec des extraits intracellulaires. Prises dans leur ensemble, toutes ces données indiquent nettement que les deux tests permettent effectivement une détermination quantitative des interleukines 1 dans ces milieux. EXEMPLE 4 : Mesure de l'IL-1α et de l'iL-1β dans le plasma et le sérum.
En utilisant ces EIA spécifiques, des tests de détermination des taux d' IL-1α et d' IL-1β dans le plasma ou le sérum de donneurs sains ou de patients souffrant de troubles rhumatoïdes, ont été réalisés. Ces mesures ont été effectuées, comme indiqué plus haut, en présence d' IgG de souris afin de neutraliser les anticorps IgG humains anti-souris éventuellement présents dans ces fluides. Cette précaution est tout à fait nécessaire car d' autres expérimentations ont montré que les mesures réalisées en l'absence d'IgG murines pourraient conduire à une surestimation importante des taux d'IL-1, spécialement dans les fluides de patients atteints de troubles rhumatoïdes.
Des tests réalisés dans le plasma ou le sérum de volontaires sains ont révélé qu' il est possible de sélectionner des fluides ne contenant pas de quantités détectables d' IL-1α ou d'IL-1β. Ces plasmas ou ces sérums réunis peuvent être utilisés comme diluants pour établir des courbes-étalons appropriées. L'établissement de ces courbes a permis de mesurer les taux d'IL-1 dans ces fluides et de détecter des concentrations d' interleukines comprises entre 5 pg/ml et quelques ng/ml aussi bien chez des donneurs apparemment sains que chez des patients. Bien que les résultats représentés à la figure 6 qui donnent un profil typique obtenu avec un plasma ne soient pas satisfaisants puisque la substance immuno-réactive est éluée à un poids moléculaire de beaucoup supérieur à celui qui correspond à l'IL-1 recombinante (> 500 000) néanmoins, ces tests de détermination des IL-1 conviennent également aux dosages dans le plasma et le sérum. EXEMPLE 5 : Activité inhibitrice exercée par les anticorps conformes à l'invention à l'égard de l'activité biologique de l'IL-1 (activité neutralisante).
L'activité inhibitrice exercée par les anticorps monoclonaux anti-IL-1 conformes à l'invention, à l'égard de l'activité biologique de l'IL-1, a été mise en évidence à l'aide de deux séries de tests :
1. Les tests d'inhibition de l'induction du récepteur de l'IL-2.
De tels tests ont été décrits notamment par
KAYE et al., JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1984), 133. N° 3, pages 1339-1345.
- Principe :
Les cellules de JURKAT, par exemple, (lignée cellulaire issue d'un lymphome T humain) sécrètent de l'IL-2 quand elles sont stimulées par de l'IL-1α ou de l'IL-1β en présence de phytohémagglutine (PHA). Certains anticorps anti-IL-1α ou anti-IL-1β sont capables d'inhiber l'effet des IL-1 soit parce qu'ils reconnaissent le site impliqué dans la liaison avec le récepteur soit parce que la formation du complexe IL-1- anticorps perturbe le processus biologique.
- Procédure expérimentale :
Les anticorps anti-IL-1α ou IL-1β conformes à l'invention (10 μg/ml) sont incubés en présence d'IL-1α ou d'IL-1β (10 ng/ml) pendant 18 heures à 4°C. Un contrôle est effectué en incubant dans les mêmes conditions de l'IL-1α ou de l'IL-1β (10 ng/ml) sans anticorps.
On stimule ensuite les cellules JURKAT
(5.105 cellules/ml) en présence de PHA (0,8 μg/ml), par les différentes préparations ci-dessus pendant 24 h à 37°C, sous 5 % CO2. Dans les conditions des expériences, la concentration des IL-1 au moment de la stimulation est de 1 ng/ml. La concentration de l'IL-2 dans les surnageants de culture cellulaire est mesurée à l'aide d'un dosage immunométrique mis au point à la SPI dont le principe est identique à ceux développés pour les IL-1.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport à deux témoins, l'un est réalisé en absence d'IL-1 (PHA seul) et représente le 100 % d'inhibition, l'autre est réalisé en absence d'anticorps et représente le 0 % d'inhibition.
-
Figure imgf000042_0001
2. Les tests d'inhibition de la liaison des IL-1 aux récepteurs cellulaires, notamment aux cellules T.
Des tests de ce type sont décrits, notamment. dans :
- LOWENTHAL et al., J. EXP . MED. (1986), 164, page 1060, et
- SECKINGER et al., THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY (1987), 119, pages 1546-1549.
- Principe :
L'IL-1α agit sur des cellules par l'intermédiaire d'un récepteur membranaire avec lequel il se lie spécifiquement. On peut étudier la liaison de l'IL-1α marquée à l'iode 125. Les anticorps monoclonaux peuvent inhiber la liaison de l'IL-1α aux récepteurs s'ils reconnaissent la partie de la molécule d'IL-1α impliquée dans le complexe. En inhibant la liaison avec le récepteur ils inhibent aussi l'effet biologique.
- Protocole expérimental :
L' IL-1 marquée à l'iode 125 est incubé pendant une heure à 4°C avec les anticorps à une concentration de
200 ng/ml. A la fin de la réaction, le mélange est mis au contact des cellules EL4 (lignée cellulaire de Thymome murin) pendant 8 heures à + 4°C.
Les cellules sont ensuite lavées avec un tampon approprié et la radioactivité fixée est mesurée avec un compteur à scintillation solide (multigramma LKB). Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport à un témoin (100 % de liaison) pour lequel l'IL-1α marquée à l'iode 125 n'a pas été incubé avec un anticorps.
Figure imgf000044_0001
EXEMPLE 6 : Mise en évidence de la sensibilité des anticorps monoclonaux conformes à l'invention ; essai comparatif avec des tests utilisant les anticorps de l'Art antérieur.
L'Exemple 2 ci-dessus, montre que dans les réactions optimales des tests conformes à l'invention, les concentrations minimales détectables sont inférieures à 2 pg/ml (voir en particulier le Tableau IV).
1. Dosage par compétition : comparaison avec le test AMERSHAM de dosage de l'IL-1α :
Comme précisé dans l'exemple 1, la sensibilité des tests a été. caractérisée par la dose d'IL-1 qui induit une diminution statistiquement significative de la fixation observée en l'absence de compétiteur (Bo), soit
Bo-3 déviations standard (taux de confiance 99 %).
Un essai a été réalisé dans les conditions définies par AMERSHAM ; (dosage radioimmunologique, IL-1α marquée à l'iode 125) : on obtient la courbe comme visible à la figure 8, qui comprend en abscisse les concentrations d'IL-1α en pg/ml et en ordonnée, B/Bo en % et qui montre que la limite de détection est de l'ordre de 80 pg/ml. Ceci correspond donc à une sensibilité nettement inférieure à celle des tests conformes à l'invention, comme précisé ci-dessus.
2. Essai immunométrique : comparaison avec le test MEDGENIX.
Un essai a été réalisé dans les conditions définies par MEDGENIX (dosage immunoradiométrique : anticorps anti-IL-1β marqué à l'iode 125) : on obtient la courbe comme visible à la figure 9, qui comprend en abscisse les concentrations en IL-1β en pg/ml et en ordonnée la radioactivité liée (en cpm) et qui montre que la limite de détection est de l'ordre de 15 pg/ml. Comme précisé dans l'Exemple 1, la sensibilité des tests immunométriques est calculée comme étant la dose d'IL-1, qui correspond à la fixation non spécifique + 3 déviations standard (avec un taux de confiance de 99 %). Ceci correspond donc à une sensibilité nettement inférieure à celle des tests conformes à l'invention, comme précisé ci-dessus, qui est de l'ordre de 2 pg/ml.
Ces deux tests montrent bien que les anticorps monoclonaux conformes à l'invention qui présentent une constante de dissociation inférieures à 5.10-10 permettent de manière inattendue d' accroître la sensibilité des tests de dosage dans lesquels ils sont mis en oeuvre.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d' être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001

Claims

REVENDICATIONS
1.- Anticorps monoclonaux spécifiques des IL- 1α et 1β, qui résultent de l'immunisation de mammifères, notamment de rongeurs, et plus particulièrement de souris, par des IL-1α ou -1β selon le cas, qui reconnaissent spécifiquement les IL-1α naturelles ou recombinantes ou les IL-1β naturelles ou recombinantes qui ne présentent pratiquement pas de réaction croisée entre les deux IL-1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux ont une constante de dissociation inférieure à 5.10-10, en ce qu'ils se composent de plusieurs groupes qui reconnaissent des régions distinctes des IL-1α ou -1β et dont les anticorps de certains groupes sont aptes à se lier de façon compatible avec tous les anticorps des autres groupes, à savoir :
- les anticorps anti-IL-1α se composent de trois groupes (A, B et C) qui reconnaissent trois régions distinctes de l' interleukine-1α, tous les anticorps d'un groupe étant aptes à se lier de façon compatible avec tous ceux des deux autres groupes mais n'étant pas compatibles avec un autre anticorps du même groupe ;
- les anticorps anti-IL-1β se composent de quatre groupes dont les deux premiers (A et B) ont un comportement similaire à celui des anticorps anti-IL-1α, dont les anticorps du groupe C sont compatibles avec un seul anticorps de chacun des deux premiers groupes et dont les anticorps du quatrième groupe (D) sont incompatibles avec l'un quelconque des anticorps des trois premiers groupes, et ne se lient pas à l'IL-1β native recom- binante, reconnaissent une interleukine-1β modifiée, et réagissent avec un conjugué IL-1β-AChE ;
et en ce que lesdits anticorps anti-IL-1α et anti-IL-1β reconnaissent les conjugués IL-1α ou 1β/acétyl- cholinestérase (AChE).
2.- Conjugués d'acétylcholinestérase et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou -1β ou de fragments de ces anticorps, notamment de fragments Fab'.
3.- Procédé de production de fragments Fab' des anticorps monoclonaux anti-interleukine-1α ou -1β selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits anticorps monoclonaux sont traités par de la pepsine en milieu acide, pour obtenir des fragments F(ab')2 qui sont isolés par chromatographie sur tamis moléculaire, puis en ce que ces fragments F(ab')2 sont soumis à un processus de réduction ménagée, par un agent réducteur approprié tel, notamment, que la β-mercaptoéthylamine (βMEA), pour fournir un fragment Fab' qui est purifié par passage sur une colonne de chromatographie sur tamis moléculaire.
4.- Procédé de production de conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux entiers anti-IL-1α ou anti-IL- 1β et de conjugués d'AChE et de fragments d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α ou anti-IL-1β, notamment de fragments Fab' selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins un groupe thiol incorporé ou naturellement présent dans l'un des fragments, est couplé à au moins un groupe maleimido incorporé dans l'AChE, par l'intermédiaire d'un agent de couplage approprié tel que, notamment, un ester de N-hydroxy-succinimide.
5.- Test immunoenzymatique par compétition de détection de l'IL-1α et de l'IL-1β dans des surnageants de cultures cellulaires et dans des fluides biologiques, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal anti-IL-1α ou anti-IL-1β approprié, utilisé comme premier anticorps, et des IgG portées par un support approprié utilisées comme second anticorps, sont mis en contact avec des conjugués d' IL-1-AChE, qui jouent le rôle de traceurs, et de l'interleukine-1α ou -1β, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
6.- Test enzymo-immunométrique hautement spécifique et sensible, de détection de 1'IL-1α et de 1'IL- 1β dans des surnageants de cultures cellulaires et des fluides biologiques, caractérisé en ce que des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou anti-IL-1β portés par un support approprié sont mis en contact avec de l'IL-1α ou -1β et avec du conjugué Acm-AChE, après quoi l'activité AChE est révélée par tous moyens appropriés.
7.- Test selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'IL-1α ou -1β est ajoutée à l'anticorps simultanément avec le conjugué Acm-AChE et les deux anticorps monoclonaux réagissent simultanément avec l'IL-1α ou -1β.
8.- Test selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'IL-1α ou -1β est tout d'abord introduite et réagit avec l'anticorps fixé sur le support, puis le conjugué Acm-AChE est ensuite introduit et l'activité AChe est révélée par tous moyens appropriés.
9.- Kit pour la réalisation des tests immuno- enzymatiques par compétition selon la revendication 5, caractérisé en ce qu' il comprend :
. une série de plaques de microtitration revê- tues d'un anticorps constitué par des IgG de lapin antisouris ;
au moins un flacon contenant des doses appropriées d'anticorps monoclonal anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonal anti-IL-1β ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1α et d'AChE et/ou au moins un flacon contenant des conjugués d' IL-1β et d'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β.
10.- Kit pour la réalisation des tests immunométriques selon l'une quelconques des revendications 6 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend :
. une série de plaques de microtitration revêtues d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou d'anticorps monoclonaux anti-IL-1β ;
. au moins un flacon contenant des conjugués d'AChE et d'anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou 1β ;
. des quantités ou doses appropriées d'un substrat de révélation de l'AChE ;
. des quantités ou doses appropriées d'IL-1α et/ou d'IL-1β.
11.- Agents à visées thérapeutiques caractérisés en ce qu'ils sont constitués par, ou comprennent en tant que constituants actifs, des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β et/ou leurs fragments, seuls ou conjugués ou hybrides ou associés avec d'autres substances.
12.- Agents de diagnostic aptes à être mis en oeuvre pour le diagnostic in vivo, caractérisés en ce qu'ils comprennent des anticorps anti-IL-1α et/ou des anticorps anti-IL-1β ou leurs fragments, associés à un antigène et/ou à un haptène et/ou à un autre anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou marqués par des marqueurs stables ou radioactifs.
13.- Hybridomes mis en oeuvre pour la préparation des anticorps monoclonaux anti-IL-1α et anti-IL-1β selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, déposés auprès de la COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) tenue par l'INSTITUT PASTEUR, en date du 8 Décembre 1988 et identifiés dans cette Collection sous les N° 1-823, 1-824, 1-825, 1-826, 1-827, 1-828, I- 829.
PCT/FR1989/000634 1988-12-08 1989-12-08 ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α et 1β ET EN THERAPEUTIQUE WO1990006371A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE199090900216T DE399024T1 (de) 1988-12-08 1989-12-08 Monoklonale antikoerper gegen interleukin-1 alpha und beta, deren herstellung und verwendung zum nachweis von interleukinen und fuer therapeutische zwecke.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR88/16165 1988-12-08
FR8816165A FR2640146B1 (fr) 1988-12-08 1988-12-08 Anticorps monoclonaux anti-interleukines 1(alpha) et 1(beta), leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines 1(alpha) et 1(beta) et en therapeutique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1990006371A1 true WO1990006371A1 (fr) 1990-06-14

Family

ID=9372733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1989/000634 WO1990006371A1 (fr) 1988-12-08 1989-12-08 ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α et 1β ET EN THERAPEUTIQUE

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0399024A1 (fr)
JP (1) JPH04503600A (fr)
CA (1) CA2004935A1 (fr)
DE (1) DE399024T1 (fr)
ES (1) ES2038571T1 (fr)
FR (1) FR2640146B1 (fr)
WO (1) WO1990006371A1 (fr)

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992001472A1 (fr) * 1990-07-19 1992-02-06 Celltech Limited Immunoglobuline anti-cytokines polyvalente
WO1995014780A3 (fr) * 1993-11-23 1995-06-22 Schering Corp Anticorps monoclonaux humains diriges contre des cytokines humaines et procedes de production et d'utilisation de ces anticorps
US5959085A (en) * 1993-11-23 1999-09-28 Schering Corporation Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
WO2001053353A3 (fr) * 2000-01-21 2002-04-04 Novartis Ag Anticorps anti-interleukine 1$g(b) humain
EP1992636A2 (fr) 1999-11-12 2008-11-19 Amgen Inc. Procédé pour la correction d'un mauvais repliement de bisulfure dans les molécules Fc
EP2002846A2 (fr) 1996-12-06 2008-12-17 Amgen Inc. Thérapie combinée utilisant un inhibiteur IL-1 pour traiter les maladies liées au IL-1
US7566772B2 (en) 2005-01-26 2009-07-28 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1β
EP2087908A1 (fr) 2001-06-26 2009-08-12 Amgen, Inc. Anticorps opgl
EP2213685A1 (fr) 2002-09-06 2010-08-04 Amgen Inc. Anticorps monoclonal anti-IL-1R1 thérapeutique
US7993878B2 (en) 2000-08-22 2011-08-09 Novartis Ag Antibodies to human IL-1β
EP2366715A2 (fr) 2005-11-14 2011-09-21 Amgen Inc. Molécules chimère d'anticorps anti-RANKL et de PTH/PTHRP
US8034337B2 (en) 2008-05-30 2011-10-11 Xbiotech, Inc. Interleukin-1α antibodies
US8187817B2 (en) 2005-08-02 2012-05-29 Xbiotech, Inc. Diagnosis, treatment, and prevention of vascular disorders using IL-1 autoantibodies
US8242074B2 (en) 2008-09-12 2012-08-14 Xbiotech, Inc. Modulation of the amount or function of pathogenic CD14+CD16+ monocytes
US9545441B2 (en) 2012-09-18 2017-01-17 Xbiotech, Inc. Treatment of diabetes
US9809649B2 (en) 2011-09-23 2017-11-07 Xbiotech, Inc. Cachexia treatment
US10041044B2 (en) 2016-07-29 2018-08-07 Trustees Of Boston University Age-associated clonal hematopoiesis accelerates cardio-metabolic disease development
US10294296B2 (en) 2010-08-23 2019-05-21 Xbiotech, Inc. Treatment for neoplastic diseases
WO2020035482A1 (fr) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combinaison d'interleukine 2 et d'un inhibiteur de l'interleukine 1, conjugués et utilisations thérapeutiques de celle-ci
US11191831B2 (en) 2011-04-01 2021-12-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of psychiatric conditions
US11225517B2 (en) 2017-02-16 2022-01-18 Janssen Biotech, Inc. Treatment of hidradenitis suppurativa
US11390672B2 (en) 2010-06-18 2022-07-19 Janssen Biotech, Inc. Arthritis treatment

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6456015B2 (ja) * 2013-07-19 2019-01-23 国立大学法人三重大学 閉塞性動脈硬化症モデル動物、るい痩研究用モデル動物、及び全身性アミロイドーシスモデル動物としての非ヒト哺乳動物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0245052A2 (fr) * 1986-05-01 1987-11-11 Immunex Corporation Détection d'inflammation et anticorps à cet effet
EP0267611A2 (fr) * 1986-11-13 1988-05-18 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Anticorps contre l'interleukine-1

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6291197A (ja) * 1985-10-17 1987-04-25 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 抗ヒトインタ−ロイキン１抗体，その製法及びその使用法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0245052A2 (fr) * 1986-05-01 1987-11-11 Immunex Corporation Détection d'inflammation et anticorps à cet effet
EP0267611A2 (fr) * 1986-11-13 1988-05-18 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Anticorps contre l'interleukine-1

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Analytical Biochemistry, Volume 173, 1988, Academic Press, Inc., D. CARUELLE et al.: "Development and Testing of Radio and Enzyme Immunoassays for Acidic Fibroblast Growth Factor (aFGF)", pages 328-339 *
Analytical Letters, Volume 21, No. 2, 1988, Marcel Dekker, Inc., K. TANAKA et al.: "Demonstration and Measurement of Human Interleukin-1alfa (hIL-1alfa) and Interleukin-1beta (hIL-1beta) in Vitro and in Vivo by Sensitive Enzyme Immunoassay", pages 169-181 *
Biotechniques, Volume 5, No. 7, 1987, E.W. GAFFNEY et al.: "Enzyme Linked Immunoassay with Monoclonal Antibody for Human Interleukin-1beta", pages 652-657 *
European Journal of Immunology, Volume 17, 1987, VCH Verlagsgesellschaft mbH, (Weinheim, DE), K. TANAKA et al.: "In Vitro Production of Human Interleukin 1alfa and Interleukin 1beta by Peripheral Blood Mononuclear Cells Examined by Sensitive Sandwich Enzyme Immunoassay", pages 1527-1530 *
Jounral of Nuclear Medicine, Volume 26, No. 5, Mai 1985, A.M. KEENAN et al.: "Monoclonal Antibodies in Nuclear Medicine", pages 531-537 *
Journal of Immunological Methods, Volume 123, 1989, Elsevier Science Publishers B.V,, (Biomedical Division)", J. GRASSI et al.: "Production of Monoclonal Antibodies Against Interleukin-1alfa and -1beta", pages 193-210 *
The Journal of Immunology, Volume 138, No. 12, 15 Juin 1987, The American Association of Immunologists", (US), J.S. KENNEDY et al.: "Monoclonal Antibodies to Human Recombinant Interleukin 1 (IL 1)beta: Quantitation of IL 1beta and Inhibition of Biological Acitivity", pages 4236-4242 *
The Journal of Immunology, Volume 138, No. 6, 15 Mars 1987, The American Association of Immunologists, (US), T. KASAHARA et al.: "Preparation and Characterization of Polyclonal and Monoclonal Antibodies Against Human Interleukin 1alfa (IL 1alfa)", pages 1804-1812 *

Cited By (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992001472A1 (fr) * 1990-07-19 1992-02-06 Celltech Limited Immunoglobuline anti-cytokines polyvalente
GB2261666A (en) * 1990-07-19 1993-05-26 Celltech Ltd Multivalent anti-cytokine immunoglobulins
GB2261666B (en) * 1990-07-19 1994-07-27 Celltech Ltd Multivalent anti-cytokine immunoglobulins
WO1995014780A3 (fr) * 1993-11-23 1995-06-22 Schering Corp Anticorps monoclonaux humains diriges contre des cytokines humaines et procedes de production et d'utilisation de ces anticorps
EP0659766A1 (fr) * 1993-11-23 1995-06-28 Schering-Plough Anticorps monoclonaux humains contre des cytokines humains et méthode de fabrication de tels anticorps
US5959085A (en) * 1993-11-23 1999-09-28 Schering Corporation Human monoclonal antibodies against human cytokines and methods of making and using such antibodies
EP2002846A2 (fr) 1996-12-06 2008-12-17 Amgen Inc. Thérapie combinée utilisant un inhibiteur IL-1 pour traiter les maladies liées au IL-1
EP1992636A2 (fr) 1999-11-12 2008-11-19 Amgen Inc. Procédé pour la correction d'un mauvais repliement de bisulfure dans les molécules Fc
WO2001053353A3 (fr) * 2000-01-21 2002-04-04 Novartis Ag Anticorps anti-interleukine 1$g(b) humain
US7491392B2 (en) 2000-01-21 2009-02-17 Novartis Ag Antibodies to human IL-1β
CZ302738B6 (cs) * 2000-01-21 2011-10-12 Novartis Ag Protilátka proti IL-1beta tvorená molekulou vázající IL-1beta, tato molekula pro použití jako lécivo, použití této molekuly pro výrobu léciva, odpovídající DNA konstrukty a expresní vektor, zpusob prípravy uvedené molekuly a farmaceutická kompozice o
US7993878B2 (en) 2000-08-22 2011-08-09 Novartis Ag Antibodies to human IL-1β
US8273350B2 (en) 2000-08-22 2012-09-25 Novartis Ag Antibodies to human IL-1β
EP2087908A1 (fr) 2001-06-26 2009-08-12 Amgen, Inc. Anticorps opgl
EP3492100A1 (fr) 2001-06-26 2019-06-05 Amgen Inc. Anticorps pour opgl
EP2213685A1 (fr) 2002-09-06 2010-08-04 Amgen Inc. Anticorps monoclonal anti-IL-1R1 thérapeutique
EP2277543A1 (fr) 2002-09-06 2011-01-26 Amgen, Inc Anticorps monoclonal anti-IL-1R1 thérapeutique
EP3020414A1 (fr) 2002-09-06 2016-05-18 Amgen, Inc Anticorps monoclonal anti-il-1r1 thérapeutique
US7964193B2 (en) 2005-01-26 2011-06-21 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 β
US7566772B2 (en) 2005-01-26 2009-07-28 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1β
US8187817B2 (en) 2005-08-02 2012-05-29 Xbiotech, Inc. Diagnosis, treatment, and prevention of vascular disorders using IL-1 autoantibodies
EP2366715A2 (fr) 2005-11-14 2011-09-21 Amgen Inc. Molécules chimère d'anticorps anti-RANKL et de PTH/PTHRP
EP2816060A1 (fr) 2005-11-14 2014-12-24 Amgen Inc. Molécules chimère d'anticorps PTH/PTHRP de rang 1
US8034337B2 (en) 2008-05-30 2011-10-11 Xbiotech, Inc. Interleukin-1α antibodies
US8242074B2 (en) 2008-09-12 2012-08-14 Xbiotech, Inc. Modulation of the amount or function of pathogenic CD14+CD16+ monocytes
US12116405B2 (en) 2010-06-18 2024-10-15 Xbiotech Inc. Arthritis treatment
US11390672B2 (en) 2010-06-18 2022-07-19 Janssen Biotech, Inc. Arthritis treatment
US11932688B2 (en) 2010-08-23 2024-03-19 Xbiotech Inc. Treatment for neoplastic diseases
US10294296B2 (en) 2010-08-23 2019-05-21 Xbiotech, Inc. Treatment for neoplastic diseases
US11191831B2 (en) 2011-04-01 2021-12-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of psychiatric conditions
US9809649B2 (en) 2011-09-23 2017-11-07 Xbiotech, Inc. Cachexia treatment
US9545441B2 (en) 2012-09-18 2017-01-17 Xbiotech, Inc. Treatment of diabetes
US10041044B2 (en) 2016-07-29 2018-08-07 Trustees Of Boston University Age-associated clonal hematopoiesis accelerates cardio-metabolic disease development
US11225517B2 (en) 2017-02-16 2022-01-18 Janssen Biotech, Inc. Treatment of hidradenitis suppurativa
WO2020035482A1 (fr) 2018-08-13 2020-02-20 Iltoo Pharma Combinaison d'interleukine 2 et d'un inhibiteur de l'interleukine 1, conjugués et utilisations thérapeutiques de celle-ci

Also Published As

Publication number Publication date
DE399024T1 (de) 1991-04-11
FR2640146A1 (fr) 1990-06-15
FR2640146B1 (fr) 1993-12-24
JPH04503600A (ja) 1992-07-02
ES2038571T1 (es) 1993-08-01
CA2004935A1 (fr) 1990-06-08
EP0399024A1 (fr) 1990-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO1990006371A1 (fr) ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-INTERLEUKINES 1α ET 1β, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET APPLICATIONS DESDITS ANTICORPS A LA DETECTION DES INTERLEUKINES 1α et 1β ET EN THERAPEUTIQUE
US4536479A (en) Use of anti-idiotype antibodies in immunoassays
EP1513878B1 (fr) Compositions et methodes pour le dosage de l&#39;apo b48 et de l&#39;apo b100
FR2707882A1 (fr) Nouveaux kits thérapeutiques anti-médiateurs protéiques, procédé de préparation et compositions pharmaceutiques les renfermant.
JPH0720437B2 (ja) モノクロナ−ル抗体
EP0314744B1 (fr) Dosage de monokines
EP0170302A1 (fr) Procédé de dosage immunologique d&#39;une substance dans un échantillon liquide au moyen d&#39;anticorps anti-idiotypiques
EP0119893B1 (fr) Anticorps monoclonaux anti-Légionella, procédé d&#39;obtention et application au dosage de Légionella pneumophila
EP0327418B1 (fr) Procédé immunométrique pour le dosage de particules de lipoprotéine, anticorps monoclonaux anti-Lp(a) et application au diagnostic de l&#39;athérosclérose
EP0667897B1 (fr) Methode d&#39;immunodosage specifique de la glutathion peroxydase plasmatique humaine
EP0676052A1 (fr) Detection de la mucoviscidose ou d&#39;une mutation du gene cftr
US6210906B1 (en) Specific antibodies to kringle 5 of apo(a) and methods of use therefor
JP3745411B2 (ja) モノクローナル抗体
KR100426029B1 (ko) 동종 및 이종 단백질에 대한 항체, 그 항체를 이용한 진단 및 치료방법 및 그 항체의 측정방법
CA1270778A (fr) Cellules hybrides secretant des anticorps anti- idiotypiques, anticorps monoclonaux secretes par lesdites cellules hybrides, leur preparation et leur application
FR2599513A1 (fr) Anticorps monoclonaux inhibant la liaison de ige soluble aux lymphocytes humains, hybridomes monoclonaux produisant de tels anticorps, leur utilisation
JPH04503008A (ja) ひとリンパ腫および自己抗体により発現する共通イディオタイプ反応性抗―イディオタイプ抗体
BE900023A (fr) Procede de dosage immunologique d&#39;une substance dans un echantillon liquide au moyen d&#39;anticorps anti-idiotypiques.
CA1276104C (fr) Methode de dosage de la prolylhydroxylase humaine par des methodes radioimmunologiques
Haba et al. Induction and properties of syngeneic murine anti-immunoglobulin D.
JP2004091454A (ja) 抗体及びその製造方法並びに抗体を用いた抗原の定量方法
Petit et al. Primary response to GAT in F344 rats: Anti-GAT antibodies, nonspecific immunoglobulins, and expression of the GAT-13 idiotype
ANFOSSO et al. 1.1 Efficiency of human IgE IRMA is dependent of monoclonal antibody fine specificity and solid-phase nature
CA2128364A1 (fr) Kits therapeutiques anti-mediateurs proteiques, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
WO1997039034A1 (fr) Moyens pour la detection de bacteries de l&#39;espece taylorella equigenitalis et applications biologiques

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1990900216

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1990900216

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1990900216

Country of ref document: EP

点击 这是indexloc提供的php浏览器服务，不要输入任何密码和下载