SU1708849A1 - Method of plant genetic transformation - Google Patents
Method of plant genetic transformation Download PDFInfo
- Publication number
- SU1708849A1 SU1708849A1 SU894760883A SU4760883A SU1708849A1 SU 1708849 A1 SU1708849 A1 SU 1708849A1 SU 894760883 A SU894760883 A SU 894760883A SU 4760883 A SU4760883 A SU 4760883A SU 1708849 A1 SU1708849 A1 SU 1708849A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- transformation
- plants
- pollen
- selection
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 9
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000010152 pollination Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229910000399 iron(III) phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к генетике, биотехнологии и может быть использовано вселекции культивируемых растений. Цель изобретени - увеличение эффективности трансформации. Способ заключаетс в том, что определенные гены перенос т в геном растенм посредством вектора на основе Ti-плазмиды. содержащей маркерный ген (устойчивость к антибиотику), причем опыление провод т после нанесени плаз- мидной ДНК в растворе сахарозы, борной кислоты и Са(ЫОз)2, а отбор трансформантов провод т на еелективных средах, в частности среде Кнопа. содержащей канамицин. Способ позвол ет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Частота трансформации составл ет 0.6-1.45%.The invention relates to genetics, biotechnology and can be used in the cultivation of all cultivated plants. The purpose of the invention is to increase the efficiency of transformation. The method consists in the fact that certain genes are transferred to the plant genome by means of a Ti plasmid based vector. containing a marker gene (antibiotic resistance), the pollination being carried out after the application of plasmid DNA in a solution of sucrose, boric acid and Ca (NO) 2, and the selection of transformants is carried out on selective media, in particular the Knop environment. containing kanamycin. The method allows for the quick and efficient generation and selection of transformants. The frequency of transformation is 0.6-1.45%.
Description
Изобретение относитс к генетике, биотехнологии и может быть использовано в селекции культивируемых растений.The invention relates to genetics, biotechnology and can be used in the selection of cultivated plants.
Известен способ генетической трансформации растений, включающий проведение Ь4икроинъекции чухсеродной ДНК в протопласты растений.There is a known method of genetic transformation of plants, which includes carrying out a L4 microinjection of whole DNA into plant protoplasts.
Известен также способ, согласно которому экзогенную ДНК ввод т в протопласты растений методом электропорации.There is also known a method according to which exogenous DNA is introduced into plant protoplasts by the method of electroporation.
Однако указанные способы мало пригодны дл многих однодольных растений, в частности злаковых. Применение данных способов затруднено тем. что дл злаковых обычно сложно получить растение из протопластой .However, these methods are not very suitable for many monocotyledonous plants, in particular, cereals. The application of these methods is difficult. that for cereals it is usually difficult to get a plant from protoplasts.
Известен также способ генетической трансформации, предусматривающий vicпользование бактерий AgrobacteriumThere is also known a method of genetic transformation involving the use of Agrobacterium bacteria.
tumefaclens дл переноса генов с помощью векторов, основанных на Т1-плазмиде.tumefaclens for gene transfer using vectors based on the T1 plasmid.
Такой способ практически неприемлем дл однодольных растений, поскольку A.tumefaciens не обладает вирулентностью по отношению к ним.This method is practically unacceptable for monocotyledonous plants, since A. tumefaciens does not have virulence to them.
Известен способ генетической трансФормации растений, например табака, заключающийс в том. что пыльцу проращивают на среде, содержащей экзогенную ДНК ввиде Т1-плазмиды. Проросшую пыльцу нанос т на рыльце пестика. Затем клетки ткани анализируют на нопалинсинтетазную активность, на основе чего суд т о генетической трансформации.There is a method of genetic transformation of plants, for example, tobacco, which consists in that. that the pollen is germinated on medium containing exogenous DNA in the form of a T1 plasmid. Sprouted pollen is applied to the stigma of the pistil. Tissue cells are then analyzed for nopaline synthetase activity, on the basis of which a genetic transformation is judged.
Известен также способ генетической трансформации растений, согласно которому рыльца растений инкубируют в присутствии ДНК плазмиды. содержащей ген устойчивости к антибиотикам, в частности кThere is also known a method of genetic transformation of plants, according to which the stigmas of plants are incubated in the presence of plasmid DNA. containing antibiotic resistance gene, in particular to
канамицииу. Методом электропорации ввод т плазмидную ДНК в пыльцевые зерна растений, затем растение опыл ют и селекцию трансформантов в полученном потомстве провод т по устойчивости к канамицину.kanamitiyu. Plasmid DNA was introduced into the pollen grains of plants using an electroporation method, then the plant was pollinated and the selection of transformants in the resulting progeny was performed for kanamycin resistance.
Однако известные способы неприемлемы дл растений, у которых жизнеспособность пыльцы в значительной степени зависит от времени хранени , например кукурузы и других злаковых.However, the known methods are unacceptable for plants in which the viability of pollen largely depends on the storage time, for example, maize and other cereals.
Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ, заключающийс в том, что с растений кукурузы собирают пыльцу, готов т пасту из смеси: пыльца, раствор.сахарозы , экзогенна ДНК, Экзогенную ДНК выдел ют из линий кукурузы, содержащих в себе маркерные гены окраски эпидермиса сем н. Приготовленную смесь нанос т на рыльца пестиков растений. Частоту трансформации оценивают по частоте по влени на початках окрашенных зерен.The closest to the proposed method is that pollen is collected from maize plants, a paste is prepared from a mixture: pollen, solution sucrose, exogenous DNA, exogenous DNA is isolated from maize lines containing the marker genes of epidermis staining n The prepared mixture is applied to the stigmas of the plant pistils. The frequency of transformation is estimated by the frequency of occurrence of colored grains on the cobs.
Недостатки этого способа заключаютс в том чтоThe disadvantages of this method are that
трансформаци носит невекторный характер;transformation is non-vectorial;
отсутствует легко селектируемый мар-. керн уй ген, наличие которого позволило бы быстро и эффективно отобрать трансформанты;no easily selectable mar-. Kern ui gene, the presence of which would quickly and efficiently select transformants;
отсутствует возможность получени достаточного количества сем н, необходимых дл анализа, ввиду их слабой зав зываемости .there is no possibility of obtaining a sufficient number of seeds necessary for analysis, due to their weak entrainment.
Цель изобретени - увеличение эффективности трансформации.The purpose of the invention is to increase the efficiency of transformation.
Способ включает обработку рыльца пестика растений смесью пыльцы и экзогенной ДНК в растворе сахарозы, использование вектора на основе Т -плазмид, например, серии PGV, содержащих маркерный ген устойчивости к антибиотикам, npvi этом плазмиду смешивают с раствором сахарозы , борной кислотой и Са(МОз)2, причем смесь сразу же нанос т на рыльце пестика и немедленно производ т опыление, а отбор трансформированных растений провод т путем проращивани на среде Кнопа, г/л: Са(ЫОз)2 0,S; КН2Р04 0,2; MgO-i х 7Н20 0,2; KNOa 0,2; FeP04 0,1, содержащей канамицин в концентрации 250-400 мкг/мл.The method involves treating the pistil stigma with a mixture of pollen and exogenous DNA in a sucrose solution, using a T-plasmid vector, for example, the PGV series, containing the antibiotic resistance marker gene, npvi, this plasmid is mixed with sucrose solution, boric acid and Ca (MOH) 2, the mixture being immediately applied to the stigma of the pistil and immediately pollinated, and the selection of transformed plants was carried out by germination on a Knop medium, g / l: Ca (Li) 2 0, S; KH2P04 0.2; MgO-i x 7H20 0.2; KNOa 0.2; FeP04 0.1, containing kanamycin at a concentration of 250-400 μg / ml.
Готов т смеси следующего состава: 0,40 ,5 М сахарозы; 0,017-0,020% борной кислоты; 0,038-0,042% Ca(N03)2; РН 5,5-6,8; 40-100 мкг/мл плазмидной ДНК (например, PGV1501), содержащей ген устойчивости к канамицину.Mixtures of the following composition are prepared: 0.40, 5 M sucrose; 0,017-0,020% boric acid; 0.038-0.042% Ca (N03) 2; PH 5.5-6.8; 40-100 μg / ml plasmid DNA (for example, PGV1501) containing the kanamycin resistance gene.
П р им 6 р 1. В смесь, включающую 0,4 М сахарозы, 0,018% борной кислоты, 0,04% Са(МОз)2, (рН 5,5-5,8), непосредственно перед нанесением на рыльце пестиков ввод т плазмидную ДНК (PGV 1501), содержащую ген устойчивости к канамицину, в количестве 70 мкг/мл. На каждый початок кукурузыIt is 6 p 1. In a mixture of 0.4 M sucrose, 0.018% boric acid, 0.04% Ca (MO3) 2, (pH 5.5-5.8), immediately before applying to the stigma of the pestles, enter t plasmid DNA (PGV 1501) containing the kanamycin resistance gene in an amount of 70 μg / ml. On every ear of corn
линии Rfs (предварительно изолированный) сразу же нанос т 200 мкл смеси, после чего немедленно опыл ют его же пыльцой. После созревани семена проращивают на среде Кнопа. Затем 1-2-дневные проростки перенос т на среду Кнопа, содержащую канамицин в концентрации 400 мкг/мл. Через 10-14 сут. растени , прошедшие отбор на этой среде, перенос т з грунт в услови х климокамеры (20 люкс - 16 ч, температураRfs lines (previously isolated) were immediately applied with 200 µl of the mixture, and then immediately pollinated with its own pollen. After ripening, seeds are germinated in a Knop medium. 1-2-day old seedlings are then transferred to Knop medium containing kanamycin at a concentration of 400 µg / ml. After 10-14 days. the plants that have been selected on this medium are transferred from the soil under the conditions of an air-conditioner (20 lux - 16 h, temperature
днем 28 ±1°С, ночи19 ± 1°С) и доращивают дл пересадки в открытый грунт.the day is 28 ± 1 ° C, nights 19 ± 1 ° C) and grow for transplantation into open ground.
Часть растений на стадии проростков анализируют методом блотгибридизации по Саузерну дл доказательства интеграции вSome of the plants at the seedling stage are analyzed by Southern blot hybridization to prove integration into
геном растени интересующего гена.plant genome of the gene of interest.
Частота трансформантов, полученных при использовании предлагаемого способа, составл ет около 0,6%.The frequency of transformants obtained using the proposed method is about 0.6%.
Пример 2. В смесь, содержащую 0,45Example 2. In a mixture containing 0.45
М сахарозы, 0,017% борной кислоты, 0,038% Ca(N03)2, рН 5,5-5,8, внос т плазмидную ДНК, содержащую ген устойчивости к канамицину. Смесь нанос т на рыльце пестика томата и немедленно опыл ют. Созревшие семена проращивают на среде Кнопа с канамицином (100 мкг/мл). При использовании сорта томата Факел частота трансформации составл ет 1,45%.M sucrose, 0.017% boric acid, 0.038% Ca (NO3) 2, pH 5.5-5.8, are plasmid DNA containing the kanamycin resistance gene. The mixture is applied to the stigma of the tomato pistil and immediately pollinated. Ripe seeds are germinated in a Knop medium with kanamycin (100 μg / ml). When using a tomato variety Torch, the transformation frequency is 1.45%.
В прототипе на один ген частотаIn the prototype for one gene frequency
трансформации составл ет около 0,3%, т.е. получен,ча в результате использовани предлагаемого способа частота трансформации в 2 раза превосходит полученную в известном способе. Анализ трансформанто .в методом блот гибридизации по Сауэерну показал, что ген устойчивости к канамицину встроилс в растительный геном ,transformation is about 0.3%, i.e. obtained, as a result of using the proposed method, the frequency of transformation is 2 times higher than that obtained in the known method. Analysis of transformanto. By the Sauern blot hybridization method showed that the kanamycin resistance gene was inserted into the plant genome,
Таким образом, оценка следующих поколений предполагаемых трансформантов отбором на селективных средах и методом блот-гибридизацми показывает эффективность данного метода трансформации.Thus, the evaluation of the next generations of putative transformants by selection on selective media and by blot hybridization method shows the effectiveness of this transformation method.
Способ позвол ет быстро и эффективно получать и отбирать трансформанты. Способ позвол ет также сократить врем между сбором пыльцы, приготовлением смеси и опылением растений, что не вызывает ощутимого воздействи физических факторов и нуклеаз на ДНК, пыльцу и пыльцевые трубки (механические разрывы, деградаци и др.). Способ может быть использован дл целенаправленной трансформации генома растений.The method allows for the quick and efficient generation and selection of transformants. The method also makes it possible to reduce the time between the collection of pollen, the preparation of the mixture and the pollination of plants, which does not cause a noticeable effect of physical factors and nucleases on DNA, pollen and pollen tubes (mechanical ruptures, degradation, etc.). The method can be used for the targeted transformation of the plant genome.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894760883A SU1708849A1 (en) | 1989-10-12 | 1989-10-12 | Method of plant genetic transformation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894760883A SU1708849A1 (en) | 1989-10-12 | 1989-10-12 | Method of plant genetic transformation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1708849A1 true SU1708849A1 (en) | 1992-01-30 |
Family
ID=21480472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU894760883A SU1708849A1 (en) | 1989-10-12 | 1989-10-12 | Method of plant genetic transformation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1708849A1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2128427C1 (en) * | 1996-10-10 | 1999-04-10 | Рязанская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.П.А.Костычева | Plant transformation method |
| US5929300A (en) * | 1997-07-15 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pollen-based transformation system using solid media |
| US6806399B1 (en) | 2000-04-19 | 2004-10-19 | Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. | Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon |
| RU2351120C1 (en) * | 2007-09-17 | 2009-04-10 | Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук | Method of obtaining transgenic corn plants |
| RU2351121C1 (en) * | 2007-09-17 | 2009-04-10 | Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук | Method of obtaining transgenic monocotyledon plants |
-
1989
- 1989-10-12 SU SU894760883A patent/SU1708849A1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Appl. Microblo! Biotechnol. 1985. v.21. p.336.Biotechnology and Ecology of Pollen, 1986, p.p. 59-76.Procid. Nat. Acad Scl. 1986, v.83, p.715- 720. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2128427C1 (en) * | 1996-10-10 | 1999-04-10 | Рязанская государственная сельскохозяйственная академия им.проф.П.А.Костычева | Plant transformation method |
| US5929300A (en) * | 1997-07-15 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pollen-based transformation system using solid media |
| US6806399B1 (en) | 2000-04-19 | 2004-10-19 | Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. | Pollen-mediated method for transformation of maize, tomato or melon |
| RU2351120C1 (en) * | 2007-09-17 | 2009-04-10 | Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук | Method of obtaining transgenic corn plants |
| RU2351121C1 (en) * | 2007-09-17 | 2009-04-10 | Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук | Method of obtaining transgenic monocotyledon plants |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220411810A1 (en) | Method for conducting site-specific modification on entire plant via gene transient expression | |
| Gordon-Kamm et al. | Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants. | |
| Casas et al. | Transgenic sorghum plants via microprojectile bombardment. | |
| RU2114911C1 (en) | Method of maize transgenic plant preparing | |
| DE69331055T2 (en) | DNA CONSTRUCTIONS AND PLANTS CONTAINING THEM | |
| Polowick et al. | Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of chickpea (Cicer arietinum L.): gene integration, expression and inheritance | |
| AU2002256227B2 (en) | Methods of transforming plants | |
| EP0275069A2 (en) | Pollen-mediated gene transformation in plants | |
| US5049500A (en) | Pollen-mediated gene transformation in plants | |
| HU215777B (en) | Stabile transformation of maize cells by electroporation | |
| Lännenpää et al. | Prevention of flower development in birch and other plants using a BpFULL1:: BARNASE construct | |
| AU2002256227A1 (en) | Methods of transforming plants | |
| AU2005217648A1 (en) | Plants modified with mini-chromosomes | |
| AU2017271409A1 (en) | Compositions, kits and methods for weed control | |
| ES2750530T3 (en) | Means and procedures to produce yield in plants | |
| Bibi et al. | An efficient and highly reproducible approach for the selection of upland transgenic cotton produced by pollen tube pathway method | |
| Chupeau et al. | Recovery of transgenic trees after electroporation of poplar protoplasts | |
| Jiang et al. | High efficiency transformation of US rice lines from mature seed‐derived calli and segregation of glufosinate resistance under field conditions | |
| CN107302915B (en) | Crop weed control method | |
| SU1708849A1 (en) | Method of plant genetic transformation | |
| Li et al. | Soybean transformation via the pollen tube pathway | |
| CN101280289A (en) | Method for Improving Rice Plants' Resistance to Leaf Roller Borer Using Transgenic Technology | |
| Sun et al. | Analysis of the genetic stability of insect and herbicide resistance genes in transgenic rice lines: A laboratory and field experiment | |
| Okeyo-Ikawa et al. | In planta seed transformation of Kenyan cowpeas (Vigna unguiculata) with P5CS gene via Agrobacterium tumefaciens. | |
| Zeldin et al. | Tolerance to the herbicide glufosinate in transgenic cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) and enhancement of tolerance in progeny |