SU1677599A1 - Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel - Google Patents
Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel Download PDFInfo
- Publication number
- SU1677599A1 SU1677599A1 SU894703125A SU4703125A SU1677599A1 SU 1677599 A1 SU1677599 A1 SU 1677599A1 SU 894703125 A SU894703125 A SU 894703125A SU 4703125 A SU4703125 A SU 4703125A SU 1677599 A1 SU1677599 A1 SU 1677599A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- peptides
- polyacrylamide gel
- gel
- isoelectrofocusing
- mol
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 title claims abstract description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 241000382509 Vania Species 0.000 claims 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 abstract description 12
- -1 glutaral aldehyde Chemical class 0.000 abstract description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 abstract description 2
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 abstract 2
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 abstract 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N methyl acetate Chemical compound COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биохимии и касаетс способа вы влени пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле. Целью вл етс повышение чувствительности при определении изоэлектрической точки пептидов с мол.м. ниже 10000. Способ осуществл етс изоэлектрофокусированием пептидов в борат-полиольной системе в полиакриламидном геле, фиксацией и окрашиванием гелей в 0,1-0,15%-ном растворе бриллиантового голубого в 20-30%-ном метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и обесцвечивают в 0,3-0,5%-ном растворе глутараль- дегида в 20-30%-ном метаноле. 4 шт., 1 табл. Q $This invention relates to biochemistry and concerns a method for detecting peptides by isoelectrofocusing in a polyacrylamide gel. The goal is to increase the sensitivity in determining the isoelectric point of the mol.m. below 10,000. The method is carried out by iso-focusing of peptides in a borate-polyol system in a polyacrylamide gel, fixing and staining the gels in a 0.1-0.15% solution of brilliant blue in 20-30% methanol containing 3-7% glutaral aldehyde and bleach in a 0.3-0.5% solution of glutaraldehyde in 20-30% methanol. 4 pieces, 1 tab. Q $
Description
Изобретение относитс к медицине, а именно к биологической химии, и касаетс способа вы влени белков при изоэлектрофокусировании в борат-поли ольной системе в полиакриламидном геле.The invention relates to medicine, in particular to biological chemistry, and concerns a method for detecting proteins during isoelectrofocusing in a borate polyol system in a polyacrylamide gel.
Целью изобретени вл етс опреде ление изоэлектрической точки белков низкомолекул рных пептидов.The aim of the invention is to determine the isoelectric point of proteins of low molecular weight peptides.
Пример 1. Химотрипсинолиз бычьего сывороточного альбумина провод т по следующей методике: 100 мкг белка раствор ли 100 мкл дистиллированной воды и по капл м добавл ли 100 мкл 0,2 М N-метил-ацетатного буфера до рН 8,1. После этого добавл ют 2 мкг химотрипсина, растворив его предварительно в 2 мкл дистиллированной воды. Пробирку закрывают пара- фильмом и перемешивают при 37°С в течение 4ч. После окончани химотрипIExample 1. Chymotrypsinolysis of bovine serum albumin was carried out as follows: 100 µg of protein was dissolved in 100 µl of distilled water and 100 µl of 0.2 M N-methyl acetate buffer was added dropwise to pH 8.1. After that, 2 µg of chymotrypsin is added, dissolving it in 2 µl of distilled water. The tube is closed with para-film and stirred at 37 ° C for 4 hours. After completing chymotrip I
синолиза на концентраторе фирмы Ami- con с фильтром рМ-10 из пептидной смеси отдел ют фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д.synolysis at a concentrator of the Amidon company with a pM-10 filter from the peptide mixture the peptide fractions with mol% are separated. less than 10,000 D.
Стекл нные трубки с внутренним диаметром 4 мм и длиной 17 см помещают в виде пакета в химический стакан . Непрерывный линейный градиент рН создавали путем смешивани с помощью градиентного смесител Ultro- grad (LKB Швеци ) в определенных концентраци х трис-боратного буфера рН 7,0, содержащего борную кислоту 0,1 II (трис-Гидроксиметил), метиламин 0,039 М, мочевину 6 М, смесь акрил-бис/акриламид (30-1,2) 5% и 55% раствора глицерина в этом же буфере , после чего его рН снижалось до 4,0. Провод т подслаивание перисталь-: тическим насосом буферной смеси, начинал с самой щелочной, в химическийGlass tubes with an internal diameter of 4 mm and a length of 17 cm are placed as a bag in a beaker. A continuous linear pH gradient was created by mixing with a Ultro-grad gradient blender (LKB Sweden) in certain concentrations of Tris-borate buffer pH 7.0 containing 0.1 II boric acid (Tris-Hydroxymethyl), methylamine 0.039 M, urea 6 M, a mixture of acryl-bis / acrylamide (30-1,2) 5% and 55% solution of glycerol in the same buffer, after which its pH decreased to 4.0. Percolation is carried out with a peristali-: tic pump of the buffer mixture, starting from the most alkaline, into the chemical
ел сate with
ОдOd
1 1 ел1 1 ate
со соwith so
стакан. Заполнение провод т в термостате при Т 25°С с последующей фотополимеризацией в течение 4 ч при Т 20°С под действием 0,15% рибофлавина и 0,038% тетраметиленэтилендиа- мида.glass. The filling is carried out in a thermostat at a temperature of 25 ° C, followed by photopolymerization for 4 hours at a temperature of 20 ° C under the action of 0.15% riboflavin and 0.038% tetramethylene ethylene diamide.
Изоэлектрофокусирование с целью определени количества пептидов после химотрипсииолиза бычьего сывороточного альбумина провод т в течение 26 ч. На щелочной торец столбика гел нанос т 100 мкл пептидной смеси с мол.в. менее 10000 Д. Стекл нные трубки со столбиками гел подключают к источнику посто нного тока при градиенте потенциала 30 В/см. После окончани изоэлектрофокусировани гели извлекают из трубок с помощью вакуумного насоса и окрашивают в одном случае 0,1%-ным раствором кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 50%-ном этаноле и 10%-ной уксусной кислоте в течение 4 ч при Т 20°С с отмыванием в 6%-ной уксусной кислоте в течение 4 ч при Т 20°С с отмыванием в 6%-ной уксусной кислоте, в другом случае - 0,1%-ным раствором кумасси бриллиановый голубой R-250 в 25%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде в течение 4 ч при Т 20 С с отмыванием в 25%-ном метаноле и 0,4%-ном глутановом альдегиде.Isoelectrofocusing with the aim of determining the amount of peptides after chymotripsyolysis of bovine serum albumin is carried out for 26 hours. 100 µl of the peptide mixture in mol% is applied to the alkaline end of the gel column. less than 10,000 D. Glass tubes with gel columns are connected to a direct current source at a potential gradient of 30 V / cm. After the isoelectric focusing is completed, the gels are removed from the tubes using a vacuum pump and, in one case, are stained with a 0.1% Coomassie blue-blue R-250 solution in 50% ethanol and 10% acetic acid for 4 hours at T 20 ° With washing with 6% acetic acid for 4 h at T 20 ° C with washing with 6% acetic acid, otherwise - with a 0.1% Coomassie brilliant blue solution of R-250 in 25% - methanol and 5% glutaraldehyde for 4 h at T 20 C with washing in 25% methanol and 0.4% gluten aldehyde.
На основании сравнительного сканировани на лазерном денситометре гелей про вл етс полоса сфокусированных пептидов, отсутствующа в известном способе (фиг. 1 а, б).On the basis of comparative scanning, a band of focused peptides appears on the laser densitometer of the gels, which is absent in the known method (Fig. 1 a, b).
Пример 2. Изофокусирование пептидов после химотрипсинолиза аль- долазы с последующим отделением на фильтре РМ-10 фракции пептидов с мол.м. менее 10000 Д провод т в тех же услови х, что и в примере 1, использу в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид в концентрации 7%, а в отмывающем растворе - 0,3%.Example 2. Isofocusing of peptides after chymotrypsinolysis of aldolase, followed by separation on the filter PM-10 of a fraction of peptides with mol.m. less than 10,000 D are carried out under the same conditions as in Example 1, using glutaraldehyde at a concentration of 7% in the fixing dye of this method, and 0.3% in the washing solution.
На основании сравнительного сканировани на лазерном денситометре гелей про вл ютс две полосы сфокусированных пептидов при полном отсутствии полос в известном способе определени (фиг. 2 а, б) .Based on a comparative scan on the laser densitometer of the gels, two bands of focused peptides appear in the absence of bands in the known determination method (Fig. 2 a, b).
Пример 3. Изофокусирование пептидов после химотрипсинолиза ката- лазы с последующим отделением на фильтре РМ-10 фракции пептидов с мол .в. менее 10000 Д провод т в техExample 3. Isofocusing of peptides after chymotrypsinolysis of a catalase, followed by separating on the filter PM-10 the fraction of peptides with mol. less than 10,000 D is carried out in those
же услови х, что и в примере 1, использу в фиксирующем красителе по данному способу глутаровый альдегид в концентрации 3%, а в отмывающем растворе - 0,3%.the same conditions as in example 1, using glutaraldehyde at a concentration of 3% in the fixing dye of this method, and 0.3% in the washing solution.
На основании сравнительного сканировани на лазерном денситометре гелей про вл ютс три полосы сфокусироQ ванных пептидов при полном отсутствии полос в геле по известному способу определени (фиг. За, б).On the basis of a comparative scan, three bands of focused peptides appear on the laser densitometer of the gels with the complete absence of bands in the gel according to a known determination method (Fig. 3A, b).
Пример 4. Изофокусирование с целью определени количества пепти5 дов после химотрипсинолиэа бычьего сывороточного альбумина с последующим отделением на фильтре РМ 10 фракции пептидов с мол.в. менее 10000 Д проводили в тех же услови х, что в приQ мере 1, использу в фиксирующем красителе по данному способу 0,15%-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 20%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде (фиг. 4а) иExample 4. Isofocusing to determine the amount of peptides after chymotrypsinolye bovine serum albumin, followed by separating on the PM 10 filter the fraction of peptides in mol. less than 10,000 D were carried out under the same conditions as in measure 1, using a 0.15% solution of Coomassie brilliant blue R-250 in 20% methanol and 5% glutaraldehyde in fixing dye using this method ( Fig. 4A) and
5 0,15%-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой R-250 в 30%-ном метаноле и 5%-ном глутаровом альдегиде (фиг. 4б).5 0.15% solution of Coomassie brilliant blue R-250 in 30% methanol and 5% glutaraldehyde (Fig. 4b).
На основании сканировани на лазерном денситометре гелей показано, что использование в фиксирующем красителе 0,15%-ного раствора кумасси бриллиантовый голубой R-250 и 20 и 30%-ного метанола не ведет к изменению пенситограмм.Based on scanning gels on a laser densitometer, it was shown that the use of a 0.15% Coomassie Brilliant Blue R-250 solution and 20 and 30% methanol in a fixing dye does not lead to a change in the pensytograms.
5в результате проделанной работы5 as a result of the work done
показано, что по сравнению с базовым методом получены лучшие результаты дл определени изоэлектрических точек пептидов с мол.в. менее 10000 Д.It is shown that, as compared with the base method, the best results were obtained for determining the isoelectric points of peptides with mol. less than 10,000 D.
0 По сравнению с другими методами изо- электрофоретического разделени , такими как изоэлектрофокусирование в амфолитах различных фирм (алфолины фирмы LKB Швеци , сервалиты фирмы0 Compared with other methods of iso-electrophoretic separation, such as isoelectrofocusing in ampholytes of various firms (alfolins from LKB Sweden, servalites from
5 Serva ФРГ, биолиты фирмы BioRad США), предложенный способ дает существенные преимущества дл определени низ- комолекул рных пептидов. Амфолиты любой фирмы близки по мол.м. и химичес0 ким свойствам к низкомолекул рным пептидам и окрашиваютс вместе с ними . Поэтому определение низкомолекул рных пептидов при разделении их в амфолитах невозможно.5 Serva HGF, bioliths (BioRad, USA), the proposed method provides significant advantages for the determination of low molecular weight peptides. Ampholytes of any company are close in mol.m. and chemical properties of low molecular weight peptides and are stained with them. Therefore, the determination of low molecular weight peptides during their separation in ampholytes is impossible.
Предлагаемый способ позвол ет определить изоэлектрические точки пептидов , в то врем как прототип изоэлектрические точки пептидов сThe proposed method allows to determine the isoelectric points of the peptides, while the prototype isoelectric points of the peptides with
00
516516
мол.в. менее 10000 не представл етс возможным определить вообще (см. таблицу ).mol.v. less than 10,000 it is not possible to determine at all (see table).
Значени иэоэлектрических точек пептидов, определенных в примерах, приведены в таблице.The values of the pheoeoelectric points of the peptides defined in the examples are listed in the table.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894703125A SU1677599A1 (en) | 1989-04-26 | 1989-04-26 | Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU894703125A SU1677599A1 (en) | 1989-04-26 | 1989-04-26 | Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1677599A1 true SU1677599A1 (en) | 1991-09-15 |
Family
ID=21453184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU894703125A SU1677599A1 (en) | 1989-04-26 | 1989-04-26 | Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1677599A1 (en) |
-
1989
- 1989-04-26 SU SU894703125A patent/SU1677599A1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Остреман Л.А. Методы исследовани белков и подкпеточных кислот, М.: Наука, 1981, с. 93. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wrigley | [38] Gel electrofocusing | |
| Bjellqvist et al. | Micropreparative two‐dimensional electrophoresis allowing the separation of samples containing milligram amounts of proteins | |
| Rodriguez‐Diaz et al. | Capillary isoelectric focusing | |
| CA2498354C (en) | System and methods for electrophoretic separation of proteins on protein binding membranes | |
| Ueda et al. | Separation of naphthalene-2, 3-dicarboxaldehyde-labeled amino acids by high-performance capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection | |
| Novotny et al. | Recent advances in capillary electrophoresis of proteins, peptides and amino acids | |
| Olsson et al. | Fast horizontal electrophoresis. I. Isoelectric focusing and polyacrylamide gel electrophoresis using PhastSystem™ | |
| JPH08220069A (en) | Electrophoresis method in low electric-conductivity buffer solution | |
| Havel et al. | Isoelectric heterogeneity of the cofactor protein for lipoprotein lipase in human blood plasma | |
| Sabounchi‐Schütt et al. | An Immobiline DryStrip application method enabling high‐capacity two‐dimensional gel electrophoresis | |
| Harrington | [37] Elution of protein from gels | |
| Strege et al. | Capillary electrophoretic protein separations in polyacrylamide-coated silica capillaries and buffers containing ionic surfactants | |
| Lee et al. | Free solution capillary electrophoresis of proteins using untreated fused-silica capillaries | |
| Taverna et al. | Electrophoretic methods for process monitoring and the quality assessment of recombinant glycoproteins | |
| Strege et al. | Capillary electrophoresis of biotechnology‐derived proteins | |
| Shimura et al. | Fluorescence‐labeled peptides as isoelectric point (pI) markers in capillary isoelectric focusing with fluorescence detection | |
| SU1677599A1 (en) | Method for peptides detection at isoelectrofocusing in polyacrylamide gel | |
| Pinto et al. | Solid‐phase fluorescent labeling reaction of picomole amounts of insulin in very dilute solutions and their analysis by capillary electrophoresis | |
| Thiriet et al. | Rapid and effective Western blotting of histones from acid‐urea‐Triton and sodium docecyl sulfate polyacrylamide gels: Two different approaches depending on the subsequent qualitative or quantitative analysis | |
| Michaelsen et al. | Analysis of dansyl amino acids in feedstuffs and skin by micellar electrokinetic capillary chromatography | |
| Guzman et al. | Capillary electrophoresis for the analytical separation and semi-preparative collection of monoclonal antibodies | |
| Yao et al. | Analysis of recombinant human tumor necrosis factor beta by capillary electrophoresis | |
| Goldring et al. | Solubilization of protein–dye complexes on nitrocellulose to quantify proteins spectrophotometrically | |
| US5961801A (en) | DNA separation electrophoresis gels and methods for their use | |
| Obinata et al. | The subunit structure of myosin from skeletal muscle of the early chick embryo |