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WO1987006007A1 - Substance physiologiquement active immobilisee - Google Patents

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WO1987006007A1
WO1987006007A1 PCT/JP1987/000185 JP8700185W WO8706007A1 WO 1987006007 A1 WO1987006007 A1 WO 1987006007A1 JP 8700185 W JP8700185 W JP 8700185W WO 8706007 A1 WO8706007 A1 WO 8706007A1
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WO
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physiologically active
carrier
immobilized
group
active substance
Prior art date
Application number
PCT/JP1987/000185
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English (en)
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Inventor
Shoji Nagaoka
Hajimu Kurumatani
Yuichi Mori
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries, Inc. filed Critical Toray Industries, Inc.
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    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Definitions

  • the present invention relates to an immobilized physiologically active substance and an immobilizing material for immobilizing the physiologically active substance.
  • immobilization is to make these naturally water-soluble physiologically active substances water-insoluble without impairing their functions, including various methods such as carrier binding, cross-linking, and inclusive methods.
  • the carrier binding method of immobilizing a target physiologically active substance via a covalent bond with a carrier has the strongest binding force and does not come off, and is the most stable, and there are many reported examples.
  • a water-insoluble carrier (R-NH 2 ) having an amino group is converted into a diazonium compound using dilute sulfuric acid and sodium nitrite, and diazo-bonded to a protein (eg, albumin) for immobilization ( Nat. Acad. Sci., 37, 575 (1951)).
  • this carrier binding method has been improved to consist of a n-alkyl chain with a bioactive substance to be bound to the carrier
  • n-alkyl groups are water-insoluble regardless of the terminal functional group, and it is necessary to use an organic solvent to introduce them into the carrier.However, depending on the carrier, the n-alkyl group may be dissolved in the organic solvent, damaged or damaged. Because of the possibility of denaturation, the selection range is significantly limited.
  • the surface of the carrier that has been hydrophobized by the introduction of such a hydrophobic spacer is coated with other physiologically active substances, especially proteins. Non-specific adsorption and denaturation of the substance are likely to occur, which may impair the original function of the immobilized bioactive substance.
  • An object of the present invention is to provide a bioactive substance-immobilizing material capable of highly expressing the function of a bioactive substance when immobilized, and a highly active immobilized bioactive substance immobilized thereby. Aim.
  • the present invention relates to an immobilized physiologically active substance in which a carrier and a physiologically active substance are bound via an alkylene oxide, and an immobilizing material therefor.
  • ⁇ is from 2 to: L is an integer of 0, m and n are 0 or a positive integer, and
  • copolymer may be a block copolymer in a random copolymer, also may be a mixture thereof, particularly a degree of polymerization of. 2 to 1 0 ⁇ ethylene Okisai degrees (? One CH CH 2 0 -)
  • a block copolymer or a homopolymer having a content of 50% by weight or more is preferred.
  • the carrier used in the present invention has at least a surface insoluble in water. That is, the entire carrier may be composed of a water-insoluble material, or may be a carrier in which the surface of a water-soluble material is covered with a water-insoluble material.
  • water-insoluble refers to a substance which exhibits substantially no solubility in water at 20.
  • a water-insoluble material a natural or synthetic organic or inorganic polymer is used. Examples of such a polymer include those shown below. These polymers are subjected to a crosslinking treatment as necessary to make them water-insoluble.
  • Cellulose such as cellulose acetate, polysaccharides such as dextran, collagen, polyolefins such as polyethylene and polypropylene, vinyl compounds such as vinyl acetate, vinyl chloride, acryl nitrile, acrylate, methacrylate, and styrene alone Or copolymers, polyesters such as polyethylene terephthalate and polybutylene terephthalate, and aliphatic and aromatic polyamides.
  • the carrier of the present invention has an alkylene oxide as a support. Since the side chains are bonded, it is necessary for the carrier to contain a functional group as a bond with the spacer, and therefore, when such a functional group does not exist, Is subjected to an activation treatment for introducing a functional group.
  • Representative examples of the functional group are an amino group and an epoxy group.
  • the alkylene oxide side chain can be introduced into the carrier. it can.
  • the form of the carrier is appropriately determined depending on the purpose. For example, spheres, cylinders, disks, test tubes, cylinders, fibers, membranes, particles, nets, micro trays, etc.
  • ultrafine fibers having a density of 1.0 denier or less are used as a carrier.
  • the polymer constituting the ultrafine fibers is appropriately selected from polyester, polyamide, polytetrafluoroethylene, polystyrene, polyolefin, cellulose, polyamino acid, collagen, and the like, and polyester is particularly preferred.
  • the final polymer remaining is the above-mentioned polymer, but other combination components include polystyrene, polyethylene, water-soluble polyamide, alkali-water-soluble polyester, and water-soluble polymer. There is vinyl alcohol and the like.
  • the ultrafine fibers made of the above polymer are generally used as a tissue such as woven, knitted or nonwoven fabric for the carrier of the present invention.
  • the method (1) is preferred, and an alkylene oxide compound having an amino group or an epoxy group at the terminal as a functional group is particularly preferred.
  • an alkylene oxide having an amino group as a functional group at both terminals with a carrier comprising a polymer having a functional group capable of binding to an amino group.
  • a carrier comprising a polymer having a functional group capable of binding to an amino group.
  • functional groups include, for example, epoxy groups
  • polymers include, for example, those containing glycidyl methacrylate as a copolymer component, and uncured epoxy resins. I can give it.
  • a carrier made of a water-insoluble copolymer containing a monomer unit represented by or a carrier coated with this monomer can be used.
  • the copolymer component Any polymerizable and water-insoluble polymer can be used, and examples thereof include methyl methacrylate, acrylonitrile, styrene, and vinyl chloride. Copolymerization with a crosslinkable monomer such as diethylene glycol dimethacrylate is also a preferred method.
  • the thickness of the coating layer is not particularly limited, but is usually preferably 100 A or more.
  • the material inside the carrier is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include organic polymers, glass, and metals.
  • the position of the alkylene oxide chain bonded to the surface of the carrier can be arbitrarily adjusted by changing the chemical composition of the carrier, reaction conditions, and the like.However, in order to obtain an effective amount of the immobilized physiologically active substance, is preferably bonded carriers lc ⁇ per 1 X 1 0- 8 mo l or more.
  • a functional group capable of forming a covalent bond with the physiologically active substance is introduced into the end of the alkylene oxide chain, and the functional group is introduced. Immobilization can be easily performed by covalently bonding the group and the physiologically active substance.
  • Examples of the functional group capable of forming a covalent bond by reacting with a physiologically active substance include an amino group, a carboxyl group, an evoxy group, a hydroxyl group, a carbodiimide group, an aldehyde group, and an iso group.
  • a dazole group and the like can be mentioned, a hydroxyl group, an amino group, an epoxy group and the like are particularly preferable because of easy introduction into a pod compound terminal.
  • the formation of a covalent bond between these functional groups and a physiologically active substance is described in, for example, "Immobilized Enzyme", edited by Ichiro Chiba, P. 11-40, Kodansha (19775). Well-known techniques can be used.
  • glutaraldehyde is used as a binder to form the amino acid of the polyethylene oxide compound.
  • a Schiff base can be formed and immobilized between the group and a physiologically active substance, for example, an amino group in a protein.
  • the physiologically active substance to be immobilized has a carboxyl group
  • the physiologically active substance is preliminarily replaced with a carbodiimide reagent or a padward reagent (N-ethyl-5-phenylisoxazolyl).
  • a condensing agent such as PEM-3-sulfonate
  • physiologically active substances to be immobilized include enzymes such as asparaginase, perease, and perokinase; hormones such as human chorionic gonadotropin and thyroid-stimulating hormone; albumin; and various complements.
  • Dragon reams clotting factors such as thrombin and antithrombin M Plasma proteins such as coagulation inhibitors, immunoreactive substances such as mycoplasma antigens, anti-estrogen antibodies, mucopolysaccharides such as heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid; Amino acids such as alanine, lysine, glutamic acid, and aspartic acid; various prostaglandin derivatives; lipid derivatives such as phosphatidyl choline; glycolipids such as lipopolysaccharide; antibiotics such as polymyxin B and chloramphenicol Substances, red blood cells, white blood cells (granulocytes
  • a carrier in which the above-mentioned PGD-100 was introduced into a polyvinyl chloride copolymer film containing an epoxy group was synthesized by the following procedure.
  • PVC polychlorinated vinyl chloride
  • DMF ⁇ -dimethylformamide
  • DTC sodium getyldithiocarbamate
  • a film with a thickness of about 100 m was prepared by a solvent casting method using glass, and this film was immersed in a 50% aqueous solution of PGD-1000, and After reacting for a time, a film surface spacer was introduced.
  • heparin sodium 800 and pad reagent KO.07 g dissolve in 10 Oml of phosphate buffered saline (PBS), and slowly shake with 4 for 8 hours. While activating heparin. To this activation. 3. Immerse the above-mentioned PGD-1000 introduction film in a phosphorus solution; The reaction was allowed to proceed at C for a time to immobilize heparin on the film surface.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the film was washed three times with PBS to remove unfixed heparin, and a 2 M ethanolamine PBS solution adjusted to pH 7.4 with hydrochloric acid was added4. The remaining active groups of heparin were blocked by shaking with C for 24 hours.
  • the surface of the heparin-immobilized film obtained in this way was analyzed by ESC A (EI ectron Spectroscopy for Chemical Analysis, using Shimadzu X-ray electron spectrometer ESC A75 °). Heparin was found to be immobilized (Heparin activity measurement) Activated partial thromboplastin time (APTT) was used to measure the anticoagulant activity of immobilized heparin.
  • a carrier containing hexamethylenediamine and diaminododecane as spacers was synthesized under exactly the same conditions, and heparin was immobilized, and the activity was measured. Table 1 shows the results. Margin below
  • the anticoagulant activity of heparin immobilized by using the spacer of the present invention is higher than that of heparin immobilized by using other known hydrophobic ⁇ -alkyl spacers. It was significantly higher than the anticoagulant activity.
  • the polymer particles (10 g) are sufficiently washed with water and suspended in 1 M NaOH8 Oml. Epiclorhydrin (10 ml) is added thereto, and the mixture is vigorously stirred at room temperature for 24 hours. After the completion of the reaction, the carrier having the epichlorohydrin-activated polyethylene oxide spacer is collected, and excess epichlorohydrin is removed by washing with water. Next, the suspension was converted to 2 M potassium carbonate buffer containing 3 s of sulfanilic acid (PH10). Suspend in. Adjust the pH to 10 again and let it stand for 6 days. Fluoroglycinol is allowed to act on the carrier obtained by the above method. After adding 5% divinyl sulfone to this phlorogrisinol derivative and reacting it at pH 30 for 30 minutes, a soybean trypsin pollutant is added as a ligand under the condition of PH9.
  • a soybean trypsin-damaging agent-immobilized carrier using polyethylene oxide having a degree of polymerization of 9 as a spacer was obtained.
  • hydroxyethyl ethyl methacrylate was used as a copolymer component of MMA, polymer particles were prepared under exactly the same conditions, a carrier in which a soybean trypsin-poisoning agent was fixed was prepared, and the trypsin adsorption capacities were compared. Table 2 shows the results. Table 2 Trypsin adsorption capacity of various carriers
  • the adsorbent obtained by this method exhibited a high adsorption capacity.
  • Polypropylene (Mitsui "Noblen” J 3 HG) 50 400 g of sea-island composite fiber with a mixture of 46 parts of polystyrene (“Stylon” 679) and 4 parts of polypropylene (Sumitomo “Rebren” WF-727-F) as the sea component.
  • Monochloroacetamide 5 60 g, nitrobenzene 3100 m, immersed in a mixed solution consisting of 2020 ml of concentrated sulfuric acid and 8 ff of paraformaldehyde, and reacted for 2 hours at TC (reacted for 1 hour at TC.
  • the fiber had a diameter of 0.5 denier.
  • 3000 mi of a 20 wt% dimethyl sulfoxide solution of the same bisaminopolyethylene oxide compound (PGD-1000) used in Example 1 was added to the fiber A80.
  • the reaction was allowed to stand at room temperature for 48 hours, washed with 20 ⁇ of water, and then with 1 NHC1.
  • the fiber was washed again with 20 ml of water to obtain a fiber into which a polyethylene oxide chain having a terminal amino group was introduced.
  • the amount of polymyxin B immobilized on the fiber was measured by amino acid analysis and was 3. SmffZg-fiber.
  • Table 3 shows the results of measuring the antibacterial activity of these fibers using Escherichia coli ⁇ E-Coli, ATCC 25922). Margin below
  • the material for immobilizing a physiologically active substance of the present invention can be immobilized while maintaining the function of the physiologically active substance at a high level. Therefore, the biologically active substance immobilized in this manner is used as a substrate for affinity mouth chromatography for the separation and purification of the substance, a component of a kit for diagnosing and treating a disease, and a bioinertant. Can be used as material

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Description

明 細 書
固 定 化 生 理 活 性 物 質
技 術 分 野
本発明は固定化された生理活性物質および該生理活性 物質を固定化するための固定化材に開する。
背 景 技 術
従来、 生理活性物質を固相担体に固定化する研究は数 多く知られている。 今日、 この研究の主体をなすものは 酵素の固定化であるが、 その他にも抗原、 抗体など免疫 学的反応性物質を固定化した医療用材料あるいは、 特定 の生理话性物質を吸着させるためのァフィニテイクロマ トグラフィー用分離基材、 さらには有用な菌体、 細胞な どの有形成分を固定化したバイオリアクター、 人工臓器 などがあげられる。
ここで固定化とは、 本来水溶性であるこれら生理活性 物質をその機能を損なうことなく水不溶性にすること.で あり、 これには担体結合法、 架橋法、 包括法などいろい ろな手法が用いられるが、 担体との間に共有結合を介し て目的とする生理活性物質を固定化する担体結合法は結 合力が強く離脱しないため最も安定であり報告例が多い。 一例をあげるならばアミノ基を有する水不溶性の担体 ( R - N H2 ) を希硫酸と亜硝酸ソーダによってジァゾ ニゥム化合物と し、 これとタンパク質 （たとえばアルブ ミン） とでジァゾ結合させ固定化する （Chambel lら、 Pr oc. Nat. Acad. Sci .，37， 575 (1951 )) などである。 一方、 近年この担体結合法の改良として、 担体と結合 すべき生理活性物質との閭に n—アルキル鎖からなる
"スぺーサ一" または "アーム" と呼ばれる直鎮状構造 を導入することが行なわれている。 これは、 このような 構造を導入することによって、 その先端に固定化された 生理活性物質が基質と反応する際の立体障害が緩和され、 その機能が発現しやすくなるためである。
たとえば K i mらは鎮長が 2、 4、 8、 1 0、 1 2の n—アルキル鎖をスぺーサ一として有するァガロースビ ーズに抗凝固物質であるへパリンを固定化し、 活性化部 分トロンボプラスチン時閭 （ APTT ) で測定したその 抗凝固活性がアルキル鎖長が長くなるにつれて増大する ことを見出し、 これを "スぺーサ一効果 " と名づけた ( K i mら、 Thrombosis Researc ,26, 43 (1982))0 しかし、 n—アルキル鎖のような疎水性のスぺーサ一 は本質的に水溶性である生理话性物質との親和性が低く、 その結果、 固定化率が低下したり、 固定化に際し生理活 性物質の変性、 失话をまねくことがある。 また、 長い n 一アルキル鎮は末端官能基の如何にかかわらず水不溶性 であり、 その担体への導入には有機溶媒を用いる必要が あるが、 担体によっては有機溶媒により溶解したり、 破 損、 変性したりする場合があるため、 その選択範囲が著 しく限定される。
さらにこのような疎水性スぺーサ一の導入により疎水 化した担体表面には、 他の生理活性物質、 特にタンパク 質の非特異的吸着 · 変性がおこり易く、 このために固定 化された生理活性物質本来の機能が損なわれる場合があ る。
本発明は、 固定化したときに生理活性物質の機能を高 度に発現し得る生理活性物質固定化材およびそれによ.つ て固定化された高活性の固定化生理活性物質を提供する ことを目的とする。
発 明 の 開 示
上記目的は、 アルキレンオキサイ ド鎖をスぺーサ一と して導入することによって達成される。 すなわち本発明 は、 担体と生理活性物質とをアルキレンォキサイ ド鎮を 介して結合された固定化生理活性物質およびそのための 固定化材である。
発明を実施するための最良の形態 本発明でスぺーサ一と して好ましく用いられるアルキ レンォキサイ ド鎖は、 下記式
CH3
CH2 CH2 Ο ^- v, CH2 CHO + H—I - - CH2 CH2 CH2 CH20+ Π
(ただし、 ϋ は 2〜： L 0 0の整数、 m、 nは 0または正 の整数であり、 かつ
4 4 ϋ
≥ 0 . 5である）
4 4 ί + 5 8 m + 7 2 n ン才キサイ ドまたはエチレンォキ サイ ドの共重合体である。 共重合体の場合は、 ランダム 共重合体でもブロック共重合体でも良く、 またこれらの 混合物でも良いが、 特に重合度が 2〜 1 0 ◦のエチレン ォキサイ ド単位 （一 C H ? C H 2 0 - ) 含有率が 5 0重 量％以上のブロック共重合体またはホモ重合体が好まし い c
本発明に用いられる担体は、 少なくともその表面が水 不溶性のものである。 すなわち、 担体の全てが水不溶性 の素材から構成されていても良いし、 水溶性の素材の表 面が水不溶性の素材によって被覆されて成る担体であつ ても良い。 ここに言う水不溶性とは、 2 0でにおいて水 に対し実質的に溶解性を示さないものを言う。 このよう な水不溶性の素材と しては、 天然または合成の有機また は無機重合体が用いられる。 かかる重合体と しては、 以 下に示すようなものを例示することができ、 これらは水 不溶性とするために必要により架橋処理が施される。
酢酸セルロースなどのセルロース系、 デキストランな どの多糖類、 コラーゲン類、 ポリエチレンやポリプロピ レンなどのポリオレフイン類、 酢酸ビニル、 塩化ビニル、 アクリル二トリル、 アクリル酸エステル、 メタクリル酸 エステル、 スチレンなどのビニル化合物の単独または共 重合体、 ポリエチレンテレフタレートゃポリブチレンテ レフタレートなどのポリエステル、 脂肪族や芳香族のポ リアミ ド。
本発明の担体にはスぺ一サ一としてのアルキレンォキ サイ ド鎖が結合されるから、 担体中にはスぺーサ一との 結合手と しての官能基が含まれていることが必要であり、 従って、 そのような官能基が存在しない場合には、 官能 基導入のための活性化処理が施される。 官能基の代表例 は、 ァミノ基とエポキシ基である。 また後述のように、 アルキレンォキサイ ド鎖を側鎖として有する単量体を、 担体を構成する重合休の共重合成分として用いることに より、 アルキレンォキサイ ド鎖を担体中に導入すること もできる。
担体の形態は、 目的に応じて適宜決定される。 たとえ ば、 球、 円柱、 円板、 試験管、 円筒、 繊維、 膜、 粒子、 網、 マイクロトレイなどである。 特に好ましい態様は、 1 . 0デニール以下の極細繊維を担体として用いるもの である。 極細繊維を構成するポリマーは、 ポリエステル、 ポリアミ ド、 ポリテトラフルォロエチレン、 ポリスチレ ン、 ポリオレフイン、 セルロース、 ポリアミノ酸、 コラ 一ゲンなどから適宜選択されるが、 特にポリエステルが 好ましい。 多成分系繊維を用いる場合は、 最終的に残る ポリマーは上記ポリマーであるが、 他の組み合わせ成分 と しては、 ポリスチレン、 ポリエチレン、 水溶性ボリァ ミ ド、 アルカリ水溶液可溶型ポリエステル、 水溶性ポリ ビニルアルコール等がある。 上記ポリマーからなる極細 繊維は、 一般には、 織り、 編み、 不織布などの組織とし て本発明の担体に使用される。
ド鎖を担体表面に結合せしめる方 法としては、 たとえば
( 1 ) カツプリング反応を利用する方法、 あるいは
( 2 ) 側鎖にアルキレンォキサイ ド鎮を有し、 かつ重合 可能な炭素一炭素二重結合をもつ単量体からなる重合体、 または共重合体を利用する方法などがあげられるが、
( 1 ) の方法が好ましく、 特に官能基としてアミノ基ま たはエポキシ基を末端に有するアルキレンォキサイ ド鎮 を用いることが好ましい。
具体的には、 たとえば両末端に官能基としてアミノ基 を有するアルキレンォキサイ ド鎮の過剰量をァミノ基と 結合しうる官能基を有する重合体からなる担体と反応せ しめることによって達成される。 このような官能基とし ては、 たとえばエポキシ基などがあり、 またこのような 重合体としては、 たとえばグリジジルメタクリレートを 共重合成分と して含有するもの、 あるいは未硬化のェポ キシ樹脂などをあげることができる。
一方、 （ 2 ) の方法は、 たとえば
式 R
Z
Figure imgf000008_0001
(ただし、 P は 2以上の整数、 Rは Hまたは C H 3 を 示す）
で示される単量体単位を含有する水不溶性の共重合体か らなる担体、 あるいはこの単量体で被覆された担体を利 用することができる。 共重合成分としては該単量体と共 重合可能で水不溶性の重合体を形成しうるものであれば いずれでもよいが、 たとえばメチルメタクリレート、 ァ クリロニトリル、 スチレン、 塩化ビニルなどをあげるこ とができる。 また、 ジエチレングリコールジメタクリレ —トなどの架橋性単量体との共重合も好ましい方法であ る。
この共重合体を被覆剤として用いる場合、 その被覆層 の厚みは特に限定されるものではないが、 通常は 1 0 0 A以上が好ましい。 この際、 担体の内部の材質は特に限 定されるものではなく、 その目的に応じて適宜選択でき るが、 たとえば有機重合体、 ガラス、 金属などを例示す ることができる。
担体表面に結合するアルキレンォキサイ ド鎖の置は、 担体の化学組成、 反応条件などをかえることにより任意 に調節することが可能であるが、 生理活性物質の有効 な固定化量を得るためには、 担体 l c^あたり 1 X 1 0— 8 mo l 以上結合していることが望ましい。
担体に結合されたアルキレンォキサイ ド鎖に、 生理话 性物質を固定化させるには、 アルキレンオキサイ ド鎖の 末端に生理活性物質と共有結合を形成しうる官能基を導 入し、 該官能基と生理活性物質とを共有結合させること により容易に固定化することができる。
生理活性物質と反応し共有結合を形成しうる官能基と しては、 たとえば、 アミノ基、 カルボキシル基、 ェボキ シ基、 水酸基、 カルボジィ ミ ド基、 アルデヒド基、 ィソ ダゾール基などがあげられるが、 ポ ド化合物末端への導入の容易さから、 特に水酸基、 アミノ基、 エポキシ基などが好ましい。 こ れらの官能基と生理活性物質との共有結合形成には、 た とえば千畑一郎編 「固定化酵素」 P 1 1〜4 0 講談社 ( 1 9 7 5 ) に記载されているような周知の手法を用い ることができる。
一例をあげるならば、 水不溶性の担体表面に結合した ポリエチレンォキサイ ド化合物が遊離のアミノ基末端を 有する場合、 グルタルアルデヒドを結合剤と して使用す ることにより、 ポリエチレンォキサイ ド化合物のアミノ 基と生理活性物質、 たとえばタンパク質中のアミノ基と の間にシッフ塩基を形成せしめて固定化することができ る。
また、 たとえば固定化されるべき生理活性物質がカル ボキシル基を有するような場合には、 あらかじめ該生理 活性物質をカルボジィ ミ ド試薬、 あるいはゥッドワード 試薬 （ N—ェチル— 5—フヱニルイソォキサゾリゥム — 3—スルホナート〉 のような縮合剤で処理しておくこ とにより容易に前述の担体に固定化される。
た、 固定化の対象となる生理活性物質の例をあげれ ば、 ァス'パラギナーゼ、 ゥレアーゼ、 ゥロキナーゼなど の酵素類、 ヒト絨毛性ゴナドトロピン、 甲状線刺激ホル モンなどのホルモン類、 アルブミン、 各種補体鬨連物質、 トロンビンなどの凝固因子およびアンチトロンビン Mな どの凝固抑制因子などに代表される血漿タンパク質、 マ ィコプラズマ抗原、 抗エス卜ロゲン抗体などに代表され る免疫反応性物質、 へパリン、 へパラン硫酸、 コンドロ ィチン硫酸、 ヒアルロン酸などのムコ多糖類、 ァラニン、 リジン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸などのアミノ酸 類、 各種のプロスタグランジン誘導体、 ホスファチジル コリンなどの脂質誘導体、 リポポリサツカライ ドのよう な糖脂質、 ポリ ミキシン B、 クロラムフヱニコールのよ うな抗生物質、 赤血球、 白血球 〈顆粒球とマクロファー ジ〉 、 リンパ球などの血液細胞、 血管内皮細胞、 肝細胞、 膝^細胞などの上皮、 あるいは内皮系細胞あるいはこれ ら細胞の分化、 生長に鬨連する E C G F、 C S Fなど各 種の分化、 生長因子、 D N A、 R N Aなどの遺伝子鬨連 物質などがあげられるが、 目的に応じて適宜選択できる。
以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
実施例 1および比較例 1、 2
(スぺーサ一の合成）
重合度 2 3 〈数平均分子量 1 0 0 0 〉 のポリエチレン グリコールとアクリロニトリルとの混合液を、 微粒子状 の強塩基性陰イオン交換樹脂 "アンバーライ ト I R A—
4 0 0 " ( Rohm & Haas 社製〉 の存在下でシァノエチル 化反応させ、 両末端に /3—シァノエチキシ基を有するボ リエチレンォキサイ ド化合物を得た。 この化合物 1 ◦ 0 ff を ΐ ϋ の水に溶解し、 6 CTCで 6時間、 水素添加を行 なうことにより、 両末端にアミノ基を有し、 重合度 2 3 のビスアミノポリエチレンォキサイ ド化合物 （ PGD— 1 000 ) 1 g-を合成した。
(担体の合成〉
担体として、 下記の手順で、 エポキシ基を含有するポ リ塩化ビニル共重合体フィルムに上述の P GD— 1 00 0を導入した担体を合成した。
まず、 市販のポリ塩化ビュル （ P VC ) を 4 の Ν， Ν—ジメチルホルムアミ ド （ DMF ) に溶解し、 1 1 g のジェチルジチォカルバミン酸ナトリウム （ DTC〉 を 加え、 遮光下に 50 で 3時間反応せしめ、 光官能性 D 丁（ 化 （ を合成した。
この DTC化 PVCの 50 gを 1 ϋ のテトラヒドロフ ラン （ T H F〉 に溶解し、 80 gのグリシジルメタクリ レート （ GMA ) を添加し、 1 00wの高圧水銀灯を用 いて、 4 (TCで 6時間光グラフト反応を行ない、 ェポキ シ基を含有するポリ塩化ビニルーグリシジルメタクリレ —ト グラフト共重合体 （ PVC— g— GMA〉 を合成 した。 元素分析により決定されたこのグラフト共重合体 のグラフト率は 86%であった。
このポリマの 5 %TH F溶液からガラス扳を用いた溶 媒キャスト方式で約 100 mの厚みを有するフィルム を作成し、 このフィルムを P G D— 1000の 50 %水 溶液に浸漬し、 60でで 24時間反応せしめフィルム表 面ヘスぺーサ一を導入した。
ベンジルアミンと 2—ヒドロキシ一 1—ナフチルアミ ド （ HNA〉 のァダクト形成を利用した導入アミノ基の 定量 （ D.Ebert et al. , J. Biomed. Hater. Res. , 16, 629(19δ2))によればフィルム表面に導入された P G D— 1 〇 0 0は0. 7 ίηοΙ/αであった。 また P G D— 1 〇 0 0の導入により、 フ ィルム表面での水の接触角 （協和 科学 （株） 製 C Α - Ρ型接触角測定装置使用〉 が 65 ' から 43。 にまで低下し明らかにフィルム表面が親水化 していることがわかった。
(へパリンの固定化）
ガラス容器中に、 へパリンナトリウム 800 、 ゥッ ドヮ一ド試薬 K O . 07 gを入れ、 リン酸緩衝生理食塩 水 〈 P B S ) 1 0 Omlに溶解し、 4でで 8時間ゆつく り と撹拌しながらへパリンを活性化させた。 この活性化へ ノ、。 リン溶液に前述の P GD— 1 0 0 0導入フイルム浸漬 し、 4。Cで時間反応させへパリンをフィルム表面に固定 化した。
反応終了後、 フィルムを P B Sで 3回洗浄し、 未固定 のへパリンを除去し、 塩酸で P H 7. 4に調整した 2 M エタノールァミン P B S溶液を加え 4。Cで 24時間浸盪 してへパリンの残留活性基をブロックした。 このように して得られたへパリン固定化フイルム表面には、 E SC A (E I ectron Spectroscopy for Chemical Analysis, 島 津 X線電子分光装置 E SC A75◦使用） 分析により 0. 2
Figure imgf000013_0001
のへパリンが固定化されていることがわかった (へパリン活性測定〉 固定化へパリンの抗凝固活性の測定には活性化部分卜 ロンボプラスチン時間 （ APTT) を用いた。
すなわち、 3. 8%クェン酸ナトリウム液を抗凝固剤 と して用い、 遠心して細胞成分を除いたゥシ血漿を被検 血漿とした。 この血漿 1mlの中に 2 Οαίの表面積を有す るへパリン固定化フィルムを入れ、 37 で 30分撹拌 後、 血漿とフィルムを分離した。 この血漿をシリコンコ 一トしたガラス製試験管に入れ、 さらに活性化リン脂質 製剤 0. 1 mlを加えて、 30秒間 37 eCで 5分間加温し、 ついで 1Z40M 0 3«0 12 溶液0. 1 miを加えて、 3〇秒間 37。Cに静置し、 試験管を静かに傾けてフィブ リン析出までの時間を AT P Pとして測定した。
また比較例と して、 全く同じ条件でへキサメチレンジ ァミンおよびジァミノドデカンをスぺーサ一と して有す る担体を合成し、 へパリンを固定化して、 その活性を測 定した。 結果を表 1に示す。 以 下 余 白
r
n Cn
表 1 各種スベーサ一を用いた塩化ビニルフィルムへの へパリンの固定化とその活性
Figure imgf000015_0001
この表からもわかるように、 本発明のスぺーサーを用 いて固定化されたへパリンの抗凝固活性は、 他の公知の 疎水性 η—アルキルスぺーサーを用いて固定化されたへ パリンの抗凝固活性に比べて著しく高いものであった。 実施例 2および比較例 3
1 0 0 0 gのィソプロパノール中に 1 20 gのメチル メタクリレート （ MMA〉 と 80 sのポリエチレングリ コールモノメタクリレート （ポリエチレングリコール部 分の数平均重合度 9、 日本油脂 （株） 製、 "ブレンマー P E - 3 50 " ) および 1. 4 gの 、 a ' —ァゾビス 、 a、 a ' —ジメチルバレロニトリル） を入れ、 窒素気 流下に 5 (TCで反応させた。 5時閩後に得られた重合溶 液を底部の 2謹の細孔を有する容器にうつし、 約 l mの 高さから、 撹拌冷水中に再沈することにより、 直径が 5 0〜1 00 mのポリマー粒子を得ることができた。 E S CA分析によるとこのポリマー粒子表面には、 約 20 關 Ol/gのポリエチレングリコール鎮が存在していること がわ力 3つた。
このポリマー粒子 1 0 gを水で十分洗浄し、 1 M N a OH8 Oml中に懸濁する。 これにェピクロルヒドリン 1 0 mlを加え、 室温で 24時閭激しく撹拌反応させる。 反応終了後ェピクロルヒドリン活性化ポリエチレンォキ サイ ドスぺーサ一を有する担体を集め、 過剰のェピクロ ルヒドリンを水洗して除去する。 次にこの担休をスルフ ァニル酸 3 sを含む 2 M炭酸力リウム緩衢液 （ P H 1 0 ) 中に懸濁する。 あらためて P Hを 1 0に調整し直したの ち 6日間静置する。 以上の方法で得られた担体にフロロ グリシノールを作用させる。 このフロログリシノール誘 導体に 5 %ジビニルスルホンを加え、 p H l lで 3 0分 反応させたのち、 P H 9の条件下、 リガンドとして大豆 トリプシン疎害剤を加える。
この方法により、 重合度 9のポリエチレンォキサイ ド をスぺーサ一とした大豆トリプシン踩害剤固定化担体を 得ることができた。 比較例として MMAの共重合成分と してヒドロキシェチルメタクリレートを用い、 全く同じ 条件でポリマ粒子を作成し、 大豆トリプシン疎害剤を固 定化した担体を作成し、 トリプシンの吸着容量を比較し た結果を表 2に示す。 表 2 各種担体のトリプシン吸着容量
Figure imgf000017_0001
以上のように本法で得られた吸着体が高い吸着容量を 示した。
実施例 3および比較例 4
ポリプロピレン （三井 "ノーブレン" J 3 H G ) 5 0 分を島成分とし、 ポリスチレン （ "スタイロン" 679 ) 46部、 ポリプロピレン （住友 "レーブレン" WF— 7 27-F ) 4部の混合物を海成分とする海島型複合纖維 400 g、 N—メチロール一な一クロルァセトアミ ド 5 60 g、 ニトロベンゼン 3100 mし 濃硫酸 2020 ml および、 パラホルムアルデヒド 8 ff からなる混合液溶液 中に浸し、 2 (TCで 1時間反応させた。 繊維を反応液か ら取り出し、 0での氷水 5ϋ 中に投じて反応停止させた のち、 水で洗浄し、 次に繊維に付着しているニトロベン ゼンをメタノールで抽出し、 除去した。 この繊維を 40 で真空乾燥して、 クロルァセトアミ ドメチル化繊維
(繊維 Α) を得た。
この繊維の直径は 0. 5デニールであった。 次に該纖 維 A 80 に対し、 実施例 1で用いたのと同じビスァ ミノポリエチレンォキサイ ド化合物 （ PGD— 1000 ) の 20Wt%ジメチルスルホキシド溶液 3000 miを添加 した。 室温で 48時間静置反応させ、 水 20ϋ で水洗後 1 NHC 1で洗浄した。 再度水 20ί で水洗し、 末端が ァミノ基のポリエチレンォキサイ ド鎖が導入された繊維 を得た。
この繊維の 1. 3 をフラスコに入れ、 グルタルアル デヒドの 3%リン酸緩衝生理食塩水溶液 < PB S ) を加 え、 室温で 4. 5時閭浸盪した。
PB Sで十分洗浄後、 ポリペプチド系抗生物質硫酸ポ リミキシン Β (フアイザ一社製） の 2. 5wt%水溶液と P B S 7 miを加えて 4 で 24時閭ゆつく り撹拌しな がら固定化を行なった。 さらに、 トリス緩衝液中に 4で、 24時間浸漬し残留しているフリーのアミノ基をブロッ クした。 ついで、 このフィルムを水素化ホウ素ナトリウ ムの 0. 1 Wt%P B S溶液 5 ml中に移し、 室温で 24時 閭撹拌し、 形成されたシッフ塩基を還元して、 ポリミキ シン B固定化繊維 （ P MX— P E 0 ) を得た。
アミノ酸分析により、 この繊維に固定化されたポリ ミ キシン Bの量を測定したところ、 3. SmffZg -f iberで あった。
比較例として全く同様の方法でジァミノドデカンをス ぺーサ一と してポリミキシ Bを固定化した繊維 （ PMX
- C 12) を得た。 この繊維には、 3. 8m?Zff -fiberの ポリミキシン Bが固定化された。
大腸菌 〈 E-C0l i， ATCC 25922 ) を用いて、 こ れらの繊維の抗菌活性を測定した結果を表 3に示す。 以 下 余 白
表 3 ポリミキシン B固定化
Figure imgf000020_0001
実験条件： ボリミキシン B固定化繊維 1 gを菌液 3 0 mlに浸漬、 3 7でで浸盪後、 菌数を測定。 以上のように、 アルキルスぺーサ一に比べて本発明の スぺーサーを用いて固定化されたポリ ミキシン Bは、 高 い抗菌活性を示した。
産業上の利用可能性
本発明の生理活性物質固定化材は、 生理活性物質の機 能を高度に保持したまま固定化することができる。 従つ て、 このようにして固定化された生理活性物質は、 物質 の分離や精製のためのァフィニティーク口マトグラフィ 一用基材、 病気の診断や治療のためのキットの構成要素 生体内ィンアラント材などとして利用することができる

Claims

請 求 の 範 囲
1. 担体と生理活性物質とがアルキレンオキサイ ド鎖 を介して結合されてなる固定化生理活性物質。
2. アルキレンオキサイ ド鎖が式
CH3
I
CH2 CH2 O + CH2 CHO +m + CH2 CH2 CH2 CH20 +
(ただし、 ϋ は 2〜 1 0 0の整数、 m、 nは 0または正 の整数であり、 かつ
44
一 ≥ 0. 5である〉
44 ϋ + 58 m+ 7 2 n で示される重合体である請求の範囲第 1項記載の固定化 生理活性物質。
3. mおよび nが 0である請求の範囲第 2項記載の固 定化生理活性物質。
4. 担体が水不溶性の素材からなる請求の範囲第 1項 記載の固定化生理活性物質。
5. 担体が 1 . 0デニール以下の極細繊維である請求 の範囲第 1項記載の固定化生理活性物質。
6. アルキレンオキサイ ド鎖の一端が、 担体に結合さ れ、 他端に生理活性物質と反応性の官能基が導入されて なる生理活性物質固定化材。
7. アルキレンオキサイ ド鎖が式 CH3
+ CH2 CH2 O^- -f CH2 CHO -) - 十 CH2 CH2 CH2 CH20 +n
■& 1 丄 I丄
(ただし、 Hま 2〜： L ◦ ◦の整数、 m、 nは 0または正 の整数であり、 かつ
44ϋ
≥ 0 - 5である）
44 J2 -t- 5 S m - 7 2 n で示される重合体である請求の範囲第 6項記載の生理活 性物質固定化材。
8. mおよび riが 0である請求の範囲第 6項記載の生 理活性物質固定化材。
9. 担体が水不溶性の素材からなる請求の範囲第 6項 記載の生理活性物質固定化材。
1 〇 . 担体が 1 . 0デニール以下の極細繊維である請 求の範囲第 6項記載の生理活性物質固定化材。
1 1 . 官能基が、 アミノ基、 カルボキシル基、 ェポキ シ基、 水酸基、 カルボジィ ミ ド基、 アルデヒド基、 ィソ シアナ一ト基、 およびィ ミダゾール基からなる群から選 ばれる一種以上である請求の範囲第 6項記載の生理活性 物質固定化材。
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