SK7012003A3 - Fibroblast growth factors - Google Patents

Description

r.r κι- 2^3

Kompozície obsahujúce fibroblastové rastové faktory

Oblasť techniky

Táto prihláška si nárokuje prioritu z prihlášky USA č. 60/251,837 podanej 8. decembra 2000, ktorá je vo forme odkazu zahrnutá v plnom rozsahu v tomto dokumente.

Predkladaný vynález sa týka nových sekvencii nukleových kyselín a polypeptidov a ich regulátorov, hlavne fibroblastových rastových faktorov (FGF), výhodne FGF-20 a FGF-23. FGF predstavujú triedu polypeptidov, ktoré sa podieľajú na vývine, diferenciácii a morfogenéze, napr. zúčastňujú sa na signalizácii medzi bunkami a pôsobia na proliferáciu buniek. FGF podľa predkladaného vynálezu, ich fragmenty a deriváty majú jednu alebo viac z biologických aktivít, ako je, podpora hojenia rán, podpora prežívania neurónov, stimulácia bunkovej proliferácie, napr. proliferácie kmeňových buniek, fibroblastov, neurónov, gliových buniek, oligodendrocytov, Schwannových buniek, alebo zodpovedajúcich prekurzorových buniek, modulácia diferenciácie buniek, indukcia embryonálneho vývinu, stimulácia rastu neuritov, zlepšenie regenerácie po poškodení nervu alebo neurónu, stimulácia myelinizácie, stimulácia angiogenézy, väzbová aktivita na receptor, modulácia tumorigenézy a ďalšie.

Doterajší stav techniky

Fibroblastové rastové faktory hrajú dôležitú úlohu v rôznych biologických funkciách, vrátane napr. bunkovej proliferácie, a diferenciácie a vývinu.

Podstata vynálezu

Identifikovali sa nové nukleové kyseliny, polypeptidové sekvencie a regulátory nukleových kyselín, ktoré kódujú fibroblastové rastové faktory (FGF), výhodne FGF-20 (označený ako FGF-21 v dočasnej patentovej prihláške US 60/251,831, podanej 8. decembra 2000, ktorá je celá zahrnutá vo forme odkazu, a ktorej priority sa dovoláva predkladaná prihláška) alebo FGF-23 (ktorý bol v už zmienenej dočasnej prihláške označený ako FGF-22), čo je trieda polypeptidov zapojených do vývinu, diferenciácie a morfogenézy, napr. účasťou v signalizácii medzi bunkami a bunkovej proliferácii. FGF podľa predkladaného vynálezu, ich fragmenty a ich deriváty majú jednu alebo viac z nasledujúcich biologických aktivít, pričom tento zoznam nie je obmedzujúci: FGF aktivita, FGF-špecifická imunogénna aktivita. Podľa predkladaného vynálezu sa identifikovali aspoň dve nové triedy FGF, a to FGF-20 a FGF-23.

FGF aktivita znamená v predkladanej prihláške aktivitu, ako je napr. podpora hojenia rán, podpora prežívania neurónov, stimulácia bunkovej proliferácie, napr.

proliferácie kmeňových buniek, fibroblastov, neurónov, gliových buniek, oligodendrocytov, Schwannových buniek, alebo zodpovedajúcich prekurzorových buniek, modulácia diferenciácie buniek, indukcia embryonálneho vývoja, stimulácia rastu neuritov, zlepšenie regenerácie po poškodení nervu alebo neurónu, stimulácia myelinizácie, stimulácia angiogenézy, väzbová aktivita na receptor, modulácia tumorigené z y a ďalšie.

FGF-špecifická imunogénna aktivita znamená, že napr. FGF polypeptid vyvolá imunologickú reakciu, ktorá je selektívna pre FGF, napr. imunologickú reakciu selektívnu pre cicavčí FGF-20. Takže stimulácia protilátok, T-lymfocytov, makrofágov, B-lymfocytov, dendritických buniek a pod. aminokyselinovou sekvenciou vybranou z cicavčích FGF, napr. FGF na obrázkoch 1 a 2, je špecifickou imunogénnou aktivitou. Tieto reakcie sa môžu merať rutinným spôsobom.

FGF, ako je napr. FGF-20 alebo FGF-23, je cicavčí polypeptid s úplnou dĺžkou („full-legth), ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorú je možné získať z prírodného zdroja, a ktorý má jednu alebo viacero z už uvedených aktivít. FGF môže mať napr. sekvenciu uvedenú, na obrázkoch 1 a 2, ktorá má otvorený čítací rámec začínajúci iniciačným kodónom a končiaci stop kodónom. Zahŕňa tak prirodzene sa vyskytujúce normálne sekvencie, prirodzene sa vyskytujúce mutantné sekvencie a prirodzene sa vyskytujúce polymorfné sekvencie, a to vrátane jednonukleotidových polymcrfizmov (SNP). Prírodné zdroje zahŕňajú napr. živé bunky, ako sú napr. bunky získané z tkaniva alebo celých organizmov, kultivované bunkové línie, ktoré zahŕňajú primárne a imortalizované bunkové línie, tkanivá odobraté biopsiou a pod..

Predkladaný vynález sa tiež týka fragmentov cicavčích FGF. Fragmenty sú výhodne „biologicky účinné. Termínom „biologicky účinný sa myslí to, že polypeptidový fragment prejavuje aktivitu v živom systéme alebo so zložkami živého systému. Biologická aktivita zahŕňa už uvedené aktivity, napr. FGF-aktivitu, ako je napr. väzbová aktivita na FGF-receptor, a FGF-imunogénr.a aktivita .

Fragmenty sa môžu pripraviť akoukoľvek vhodnou metódou, aká je odborníkom známa, napr. chemickou syntézou, genetickým inžinierstvom, ako produkty štiepenia a pod.. Biologický fragment FGF je polypeptid, ktorý má na karboxylovom konci alebo amínovom konci proteínu odstránenú alebo modifikovanú aminokyselinovú sekvenciu.

Ktorýkoľvek z verejnosti dostupných fragmentov nukleových kyselín a fragmentov polypeptidov FGF-20 a FGF-23 alebo fragmenty s nimi homologické, sú z predkladaného vynálezu vylúčené, napr. g5762262, čo je podobná sekvencia identifikovaná v Xenopus laevis.

Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie verejne dostupných nukleových kyselín sa môžu identifikovať tak, že sa prehľadajú verejne prístupné databázy.

Predkladaný vynález sa tiež týka FGF-20, ktorý má dedukovanú sekvenciu aminokyselín 1 až 211, ako je uvedené na obrázku 1; a FGF-23, ktorý má dedukovanú sekvenciu aminokyselín 1 až 169, ako je uvedená na obrázku 2. FGF-20 má predikovanú molekulovú hmotnosť približne 23,5 kDa a predikovaný pi približne 9,25. FGF-23 má predikovanú molekulovú hmotnosť približne 19,6 kDa a predikovaný pi približne 12,32.

Stupeň (miera) identity proteínov znamená podiel počtu totožných aminokyselinových zvyškov a celkového počtu aminokyselinových zvyškov v proteíne. Stupeň (miera) podobnosti znamená podiel súčtu počtu totožných aminokyselinových zvyškov a počtu konzervatívne substituovaných aminokyselín (ako napr. V za L a pod. ) a celkového počtu aminokyselinových zvyškov. Pri DNA identite to znamená to isté ako pri podobnosti a znamená podiel počtu totožných nukleotidov a celkovej dĺžky (t. j. celkového počtu nukleotidov).

FGF polypeptidy podlá vynálezu, napr. polypeptidy, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené na obrázkoch 1 a 2, sa môžu analyzovať akýmikoľvek odborníkovi známymi metódami na identifikáciu ďalších štrukturálnych a/alebo funkčných domén v polypeptide, vrátane úsekov prechádzajúcich membránou, hydrofóbnych úsekov. Napríklad FGF polypeptidy sa môžu analyzovať metódami opísanými v Kyte a Doolittle, J. Mol. Bíol. 157: 105,1982, EMBL Protein Predict., Rošt a Sander, Proteins, 19: 55-72,1994 .

Ďalšie homológy FGF podľa predkladaného vynálezu sa môžu získať z cicavčích a iných ako cicavčích zdrojov rôznymi metódami. Napríklad hybridizácia s oligonukleotidmi odvodenými zo sekvencie na obrázkoch 1 a 2 sa môže využiť na selekciu homológov, napr. postupom opísaným v Sambrook et al., Molecular Cloning, kapitola 11, 1989.

Takéto homológy majú rôzny stupeň nukleotidovej a aminokyselinovej sekvenčnej identity a podobnosti s GENE. Medzi vhodné cicavčie organizmy patria napr. hlodavce, myši, laboratórne potkany, škrečkovia, opice, prasatá, kravy a pod., medzi iné vhodné organizmy, ktoré nie sú cicavce, patria napr. scavovce, bezstavovce, Brachydanio rerio („zebra fish), kura, Drcsophila, C. elegans, Xenopus, kvasinky ako napr. S. pombe, S. cerevisiae, hlísty, prokaryoty a taktiež rastliny, Arabidopsis, vírusy, artémie a pod. .

Vynález sa taktiež týka FGF-špecifických aminokyšelinových sekvencii, napr. definovaných aminokyšelinových sekvencii, ktoré sa vyskytujú konkrétne v sekvencii na obrázkoch 1 a 2, konzervatívnych aminokyšelinových motívov, ktoré sa nachádzajú v polypeptidoch FGF podlá predkladaného vynálezu. Porovnanie s príbuznými proteínmi, ako napr. s inými príbuznými FGF (pozri napr. Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 9c: 36583663,1999), sa môže využiť na selekciu sekvencii špecifických pre FGF.

Napríklad sa porovnali proteínové sekvencie FGF-20 a FGF-23 a aminokyselinové motívy sa generovali na základe konzervatívnych úsekov homológie, ukázaných na obrázkoch 1 a 2. Predkladaný vynález sa týka akejkoľvek nukleovej kyseliny alebo zodpovedajúcej polypeptidovej sekvencie, napr. polypeptidu, ktorý obsahuje tri alebo viacero konzervatívnych zvyškov alebo homclogických zvyškov, ako napr. úseky LYGS, HFLP, VQGTR, RľEENGHNTY, QFEENWYNTY, AGTPSA, AAERSA a pod. Ďalšie špecifické a/alebo konzervatívne aminokyselinové sekvencie sa môžu zistiť rutinným spôsobom, napr. tým, že sa prehľadáva génová/proteínová databáza s použitím súboru počítačových programov BLAST. FGF-špecifické aminokyselinové sekvencie alebo motívy môžu byť užitočné na prípravu peptidov ako antigénov na vyvolanie imunitnej reakcie, ktorá je pre ne špecifická. Protilátky získané takoucc imuni záciou sa môžu použiť ako špecifická sonda pre cicavčí FGF proteín na diagnostické alebo výskumné účely.

Ako už je uvedené, polypeptidy podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať rôzne aminokyselinové sekvencie pre FGF, napr. úplnú, tzv. „full-length sekvenciu (t. j. sekvenciu, kcorá má iniciačný kodón a stop kodón, ako je ukázané na obrázkoch 1 a 2), zrelú aminokyselinovú sekvenciu (t. j. sekvenciu, keď FGF polypeptid je vytvorený ako prekurzor, ktorý je spracovaný na zrelý polypeptid) alebo jej fragmenty. Použiteľné fragmenty zahŕňajú napr. fragmenty, ktoré obsahujú alebo pozostávajú v podstate z akýchkoľvek už uvedených domén a špecifických a konzervatívnych aminokyselinových sekvencií.

Fragment FGF polypeptidu podľa predkladaného vynálezu je vybraný tak, aby mal špecifickú biologickú aktivitu, napr. väzbovú aktivitu na FGF receptor alebo imunogénnu aktivitu. Meranie týchto aktivít je opísané ďalej a v príkladoch.

Tieto peptidy sa môžu taktiež identifikovať a pripraviť, ako je opísané v dokumente EP 496 162. Použiteľné fragmenty obsahujú alebo pozostávajú v podstate zo súvislého úseku približne deviatich aminokyselín, výhodne približne 10, 15, 20, 30, 40, a podobne, súvislých aminokyselín z obrázkov 1 a 2.

Polypeptid podľa vynálezu má taktiež 100% alebo nižšiu aminokyselinovú sekvenčnú identitu s aminokyselinovými sekvenciami uvedenými na obrázkoch 1 a 2.

Na účely nasledujúceho opisu: sekvenčná identita znamená, že rovnaký nukleotid alebo aminokyselina, ktorá sa vyskytuje v sekvencii uvedenej na obrázkoch 1 a 2, sa taktiež vyskytuje v zodpovedajúcej polohe porovnávanej sekvencie. Polypeptid, ktorý má menej ako 100% sekvenčnú identitu s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obrázkoch 1 a 2, môže obsahovať rôzne substitúcie z prirodzene sa vyskytujúcich sekvencií, vrátane substitúcií homologických a nehomologických aminokyselín.

Príklady homologických aminokyselinových substitúcii sú ukázané ďalej . Súčet totožných a homologických zvyškov delený celkovým počtom zvyškov v sekvencií, v ktorej je FGF pclypeptid porovnávaný, sa rovná percentám sekvenčnej podobnosti. Na vypočítanie sekvenčnej identity a podobnosti sa uskutoční priradenie sekvencie („alignment) a sekvenčná identi-a/podobnosť sa vypočíta akýmkoľvek spôsobom, ktorý je odborníkom známy, napr. použitím algoritmov, počítačových programov a pod., vrátane napr. programov FASTA, BLAST. Polypeptid, kmorý má menšiu ako 100% aminokyselinovú sekvenčnú identitu s aminokyselinovou sekvenciou na obrázkoch 1 a 2, môže mať približne 99%, 98%, 97%, 95%, 90,5%, 90%, 85%, 70% alebo nižšiu identitu, napr. až približne 60% sekvenčnú identitu.

Predkladaný vynález sa taktiež týka muteínov FGF pclypeptidov FGF-21 a FGF-23, t. j. ktoréhokolvek polypeptidu, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa sekvenčne líši od aminokyselinovej sekvencie, ktorú je možné získať z prírodného zdroja (fragment cicavčieho FGF sa sekvenčne nelíši od prirodzene sa vyskytujúceho FGF, hoci sa líši počtom aminokyselín: . Takže muteíny FGF polypeptidu obsahujú substitúcie aminokyselín, inzercie a delécie, a taktiež obsahujú aminokyseliny, ktoré sa v prírode nevyskytujú.

Muteíny aminokyselinovej sekvencie FGF podlá vynálezu sa môžu taktiež pripraviť na základe vyhľadávania homológie v génovej databanke, napr. Genbank, EMBL. Vyhľadávanie sekvenčnej homológie sa môže uskutočniť s použitím rôznych metód, ktoré obsahujú algoritmy opísané napr. v rodine počítačových programov BLAST, Smith-Watermanov algoritmus, a pod. Muteíny sa môžu zaviesť do sekvencie tým, že sa identifikujú a porovnajú aminokyseliny v doménach, ktoré sú totožné a/alebo homologické medzi polypeptidmi, a potom sa na základe takého porovnania modifikujú aminokyseliny. Napríklad FGF podľa predkladaného vynálezu má sekvenčnú identitu s rôznymi známymi formami FGF, ktoré opísali napr. Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 3658

-3663, 1999. Porovnanie týchto polypeptidov, obzvlášť v oblasti konzervatívnych aminokyselinových zvyškov, ktoré sú identifikované v tabuľke 1 substitúcii aminokyselín v publikácii Venkataraman et al., môže pomôcť rozpoznať zvyšky, ktorých modifikácia by podlá očakávania mohla obmedziť, znížiť alebo úplne vylúčiť biologickú aktivitu FGF, ako napr. väzbovú aktivitu na receptor a pod. Napríklad, keď porovnanie odhalí totožné aminokyseliny zachované medzi dvoma alebo viacerými doménami, je možné očakávať, že eliminácia alebo substitúcia takých aminokyselín nepriaznivo ovplyvní biologickú aktivitu polypeptidu.

Aminokyselinové substitúcie môžu byť vytvorené nahradením jednej homologickej aminokyseliny inou. Homologické aminokyseliny sa môžu definovať na základe veľkosui bočného reťazca a stupňa polarizácie, vrátane malých nepolárnych aminokyselín: cysteín, prolín, alanín, treonín, malých polárnych aminokyselín: serín, glycín, aspartát, asparagín, veľkých polárnych aminokyselín: glutamát, glutamín, lyzín, arginín, aminokyselín so strednou polaritou: tyrozín, histidín, tryptofán, veľkých nepolárnych aminokyselín: fenylalanín, metionín, leucin, izoleucín, valin. Homologické kyseliny môžu byť taktiež zoskupené takto: polárne R skupiny bez náboja, glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín, glutamín, kyslé aminokyseliny (záporne nabité), kyselina asparágová a kyselina glutámová, bázické aminokyseliny (pozitívne nabité), lyzín, arginín, histidín. Homologické aminokyseliny taktiež zahŕňajú aminokyseliny, ktoré opísal Dayhoff v práci Atlas of Protein Sequence and Structure, 5,1978, a Argos v EMBO J., 8, 779-785, 1989.

Vynález sa týka muteínov polypeptidov a muteínov nukleových kyselín, ktoré kódujú takéto polypeptidy. Predkladaný vynález sa teda týka nukleotidových sekvencií z obrázkov 1 a 2, pričom nukleové kyseliny kódujú polypeptid a jedna alebo viacero aminokyselinových polôh je substituovaných alebo odstránených alebo oboje a polypeptid, ktorý je kódovaný nukleovou kyselinou, má biologickú aktivitu, ako je napr. podpora regenerácie nervu alebo neurónového poškodenia. Mutein polypeptidu a jeho zodpovedajúca nukleotidová kódujúca sekvencia mcže mať aminokyselinovú sekvenciu, ako je uvedené na obrázkoch 1 a 2, okrem toho, že jedna alebo viacero polôh sú substituované homológnymi aminokyselinami, napr. kde je 1, 5, 10, 15 alebo 20 substitúcii. Ako modifikácia ovplyvňuje uvedené aktivity, sa môže merať podlá už opísaných metód, podlá metód uvedených ďalej a ako je odborníkovi v odbore známe. V odbore sú známe napr. rôzne metódy testovania FGF aktivity, vrátane napr. restov, ktoré merajú prežívanie neurónov a ďalšie neurotrofné aktivity, ako sú napr. aktivity opísané v príkladoch a v práci autorov Kanda et al., Int. J. Devl. Neuroscience, 12 (3) : 191-200, 1999 a väzbové testy FGF-receptora.

Ako už bolo uvedené, aminokyselinové substitúcie sa mcžu taktiež vytvoriť na základe analógie vzhľadom na ďalších príbuzných FGF. Ďalšie mutácie sa môžu vybrať rutinne modifikáciou alebo mutáciou nukleotidovej sekvencie na obrázku 1 a 2 a selekciou mutácií, ktoré ovplyvnia jednu alebo viacero aktivít, napr. meraním aktivity podlá metód a príkladov opísaných ďalej.

Cicavčí FGF podlá predkladaného vynálezu, jeho fragmenty alebo substituované polypeptidy môžu taktiež zahŕňať rôzne modifikácie, keď takéto modifikácie zahŕňajú modifikácie lipidov, metyláciu, fosforyláciu, glykozyláciu, kovalenczú modifikáciu (napr. R-skupiny aminokyseliny), substitúciu, deléciu aminokyselín alebo adíciu aminokyselín. Modifikácie polypeptidu sa môžu uskutočniť podľa rôznych metód, vrátane rekombinantných, syntetických, chemických a pod.

Polypeptidy podľa predkladaného vynálezu (napr. úplné, ich fragmenty, ich mutácie) sa môžu použiť rôznymi spôsobmi, napr.

v testoch, ako imunogény pre protilátky, ako je opísané ďalej, ako biologicky aktívne činidlá (napr. ktoré majú jednu alebo viacero aktivít asociovaných s FGF podľa predkladaného vynálezu).

Polypeptid kódujúci FGF podľa predkladaného vynálezu, jeho derivát alebo jeho fragment, sa môže spojiť s jednou alebo viacerými štrukturálnymi doménami, funkčnými doménami, detegovatelnými doménami, antigénnymi doménami a/alebo požadovaným polypeptidom v .usporiadaní, ktoré sa nevyskytuje v prírode, t. j. neprirodzene sa vyskytujúcom usporiadaní. Polypeptid, ktorý nesie takéto črty, je chimérickým alebo fúznyrr. polypeptidom. Takýto chimérický polypeptid sa môže pripraviť podľa rôznych metód, vrátane chemických, syntetických, kvázisyntetických a/alebo rekombinantných metód. Chimérická nukleová kyselina, ktorá kóduje chimérický polypeptid, môže obsahovať rôzne domény alebo požadované polypeptidy v kontinuálnom čítacom rámci (napr. s mnohonásobnými N-koncovými doménami na stabilizáciu alebo zvýšenie aktivity) alebo v prerušenom otvorenom čítacom rámci, napr. ktorý obsahuje intróny, miesta zostrihu, enhancery (zosilňovače) a pod. Chimérická nukleová kyselina sa môže vytvoriť podľa rôznych metód. (Pozri napr. US patent č. 5 439 819) . Doména alebo požadovaný polypeptid môžu mať ktorúkoľvek požadovanú vlastnosť, vrátane biologickej funkcie, ako je napr. signalizácia, podpora rastu, bunkové cielenie (napr. signálne sekvencie, cieliace sekvencie, ako napr. na cielenie do endoplazmatického retikula alebo jadra) a pod., štrukturálne funkcie, ako je napr. hydrofóbnosť, hydrofilnosť, prechádzanie membránou a pod., funkcie receptora alebo ligandu, a/alebo detekčné funkcie, napr. spojené s enzýmom, fluorescenčným polypeptidom, zeleným fluorescenčným proteínom, (Chalfie et al,. , Science, 263: 802, 1994, Cheng et al., Náture Biotechnology, 14: 606, 1996, Levy et al., Náture Biotechnology, 14: 610, 1996) a pod. Okrem toho sa môže použiť polypeptid alebo jeho časť ako selekčný marker, keď je zavedený do hostiteľskej bunky. Napríklad nukleová kyselina, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu podľa predkladaného vynálezu, sa môže fúzovať v zhodnom čítacom rámci s požadovanou kódujúcou sekvenciou a pôsobí ako značka na purifikáciu, selekciu alebo na značenie. Oblasť fúzie môže kódovať miesto štiepenia na uľahčenie expresie, izolácie, purifikácie a pod.

Polypeptid podľa predkladaného vynálezu môže byť produkovaný v expresnom systéme, napr. in vivo, in vitro, bezbur.kovc, rekombinantne, bunkovou fúziou a pod., podľa predkladaného vynálezu. Modifikácie odovzdané polypeptidu takýmito systémami zahŕňajú glykozyláciu, aminokyselinovú substitúciu (napr. použizie rozdielneho kodónu), spracovanie polypeptidu, ako je napr. digescia, štiepenie, endopeptidázová alebo exopeptidázová aktivita, pripojenie chemických skupín vrátane lipidov a fosfátov a pod.

Polypeptid podľa z prírodných zdrojov, (z kultivačného média predkladaného vynálezu sa môže transformovaných hostiteľských alebo buniek) podľa získať buniek metód vrátane extrakcie detergentom (napr. neiónový detergenz,

Triton

X-100,

CHAPS, oktylglukozid, amóniumsuifátovej alebo alebo etanolovej precipitácie, extrakcie kyselinou, ar.zónovej katióntovej výmennej chromatografie, fosfoceiulózovej chromatografie, hydrofóbnej interaktívnej chromatografia, hydroxyapatitovej chromatografie, lektínovej chromatografie, gélovej elektroforézy. Môžu sa použiť kroky na opätovné zvinutie preternu, ak je to nutné, na skompletizovanie konfigurácie zrelého proteínu. Nokoniec, vysokoúčinná kvapalinová enremazografia (HPLC) sa môže použiť na purifikačné kroky. FGF pclyceptid sa môže taktiež izolovať, ako je opísané pri ďalších FG“ proteínoch, ako je pre odborníka známe, napr. ako je opísané v nasledujúcich prácach, ktoré opisujú izoláciu rôznych FGF, US patent č. 5 604 293, 5 395 756, 5 155 214, 4 902 782 a SantosOcampo et al., J. Biol. Chem., 271: 1726-1731, 1996 (purifikácia

FGF z bakteriálneho hostiteľa, ako je napr. E. coli':, . Iným prístupom je expresia FGF rekombinantne s afinitnou značkou (Flag epitop, HA epitop, myc epitop, 6xHis, proteín viažuci maltózu, chitináza a pod.) a potom purifikácia afinitnou chromatografiou s konjugovanou protilátkou proti použitej

Predkladaný vynález sa taktiež cýka nukleových ich fragmenty značke .

sú napr. DNA a RNA, ktoré kódujú FGF polypeptidy a podľa predkladaného vynálezu. Nukleová kyselina

FGF (ako je

FGF-20 alebo -23) je nukleová ktorá má nukleotidovú sekvenciu, ktorú

J^e možné získať z orirodného zdroja. Preto zahŕňa prirodzene vyskytuj úce, normálne, prirodzene sa vyskytujúce mutované a prirodzene sa vyskytujúce polymorfné napr. živé bunky získané z tkanív a celých organizmov, nádory, kultivované bunkové línie, vrátane primárnych a imortalizovaných bunkových línií.

Sekvencia nukleovej kyseliny podľa vynálezu môže obsahovať kompletnú kódujúcu sekvenciu, ako je ukázané na obrázkoch 1 a 2, jej degenerovanú sekvenciu a jej fragmenty. Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu môže caktiež zahŕňať nukleotidovú sekvenciu, ktorá je 100% komplementárna, napr. antisense, s ktoroukoľvek nukleotidovou sekvenciou v tomto texse už uvedenou a uvedenou ďalej.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu sa môže získať z celého radu rôznych zdrojov. Môže sa získať z DNA alebo RNA, ako je napr. polyadenylovaná mRNA, napr. izolovaná z tkanív, buniek alebo celého organizmu. Nukleová kyselina sa môže získať priamo z DNA alebo RNA alebo z cDNA knižnice. Nukleová kyselina sa môže získať z buniek alebo tkaniva (napr. z embryonálnych alebo dospelých buniek alebo tkanív srdcového alebo kostrového svalstva) v konkrétnej fáze vývinu, ktoré majú požadovaný genotyp, fenotyp a pod.

Ako je opísané pri FGF polypeptide, ktorý už bol opísaný, nukleová kyselina obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid podľa predkladaného vynálezu, môže zahŕňať len kódujúcu sekvenciu; kódujúcu sekvenciu a ďalšiu kódujúcu sekvenciu (napr. sekvencie kódujúce vedúce, sekrečné, cieliace, enzy13 matické, fluorescenčné alebo iné diagnostické peptidy), kódujúce sekvencie a nekódujúce sekvencie, napr. netranslatované sekvencie buď na 5' alebo 3' konci alebo rozptýlené v kódujúcej sekvencii, napr. intróny. Nukleová kyselina obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid bez prerušenia, znamená, že nukleotidová sekvencia obsahuje sekvenciu, ktorá kóduje aminokyseliriovú sekvenciu FGF bez akýchkoľvek nekódujúcich nukleotidov, ktoré by prerušovali alebo zasahovali do kódujúcej sekvencie, napr. bez intrónu/intrónov. Takáto nukleotidová sekvencia sa môže taktiež opísať ako súvislá. Genómová DNA, ktorá kóduje humánny, myší alebo iný cicavčí gén FGF a pod., sa môže získať rutinne.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu takciež môže zahŕňať sekvenciu kontroly expresie operatívne spojenú s nukleovou kyselinou, ako už je opísané. Termín sekvencia kontroly expresie znamená sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá reguluje expresiu polypeptidu, ktorý je kódovaný nukleovou kyselinou, ku ktorej je operatívne pripojená. Expresia môže byť regulovaná na úrovni mRNA alebo polypeptidu. Teda sekvencia kontroly expresie zahŕňa prvky so vzťahom k mRNA a prvky so vzťahom k proueínu. Takéto prvky zahŕňajú promótory, enhancery (vírusové alebo bunkové), sekvencie viažuce ribozóm, transkripčné terminárory a pod. Sekvencia kontroly expresie je operatívne spojená s nukleotidovou kódujúcou sekvenciou, keď je sekvencia kontroly expresie umiestnená tak, aby sa dosiahol účinok alebo sa dosiahla expresia kódujúcej sekvencie. Napríklad, keď je promótor operatívne spojený 5' ku kódujúcej sekvencii, expresia kódujúcej sekvencie je riadená promótorom. Sekvencie kontroly expresie môžu byť heterológne alebo endogénne vzhľadom na normálnemu génu.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu sa môže vybrať na základe hybridizácie nukleových kyselín. Schopnosť dvoch preparátov jednoreťazcovej nukleovej kyseliny spolu hybridizovať je mierou komplementarity ich nukleotidových sekvencii, napr.

párovánie báz medzi nukleotidmi, ako je napr. A-T, G-C a pod.

Vynález sa teda taktiež týka nukleových kyselín a ich komplementov (t. j. komplementárnych sekvencii), ktoré hybridizujú s nukleovou kyselinou obsahujúcou nukleotidovú sekvenciu, ako je uvedená na obrázkoch 1 a 2, hybridizuje s druhou uvedenou reťazec nukleovej kyseliny alebo v prítomnosti polymerázy (t syntetizuje nukleovú kyselinu) obidva reťazce nukleovej ky:

Nukleotidova sekvencia,	ktorá
sekvenciou, má	komplex	lentárny
pôsobí ako templát pre	reťazec
j . vhodného	enzýmu,	ktorý
Predkladaný	vynález	zahŕňa
eliny, napr.	sense	reťazec

a antisense reťazec.

Hybridizačné podmienky sa môžu zvoliť tak, aby viedli k výberu nukleových kyselín, ktoré majú požadovaný stupeň komplementarity nukleotidov s nukleotidovou sekvenciou uvedenou na obrázkoch 1 a 2. Nukleová kyselina, ktorá je schopná hybridizovať s takouto sekvenciou, má výhodne napr. približne 85%, výhodnejšie 90%, 92% a ešte výhodnejšie 95%, 97% alebo 100% komplementaritu medzi sekvenciami. Predkladaný vynález sa konkrétne týka sekvencii nukleovej kyseliny, ktoré hybridizujú s nukleotidovou sekvenciou uvedenou na obrázkoch 1 a 2 v podmienkach nízkej alebo vysokej stringencie.

Nukleové kyseliny, kcoré hybridizujú s FGF sekvenciami, sa môžu vybrať rôznymi spôsobmi. Napríklad tzv. bloty (t. j. matrice, ktoré obsahujú nukleovú kyselinu, konkrétne napr. nylonová membrána), čipové matrice a ďalšie matrice, ktoré obsahujú požadované nukleové kyseliny, sa môžu inkubovať v prehybridizačnom roztoku (6x SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturovanej DNA zo spermií lososa, 5x Denhardtov roztok a 50% formamid) pri 30°C cez noc a potom hybridizovať s detegovateľnou oligonukleotidovou sondou (pozri ďalej) v hybridizačnom roztoku (napr. 6x SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturovanej DNA zo spermií lososa a 50% formamid) pri 42°C cez noc podlá známych postupov. Bloty sa môžu premyť v podmienkach vysokej stringencie, čo umožní výskyt nesúhlasných (mismatch) polôh napr. menej ako 5% bp (napr. dvakrát premytie v 0,1% SSC a 0,1% SDS počas 30 minút pri 65°C), t. j.

selekciu sekvencií, ktoré majú 95% alebo vyššiu sekvenčnú identitu. Ďalšie neobmedzujúce príklady vysoko stringentných podmienok zahŕňajú konečné premytie pri 65°C vo vodnom pufri, ktorý obsahuje 30 mM NaCl a 0,5% SDS. Ďalším príkladom vysoko stringentných podmienok je hybridizácia v 7% SDS, 0,5 M NaPO₄, pH 7, 1 mM EDTA pri 50°C, napr. cez noc, po ktorej nasleduje jedno alebo viacero premytí 1% roztokom SDS pri 42°C.

Zatiaľ čo vysoko stringentné premytie môže umožniť výskyt nesúhlasných (mismatch) polôh menší ako 5%, mierne podmienky alebo málo stringentné podmienky premytia (napr. premytie dvakrát v 0,2% SSC a 0,5% SDS počas 30 minút pri 37°C) môžu umožniť až 20% výskyt nesúhlasných (mismatch) polôh. Iný neobmedzujúci príklad málo stringentných podmienok zahŕňa konečné premytie pri 42°C v pufri, ktorý obsahuje 30 mM NaCl a 0,5% SDS. Premytie a hybridizácia sa môžu taktiež uskutočňovať tak, ako je opísané v Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, kapitola 9.

Hybridizácia môže byť taktiež založená na výpočte teploty topenia (Tm) hybridu vytvoreného medzi sondou a jej cieľom, ako je opísané v Sambrook et al. Všeobecne, teplota Tm, pri ktorej sa krátky oligonukleotid (obsahujúci 18 nukleotidov alebo menej) oddelí od svojej cieľovej sekvencie (topí sa), je daná podľa nasledujúcej rovnice: Tm = (počet A a T) x 2°C + (počet C a G) x 4°C. Čo sa týka dlhších molekúl, Tm = 81,5 + 16, ôloglO [Na+] + 0,41(%GC)-600/N, kde [Na+] je molárna koncentrácia sodíkových iónov, % GC je percento GC párov báz v sonde a N je dĺžka. Hybridizácia sa môže uskutočniť pri teplote o niekoľko stupňov nižšou, ako je táto teplota, aby sa zaistilo, že sonda a ciel môžu hybridizovať. Pri výskyte nesúhlasných („mismatch) polôh sa môže kalkulovať s ešte väčším znížením teploty.

Stringentné podmienky sa môžu vybrať tak, aby sa izolovali sekvencie a ich komplementy, ktoré majú napr. približne aspoň

95%, výhodne 97% komplementaritu nukleotidov medzi sondou (napr.

oligonukleotid FGF) a cieľovou nukleovou kyselinou).

Podlá predkladaného vynálezu nukleová kyselina alebo polypeptid môžu zahŕňať jeden alebo viacero rozdielov v nukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencií uvedenej na obrázkoch 1 a

2. Zmeny alebo modifikácie nukleotidovej a/alebo aminokyselinovej sekvencie sa môžu uskutočniť ktorýmkoľvek dostupným spôsobom, vrátane priamej alebo náhodnej mutagez.ézy.

Nukleová kyselina, ktorá kóduje cicavčí FGF, ako je napr. FGF-20 alebo FGF-23, môže podľa vynálezu zahŕňať nukleotidy, ktoré sa vyskytujú v prirodzene sa vyskytujúcom géne, napr. prirodzene sa vyskytujúce polymorfi zmy, normálne alebo mutované alely (nukleotidu alebo aminokyseliny), mutácie, ktsré boli objavené v prírodnej populácii cicavcov, ako sú napr. ľudia, opice, prasatá, myši, laboratórne potkany alebo králiky. Napríklad humánna FGF nukleová kyselina alebo polypeptid obsahuje nukleotidy alebo aminokyseliny, ktoré sa vyskytujú v prirodzene sa vyskytujúcej ľudskej populácii. Termín „prirodzene sa vyskytujúci znamená, že nukleovú kyselinu je možné získať z prírodného zdroja, napr. zvieracieho tkaniva a buniek, telesných tekutín, buniek tkanivových kultúr, forenzných vzoriek. Prirodzene sa vyskytujúce mutácie môžu zahŕňať delécie (napr. skrátený amino- alebo karboxykoniec), substitúcie, inverzie alebo adície nukleotidovej sekvencie. Tieto gény sa môžu detegovať a izolovať hybridizáciou nukleových kyselín podľa metód, ktoré odborník v odbore pozná. Nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje cicavčí FGF podľa vynálezu, môže obsahovať kodóny zistené v prirodzene sa vyskytujúcom géne, transkripte alebo cDNA, napr. ako je uvedené na obrázkoch 1 a 2, alebo môže obsahovať degenerované kodóny, ktoré kódujú rovnaké aminokyselinové sekvencie. Naprík.ad môže byť žiadúce meniť kodóny v sekvencií tak, aby sa optima^izovala sekvencia na expresiu v požadovanom hostiteľovi.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu môže zahŕňať napr. DNA, RNA, syntetickú nukleovú kyselinu, peptidovú nukleovú kyselinu, modifikované nukleotidy alebo zmesi. DNA mcže byť dvojreťazcová alebo jednoreťazcová. Nukleotidy obsiahnuté v nu17 kleovej kyseline môžu byť spojené prostredníctvom rôznych známych väzieb, ako je napr. väzba esterová, sulfamátová, sulfamidová, fosforotioátová, fosforamidátová, metylfosfonátová, karbamátová a pod., v závislosti od požadovaného ciela, napr. rezistencia proti nukleázam, ako je napr. RNAáza H, zlepšenie in vivo stability a pod. (pozri napr. US patent č. 5 378 825).

Môžu sa vytvárať rôzne modifikácie nukleových kyselín, ako je napr. pripojenie detegovateľných markerov (avidín, biotín, rádioaktívne prvky), skupín, ktoré zlepšujú hybridizáciu, detekciu alebo stabilitu. Nukleové kyseliny môžu byť taktiež pripojené na pevné nosiče, ako je napr. nitrocelulóza, magnetické alebo paramagnetické mikrosféry (napr. ako je opísané v US patentoch č. 5 411 863, č. 5 543 289, napr. ktoré obsahujú feromagnetický, supermagnetický, paramagnetický, superparamagnetický, oxid železnatý a polysacharid), nylon, agaróza, diazotizovaná celulóza, latexové pevné mikrosféry, polyakrylamidy a pod., podľa požadovaného spôsobu (pozri napr. US patenty č. 5 470 967, 5 476 925, 5 478 893) .

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka oligonukleotidov alebo sond nukleovej kyseliny. Taktiež oligonukleotidy alebo sondy nukleovej kyseliny sa môžu použiť napr. na detekciu, kvantifikáciu alebo izoláciu cicavčej FGF nukleovej kyseliny v testovanej vzorke alebo na identifikáciu FGF homológov. Vo výhodnom uskutočnení sa môžu nukleové kyseliny použiť ako oligonukleotidové sondy, napr. v PCR, diferenciálnom displeji, génových čipoch (napr. Affymetrix GeneChips, US patenty č. 5 143 854, č. 5 424 186, a č. 5 874 219; PCT WO 92/10092, PCT WO 90/15070) a v iných dostupných metódach. Detekcia môže byť žiadúca na celý rad odlišných cieľov, vrátane výskumu, na účely diagnostické a forenzné. Na diagnostické účely môže byť žiadúce identifikovať prítomnosť alebo množstvo (kvantitu) sekvencie nukleovej kyseliny vo vzorke, či už sa vzorka získala z tkaniva, buniek, telesných tekutín a pod. Vo výhodnom uskutočnení sa predkladaný vynález týka spôsobu detekcie nukleovej kyseliny, ktorá zahŕňa kontakt cieľovej nukleovej kyseliny v testovanej vzorke s oligonukleotidom v podmienkach efektívnych na dosiahnutie hybridizácie medzi cieľom a oligonukleotidom; a detekcie hybridizácie. Oligonukleotid použiť v syntetickej amplifi napr. PCR (napr. Saiki et al. č. 4 683 ' 202, PCR Prot<

Applications, Innis et al., 1990), diferenciálny displej Acid. Res., 21: 3269-3275,

WO97/18454) .

podľa vynálezu sa môže taktiež kácii nukleovej kyseliny, ako je , Science, 241: 53, 1988, CS patent jcols: A Guide to Methods and vyd., Academic Press, Ne·.·.' York, (pozri napr. Liang et al. , Nucl. 1993, US patent č. 5 599 672,

Detekcia sa môže uskutočniť v kombinácii s oligonukľeotidmi pre ďalšie gény, napr. gény zapojené do signálnej transdukcie, rastu, rakoviny, apoptózy alebo ktorýkoľvek z génov už uvedených alebo uvedených ďalej v tomto texte a pod. Oligonuklec“idy sa taktiež môžu použiť na testovanie mutácii napr. s použitím technológie opráv nesúhlasných polôh v DNA („mismatch DNA repair technology) , ako je opísané v US patente č. 5 683 :~7, US patente č. 5 656 430, Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 8779-8783, 1992.

Oligonukleotidy podľa predkladaného vynálezu môžu ocsahovať ktorúkoľvek kontinuálnu nukleotidovú sekvenciu z obrázkov 1 a 2 alebo ich komplement alebo ktorúkoľvek zo sekvencií aľeoo ich komplementov. Tieto oligonukleotidy (nukleová kyselina; podľa predkladaného vynálezu môžu mať ktorúkoľvek požadovanú veľkosť, napr. približne 10 až 200 nukleotidov, 12 až 100, výhodne 12 až 50, 12 až 25, 14 až 16, aspoň približne 15, aspoň približne 20, aspoň približne 25 a pod. Oligonukleotidy môžu mať neprirodzene sa vyskytujúce nukleotidy, napr. inozín, AZT, 3TC a pod. Oligonukleotidy môžu mať 100% identitu alebo komplementaritu so sekvenciou z obrázkov 1 a 2 alebo môžu mať nesúhlasné polohy alebo nukleotidové substitúcie, napr. 1, 2, 3, 4 alebo 5 substitúcií. Napríklad oligonukleotidy môžu mať 70% až 99% identitu, napr. 90%, 95% alebo 97% identitu, so sekvenciou z obrázkov 1 alebo 2. Podlá predkladaného vynálezu oligonukleotid môže tvoriť diagnostickú súpravu (kit), pričom súprava zahŕňa požadovaný pufor (napr. fosfát, Tris a pod.), detekčné prípravky a pod. Oligonukleotid môže byť značený alebo neznačený, rádioaktívnou alebo nerádioaktívnou značkou, ako je v odbore známe.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je nukleotidová sekvencia, ktorá je unikátna vzhladom na cicavčí FGF. Termínom „unikátna sekvencia vzhladom na FGF” sa myslí definované coradie nukleotidov, ktoré sa vyskytuje v FGF, napr. v nukleccidových sekvenciách z obrázkov 1 a 2, ale zriedka alebo občas v iných nukleových kyselinách, obzvlášť nie vo zvieracej nukleovej kyseline, výhodne cicavčej, ako je napr. humánna nukleová kyselina, nukleová kyselina laboratórneho potkana, myší a pod. Unikátne nukleotidové sekvencie zahŕňajú sekvencie alebo ich komplementy, kódujúce aminokyseliny, ako je ukázané v sekvencií SEQ TI NO: 1 a 2 na obrázkoch 1 a 2. Takéto sekvencie sa môžu pcužiť ako sondy v ktorejkoľvek metóde opísanej v tomto texte alebo zahrnutej vo forme odkazu. Zahrnuté sú aj sense aj ar.zisense nukleotidové sekvencie. Unikátna nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu sa môže určiť rutinne. Nukleová kyselina, ktorá obsahuje takúto unikátnu sekvenciu, sa môže použiť ako hybridizačná sonda na identifikáciu výskytu napr. humánneho alebo myšieho FGF vo vzorke, ktorá obsahuje zmes nukleových kyselín, napr. na Northern blote. Hybridizácia sa môže uskutočňovať pri vysoko stringentných podmienkach (pozri už uvedené) na selekciu nukleových kyselín (a ich komplementov, ktoré môžu obsahovať kódujúce sekvencie), ktoré majú aspoň 95% identitu (t. j. komplementaritu) so sondou, ale môžu sa taktiež použiť menej stringentné podmienky. Unikátna FGF nukleczidová sekvencia môže taktiež byť fúzovaná v zhodnom čítacom rámci, buď na jeho 5' alebo 3’ konci, k rôznym nukleotidovým sekvenciám, ako je uvádzané v opise patentu, vrátane kódujúcich sekvencií pre ďalšie časti FGF, enzýmy, GFP a pod., sekvencie kontroly expresie a pod.

Ako už je opísané, hybridizácia sa môže uskutočňovať v rôznych podmienkach, v závislosti od požadovanej selektivity, napr. ako je opísané v práci Sambrook et al. , Molecular Clonrng, 1989. Napríklad na špecifickú detekciu FGF podlá predkladaného vynálezu sa cligonukleotid môže hybridizovať s cieľovou nukleovou kyselinou v podmienkach, v ktorých oligonukleotid hybridizuje len s ňou, napr. kde oligonukleotid je 100% komplementárny s cieľom.. Môžu sa použiť rôzne podmienky, ak je žiadúce vybrať cieľové nukleové kyseliny, ktoré majú menšiu ako 100% komplementaritu nukleotidov, približne aspoň napr. 99%, 97%, 95%, 90%, 86,4%, 85%, 70%, 67%.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu môže byť značená akýmkoľvek požadovaným spôsobom. Nukleová kyselina sa môže značiť s použitím značiacich izotopov, ako je napr. 'P, ^j5S, ¹²⁵I, ³H alebo ¹⁴C, aby sa zmienili aspoň všeobecne používané izotopy. Rádioaktívne značenie sa môže uskutočňovať akoukoľvek odborníkovi známou metódou, napr. koncovým značením na 3' alebo 5' konci s použitím rádioaktívne značeného nukleotidu, polynukleotidylkinázy (s defosforyláciou alebo bez defos forylácie s fosfatázou) alebo ligázy (v závislosti od toho, ktorý koniec má byť značený). Môže sa taktiež použiť nerádioaktívne značenie, keď sa kombinuje nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu so skupinami, ktoré majú imunologické vlastnosti (antigény, haptény), špecifickú afinitu pre určité činidlá (ligandy;, vlastnosti, ktoré umožňujú detegovať enzymatickú reakciu, ktorá má prebehnúť (enzýmy alebo koenzýmy, enzýmové substráty alebo iné látky, ktoré sa zúčastňujú enzymatickej reakcie) alebo charakteristické fyzikálne vlastnosti, ako je napr. fluorescencia alebo emisia alebo absorpcia svetla v požadovanej vlnovej dĺžke a pod.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu, vrátane oligonukleotidov, antisense nukleových kyselín a pod., sa môže použiť na detekciu expresie FGF v celých orgánoch, tkanivách, bunkách a pod., a to rôznymi technikami, ku ktorým patrí Northern blot, PCR, hybridizácia in situ, diferenčný displej, čipy s nukleovými kyselinami, hybridizácia „bodových blotov a pod. Takéto nukleové kyseliny sa môžu konkrétne použiť na detekciu narušenej expresie napr. bunkovo špecifických a/alebo subcelulárnych zmien FGF. Hladiny FGF sa môžu určiť samostatne alebo v kombinácii s inými génovými produktami, hlavne iných produktov génov, ktoré sú zahrnuté v nervovej fyziológii.

Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu sa môže exprimovať v celom rade rôznych systémov, tak in vitro ako in vivo, podľa požadovaného cieľa. Napríklad nukleová kyselina sa môže vložiť do expresného vektora, vniesť do požadovaného hostiteľa a ten ďalej kultivovať v podmienkach, ktoré sú účinné (vhodné) na expresiu polypeptidu kódovaného nukleovou kyselinou. Účinnými podmienkami sú akékoľvek kultivačné podmienky, ktoré sú vhodné na dosiahnutie produkcie polypeptidu v hostiteľskej bunke a zahŕňajú účinnú teplotu, pH, médium, aditíva k médiu, v ktorom je hostiteľská bunka kultivovaná (napr. aditíva, ktoré amplifikujú alebo indukujú expresiu, ako je napr. butyrát alebo metotrexát, ak je kódujúca nukleová kyselina spojená s génom dhfr) , cykloheximid, bunková hustota, kultivačné nádoby a pod. Nukleová kyselina sa môže vniesť do bunky ktorýmkoľvek účinným spôsobom, vrátane napr. prenosu holej DNA, prenosu pomocou precipitácie s fosforečnanom vápenatým, elektroporáciou, injekciou, transfekciou sprostredkovanou DEAE-dextránom, fúziou s lipozómami, asociáciou s činidlom, ktoré zosilňuje ich vychytávanie do buniek, vírusovou transfekciou. Bunka, do ktorej bola vložená nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu, je transformovaná hostiteľská bunka. Nukleová kyselina môže byť extrachromozomálna alebo sa integruje do chromozómu hostiteľskej bunky. Táto integrácia môže byť stabilná alebo prechodná. Expresný vektor je vybraný kvôli jeho zlúčiteľnosti s hostiteľskou bunkou. Hostiteľské bunky zahŕňajú cicavčie bunky, napr. COS, CVI, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293, PAE, humánne bunky, humánne fibroblas22 ty, humánne primárne nádorové bunky, bunky semenníkov, gliové bunky, neuróny, oligodendrocyty, bunky z neuroblastómu, gliómu a pod., hmyzie bunky, ako je napr. Sf9 (S. frugipeda) a bunky z drozofily (Drosophila) , baktérie, ako je napr. E. coli, Streptococcus, Bacillus, kvasinky, ako je napr. Saccharcmyces, napr. S. cerevisiae, bunky húb, rastlinné bunky, embryonálne kmeňové bunky (napr. cicavčie, ako napr. myšie alebo humánne), neurónové kmeňové bunky, fibroblasty, svalové bunky, srdcové bunky a T lymfocyty.

Sekvencie kontroly expresie sú podobne vybraté na základe hostiteľskej kompatibility a požadovaného cieľa, napr. vysoký počet kópii, veľké množstvo, indukcia, amplifikácia, riadená expresia. Ďalšie sekvencie, ktoré sa môžu použiť, zahŕňajú enhancery (zosilňovacie sekvencie), ako je napr. SV40, CMV, RSV, indukovatelné promótory, prvky alebo sekvencie špecifické pre bunkový typ, ktoré umožňujú bunkovo selektívnu alebo špecifickú expresiu. Promótory, ktoré sa môžu použiť na riadenie expresie, zahŕňajú napr. endogénny promótor, promótory ostatných génov v bunkovej dráhe signálnej transdukcie, promótory MMTV, SV40, trp, lac, tac alebo T7 pre bakteriálnych hostiteľov alecc promótory alfa faktora, alkoholoxidázy alebo PGH pre kvasinky. RNA promótory sa môžu použiť na vytvorenie RNA transkriptov, ako je napr. T7 alebo SP6 promótor. Pozri napr. Melton et al., Nucleic Acid Res., 19 (18): 7035-7056,1984, Dunn a Studier, J. Mol. Bio., 166: 477-435, 1984, US patent č. 5 891 636, Studier et al. , Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85: 6089,1987.

Nukleová kyselina alebo polypeptid podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť ako marker veľkosti pri elektroforéze nukleových kyselín alebo proteínov, chromatografii a pod.. Definované reštrikčné fragmenty sa môžu určiť pomocou vyhľadávania reštrikčných miest v sekvencií a vypočítaním veľkosti a nakoniec uskutočnením zodpovedajúceho štiepenia reštrikčnými enzýmami.

FGF polypeptid a nukleová kyselina predkladaného vynálezu môžu byť „izolované.

Termín izolovaný znamená, že zodpovedajúca zlúčenina je vo forme, v ktorej sa nevyskytuje v pôvodnom prostredí alebo v prírode, napr. je viac koncentrovaná, viac purifikovaná, oddelená od zložiek, .prítomných v lyzáte bunky, v ktorej je heterológny FGF gén exprimovaný. Keď je FGF exprimovaný ako heterológny gén v transfekovanej bunkovej línii, gén podlá predkladaného vynálezu je vnesený do bunky, ako je už opísané v podmienkach, v ktorých je gén exprimovaný. Termín heterológny znamená, že gén bol zavedený do bunkovej línie ľudským experimentálnym zásahom („ľudskou rukou). 0 vnášaní génu do bunkovej línie sa už diskutovalo. Transfekované (alebo transformované) bunky, ktoré exprimujú FGF gén, môžu byť lyzované, ako je opísané v príkladoch a použité spôsobom ako lyzát (t. j. izolovaný) alebo môžu byť použité bunkové línie neporušené.

Všeobecne, termín účinné podmienky znamená napr. prostredie, v ktorom sa dosiahne žiadaný účinok. Takéto prostredie zahŕňa napr. pufre, oxidačné činidlá, redukčné činidlá, pH, kofaktory, teplotu, koncentráciu iónov, vhodný vek a/alebo fázu bunkového cyklu, keď sú bunky použité (ako je napr. konkrétna fáza bunkového cyklu alebo konkrétne štádium, keď sú exprimované konkrétne gény), kultivačné podmienky (vrátane substrátu, kyslíka, oxidu uhličitého a pod.).

Na zvýšenie stability sa podávaná nukleová kyselina môže modifikovať napr. tak, aby bola odolná proti bunkovým enzýmom, oxidázam, reduktázam, nukleázam a pod., alebo aby sa zosilnilo jej vychytávanie do buniek. Môže sa použiť ktorákolvek vhodná modifikácia, vrátane modifikácie s použitím napr. fosforotioátov, metylfosfonátov, fosfodiesteroligonukleotidov spojených s akridinovým interkalačným činidlom a/alebo hydrofóbnym „chvostíkom, derivátov psoralénu, modifikácie 2'-ribózy, deriváty cukru pentózy, deriváty dusíkatých báz a pod., pozri napr. US patent č. 5 576 208 a č. 5 744 362. Pre iné deriváty, modifikácie a pod., ktoré sa môžu použiť vo vynáleze taktiež pozri už uvedené. Všebecne, antisense predkladaného vyskytujúcich tidy a ich vynálezu môžu zahŕňať nukleové kyseliny podľa monoméry prirodzene sa nukleotidov, neprirodzene kombinácie bunkového vycnytávania a/alebo stability.

Antisense nukleové kyseliny sa môžu podávať ako holé nukleové kyseliny, v komplexe alebo opuzdrené s inými činidlami, ktoré uľahčujú vychytávanie do bunky, tnjikovaním do buniek alebo akýmkoľvek iným známym spôsobom.

Predkladaný vynález sa taktiež týka spôsobov použitia FGF podľa predkladaného vynálezu, ako je napr. FGF-20 a FGF-23. Takéto spôsoby sa týkajú podávania účinného množstva FGF alebo nukleovej kyseliny, ktorá kóduje FGF podľa predkladaného vynálezu hostiteľovi, a to na jeden alebo viacero nasledujúcich cieľov: podpora prežívania a/alebo proliferácie napr. neurónov, oligodendrocytov, Schwannových buniek, kmeňových buniek, obzvlášť nervových kmeňových buniek, endotelových buniek, keratinocytov a ktoréhokoľvek bunkového typu, ktorý je schopný reagovať na FGF-20 alebo FGF-23, napr. buniek, ktoré exprimujú príbuzný receptor (ako je napr. FGFR 1-4) na svojom bunkovom povrchu, alebo ich progenitorov; podpora hojenia rán, modulácia diferenciácie buniek, indukcia embryonálneho vývinu, stimulácia neuritového vyrastania, posilnenie regenerácie po nervovom alebo nervovom poškodení, stimulácia myelinizácie, stimulácia angiogenézy, väzbové aktivity receptora.

Predkladaný vynález sa taktiež týka indikácií a spôsobov použitia FGF podľa predkladaného vynálezu, ako je napr. FGF-20 a

FGF-23 alebo nukleová kyselina kódujúca FGF. Takéto spôsoby zahŕňajú podávanie účinného množstva FGF podľa predkladaného vynálezu hostiteľovi na jeden alebo viacero nasledujúcich cieľov:

posilnenie regenerácie po nervovom a axónovom poškodení, stimu25 lácia myelinizácie, angiogenéza, hojenie rán, hojenie vredov, indukcia opravy kostného defektu, podpora prežívania štepu a indukcia embryonálneho vývinu. Už uvedené aplikácie sú dôsledkom potenciálnej FGF aktivity, ktorá podporuje prežívanie a/alebo proliferáciu buniek, inhibíciu a/alebo stimuláciu diferenciácie určitých bunkových typov. FGF môže indukovať bunkové prežívanie/proliferáciu kmeňových buniek, progenitorov, prekurzorov a zrelých buniek nasledujúceho pôvodu: neurónov, oligodendrocyťov, Schwannových buniek, endotelových buniek, keratinocytcv a ďalších bunkových typov exprimujúcich ktorýkoľvek z FGF receptorov. Okrem toho FGF môžu indukovať diferenciáciu neurónových progenitorov indukciou neuritového vyrastania/extenzie.

Nasledujúce in vitro a in vivo testy môžu byť uskutočňované na meranie aktivity FGF vzhľadom na už opísané bunkové funkcie.

In vitro testy

Indukcia proliferácie oligodendrocyťov in vitro

Oligodendrocyty použité na meranie účinkov GF na bunkovú proliferáciu sú buď už zavedené bunkové línie, ako je napr. N 20.1 alebo primárne oligodendrocyty hlodavcov. Primárne oligodendrocyty a progenitory oligodendrocyťov hlodavcov (laboratórny potkan) môžu byť izolované a purifikované napr.

jednou z nasledujúcich techník: technika založená na rozdielnej adhézii (Mitrovic centrifugácia

Percolu (Mattera et al., Neurochem.

41-50 a Kim

J Neurol

Sci, 1983

Dec, imunoseparácia. Bez ohľadu na zdroj oligodendrocytov 'primárne bunky alebo bunková línia) alebo spôsob ich izolácie a purifikácie, testy proliferácie oligodendrocytov sa môžu uskutočňovať počas 3, 5 a 7 dní. Pozitívnymi kontrolami sú niektoré iné členy FGF rodiny,

Bunková proliferácia sa meria ako MTT test a inkorporácia ³Htymidínu. Pozri taktiež testy proliferácie oligodendrocytov v publikácii Danilenko, et al. , Árch Biochem Biophys. 1999 Jan 1: 361 (1) : 34-46.

Indukcia neuritových výrastkov

PC12 testy

Pri nových členoch FGF rodiny je možné testovať indukciu diferenciácie a neuritové výrastky v bunkovej línii PC-12 (pochádzajúcej z feochromocytomóveho nádoru laboratórneho potkana) (Rydel, 1987 Greene, 1976).

Navyše, pretože sa ukázalo, že časť NGF indukovanej reakcie je spôsobená autokrinnou NGF-indukovancu produkciou FGF-2, je možné taktiež skúmať účinky nových FGF na „up-reguláciu (zosilnenie) NGF produkcie PC12 buniek (Chevet et al., J. Biol Chem. 1999 Jul 23: 274 (3): 20901-8).

Neuritové výrastky v gangliu dorzáine’no koreňa (DRG)

DRG sa izolujú pitvaním embryí laboratórneho potkana a DRG sa potom kultivujú v neurobazálnom médiu, rozsah neuritových výrastkov DRG sa potom hodnotí vizuálne a kvantifikuje na základe určenia počtu a dĺžky neuritov v porovnaní s neošetrenou kontrolou.

Testy sa môžu uskutočňovať na bunkách fibroblastového a endotelového pôvodu. Na fibroblasty sa môže použiť modifikovaný NIH 3T3 proliferačný test. Na určenie účinkov FGF na indukciu proliferácie endotelových buniek sa môžu použiť nasledujúce bunky: HUVEC bunky, bunky z mikrovaskulatúry endotelu a bunky aortálneho endotelu. In vitro tescy, ktoré sú relevantné na určenie terapeutického potenciálu FGF ako potenciálneho terapeutického agensu na liečbu zranení, vredov alebo poškodenia kostí, sa môžu uskutočniť postupmi opísanými v odbornej literatúre.

Iné testy, ktoré korelujú s regeneráciou CNS, zahŕňajú testy aktivácie génovej expresie spojené s rastom alebo prežívaním (Meinerse, et al., Dev Biol. 1993 Dec: 160 (2): 480-93); modulácie iného rastového faktora in vivo (Yosnida, 1992); modulácie elektrofyziológie neurónov (Terlau, 1990); aktivity ako mitogény alebo diferenciačné faktory pre oligodendrocyty, Schwannove bunky alebo astrocyty (Genburger, 1987, Stemple, 1988, Kalcheim, Dev Biol. 1989 Jul: 134 (1): 1-10, Murphy, 1990); podpory in vitro prežívania neurónov z kôry alebo hipokampu, motorických, zmyslových, sympatických alebo parasympatických neurónov (Eckstein, 1994, Unsicker, et al. , Ann N. Y. Acad Sci. 1991: 638: 300-5, Grothe, et al., Int J Dev Biol. 1996 Feb: 40 (1): 403-10); podpory prežívania motorických neurónov in vitro a pod.

In vivo testy

Remyelinizačný potenciál nových FGF sa môže vyšetriť napr. v nasledujúcich modeloch: a) zvierací model deficitný na myelín, ako je transplantácia SVZ buniek z darcovského zvieraťa ošetreného s FGF, do myši deficientnej na myelín a potom meranie expanzie oligodendrocytov in vivo, b) demyelinizačný zvierací model, ako je napr. PLT indukovaný CR-EAE a MBP adoptívny transfer indukovaný s CR-EAE. Pozri taktiež testy opísané v publikácii Gumpel, 1992 a Hinks, et al., Mol Celí Neurosci. 1999 Aug: 14 (2): 15368.

FGF sa môžu testovať vzhľadom na ich schopnosť indukovať neuroregeneráciu a neuroprotekciu v nasledujúcich in vivo modeloch: mechanické poškodenie/zranenie (prerušenie priečnym rezom dráhy fimbria fornix, ischiatického nervu, miechy, optického nervu a odrezanie DRG), modely nervového poškodenia spôsobeného cerebrovaskulárnym zranením, ako je napr. oklúzia karotídy, dočasná oklúzia MCAO a hypoxické-ischemické cerebrálne poškodenie a chemicky indukovaná neurodegenerácia spôsobená MPTP indukovanou léziou alebo KA indukované záchvaty.

K typickým in vivo testom patrí napríklad meranie redukcie strát neurónov po ischémii hipokampu (Sasaki, 1992, Macmillan, et al., Can J Neurol Sci 1993 Feb: 20 (1): 37-40), podpory prežívania kortikálnych neurónov po lézii perforujúcej dráhu (Gomez-Pinilla, 1992, Peterson, et al., J. Neurosci. 1996 Feb 1: 16 (3): 886-98), ochrany bazálnych cholinergných neurónov predného mozgu pred poškodením, ktoré je indukované degeneráciou a redukcie MPTP-indukovanej alebo léziou-indukovanej straty neurónov zo ’ substantia nigra (Anderson, et al., Náture 1998 Mar 24: 332 (6162): 360-1, Orto, 1989, Gomez-Pinilla, 1992, Ottc, 1990) a dlhodobého rastu progenitorových nervových buniek in vitro ako neurosfér (opísané v Svendsen, et al., Trends Neurosci. 1999 Aug: 22 (S): 357-64. Pozri taktiež použitie modelov pre traumatické poškodenie, ako je napr. priečny rez optického nervu (Sievers, 1987), priečny rez ischiatickéhc nervu (Cordeiro, et al., Plast Reconstr Surg. 1989 June: 83 (6): 1013-

9, Khouri, et al., Microsurgery 1989: 10 (3): 206-9), priečny rez DRG (Aebischer, e~ al., J. Neurosci Res. 1989 Jul. 23 (3): 282-9), priečny rez miechy (Cheng, et al., Science 1996 Jul 26:

273 (5274) : 510-3 1996) a

1990), použitie modelov pre c napr. hypoxemické-íschemické

1993) a oklúzia MCA (Kawamat: A. 1997 Jul 22: 94 (15):

neurodegeneratívne modely, kianovou (KA) (Liu, et al., 335-8) alebo MND pri „pot rozdrvenie tvarového nervu (Kuzis erebrovaskulárne poškodenie, ako je cerebrálne poškodenie (MacMillen, ., et al., Proc Natl Acad Sci U. S.

8179-84, Schabitz, 1999) a iné ako je napr. liečba kyselinou Brain Res 1993 Oct 29: 626 (1-2) :

ícajúcich sa” („wobbler”) myšiach (Ikeda, et al., Neurol Res. 1995 Dec: 17 (6): 445-8).

Termín podávanie znamená, že FGF, nukleová kyselina, ktorá kóduje FGF alebo iná účinná látka je dopravená do cieľa, napr. do poranenia, poškodeného tkaniva a pod. FGF sa môže podávať do ktoréhokoľvek cieľa (napr. in vivo, in vitro alebo in situ), vrátane buniek v kultúre a hostiteľov, ktorí majú liečené poranenie, chorobný stav alebo ochorenie, účinným spôsobom, vhodným na dosiahnutie cieľa, ako už je opísané, napr. FGF formulácia sa môže podávať injekciou priamo do cieľového miesta alebo blízko k nemu. Môže sa taktiež podávať topicky, enterálne, parenterálne, intravenózne, intramuskulárne, subkutánne, perorálne, nazálne, intracerebrálne, intraventrikulárne, intracisternálne, intrakraniálne, implantovaná do požadovanej lokalizácie, napr. v gélovej pene, kolagénom naplnenej „dlahe na vedenie nervu a pod., napr. v závislosti od lokalizácie liečeného cieľového miesta. FGF' sa môže taktiež podávať nepretržite s použitím osmotickej pumpy. FGF sa môže taktiež podávať ako nukleová kyselina na vychytávanie bunkami. Spôsoby podávania nukleovej kyseliny zahŕňajú už opísané spôsoby a iné spôsoby známe zo stavu techniky.

Účinné množstvo FGF sa podáva k cieľovému miestu (cieľu). Účinné množstvo je také množstvo, ktoré je užitočné na dosiahnutie žiadaného efektu, výhodne s prospešným alebo terapeutickým účinkom. Také množstvo sa môže určiť rutinne napr. uskutočnením experimentu reakcie na dávku, v ktorom kolísajúce dávky sú podávané cieľovým bunkám na určenie účinného množstva na dosiahnutie požadovaného cieľa, napr. stimulácie neuritového vyrastania alebo podpory prežívania neurónov. Množstvá sa vyberajú na základe rôznych faktorov, vrátane prostredia, do ktorého je FGF podávaný (napr. pacientovi s poškodením mozgu, zvierací model, bunky tkanivových kultúr a pod.), miesta liečených buniek, veku, zdravia, pohlavia a hmotnosti liečeného pacienta alebo zvieraťa a pod.

V jednom aspekte sa predkladaný vynález týka spôsobov liečby nervových poranení, ako je napr. poškodenie nervov a trauma, poškodenie miechy a trauma, poškodenie nervového tkaniva, ktoré je vyvolané napr. ischemickými záchvatmi, infarktom, krvácaním a aneuryzmou, liečby nervových ochorení, napr. nervových degeneračných chorôb, ako je napr. Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtcnova choroba, sclerosis multiplex, myelopatia, myelitída a syringomyélia a pod., ktoré obsahujú podávanie účinného množstva FGF podľa predkladaného vynálezu.

FGF podlá tohto vynálezu sa môžu použiť na liečbu neurodegenerativnych a demyelinizačných chorôb CNS a PNS, charakterizovaných deštrukciou neurónov a oligodendrocytov. FGF sa môže použiť ako remyelinizačný liek na liečbu roztrúsenej sklerózy mozgovomiechovej (sclerosis multiplex} a iných primárnych a/alebo sekundárnych demyelinizačných ochorení CNS alebo PNS. Primárne demyelinizačné choroby CNS zahŕňajú adrenoleukodystrofiu, leukoencefalopatiu (ako je napr. progresívna multifokálna leukoencefalopacia), encefalomyelitída (ako je napríklad akútna diseminovaná perivenózna encefalomyelitída). Sekundárna demyelinizácia CNS je reprezentovaná ako tvorba demyelinizačných lézií pri CNS traume, toxicite (kyanid, hexachlórfan) alebo ischémii (mŕtvica). Demyelinizačné choroby PNS zahŕňajú primárne chorobné stavy, ako je Guillian-Barreho syndróm (GBS), paraproteinémia, chronická zápalová demyelinizačná polyneuropatia (CIDP). Okrem toho, FGF sa bude používať na liečbu neurodegeneratívnycn chorôb CNS a PNS, kde neurónové poškodenie je spôsobené ccškodenim/traumou (mechanické, chemické, cerebrovaskulárne poškodenie a zápal spôsobený infekciou a autoimunitnou reakciou' a na liečbu iných neurodegeneratívnych chorôb.

FGF podlá vynálezu môžu byť taktiež použité na podporovanie prežívania štepu (transplantátu). Napríklad FGF môžu pooporovať prežívanie štepov (napr. alogénnych, izogénnych alebo autológnych) celého radu buniek, tkanív alebo orgánov, ako je napríklad koža, fascia, šľachy, kosti, oblička, rohovka a dalšie. Transplantácia buniek, ktoré pochádzajú z neurónov, gliových alebo kmeňových buniek, do CNS alebo PNS, tiež prichádza do úvahy podlá vynálezu. Tranpslantovaný materiál môže pochádzať z prírodného zdroja alebo môže byť získaný in vitro expanziou buniek alebo tkanív alebo sa môže získať diferenciáciou nediferencovaných kmeňových buniek. Termín podporovať” znamená v tomto texte zosilňovať prežívanie a/alebo proliferáciu transplantovaných buniek, tkaniva alebo orgánu, ktoré boli ošetrené s FGF v porovnaní s bunkami, tkanivami alebo orgánmi, ktoré neboli oše trené. Metódy používané na testovanie prežívania štepov sú zvyčajné.

Testy na meranie prežívania štepov sú rutinné a sú odborníkom známe. Zvyčajné in vitro testy zahŕňajú napr. MTT, MTS, inkorporáciu Thy, testy s bunkami typu živá/mŕtva (napr. dvojité farbenie s kalceínom AM a etídiom homodimérom EthD-1), meranie celkového počtu buniek, napr. s použitím mikroskopického hodnotenia alebo fyzikálnymi metódami počítania buniek, ako je napríklad použitie počítača krviniek. Zvyčajné in vivo metódy zahŕňajú napr. pre CNS indikácie, detekciu zlepšenej neurologickej funkcie alebo zobrazovacie techniky, ako je napríklad MTR, MRS, CT alebo MRI, s Gd zosilnením alebo bez neho.

Ostatné stavy, ktoré sa môžu liečiť podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú prevenciu proti poškodeniu myokardu v dôsledku MI, indukciu angiogenézy, hojenie rán, hojenie vredov, prevenciu deštrukcie kosti a indukcie novotvorby kosti, podpora prežívania štepu a indukciu embryonálneho rozvoja.

FGF aktivity, ktoré sú užitočné pri už opísanej liečbe, zahŕňajú aktivity, ako je: podpora prežívania a/alebo proliferácia buniek, inhibícia a/alebo stimulácia diferenciácie nasledujúcich typov buniek: prežívanie/proliferácia kmeňových buniek, progenitorových, prekurzorových a zrelých buniek nasledujúceho pôvodu: neuróny, oligodendrocyty, Schwannove bunky, endotelové bunky, keratinocyty, osteoblasty a ďalšie bunkové typy, ktoré exprimujú ktorýkoľvek z FGF receptorov. Navyše FGF účinky na indukciu diferenciácie progenitorových buniek neurónov indukciou vyrastania/predlžovania neuritov sa považujú za využiteľné pri liečbe ktoréhokoľvek druhu poškodenia/poranenia neurónov.

Termín liečba znamená akékoľvek ošetrenie alebo účinok, ktorý vedie k zlepšeniu poškodenia alebo ochorenia, ako je napríklad podporovanie prežívania neurónov, gliových buniek, oligodendrocytov, astrocytov, Schwannových buniek a pod., stimulácia vyrastania neuritov, stimulácia myelinizácie, stimulácia proliferácie buniek a pod., ako už bolo uvedené. Na liečbu uvedených poranení alebo chorôb sa môžu FGF formulovať ako kompozícia alebo nukleová kyselina a aplikovať na poranené alebo choré miesta s použitím chirurgickej techniky.

FGF podlá vynálezu sa môžu taktiež podávať pri akomkoľvek spôsobe liečby opísanom v tomto texte, napr. podávať sa ako nukleová kyselina napr. pri génovej terapii. Nosiče na podávanie génov môžu mať vírusový alebo nevírusový pôvod (pozri všeobecne Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5: 845-852 (1994), Connelly, Human Gene Therapy 1: 185— 193 (1995) a Kaplitt, Náture Genetics 6: 148-153 (1994). Nosiče na génovú terapiu na aplikáciu konštruktov, vrátane terapeutickej kódujúcej sekvencie podlá vynálezu, sa môžu podávať buď lokálne alebo systémovo. Takéto konštrukty využívajú metódy vírusových alebo nevirusových vektorov. Expresia kódujúcej sekvencie je navodená pôsobením endogénneho cicavčieho alebo heterológneho promotóra. Expresia kódujúcej sekvencie je buď konštitutívna alebo regulovaná.

Predkladaný vynález môže využiť rekombinantné retrovírusy, ktoré sú konštruované tak, aby niesli alebo exprimovali požadovanú molekulu nukleovej kyseliny. Retrovírusové vektory, ktoré sa môžu použiť, zahŕňajú vektory opísané v nasledujúcich publikáciách: EP 0 415 731, WO 90/07936, WO 94103622, WO 93/25698, WO 93/25234, US Patent č. 5 219 740, WO 93/11230, WO 93/10218, Vile a Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864 (1993), Vile a Hart, Cancer Res. 53: 962-967 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53: 83-88 (1993), Takamiya et al., J Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992), Baba et al. , J. Neurosurg. 79: 729-735 (1993), US patent č. 4 777 127, patent Veľkej Británie č. 2 200 651 a EP 0 345 242. Výhodné rekombinantné retrovírusy boli opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 91/02805.

Zbaľovacie bunkové línie vhodné na použitie s už uvedenými retrovírusovými vektorovými konštruktami sa môžu ľahko pripraviť (pozri PCT publikácie WO 95/30763 a WO 92/05266) a použiť na vytvorenie produkčnej bunkovej línie (taktiež nazývanej vektorová bunková línia) na produkciu rekombinantných vektorových častíc. V konkrétnom výhodnom uskutočnení vynálezu sú zbaľovacie bunkové línie pripravené z humánnej (ako je napríklad línia HT1080 buniek) alebo norkovej rodičovskej bunkovej línie, čo umožňuje produkciu rekombinantných retrovírusov, kzoré prežívajú inaktiváciu v humánnom sére.

Predkladaný vynález taktiež používa vektory odvodené z alfavírusov („alphavírus-based), ktoré môžu pôsobiť ako nosiče na prenos génov. Také vektory sa môžu konštruovať zo širokého spektra alfavírusov, ako je napríklad Sindbis vírus, Semliki Forrest vírus (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Rcss River vírus (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) a vírus venezuelskej konskej encefalitídy (ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR532) . Reprezentatívne príklady takých vektorových systémov je možné nájsť v US patente č. 5 091 309, 5,217, S79 a 5 185 440 a PCT publikáciách č. WO 92/10578, WO 94/21792, WO 95/27369, WO 95/27044 a WO 95107994.

Nosiče na prenos génov podía predkladaného vynálezu môžu taktiež využívať parvovírusové vektory, ako sú napríklad vektory z adenoasociovaných vírusov (AAV). Reprezentatívne príklady zahŕňajú AAV vektory,ktoré sú opísané vo WO 93/09239 (Srivaszava), Samulski et al., J. Vir. 63: 3822-3828 (1989), Mendelson et al., Virol. 166: 154-165 (1988) a Flotte et al., P. N. A. S. 90: 10613-10617 (1993).

Reprezentatívne príklady adenovírusových vektorov sú opísané v Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988), Rosenfeld et al.,

Science 252: 431-434 (1991), WO 93/19191, Kolls et al., P. N. A.

S. 915-219 (1994), Kass-Eisler et al., P. N. A. S. 90: 1149811502 (1993), Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848 (1993),

Guzman et al., Cir. Res. 73: 12021207 (1993), Zabner ez al.,

Celí 75: 207-216 (1993), Li et al. , Hum. Gene Ther. 4: 403-409 (1993), Cailaud et al., Eur. J Neurosci. 5: 1287-1291 (1993), Vincent et al. , Nat. Genet 5: 130-134 (1993), Jaffe et al, Nat. Genet 1: 372-378 (1992) a Levrero et al., Gene 101: 195-202 (1992). Príklady adenovírusových vektorov vhodných na génovú terapiu podlá predkladaného vynálezu zahŕňajú vektory opísané v WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984/a WO-95/00655. Podávanie DNA naviazanej na usmrtený adenovírus, ako je opísané v Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992), sa môže taktiež použiť.

Iné nosiče a metódy na prenos génov sa môžu taktiež použiť, vrátane

DNA kondenzovanej s polykatiónmi a nespojenej alebo spojenej s usmrteným adenovírusom, pozri napr.

Curiel, Hum. Gene

Ther. 3:

na ligand, napríklad pozri Wu,

J. Biol. Chem. 264: 16985-16987 prihlášky buniek ako nosiča na bunkový prenos, pozri

9. mája 1994 a US 08/404,796,

č. 08/240,030, podané fotopolymerizovaného hydrogélu, ručnou „puškou vynálezu US depozíciou na génové častice, ako bolo patente č.

ionizujúcim žiarením, ako bolo opísané v US patente

č. 5 206 152 a v WO 92/11033, neutralizáciou jadrového membránou. Ďalšie prísoupy boli s bunkovou náboj a alebo fúziou opísané vo Philip,

Mol. Celí (1994) a v Woffendin, Proc. Natl.

Acad. Sci.

91:

1581-1585 (1994) môže taktiež holá

DNA, sú opísané používajú holú

580 859. Účinnosť príjmu sa v WO môže

DNA. Príklady metód, ktoré

90/11092 a v US patente č. 5 zvýšiť použitím biologicky rozložiteľných latexových perličiek.

potiahnuté latexové perličky sú účinne transportované do buniek po endocytózy perličkami. Tento spôsob sa môže ďalej zlepšiť ošetrením perličiek na zvýšenie hydrofóbnosri, čím sa uľahčí rozpad endozómu a uvoľňovanie DNA

Lipozómy, ktoré môžu pôsobiť ako nosiče na prenos génov, sú opísané v US patente

č. 5 422 120, PCT patentovej publikácii č. WO 95/13796, WO

94/23697 a WO 91/14445 a EP č. 0 524 968.

Ďalšie nevírusové prenosové systémy vhodné na použitie vo vynáleze zahŕňajú mechanické systémy, je napríklad et al.

Proc. Natl. Acad.

Sci. USA

Navyše kódujúca sekvencia a produkt depozície vnášania expresie ako taký sa môžu preniesť prostredníctvom fotopolymerizovaného hydrogélu.

génov, ktoré sa

Iné zvyčajné metódy môžu použiť na aplikáciu kódujúcej sekvencie, zahŕňajú napr.

použitie ručnej „pušky na prenos génových častíc, ako bolo opísané v US patente č. 5 149 655, použitie ionizujúceho žiarenia na aktiváciu prenášaného génu, ako bolo opísané v US patente č.

publikácii č. WO 92/11033.

206 152 a PCT patentovej

Predkladaný vynález sa taktiež týka spôsobu stimulácie bunkovej proliferácie, ktorý zahŕňa podávanie účinného množstva FGF-9 (napr. Kanda et al., už uvedené), FGF-20 alebo FGF-23 alebo jeho biologicky aktívneho fragmentu. Termín stimulácia bunkovej proliferácie znamená, že podávanie FGF vedie k bunkovému deleniu alebo mitóze. FGF sa môže podávať v akejkoľvek účinnej forme (nukleová kyselina alebo polypeptid) ktorémukoľvek vhodnému hostiteľovi.

Napríklad v jednom uskutočnení je spôsob užitočný r.a identifikáciu agonistov a antagonistov FGF. V takomto prípade je užitočné podávať FGF bunkovým líniám, vrátane už zajedených línií alebo primárnych buniek, ako je napríklad línia spinálnych motorických neurónov. Už zavedené línie zahŕňajú napr. línie uložené v Americkej zbierke mikroorganizmov (ATCC, Američan Tissue Culture Collection, atccc. org) ako napr. DBTRG-05MG, PFSK-1, MSTO-211H, NCI-H378, NCI-N417, NCI-H526, HCN-1A, HCN-2, CATH.a, NG108-15, NCI-H446, NCI-H209, NCI-H146, NCI-H82, NCIH345, NCI-H510A, D283 Med, D341 Med, C6, IMR-32, Neuro-2a,

NB41A3, BC3H1, A172, Mpf, T98G[T98-G], SCP, CCF-STTG1, Dl TNC1, CTX TNA2, PG-4 (S+L-), G355-5, SW 598[SW-598, SW598], Co/LacZ,

9L/lacZ, N1E-115, SH-SY5Y, BE(2)-M17, BE(2)-C, MC-IXC, SK-NBE(2), CHP-212, C6/lacZ7, M059K, M059J, F98, RG2[D74], NCI-H250,

NCI-H1915, 0Α1, TE 615.T, SVG pl2, TE671 sublínie č. 2, MBr Cl

1, SK-N-MC, SW 1088 [SW-1088, SW1088], SW 1783 [SW-1783,

SW1783], U-87 MG, U-118 MG, U-138 MG, MDA-MB-361, DU 145, Hs

683, H4, 293, PC-12, P19, NTERA-2 cl.Dl[NT2/D1], BCE C/D-lb, SKN-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ, SK-N-SH, Daoy, výhodne, bunky N2C.1.

Predpokladané agonisty a antagonisty FGF sa môžu počúvať in vitro k bunkám, ktorým bol podávaný FGF, ako sú napríklad už opísané bunkové línie alebo sa predpokladané činidlá môžu podávať in vitro alebo in vivo bunkám, ktoré prirodzene produkujú FGF. Agonistický alebo antagonistický účinok takéhoto činidla sa môže merať ktorýmkoľvek testom z celého radu testov známych v odbere, ako sú napríklad testy opísané inde v tomto texte.

Nervové kmeňové bunky môžu byť taktiež stimulované na prolíferáciu FGF podľa predkladaného vynálezu. Takto získané bunky sa môžu potom použiť ako zdroj nervových buniek na transplantáciu späť do rovnakého pacienta, z ktorého pochádzajú (t.j. autológna transplantácia), čo eliminuje všetky klasické problémy spojené s alogénnou transplantáciou, ako je napríklad rejekcia (odvrhnutie) transplantátu. Teda spôsob podlá predkladaného vynálezu sa týka podávania množstva FGF, ktoré je účinné na stimuláciu proliferácie a diferenciácie nervových kmeňových buniek a transplantácie kmeňových buniek naspäť.

Predkladaný vynález sa taktiež týka protilátky, ktorá špeci ficky rozpoznáva FGF podľa predkladaného vynálezu. Protilátka špecifická pre FGF znamená, že protilátka rozpoznáva definovanú sekvenciu aminokyselín obsiahnutú v FGF alebo zahŕňajúcu FGF, napr. sekvencie na obrázkoch 1 a

2. Teda špecifická protilátka sa všeobecne viaže s vyššou afinitou na aminokvselinovú sekvenciu,

t.j. epitop, ktorý sa nachádza v sekvencii na obrázkoch

2, v porovnaní s iným epitopom (inými epitopmi), napr. ako

S 3.

deteguje a/alebo meria imunoprenosovým testom („imunoblot) alebo iným známym imunotestom. Teda protilátka, ktorá je špecifická pre epitop humánneho FGF-21, sa môže použiť na detekciu prítomnosti epitopu vo vzorke, napr. vo vzorke tkaniva, ktoré obsahuje humánny génový produkt FGF-21, t. j. na rozlíšenie vzorky, v ktorej epitop je, od vzorky, kde nie je prítomný. Takéto protilátky sa používajú napr. spôsobom, ktorý je opísaný v katalógu firmy Šanta Cruz Biotechnology, Inc., a zodpovedajúcim spôsobom sú formulované.

Protilátky, napr. polyklonálne, monoklonálne, rekombinantné, chimérické alebo humanizované, sa môžu pripraviť akýmkoľvek vhodným spôsobom, ktorý je odborníkom známy. Pozri taktiež skríning rekombinantnej imunoglobulínovej knižnice (napr. Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:

3833-3837, 1989, Huse al., in vitro stimuláciu occulácie lymfocytov,

Winter a Milstein,

Náture,

349: 293-299,

1991.

Napríklad na produkciu monoklonálnych protilátok sa môžu polypeptidy podľa obrázkov 1 a 2 podávať alebo králikom subkutánne a/alebo intraperitoneálne, bez adjuvansu alebo spolu s adjuvansom, v množstve účinnom na volanie imunitnej reakcie.

Protilátkami môžu byť j ednoreťazcové protilátky alebo FAB fragmenty. Protilátky môžu byť IgM, IgG, podtypy, IgG2a, IgGl a pod. Protilátky a imunitné reakcie môžu byť taktiež vyvolané podávaním holej DNA, pozri napr. US patenty č. 5 703 055, 5 589 466, 5 580 859.

FGF alebo jeho fragmenty nemusia mať biologickú aktivitu na použitie na indukciu protilátok, avšak musia mať imunogénnu aktivitu, buď samotné alebo v kombinácii s nosičom. Peptidy na použitie na indukciu FGF-špecifických protilátok majú aminokyselinovú sekvenciu, ktorú tvorí aspoň päť aminokyselín, výhodne aspoň 10 aminokyselín.

Krátke úseky FGF aminokyselín, napr. piatich aminokyselín, môžu byť fúzované s ďalším proteínom, ako je napr. hemocyanín morskej prílipky alebo iný použiteľný nosič, a chimérická molekula je potom použitá na produkciu protilátky. Úseky FGF, ktoré sú použiteľné na produkciu protilátky, sa môžu vybrať empiricky alebo napr.

aminokyselinová sekvencia z GENE, odvodená z cDNA, sa môže analyzovať na určenie úsekov s vysokou imunogenicitou. Analýza, ktorá umožňuje výber vhodných epitopov, je opísaná napr. v Ausubel FM et al (1989, Current Protocols in Molecular Biolcgy, diel 2. John Wiley & Sons).

Užitočné sekvencie na generovanie protilátok zahŕňajú priradené sekvencie, ktoré sú ukázané na obrázkoch 1 a 2. Protilátky k takýmto sekvenciám môžu byť použiteľné na rozlíšenie medzi rôznymi transkriptami FGF (pozri skôr) .

Konkrétne FGF protilátky sú použiteľné na diagnózu prepatologických stavov a chronických alebo akútnych ochorení, ktoré sú charakterizované rozdielmi v množstve alebo distribúcii FGF. Diagnostické testy na FGF zahŕňajú metódy využívajúce protilátku a značku na detekciu FGF u človeka (alebo myši, ak sa použije myšia protilátka a pod.) v telových tekutinácn, tkanivách alebo extraktoch tkanív.

Polypeptidy a protilátky podľa predkladaného vynálezu sa môžu použiť buď bez modifikácie alebo s modifikáciou. Gastc sú polypeptidy a protilátky značené tým, že je k nim pripojená, buď kovalentne alebo nekovalentne, látka, ktorá poskytuje oetegovatelný signál. Široký rad značiek a kondenzačných techník je odborníkom známy a publikovali sa vo vedeckej a patentovej literatúre. Vhodné značky zahŕňajú rádionuklidy, enzýmy, substráty, kofaktory, inhibítory, fluorescenčné činidlá, chemiluminiscenčné činidlá, magnetické častice a pod. Použitie takých značiek opisujú napr. US patenty č. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 a 4 366 241.

Protilátky a iné ligandy, ktoré sa viažu na FGF, sa môžu použiť rôznymi spôsobmi, vrátane terapie a diagnostiky, a tiež na komerčný výskum, napr. na kvantifikáciu hladiny polypeptidu

FGF vo zvieratách, tkanivách, bunkách a pod., na vyšetrenie bunkovej lokalizácie a/alebo distribúcie FGF, na purifikáciu FGF alebo polypeptidu, ktorý obsahuje časť FGF, moduláciu funkcie, v testoch typu Western blot, ELISA, imunoprecipitácia, RIA a pod. Predkladaný vynález sa týka takýchto testov, kompozícií a súprav na ich uskutočňovanie a pod. . S využitím týchto a ešte ďalších metód sa môžu protilátky podľa predkladaného vynálezu použiť na detekciu polypeptidu FGF alebo jeho fragmentov v rôznych vzorkách, vrátane tkanív, buniek, telesných tekutín, ako je napr.' krv, moč, cerebrospinálny mok.

Navyše ligandy, ktoré sa viažu na FGF polypeptid podľa predkladaného vynálezu alebo jeho derivát, sa môžu tiež oripraviť napr. s použitím syntetickej peptidovej knižnice alebo tzv. aptamérov (napr. Pitrung et al., US patent č. 5 143 854, Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102: 259-274,1987, Scott et al., Science, 249: 386, 1990, Blackwell et al., Science, 250: 1104,1990, Tuerk et al., 1990, Science, 249: 505.).

Predkladaný vynález sa taktiež týka FGF polypeptidu, pripraveného požadovaným spôsobom napr. ako bolo opísané v US patente č. 5 434 050. Značený polypeptid sa môže použiť napr. vo väzbových testoch, ako napríklad na rozpoznanie látok, k~oré sa viažu na FGF, na sledovanie pohybu FGF v bunke, v in vizro, in vivo alebo in situ systéme a pod.

Nukleová kyselina, polypeptid, protilátka, ligand a pod. podlá predkladaného vynálezu môžu byť izolované. Termín izolovaný znamená, že látka je vo forme, v ktorej sa nevyskytuje vo svojom pôvodnom prostredí alebo v prírode, napr. je viac koncentrovaná, viac purifikovaná, oddelená od zložiek a pod. . Izolovaná nukleová kyselina zahŕňa napr. nukleovú kyselinu, ktorá má sekvenciu FGF oddelenú od chromozomálnej DNA, ktorá sa vyskytuje v žijúcom zvierati, napr. ako kompletný gén, transkript RNA alebo cDNA. Táto nukleová kyselina môže byť časťou vektora alebo vložená do chromozómu (špecifickým génovým cielením alebo náhodnou integráciou do polohy inej, ako je jej normálna poloha) a pritom sa stále jedná o izolovanú nukleovú kyselinu, ktorá nie je vo forme, v ktorej sa vyskytuje vo svojom prírodnom prostredí. Nukleová kyselina alebo polypeptid podľa predkladaného vynálezu môžu byť taktiež v podstate purifikované. V podstate purifikovaný znamená, že nukleová kyselina alebo polypeptid je oddelený od a je v podstate zbavený všetkých ostatných nukleových kyselín alebo polypeptidov, tzn. že nukleová kyselina alebo polypeptid je primárny a aktívny komponent daného purifikovaného preparátu.

Predkladaný vynález sa taktiež týka transgénneho zvieraťa napr. cicavca iného ako ľudského pôvodu, ako je napríklad myš, ktoré obsahuje FGF. Transgénne zvieratá sa môžu pripraviť podľa známych metód, vrátane napr. pronukleárnej injekcie rekombinantných génov do pronukleov jednobunkových embryí, inkorporáciou arteficiálneho kvasinkového chromozómu do embryonálnych kmeňových buniek, metódami cielenia génov, metodológiou embryonálnej kmeňovej bunky. Pozri napr. US patent č. 4 736 866, 4 873 191, 4 873 316, 5 082 779, 5 304 489, 5 174 986, 5 175 384, 5 175 385, 5 221 778, Gordon et al., Prcc. Natl. Acad. Sci., 77: 7380-7384, 1980, Palmiter et al., Celí, 41: 343345, 1985, Palmiter et al. , Ann. Rev. Genet., 20: 465-4 99, 1986, Askew et al., Mol. Celí. Bio., 13: 4115-4124, 1993, Games et al. Náture, 373: 523-527, 1995, Valancius a Smithies, Mcl. Celí. Bio., 11: 1402-1408, 1991, Stacey et al., Mol. Celí. Bto., 14: 1009-1016, 1994, Hasty et al., Náture, 350: 243-246, 1995, Rubinstein et al·., Nucl. Acid Res., 21: 2613-2617, 1993. Nukleová kyselina podľa predkladaného vynálezu sa môže zaviesť do ktoréhokoľvek cicavca iného ako ľudského pôvodu, vrátane myši (Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), prasaťa (Hammer et al·., Náture, 315: 343-345, 1985), ovce (Hammer et al., Náture, 315: 343-345, 1985), dobytka, laboratórneho potkana alebo primáta. (Pozri taktiež napr. Church, 1987, Trends in Biotech. 5: 13-19, Clark et al., Trends in Biotech. 5: 20-24, 1987) a DePamphilis et al., BioTechniques, 6: 662-680, 1988). Okrem toho je napr. komerčne dostupná zákazková produkcia transgénnych laboratórnych potkanov a myši. Tieto transgénne zvieratá sa môžu použiť ako zvieracie modely na testovanie funkcií génov, ako potrava pre hady, ako genetický marker na detekciu pôvodného kmeňa (c. j. kde bol vložený FGF-21, -23 alebo ich fragment) a pod. Také transgénne zvieratá môžu ďalej obsahovať ďalšie transgény. Transgénne zvieratá sa’ môžu pripraviť a použiť podľa ktoréhokc vhodného spôsobu.

Čo sa týka ďalších aspektov nukleových kyselín, odkazuje sa na štandardné učebnice molekulárnej biológie. (Pozri napr. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986, Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985, Sambrook et al·., Molecular Cloning, CSH Press, 1989, Howe, Gene Cloning and Manlpulation, Cambridge University Press, 1995) .

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr.

ukazuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu

FGF-20 (sekvencia SEQ ID NO: 1 a 2).

Obr.

ukazuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu

FGF-23 (sekvencia SEQ ID NO: 3 a 4).

Obr.	3	ukazuj e	aminokyselinovú	sekvenciu FGF-20	proteínu
porovnanú	so	známymi	členmi rodiny	FGF. xFGF-20 je	z Xenopus
laevis.
Obr.	4	ukazuj e	proliferáciu	oligodendrocytov.	Obr.	4A
ukazuj e	proliferáciu	oligodendrocyt	ov. Obr. 4B ukazuje,	že

aktivita je zrušená povarením proteínu.

Obr. 5 ukazuje účinok FGF-20 na N20.1 proliferáciu oligodendrocytov.

Obr. 6 ukazuje účinok FGF na proliferáciu primárnych oligodendrocytov laboratórneho potkana (PRO). Obr. 6A ukazuje bunky ošetrené s FGF-2. Obr. 6B ukazuje bunky ošetrené s FGF-20.

Obr. 7 ukazuje účinok FGF na prežívanie/proliferáciu bunkovej línie neurónového pôvodu. Obr. 7A ukazuje účinok FGF-20. Obr. 7B ukazuje účinok FGF-2, FGF-9 a FGF-20.

Obr. 8 ukazuje neuricový výrastok. Kultivované bunky PC12 sú ošetrované v priebehu 6 dní s rekombinantným FGF-20 a heparínom (ľavý panel) alebo samotným heparínom (pravý panel). Bunky sú fixovány a obarveny na becalll-tubulin, jádra sú zobrazená se 7AAD. Neuritový výrústek nebyl pozorován v bunkách ošetrených samotným heparinem.

Obr. 9 ukazuje, že FGF-20 je účinným faktorom pri prežívaní kortikálnych neurónov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Proliferácia oligodendrocytov a prežívanie

Oligodendrocvty použaté na meranie účinkov rastových faktorov (GF) na bunkovú proliferáciu sú buď zavedené bunkové línie, ako je napr. N20 alebo primárne oligodendrocyty hlodavcov. Primárne oligodendrocyty a oligodendrocytové progenitory hlodavcov (laboratórnych potkanov) sú izolované a purifikované technikou diferencovanej adhézie (Mitrovic, 1994) a centrifugáciou na gradiente Percolu (Mattera, et al., Neurochem. Int. 1984, 6(1)

41-50, Kim, et al., J Neurol Sci 1983 Dec: 62 (1 až 3) : 295301). Testy týkajúce sa proliferácie oligodendrocytov sa uskutočňujú nanesením 2,5xl0⁴ buniek/ml na 96 jamkové doštičky.

Bunky sú stimulované rastovými faktormi počas 3,5 a 7 dní.

Pozitívnymi kontrolami sú ďalší členovia FGF rodiny, ako je napr. FGF-2 alebo FGF-9. Bunková proliferácia sa meria MTT a 6 ukazujú, že FGF-20 stimuluje proliferáciu

N20.1 oligodendrocytovej bunkovej línie spôsočasu a dávky. Bunky N20.1 sú testom a testom inkorporácie ³H-tymidínu.

Obrázky 4, oligodendrocytov bom závislým od ošetrené vzorkami

FGF-20, ktoré sú čiastočne purifikované chromatografiou na agaróze, . na ktorú je naviazaný heparín.

Proliferácia je určená

MTT farbením.

FGF-20 indukuj e oligodendrocytov (obrázok je zrušená povarením

Už uvedené pozorovania sa potvrdili preparátmi čiastočne purifikovaného materiálu z heparínových a S kolón (obrázok 5). Bunky N20.1 sa ošetrili s FGF-20 z heparínových alebo S kolón. Bunky sa inkubovali s FGF-20 počas 5 dní a zvýšenie proliferácie oproti neošetreným kontrolám sa určilo MTT farbením. Ako pozitívna kontrola sa použil FGF-9 a vhodné zodpovedajúce pufre (H a S) sa použili ako negatívna kontrola. Aktivita čiastočne purifikovanej látky bola porovnateľná s FGF-9.

Okrem toho FGF-20 indukoval proliferáciu primárnych oligodendrocytov laboratórneho potkana (obr 6B). Oligodendrocyty sa ošetrili s FGF-2 (obrázok 6A) a FGF-20 (obrázok 6B) . Bunky sa inkubovali s GF počas 3 dní a zvýšenie proliferácie oproti neošetrenej kontrole sa určilo MTT farbením. Aktivita čiastočne purifikovanej látky bola porovnateľná s FGF-2. FGF-20 je silný induktor proliferácie oligodendrocytov a jeho aktivita je porovnateľná s inými členmi FGF rodiny, ako je napríklad FGF-2 a FGF-9.

Príklad 2

Indukcia prežívania neurónov

Testy prežívania neurónov sa uskutočňovali nanesením 2,5xl0⁴ buniek/ml na 96 jamkové doštičky v médiu s nízkym obsahom séra.

V týchto podmienkach neuróny prekonávajú apoptózu vďaka odstráneniu rastového faktora. Bunky boli stimulované rastovými faktormi rôzne časové obdobia v rozmedzí od 3 dní do 12 dní. Pozitívnymi kontrolami sú ďalší členovia FGF rodiny, ako je napríklad FGF-2 alebo FGF-9. Prežívanie neurónov sa meralo MTT.

Obrázky. 7 a 9 ukazujú, že FGF-20 je silný neurotrofný faktor, ktorý môže stimulovať prežívanie buniek neurónového pôvodu.

Bunky PC12 sa naniesli na 96 jamkové doštičky v prítomnosti s nízkym obsahom séra (1% Nu sérum). Rôzne rastové faktory, vrátane FGF-20, sa pridali v koncentráciách v rozmedzí od 0,0025 do 2500 ng/ml. O 7 a 10 dní potom sa meralo relatívne prežívanie MTT testom a porovnalo s neošetrenou kontrolou. Dáta pre FGF-20 boli ukázané na obrázku 7A a pre FGF-2, FGF-9 a FGF-20 na obrázku 7B.

Príklad 3

Indukcia neuritových výrastkov

FGF-20 prejavuje aktivitu na výrastky buniek PC12. Táto aktivita nie je závislá od predbežného ošetrenia NGF (pozri tabuľky 1 a 2 a obrázok 9).

Správanie sa čiastočne purifikovaného FGF-21 v tomto teste je podobné správaniu sa, ktoré bolo pozorované pri FGF-9, ktorému je veľmi podobné. Okrem toho sa porovnávala aktivita rôznych členov FGF rodiny na indukciu neuritového vyrastenia v bunkách PC12 (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-16, FGF-16, FGF17, FGF-18 - (pozri tabuľku 2).

Najsilnejší FGF pri indukcii neuritového vyrastenia v tomto systéme boli FGF-2 a FGF-9 a FGF-20/21. Zistilo sa, že dva FGF:

FGF-7 a FGF-10, sú v tomto teste inaktívne bez ohľadu na prítomnosť alebo neprítomnosť heparínu.

Primárne fetálne kortikálne neuróny laboratórneho potkana sa izolovali z mozgov embryí laboratórneho potkana (E16). Mozgová kôra sa rozpitvala pod mikroskopom a premyla 6-krát Hanksovým roztokom a mechanicky sa oddelila bez enzymatického ošetrenia. Neuróny sa kultivovali v médiu, ktoré sa skladalo z DMEM doplneného 10% konským sérom, 10% FCS, 2mM L-glutamínom, HEPES pufrom. Po 24 hodinách sa pridala zmes inhibítorov (inhibitorový koktail), ktorú tvorí ΙΟμΜ FdU a ΙμΜ cytozínarabinozid, počas 3 dní, aby sa inhibovala proliferácia všetkých ďalších bunkových typov okrem neurónov. Po 8 dňoch v kultúre sa získali neuróny a naniesli na 96 jamkové doštičky v prítomnosti média s nízkym obsahom séra (2% Nu sérum). Rôzne rastové faktory, vrátane FGF-20, sa pridali v koncentráciách v rozmedzí od 0,0025 do 2500 ng/ml. Po 5 dňoch sa relatívne prežívanie meralo MTT restom a porovnalo s neošetrenou kontrolou.

Tabulka 1

FGF-20 je silný induktor neuritových extenzií v bunkách t-012

Bunky PC12 sa naniesli na misky a ošetrili ako v experimente uvedenom na obrázku 7. FGF-9 a FGF-20 sa pridali v koncentráciách v rozmedzí od 0,0025 do 2500 ng/ml. Sedem a dvanásť dní po ošetrení sa neuritová extenzia určovala farbením buniek podlá Wrighta a následným mikroskopickým vyšetrením. Percento výrastkov reprezentuje odhadovaný počet buniek s výbežkami.

Zhrnutie nálezov, ktoré sa týkajú indukcie neuritového vyrastania vďaka FGF-9 a FGF-20/21 ošetrenia, je ukázané ďalej. Najvyššia koncentrácia čiastočne purifikovaného materiálu je pre bunky toxická a ovplyvňuje tak dáta prežívania (pozri obrázok 7B), ako neuritové výrastky (pozri ďalej).

Neuritová extenzia v bunkách PC12

GF	koncentrácia ng/ml	% vyrastania
7 dní	12 dní
FGF-9	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	5	10-20
	2,5	5-10	20-30
	25	60	60
	250	90	100
	2500	90-100	100
FGF-21	0	0	0
	0, 025	<5	5
	0,25	10	10
	2,5	20-30	30
	25	50	60
	250	90	80
	2500	0	0

Tabuľka 3

Neuritový výrastok - porovnanie rôznych členov rodiny FGF

Kultivované bunky PC12 sa ošetrili s FGF a neuritový výrastok sa .hodnotil vizuálne. FGF-20 je jeden z najsilnejších testovaných neurotrofných GF z členov rodiny FGF.

Pridaný FGF: Reakcia

FGF-1 (kyselý FGF)	++
FGF-2 (bázický FGF)	+++
FGF-4	+
FGF-6	+
FGF-7	-
FGF-8	++
FGF-9	+++
FGF-10	-
FGF-16	+
FGF-17	+ +
FGF-18	++
FGF-21	+ + +

Zoznam sekvencií <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Neznámy organizmus <220>

<221> CDS <222> (1)..(633) <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-21 nukleotidová sekvencia

<400> 1

ggc Gly

ttt Phe 10

ctg Leu

ggc ggc

ctg Leu

gag Glu 15

ggc Gly

48

atg Met 1

get Ala

ccc Pro

tta Leu

gcc Ala 5

gaa Glu

gtc Val

ggg Gly

Gly

Gly

ttg

ggc

cag

cag

gtg

ggt

tcg

cat

Ctc

ctg

ttg

cct

.cct

gcc

ggg

gag

96

Leu

Gly

Gin

Gin

Val

Gly

Ser

His

Phe

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Gly

Glu

20

25

30

cgg

ccg

ccg

ctg

ctg

ggc

gag

cgc

agg

age

gcg

gcg

gag

cgg

age

gcg

144

Arg

Pro

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Arg

Arg

Ser

Ala

Ala

Glu

Arg

Ser

Ala

35

40

45

cgc

ggc

ggg

ccg

ggg

gcc

gcg

cag

ctg

gcg

cac

ctg

cac

ggc

atc

ctg

192

Arg

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Ala

C-ln

Leu

Ala

His

Leu

His

Gly

íle

Leu

50

55

60

cgc

cgc

cgg

cag

ctc

tat

tgc

cgc

acc

ggc

ttc

cac

ctg

cag

atc

ctg

240

Arg

Arg

Arg

Gin

Leu

Tyr

Cys

Arg

Thr

Gly

Phe

His

Leu

Gin

íle

Leu

65

70

75

80

ccc

gac

ggc

age

gtg

cag

ggc

acc

cgg

cag

gac

cac

age

ctc

ttc

ggt

288

Pro

Asp

Gly

Ser

Val

Gin

C-ly

Thr

Arg

C-ln

Asp

His

Ser

Leu

Phe

Gly

atc íle

ttg Leu

gaa ttc

atc íle

agt Ser

gtg gca

gtg gga

ctg gtc

agt Ser

att íle 110

aga Arg

ggt Gly

336

Glu

Phe 100

Val

Ala

Val 105

Gly

Leu

val

gtg

gac

agt

ggc

ctc

tat

ctt

gga

atg

aat

gac

aaa

gga

gaa

ctc

tat

384

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Tyr

Leu

Gly

Met

Asn

Asp

Lys

Gly

Glu

Leu

Tyr

115

120

125

gga

tca

gag

aaa

ctt

act

tcc

gaa

tgc

atc

ttt

agg

gag

cag

ttt

gaa

432

Gly

Ser

Glu

Lys

Leu

Thr

Ser

Glu

Cys

íle

Phe

Arg

Glu

Gin

Phe

Glu

130

135

140

gag

aac

tgg

tat

aac

acc

tat

tca

tct

aac

ata

tat

aaa

cat

gga

gac

480

Glu

Asn

Trp

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ser

Ser

Asn

íle

Tyr

Lys

His

Gly

Asp

145

150

155

160

act

ggc

cgc

agg

tat

ttt

gtg

gca

ctt

aac

aaa

gac

gga

act

cca

aga

528

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Arg

165

170

175

gat

ggc

gcc

agg

tcc

aag

agg

cat

cag

aaa

ttt

aca

cat

ttc

t ta

cct

576

Asp

Gly

Ala

Arg

Ser

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Phe

Thr

His

Phe

Leu

Pro

.180

185

190

aga

cca

gtg

gat

cca

gaa

aga

gtt

cca

gaa

ttg

tac

aag

gac

cta

ctg

624

Arg

Pro

Val

Asp

Pro

Glu

Arg

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

Lys

Asp

Leu

Leu

195

200

205

atg tac act tga

Met Tyr Thr

210

635 <210> 2 <211> 211 <212> PRT <213> Neznámy organizmus <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-21 sekvencia aminokyselín <400> 2

Met

Ala

Pro

Leu

Ala

Glu

Val

Gly

Gly

Phe

Leu

Gly

Gly

Leu

Glu

Gly

1

5

10

15

Leu

Gly

Gin

Gin

Val

Gly

Ser

His

Phe

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Gly

Glu

20

25

30

Arg

Pro

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Arg

Arg

Ser

Ala

Ala

Glu

Arg

Ser

Ala

35

40

45

Arg

Gly

Gly

Pro

Gly

Ala

Ala

Gin

Leu

Ala

His

Leu

His

Gly

íle

Leu

50

55

60

Arg 65

Arg

Arg Gin Leu

Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His

Leu Gin

íle

Leu 80

70

75

Pro

Asp

Gly

Ser

Val

Gin

Gly

Thr

Arg

Gin.

Asp

His

Ser

Leu

Phe

Gly

85

90

95

íle

Leu

Glu

Phe

íle

Ser

Val

Ala

Val

Gly

Leu

Val

Ser

íle

Arg

Gly

100

105

110

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Tyr

Leu

Gly

Met

Asn

Asp

Lys

Gly

Glu

Leu

Tyr

115

120

125

Gly

Šer

Glu

Lys

Leu

Thr

Ser

Glu

Cys

íle

Phe

Arg

Glu

Gin

Phe

Glu

130

135

140

Glu

Asn

Trp

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ser

Ser

Asn

íle

Tyr

Lys

His

Gly

Asp

145

150

155

160

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

Val

Ala

Leu

Asn

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Arg

165

170

175

Asp

Gly

Ala

Arg

Ser

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Phe

Thr

His

Phe

Leu

Pro

180

' 185

190

Arg

Pro

Val

Asp

Pro

Glu

Arg

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

Lys

Asp

Leu

Leu

195

200

205

Met Tyr Thr

210 <210> 3 <211> 513 <212> DNA <213> Neznámy organizmus <220>

<221> CDS <222> (1)..(510) <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-23 nukleotidová sekvencia <400> 3

atg cgc cgc cgc ctg tgg ctg ggc ctg gcc tgg ctg

ctg ctg

gcg Ala 1S

cgg Arg

Met 1

Arg Arg Arg

Leu 5

Trp Leu

Gly

Leu Ala Trp 10

Leu

Leu

Leu

gcg

ccg

gac

gcc

gcg

gga

acc

ccg

agc

gcg

tcg

cgg

gga

ccg

cgc

agc

Ala

Pro

Asp

Ala

Ala

Gly

Thr

Pro

Ser

Ala

Ser

Arg

Gly

Pro

Arg

Ser

20

25

30

tac

ccg

cac

ctg

gag

ggc

gac

gtg

cgc

tgg

cgg

cgc

ctc

ttc

tcc

tcc

Tyr

Pro

His

Leu

Glu

Gly

Asp

Val

Arg

Trp

Arg

Arg

Leu

Phe

Ser

Ser

35

40

45

act cac

ttc Phe

ttc ctg cgc Phe Leu Arg

gtg Val 55

gat ccc ggc ggc cgc

gtg cag ggc

acc Thr

192

Thr

HiS 50

Asp Pro Gly

Gly

Arg 60

Val

Gin

Gly

cgc

tgg

cgc

cac

ggc

cag

gac

agc

atc

ctg

gag

atc

cgc

tet

gta

cac

240

Arg

Trp

Arg

His

Gly

Gin

Asp

Ser

íle

Leu

Glu

íle

Arg

Ser

Val

His

65

70

75

80

gtg

ggc

gtc

gtg

gtc

atc

aaa

gca

gtg

tcc

tca

ggc

ttc

tac

gtg

gcc

288

Val

Gly

Val

Val

Val

íle

Lys

Ala

Val’

Ser

Ser

Gly

Phe

Tyr

Val

Ala

as

90

95

atg

aac

cgc

cgg

ggc

cgc

ctc

tac

ggg

tcg

ega

ctc

tac

acc

gtg

gac

336

Met

Asn

Arg

Arg

Gly

Arg

Leu

Tyr

Gly

Ser

Arg

Leu

Tyr

Thr

Val

Asp

100

105

110

tgc

agg

ttc

cgg

gag

cgc

atc

gaa

gag

aac

ggc

cac

aac

acc

tac

gcc

384

Cys

Arg

Phe

Arg

Glu

Arg

íle

Glu

Glu

Asn

Gly

His

Asn

Thr

Ťyr

Ala

115

120

125

tca

cag

cgc

tgg

cgc

cgc

cgc

ggc

cag

ccc

atg

ttc

ctg

gcg

ctg

gac

432

Ser

Gin.

Arg

Trp

Arg

Arg

Arg

Gly

Gin

Pro

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Asp

130

135

140

agg

agg

ggg

ggg

ccc

cgg

cca

ggc

ggc

cgg

acg

cgg

cgg

tac

cac

ctg

480

Arg

Arg

Gly

Gly

Pro

Arg

Pro

Gly Gly

Arg

Thr

Arg

Arg

Tyr

His

Leu

145

150

155

160

tcc

gcc

cac

ttc

ctg

ccc

gtc

ctg

gtc

tcc

tga

513

Ser

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Val

Leu

val

Ser

165 170 <210> 4 <211> 170 <212> PRT <213> Neznámy organizmus <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-23 sekvencia aminokyselín <40Ó> 4

Met

Arg

Arg

Arg

Leu

Trp

Leu

Gly

Leu

Ala

Trp

Leu

Leu

Leu

Ala

Arg

1

5

10

15

Ala

Pro

Asp

Ala

Äla

Gly

Thr

Pro

Ser

Ala

Ser

Arg

Gly

Pro

Arg

Ser

20

25

30

Tyr

Pro

His

Leu

Glu

Gly

Asp

Val

Arg

Trp

Arg

Arg

Leu

Phe

Ser

Ser

35

40

45

Thr

His

Phe

Phe

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Gly

Gly

Arg

Val

Gin

Gly

Thr

50

55

60

Arg Trp Arg His Gly Gin. Asp Ser íle Leu Glu íle Arg Ser Val His

65

70

75

80

Val

Gly

Val

Val

Val

íle

Lys

Ala

Val

Ser

Ser

Gly

Phe

Tyr

Val

Ala

85

90

95

Met

Asn

Arg

Arg

Gly

Arg

Leu

Tyr

Gly

Ser

Arg

Leu

Tyr

Thr

Val

Asp

100

105

110

Cys

Arg

Phe

Arg

Glu

Arg

íle

Glu

Glu

Asn

Gly

His

Asn

Thr

Tyr

Ala

115

120

12S

Ser

Gin

Arg

Trp

Arg

Arg

Arg

Gly

Gin

Pro

Met

Phe

Leu

Ala

Leu

Asp

130

13 5

140

Arg

Arg

Gly

Gly

Pro

Arg

Pro

Gly

Gly

Arg

Thr

Arg

Arg

Tyr

His

Leu

145

150

155

160

Ser

Ala

His

Phe

Leu

Pro

Val

Leu

Val

Ser

165 170 <210> 5 <211> 206 <212> PRT <213> Neznámy organizmus <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-9 sekvencia aminokyse <400> 5 i in

Met Ala Pro Leu Gly Glu Val

Gly

Asn Tyr 10

Phe

Gly Val

Gin

Asp 15

Ala

1

5

Val

Pro

Phe

Gly

Asn

Val

Pro

Val

Leu

Pro

Val

Asp

Ser

Pro

Val

Leu

20

25

30

Leu

Ser

Asp

His

Leu

Gly

Gin

Ser

Glu

Ala

Gly Gly

Leu

Pro

Arg

Gly

35

40

45

Pro

Ala

Val

Thr

Asp

Leu

Asp

His

Leu

Lys

Gly

íle

Leu

Arg

Arg

Arg

50

55

60

Gin

Leu

Tyr

Cys

Arg

Thr

Gly

Phe

His

Leu

Glu

íle

Phe

Pro

Asn

Gly

65

70

75

80

Thr

íle

Gin

Gly

Thr

Arg

Lys

Asp

His

Ser

Arg

Phe

Gly

íle

Leu

Glu

85

90

95

Phe

íle

Ser

Tie

Ala

Val

Gly

Leu

Val

Ser

íle

Arg

Gly

Val

Asp

Ser

100

10S

110

Gly

Leu

Tyr

Leu

Gly

Met

Asn

Glu

Lys

Gly

Glu

Leu

Tyr

Gly

Ser

Glu

115 120 125

Lys Leu Thr Gin Glu Cys Val Phe Arg Glu Gin Phe Glu Glu Asn Trp

130 13S 140

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ser

Ser

Asn

Leu

Tyr

Lys

His

Val

Asp

Thr

Gly

Arg

145

150

155

160

Arg

Tyr

Tyr

Val

Ala

Leu

Asn

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Arg

Glu

Gly

Thr

165

170

175

Arg

Thr

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Phe

Thr

His

Phe

Leu

Pro

Arg

Pro

Val

130

185.

190

Asp

Pro

Asp

Lys

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

Lys

Asp

íle

Leu

Ser

Gin

Ser

195

200

205

<210> 6 <211> 207 <212> PRT <213> Neznámy organizmus <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-16 sekvencia aminokyselín <400> 6

Met 1

Ala Glu

Val Gly 5

Gly Val

Phe

Ala Ser 10

Leu

Asp

Trp Asp

Leu His 15

Gly

Phe

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Asn

Val

Pro

Leu

Ala

Asp

Ser

Pro

Gly

20

25

30

Phe

Leu

Asn

Glu

Arg

Leu

Gly

Gin

íle

Glu

Gly

Lys

Leu

Gin

Arg

Gly

35

40

45

Ser

Pro

Thr

Asp

Phe

Ala

His

Leu

Lys

Gly

íle

Leu

Arg

Arg

Arg

Gin

50

55

60

Leu

Tyr

Cys

Arg

Thr

Gly

Phe

His

Leu

Glu

íle

Phe

Pro

Asn

Gly

Thr

65

70

75

80

Val

His

Gly

Thr

Arg

His

Asp

His

Ser

Arg

Phe

Gly

íle

Leu

Glu

Phe

85

90

95

íle

Ser

Leu

Ala

Val

Gly

Leu

íle

Ser

íle

Arg

Gly

Val

Asp

Ser

Gly

100

105

110

Leu

Tyr

Leu

Gly

Met

Asn

Glu

Arg

Gly

Glu

Leu

Tyr

Gly

Ser

Lys

Lys

115

120

125

Leu

Thr

Arg

Glu

Cys

Val

Phe

Arg

Glu

Gin

Phe

Glu

Glu

Asn

Trp

Tyr

130

135

140

Asn

Thr

Tyr

Ala

Ser

Thr

Leu

Tyr

Lys

His

Ser

Asp

Ser

Glu

Arg

Gin

145

150

155

160

Tyr

Tyr Val

Ala

Leu

Asn

Lys

Asp

Gly

Ser

Pro

Arg

Glu

Gly

Tyr

Arg

165

170

175

Thr

Lys

Ara

His 180

Gin

Lys

Phe

Thr

His 185

Phe

Leu

Pro

Arg

Pro Val Asp 190

Pro

Ser

Lys 195

Leu

Pro

Ser

Met

Ser 200

Ara

Asp

Leu

Phe

His 205

Tyr Arg

<210> 7 <211> 117 <2·12> PRT <213> Neznámy organizmus <220>

<223> Opis neznámeho organizmu: FGF-22.

<220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> akákoľvek aminokyselina <400> 7

Xaa 1

Gly Met Leu

Ala 5

Ser

Tyr

Ser

Val

Ala 10

Val

Ala Met

Val

Thr 15

Thr

Arg

Gly

Val

Ala

Ser

Arg

Leu

Tyr

Leu

Asp

Ser

Asn

His

Lys

Gly

Asp

20

25

30

Leu

Tyr

Ala

Ser

Val

Arg

Leu

Ala

Gin

Glu

Ser

Val

Phe

Trp

Gly

Gin

35

40

45

Ser

Glu

Glu

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Ser

Asn

Leu

Tyr

Lys

His

50

55

60

Val

Asp

Thr

Arg

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Val

Pro

Leu

Asn.

Gin

Gly

Ala

Thr

65

70

75

80

Pro

Ser

Ala

Gly

Thr

Arg

Ser

Leu

Arg

Arg

Gin

Asn

Tyr

Thr

His

Val

85

90

95

Leu

Pro

Arg

Pro

Val

Asp

Pro

Asp

Lys

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

Lys

Asp

100

105

110

íle Leu Ser Gin Ser

115 <210> 8 <211> 208 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 8

Met Ala Pro Leu Ala Asp Val Gly Thr Phe Leu Gly Gly Tyr

Asp Ala 1S

1

5

10

Leu Gly Gin Val <

31y Ser :

His

Phe

Leu

Leu

Pro

Pro

Ala

Lys

Asp

Ser

20

25

30

Pro

Leu

Leu

Phe

Asn

Asp

Pro

Leu

Ala

Gin

Ser

Glu

Arg

Leu

Ser

Arg

35

40

45

Ser

Ala

Pro

Ser

Asp

Leu

Ser

His

Leu

Gin

Gly

íle

Leu

Arg

Arg

Arg

50

55

60

Gin

Leu

Tyr

Cys

Arg

Thr

Gly

Phe

His

Leu

Gin

íle

Leu

Pro

Asp

Gly

65

70

75

80

Asn

Val

Gin

Gly- Thr

Arg

Gin

Asp

His

Ser

Arg

Phe

Gly

íle

Leu

Glu

85

90

9S

Phe

íle

Ser

Val

Ala

íle

Gly

Leu

Val

Ser

íle

Arg

Gly

Val

Asp

Thr

100

105

110

Gly

Leu

Tyr

Leu

Gly

Met

Asn

Asp

Lys

Gly

Glu

Leu

Phe

Gly

Ser

Glu

115

120

125

Lys

Leu

Thr

Ser

Glu

Cys

íle

Phe

Arg

Glu

Gin

Phe

Glu'

Glu

Asn

Trp

130

135

140

Tyr

Asn

Thr

Tyr

Ser

Ser

Asn

Leu

Tyr

Lys

His

Gly

Asp

Ser

Gly

Arg

145

150

155

160

Arg

Tyr

Phe

Val

Ala

.Leu

Asn

Lys

Asp

Gly

Thr

Pro

Arg

Asp

Gly

Thr

165

170

175

Arg

Ala

Lys

Arg

His

Gin

Lys

Phe

Thr

His

Phe

Leu

Pro

Arg

Pro

Val

180

185

190

Asp

Pro

Glu

Lys

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

Lys

Asp

Leu

Met

Gly

Tyr

Ser

195

200

205

<210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: Ilustrativny peptid <400> 9 •Leu Tyr Gly Ser <210> 10 <211> 4 peptid

<212>	PRT
<213>	Umelá sekvence
<220>
<223>	Opis umelej sekvencie:	Ilustrativny
<400> 10
His Phe	Leu Pro
1
<210>	11
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Umelá sekvencia
<220>
<223>	Opis umelej sekvencie:	Ilustrativny
<400> 11
Val Gin	Gly Thr Arg
1	5
<210>	12
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Umelá sekvencia
<220>
<223>	Opis umelej sekvencie:	Ilustrativny
<400>	12
Arg íle Glu Glu Asn Gly His Asn Thr Tyr
1	5	10
<210>	13
<211>	10
<212>	PRT
<213>	Umelá sekvencia
<220>
<223>	Opis umelej sekvencie:	Ilustrativny
<400>	13

peptid peptid peptid

Gin Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr

10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 14

Ala Gly Thr Pro Ser Ala

5

<210>	15
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Umelá sekvencia

<220>

<223> Opis umelej sekvencie:

Ilustrativny peptid

Ilustrativny peptid <400> 15

Ala Ala Glu Arg Ser Ala

5

<210>	16
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Umelá sekvencia

<220>

<223> Opis umelej sekvencie: 6X His tag <400> 16

His His His His His His

5

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGE-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení poškodenia miechy, úrazu miechy, poškodenia nervového ckaniva, ktoré vzniká ischemickým záchvatom, infarktom, hemorágiou alebo aneuryzmou; Huntingtonovej choroby; roztrúsenej sklerózy mozgovomiechovej; myelopatie; myelitídy alebo syringomyélie.
2. 2. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení poškodenia miechy, úrazu miechy, poškodenia nervového tkaniva, ktoré vzniká ischemickým záchvatom, infarktom, hemorágiou alebo aneuryzmou; Huntingtonovej choroby; roztrúsenej sklerózy mozgovomiechovej; myelopatie; myelitídy alebo syringomyélie.
3. 3. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení adrenálnej leukodystrofie, progresívnej multifokálnej leukoencefalopatie, encefalomyelitídy, syndrómu Guillian-Barre, paraproteinémie alebo chronickej zápalovej demyelinizačnej polyneuropatie.
4. 4. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujucu polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení adrenálnej multifokálnej leukoence.f a lopát i e,

   Guillian-Barre, paraproteinémie demyelinizačnej polyneuropatie.

   leukodystrofie, progresívnej encefalomyelitídy, syndrómu alebo chronickej zápalovej
5. 5. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení podorujúcom prežívanie štepu.
6. 6. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie pri liečení podorujúcom prežívanie štepu.
7. 7. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie na výrobu lieku na liečenie poškodenia miechy, úrazu miechy, poškodenia nervového tkaniva, ktoré vzniká ischemickým záchvatom, infarktom, hemorágiou alebo aneuryzmou; Huntingtonovej choroby; roztrúsenej sklerózy mozgovomiechovej; myelopatie; myelitídy alebo syringomyélie.
8. 8. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu

   FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky kódujúcu polypeptid účinný fragment na použitie na výrobu lieku na liečenie poškodenia miechy, úrazu miechy, poškodenia záchvatom, nervového tkaniva, ktoré vzniká ischemickým infarktom, hemorágiou alebo aneuryzmou;

   Huntingtonovej choroby; roztrúsenej sklerózy mozgovomiechovej;

   myelopatie; myelitídy alebo syringomyélie.
9. 9. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie na výrobu lieku na liečenie adrenálnej leukodystrofie, progresívnej multifokálnej leukoencefalopatie, encefalomyelitídy, syndrómu Guillian-Barre, paraproteinémie alebo chronickej zápalovej demyelinizačnej polyneuropatie.
10. 10. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid

    FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie na výrobu lieku na liečenie adrenálnej leukodystrofie, progresívnej multifokálnej leukoencefalopatie, encefalomyelitídy, syndrómu Guillian-Barre, paraproteinémie alebo chronickej zápalovej demyelinizačnej polyneuropatie.
11. 11. Kompozícia obsahujúca polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie na výrobu lieku na podoru prežívanie štepu.
12. 12. Kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu kódujúcu polypeptid FGF-9 alebo FGF-20 alebo jeho biologicky účinný fragment na použitie na výrobu lieku na podoru prežívanie štepu.
13. 13. Kompozícia podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptidom je humánny polypeptid.
14. 14. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid obsahuje aminokyselinu 1 až aminokyselinu 208, ako je uvedené na obrázku 3.
15. 15. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid obsahuje aminokyselinu 1 až aminokyselinu 211, ako je uvedené na obrázku 1.
16. 16. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenčnú identitu s úsekom od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 208, ako je uvedené na obrázku 3.
17. 17. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenčnú identitu s úsekom od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 211, ako je uvedené na obrázku 1.
18. 18. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenčnú identitu s úsekom od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 208, ako je uvedené na obrázku 3, pričom má imunogénnu aktivitu FGF-9.
19. 19. Kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenčnú identitu s úsekom od aminokyseliny 1 po aminokyselinu 211, ako je uvedené na obrázku 1, pričom má imunogénnu aktivitu FGF-20.
20. 20. Kompozícia podľa nároku 2, 4, 6, 8, 10 alebo 12, kde nukleotidová sekvencia kóduje bez prerušenia FGF-9.
21. 21. Kompozícia podľa nároku 2, 4, 6, 8, 10 alebo 12, kde nukleotidová sekvencia kóduje bez prerušenia FGF-20.

    22. Kompozícia podľa nároku 2, 4, 6, 8, 10 alebo 12, kde nukleotidová sekvencia má 95% sekvenčnú identitu s nukleotidovou sekvenciou uvedenou na obrázku 3. 23. Kompozícia podľa nároku 2, 4, 6, 8, 10 alebo 12, kde nukleotidová sekvencia má 95% sekvenčnú identitu s nukl eotidovou sekvenciou uvedenou na obrázku 1.
22. 24. Kompozícia podľa nároku 1, 2, 7 alebo 8, kde liečením je