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WO1989003997A1 - Method for diagnosis of liver cancer - Google Patents

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WO1989003997A1
WO1989003997A1 PCT/JP1988/001103 JP8801103W WO8903997A1 WO 1989003997 A1 WO1989003997 A1 WO 1989003997A1 JP 8801103 W JP8801103 W JP 8801103W WO 8903997 A1 WO8903997 A1 WO 8903997A1
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WO
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inhibitor
collagenase
serum
collagenase inhibitor
antibody
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PCT/JP1988/001103
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Inventor
Kyoichi Inoue
Takafumi Ichida
Miki Miyagiwa
Taro Hayakawa
Shuji Kodama
Kazushi Iwata
Original Assignee
Fuji Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing a liver-cancer disease by quantifying a collagenase inhibitor. More specifically, the present invention relates to a tissue collagen inhibitor (tissue inhibitor).
  • the amount of collagenase inhibitor in serum, plasma, or synovial fluid of patients with liver cancer disease can be measured by the method of Diagnose liver cancer disease based on the fact that it shows a clear ⁇ value compared to the amount of collagenase inhibitor in plasma or in joint fluid It is about the method.
  • the enzyme immunoassay described above differs from collagenase inhibitor in terms of an antibody that binds to a solid-phase antibody and an antibody that attaches an enzyme label.
  • a method for measuring collagenase inhibitor which comprises using two types of monoclonal antibodies that specifically bind to antigenic determinants. Means.
  • Collagenase inhibitors are used in humans and other animal bones, skin, dental pulp, amniotic fluid, blood, synovial fluid and articular chondrocytes, synovial fluid cells, and various tissues. From fibroblasts, fibrous meat It is known to be present in tumor cell cultures. As a means for measuring the amount of collagenase inhibitor, a method based on measuring its biological activity is conventionally known. Eisen et al. In J. Lab. Clin. Med. 75, 258-263 (1973) and Cawston et al. In Arthritis and Rheumatism 27, 285-290 (1984).
  • the present invention has been made based on the above-mentioned findings, and has an antibody and an enzyme label attached to a solid phase alone.
  • the antibody to be used is a combination of two types of monoclonal antibodies that specifically bind to different antigenic determinants of Pseudocollagenase-inhibitor.
  • the enzyme-linked immunosorbent assay performed by the Sandwich method can be used to detect the presence of the human collagen in serum, plasma, or synovial fluid. -Quantifying the inhibitor and comparing the quantified value with the value indicated by a healthy person to determine whether or not the subject has a liver cancer disease. It provides a way to diagnose.
  • the inventors of the present invention administer a solution containing collagenase inhibitor purified from the culture solution of pulp pulp to the intraperitoneal cavity of Balb / c mice. After immunization, the mouse spleen cells were isolated. The spleen cells are mixed with 8-1 azaguannin-resistant myeloma cells NS-1 at a ratio of 5: 1 and fused in 50% polyethylene glycol 4000. I got a hybridoma by letting me do it. The hybridomas obtained were distributed in a polystyrene 96-hole microgel to obtain 6.0 x 10 5 cells per hole. Later, the cells were cultured in HAT medium.
  • a solid phase-antibody binding test (ELISA) was performed to determine whether antibodies to the pulpal collagenase inhibitor were produced in the culture medium of each well. The positive rhoma was checked. The hybridoma in the well was cloned by the limiting dilution method. As a result, 17 types of monoclones that produce monoclonal antibodies against the pulp pulp collagenase inhibitor were obtained. Contains monoclonal antibody by intraperitoneal administration of noclone to Baib / c mouse Ascites was obtained.
  • Monoclonal antibodies were purified by gel filtration chromatography and the like. All of the 17 monoclonal antibodies purified as described above crossed specifically with the psicogenase inhibitor, but four of them. Monoclonal antibodies, i.e., IgG (Clone 7-6C1), IgG (Clone 7-19F6), IgG (Clone 7-21BI2) and IgG (Clone 7-23G9) Force s Histogenesis It is also known that it reacts with the enzyme inhibitor. I made it.
  • the serum of 46 patients with cirrhosis 45 samples of serum of patients with chronic active hepatitis and 26 samples of serum of patients with chronic inactive hepatitis, a part of collagenase inhibitor was present in serum.
  • the average was 228 ⁇ 163 ng / mj2, 233 ⁇ 88 ns and 166/73 ns, respectively, and there was no significant difference compared to the amount present in the serum of a healthy subject. won .
  • patient serum By measuring the amount of collagenase inhibitor in the sample, it is possible to diagnose whether the patient is a liver cancer patient or not. It turned out to be.
  • the amount of collagenase inhibitor in 26 samples of plasma from healthy volunteers was 64 ⁇ 10i ⁇ / m2 of plasma, whereas the amount of collagenase inhibitor was 8 in primary liver cancer patients.
  • the amount of jurageenase inhibitor present in it is 583 ⁇ 447 ng / plasma, which is clearly higher than that present in normal human plasma. And were recognized.
  • Giza-mouth acetate transaminases GPT (daltampyruvic acid transaminases), ALP (alkaline phosphorous phosphates) Ze), LDH (lactate dehydrogenase), a-GPT (a-g Measurements such as rutamyl trans-peptidase), PH (prolylrenodidoxylase), and AFP (tr—fetoprotein)
  • GPT dialampyruvic acid transaminases
  • ALP alkaline phosphorous phosphates
  • LDH lactate dehydrogenase
  • a-GPT a-g Measurements such as rutamyl trans-peptidase
  • PH prolylrenodidoxylase
  • AFP tr—fetoprotein
  • the above-mentioned enzyme immunoassay is used, but it is made of polystyrene or polystyrene, which passively adsorbs antigens and antibodies well as a solid phase alone.
  • Ball Polypropylene, Polyvinyl or Polyvinyl Balls, Microplates, Sticks, Test Tubes, etc.
  • Various materials and usage forms can be arbitrarily selected and used.
  • the antibody-containing substance is fractionated with ammonium sulfate,
  • IgG fraction or a specific binding portion Fab ′ obtained by digesting with pepsin and then reducing the digestion.
  • an antibody to be bound to a simple substance and an antibody to be labeled with an enzyme different antigenic determinants of collagenase inhibitor are used.
  • Immunogen assay based on solid-phase antibody enzyme immunoassay using a combination of two types of monoclonal antibodies that specifically bind to By quantifying the inhibitor and comparing the result with the value of a healthy person, the subject can be diagnosed as having or not being able to treat liver cancer disease. It is something.
  • Honkiaki is not limited to these.
  • mice Two 6-week-old Balb / c female mice were purified in the complete Freund's band, as described in (a) above. First immunization with bitter. Each mouse is intraperitoneally administered with 48zg of psicogenase inhibitor as a 0.4rai2 solution. Further, a booster immunized with a saline extract dissolved in physiological saline on the 30th day was administered. Intraperitoneal administration on the 58th day as the final immunization C95 / is / After booster immunization with 500 physiological saline, 3 days later, the mouse spleen is removed and spleen cells are prepared.
  • RPMI 1640 medium RPMI No. 1640 (Difco Labo-rators) with sodium bicarbonate (12raM), sodium pyruvate (1 mM), L-glutamine (2 mM :), penicillin G potassium (50 ⁇ mH), sulfate mycin ( ⁇ ), and amicasin sulfate (100 / ⁇ / After adding mQ), adjust the pH to 7-2 with a dry-ice, and remove bacteria with a 0. Toyo membrane filter.
  • NS-1 medium Calf fetal calf serum (CM-A. Bioproducts) that has been sterilized in the RPMI 1640 medium described above is concentrated to a concentration of 15% (: v / v).
  • PEG 4,000 solution Prepare a 50% (/ w) serum-free solution of RPMI 1640 medium (polyethylene glycol-) V 4,000 (PEG 4,000, Merck & CO., Inc.).
  • the nucleated spleen cells (viable cell rate 100%) and myeloma cells (viable cell rate 100%) prepared in the above are fused at a ratio of 5: 1.
  • the spleen cells and myeloma cells are separately washed with the RPMI 1640 medium described above.
  • the cells are suspended in the same medium and mixed at the above ratio in order to fuse them.
  • the medium used is as follows.
  • HAT medium NS-1 medium described in (c) above, plus hypoxanthine ( ⁇ ⁇ :), aminobuterin (0.4 iM), and thymidine (16 / iM).
  • HT medium It has the same composition as the above HAT medium except that aminopterin has been removed.
  • Adherence Detection of anti-pseudocollagenase inhibitor antibody-producing hybridomas by antibody binding test (ELISA).
  • horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse immunoglobulin (capp-el Lab.) was added, and the mixture was incubated for about 1 hour at room temperature. Incubate. Next, hydrogen peroxide and a substrate, o-phenylenediamine, are added, and the degree of brown produced is determined qualitatively with the naked eye, or the corona 2 wavelengths are determined. Measure the absorbance at 500 nm using a microplate photometer (MTP-22, Corona Electric).
  • the monoclonal antibody is obtained by culturing each of the obtained hybridomas in an appropriate culture medium such as NS-1 medium (in vitro propagation), and then culturing the cells.
  • NS-1 medium in vitro propagation
  • the tumor formation promoting agent pristane (2, 6, 10, 14-tetramethyltilpentadecane (Aidrich Chemical Co.) was intraperitoneally administered to each mouse at 0.5 mfi, and after 1-3 weeks, each hybrid was administered. The same dose of 1 ⁇ 10 7 Domas administered intraperitoneally in vivo, and after i ⁇ 2 weeks, the monoclonal antibody protein concentration 4 ⁇ You can get ascites of 7 sZ m £.
  • Each of the ascites fluids obtained in (g) above was subjected to ammonium sulfate fractionation (40% saturation), and then equilibrated with 40 mM phosphate buffer containing 0.06 M sodium chloride and PH8.0.
  • the ⁇ adsorbed fraction of Sephacel (pharmacia) was collected, and the IgG fraction was further equilibrated with 50 mM phosphate buffer containing 0.42 M sodium chloride, pH 7.4.
  • the cells were passed through a Geno oven with the power of Sephacryl S-300 Superfine (Pharmacia) to separate and remove the FCS and mouse-derived proteins in the culture medium.
  • maleimide was labeled on horseradish peroxidase (POD) as described below. That is, POD was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (PH7.0) in the amount of lOmgZmfi, and 25 times the amount of N— ( ⁇ —maleimide Cub mouth oleoxy) Imino acid conodic acid (ECS) was added as a dimethylformamide solution and reacted at 30 ° C for 30 minutes. This was gelled with 50 columns of Sephadex G — equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (PH6.0), and the maleimide-labeled POD fraction was separated. I took it. (3) Preparation of Fab'-POD complex fraction
  • the Fab 'in the fraction prepared as described in (1) above was equimolar to the maleimide-labeled POD in the fraction obtained in (2) above against the Fab' in the fraction obtained above.
  • the two fractions were mixed and the final concentration of Fab 'and maleimide-labeled POD was 0 / iM containing 5 mM EDTA so that the final concentration was 100 / iM.
  • Example 1 The pulp pulp collagenase inhibitor purified in Example 1 (a) was subjected to SDS-PAGE, and then commercially available POD-labeled goat anti-mouse immunoglobulin.
  • Fab'-POD complex obtained in Example 2 (a) above, a cell was prepared according to the method of Tabe described in Cell Engineering 1 & 2, 1061-1068 (1983). The blotting was performed to obtain a pattern of enzyme antibody staining. This is shown in Figure 1.
  • a and B are obtained from Example 2 (a), respectively, after the western plating. 1 shows the results of immunostaining with Fab '(clonal 7-3F1) -POD complex and Fab' (clonal 7-21B12) -POD complex.
  • 1 to 16 are the following monoclonal antibodies (any After immersing the nitrose in a solution of IgG type), the nitrose is removed after the estam- blotting.
  • the figure shows the results of immunostaining of a loose membrane with POD-labeled goat anti-mouse immunoglobulin (manufactured by CCappel Laboratories).
  • Example 1 (i) J. Immunoassay 4, 209-327 (1983), using the method of Ishikawa et al. Described in Example 1 (i) to reduce the monoclonal antibody obtained in Example 1 (i) to 0.1% sodium azide.
  • the monoclonal antibody After removing the solution, 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% BSA, 0.1% sodium chloride and 0.1% sodium azide
  • buffer A (Hereinafter abbreviated as buffer A) 5 times, then buffer
  • the mixture was diluted with the solution (PH7.0) and heated by shaking at 30 ° C for 1 hour (second reaction). After the completion of the reaction, washing was performed in the same manner as at the end of the first reaction. Then add 0.3 mi2 of POD substrate dissolved in 0.1 M acetate buffer (pH 5.5), that is, 0.0134% tetramethylbenzidine (TMBZ), and further add 0.01% peroxide. After adding hydrogen O. lrafi and shaking at 30 ° C for 1 hour (third reaction), the reaction was stopped by adding 0.6 mJ2 of 1.33 N sulfuric acid. A 4 5 of the reaction mixture of it. The values were measured with a spectrophotometer, and the amount of collagenase inhibitor in the sample was determined from the standard straight line.
  • TMBZ 0.0134% tetramethylbenzidine
  • Clone 7-3F 1, 7-4F2, 7-5A1, 7-6C1, 7-7F1 l 7-8B2, 7-9B4, 7-10E11, 7-1U5, 7-12B6, 7-15E8 , 7-18F3, 7-19F6, 7-20C2, 7-21B12, and 7-23G9 were purified using a monoclonal antibody as a solid phase.
  • the amount of sand switch was determined by the method of Example 3 (b). The resulting et al. The A 4 5. The values are shown in Table 2 below. Your name, A 4 5 in the second table.
  • the value is the value obtained by subtracting the value when no collagenase inhibitor was added from the value of the addition of 1 ng of the sample.
  • the solid phase is 7-4F2, 7-11A5, 7-12B6, 7-18F3, 7-20C2, and 7 - a 4 5 when had use six kinds of antibodies of 23G9. Showed a value of 2 or more.
  • Sandwich quantification was performed by changing the addition amount of collagen pulp collagenase inhibitor. Fal) '(Clone 7-6C1) — POD is used as a complex, and the clone 7-23 G9 antibody is used as a solid phase. As shown in Fig.
  • Human serum lra j2 is dialyzed against 0.1 M salted sodium and 30 mM tris containing 5 mM calcium chloride-hydrochloric acid buffer (PH8.0). After that, it is applied to the clone 7—21B12 antibody-binding Sepharose 4B column prepared according to the method described in (a) above, and washed with the above buffer ( Non-adsorbed fraction), followed by a column containing 30 mM Tris containing 2 M sodium chloride — 0.2 M Greens containing hydrochloric acid buffer (PH7.5) and 0.5 M sodium chloride.
  • PH8.0 calcium chloride-hydrochloric acid buffer
  • Example 3 (c) Sandwich quantification of human collagen inhibitor The most suitable combination of monoclonal antibodies was examined.
  • four Fab'-POD complexes capable of sensitively quantifying human pulp pulp collagenase inhibitor namely, , Fab '(7-3F1) -P0D, Fab' (7-6C1) -P0D, Fab '(7-19F6) -POD and Fab' (7-21 Bl2) -POD and 6 solid phases 24, using the monoclonal antibodies of clones 7-4F2, 7-11A5, 7-12B6, 7-18F3, 7-20C2 and 7-23G9 Of the human serum collagenase treated with column chromatograph as described in Example 4 (b). Combinations that could quantify inhibitors were examined.
  • the quantitation sensitivity is about 10 pg (320 araofi) per test tube, and the quantification in the case of pulp pulp collagenase inhibitor. Sensitivity [1 P per test tube. It was found to be 10 times lower than that of.
  • the results are as follows: in serum from cirrhotic patients, in serum from patients with chronic active hepatitis, and chronic inactive liver
  • the average amount of collagenase inhibitor present in the serum of patients with inflammation was 1.52 sq. 1.08 / ⁇ , 1.55 sq. 0.58 and 1.10 sq. 0.48 ⁇ , respectively.
  • the difference was also significant with no significant difference in the amount of collagenase inhibitor present in the serum of healthy humans.
  • FIG. 5 shows the obtained serum collagenase inhibitor (1) and the control of human dental pulp collagenogen inhibitor (2) and the control.
  • Each SDS-PAGE pattern of the molecular weight marker (3) is shown.
  • the molecular weight of human blood collagenase inhibitor is similar to that of human bone marrow collagenase inhibitor. , And 32,000 D.
  • the monoclonal antibody described in (a) of Example 5 was changed by changing the amount of the purified human serum collagenase inhibitor obtained in Example 6 to be added.
  • a standard line was created by performing sandwich quantification using a combination of the above. The results obtained are shown in Fig. 6. To jar'll see we are in FIG. 6, human serum co-La Gena over Ze Lee emissions heat Vita over the amount and ⁇ 45 was added. A linear relationship was established, and the quantitative sensitivity at this time was 1.5 p (48 a ⁇ ) per test tube. This quantitative sensitivity is 6.7 times higher than the case of the standard straight line created in (a) of Example 5, and the pulp pulp collagen described in (c) of Example 3 is used. -It is 1.5 times lower than in the case of the Zinc inhibitor.
  • collagenase inhibitor present in serum of patients with cirrhosis As can be seen in Table 6, collagenase inhibitor present in serum of patients with cirrhosis, serum of patients with chronic active hepatitis and serum of patients with chronic inactive hepatitis The average amount is 163 ng for 228 soil, 233 ⁇ 88 n and 73 ng for 166 soil, respectively. These values are all collagenase inhibitors present in serum of healthy humans. No significant difference was found between the amount and the amount.
  • Collagenase inhibitors present in 26 plasma samples of healthy humans and 8 plasma samples of patients with primary liver cancer obtained as described above are described in the above section (a). Sandwich quantification was performed using the same method as indicated. The results are shown in Table 7 below. As can be seen from Table 7, the amount of collagenase-inhibitor present in plasma imfi of healthy humans is 64 ⁇ long on average, whereas the primary The amount of collagenase inhibitor present in the blood of patients with primary liver cancer disease was as high as 583 ⁇ 447 n on average.
  • Clones 7-6C1 and clone 6 used for the Sandwich assay were used.
  • Clones 7-23G9 react with the human collagenase inhibitor, but various proteins are dissolved at high concentrations, such as serum or plasma.
  • a test was also performed to confirm that this monoclonal antibody specifically reacted with collagenase inhibitor.
  • the use of the method of the present invention makes it possible to diagnose liver cancer diseases easily and with high sensitivity in a short time. be able to .
  • FIG. 1 shows the results obtained after subjecting the pulp collagen pulp collagen inhibitor to SDS-PAGE and using various monoclonal antibodies.
  • FIG. 2 is a diagram showing a blotting pattern, and FIG. 2 is a diagram showing a solid dental 7 ⁇ 23G9 antibody-complex Fab ′ (7—6C1) —POD pulp in a POD measurement system.
  • FIG. 3 shows a standard line of collagenase inhibitor, and FIG. 3 shows that human serum collagenase inhibitor was subjected to SDS-PAGE, and FIG. 4 shows the pattern of immunostaining when performing ester blotting.
  • FIG. 3 shows a standard line of collagenase inhibitor
  • FIG. 3 shows that human serum collagenase inhibitor was subjected to SDS-PAGE
  • FIG. 4 shows the pattern of immunostaining when performing ester blotting.
  • FIG. 4 shows the solid-phase 7-23G9 antibody-complex Fab ′ (7-6C 1) A graph showing the standard line of human serum collagenase inhibitor in the -P0D assay system.
  • Fig. 5 shows collagenase purified from human serum. Nhibita Roh SDS- PAGE Bruno,.
  • Fig. 6 shows the standard straight line when sand titration was measured using purified human serum collagenase inhibitor.
  • Figure 7 shows the results.
  • Fig. 7 shows the results obtained by subjecting the human serum to an IgG (7-23G9) antibody-bound affinity column and subjecting the eluted fraction to SDS-PAGE.
  • FIG. 4 is a view showing a western blotting notation when a Fab ′ (7-6C1) -P0D complex is used after the reaction.

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Description

明 細 書 肝 臓 癌 疾 患 の 診 断 法
〔技術分野〕
本発明 は コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を定量す る こ と に よ り 肝臓-癌疾患を診断す る 方法に 関す る も の であ る 。 さ ら に詳 し く は、 本発明 は ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー (テ ィ シ ュ . イ ン ヒ ビ タ ー ♦ ォ ブ ' メ タ 口 プ ロ テ ア ー ゼ ：
T I MP ) に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い る サ ン ド ィ ッ チ法に基づ く 酵素免疫学的測定法に よ る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定法 を 手段 と し 、 肝臓癌疾患患者の 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量がそ れぞれ健常人の血清中、 血漿中 あ る い は関 節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量に比べ て 明 ら かに 髙 ぃ値を 示す こ と に基づ い て肝臓癌疾患の診断 を行 う 方 法に 関す る も の であ る 。 な お、 上記の酵素免疫学的測定 法 と は、 固相抗体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識 を 付 与す る 抗体 と し て コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗 原決定基に対 し特異的 に 結合す る 2 種類の モ ノ ク 口 一 ナ ル抗体を 用 い る こ と を特徴 と す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定法を意味す る 。
〔背景技術〕
コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー は、 ヒ 卜 お よ びそ の他の動 物の骨、 皮膚、 歯髄、 羊水、 血液、 関節液中 お よ び関節 軟骨細胞、 滑液細胞、 各種組織 由 来線維芽細胞、 線維肉 腫細胞培養液中 に存在する こ と が知 ら れて い る 。 コ ラ ゲ ナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量を測定す る 手段 と し て は、 従来、 そ の生物活性を測定す る こ と に よ る 方法が知 ら れて い る 。 し力 し、 J . Lab. Cl in. Med. 75, 258-263 〔 1973) に Eisenらカ 、 また、 . Arthritis and Rheumatism 27， 285 ~ 290 ( 1984) に Cawstonら が記載 して い る よ う に、 血清 中、 血漿中 あ る い は関節液中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一活性を測定す る に は、 それ ら の液中に、 そ の測定を妨 害す る 蛋 白質、 た と え ば、 な 2 —マ ク ロ グ ロ ブ リ ン が存 在す る ため、 従来知 ら れてい る 測定方法に よ っ て は、 そ の測定は不可能であ る 。 早川、 岩田 ら は、 先に、 ゥ シ コ ラ ゲナーゼ ィ ン ヒ ビ タ ーに対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 用 い、 サ ン ド イ ッ チ法に基づ く 薛素免疫学的測定法（EIA) を行 う こ と に よ り 微量の試料で精度良 く 、 箇便かつ迅速 に コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を特異的 に定量す る 方法を 開発 し たが （特願昭 62— 42781号）、 本発明者 ら は、 ヒ ト 血清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビ タ ー量が、 肝臓癌疾患に かかる こ と に よ り 明 ら かに増加する こ と を発見 し、 血清中、 血漿中 あ る い は 関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量を上 記の酵素免疫学的測定法に よ り 測定す る こ と に よ っ て、 肝臓癌疾患の診断を行い得る こ と を見出 し た。
〔発明の開示〕
本発明 は、 上述の如 き 知見に基づいて な さ れた も の で あ っ て、 固相単体に結合さ せ る 抗体お よ び酵素標識を付 与す る 抗体 と し て ゥ シ コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の異な る 抗原決定基に対 し 特異的 に 結合す る 2 種類の モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体の組み合わせ を用 い て、 サ ン ド イ ッ チ法に よ り 酵素抗体免疫学的測定法 を 行 う こ と に よ り 、 血清中、 血漿中 あ る い は 関節液中 に存在す る ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 定量 し 、 そ の定量値 を 健常人の示す値 と 比 較す る こ と に よ り 、 被測定者 肝臓癌疾患に かか っ て い る か否か を 診断す る 方法 を提供す る も の であ る 。
本発明者 ら は、 ゥ シ歯髄の培養外液か ら 精製 し た コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一を含む溶液 を Balb/cマ ウ ス の腹腔 内 に投与す る こ と に よ り 免疫 し た後、 そ の マ ウ ス の ひ臓 細胞 を 分離 し た 。 そ の ひ臓細胞 と 8 — ァ ザ グァ ニ ン耐性 ミ エ ロ ー マ細胞 NS-1と を 5 ： 1 の割合で混合 し、 50%ボ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル 4000中で融合 さ せ る こ と に よ り ハ イ ブ リ ド ー マ を得た。 ポ リ ス チ レ ン 製 96穴マ イ ク ロ ゥ ェ ル に 各 ゥ エ ル 当 た り 6.0 X 105個 と な る よ う に 得 ら れ た ハ イ ブ リ ド ー マ を分散 し た後、 HA T培地中で培養 し た 。 各 ゥ エル の培養液中 に ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る 抗体が産生 さ れて い る か否か を 固相一抗体結合 テ ス ト 法（EL ISA) に よ り チ ェ ッ ク し 、 そ れが陽性で あ る ゥ エル中の ハ イ プ リ ド ー マ を 限界希釈法 に よ り ク ロ ー 二 ン グ し た 。 そ の結果、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 産生す る 17種類の モ ノ ク ロ ー ン を 得、 そ の各モ ノ ク ロ 一 ン を Baib/cマ ウ ス の腹 腔内 に 投与す る こ と に よ り 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 含む 腹水を得た。 そ の腹水か ら硫酸ア ン モ ニ ゥ ム に よ る 塩析 分別、 DEAE- Sephace 1に よ る イ オ ン交換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーおよび Sephac ry 1 S-300 S u p e r f i n eに よるゲルろ過 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー な どに よ っ てモ ノ ク ロ ーナル抗体を 精製 し た。 上記の如 く 精製 し た 17種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体い ずれ も ゥ シ コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と 特異的に 交叉 し たが、 それ ら の なかの 4 種類の モ ノ ク ロ ーナル抗 体、 すな わ ち 、 IgG (ク ロ ー ン 7-6C1) 、 IgG ( ク ロ ー ン 7- 19F6)、 IgG ( ク ロ ー ン 7-21BI2) お よ び I gG ( ク ロ ー ン 7- 23G9) 力 s ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と も 反応す る こ と を ゥ エ ス タ ン ブロ ッ テ ィ ン グに よ っ て明 ら 力 に した。 こ れ ら 4 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の う ち 2 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体、 すなわ ち、 IgG (ク ロ ー ン 7- 23G9) を 固 相用抗体 と し、 IgG ( ク ロ ー ン 7-6C1) か ら調製 し た Fab' (ク ロ ー ン 7-6C1) — POD複合体 を標識抗体 と し て用 いた サ ン ド ィ ツ チ法に基づ く E I Aを行 う こ と に よ り 、 ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼイ ン ヒ ビ タ ー を微量（1.5P3) で、 特異的に、 精度良 く 、 定量する こ と がで き た。 こ のサ ン ド イ ッ チ法 を 用 いて、 健常人血清 50検体中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を定量 した と こ ろ、 血清 l m£当た り 184 ± 30ngの コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る こ と がわ力 つ た。 一 方、 原発性肝臓癌患者血清 100検体中 お よ び転移性肝臓 癌患者血清 3 検体中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は血清 1 mi2当た り それぞれ平均 486 ± 316ngお よ び 1172 ± 712ngであ り 、 こ れ ら の値は健常人血清中に存在 す る そ の値に比べて 明 ら かに高い 。 一方、 肝硬変患者血 清 46挨体、 慢性活動性肝炎患者血清 45検体お よ び慢性非 活動性肝炎患者血清 26検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量は血清 1 mj2当 た り そ れぞれ平均 228 ± 163 ng、 233 ± 88nsお よ び 166士 73nsであ り 、 健常人血清中 に 存在す る そ の量 と 比べて有意の差は認め ら れ な か っ た 。 従 っ て、 種 々 の肝臓病患者中 で も 肝臓癌患者に お け る 血 清中での特異的 に高い コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量に 着 目 し て、 患者血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量 を 測定す る こ と に よ り 、 そ の患者が、 肝臓癌患者であ る か 否かを診断す る こ と がで き る こ と に な る こ と が判 っ た。 ま た、 健常人血漿 26検体中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の量は血漿 1 m£当た り 64 ± 10i ^であ る の に対 し 、 原発性 肝臓癌患者 8 検体中 に存在す る ユラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量 は血漿 1 当 た り 583 ± 447ngであ り 、 建常人血漿中 に存在す る そ の値に比べ て 明 ら かに高 い こ と が認め ら れ た 。
た だ し、 血清中 あ る い は血漿中 に 存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー量増加の現象 は、 肝臓癌患者以外に 慢性 関節 リ ウ マ チ疾患患者に つ い て も 認め ら れ る の で、 こ の 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の測定 を 、 肝機能判 定法であ る ZTT (硫酸亜鉛混濁反応） 、 GOT ( グル タ ミ ン オ ギザ 口 酢酸 ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ）、 GPT ( ダル タ ミ ン ピ ル ビ ン 酸 ト ラ ン ス ァ ミ ナ ー ゼ ）、 ALP ( ア ル 力 リ 性 フ ォ ス フ ァ タ 一ゼ）、 LDH (乳酸脱水素酵素）、 ァ — GPT ( ァ — グ ル タ ミ ル ト ラ ン ス ぺ プチ ダー ゼ） 、 PH ( プ ロ リ リレノヽ ィ ド ロ キ シ ラ ーゼ） お よ び AFP ( tr — フ エ ト プ ロ テ イ ン） な ど の測定 と 併用 す る こ と に よ り 、 被測定者の肝臓癌の罹息 の有無を診断す る こ と がで き る の であ る 。
本発明方法におい て は上記の酵素免疫学的測定法が用 い ら れ る が、 固相単体 と し て抗原や抗体を受動的に 良 く 吸着す る ポ リ ス チ レ ン製、 ポ リ カ ー ボネ イ ト 製、 ポ リ プ ロ ピ レ ン製、 あ る い はボ リ ビニ ー ル製の ボー ル 、 マ イ ク 口 プ レ ー ト 、 ス テ ィ ッ ク 、 試験管な どの種 々 の材料お よ び使用形態が任意に選択、 使用 で き る 。 一方、 酵素標識 を 付 す る 抗体 と し て は 、 抗体含有物 を 硫安分画後、
DEAE - Sephac e lの如 き 陰ィ オ ン交換ゲル に よ り 精製 し た
I g G画分、 さ ら に はペ プ シ ン 消化後、 還元 し て得 られる 特異的結合部分 Fab 'を用 い る こ と も で き る 。
前述の と お り 、 本発明方法は、 固栢単体に結合 さ せ る 抗体お よ び酵素標識を付与す る 抗体 と し て、 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー の異な る 抗原決定基に対 し、 特異的に結 合す る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わ せ を用 い た固相抗体酵素免疫学的測定法に基づいた ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の定量を行い、 そ の結果を 、 健常人の 値 と 比較する こ と に よ っ て、 被測定者が、 肝臓癌疾患に 力、力 つ て レ、 る か否力 を 診断す る も の であ る 。
以下実施例に よ り 本発明 を具体的に説明す る 。 ただ し 本癸明 は こ れ ら に限定 さ れる も の では な い。
実施例 1 抗 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の 作製
(a) 抗原 一 ゥ シ コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の調製
J . Biochera. 96, 395〜 404 ( 1984)に記載の本癸明者 ら の方法に従い ゥ シ未萌出知歯の根部歯髓 を イ ー グル MEM 培地 （ 日 水製薬製） で培養 し た培養外液か ら Con A - セ フ ァ ロ ー ス 、 ウ ル ト ロ ゲル AcA 44お よ び DE— 52セ ル ロ ー ス の各カ ラ ム を用 い て コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 精製 し た 。 精製 イ ン ヒ ビ タ ー は J . ol . Biol . 8 , 579~ 599 ( 1973) に記載の Laemml iら の方法に従い ド デ シル硫酸ナ ト リ ウ ム — ポ リ ア ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動（SDS-PAGE) で調べた と こ ろ 分子量約 32， 000ダル ト ン （ D )の単一バ ン ド を示 し た。
(b) 抗体産生細胞の調製
6 週令の Balb/c雌マ ウ ス 2 匹 を ま ず フ ロ イ ン ド完全ァ ジ ュ バ ン ド 中で、 前記（ a )で記述 し た精製 ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー で初回免疫す る 。 マ ウ ス に そ れぞれ 48zgの ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 0.4rai2の溶液 と し て腹腔内投与す る 。 さ ら に 30日 目 に 生理食塩水に溶解 し た の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を追加免疫す る ， 最終免疫 と し て 58日 目 に 腹腔内投与 C95/is/ 500 生理食 塩水） に よ り 補助免疫 し 、 3 日 後 に マ ウ ス 脾臓 を取 り 出 し 、 脾細胞 を 調製す る 。
( c ) 細胞融合
(1) 以下の材料お よ び方法 を 用 い る 。 RPMI 1640培地 ： RPMI No. 1640(Dif co Labo-rator i es) に重炭酸ナ ト リ ウ ム （ 12raM)、 ピ ル ビ ン酸ナ ト リ ゥ ム （ 1 mM)、 L — グル タ ミ ン （ 2 mM：)、 ペ ニ シ リ ン G カ リ ウ ム （50 ϋΖ mH)、 硫酸 ス ト レ プ ト マ イ シ ン （ Μ ) 、 お よ び 硫酸ア ミ カ シ ン （100/^/ mQ) を 加 え 、 ド ラ イ ア イ ス で pH を 7 - 2に し、 0. 東洋 メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー で除菌 ^過 す る 。
NS- 1 培地 ： 上記 RPMI 1640培地に除菌^過 し た仔牛胎 児血清 CM- A. Bioproducts) を 15 % (： v/ v)の濃度にカロえ る 。
PEG 4, 000溶液 ： RPMI 1640培地の ポ リ エ チ レ ン グ リ コ - )V 4,000 ( PEG 4,000、 Merck & CO. , Inc.) 50% ( / w) 無血清溶液を調製す る 。
8 - ァ ザグァ ニ ン耐性 ミ エ ロ ー マ細胞 NS- KP3-NS1-1) との融合は Selected Method in Cel lular Immunology Ced. B. B . ishel 1 and S.M. Shi i gi W. H . Freeman and Company (1980)、 351〜 372に記載の 0 i らの方法を若 干改変 し て行 っ た。
(2) 前記 ）で調製 し た有核脾臓細胞 （生細胞率 100% ) と ミ エ ロ ー マ細胞（生細胞率 100% ) と を 5 ： 1 の割合で 融合す る 。 脾臓細胞 と ミ エ ロ ー マ 細胞 と を 別 に 前記の RPM I 1640培地で洗浄する 。 次に 同 じ培地に けん濁 し、 融合 さ せ る た め上記の割合で混合す る 。 容量 50mfiの円錐 形 ス チ ロ ー ル樹脂製試験管（lwaki Glass) を用 い、 40m2 の RPM I 1640培地中 400 x g、 10分間遠心し、 上清を完全 に吸出す る 。 沈澱細胞に 37°C加温 PEG 4,000溶液 1.3mi2を 穏やかに 撹拌 し なが ら 1 分間で滴下 し、 さ ら に 1 分間撹 拌 し細胞 を再けん濁、 分散 さ せ る 。 次に 37 °C加温 RPM I 1640培地 1.3rai2を 1 分間で滴下す る 。 こ の操作を さ ら に 1 回繰返 し た後、 同培地 9 を 2 〜 3 分間で常に撹拌 し な が ら滴下 し細胞を分散 さ せ る 。 こ れ を 400 X 2、 10分間 '遠心分離 し、 上清を 完全に吸引除去す る 。 次に こ の沈澱 細胞に 37°C加温 NS-1培地 12.9rai2を す みやかに 加え 、 細胞 の大 き い塊 り を 10m2の ピぺ ッ ト を 用 い て注意深 く ピぺ ッ テ ィ ン グ し て分散す る 。 さ ら に 同培地 26rai2を 加え て希釈 し 、 ポ リ ス チ レ ン 製 96穴 マ イ ク ロ ウ ェ ル （ I waki Glass) に ゥ エ ル当 り 6.0 X 105個 / 0. i mJ2の細胞 を 加え る 。 な お、 こ の時使用 す る 96穴マ イ ク 口 ゥ エ ル は前処理 と し て 0.2 mfiの NS-1培地 を 加え、 炭酸 ガ ス 培養器中（37°C )で一晚保 温 し、 使用時に培地 を吸引除去 し て お く 。 細胞 を 加 え た 上記の マ イ ク ロ ウ ェ ル を 7 % 炭酸 ガ ス ノ 93%空気中で温 度 37°C、 湿度 100%下に培養に 付す る 。
(d) 選択培地に よ る ハ イ プ リ ド ー マ の選択的増殖
( 1 ).使用 す る 培地は以下の と お り であ る 。
HAT培地 ： 前記（c)で述べ た NS-1培地に さ ら に ヒ ポ キ サ ン チ ン （ΙΟΟ Μ：)、 ア ミ ノ ブ テ リ ン （0.4 iM)、 お よ びチ ミ ジ ン （16/iM)を 加え る 。
HT培地 ： ァ .ミ ノ プテ リ ン を除去 し た以外 は上記 HAT培 地 と 同一組成の も の であ る 。
(2) 前記（c)の培養開始後翌 日 （ 1 日 目 ）、 細胞 に パ ス ッ 一ル ビぺ ッ ト で HAT培地 2 滴 （約 0. Imi2) を加え る 。 2 、 3 、 5 、 8 、 11日 目 に培地の半分（0. Imi2)を新 しい HAT培 地で置 き換え、 14 日 目 に培地の半分 を新 し い HT培地で 置 き換え る 。 以降 3 4 日 毎に培地の半分を新 し い HT培 地で置 き 換え る 。 通常 2 〜 3 週間で充分 なハ イ プ リ ドー マ の生育が観察され る 。 ハ イ ブ リ ド ー マ生育全 ゥ エ ル に つ い て次項（e)記載の固相 -抗体結合テ ス ト 法 （ELISA) に よ り 陽性 ゥ エ ル を チ ェ ッ ク する 。 次に フ ィ ー ダ一 と し て 107個のマ ウ ス胸腺細胞を含む HT培地 1 mfiを ポ リ ス チ レ ン製 24穴セ ル ゥ エ ル（Iwaki Glass) に加え た も の を用 い、 上記で検出 さ れた各陽性ハ イ プ リ ド ーマ の全内容物 を移す。 こ れ を前記（ c ) に お け る と 同様に 7 %炭酸ガ ス 存在下、 37°Cで約 1 週間培養に付す る 。 そ の間 i 〜 2 回 各 ゥ エルの上清 0.5mfiを新 し い HT培地 0.5m2と 交換する 。 ノヽ ィ プ リ ドー マ の充分生育 し た時点で EL I SA法に よ り 陽 性を再確認 し、 それぞれに つ い て次項（ f )記載の限界希 釈法に よ る ク ロ ー ニ ン グを行 う 。 な お、 ク ロ 一 ニ ン グに 使用後の残液を ポ リ ス チ レ ン製 25 cm 2組織培養フ ラ ス コ CI waki Glass)に移 し 、 凍結保存用試料を調製す る 。
(e) 固栢 — 抗体結合テ ス 卜 （ELISA) に よ る 抗 ゥ シ コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー 抗体産生ハ イ ブ リ ド ー マ の 検
Anal . B i ochem . 104. 205〜 214 ( 1980 ) に記載の Rennar d ら の方法を若干改変 した方法を用 い る 。 こ の方 法は、 ハ イ プ リ ドーマ抗体の検出 に適 し て い る 。 96穴 ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ヨ ン プ レ ー ト (F l ow Labora tor i es , Inc.) を 0.5〜： の ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 で コ ー ト し、 次 に 、 未 コ ー ト 部分 を 1 %牛血清ア ル ブ ミ ン (BSA)で ブ ロ ッ ク す る 。 こ れ に 前記（d)で得 ら れた ハ イ ブ リ ド ー マ生育 ゥ エ ル の上清の一部 を 加え て室温で約 1 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト す る 。 2 次抗体 と し て西洋わ さ びペ ル ォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗マ ウ ス ィ ム ノ グ ロ プ リ ン （capp- el Lab .)を 加え、 さ ら に 室温で約 1 時間 ィ ン キ ュ ベ ー 卜 す る 。 次に過酸化水素 と 基質で あ る o — フ エ 二 レ ン ジ ァ ミ ン を 加え生成 し た褐色の程度を 肉 眼で定性的 に判定す る か、 あ る い は コ ロ ナ 2 波長 マ イ ク ロ プ レ ー ト 光度計 (MTP-22、 コ ロ ナ電気社） を 用 レ、 て 500nmの吸光度を 測定 す る 。
(f ) ク ロ ー ニ ン グ
前記（ d ) の操作後、 各 ゥ エ ル中 に は 2 種以上の ハ イ ブ リ ド ー マが生育 し て い る 可能性が あ る の で、 限界希釈法 に よ り ク ロ ー ニ ン グ を 行い、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハ イ ブ リ ド ー マ を取得す る 。 NS - 1培地 m2当 り フ ィ ー ダ一 と し て 1 0 7 個の マ ウ ス 胸腺細胞を 含む ク ロ ー ニ ン グ培地 を 調製 し 、 96穴マ イ ク ロ ウ ェル の 36ゥ エル、 36ゥ エル お よ び 24 ゥ エ ル に ゥ エ ル当 り 5 個、 1 個お よ び 0 . 5個の ハ イ プ リ ド ー マ を 力 Bえ る 。 5 日 目 、 12日 目 に 全 ゥ エ ル に 各約 O . l rafiの NS - 1培地を追加する 。 ク 口 一 二 ン グ開始後 14〜 15日 で充分 な ハ イ プ リ ド ー マ の生育が認め ら れ、 コ ロ ニ 一形成陰性 ゥ エルが 50 %以上であ る 群について EL I SA法 を行 う 。 テ ス ト し た全ゥ エルが陽性でな い場合、 抗体陽 性 ゥ エ ル中 の コ ロ ニ ー数を確認 し、 ゥ エル中に i コ ロ ニ 一が確認さ れた ゥ エ ルを 4 ~ 6 個選び再ク ロ ー ニ ン グす る 。 最終的に ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハイ プ リ ド ー マ 17株が得 ら れた。
(g) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の 生体外増殖お よ び生体内増 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の増殖は常法に よ る 。 すなわ ち 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は 、 得 ら れた各ハ イ ブ リ ド ー マ を NS -1培地な どの適当 な培養液で培養 （生体外増殖） し、 そ の培養上清か ら得る こ と がで き る （モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 た ん白質濃度は 10〜； ΙΟΟ/^Ζ ηιβであ る ）。 一方、 大量に抗 体を得る た め に は脾細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞の 由来動物 と 同系の動物（Balb/c、 マ ウ ス ）に腫瘍形成促進剤 プ リ ス タ ン （2， 6 ， 10， 14ー テ ト ラ メ チルペ ン タ デカ ン、 A i dr i ch Chemical社） を マ ウ ス 一匹当 た り 0.5mfi腹腔内投与 し 、 1 〜 3 週間後に、 各ハイ プ リ ド ー マ 1 X 107個 を 同 じ く 腹 腔内投与す る こ と に よ り 生体内 で、 さ ら に、 i 〜 2 週間 後、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体たん 白質濃度 4 〜 7 sZ m£の腹 水を得る こ と がで き る 。
(h) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 重鎮、 軽鎖及びア イ ソ タ ィ プ
前記（ g )で得 ら れた各 々 の腹水を先ず ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を コ ー ト し た ミ ク ロ タ イ ト レ ー シ ヨ ン ブ レ ー ト に前述 し た ELISA法に従 っ て結合 さ せ る 。 PBSに よ る 洗浄後次に、 ア イ ソ タ イ プ特異的 ゥ サ ギ抗マ ウ ス Ig抗 体（ZyraedLaborator ies)を 力 (3え る 。 PBSに よ る 洗浄後、 西 洋わ さ びペル ォ キ シ ダー ゼ標識ャ ギ抗 ゥ サ ギ I gG( H + L ) 抗体を 加え、 基質 と し て 2， 2'— ア ジ ノ ー ジ （ 3 — ェ チ ル ベ ン ゾチ ア ゾ リ ン 硫酸 一 6 ) お よ び過酸化水素を 用 い て 検出 し た。 そ の結果 を ま と め て後掲の第 1 表に示 し た 。 得 ら れた ゥ シ コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナル抗体の 内 15個が免疫 グ ロ プ リ ン鎮 ァ 1ノ /c を 、 1 個；^ ァ 2 a Z /c を 、 そ して、 1 個； ^ 7 2 b ノ c を有 し て い た 。
(i) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の精製
前記（g)で得 ら れた各腹水 を 硫安分画（40%飽和） 後、 塩化ナ ト リ ゥ ム 0.06 Mを含む 40mM リ ン酸緩衝液、 PH8.0 で平衡ィ匕 し た DEAE-Sephacel (pharmac ia¾ )の ^ 吸着画分 を分取 し、 こ の I g G画分 を更に 0 . 42 M塩化ナ ト リ ウ ム を 含む 50mM リ ン酸緩衝液、 PH7.4で平衡ィヒ し た Sephac ry l S - 300Super f ine ( Pharmacia社） 力 ラ ム でゲノレ炉過 し 、 培地中 の FCSお よ びマ ウ ス 由 来の たん 白質 を 分離、 除去 し た 。
実施例 2
ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 と の交叉性
(a) 酵素標識モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ Fab POD複合体） の 調製法
(1) Fab'画分の調製 実施例 1 ( i )で得 られた I gG画分を O . i M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 0.1M酢酸緩衝液 （PH4.2) に溶解 し、 そ の溶液 を 以下述べ る よ う に し てペ プ シ ン で消化 し た。 すな わ ち 、 前記画分中の IgGに対 し て 2 % (w/w)のペ プ シ ン を加え、 37°C、 24時間消化 した。 更に そ の消化物に 2 M ト リ ス溶 液を 加えて pHを 7. 0に調整す る こ と に よ り 消化反応を停 止 さ せ、 0.1 M リ ン酸緩衝液（pH7.0)で平衡化 し た ウ ル ト π ゲル icA 44カ ラ ム （ LKB製） を用 い たゲル -? 過に よ り FCab' 画分を 分取 し た。
次に 、 こ の F ( a b ' ) 2 画分を エ チ レ ン ジァ ミ ン 四酢酸
(EDTA)含有 0.1M リ ン酸緩衝液（PH6.0)中で透析 し、 終濃 度 10mMと な る よ う にア ミ ノ エ タ ン チオー ル （MEA)を加え 37 °Gで 1.5時間還元 した後、 5 mM EDTA含有 0.1 M リ ン酸 緩衝液（PH6.0) で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル AcA 44カ ラ ム を用 いてゲル炉過 し、 Fab'画分を分取 し た。
C2) マ レ イ ミ ド標識 POD画分の調製
上記（ 1 )の操作 と は別に、 以下述べる よ う に し て西洋 わ さ び由来ペ ルォ キ シ ダーゼ（POD)にマ レ イ ミ ドを標識 し た。 すなわ ち、 PODを lOmgZmfiの量で 0.1M リ ン酸緩衝 液（PH7.0)に溶解 し、 そ の PODに対 して、 25倍モ ル量の N — ( ε — マ レ イ ミ ド カ ブ 口 イ レ オ キ シ ） コ ノヽ ク 酸 イ ミ ド (E CS)を ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド溶液 と し て加え、 30°C、 30分間反応 さ せた。 こ れ を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH6.0)で 平衡化 し た セ フ ア デ ッ ク ス G — 50カ ラ ム でゲル ^過 し 、 マ レ イ ミ ド標識 POD画分 を 分取 し た。 (3) Fab' -POD複合体画分の調製
上記（ 1 )の如 く し て調製 し た画分中の Fab ' に対 して上 記（2)で得 ら れ た 画分中 の マ レ イ ミ ド標識 PODと し て等モ ル に な る よ う に し て、 両画分 を 混合 し、 更に Fab 'お よ び マ レ イ ミ ド標識 PODの終濃度が 100/iMと な る よ う に 5 mM EDTA含有 0 · i M リ ン 酸緩衝液（PH6.0)で希釈 し た。 こ の混 合液を 4 °C、 20時間反応後、 Fab'の 10倍モ ル量の N — ェ チ ル マ レ イ ミ ド で未反応の チ オ ー ル基 を ブ ロ ッ ク し た 。 こ れ を 0.1 M リ ン酸緩衝液 （ PH6.5) で平衡化 し た ウ ル ト 口 ゲル AcA 44カ ラ ム でゲル炉過 し 、 Fab' -POD複合体画分 を 分取後、 0.1%牛血清ア ル ブ ミ ン （BSA) 及び 0.005 % チ メ ロ サ ール を 添加 し 、 4 °C で保存 し た。
(b) ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ
実施例 1 ( a )項で精製 し た ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー を SDS- PAGEに供 した後、 市販の POD標識ャ ギ抗 マ ウ ス 免疫 グ ロ ブ リ ン お よ び上記実施例 2 ( a )で得 ら れ た Fab' -POD複合体 を 用 い て細胞工学 1 & 2 、 1061- 1068 (1983)に 記載の 田部の方法に従 つ て ゥ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ イ ン グ を 行い 、 酵素抗体染色のパ タ ー ン を 得た 。 こ れ を 第 1 図 に 示す 。 第 1 図 に お い て、 A及び B は ウ ェ ス タ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ後の 二 卜 ロ セ ル ロ ー ス膜 を そ れぞれ実施 例 2 (a)で得 ら れた Fab' (ク 口 ー ン 7— 3F1)— POD複合体及 び Fab' (ク ロ ー ン 7— 21B12) ― POD複合体で免疫染色 し た 結果を示す も の であ る 。
ま た、 1 ~ 16は下記の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ い ずれ も I g G タ イ プ） の 溶液 に ゥ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 腠を 浸 し た 後、 あ ら た め て各 ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜を P O D標識ャ ギ抗マ ウ ス 免疫 グ ロ プ リ ン CCappel Laborator ies製） で免疫染色 し た結果を示す も の であ る 。
I ： ク ロ ー ン 7— 3 1、 2 ： ク ロ ー ン 7 - 4F2、 3：ク ロ ー ン 7 - 5A 4 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 5 ： ク ロ ー ン 7— 7F11、 6 : ク ロ ー ン 7— 8B2、 7 : ク ロ ー ン 7— 9B4、 8 : ク ロ ー ン 7— 10E1K 9 ： ク ロ ー ン 7— 11A5、 10 ： ク ロ 一 ン 7— 12B6、 11 ： ク ロ ー ン 7— 15E8、 12 : ク ロ ー ン 7— 18F3、 13 : ク ロ ー ン 7 — I 9F6、 14 : ク ロ ー ン 7— 20C2、 15 : ク ロ ー ン 7— 21B12、 16 ： ク ロ ー ン 7— 23G9。
第 1 HIに示さ れ る と こ ろ 力 ら 明 ら 力 な よ う に、 上記 の モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体は 、 いずれ も ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と 交叉す る こ と がわ力 つ た。
実施例 3
サ ン ド ィ ツ チ酵素免疫測定法
(a) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体結合ボー ル の調製法
J . Immunoassay 4, 209 ~ 327( 1983)に記載の石川 ら の 方法に従 っ て実施例 1 ( i )で得 ら れた モ ノ ク ロ 一 ナル抗 体を 0.1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ ム 含有 0.1 M リ ン 酸緩衝液 （ PH 7.5) に溶解 し、 それを 100 i3Z mi2 (A28。 = 0.15) の濃度 に調整 し た後、 そ の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体溶液に ポ リ ス チ レ ン ボ ー ル（径 6.5mm、- Prec is ion Plastic Bal l製） を 浸 漬 し、 4 °Gに 24時間静置 し た 。 次に モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 溶液を除去 し た後、 0. 1 % BSA、 0. 1 %塩化ナ ト リ ウ ム及 び 0.1 % ア ジ化ナ ト リ ゥ ム含有 10mMリ ン 酸緩衝液（pH7.0)
(以下緩衝液 A と 略記す る ） で 5 回洗浄 し た後、 緩衝液
A に 浸 し、 4 。Cで保存 し た 。
■ (b) サ ン ド イ ッ チ測定法
精製 し た コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー溶液、 あ る レ、 は コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 含む試料溶液を 1 % B SAを含 む緩衝液 A で希釈 し 、 各試験管に 300 μ ώを加え た。 次に 前記（ a )項で調製 し た抗体結合ボ ー ル を 加え、 37。Cで 1 時間振 と う 加温後（第 1 反応） 、 0.1M塩化ナ ト リ ウ ム 含 有 10mMリ ン 酸緩衝液（PH7.0) 3 で各試験管 を 3 回洗浄 し た。 次に実施例 2 ( a)項で調製 した Fab ' - POD複合体を 20ngZ試験管と な る よ う に 0. 1 % BSA及び 0. 1 M塩化ナ ト リ ウ ム 含有 10mMリ ン酸緩衝液（PH7.0) で希釈 し 30°C で 1 時間振 と う 加温 し た （第 2 反応） 。 反応終了後、 第 1 反 応終了時 と 同様に 洗浄 し た 。 次 に 0 . 1 M酢酸緩衝液 （ pH 5.5) に溶解 し た POD基質、 す な わ ち 0.0134% テ ト ラ メ チ ル ベ ン チ ジ ン （TMBZ) を 0.3mi2加え 、 更に 0.01%過酸化水 素 O. lrafiを 加え て 30°Cで 1 時間振 と う 加温（第 3 反応） 後、 1 .33 N硫酸 0.6mJ2を添加す る こ と に よ り 反応を停止 さ せ た 。 そ の反応混液の A4 5。値 を 分光光度計で測定 し 、 標準 直線 よ り'試料 中 の コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー 量 を 求 め た 。
(c) サ ン ド イ ッ チ測定用 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の選択
コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 定量す る こ と が可能な モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体の組み合わ せ を探す 目 的で実施例 1 (i) 項の方法で精製 し た ク ロ ー ン 7— 3F1、 7— 6C1、 7— 19F6、 お よ び 7— 21B12の各モ ノ ク 口 一 ナ ル抗体か ら Fab'- POD複 合体を調製 した。 一方、 ク ロ ー ン 7— 3F 1、 7 — 4F2、 7 - 5A1、 7 - 6C1、 7 - 7F1 l 7— 8B2、 7 - 9B4、 7— 10E11、 7 一 1U5、 7 - 12B6、 7 - 15E8、7 - 18F3、 7 - 19F6、 7 - 20C2、 7— 21B12、 お よ び 7— 23G9 の各モ ノ ク ロ ー ナル抗体を 固 相 と して、 試験管当た り I nsの精製 し た ゥ シ齒髄コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を用 い て実施例 3 ( b )項の方法に よ り サ ン ド イ ッ チ定量を行 っ た。 得 ら れた A4 5。値を後掲の 第 2 表に示す。 な お、 第 2 表中の A4 5。値は試料 l ng添加 の値力 ら コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー を添加 し な い時の値 を差 し引 い た数値であ る 。 上記 4 種類の いずれの Fab ' - P0D複合.体を 用 いた場合に おい て も 、 固相 と し て 7— 4F2、 7- 11A5、 7 - 12B6、 7 - 18F3、 7- 20C2、 お よ び 7 - 23G9 の 6 種類の抗体を用 い た時の A4 5。が 2 以上の値を示 し た。 次に こ れ ら 24通 り の組み合わ せ につ いて、 ゥ シ歯髄コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー の添加量を変えてサ ン ド ィ ツ チ定 量を 行 っ た。 Fal)' (ク ロ ー ン 7— 6C1) — PODを複合体 と し て、 ク ロ ー ン 7 — 23 G9抗体を 固相 と し た場合に得 られた 結杲を第 2 図 に示す。 第 2 図 に示す よ う に、 添加 し た ゥ シ齒髄コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 5。の間に直線関 係が成立 し、 定量感度は試験管当た り 約 i pg(32 a πιοώ) であ っ た。 上記以外の組み合わ せにつ いて も 上記の直線 関係がみ ら れ、 い ずれの組み合わせ につ い て も サ ン ド ィ ツ チ定量が可能であ る こ と がわか っ た 。
実施例 4
ヒ ト 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 の 同定
(a) ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム の調製
Nature 214, 1302〜 1304 ( 1967 )に記載の Axenら お よ び
Proc . Nat l - Acad. Sc i . USA , 6^ 636- 643 (1968) に記 載の C ua t r e c as a s ら の方法に従つ て臭化 シァ ン を介 して 担体の セ フ ァ ロ ー ス 4 B に リ ガ ン ド と し て実施例 l ( i ) 項で得 ら れた精製モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 固定化 し た 。 次 に 抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B ゲル 0 . 3 m £を ガ ラ ス管に充 填 し 、 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化 カ ル シ ウ ム 含有 30mMト リ ス — 塩酸緩衝液（PH8.0) で平衡化 し使用 し た 。
(b) ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー
ヒ ト 血清 l ra j2を 0 . 1 M塩ィ匕ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化 カ ル シ ウ ム 含有 30mM 卜 リ ス — 塩酸緩衝液（PH8.0) に対 し て透析 し た後、 上記（ a )項記載の方法に 従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7— 21B12抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム に供 し 、 上記緩衝液で洗浄 し （非吸着画分）、 次 に カ ラ ム を 2 M塩化ナ ト リ ゥ ム含有 30mM ト リ ス — 塩酸緩衝液（PH7.5) お よ び 0.5 M塩化ナ ト リ ゥ ム 含有 0.2 M グ リ シ ン — 水酸化 ナ ト リ ゥ ム 緩衝液（PH 10.5)で順次洗浄 し （洗浄画分）、 最 後 に カ ラ ム に 吸着 し た蛋 白質 を 0 . 2 M グ リ シ ン — 塩酸緩 衝液（PH2.0)で溶出 し た （溶出画分） 。 得 ら れ た溶 出画分 を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 m M塩化カ ル シ ウ ム含有 30mMト リ ス ー 塩酸緩衝液（PH8.0) 中で透析 し た後、 も う 一度 ク ロ ー ン 7— 21B12抗体結合セ フ ァ ロ ー ス 4 B カ ラ ム を 用 い た再ァ フ ィ 二 テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に供 し、 上 記 と 同様の操作に よ り 溶出画分に コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を得た。 そ こ で、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体力 ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー と 交叉する のか否かを検討す る ため、 上記 の溶出画分 を SDS-PAGEに供 した後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ を行 っ た。 第 3 図は ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ後 の ニ ト ロ セ ル ロ ー ス膜を 1 : ク ロ ー ン 7 - 3F1、 2 : ク ロ ー ン 7— 6C1、 3 ： 7 - 19F6、 4 ： ク ロ ー ン 7— 21B 12お よ び 5 ： ク ロ ー ン 7 - 23G9の各モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体か ら賙製 した Fa - POD複合体で免疫染色を行 っ た結果を示す も の であ る 。 第 3 図 に示さ れ る よ う に、 ヒ ト 血清中 に も ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 ど反応す る コ ラ ゲナ 一ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る こ と が わか っ た。 し かも 、 それ ら の分子量は いずれ も 実施例 1 ( a )項で得 ら れた ゥ シ歯髓 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ 一 の それ と 同 じ 32 , 000 D であ る こ と がわ力 つ た。
実施例 5
サ ン ド イ ッ チ測定法に よ る ヒ ト 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量
(a) 標準直線の作成
ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー を サ ン ド イ ッ チ定量す る の に最 も 適 し た モ ノ ク ロ ー ナル抗体の組み合わせ に つ い て検討 し た。 実施例 3 ( c )項に示 し た よ う に 、 ゥ シ歯 髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を 感度良 く 定量で き る 4 種 類の Fab ' -POD複合体、 すなわち、 Fab ' (7— 3F1 )-P0D、 Fab'(7- 6C1)- P0D、 Fab' (7 - 19F6)- PODお よ び Fab' (7- 21 Bl 2) -PODと 6 種類の固相用抗体、 す な わ ち 、 ク ロ ー ン 7 - 4F2、 7 - 11A5、 7 - 12B6、 7 - 18F3、 7 - 20C2および 7— 23G 9の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 いた 24通 り の組み合 わ せ の う ち 、 実施例 4 ( b )項 に 記載 し た と お り に カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー処理 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 定量で き る 組み合わ せ を 調べた。 そ の結果、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を抗原 と し た場合、 用 い た ほ と ん どの組み合わ せで A 4 5。の シ グナ ル は全 く 検 出 さ れ な か っ たが、 固相用抗体 と し て ク ロ ー ン 7-23G9抗 体、 複合体 と し て Fab' (ク ロ ー ン 7- 6C1)— PODを 用 い た場 合、 サ ン ド イ ッ チ定量可能であ る こ と がわ力 つ た 。 次 に 、 上記の組み合わせ を 用 い て、 実施例 3 ( c )項に示 し た方 法に よ り 、 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の添加量 を変え てサ ン ド ィ ツ チ定量 を 行 う こ と に よ っ て標準直線 を 作成 し、 得 ら れた結果 を 第 4 図 に示す。 第 4 図 に み ら れ る よ う に 、 添加 し た ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量 と A45。の間 に 直線関係が成立 し 、 ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量が可能であ る こ と がわ 力 つ た 。 し 力、 し 、 そ の定量感度は試験管当 た り 約 10pg(320 a raofi) で あ り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の場合の定量 感度〔試験管当た り 1 P。に比べて 10倍低い こ と がわか つ た 。
(b) 息者血清中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量
上記（ a )に おいて示 し たモ ノ ク ロ ーナル抗体の組み合 わせ を用 い て健常人血清 95検体、 屎癸性肝臓癌息者血清 100検体およ び転移性肝臓癌患者血清 3 検体の 中に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し、 そ の結果を そ れぞれ第 3 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 した。 な お、 こ のサ ン ド.イ ッ チ定量に お いて、 標準直線の作成 に は抗原 と して実施例 4 (b)項で精製 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ 一 ゼ イ ン ヒ ビタ ー を用 いた。 ま た、 こ の定量は検体 血清を 1 % BSAを含む緩衝液 Aで 1 , 600倍に希釈 して行 つ た。 第 3 表の 1 お よ び 2 に示 し た数値は同一の実験系 を 2 回行 っ た結杲の平均値であ る 。 第 3 表の 1 にみ ら れ る よ う に、 健常人血清 l mi2中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は平均 1.59土 0.37 であ る の に 対 し 、 原発 性肝臓癌患者血清お よ び転移性肝臓癌患者血清 1 中 に 存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は第 3 表の 2 お よ び 3 に見 ら れ る よ う に それぞれ平均 3.22± 2.10 i2お よ び 7.81± 3-87；^と 高い値を示 し た。 一方、 肝硬変患者血清 46検体、 慢性活動性肝炎息者血清 45検体お よ び慢性非活 動性肝炎息者血清 26検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し た値を それぞれ、 第 4 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た。 そ の結杲、 肝硬変息者血 清中、 慢性活動性肝炎患者血清中お よ び慢性非活動性肝 炎患者血清中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は それぞれ平均 1.52土 1.08/^、 1.55士 0.58 お よ び 1.10土 0.48^であ り 、 こ れ ら の値は い ずれ も 健常人血清中 に存 在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 有意の差は認め ら れな 力 つ た 。
実施例 6
ヒ 卜 血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の精製
実施例 4 の （b )で最終的 に 得 ら れた溶出画分中 に は前 述 し た と お り 、 ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 と 反応す る コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ーが存在す る （第 3 図参照） 。 し カゝ し 、 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー以外 に も 、 上記モ ノ ク ロ ー ナル抗体 と は 反応 し な い蛋 白質が多種存在す る こ と が認め ら れた。 そ こ で 、 こ の溶出画分 を 0.1M リ ン酸緩衝液（PH7.5)で平衡 ィ匕 し た AcA 44カ ラ ム を 用 レ、 てゲノレ ^過 を 行い、 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と 他の蛋 白質 と を 分離す る こ と に よ り ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 精製 し た 。 第 5 図 は得 ら れ た血清 コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー （ 1 )、 対照 と し て の ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 （ 2 ) お よ び分 子量マ ー カ 一 （3)の各 SDS-PAGEパ タ 一 ン を 示 し て い る 。 第 5 図 に み ら れ る よ う に、 ヒ 卜 血淸 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の分子量は ゥ シ歯髓 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の そ れ と 同様、 32, 000 D であ る こ と がわ 力 つ た 。
実施例 7
サ ン ド イ ッ チ測定法 に お け る 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線の作成
実施例 6 に おいて得 ら れた精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビ タ 一の添加量を変え て、 実施例 5 の（ a)項記載 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合わ せ を 用 い てサ ン ド ィ ッ チ定量を行 う こ と に よ っ て標準直線を作成 した。 得 ら れ た結果は第 6 図 に示す と お り であ る 。 第 6 図に み ら れる よ う に、 添加 し た ヒ ト 血清コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー量 と Α45。の間に直線関係が成立 し、 こ の時の定量感度は試 験管当 た り 1.5p (48 a πιοβ)であ っ た。 こ の定量感度は、 実施例 5 の （a)項で作成 し た標準直線の場合に比べて 6.7 倍高 く 、 ま た、 実施例 3 の（ c )項記載の ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の場合に比べて 1 . 5倍低い こ と がわ か つ す： 。
実施例 8
サ ン ド ィ ツ チ測定法に よ る ヒ ト 血清中 あ る い は ヒ ト 血清 中の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定量に基づ く 肝臓癌疾 息の診断
(a) 肝疾患息者血清中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビタ 一の定 実施例 7 に お い て示 し たモ ノ ク ロ ー ナル抗体の組み合 わ せ を用 い て健常人血清 50検体、 原癸性肝臓癌息者血清 100検体お よ び転移性肝臓癌患者血清 3 検体の中 に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を サ ン ド ィ ツ チ定量 し、 そ の結杲を そ れぞれ、 第 5 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た な お、 こ の サ ン ド イ ッ チ定量に おい て、 標準直線の作成 に は抗原 と し て実施例 6 で精製 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を 用 い た 。 ま た、 こ の定量 は検体血清 を 1 % BSAを含む緩衝液 A で 1 , 600倍に希釈 し て行っ た。 第 5 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た数値は同一の実験糸 を 2 回行 っ た結果の平均値であ る 。 第 5 表の 1 に み ら れ る よ う に 、 健常人血清 Ι τηβ中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一量は平均 184 ± 31 であ る の に対 し 、 原発性肝 臓癌患者血清お よ び転移性肝臓癌患者血清 1 m2中 に 存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量は第 5 表の 2 お よ び 3 に 見 ら れ る よ う に それぞれ平均 484 ± 316ngお よ び 1171土 712ngと 高い値 を示 し た。 一方、 肝硬変患者血清 46検体、 慢性活動性肝炎患者血清 45検体お よ び慢性非活動性肝炎 患者血清 26検体の 中に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一を サ ン ド イ ッ チ定量 し た値を そ れぞれ、 第 6 表の 1 、 2 お よ び 3 に示 し た 。 第 6 表 に 見 ら れ る よ う に 、 肝硬変 患者血清中、 慢性活動性肝炎患者血清中 お よ び慢性非活 動性肝炎患者血清中に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一量 は それぞれ平均 228土 163ng、 233± 88n お よ び 166土 73ngであ り 、 こ れ ら の値 は い ずれ も 健常人血清中 に存在 す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量 と 有意の差 は認め ら れ な カゝ つ た 。
(b) 肝疾患患者血漿中 の コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の定
Br . J . Haematol . 31, 239 - 247C 1976)に 記載の Lud 1 am と Cashの方法 に従 っ て、 健常人血液お よ び原発性肝臓癌 疾患恩者血液か ら それぞれの血漿を採取 し た。 な お、 こ こ で採取 し た血漿は、 血液に EDT i プ ロ ス タ グ ラ ン ジ ン E 、 お よ びテ オ フ ィ リ ン を 加え冷却 し た後、 4 °C で 1900 X g 60分間遠心分離 し て得 ら れた上澄であ り 、 血液中の 血小板は、 分解 さ れずに沈殿画分に と どま つ て い る 。
上記の如 く し て得 ら れた健常人血漿 26検体お よ び原発 性肝臓癌患者血漿 8 検体の 中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を上記（ a )項に示 し た の と 同 じ方法を用 いて サ ン ド ィ ツ チ定量 し た。 そ の結果は後掲の第 7 表に示 さ れ る と お り であ る 。 第 7 表にみ ら れ る よ う に、 健常人血 漿 i mfi中 に存在す る コ ラ ゲナ 一 ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は平均 64 ± l ongであ る の に対 し、 原発性肝臓癌疾患患者血槳中 に存在す る コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー量は平均 583 ± 447 n と 高い値を示 し た。
C c ) モ ノ ク ロ ー ナル抗体 と コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー と の特異的反応の確認
実施例 4 、 C b )項に示 し た よ う に、 サ ン ド イ ッ チ測定 法に用 い る 2 種類の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体（ク ロ ー ン 7 - 6 C 1 と ク ロ ー ン 7— 23G9 ) は ヒ ト コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビタ ー と 反応す る が、 血清あ る い は血漿な どの よ う に、 種々 の蛋 白質が高濃度で溶解 し てい る 系でも 、 こ の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体がコ ラ ゲナ ーゼ ィ ン ヒ ビタ ー と 特異的 に反応 し て い る こ と を確認す る た め の試験 を行 っ た。
健常人血清あ る い は肝臓癌患者血清を 0 . 1 M塩化ナ ト リ ゥ ム お よ び 5 mM塩ィ匕カ ル シ ウ ム含有 30 mM卜 リ ス ー塩酸 緩衝液 （ PH8.0) で 5 倍に希釈 し た後、 実施例 4 の （a)項 記載の方法に従 っ て調製 し た ク ロ ー ン 7-23G9 ( サ ン ド ィ ツ チ測定法の固相用抗体） 結合セ フ ァ ロ ー ス 4Bカ ラ ム に 供 し 、 実施例 4 の （ b )項記載の方法に 従 っ て溶出画分 を 得た。 こ の溶出画分 を SDS- PAGEに供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を 行 レ、 、 サ ン ド イ ッ チ 測定法の標識抗体 で あ る Fab' (ク ロ ー ン 7— 6C1)— POD複合体で免疫染色 を 行 つ た。 そ の結果 は第 7 図 に示す と お り であ る 。 1 ： 精製 ヒ ト 血清 コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一 、 2 ： 健常人血清、 3 ： 肝臓癌患者血清の い ずれ を用 い た場合 に も 、 単一バ ン ド を 示す こ と か ら 、 本発明 の診断法に お け る サ ン ド ィ ツ チ測定法では、 極め て特異的 に コ ラ ゲ ナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ 一だ けが定量 さ れて い る こ と が示 さ れた 。
以上述べた こ と カゝ ら 明 ら かな よ う に 、 本発明方法を 用 い る こ と に よ り 、 肝臓癌疾患の診断 を 、 簡便に 、 短時間 内 に さ ら に感度良 く 行 う こ と がで き る 。
X
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Figure imgf000030_0002
2
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第 3 表 の 1
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第 3 表 の 2 原 性 肝 臓 癌 患 者 血 清 コラゲ + コラゲナ コラゲナ コラゲ十 検体 ーゼィン 侠体 —セ ン 検体 ーゼィン 検体 ーゼイ ン 口
ヒビタ一 せ 食^" グ一 ヒビター
OlgZ O,ヽ (ttg / 0,~)
八
1 3.38 26 7-08 51 1.53 76 2.32
2 2.28 27 1-00 52 4.17 77 1.58
no
3 2-35 28 4.00 bo 2.83 7o 5.27
4 4.25 29 54 2. id 79 2.44 no
5 4.32 30 00 4.87 2.13
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10 7.39 35 DU gi 00 0.82
11 3.07 36 0 A A di 4.1/ oD 2.32
o 07
12 3.67 37 丄 DZ 丄 0/ 1.85
0
13 13.77 38 0.00 o 00
00 2.99
14 3.61 39 ο· /U o4 on
0.00 2.24
15 4.32 40 1 18 u 9 · 01 on 2.91
16 4.17 41 2.99 66 3.38 91 2.49
17 2.04 42 4.56 67 4.63 92 2.09
18 1.37 43 1.65 68 1.46 93 1.53
19 1.46 44 1.70 69 1.89 94 2.16
20 1.53 45 1.65 70 4.10 95 3.46
21 5.59 46 1.22 71 1.46 96 1.10
22 1.89 47 1.80 72 2.98 97 1.97
23 1.80 48 1.34 73 2.99 98 1.46
24 2.28 49 1.34 74 1.37 99 3.86
25 2.16 50 1.37 75 1.65 100 3.22 平 均 3.22±2·10 /nH 第 3表の 3 転移性肝臓癌患者血清 検体 コラゲナーゼ 番号 イ ンヒ ビター
1 13.01 2 6.69 3 3.72
平均 7.81± 3.87 /md 第 4 表 の 1 肝 硬 変 患 者 血 清 検体 コラゲナ一ゼ 検体 コラゲナーゼ
c
番 ィ ノ ヒ ヒ グ ー 杳 a
ィ ノ ヒ ヒ タ ー
{ H O )
1 1.22 26 0.82
2 0.75 27 1.85
3 0.77 28 2.00
4 1.14 29 2.12
5 1.22 30 0.67
6 1.37 31 1.42
7 1.03 32 0.80
8 1.77 33 1.03
9 1.58 34 1.70
10 1.65 35 0.64
11 1.70 36 0.94
12 2.13 37 2.12
13 1.06 38 0.57 丄4 π u . o ona b U - 4
15 2.32 40 1.49
16 2.44 41 1.80
17 2.12 42 0.79
18 1.42 43 1.42
19 1.53 44 0.66
20 1.70 45 1.49
21 2.52 46 1.49
22 0.25
23 7.63
24 1.22
25 2.11
平均 1.52±1.07 119/nQ. 第 4 表の 2
慢性活動性肝炎患者血清 検体 コラゲナ一ゼ 餘佐 コ -^ノ7 ノ -ソ一― ィ ン ヒ ビタ一 イ ン ヒ ビター
V-^/ nil)
1 1.42 26 し 92
2 2.59 27 0.86
3 1.41 28 2.91
4 3.38 29 1.37
5 1.37 30 1.15
6 1.03 31 1.30
7 1.77 32 2.24
8 1.61 33 1*10
9 1.42 34 0.76
10 1.89 35 0.72 ，
11 1.85 36 0.72
12 1.80 37 1.97
13 1.65 38 0.91
14 1-22 39 1.06
1 it) 丄 - 40 1.97
16 0.97 41 0.91
17 0.76 42 1.77
18 2.04 43 0.91
19 2.09 44 し 85
20 2.16 45 0-91
21 1.89
22 1.65
23 1.25
24 1.77
25 1.65
平均 1.55±0. 58 viQ. 第 4 表 の 3 慢性非活動性肝炎患者血清
J . ir コラゲナーゼ 横体 J フ ケナーセ イ ン z 匕 ビ夕 ー ¾：-& イ ン ヒ ビタノ ー
Ogf
1 1 ·5ο ΔΌ 0.97 o ΟΛ
丄 - il
0 丄 ·丄
A
4
r Λ Q7
0
D 1 Q7
7 π 70
Q
O 丄 ·34
π 1 A
y
1U 丄 * lb
11
o CO
\L
13 1 · lo
14 1. lb
丄 丄 · 丄 o
16 1.46
17 0.49
18 0.54
19 0.30
20 1.15
21 0.79
22 0.52
23 0.63
24 0.98
25 0.91
平均 1.10±0.48 第 5 表 の 1 人 ΠΤϊ
1111
検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
Λ ノ ヒ ヒ グ ー 番 イ ン ヒ ビター π mii
1 123 26 155
2 131 27 225
3 210 28 185
4 161 29 245
5 176 30· 200
6 210 31 210
7 200 32 210
8 191 33 176
9 155 34 165
10 210 35 176
11 155 36 176
12 200 37 185
13 170 38 245
14 210 39 155
15 123 40 210
1 ft 1
丄 0 丄 on
41 155
17 155 42 200
18 161 43 236
19 176 44 230
20 200 45 191 '
21 221 46 165
22 200 47 176
23 170 48 210
24 221 49 165
25 150 50 155 平 均 184士 31 第 5 表 の 2 原 発 性 肝 臓 癌 患 者 血 ΐη
コラゲナ フケナ コラゲナ コラゲナ 検体 —ゼイ ン 検体 ^ィ ーゼイ ン 検体 ーゼィン 番号 ヒビター 番号 ヒビター 番号 ヒビター ヒビタ一
1 507 26 1 0R9 1 230 76 348
2 342 27 9Q7 RO 626 77 237
3 353 28 uou C J:OQ 425 78 791
4 638 29 j¾ 320 79 366
5 648 30 O I 731 80 320
6 615 31 ou 791 81 248
7 201 32 丄 1 7 ί丄1 Π 1 1062 82 437
8 648 33 1299 83 437
9 141 34 708 698 84 1014
10 1109 35 336 437 85 123
11 461 36 366 61 626 86 348
12 551 37 7R 237 87 278
13 2066 38 リ 672 88 449
14 542 39 o R4 875 89 336
15 648 40 111 65 437 90 437
16 626 41 449 66 . 507 91 374
17 306 42 684 67 694 92 314 丄 1 0Q 43 248 68 厶 9丄1 Q 3
19 219 44 255 ' 69 284 94 324
20 230 45 248 70 615 95 519
21 839 46 183 71 219 96 165
22 284 47 270 72 447 97 296
23 270 48 201 73 449 98 219
24 342 49 201 74 206 99 579
25 324 50 206 75 248 100 483 平 均 484 ± 316 第 5表の 3 転移性肝臓癌患者血清 検体 コラゲナーゼ 番号 イ ン ヒ ビター
1 1952 2 1004 3 558
平均 1171±712 第 6表の 1
Figure imgf000041_0001
第 6表の 2 慢性活動性肝炎息者血清 検体 コラゲナーゼ 検体 コ ラゲナーゼ
¾ イ ン ヒ ビタ ー ¾ イ ン ヒ ビタ ー
1 213 26 288
2 389 27 129
3 212 28 437
4 507 29 206
5 206 30 173
6 155 31 195
7 266 32 336
8 242 33 165
9 213 34 114
10 284 35 108
11 278 36 108
12 . 270 37 296
13 248 38 137
14 183 39 159
15 278 40 296 丄 D A T
1 0 4丄 丄0 /
17 114 42 266
18 306 43 137
19 314 44 278
20 324 45 137
21 284
22 248
23 188
24 266
25 248
平 均 233 ± 88 第 6表の 3 慢性非活動性肝炎患者班清 快 W ノ ア -ァί- J LT 恢 コ フ ケナ tr 番号 イ ンヒ ビター ¾:号 イ ン '々 一
1
丄 Δό ί ώ!3 1 t) o 丄 yiD
ό q 丄 03
Ai 丄
1 0
u onfi
7 丄 uo
Figure imgf000043_0001
Q ^flii丄l
丄 u 丄 1 71 Q
丄 1 丄 1 079
丄 1 o乙
丄》J 1 77
丄 1 4 ¾ 丄 / ϋ
15 177
16 219
17 74
18 81
19 45
20 173
21 119
22 78
23 95
24 147
25 137
平 均 166 土 73 第 7 表 is* 2* R gat
吊 入 皿 乘
Figure imgf000044_0001
検体 コラゲナーゼ 検体 コラゲナーゼ
¾ イ ン ヒ ビター 番号 イ ン ヒ ビター n^/ il J π / mil )
1 61 1 175
2 78 2 431
3 44 3 1534
4 70 4 943
5 75 ' 5 261
6 84 6 429
7 70 7 366
8 54 8 523
9 49
10 74
11 73
12 64
13 72
14 62
15 67
16 54
17 74
18 51
19 57
20 53
21 60
22 60
23 64
24 56
25 62
26 74
平 均 64±10 平 均 583 ±447 〔図面の簡単な説明〕
第 1 図 は ゥ シ歯髄 コ ラ ゲ ナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー を S D S - PAGEに 供 し た後、 種 々 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い た時 の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グノく タ ー ン を示す 図 であ り 、 第 2 図は固相 7— 23G9抗体一複合体 Fab ' ( 7— 6C 1 )— POD測 定系での ゥ シ歯髄 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を示す図 であ り 、 第 3 図 は ヒ 卜 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー を SDS-PAGEに 供 し た後、 ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ イ ン グ を行 っ た時の免疫染色のパ タ ー ン を 示す図 であ り 、 第 4 図は固相 7 - 23G9抗体一複合体 Fab ' (7 - 6C 1 ) -P0D測定 系での ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー の標準直線 を 示す 図 であ り 、 第 5 図 は ヒ ト 血清か ら 精製 し た コ ラ ゲナ ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー の SDS- PAGEノ、。 タ ー ン を 示す図 であ り 、 第 6 図 は精製 し た ヒ ト 血清 コ ラ ゲナ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ 一 を 用 い て、 サ ン ド ィ ツ チ測定 し た時の標準直線 を 示す 図で あ り 、 第 7 図 は ヒ 卜 血清 を I gG(7— 23G9)抗体結合ァ フ ィ 二 テ ィ カ ラ ム に供 し て得 ら れた溶出画分を SDS- PAGEに 供 し た後、 Fab' (7— 6C1)-P0D複合体 を 用 い た時の ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ ノ タ ー ン を 示す図 であ る 。

Claims

求 の 範 囲
コ ラ ゲナ ー ゼィ ン ヒ ビタ ーの異な る 抗原決定基に対 し 特異的 に結合す る 2 種類のモ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の組み合 わせを用 いたサ ン ド ィ ツ チ法に よ り 、 酵素免疫学的に血 清中、 血漿中 あ る い は関節液中 に存在す る コ ラ ゲナ ーゼ イ ン ヒ ビ タ ー を定量 し、 そ の定量値を健常人の値 と 比較 する こ と を特徵 と す る 肝臓癌疾患の診断法。
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