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WO1986004240A1 - Plasma substitute - Google Patents

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WO1986004240A1
WO1986004240A1 PCT/EP1985/000589 EP8500589W WO8604240A1 WO 1986004240 A1 WO1986004240 A1 WO 1986004240A1 EP 8500589 W EP8500589 W EP 8500589W WO 8604240 A1 WO8604240 A1 WO 8604240A1
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WO
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hemoglobin
polymer
activated
inositol
phosphate
Prior art date
Application number
PCT/EP1985/000589
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen GUDJONS
Peter Wiesert
Roland Reiner
Original Assignee
Battelle - Institut E.V.
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Filing date
Publication date
Application filed by Battelle - Institut E.V. filed Critical Battelle - Institut E.V.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A61K38/42—Haemoglobins; Myoglobins

Definitions

  • the invention relates to a blood substitute based on biocompatible polymers and hemoglobin.
  • Oxygen-transporting preparations with and without plasma expander effects are already known as blood substitutes. If you leave the fluorocarbons because of their fully synthetic
  • the simplest preparation to produce is the stroma-free hemoglobin solution. Since this contains neither membrane structures nor antigen determinants, the problems of typing and sensitization are eliminated.
  • the main disadvantage of the stroma-free hemoglobin solution is the too short intravascular half-life, which should be six to twelve hours for a blood or plasma substitute.
  • the average circulating half-life for batches of 6% stroma-free hemoglobin solutions is 100 to 140 minutes. 240 minutes after the exchange of 2 ml / kg of whole blood, only approx. 20% stroma-free hemoglobin solution can be detected in the bloodstream.
  • Another disadvantage of the stroma-free hemoglobin solution is the oxygen binding curve that is clearly shifted to the left in vitro compared to the oxygen dissociation curve of normal blood.
  • the stroma-free hemoglobin solution can only be accepted as a blood substitute if, on the one hand, it is possible to increase the intravascular residence time and on the other hand the release of oxygen from to facilitate the oxygen-loaded hemoglobin tetramer.
  • hemoglobin since the accessible reactive groups in hemoglobin are also responsible for their typical biological properties such as oxygen and carbon dioxide transport, a covalent bond to these groups also necessarily leads to a different biological function of the hemoglobin.
  • preparations could be made whose intravascular half-life is sufficient for twelve hours, there is usually an increase in oxygen affinity at the same time.
  • a stroma-free hemoglobin solution can be prepared by coupling pyridoxal phosphate to the terminal amino groups with a permanently reduced oxygen affinity.
  • pyridoxal phosphate to the terminal amino groups with a permanently reduced oxygen affinity.
  • the invention has for its object a hemoglobin to be developed with an increased intravascular residence time and reduced oxygen affinity.
  • the agent according to the invention is produced by activating a water-soluble polymer by introducing free OH, NH, SH and / or COOH groups and then with a compound which has the ability to bind hemoglobin absorptively and phosphate and sulfate - And / or contains sulfonate groups, is reacted and that the resulting product is then brought together with hemoglobin. Further developments of the method according to the invention are described in subclaims 6 to 10.
  • affinors which have a high affinity for hemoglobin and at the same time shift the oxygen dissociation curves to the right are covalently bound to various polymers which act as a carrier compound. It is thereby achieved that the polymer molecule is adsorbed firmly on hemoglobin via the affinity component and thus the elimination of the hemoglobin via the kidney is made more difficult by the higher molecular weight. At the same time, the oxygen affinity of the adsorptively bound hemoglobin is reduced compared to the stroma-free hemoglobin.
  • any known plasma substitute can be used as the polymer.
  • polysaccharides in particular dextran, are preferably used.
  • inositol hexaphosphate in the series 2,3-diphosphoglycerate / adenosine triphosphate / inositol tetraphosphate / inositol pentaphosphate / inositol hexasulfate / inositol hexaphosphate causes the greatest decrease in the oxygen affinity of hemoglobin.
  • the hemoglobin / inositol hexaphosphate complex has the lowest dissociation constant in the series: 2,3-diphosphoglycerate / inositol pentaphosphate / inositol hexasulfate / inositol hexaphosphate.
  • 2,3-diphosphoglycerate / inositol pentaphosphate / inositol hexasulfate / inositol hexaphosphate Apart from these suitability factors, inositol hexaphosphate occurs naturally in the human organism. In principle, there are compounds that have an even greater affinity for hemoglobin and an even smaller one
  • Dissociation constants of the corresponding complex have as inositol hexaphosphate. These are above all analogue substances which have more than six phosphoric acid or sulfate residues.
  • the water-soluble polymer is activated to produce the blood substitute according to the invention.
  • this can be carried out synthetically most simply and with the best conversion rates by catalytic reaction with epichlorohydrin.
  • a catalyst e.g. Zinc tetrafluoroborate used.
  • Zinc tetrafluoroborate used as a catalyst e.g. Zinc tetrafluoroborate used.
  • this compound (I) converts to the very reactive epoxy variant (II):
  • hemoglobin affinor for example inositol hexaphosphate (IHP)
  • IHP inositol hexaphosphate
  • R represents an inositol ring with five remaining phosphoric acid groups.
  • a product according to the invention can be prepared starting from 3-amino-2-hydroxypropyl-dextran (IV), which is obtained by reacting 3-chloro-2-hydroxypropyidextran (I) or the epoxy variant (II) in an aqueous medium with ammonia can be.
  • the unreactive amino group of 3-amino-2-hydroxypropyl-dextran (IV) has to be activated, e.g. by dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or epichlorohydrin.
  • Polyamines e.g. Triethylenetetramine or polyethyleneimine groups can be locally enriched on the modified dextran.
  • Epichlorohydrin activated phosphate groups, the inositol hexaphosphate activated with epichlorohydrin and the alkali metal hydrogen phosphate also treated with epichlorohydrin.
  • the polymer is precipitated by pouring it dropwise into 1 liter of acetone, filtered off, washed with acetone and dried in vacuo. For further purification, the product is repeatedly dissolved in a little water and alternately precipitated by dropping it in acetone or methanol. 4 g of 3-chloro-2-hydroxypropyl-dextran are obtained as a white powder which is soluble in water. Average chlorine content: c a. 3%.
  • 3-Chloro-2-hydroxypropyl-dextran modified with triethylenetetramine is dissolved in water, mixed with an aqueous solution of the activated phosphate and stirred. The reaction solution is then concentrated in an ultrafiltration cell over a PM-10 membrane. The reaction product is precipitated by pouring it into methanol. After the precipitation has settled, the product is filtered off with suction, washed with methanol and dried. Average phosphorus content: approx. 6%
  • the inositol hexaphosphate / dextran coupling products are examined by gel chromatography for the coupling and their suitability for adsorption on hemcglobin.
  • Different mixtures of the coupling products with hemoglobin are separated by gel chromatography according to their molecular weight.
  • the chromatograms of the mixtures of hemoglobin with the coupling products always show two peaks which are more or less separate depending on the chromatography conditions (gels, eluents, etc.). This shows that, in addition to the pure hemoglobin, the fraction of a higher molecular weight, hemoglobin-containing product is present, which can be separated off by gel chromatography.
  • the coupling products cause the expected right shift of the oxygen dissociation curve of the hemoglobin.

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Description

Blutersatz
Beschreibung
Die Erfindung betrifft einen Blutersatz auf der Basis von bioverträglichen Polymeren und Hämoglobin.
Sauerstofftransportierende Präparate mit und ohne Plasmaexpanderwirkung sind bereits als Blutersatz bekannt. Läßt man die Fluorkarbone wegen ihres vollsynthetischen
Charakters außer acht, so gibt es noch eine Reihe halbsynthetischer und natürlicher Produkte.
Das von der Herstellung einfachste Präparat ist die stromafreie Hämoglobinlösung. Da diese weder Membranstrukturen noch Antigendeterminaten enthält, entfallen sowohl die Probleme der Typisierung als auch der Sensibilisiarung. Der wesentliche Nachteil der stromafreien Hämoglobinlösung liegt in der zu kurzen intravasalen Halbwertzeit, die für ein Blut- bzw. Plasmaersatzmittel sechs bis zwölf Stunden betragen sollte. Die mittlere zirkulatorische Halbwertzeit liegt für Chargen 6 %iger stromafreier Hämoglobinlösungen bei 100 bis 140 Minuten. 240 Minuten nach Austausch von 2 ml/kg Vollblut sind nur noch ca. 20 % stromafreier Hämoglobinlösung im Blutkreislauf nachweisbar. Ein weiterer Nachteil der stromafreien Hämoglobinlösung ist die in vitro deutlich nach links verschobene Sauerstoff-Bindungskurve gegenüber der Sauerstoffdissoziationskurve des Normalblutes. Das bedeutet, daß die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins wesentlich erhöht ist und dadurch der Sauerstoff im Gewebe zu schwer wieder abgegeben wird. Als Blutersatzmittel kann die stromafreie Hämoglobinlösung nur akzeptiert werden, wenn es gelingt, einerseits die intravasale Verweildauer zu erhöhen und andererseits die Abgabe des Sauerstoffs von dem sauerstoffbeladenen Hämoglobintetramer zu erleichtern.
Methoden zur Lösung des Problems der zu kurzen intraversalen Verweildauer der stromafreien Hämoglobinlösungen sind bekannt. Man kann z. B. das Hämoglobintetramer einfach oder mehrfach über kovalente chemische Bindungen entweder an einen polymeren löslichen Träger binden oder über kürzere Kopplungsstücke mit weiteren Hämoglobintetrameren zu größeren Einheiten polymerisieren. Durch dieses Vorgehen erhält man Einheiten, die meist mehrere Hamoglobintetramere enthalten und so groß sind, daß sie nicht mehr ohne vorangegangenen chemisch-physiologischen Abbau durch die Niere ausgeschieden werden können. Abgesehen von den unterschiedlichen Resten, die zur kovalenten Bindung nötig sind oder als polymere Träger fungieren, wird das Hämoglobintetramer immer an mindestens einer reaktiven Stelle durch die kovalente Bindung verändert. Da die zugänglichen reaktiven Gruppen im Hämoglobin jedoch auch für deren typische biologische Eigenschaften wie Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport verantwortlich sind, erfolgt mit einer kovalenten Bindung zu diesen Gruppen zwangsweise auch eine andere biologische Funktion des Hämoglobins. Es könnten zwar Präparate hergestellt werden, deren intravasale Halbwertzeit den ausreichenden Wert von zwölf Stunden besitzen, jedoch erfolgt meist gleichzeitig eine Erhöhung der Sauerstoffaffinität. Auf der anderen Seite kann man eine stromafreie Hämoglobinlösung durch Kopplung von Pyridoxalphosphat an die endständigen Aminogruppen mit einer auf Dauer erniedrigten Sauerstoffäffinität herstellen. Zur Verbesserung der intravasalen Halbwertzeit gibt es Produkte, bei denen durch Bindungseinheiten mehrere Hämoglobinmoleküle chemisch kovalent miteinander verbunden werden. Durch diesen Vorgang der kovalenten Verknüpfungen sind diese Produkte vom Prinzip her mit den polymergebundenen Produkten vergleichbar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hämoglobin präparat mit erhöhter intravasaler Verweildauer und erniedrigter Sauerstoffäffinität zu entwickeln.
Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Hämoglobin mit einem wasserlöslichen Polymeren über Phosphat-, Sulfat-, und/oder Sulfonat-Gruppen absorptiv gebunden ist. Unteransprüche 2 bis 4 betreffen vorteilhafte Ausbildungen des erfindungsgemäßen Blutersatzes.
Das erfindungsgemäße Mittel wird dadurch hergestellt, daß ein wasserlösliches Polymer durch Einführung von freien OH-, NH-, SH- und/oder COOH-Gruppen aktiviert und anschließend mit einer Verbindung, die die Fähigkeit besitzt Hämoglobin absorptiv zu binden, und Phosphat-, Sulfat- und/oder Sulfonat-Gruppen enthält, umgesetzt wird und daß das entstehende Produkt anschließend mit Hämoglobin zusammengebracht wird. Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 6 bis 10 beschrieben.
Erfindungsgemäß werden Affinoren, die eine hohe Affinität zu Hämoglobin aufweisen und gleichzeitig die Sauerstoffdissoziationskurven nach rechts verschieben, kovalent an verschiedene Polymere, die als Trägerverbindung fungieren, gebunden. Dadurch wird erreicht, daß das Polymermolekül über die Affinorkomponente fest an Hämoglobin adsorbiert wird und somit die Ausscheidung des Hämoglobins über die Niere durch das höhere Molekulargewicht erschwert wird. Gleichzeitig wird die Sauerstoffäffinität des adsorptiv gebundenen Hämoglobins gegenüber dem stromafreien Hämoglobin erniedrigt.
Erfindungsgemäß kann als Polymer jedes bekannte Plasmaersatzmittel verwendet werden. Vorzugsweise werden jedoch Polysacharide, insbesondere Dextran, eingesetzt.
Als Affinoren sind insbesondere Phosphorsäure bzw. Derivate 8-Hydroxy-1,3,6-pyren-trisulfonat, Pyridoxalphosphat, N-(2,4-Diphosphobenzyl)-1-amino-5-naphthalinsulfonsäure, 2,3-Disphosphoglycerat, Adenosintriphoshat, Inositoltetraphosphat, Inositolpentaphosphat, Inositolhexasulfat und vorzugsweise Inositolhexaphosphat geeignet. Einerseits bewirkt Inositolhexaphosphat in der Reihe 2,3-Diphosphoglycerat/ Adenosintriphosphat/Inositoltetraphosphat/Inositolpentaphosphat/Inositolhexasulfat/Inositolhexaphosphat, die größte Abnahme der Sauerstoffäffinität des Hämoglobins. Andererseits besitzt der Komplex Hämoglobin/Inositolhexaphosphat in der Reihe: 2,3-Diphosphoglycerat/Inositolpentaphosphat/ Inositolhexasulfat/Inositolhexaphosphat die kleinste Dissoziationskonstante. Abgesehen von diesen Eignungsfaktoren kommt Inositolhexaphosphat im menschlichen Organismus natürlich vor. Prinzipiell gibt es Verbindungen, die eine noch größere Affinität zum Hämoglobin und eine noch kleinere
Dissoziationskonstante des entsprechenden Komplexes besitzen als Inositolhexaphosphat. Das sind vor allem analog aufgebaute Substanzen, die mehr als sechs Phosphorsäura-oder Sulfatreste besitzen.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Blutersatzes wird das wasserlösliche Polymer aktiviert. Am Beispiel von Dextran läßt sich dies synthetisch am einfachsten und mit den besten ümsetzungsgraden durch katalytische Reaktion mit Epichlorhydrin durchführen. Als Katalysator wird z.B. Zinktetrafluoroborat verwendet. Auf diese Weise entsteht zunächst die nicht reaktive Verbindung (I), die während der Herstellung nicht schon zu Vernetzungen führt. Im alkalischen Medium wandelt sich diese Verbindung (I) in die sehr reaktive Epoxidvariante (II) um:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
Die Kopplung des Hämoglobin-Affinors, z.B. Inositolhexaphosphats (IHP), an lösliches Dextran kann dann z.B. entsprechend folgender Reaktion erfolgen:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0002
wobei R einen Inositolring mit restlichen fünf Phosphorsäuregruppen darstellt.
Ebenso läßt sich ein erfindungsgemäßes Produkt ausgehend von 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextran (IV) herstellen, das durch Reaktion des 3-Chlor-2-hydroxypropyi-dextran (I) oder der Epoxydvariante (II) im wäßrigen Medium mit Ammoniak erhalten werden kann. In diesem Fall muß die unreaktive Aminogruppe des 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextrans (IV) aktiviert werden, z.B. durch Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Epichlorhydrin.
Figure imgf000007_0003
Figure imgf000007_0004
wobei R die obige Bedeutung besitzt.
Um eine Erhöhung der Zahl der Phosphatgruppen des Affinors zu erreichen, können mehrere aktivierte Inositolhexaphosphat-Gruppierungen oder einfach Phosphorsäuregruppen über
Polyamine, z.B. Triethylentetramin- oder Polyethylenimin- Gruppierungen auf dem modifizierten Dextran örtlich angereichert werden.
Hierzu wird epoxydaktiviertes Dextran z.B. mit Triethylentetramin umgesetzt. Dieses besitzt zwei endständige, primäre Aminogruppen, wovon eine bei der Reaktion mit 2, 3-Epoxypropyldextran umgesetzt wird. Das entstandene Produkt enthält 3 sekundäre und eine primäre Aminogruppe. Diese Aminogruppen dienen als Reaktionszentren bei der Umsetzung mit den durch
Epichlorhydrin aktivierten Phosphatgruppen, den mit Epichlorhydrin aktivierten Inositolhexaphosphat sowie den ebenfalls mit Epichlorhydrin behandelten Alkalihydrσgenphosphat.
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
Die Erfindung wird anhand nachfolgender Beispiele näher erläutert:
Beisoiel 1
Aktivierung von Dextran mit Zinketrafluoroborat/Epi chlorhvdrin
In einem 100-ml-Dreihalskolben mit Rückflußkühler und Tropftrichter werden 5 g Dextran (M=81600) unter Erwärmen im Ölbad in einer Mischung von 5 ml Wasser und 7,5 ml 25/£iger Zinktetrafluoroborat-Lösung aufgelöst. Hat die Temperatur 80ºC erreicht, tropft man unter starkem Rühren langsam insgesamt 25 ml Epichlorhydrin zu. Die Mischung wird drei Stunden bei 80ºC und anschließend bei Raumtemperatur ca. 10 Stunden gerührt.
Das Polymer wird durch tropfenweises Eingießen in 1 1 Aceton gefällt, abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt wiederholt in wenig Wasser aufgelöst und abwechselnd durch Eintropfen in Aceton oder Methanol gefällt. Man erhält 4 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran als weißes Pulver, das in Wasser löslich ist. Durchschnittlicher Chlorgehalt: c a. 3 %.
Umsetzung von 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran mit Triethylentetramin
10 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran (M=4oooo) werden in 1 1 Wasser (pH 9) aufgelöst. Nachdem einige Zeit gerührt wurde, gibt man 10 ml Triethylentetramin zu und rührt bei Raumtemperatur über Nacht weiter. Anschließend wird, wie üblich, ultrafiltriert und das Konzentrat durch Einrühren im Aceton gefällt. Elementaranalyse Stickstoff: 4,92 %
Chlor: 0,44 %
Herstellung von aktiviertem Inositolhexaohoschat
54 g Natriumphytat pH 7 werden in 100 ml Wasser gelöst, mit 10 ml Epichlorhydrin versetzt und bei 30ºC 36 Stunden magnetisch gerührt. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampf er bis zur Trockene eingeengt. Man erhält ein feines, weißes Pulver. Elementaranalyse Chlor: 10,6 % Phosphor: 15,1 %
Umsetzung von triethylentetraminmodifiziertem Dextran mit aktiviertem Inositolhexaohosphat
Mit Triethylentetramin modifiziertes 3-Chloro-2-hydroxypropyl-dextran wird in Wasser gelöst, mit einer wäßrigen Lösung des aktivierten Phosphats versetzt und gerührt. Anschließend wird die Reaktionslösung in einer Ultrafiltrationszelle über ein PM-10-Membran konzentriert. Durch Eingießen in Methanol wird das Umsetzungsprodukt ausgefällt. Nach dem Absetzen des Niederschlags saugt man ab, wäscht mit Methanol und trocknet. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 6 %
Beisoiel 2
Herstellung von 3-Amino-2-hvdroxvoropyl-dextran
4 g 3-Chlor-2-hydroxypropyl-dextran werden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt und in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben in einem Gemisch aus 60 ml Wasser und 20 ml 25%iger wäßriger Ammoniaklösung aufgelöst und bei Raumtemperatur 20 Stunden magnetisch gerührt. Anschließend gibt man die Lösung tropfenweise in 1 1 Methanol. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Zur Reinigung wird das Produkt ebenfalls wiederholt in wenig Wasser aufgelöst und durch Eintropfen in 1 1 Methanol gefällt. Man erhält 3,5 g weißes Pulver. Durchschnittlicher Stickstoffgehalt: ca. 1 %.
Umsetzung von 3-Amino-2-hydroxyprooyl-dextran mit Natriurrtphytat 18 g Natriumphytat werden nach und nach unter Rühren und gleichzeitiger Kühlung mit Eiswasser in 200 ml Wasser eingetragen. Nach beendeter Zugabe wird so lange gerührt, bis die Lösung klar ist. Dann stellt man mit Salzsäure auf pH 7 und fügt 2 g 3-Amino-2-hydroxypropyl-dextran und 300 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid unter Rühren hinzu.
10 g Dicyclohexylcarbodiimid werden in einer Mischung von 40 ml Hexamethylphosphorsäuretriamid und 20 ml
Wasser aufgelöst (eventuell unter Erwärmen) und dann zu der obigen Lösung getropft. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung bei Raumtemperatur für 48 h gerührt. Das Hexamethylphosphorsäuretriamid wird im Vakuum entfernt und die wäßrigen Lösungen ultrafiltriert. Die Konzentrate werden gefriergetrocknet. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 8 %.
Beisoiel 3
Umsetzung von Phosohatouffer oH 7 mit Epichlorhydrin
142 g (1 mol) Dinatriumhydrogenphosphat und 136 g (1 mol) Kaliumhydrogenphosphat werden in 2 1 Wasser aufgelöst und die Lösung mit verdünnter Natronlauge auf pH 7 eingestellt. Dann gibt man 111 g (1,2 mol) Epichlorhydrin zu und rührt 72 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wird am Rotationsverdampfer das Volumen der Lösung auf einen Liter eingeengt Für die Analyse werden 50 ml dieser Lösung zur Trockne eingedampft.
Elementaranalyse Chlor: 8,2 % Phosphor: 14,4 %
Die Umsetzung des aktivierten Phosphats mit triethylentetramin-modifiziertem Dextran erfolgt nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Durchschnittlicher Phosphorgehalr: ca. 5 % Beispiel 4
Umsetzung von Phosphorsäure mit Epichlorhydrin
10 g Epichlorhydrin werden unter Rühren und Eiskühlung innerhalb von 45 Minuten zu 20 g 84 %iger Phosphorsäure getropft. Nach erfolgter Zugabe wird für weitere 30 Minuten gerührt. Man verdünnt anschließend mit Wasser auf 350 ml und versetzt die Lösung dann unter Rühren nach und nach mit insgesamt 75 g Bariumhydroxid bis zur alkalischen Reaktion.
Die weitere Umsetzung mit aktiviertem Dextran erfolgt nach dem in Beispiel 1 oder 3 beschriebenen Verfahren. Durchschnittlicher Phosphorgehalt: ca. 5 %
Beispiel 5
Die Inositolhexaphosphat/Dextran-Kopplungsprodukte werden mittels Gelchromatographie auf die erfolgte Kopplung sowie ihre Eignung zur Adsorption an Hämcglobin untersucht. Verschiedene Mischungen der Kopplungsprodukte mit Hämoglobin werden gelchromatographisch nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Im Gegensatz zum reinen Hämoglobin, bei dem immer nur ein einzelner scharfer Peak auftritt, zeigen die Chromatogramme der Mischungen von Hämoglobin mit den Kopplungsprodukten in allen Fällen zwei je nach den Chromatographiebedingungen (Gele, Laufmittel usw.) mehr oder weniger voneinander getrennte Peaks. Dies zeigt, daß neben dem reinen Hämoglobin die Fraktion eines höhermolekularen, hämoglobinhaltigen Produktes enthalten ist, die sich gelchromatographisch abtrennen läßt.
Die Kopplungsprodukte bewirken die zu erwartende Rechtsverschiebung der Sauerstoffdissoziationskurve des Hämoglobins. aktivierter Phosphorsäure oder mit aktiviertem 8-Hydroxy-1,3,6-pyren-trisulfonat, Pyridoxalphosphat, N-(2,4-Diphosphobenzyl)-1-amino-5-naphthalensulfonsäure, 2,3-Diphosphoglycerat, Adenosintriphosphat, Inositoltetraphosphat, Inositolpentaphosphat und/oder Inositolhexasulfat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat umgesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer ein Plasmaersatzmittel, vorzugsweise Dextran verwendet wird.

Claims

BiutersatzPatentansorüche
1. Blutersatz auf der Basis von bioverträglichen Polymeren und Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin mit einem wasserlöslichen Polymeren über
Phosphat-, Sulfat-, und/oder Sulfonat-Gruppen adsorptiv gebunden ist.
2. Blutersatz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur adsorptiven Bindung des Hämoglobins das Polymer an mehreren Stellen mit Phosphorsäuregruppen oder mit 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonat, Pyridoxalphosphat, N-(2,4-Diphosphobenzyl)-1-amino-5-naphthalin-sulfonsäure, 2,3-Diphosphoglycerat, Adenosintriphosphat, Inositoltetraphosphat, Inositolpentaphosphat und Inositolhexasulfat, vorzugsweise Inositolhexaphosphat chemisch gebunden ist.
3. Blutersatz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an jeder Bindungsstelle 4 bis 20 Phosphat-, Sulfat- und/oder Sulfonat-Gruppen vorhanden sind.
4. Blutersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein Plasmaersatzmittel, vorzugsweise Dextran ist.
5. Verfahren zur Herstellung des Blutersatz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserlösliches Polymer durch Einführung von freien OH-, NH-, SH- und/oder COOH-Gruppen aktiviert und anschließend mit einer Verbindung, die die Fähigkeit besitzt Hämoglobin adsorptiv zu binden und Phosphat-, Sulfat- und/oder Sulfonat-Gruppen enthält, umgesetzt wird und daß das entstehende Produkt anschließend mit Hämoglobin zusammengebracht wird.
Verfahren hach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die das Hämoglobin adsorbierende Verbindung vor der Umsetzung mit dem Polymeren, vorzugsweise mit Epichlorhydrin aktiviert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet daß das Polymer durch Umsetzung mit Epichlorhydrin unter Anwesenheit eines Katalysators oder mit Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Epichlorhydrin aktiviertes Polymer zur weiteren Einführung von reaktiven Gruppen mit einem niedermolekularen Polyamin, vorzugsweise mit Triethylentetramin oder Polyethylenimin umgesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das aktivierte Polymer mit
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