+

RU2819367C1 - Method for screening regeneration-promoting neuronal cells having neuronal regenerative activity - Google Patents

Method for screening regeneration-promoting neuronal cells having neuronal regenerative activity Download PDF

Info

Publication number
RU2819367C1
RU2819367C1 RU2023116247A RU2023116247A RU2819367C1 RU 2819367 C1 RU2819367 C1 RU 2819367C1 RU 2023116247 A RU2023116247 A RU 2023116247A RU 2023116247 A RU2023116247 A RU 2023116247A RU 2819367 C1 RU2819367 C1 RU 2819367C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
neuronal
mesenchymal stem
regeneration
promoting
Prior art date
Application number
RU2023116247A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Чэсён ЛИМ
Мин Юн Ким
Мин Ки СУН
Original Assignee
Селлатоз Терапьютикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Селлатоз Терапьютикс, Инк. filed Critical Селлатоз Терапьютикс, Инк.
Application granted granted Critical
Publication of RU2819367C1 publication Critical patent/RU2819367C1/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, in particular to a method of screening derived from mesenchymal stem cells promoting regeneration of neuronal cells (versions). Present invention also relates to a neuronal regeneration-promoting cell induced from a palatine tonsil-derived mesenchymal stem cell, as well as to a pharmaceutical composition containing it, and its use for treating a neurological disease. Said neuronal cell has the following characteristics: a) expression of markers CD121a, CD106 and CD112 is increased in comparison with palatine tonsil-derived mesenchymal stem cell; and b) expression of markers CD26 and CD141 is reduced in comparison with palatine tonsil-derived mesenchymal stem cell.
EFFECT: present invention provides a screening of regenerative neuronal cells exhibiting a neuronal regenerative effect from a number of different cells differentiated from mesenchymal stem cells, based on analysis of specific CD markers.
14 cl, 12 dwg, 2 tbl, 8 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее раскрытие имеет отношение к способу скрининга происходящих из стволовых клеток, способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенеративной активностью, и фармацевтической композиции для предотвращения или лечения неврологического заболевания, содержащей способствующие регенерации нейрональные клетки.The present disclosure relates to a method for screening stem cell-derived regeneration-promoting neuronal cells having neuronal regenerative activity, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease containing regeneration-promoting neuronal cells.

Уровень техникиState of the art

Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) используются для создания целого ряда средств для клеточной терапии, поскольку они дифференцируются в различные типы клеток в ответ на специфическую стимуляцию, не обладают туморогенностью индуцированных стволовых клеток и не имеют отношения к этическим проблемам, связанным с использованием эмбриональных стволовых клеток. Мезенхимальные стволовые клетки являются стволовыми клетками взрослых и в большинстве случаев изолируются из жировой ткани, пуповинной крови, костного мозга и т.п. взрослых людей. Способы изолирования этих тканей связаны с некоторыми проблемами, так как они являются инвазивными, вызывают боль и не могут обеспечить большое количество стволовых клеток.Mesenchymal stem cells (MSCs) are used to develop a range of cell therapies because they differentiate into different cell types in response to specific stimulation, do not have the tumorigenicity of induced stem cells, and do not pose ethical concerns associated with the use of embryonic stem cells. Mesenchymal stem cells are adult stem cells and are mostly isolated from adipose tissue, umbilical cord blood, bone marrow, etc. adults. Methods for isolating these tissues pose some problems, as they are invasive, cause pain, and cannot provide large numbers of stem cells.

Раскрытие изобретенияDisclosure of the Invention

Техническая задачаTechnical problem

Авторы настоящего изобретения разработали способ скрининга способствующих регенерации нейрональных клеток, проявляющих нейрональный регенеративный эффект из числа разных клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток, на основе анализа специфических CD маркеров.The present inventors have developed a method for screening regeneration-promoting neuronal cells exhibiting a neuronal regenerative effect from among various cells differentiated from mesenchymal stem cells based on the analysis of specific CD markers.

Настоящее изобретение направлено на предоставление способа скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенеративной активностью.The present invention is directed to providing a method for screening mesenchymal stem cell-derived, regenerative neuronal cells having neuronal regenerative activity.

Настоящее раскрытие также направлено на предоставление нейрональных способствующих регенерации клеток, отобранных при помощи данного способа скрининга.The present disclosure also aims to provide neuronal regeneration-promoting cells selected using this screening method.

Настоящее раскрытие также направлено на предоставление фармацевтической композиции, предназначенной для предотвращения или лечения неврологического заболевания и содержащей нейрональные способствующие регенерации клетки в качестве активного ингредиента.The present disclosure is also directed to provide a pharmaceutical composition intended for the prevention or treatment of a neurological disease and containing neuronal pro-regeneration cells as an active ingredient.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными благодаря последующему подробному описанию, формуле изобретения и чертежам.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description, claims and drawings.

Техническое решениеTechnical solution

В одном аспекте настоящее раскрытие предоставляет способ скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенеративной активностью, включающий:In one aspect, the present disclosure provides a method for screening mesenchymal stem cell-derived, regenerative neuronal cells having neuronal regenerative activity, comprising:

i) стадию подготовки клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток; иi) the stage of preparing cells differentiated from mesenchymal stem cells; And

ii) стадию скрининга клеток, в которых повышен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD121a, CD106 и CD112, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.ii) a step of screening cells that have increased one or more markers selected from the group consisting of CD121a, CD106 and CD112 from among the differentiated cells of step i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенеративной активностью, включающий:In another aspect, the present invention provides a method for screening mesenchymal stem cell-derived, regenerative neuronal cells having neuronal regenerative activity, comprising:

i) стадию подготовки клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток; иi) the stage of preparing cells differentiated from mesenchymal stem cells; And

ii) стадию скрининга клеток, в которых понижен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD26 и CD141, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.ii) a step of screening cells that are downregulated in one or more markers selected from the group consisting of CD26 and CD141 from the differentiated cells of step i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

Авторы настоящего изобретения дифференцировали мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из различных источников, и изучили профили экспрессии различных маркеров в разных дифференцированных клетках. В результате было неожиданно установлено, что клетки, дифференцированные в способствующие регенерации нейрональные клетки, демонстрируют общую тенденцию в профиле экспрессии специфических маркеров (например, CD маркеров, таких как CD121a, CD106 и CD112).The present inventors differentiated mesenchymal stem cells derived from various sources and studied the expression profiles of various markers in different differentiated cells. As a result, it was unexpectedly found that cells differentiated into regenerative neuronal cells exhibit a general trend in the expression profile of specific markers (eg, CD markers such as CD121a, CD106 and CD112).

В настоящем изобретении термин «способствующая регенерации нейрональная клетка» или «NRPC» относится к клетке, дифференцированной из мезенхимальной стволовой клетки, обладающей эффектом регенерации нейронов (например, действием, способствующим нейрональной регенерации прямо или опосредованно с точки зрения структуры или функции путем миелонизации поврежденных периферических нервов или секреции цитокинов, необходимых для нейрональной регенерации).In the present invention, the term “neuronal regeneration-promoting cell” or “NRPC” refers to a cell differentiated from a mesenchymal stem cell having a neuronal regeneration effect (e.g., an effect of promoting neuronal regeneration directly or indirectly in terms of structure or function by myelonizing damaged peripheral nerves or secretion of cytokines necessary for neuronal regeneration).

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения способ скрининга включает:According to a specific embodiment of the present invention, the screening method includes:

i) стадию подготовки клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток;i) the stage of preparing cells differentiated from mesenchymal stem cells;

ii) стадию скрининга клеток, в которых повышен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD121a, CD106 и CD112, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки; иii) the step of screening cells that have increased one or more markers selected from the group consisting of CD121a, CD106 and CD112 from among the differentiated cells of stage i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells; And

iii) стадию скрининга клеток, в которых понижен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD26 и CD141, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.iii) a step of screening cells that are downregulated in one or more markers selected from the group consisting of CD26 and CD141 from the differentiated cells of stage i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения способ скрининга включает:According to a specific embodiment of the present invention, the screening method includes:

i) стадию подготовки клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток;i) the stage of preparing cells differentiated from mesenchymal stem cells;

ii) стадию скрининга клеток, в которых понижен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD26 и CD141, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки; иii) the step of screening cells that are downregulated in one or more markers selected from the group consisting of CD26 and CD141 from the differentiated cells of stage i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells; And

iii) стадию скрининга клеток, в которых повышен один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD121a, CD106 и CD112, из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.iii) the step of screening cells that have increased one or more markers selected from the group consisting of CD121a, CD106 and CD112 from among the differentiated cells of stage i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В настоящем изобретении термин «стволовая клетка» имеет отношение к клетке, которая может воспроизвести себя и в то же время обладает способностью дифференцироваться в два или более типов клеток. Стволовые клетки включают стволовые клетки взрослого человека, плюрипотентные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или эмбриональные стволовые клетки. Конкретнее, они могут быть мезенхимальными стволовыми клетками.In the present invention, the term “stem cell” refers to a cell that can reproduce itself and at the same time has the ability to differentiate into two or more cell types. Stem cells include adult stem cells, pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells or embryonic stem cells. More specifically, they may be mesenchymal stem cells.

В настоящем изобретении термин «мезенхимальная стволовая клетка» относится к недифференцированной стволовой клетке, изолированной из ткани человека или млекопитающего. Мезенхимальная стоволовая клетка может происходить из различных тканей. В частности, она может происходить из одной или более тканей, выбранных из группы, состоящей из небной миндалины, пуповины, пуповинной крови, костного мозга, жировой ткани, мышцы, нерва, кожи, амниона, хориона, отпадающей плаценты и плаценты. Методики изолирования стволовых клеток из каждой ткани хорошо известны в данной области техники.As used herein, the term “mesenchymal stem cell” refers to an undifferentiated stem cell isolated from human or mammalian tissue. A mesenchymal stem cell can originate from a variety of tissues. In particular, it may be derived from one or more tissues selected from the group consisting of tonsil, umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, adipose tissue, muscle, nerve, skin, amnion, chorion, placenta and placenta. Techniques for isolating stem cells from each tissue are well known in the art.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения мезенхимальная стволовая клетка происходит из небной миндалины или жировой ткани.According to a particular embodiment of the present invention, the mesenchymal stem cell is derived from the palatine tonsil or adipose tissue.

В примере настоящего изобретения подтверждено, что наиболее предпочтительно использовать мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из небной миндалины или жировой ткани.In the example of the present invention, it is confirmed that it is most preferable to use mesenchymal stem cells derived from the palatine tonsil or adipose tissue.

В настоящем изобретении термин «CD» или «кластер дифференцировки» относится к поверхностной молекулярной структуре, присутствующей на клеточной поверхности. Поскольку некоторые клеточные популяции совместно пользуются одними и теми же CD молекулами, их используют для различения популяции клеток (т.е. в качестве маркеров). Клетки одной и той же линии дифференцировки имеют одинаковые CD молекулы, но даже та же самая клеточная популяция имеет разные CD молекулы в зависимости от стадии дифференцировки или активации. Поэтому их удобно использовать для идентификации клеточного ростка, дифференцировки, активации и т.д. клеток.In the present invention, the term "CD" or "cluster of differentiation" refers to a surface molecular structure present on the cell surface. Since some cell populations share the same CD molecules, they are used to distinguish a population of cells (ie, as markers). Cells of the same lineage have the same CD molecules, but even the same cell population has different CD molecules depending on the stage of differentiation or activation. Therefore, they are convenient to use for cell lineage identification, differentiation, activation, etc. cells.

В примере настоящего изобретения было подтверждено в результате сравнения профиля экспрессии CD молекул в происходящих из стволовой клетки, нейрональных способствующих регенерации клетках, обладающих нейрональной регенерационной активностью настоящего раскрытия, и в мезенхимальных стволовых клетках, что нейрональные способствующие регенерации клетки согласно настоящему раскрытию отличаются от мезенхимальных стволовых клеток. В настоящем изобретении CD10, CD39, CD106, CD112, CD121a, CD338 и т.д., экспрессия которых является повышенной по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, или CD26 CD54, CD126, CD141 и т.д., экспрессия которых является пониженной, могут использоваться в качестве маркеров дифференцировки способствующих регенерации нейрональных клеток.In an example of the present invention, it was confirmed by comparing the expression profile of CD molecules in stem cell-derived, neuronal regenerative-promoting cells having the neuronal regenerative activity of the present disclosure and in mesenchymal stem cells that the neuronal regenerative-promoting cells of the present disclosure are different from mesenchymal stem cells . In the present invention, CD10, CD39, CD106, CD112, CD121a, CD338, etc., the expression of which is increased compared to mesenchymal stem cells, or CD26 CD54, CD126, CD141, etc., the expression of which is decreased, can used as markers of differentiation promoting the regeneration of neuronal cells.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения дифференцированные клетки стадии i) дифференцируются из нейросфер, образованных культивируемыми мезенхимальными стволовыми клетками.According to a particular embodiment of the present invention, differentiated cells of stage i) are differentiated from neurospheres formed by cultured mesenchymal stem cells.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения нейрональная регенерационная активность включает миелинизацию периферических нервов.According to a specific embodiment of the present invention, neuronal regenerative activity includes myelination of peripheral nerves.

В настоящем изобретении термин «миелинизация» относится к явлению, при котором миелин окружает аксоны периферических нервов для увеличения скорости, с которой доставляется стимул. Поврежденные периферические нервы приходят в норму (т.е. регенерируют) за счет миелинизации.As used herein, the term “myelination” refers to the phenomenon in which myelin surrounds the axons of peripheral nerves to increase the speed at which a stimulus is delivered. Damaged peripheral nerves return to normal (i.e., regenerate) due to myelination.

В примере настоящего изобретения некоторые из кандидатных клеток, отобранных методом скрининга настоящего изобретения, были миелинизированы цитоморфологически путем совместного культивирования с дорсальными корешковыми ганглиями.In an example of the present invention, some of the candidate cells selected by the screening method of the present invention were myelinated cytomorphologically by co-culture with dorsal root ganglia.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет нейрональные способствующие регенерации клетки, отобранные методом скрининга, описанным выше.In another aspect, the present invention provides neuronal pro-regeneration cells selected by the screening method described above.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения нейрональные способствующие регенерации клетки имеют следующие характеристики:According to a specific embodiment of the present invention, neuronal regeneration-promoting cells have the following characteristics:

a) экспрессия маркеров CD121a, CD106 и CD112 является повышенной по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки; иa) expression of markers CD121a, CD106 and CD112 is increased compared to mesenchymal stem cells before differentiation; And

b) экспрессия маркеров CD26 и CD141 является пониженной по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.b) expression of markers CD26 and CD141 is reduced compared to mesenchymal stem cells before differentiation.

В нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD121a повышается, как правило, на 30% или больше, конкретнее на 40% или больше по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In neuronal regeneration-promoting cells, CD121a marker expression is increased typically by 30% or more, more specifically by 40% or more, compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В примере настоящего изобретения было подтверждено, что экспрессия маркера CD121a повышается на 94% в происходящих из T-MSC-1-1 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 71% в происходящих из T-MSC-1-2 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 51% в происходящих из T-MSC-13- нейрональных способствующих регенерации клетки и на 48% в происходящих из T-MSC-14 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 66% или более в среднем по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In an example of the present invention, CD121a marker expression was confirmed to be increased by 94% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 71% in T-MSC-1-2-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 51 % in T-MSC-13-derived neuronal regeneration-promoting cells and 48% in T-MSC-14-derived neuronal regeneration-promoting cells, 66% or more on average compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD106 повышена, как правило, на 5% или более, конкретнее на 10% или более по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In neuronal regeneration-promoting cells, CD106 marker expression is increased, typically by 5% or more, more specifically by 10% or more, compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В примере настоящего изобретения подтверждено, что экспрессия маркера CD106 повышается на 30% в происходящих из T-MSC-1-1 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 11% в происходящих из T-MSC-1-2 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 16% в происходящих из T-MSC-1-3 нейрональных способствующих регенерации клетках и на 13% в происходящих из T-MSC-1-4 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 17% или более в среднем по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In an example of the present invention, it is confirmed that the expression of the CD106 marker is increased by 30% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 11% in T-MSC-1-2-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 16% in T-MSC-1-3-derived neuronal regeneration-promoting cells and by 13% in T-MSC-1-4-derived neuronal regeneration-promoting cells, 17% or more on average compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD112 повышена, как правило, на 10% или больше, конкретнее на 15% или больше по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In neuronal regeneration-promoting cells, expression of the CD112 marker is increased, typically by 10% or more, more specifically by 15% or more, compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В примере настоящего изобретения было подтверждено, что экспрессия маркера CD112 повышается на 49% в происходящих из T-MSC-1-1 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 25% в происходящих из T-MSC-1-2 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 30% в происходящих из T-MSC-1-3 нейрональных способствующих регенерации клетках и на 19% в происходящих из T-MSC-1-4 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 30% или более в среднем по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In an example of the present invention, CD112 marker expression was confirmed to be increased by 49% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 25% in T-MSC-1-2-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 30 % in T-MSC-1-3-derived neuronal regeneration-promoting cells and 19% in T-MSC-1-4-derived neuronal regeneration-promoting cells, 30% or more on average compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения в нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD26 понижается по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.According to a specific embodiment of the present invention, the expression of the CD26 marker is reduced in neuronal regeneration-promoting cells compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD26 понижается, как правило, на 5% или больше, конкретнее на 8% или больше по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In neuronal regeneration-promoting cells, expression of the CD26 marker is generally reduced by 5% or more, more specifically by 8% or more, compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В примере настоящего изобретения экспрессия маркера CD26 понижается на 9% в происходящих из T-MSC-1-1 нейрональных способствующих регенерации клетках, 11% в происходящих из T-MSC-1-2 нейрональных способствующих регенерации клетках, 27% в происходящих из T-MSC-1-3 нейрональных способствующих регенерации клетках и 16% в происходящих из T-MSC-1-4 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 16% или более в среднем по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In an example of the present invention, expression of the CD26 marker is reduced by 9% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells, 11% in T-MSC-1-2-derived neuronal regeneration-promoting cells, 27% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells. MSC-1-3 neuronal regeneration-promoting cells and 16% in T-MSC-1-4-derived neuronal regeneration-promoting cells, 16% or more on average compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В нейрональных способствующих регенерации клетках экспрессия маркера CD141 понижается, как правило, на 5% или больше, конкретнее на 8% или больше по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In neuronal regeneration-promoting cells, expression of the CD141 marker is generally reduced by 5% or more, more specifically by 8% or more, compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells.

В примере настоящего изобретения экспрессия маркера CD141 понижается на 9% в происходящих из T-MSC-1-1 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 20% в происходящих из T-MSC-1-2 нейрональных способствующих регенерации клетках, 16% в происходящих из T-MSC-1-3 нейрональных способствующих регенерации клетках и на 38% в происходящих из T-MSC-1-4 нейрональных способствующих регенерации клетках, на 20% или более в среднем по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.In an example of the present invention, CD141 marker expression is reduced by 9% in T-MSC-1-1-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 20% in T-MSC-1-2-derived neuronal regeneration-promoting cells, by 16% in T-derived neuronal regeneration-promoting cells. -MSC-1-3 neuronal regeneration-promoting cells and 38% in T-MSC-1-4-derived neuronal regeneration-promoting cells, 20% or more on average compared to mesenchymal stem cells before differentiation.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения неврологического заболевания, содержащую нейрональные способствующие регенерации клетки в качестве активного ингредиента.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease containing neuronal cell regeneration-promoting cells as an active ingredient.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения неврологического заболевания, включающий стадию введения эффективного количества нейрональных способствующих регенерации клеток субъекту.In another aspect, the present invention provides a method of treating a neurological disease, comprising the step of administering an effective amount of neuronal cell regeneration-promoting cells to a subject.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает использование нейрональных способствующих регенерации клеток в терапии.In another aspect, the present invention provides the use of neuronal cell regeneration-promoting therapies in therapy.

В настоящем изобретении термин «неврологическое заболевание» имеет отношение к болезни, вызванной повреждением нервных тканей вследствие внутренних факторов, таких как наследственность, старение и т.д. или внешних факторов, таких как травма и т.п.In the present invention, the term "neurological disease" refers to a disease caused by damage to nerve tissue due to internal factors such as heredity, aging, etc. or external factors such as injury, etc.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения неврологическое заболевание является одним или более заболеваниями, выбранными из группы, состоящей из нейропатии Шарко-Мари-Тута, диабетической периферической нейропатии, повреждения спинного мозга, амиотрофического латерального склероза, туннельного синдрома запястья, детского паралича, проказы, мышечной дистрофии, полимиозита и миастении гравис.According to a specific embodiment of the present invention, the neurological disease is one or more diseases selected from the group consisting of Charcot-Marie-Tooth neuropathy, diabetic peripheral neuropathy, spinal cord injury, amyotrophic lateral sclerosis, carpal tunnel syndrome, infantile paralysis, leprosy, muscular dystrophy , polymyositis and myasthenia gravis.

В настоящем изобретении термин «субъект» относится к индивидууму, нуждающемуся во введении композиции или нейрональных способствующих регенерации клеток настоящего изобретения, и включает млекопитающих, птиц, рептилий, земноводных, рыб и т.д., без ограничения.In the present invention, the term “subject” refers to an individual in need of administration of the composition or neuronal cell regeneration-promoting composition of the present invention, and includes, without limitation, mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, etc.

В настоящем изобретении «предотвращение» имеет отношение к любого рода ингибированию или отсрочке неврологического заболевания при введении композиции согласно настоящему раскрытию. И «лечение» имеет отношение к любого рода улучшению или благоприятному изменению симптомов неврологического заболевания при введении композиции согласно настоящему изобретению.In the present invention, “preventing” refers to any kind of inhibition or delay of neurological disease upon administration of a composition according to the present disclosure. And “treating” refers to any kind of improvement or beneficial change in the symptoms of a neurological disease upon administration of a composition according to the present invention.

Согласно отдельному примеру осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.According to a particular embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть приготовлена в виде однодозовой или многодозовой композиции с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента согласно способу, который легко может быть осуществлен средним специалистом в области техники, к которой относится настоящее раскрытие.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared as a single-dose or multi-dose composition using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by one of ordinary skill in the art to which the present disclosure relates.

Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в виде разных композиций согласно общепринятым методам. Например, она может быть приготовлена в виде композиции для перорального приема, такой как порошок, гранула, таблетка, капсула, суспензия, эмульсия, сироп и т.п. и также может быть приготовлена в виде композиции для наружного применения, суппозитория или стерильного раствора для инъекции.The pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared into various compositions according to conventional methods. For example, it can be formulated as an oral composition such as a powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup and the like. and can also be prepared as a topical composition, suppository or sterile solution for injection.

Композиция настоящего изобретения может содержать один или более известный активный ингредиент, обладающий действием предотвращения или лечения неврологического заболевания вместе с происходящими из стволовой клетки нейрональными способствующими регенерации клетками, обладающими нейрональной регенеративной активностью.The composition of the present invention may contain one or more known active ingredients having the effect of preventing or treating a neurological disease together with stem cell-derived neuronal regeneration-promoting cells having neuronal regenerative activity.

Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться перорально или парентерально. Конкретнее, композиция может вводиться парентерально, например, путем внутривенной инъекции, трансдермального введения, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, интравитреальной инъекции, субретинальной инъекции, супрахориоидальной инъекции, введения в виде глазных капель, интрацеребровентрикулярной инъекции, интратекальной инъекции, внутриамниотической инъекции, внутриартериальной инъекции, внутрисуставной инъекции, внутрисердечной инъекции, внутрикавернозной инъекции, внутричерепной инъекции, интрацистернальной инъекции, внутрикоронарной инъекции, внутричерепной инъекции, интрадуральной инъекции, эпидуральной инъекции, интрагиппокампальной инъекции, интраназальной инъекции, внутрикостной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутриплевральной инъекции, инъекции в спинно-мозговой канал, интраторакальной инъекции, внутритимусной инъекции, внутриматочной инъекции, внутривагинальной инъекции, внутрижелудочковой инъекции, внутрипузырной инъекции, субконъюнктивальной инъекции, внутриопухолевой инъекции, местной инъекции и т.п.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally. More specifically, the composition may be administered parenterally, for example, by intravenous injection, transdermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravitreal injection, subretinal injection, suprachoroidal injection, eye drop administration, intracerebroventricular injection, intrathecal injection, intra-amniotic injection, intra-arterial injection, intra-articular injection, intracardiac injection, intracavernous injection, intracranial injection, intracisternal injection, intracoronary injection, intracranial injection, intradural injection, epidural injection, intrahippocampal injection, intranasal injection, intraosseous injection, intraperitoneal injection, intrapleural injection, spinal canal injection, intrathoracic injection , intrathymic injection, intrauterine injection, intravaginal injection, intraventricular injection, intravesical injection, subconjunctival injection, intratumoral injection, local injection, etc.

Композиции для парентерального введения включают стерилизованный водный раствор, неводный раствор, суспензию, эмульсию, лиофилизированную композицию и суппозиторий. Для неводного раствора или суспензии можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, инъецируемый сложный эфир, такой как этилолеат и т.д. В качестве основы для суппозиториев могут использоваться витепсол, макрогол, Твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерожелатин и т.п.Compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solution, non-aqueous solution, suspension, emulsion, lyophilized composition and suppository. For the non-aqueous solution or suspension, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, etc. can be used. Witepsol, macrogol, Tween 61, cocoa butter, lauric oil, glycerogelatin, etc. can be used as a base for suppositories.

Дозировка для введения фармацевтической композиции настоящего изобретения может варьировать в зависимости от различных факторов, таких как способ составления композиции, способ введения, время введения, путь введения, ответ, которого необходимо достигнуть при введении фармацевтической композиции, и его выраженность, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, патологическое состояние или его тяжесть, пол, диета и скорость экскреции у субъекта, которому вводится фармацевтическая композиция, и другие лекарственные средства или ингредиенты, использованные совместно, и других подобных факторов, хорошо известных в области медицины, причем вводимая дозировка, эффективная для достижения желаемого лечения, может быть легко определена и назначена средним специалистом в данной области техники.The dosage for administration of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on various factors such as the method of formulation, route of administration, time of administration, route of administration, the response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition and its severity, age, body weight, general health status, pathological condition or severity thereof, sex, diet and excretion rate of the subject to whom the pharmaceutical composition is administered, and other drugs or ingredients used together, and other similar factors well known in the medical field, the dosage administered effective for achieving the desired treatment can be easily determined and prescribed by one of ordinary skill in the art.

Путь и способ введения фармацевтической композиции настоящего изобретения могут быть независимыми друг от друга и не ограничиваются каким-либо специальным образом, если только фармацевтическая композиция может достигать целевого места.The route and method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be independent of each other and are not particularly limited as long as the pharmaceutical composition can reach the target site.

Полезные эффектыBeneficial effects

Признаки и преимущества настоящего изобретения могут быть суммированы, как изложено ниже:The features and advantages of the present invention can be summarized as follows:

(i) Настоящее изобретение предоставляет способ скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, нейрональных способствующих регенерации клеток, обладающих нейрональной регенерационной активностью, и фармацевтическую композицию, содержащую способствующие регенерации нейрональные клетки.(i) The present invention provides a method for screening mesenchymal stem cell-derived neuronal regeneration-promoting cells having neuronal regeneration activity, and a pharmaceutical composition containing neuronal regeneration-promoting cells.

(ii) Нейрональные способствующие регенерации клетки настоящего изобретения полностью отличаются от стволовых клеток в отношении профиля экспрессии CD маркера и демонстрируют отличный результат регенерации нейронов. Соответственно, они могут использоваться в различных областях для предотвращения или лечения неврологических заболеваний.(ii) The neuronal regeneration-promoting cells of the present invention are completely different from stem cells in terms of the CD marker expression profile and exhibit an excellent neuronal regeneration result. Accordingly, they can be used in various fields to prevent or treat neurological diseases.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На фиг. 1 показаны изображения нейрональных способствующих регенерации клеток, индуцированных из происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клеток T-MSC-1-1.In fig. 1 shows images of neuronal regeneration-promoting cells induced from tonsil-derived mesenchymal stem cells T-MSC-1-1.

На фиг. 2 показаны тепловые карты, визуализирующие экспрессию CD маркеров в нейрональных способствующих регенерации клетках согласно настоящему изобретению путем скрининга CD маркеров.In fig. 2 shows heat maps visualizing the expression of CD markers in neuronal regeneration-promoting cells according to the present invention by screening for CD markers.

На фиг. 3a и 3b продемонстрирован результат скрининга CD маркеров, показывающий различие в уровне экспрессии нейрональных способствующих регенерации клеток по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками. На фиг. 3a показан результат сравнения CD маркеров, уровень экспрессии которых повышен по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками, а на фиг. 3b показан результат сравнения CD маркеров, уровень экспрессии которых понижен по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.In fig. 3a and 3b show the result of a CD marker screen showing differences in the expression levels of neuronal pro-regeneration cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells. In fig. 3a shows the result of a comparison of CD markers whose expression level is increased compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells, and FIG. 3b shows the result of a comparison of CD markers whose expression level is reduced compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells.

На фиг. 4 показан результат сравнения профиля экспрессии CD маркеров, экспрессия которых повышается, и CD маркеров, экспрессия которых понижается в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.In fig. 4 shows the result of a comparison of the expression profile of CD markers whose expression is increased and CD markers whose expression is decreased in neuronal regeneration-promoting cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells.

На фиг. 5 показан результат скрининга CD маркеров, экспрессия которых была повышена или понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках.In fig. Figure 5 shows the result of a screen for CD markers whose expression was increased or decreased in neuronal regeneration-promoting cells.

На фиг. 6 показан результат сравнения профиля экспрессии маркеров CD121a, CD106 и CD112, экспрессия которых повышается в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.In fig. 6 shows the result of a comparison of the expression profile of the markers CD121a, CD106 and CD112, the expression of which is increased in neuronal regeneration-promoting cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells.

На фиг. 7 показан результат сравнения профиля экспрессии маркеров CD26 и CD141, экспрессия которых понижается в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.In fig. 7 shows the result of a comparison of the expression profile of the markers CD26 and CD141, the expression of which is reduced in neuronal regeneration-promoting cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells.

На фиг. 8 показан результат сравнения профиля экспрессии CD маркеров в происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках (T-MSC) и нейрональных способствующих регенерации клетках (NRPC) с использованием тепловых карт.In fig. 8 shows the result of comparing the expression profile of CD markers in tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSC) and neuronal regeneration-promoting cells (NRPC) using heat maps.

На фиг. 9 показан результат проведения анализа роста нейритов для сравнения роста нейритов из нейрональных способствующих регенерации клеток.In fig. 9 shows the result of a neurite outgrowth assay to compare neurite outgrowth from neuronal regeneration-promoting cells.

На фиг. 10 показано, что миелинизация была достигнута цитоморфологически в некоторых из кандидатных клеток, совместно культивированных с дорсальными корешковыми ганглиями.In fig. Figure 10 shows that myelination was achieved cytomorphologically in some of the candidate cells co-cultured with the dorsal root ganglia.

На фиг. 11 показан результат проведения проточной цитометрии по повышенным и пониженным CD маркерам, отобранным с помощью CD скрининга с использованием индивидуальных антител.In fig. 11 shows the result of flow cytometry for elevated and decreased CD markers selected by CD screening using individual antibodies.

На фиг. 12 показан результат анализа цитокинов T-MSC и NRPC с использованием тепловых карт (слева) и долю цитокинов, увеличенных в NRPC по сравнению с T-MSC (справа) (кратность изменения: NRPC 1-1/ T-MSC 1-1, NRPC 1-2/ T-MSC 1-2).In fig. Figure 12 shows the result of cytokine analysis of T-MSC and NRPC using heat maps (left) and the proportion of cytokines increased in NRPC compared to T-MSC (right) (fold change: NRPC 1-1/ T-MSC 1-1, NRPC 1-2/ T-MSC 1-2).

Лучший вариант осуществления изобретенияBest Mode for Carrying Out the Invention

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Примеры предоставляются только для более подробного описания настоящего изобретения, при этом средним специалистам в данной области техники будет понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается примерами.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with the help of examples. The examples are provided only to further describe the present invention, and those of ordinary skill in the art will appreciate that the scope of the present invention is not limited to the examples.

ПримерыExamples

Пример 1. Приготовление мезенхимальных стволовых клетокExample 1: Preparation of Mesenchymal Stem Cells

1-1. Изоляция и культивирование мезенхимальных стволовых клеток, происходящих из небной миндалины1-1. Isolation and culture of tonsil-derived mesenchymal stem cells

Ткани небных желез, полученные от нескольких доноров, приобретенные в медицинском колледже Женского университета Ихва, помещали в пробирки с 10 мл DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко) с добавлением 20 мкг/мл гентамицина, центрифугировали при 1,500 об/мин в течение 5 минут, а затем промывали дважды. Промытые ткани небной железы нарезали с помощью стерильных ножниц.Palatine gland tissues obtained from multiple donors, purchased from Ewha Womans University College of Medicine, were placed in tubes with 10 ml DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) supplemented with 20 μg/ml gentamicin, centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then washed twice. The washed palatine gland tissues were cut using sterile scissors.

Для того чтобы изолировать происходящие из ткани небной миндалины мезенхимальные стволовые клетки, после добавления ферментативного реакционного раствора того же самого веса, ткани небной железы инкубировали в инкубаторе-встряхивателе при 37°C и 200 об/мин в течение 60 минут. Состав ферментативного реакционного раствора описан в таблице 1.In order to isolate palatine tonsil tissue-derived mesenchymal stem cells, after adding the same weight of enzymatic reaction solution, the palatine gland tissues were incubated in a shaking incubator at 37° C. and 200 rpm for 60 minutes. The composition of the enzymatic reaction solution is described in Table 1.

Таблица 1Table 1 Конечная концентрацияFinal concentration ИнгредиентыIngredients 2 мг/мл2 mg/ml ТрипсинTrypsin 1.2 U/мл1.2 U/ml диспазаdispase 1 мкг/мл1 µg/ml Коллагеназа Типа 1 Collagenase Type 1 20 мкг/мл20 µg/ml ДНКаза 1DNase 1 -- HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса)HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)

После добавления в культуру 5% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки) смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали в 30 мл DPBS, а затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали в 10 мл DPBS для приготовления суспензии. Суспензию пропускали через 100-мкм фильтр. Происходящие из небной железы мезенхимальные стволовые клетки, оставшиеся на фильтре, промывали 20 мл DPBS, а затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант удаляли и проводили инкубацию на водяной бане с постоянной температурой 37°C в течение 5 мин после добавления лизирующего буфера ACK. После добавления к суспензии DPBS центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. После центрифугирования супернатант удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали в DMEM с высоким содержанием глюкозы (10% FBS, 20 мкг/мл гентамицина) для получения суспензии. Затем, подсчитывали число клеток в приготовленной клеточной суспензии. Клеточную суспензию высевали в T175 флаконы и инкубировали при 37°C в 5% CO2 инкубаторе.After adding 5% FBS (fetal bovine serum) to the culture, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the remaining pellet was resuspended in 30 ml DPBS and then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the remaining pellet was resuspended in 10 ml DPBS to prepare a suspension. The suspension was passed through a 100-μm filter. Palatine gland-derived mesenchymal stem cells remaining on the filter were washed with 20 ml DPBS and then centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and incubated in a water bath at a constant temperature of 37°C for 5 min after adding ACK lysis buffer. After addition to the suspension, DPBS was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the remaining pellet was resuspended in high glucose DMEM (10% FBS, 20 μg/ml gentamicin) to obtain a suspension. Then, the number of cells in the prepared cell suspension was counted. The cell suspension was seeded into T175 flasks and incubated at 37°C in a 5% CO 2 incubator.

1-2. Изолирование и культивирование мезенхимальных стволовых клеток, происходящих из жировой ткани1-2. Isolation and cultivation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells

Происходящие из жировой ткани мезенхимальные стволовые клетки покупали у компании Lonza (стволовые клетки, происходящие из человеческой жировой ткани, Cat#PT-5006, Lonza, Швейцария). Происходящие из жировой ткани мезенхимальные стволовые клетки культивировали, используя среду, предоставленную Lonza (Bulletkit ADSD, Cat#PT-4505).Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were purchased from Lonza (human adipose tissue-derived stem cells, Cat#PT-5006, Lonza, Switzerland). Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were cultured using medium provided by Lonza (Bulletkit ADSD, Cat#PT-4505).

Пример 2. Образование нейросферExample 2. Formation of neurospheres

Нейросферы были сформированы при культивировании мезенхимальных стволовых клеток из примера 1. Конкретнее, мезенхимальные стволовые клетки субкультивировали до 4-7 пассажей. После удаления культуральной среды мезенхимальные стволовые клетки промыли DPBS. После обработки промытых клеток TrypLE подсчитывали собранные клетки. После центрифугирования собранных клеток и удаления супернатанта клетки ресуспендировали в среде для образования нейросфер. Состав среды для образования нейросфер описан в таблице 2.Neurospheres were formed by culturing the mesenchymal stem cells from Example 1. More specifically, the mesenchymal stem cells were subcultured for up to 4-7 passages. After removing the culture medium, the mesenchymal stem cells were washed with DPBS. After treating the washed cells with TrypLE, the collected cells were counted. After centrifugation of the collected cells and removal of the supernatant, the cells were resuspended in medium to form neurospheres. The composition of the medium for the formation of neurospheres is described in Table 2.

Таблица 2table 2 Окончательная концентрацияFinal concentration ИнгредиентыIngredients -- DMEM/F12 с GlutaMAXDMEM/F12 with GlutaMAX 20 нг/мл20 ng/ml Основной фактор роста фибробластовMajor fibroblast growth factor 20 нг/мл20 ng/ml Эпидермальный фактор ростаEpidermal growth factor 1x1x B27 добавкаB27 additive 20 мкг/мл20 µg/ml ГентамицинGentamicin

Клетки, ресуспендированные в среде для образования нейросфер (1x106 клеток), высевали в чашки со сверхнизким «сцеплением» (60 мм). Высеянные клетки культивировали в течение 3 дней в условиях 37°C и 5% CO2. После культивирования в течение 3 дней образованные в чашке нейросферы собирали в 15-мл пробирку. После центрифугирования собранных клеток и удаления супернатанта готовили суспензию нейросфер путем добавления свежей среды для формирования нейросфер. Суспензию нейросфер переносили в чашку со сверхнизким «сцеплением» и культивировали нейросферы в течение 4 дней в условиях 37°C и 5% CO2.Cells resuspended in neurosphere formation medium (1 x 10 6 cells) were seeded in ultra-low adherence dishes (60 mm). The seeded cells were cultured for 3 days at 37°C and 5% CO 2 . After culturing for 3 days, the neurospheres formed in the dish were collected into a 15-ml tube. After centrifuging the collected cells and removing the supernatant, a neurosphere suspension was prepared by adding fresh medium to form neurospheres. The neurosphere suspension was transferred to an ultra-low grip dish and the neurospheres were cultured for 4 days at 37°C and 5% CO 2 .

Пример 3. Дифференцировка в кандидатные клетки нейрональных способствующих регенерации клеток (NRPC) с использованием нейросферExample 3: Differentiation into Candidate Neuronal Promoting Cells (NRPCs) Using Neurospheres

Нейросферы, образованные в примере 2, тонко измельчали, используя иглу для шприца 23-26G. Измельченные нейросферы переносили в 15-мл пробирку с помощью пипетки, а затем центрифугировали. После удаления супернатанта, измельченные нейросферы ресуспендировали, добавив в пробирку индукционную среду для нейрональных способствующих регенерации клеток. Были приготовлены разные индукционные среды для нейрональных способствующих регенерации клеток путем комбинирования трех или более из 1) 5-20% FBS (эмбриональная бычья сыворотка, 2) 5-20 нг/мл bFGF (основной фактор роста фибробластов, Peprotech, США), 3) 100-400 мкM бутилгидроксианизол (Sigma, США), 4) 5-40 мкM форсколин (MedCheExpress, США), 5) 0.1-10% N2 добавка (GIBCO, США), 6) 1-100 нг/мл нейротрофический фактор головного мозга (BDNF, Sigma-Aldrich, США), 7) 1-100 нг/мл фактор роста нервов (NGF, Santa Cruz, США), 8) 0,01-1 нг/мл «sonic hedgehog» (SHH, R & D Systems, США), 9) 1-10 нг/мл PDGF-AA (фактор роста тромбоцитов-AA, Peprotech, США) и 10) 50-300 нг/мл херегулин-бета1, Peprotech, США) в DMEM/F12, содержащей GlutaMAX.The neurospheres formed in Example 2 were finely ground using a 23-26G syringe needle. The crushed neurospheres were transferred into a 15-ml tube using a pipette and then centrifuged. After removing the supernatant, the crushed neurospheres were resuspended by adding induction medium for neuronal cell regeneration to the tube. Different induction media for neuronal promoting cell regeneration were prepared by combining three or more of 1) 5-20% FBS (fetal bovine serum, 2) 5-20 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor, Peprotech, USA), 3) 100-400 µM butylated hydroxyanisole (Sigma, USA), 4) 5-40 µM forskolin (MedCheExpress, USA), 5) 0.1-10% N2 supplement (GIBCO, USA), 6) 1-100 ng/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF, Sigma-Aldrich, USA), 7) 1-100 ng/ml nerve growth factor (NGF, Santa Cruz, USA), 8) 0.01-1 ng/ml “sonic hedgehog” (SHH, R & D Systems, USA), 9) 1-10 ng/ml PDGF-AA (platelet growth factor-AA, Peprotech, USA) and 10) 50-300 ng/ml heregulin-beta1, Peprotech, USA) in DMEM/F12 containing GlutaMAX.

Ресуспендированные в разных средах нейросферы высевали во флаконы T175, покрытые ламинином (2 мкг/мл). Высеянные нейросферы культивировали в течение 8-10 дней, меняя при этом индукционную среду у нейрональных способствующих регенерации клеток с 3-дневным интервалом (фиг. 1).Neurospheres resuspended in different media were seeded into T175 flasks coated with laminin (2 μg/ml). The seeded neurospheres were cultured for 8-10 days, while changing the induction environment of neuronal regeneration-promoting cells at 3-day intervals (Fig. 1).

Пример 4. Первый скрининг кандидатных клеток из нейрональных способствующих регенерации клеток путем подтверждения миелинизации периферических нервовExample 4: First Screening of Candidate Neuronal Promoting Cells by Confirming Myelination of Peripheral Nerves

Было изучено, обладают ли нейрональные способствующие регенерации кандидатные клетки, полученные в примере 3, способностью миелинизировать периферические нервы. Конкретнее, дифференцированные нейрональные способствующие регенерации кандидатные клетки совместно культивировали с ганглиями задних корешков (DRG), и наблюдали, происходит ли миелинизация.It was examined whether the neuronal regeneration-promoting candidate cells obtained in Example 3 had the ability to myelinate peripheral nerves. More specifically, differentiated neuronal regeneration-promoting candidate cells were co-cultured with dorsal root ganglia (DRG) and observed whether myelination occurred.

Клетки ганглиев задних корешков (DRG), извлеченные у крыс, покупали у Lonza (крысиные клетки ганглиев задних корешков, Cat# R-DRG-505, Lonza, Швейцария). Кандидатные клетки совместно культивировали с ганглиями задних корешков. Клетки DRG культивировали с использованием культуральной среды, предоставленной Lonza (среда для выращивания первичных нейронов (PNGM), Cat# CC-4461).Dorsal root ganglion (DRG) cells extracted from rats were purchased from Lonza (rat dorsal root ganglion cells, Cat# R-DRG-505, Lonza, Switzerland). Candidate cells were cocultured with dorsal root ganglia. DRG cells were cultured using culture medium provided by Lonza (Primary Neuron Growth Medium (PNGM), Cat# CC-4461).

Культуральную среду заменяли каждые 3 дня. В результате совместного культивирования кандидатных клеток с ганглиями задних корешков было подтверждено цитоморфологическое достижение миелинизации в некоторых клетках (фиг. 10).The culture medium was replaced every 3 days. Co-culture of candidate cells with dorsal root ganglia confirmed cytomorphological achievement of myelination in some cells (Fig. 10).

Пример 5. Второй скрининг нейрональных способствующих регенерации клеток при помощи анализа экспрессии CD маркеровExample 5: Second Screen for Neuronal Promoting Cell Regeneration Using CD Marker Expression Analysis

Всего была проанализирована экспрессия 242 CD маркеров в T-MSC-1-1 (происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках 1), T-MSC-1-2 (происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках 2), T-MSC-1-3 (происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках 3) и T-MSC-1-4 (происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках 4), в которых миелинизация была подтверждена цитоморфологически среди нейрональных способствующих регенерации клеток-кандидатов из примера 4, и среди нейрональных способствующих регенерации клеток, дифференцированных из них.In total, the expression of 242 CD markers was analyzed in T-MSC-1-1 (tonsil-derived mesenchymal stem cells 1), T-MSC-1-2 (tonsil-derived mesenchymal stem cells 2), T-MSC-1- 3 (tonsil-derived mesenchymal stem cells 3) and T-MSC-1-4 (tonsil-derived mesenchymal stem cells 4), in which myelination was confirmed cytomorphologically among the neuronal regeneration-promoting cell candidates from Example 4, and among the neuronal promoting the regeneration of cells differentiated from them.

Для анализа CD маркеров собирали 3x107 целевых клеток. Клетки промывали DPBS и затем центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут. После удаления супернатанта и одной промывки DPBS проводили центрифугирование, а оставшийся осадок ресуспендировали в 30 мл FACS буфера. 100 мкл клеточной суспензии (1x105 клеток) высевали в каждую лунку круглодонного 96-луночного планшета. Затем, 10 мкл первичных антител CD маркеров добавили в каждую лунку 96-луночного планшета. После 30 минут прохождения реакции на льду с приглушенным светом каждую лунку два раза промыли 100 мкл FACS буфера и затем центрифугировали при 300 g в течение 5 минут. После удаления супернатанта и добавления 200 мкл FACS буфера к каждой лунке провели центрифугирование при 300 g в течение 5 минут. Вторичные антитела были приготовлены в FACS буфере в соотношении 1:200 (1.25 мкг/мл). После завершения центрифугирования супернатант удалили, а затем добавили в каждую лунку 100 мкл приготовленных вторичных антител. После проведения реакции в течение 20-30 минут на льду при приглушенном свете каждую лунку промыли 100 мкл FACS буфера, а затем провели центрифугирование при 300 g в течение 5 минут. После удаления супернатанта целевые клетки промыли, добавив 200 мкл FACS буфера в каждую лунку. Промывку повторили дважды. После промывки клетки ресуспендировали, добавив 200 мкл FACS буфера в каждую лунку, и исследовали экспрессию CD маркеров в целевых клетках с помощью проточной цитометрии или FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток).For CD marker analysis, 3x10 7 target cells were collected. Cells were washed with DPBS and then centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. After removal of the supernatant and one wash with DPBS, centrifugation was performed and the remaining pellet was resuspended in 30 ml FACS buffer. 100 µl of cell suspension (1x10 5 cells) was seeded into each well of a round-bottomed 96-well plate. Next, 10 μl of CD marker primary antibodies were added to each well of a 96-well plate. After 30 minutes of reaction on ice with dimmed light, each well was washed twice with 100 μl of FACS buffer and then centrifuged at 300 g for 5 minutes. After removing the supernatant and adding 200 μl of FACS buffer to each well, centrifugation was performed at 300 g for 5 minutes. Secondary antibodies were prepared in FACS buffer at a ratio of 1:200 (1.25 μg/ml). After centrifugation was completed, the supernatant was removed and then 100 μL of the prepared secondary antibodies was added to each well. After the reaction was carried out for 20-30 minutes on ice under dim light, each well was washed with 100 μl of FACS buffer, and then centrifuged at 300 g for 5 minutes. After removing the supernatant, the target cells were washed by adding 200 μL FACS buffer to each well. The washing was repeated twice. After washing, the cells were resuspended by adding 200 μl of FACS buffer to each well, and the expression of CD markers in the target cells was examined using flow cytometry or FACS (fluorescence-activated cell sorting).

Результат сравнения экспрессии CD маркеров в индуцированных нейрональных способствующих регенерации клетках с использованием тепловых карт показан на фиг. 2. Как видно на фиг. 2, нейрональные способствующие регенерации клетки (NRPC) и мезенхимальные стволовые клетки (MSC) продемонстрировали сходные профили экспрессии CD маркеров, но показали различие в профилях экспрессии некоторых маркеров.The result of comparing the expression of CD markers in induced neuronal regeneration-promoting cells using heat maps is shown in FIG. 2. As can be seen in FIG. 2, neuronal regeneration-promoting cells (NRPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) showed similar expression profiles of CD markers, but showed differences in the expression profiles of some markers.

Профиль экспрессии CD маркеров мезенхимальных стволовых клеток (MSC) T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4 и нейрональных способствующих регенерации клеток (NRPC) сравнили для того, чтобы выбрать CD маркеры, экспрессия которых повышалась или понижалась, в качестве маркеров дифференцировки нейрональных способствующих регенерации клеток. CD маркеры, экспрессия которых повышается или понижается, показаны на фиг. 3.The CD expression profile of mesenchymal stem cell (MSC) markers T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4 and neuronal regeneration-promoting cells (NRPC) was compared in order to select CD markers whose expression was increased or decreased as differentiation markers of neuronal regeneration-promoting cells. CD markers that are upregulated or downregulated are shown in FIG. 3.

Как видно на фиг. 3a, CD маркеры, экспрессия которых повышается в нейрональных способствующих регенерации клетках происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4 (по меньшей мере, в трех из четырех NRPC) по сравнению с происходящими из небной железы мезенхимальными стволовыми клетками - это CD10, CD39, CD106, CD112, CD121a, CD338 и т.д. И, как видно на фиг. 3b, CD маркеры, экспрессия которых понижается (по меньшей мере в трех из четырех NRPC) - это CD26, CD54, CD126, CD141 и т.д.As can be seen in FIG. 3a, CD markers whose expression is increased in neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4 (at least , in three out of four NRPCs) compared to palatal gland-derived mesenchymal stem cells are CD10, CD39, CD106, CD112, CD121a, CD338, etc. And, as can be seen in Fig. 3b, CD markers downregulated (in at least three of four NRPCs) are CD26, CD54, CD126, CD141, etc.

Результат сравнения повышения и понижения CD маркеров в происходящих из небной железы нейрональных способствующих регенерации клетках показан на фиг. 4.The result of comparing the increase and decrease of CD markers in palatine gland-derived neuronal regeneration-promoting cells is shown in FIG. 4.

Как видно на фиг. 4, экспрессия 12 CD маркеров была повышена, и экспрессия 9 CD маркеров была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1. И, экспрессия 8 CD маркеров была повышена, и экспрессия 9 CD маркеров была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-2. Экспрессия 40 CD маркеров была повышена, и экспрессия 3 CD маркеров была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-3. Экспрессия 17 CD маркеров была повышена, и экспрессия 6 CD маркеров была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-4.As can be seen in FIG. 4, the expression of 12 CD markers was increased and the expression of 9 CD markers was decreased in T-MSC-1-1-derived neuronal pro-regeneration cells. And, the expression of 8 CD markers was increased and the expression of 9 CD markers was decreased in T-MSC-1-2-derived neuronal pro-regeneration cells. The expression of 40 CD markers was increased and the expression of 3 CD markers was decreased in T-MSC-1-3-derived neuronal pro-regeneration cells. The expression of 17 CD markers was increased and the expression of 6 CD markers was decreased in T-MSC-1-4-derived neuronal pro-regeneration cells.

Из приведенных выше результатов был проведен поиск маркеров CD, экспрессия которых, как правило, повышается или понижается в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4. Были отобраны следующие маркеры:From the above results, a search was made for CD markers whose expression tends to be increased or decreased in neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4. The following markers were selected:

- CD маркеры, экспрессия которых, как правило, повышается: CD106, CD112 и CD121a.- CD markers, the expression of which is usually increased: CD106, CD112 and CD121a.

- CD маркеры, экспрессия которых, как правило, понижается: CD26 и CD141.- CD markers, the expression of which is usually decreased: CD26 and CD141.

Профиль CD маркеров, экспрессия которых повышается или понижается, также наблюдался в нейрональных способствующих регенерации клетках, дифференцированных из происходящих из жировой ткани мезенхимальных стволовых клеток из примера 1-2.The profile of CD markers that are upregulated or downregulated was also observed in neuronal pro-regeneration cells differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells from Example 1-2.

Результат CD-скрининга CD маркеров, экспрессия которых повышается или понижается в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4, показана на фиг. 5.Result of CD screening for CD markers whose expression is increased or decreased in neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1- 4 is shown in FIG. 5.

Как видно на фиг. 5, уровень экспрессии CD маркеров, экспрессия которых, как правило, повышается в нейрональных способствующих регенерации клетках, т.е. CD121a, CD106 и CD112, повышается на 10% или больше после дифференцировки. В то же время, уровень экспрессии маркеров, экспрессия которых, как правило, понижается, т.е. CD26 и CD141, понижается примерно на 9% или больше. Этот результат говорит о том, что маркеры CD121a, CD106, CD112, CD26 и CD141, экспрессия которых изменяется, могут использоваться в качестве маркеров дифференцировки нейрональных способствующих регенерации клеток. В частности, CD121a, CD106 и CD112 могут использоваться в качестве типичных маркеров дифференцировки.As can be seen in FIG. 5, the level of expression of CD markers, the expression of which, as a rule, increases in neuronal cells promoting regeneration, i.e. CD121a, CD106 and CD112, increases by 10% or more after differentiation. At the same time, the level of expression of markers, the expression of which, as a rule, decreases, i.e. CD26 and CD141 are reduced by approximately 9% or more. This result suggests that the markers CD121a, CD106, CD112, CD26 and CD141, whose expression is altered, can be used as differentiation markers of neuronal regeneration-promoting cells. In particular, CD121a, CD106 and CD112 can be used as typical differentiation markers.

6-1. Сравнение экспрессии маркеров ко-экспрессии CD121a, CD106 и CD1126-1. Comparison of expression of co-expression markers CD121a, CD106 and CD112

Экспрессия маркеров CD121a, CD106 и CD112, как правило, повышается в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4 на 10% или больше по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, что является наиболее выраженным признаком нейрональных способствующих регенерации клеток. Результат сравнения экспрессии маркеров CD121a, CD106 и CD112 в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4, показан на фиг. 6.Expression of markers CD121a, CD106 and CD112 is generally increased in neuronal pro-regeneration cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1- 4 by 10% or more compared to mesenchymal stem cells, which is the most pronounced feature of neuronal regeneration-promoting cells. The result of comparison of the expression of markers CD121a, CD106 and CD112 in neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4 is shown in fig. 6.

Как видно на фиг. 6, экспрессия маркеров CD121a, CD106 и CD112 была значительно повышена в нейрональных способствующих регенерации клетках (NRPC) по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками (T-MSC).As can be seen in FIG. 6, the expression of markers CD121a, CD106 and CD112 was significantly increased in neuronal regeneration promoting cells (NRPC) compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells (T-MSC).

6-2. Сравнение экспрессии маркеров ко-экспрессии CD26 и CD1416-2. Comparison of expression of co-expression markers CD26 and CD141

Экспрессия маркеров CD26 и CD141, как правило, понижается в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4. Результат сравнения экспрессии CD маркеров в нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 и T-MSC-1-4, показан на фиг. 7.Expression of CD26 and CD141 markers is generally downregulated in neuronal pro-regeneration cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4. The result of comparing the expression of CD markers in neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-1, T-MSC-1-2, T-MSC-1-3 and T-MSC-1-4 is shown in FIG. 7.

Как видно на фиг. 7, экспрессия маркеров CD26 и CD141 была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.As can be seen in FIG. 7, expression of the markers CD26 and CD141 was reduced in neuronal pro-regeneration cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells.

6-3. Сравнение профилей экспрессии CD маркеров6-3. Comparison of expression profiles of CD markers

Для того, чтобы сравнить профиль экспрессии CD маркеров в происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках и нейрональных способствующих регенерации клетках, были построены тепловые карты на основе результатов сравнения экспрессии CD маркеров ко-экспрессии из примеров 6-1 и 6-2. Результат показан на фиг. 8.In order to compare the expression profile of CD markers in tonsil-derived mesenchymal stem cells and neuronal pro-regeneration cells, heat maps were generated based on the expression comparison results of the co-expression CD markers from Examples 6-1 and 6-2. The result is shown in Fig. 8.

Как показано на фиг. 8, нейрональные способствующие регенерации клетки показали разную экспрессию маркеров ко-экспрессии с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками.As shown in FIG. 8, neuronal regeneration-promoting cells showed differential expression of co-expression markers with tonsil-derived mesenchymal stem cells.

6-4. Средняя экспрессия CD маркеров ко-экспрессии6-4. Average expression of CD co-expression markers

Для того, чтобы изучить, сохраняется ли профиль экспрессии CD маркеров в происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клетках и нейрональных способствующих регенерации клетках после замораживания клеток, была исследована экспрессия CD маркеров ко-экспрессии в живых клетках, замороженных клетках и размороженных клетках. Результат показан на фиг. 11.To examine whether the expression profile of CD markers in tonsil-derived mesenchymal stem cells and neuronal pro-regeneration cells is maintained after cell freezing, the expression of CD markers was co-expressed in living cells, frozen cells and thawed cells. The result is shown in Fig. eleven.

Как видно на фиг. 11, экспрессия CD106, CD121a и CD112 была повышена, а экспрессия CD26 и CD141 была понижена в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины мезенхимальными стволовыми клетками даже после замораживания. Нейрональные способствующие регенерации клетки продемонстрировали разную экспрессию маркеров ко-экспрессии из происходящих из небной миндалины мезенхимальных стволовых клеток независимо от замораживания.As can be seen in FIG. 11, the expression of CD106, CD121a and CD112 was increased, and the expression of CD26 and CD141 was decreased in neuronal regeneration-promoting cells compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells even after freezing. Neuronal regeneration-promoting cells showed differential expression of co-expression markers from tonsil-derived mesenchymal stem cells regardless of freezing.

Пример 7. Действие нейрональных способствующих регенерации клеток на рост нейритовExample 7 Effect of Neuronal Promoting Cell Regeneration on Neurite Outgrowth

Нейрит (или отросток нейрона), выступающий из тела нейрона, как известно, вовлечен в транспорт веществ, необходимых для роста и регенерации аксонов, нейромедиаторов и факторов роста нервов и т.д. (L McKerracher et al., Spinal Cord Repair: Strategies to Promote Axon Regeneration, Neurobiol Dis, 2001). Был проведен анализ удлинения (роста) нейритов для сравнения роста нейритов в нейрональных способствующих регенерации клетках настоящего изобретения.The neurite (or neuron outgrowth) projecting from the neuron body is known to be involved in the transport of substances necessary for axonal growth and regeneration, neurotransmitters and nerve growth factors, etc. (L McKerracher et al., Spinal Cord Repair: Strategies to Promote Axon Regeneration, Neurobiol Dis, 2001). A neurite extension assay was performed to compare neurite growth in the neuronal regeneration-promoting cells of the present invention.

Клетки N1E-115 (клетки нейробластомы мыши, ATCC, США) культивировали и высевали на микропористый фильтр (набор для анализа роста нейритов, Millipore, США). Высеянные клетки культивировали в течение 48 часов в культуральной среде, из которой были собраны нейрональные способствующие регенерации клетки или стволовые клетки. Оптическую плотность измеряли после окрашивания нейритов, проросших через мелкопористый фильтр. В результате анализа роста нейритов было установлено, что культура нейрональных способствующих регенерации клеток регулирует или стимулирует рост нейритов (аксонов) в клетках N1E-115 (мышиная нейробластома).N1E-115 cells (mouse neuroblastoma cells, ATCC, USA) were cultured and plated on a microporous filter (neurite outgrowth assay kit, Millipore, USA). The seeded cells were cultured for 48 hours in culture medium from which neuronal pro-regeneration cells or stem cells were collected. Optical density was measured after staining neurites that grew through a fine-pored filter. As a result of the neurite outgrowth assay, it was found that the culture of neuronal regeneration-promoting cells regulates or stimulates the outgrowth of neurites (axons) in N1E-115 (murine neuroblastoma) cells.

Сравнили рост нейритов в N1E-115 клетках, культивированных с нейрональными способствующими регенерации клетками, происходящими от T-MSC-1-2. Результат показан на фиг. 9 (NRPC: нейрональные способствующие регенерации клетки, происходящие из T-MSC-1-2, T-MSC: T-MSC-1-2, Отрицательный контроль: группа отрицательный контроль, Положительный контроль: группа положительный контроль). Большое количество нейритов наблюдалось в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины стволовыми клетками, и оптическая плотность была также повышена в нейрональных способствующих регенерации клетках по сравнению с происходящими из небной миндалины стволовыми клетками (Отрицательный контроль: пористый фильтр (мембранная вкладка, предоставленная вместе с набором для роста нейритов) был покрыт BSA, и N1E-115 клетки культивировали в DMEM (+ 20 мкг/мл гентамицина). Положительный контроль: пористый фильтр был покрыт ламинином, и N1E-115 клетки культивировали в DMEM (+ 20 мкг/мл гентамицина + 1 мкг/мл BSA). NRPC и T-MSC группы: пористый фильтр был покрыт BSA, и N1E-115 клетки культивировали в культуральной среде NRPC или T-MSC).Neurite outgrowth in N1E-115 cells cultured with neuronal regeneration-promoting T-MSC-1-2-derived cells was compared. The result is shown in Fig. 9 (NRPC: neuronal regeneration-promoting cells derived from T-MSC-1-2, T-MSC: T-MSC-1-2, Negative control: negative control group, Positive control: positive control group). A high number of neurites was observed in neuronal pro-regeneration cells compared to tonsil-derived stem cells, and optical density was also increased in neuronal pro-regeneration cells compared to tonsil-derived stem cells (Negative control: porous filter (membrane insert provided together with the neurite growth kit) was coated with BSA, and N1E-115 cells were cultured in DMEM (+ 20 μg/ml gentamicin). Positive control: the porous filter was coated with laminin, and N1E-115 cells were cultured in DMEM (+ 20 μg/ml). ml gentamicin + 1 μg/ml BSA) NRPC and T-MSC groups: the porous filter was coated with BSA, and N1E-115 cells were cultured in NRPC or T-MSC culture medium).

Пример 8. Количественное определение цитокинов нейрональных способствующих регенерации клетокExample 8. Quantitative determination of neuronal cytokines promoting cell regeneration

Экспрессию 507 цитокинов анализировали в T-MSC-1-1 и T-MSC-1-2, которые продемонстрировали наиболее выраженную миелинизацию в примере 4, и нейрональных способствующих регенерации клетках, дифференцированных из них.The expression of 507 cytokines was analyzed in T-MSC-1-1 and T-MSC-1-2, which showed the most pronounced myelination in Example 4, and neuronal pro-regeneration cells differentiated from them.

Целевые клетки культивировали для анализа цитокинов. Клетки высевали во флаконы и культивировали в течение 3-4 дней. Когда клетки заполняли 80% или больше площади флакона, культуральную среду удаляли, а клетки дважды промывали DPBS. После промывки, культуральную среду заменяли на DMEM (забуференный фосфатом Дульбекко физиологический раствор), не содержащую FBS (эмбриональную бычью сыворотку), цитокины и т.п. для того, чтобы исключить влияние цитокинов. Культуральную среду целевых клеток собирали после культивирования в течение 30 часов.Target cells were cultured for cytokine analysis. Cells were seeded into flasks and cultured for 3-4 days. When cells filled 80% or more of the flask area, the culture medium was removed and the cells were washed twice with DPBS. After washing, the culture medium was replaced with DMEM (Dulbecco's phosphate buffered saline) free of FBS (fetal bovine serum), cytokines, etc. in order to exclude the influence of cytokines. The culture medium of the target cells was collected after culturing for 30 hours.

Собранную культуральную среду центрифугировали при 3600 об/мин в течение 30 минут. Супернатант переносили в центрифужную пробирку, снабженную целлюлозной мембраной и концентрировали с помощью центрифугирования при 3600 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования кондиционированную среду, пропущенную через разделительную мембрану, отбрасывали и добавляли такое же количество (объем) культуры. Центрифугирование продолжалось до тех пор, пока объем концентрированной культуры был снижен до 1 мл или ниже, и концентрированную культуру характеризовали количественно методом Бредфорда. Концентрированная культура была отрегулирована до конечной концентрации 1 мг/мл путем смешивания с DMEM.The collected culture medium was centrifuged at 3600 rpm for 30 minutes. The supernatant was transferred to a centrifuge tube equipped with a cellulose membrane and concentrated by centrifugation at 3600 rpm for 20 minutes. After centrifugation, the conditioned medium passed through the separation membrane was discarded and the same amount (volume) of culture was added. Centrifugation was continued until the volume of the concentrated culture was reduced to 1 ml or less, and the concentrated culture was characterized quantitatively by the Bradford method. The concentrated culture was adjusted to a final concentration of 1 mg/mL by mixing with DMEM.

Реакция на мембране, покрытой антителами, способными детектировать 507 цитокинов (набор для анализа цитокинов, RayBiotech, США), проходила в течение 30 минут до обработки блокирующим буфером. После удаления блокирующего буфера оставшегося на мембране и замены концентрированной культуры реакция на мембране проходила в течение ночи в холодильнике. Мембрану промывали 7 раз промывочным буфером. После добавления HRP-конъюгированного раствора стрептавидина мебрану оставляли для прохождения реакции при комнатной температуре в течение 2 часов. После удаления HRP-конъюгированного раствора стрептавидина мембрану промыли 7 раз промывочным буфером. После промывки мембрану пропитывали ECL (для увеличения хемилюминесценции) реагентом, и подтверждали экспрессию цитокинов с помощью визуализирующего устройства.The reaction on a membrane coated with antibodies capable of detecting 507 cytokines (Cytokine Assay Kit, RayBiotech, USA) was carried out for 30 minutes before treatment with blocking buffer. After removing the blocking buffer remaining on the membrane and replacing the concentrated culture, the reaction on the membrane occurred overnight in the refrigerator. The membrane was washed 7 times with wash buffer. After adding the HRP-conjugated streptavidin solution, the membrane was allowed to react at room temperature for 2 hours. After removing the HRP-conjugated streptavidin solution, the membrane was washed 7 times with wash buffer. After washing, the membrane was soaked in ECL (to enhance chemiluminescence) reagent, and cytokine expression was confirmed using an imaging device.

Результат сравнения экспрессии цитокинов в нейрональных способствующих регенерации клетках с использованием тепловых карт показан на фиг. 12. Как видно на фиг. 12, нейрональные способствующие регенерации клетки и происходящие из небной миндалины мезенхимальные стволовые клетки показали разные профили экспрессии.The result of comparing cytokine expression in neuronal regeneration-promoting cells using heat maps is shown in FIG. 12. As can be seen in FIG. 12, neuronal regeneration-promoting cells and tonsil-derived mesenchymal stem cells showed different expression profiles.

Цитокины, экспрессия которых повышается в мезенхимальных стволовых клетках и нейрональных способствующих регенерации клетках, происходящих из T-MSC-1-1 и T-MSC-1-2, показаны на фиг. 12.Cytokines that are upregulated in T-MSC-1-1 and T-MSC-1-2-derived mesenchymal stem cells and neuronal pro-regeneration cells are shown in FIG. 12.

- В 1,5 раза или больше: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-4, BIK, BMPR-IA / ALK-3, CCL14 / HCC-1 / HCC-3, CCR1, EN-RAGE, эотаксин-3 / CCL26, FGF R4, FGF-10 / KGF-2, FGF-19, FGF-21, Flt-3 лиганд, фоллистатин-подобный 1, GASP-1 / WFIKKNRP, GCP-2 / CXCL6, GFR альфа-3, GREMLIN, GRO-a, HGF, HRG-бета 1, I-309, ICAM-1, IFN-альфа / бета R2, IGFBP-2 , IGF-I, IL-4, IL-5 R альфа, IL-10 R бета, IL-12 R бета 1, IL-13 R альфа 2, IL-20 R бета, IL-22 BP, IL-23 R, FACX, LIF, LIF R альфа, LIGHT / TNFSF14, липокалин-1, липокалин-2, LRP-1, MCP-4 / CCL13, M-CSF, MDC, MFG-E8, MICA, MIP-1b, MIP-1d, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-12, MMP-16 / MT3-MMP, MMP-25 / MT6-MMP, NAP-2, NeuroD1, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-C, PDGF-D, пентаксин3 / TSG-14, персефин, PF4 / CXCL4, PLUNC, P-селектин, RANTES, RELM бета, ROBO4, S100A10, SAA, SCF, SIGIRR, Smad 1, Smad 5, Smad 8, Prdx6, Tarc, TCCR / WSX-1, TGF-бета 3, TGF-бета 5, Tie-2, TIMP-1, TROY / TNFRSF19, uPA.- 1.5 times or more: angiopoietin-1, angiopoietin-4, BIK, BMPR-IA / ALK-3, CCL14 / HCC-1 / HCC-3, CCR1, EN-RAGE, eotaxin-3 / CCL26, FGF R4, FGF-10/KGF-2, FGF-19, FGF-21, Flt-3 ligand, follistatin-like 1, GASP-1/WFIKKNRP, GCP-2/CXCL6, GFR alpha-3, GREMLIN, GRO-a , HGF, HRG-beta 1, I-309, ICAM-1, IFN-alpha/beta R2, IGFBP-2, IGF-I, IL-4, IL-5 R alpha, IL-10 R beta, IL-12 R beta 1, IL-13 R alpha 2, IL-20 R beta, IL-22 BP, IL-23 R, FACX, LIF, LIF R alpha, LIGHT/TNFSF14, lipocalin-1, lipocalin-2, LRP-1 , MCP-4 / CCL13, M-CSF, MDC, MFG-E8, MICA, MIP-1b, MIP-1d, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-12 , MMP-16 / MT3-MMP, MMP-25 / MT6-MMP, NAP-2, NeuroD1, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-C, PDGF-D, pentaxin3 / TSG-14, persephine, PF4 / CXCL4 , PLUNC, P-selectin, RANTES, RELM beta, ROBO4, S100A10, SAA, SCF, SIGIRR, Smad 1, Smad 5, Smad 8, Prdx6, Tarc, TCCR/WSX-1, TGF-beta 3, TGF-beta 5 , Tie-2, TIMP-1, TROY / TNFRSF19, uPA.

- В 1,75 раза или больше: ангиопоэтин-1, ангиопоэтин-4, BIK, CCR1, FGF-21, GRO-a, HGF, IL-10 R бета, IL-12 R бета 1, MCP-4 / CCL13, MIP-1b, MIP-1d, NeuroD1, PDGF-C, Prdx6, TIMP-1, uPA.- 1.75 times or more: angiopoietin-1, angiopoietin-4, BIK, CCR1, FGF-21, GRO-a, HGF, IL-10 R beta, IL-12 R beta 1, MCP-4 / CCL13, MIP-1b, MIP-1d, NeuroD1, PDGF-C, Prdx6, TIMP-1, uPA.

- В 2 раза или больше: BIK, GRO-a, HGF, MCP-4 / CCL13, uPA.- 2 times or more: BIK, GRO-a, HGF, MCP-4 / CCL13, uPA.

Итак, авторы настоящего изобретения получили нейрональные способствующие регенерации клетки из мезенхимальных стволовых клеток, происходящих из ткани небной миндалины и жировой ткани, изучили их профили экспрессии с помощью анализа CD маркеров. Кроме того, они установили нейрональное регенерационное действие нейрональных способствующих регенерации клеток. Это говорит о том, что ткани небной миндалины, которые выкидываются как медицинские отходы, могут использоваться для получения клеток, обладающих нейрональным регенерационным действием. Нейрональные способствующие регенерации клетки настоящего изобретения могут различным образом использоваться в области нейрональной регенерации.Thus, the authors of the present invention obtained neuronal regeneration-promoting cells from mesenchymal stem cells derived from tonsil and adipose tissue and studied their expression profiles using CD marker analysis. In addition, they established the neuronal regenerative effect of neuronal cells promoting regeneration. This suggests that tonsil tissue that is discarded as medical waste could be used to produce cells with neuronal regenerative effects. The neuronal regeneration-promoting cells of the present invention can be used in various ways in the field of neuronal regeneration.

Хотя отдельные примеры осуществления настоящего изобретения описаны, средние специалисты в данной области техники могут по-разному модифицировать и изменить настоящее изобретение посредством добавления, изменения, опущения и т.д. в пределах объема настоящего изобретения, определенного прилагаемыми пунктами формулы изобретения.Although specific embodiments of the present invention have been described, those of ordinary skill in the art may modify and change the present invention in various ways by addition, alteration, omission, etc. within the scope of the present invention as defined by the appended claims.

Claims (20)

1. Способ скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенерационной активностью, включающий:1. A method for screening neuronal cells derived from mesenchymal stem cells that promote regeneration and have neuronal regenerative activity, comprising: i) стадию получения клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток; иi) the step of obtaining cells differentiated from mesenchymal stem cells; And ii) стадию скрининга клеток, в которых один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD121a, CD106 и CD112, является повышенным из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки. ii) a step of screening cells in which one or more markers selected from the group consisting of CD121a, CD106 and CD112 are elevated among the differentiated cells of step i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells. 2. Способ скрининга происходящих из мезенхимальных стволовых клеток способствующих регенерации нейрональных клеток, обладающих нейрональной регенерационной активностью, включающий:2. A method for screening neuronal cells derived from mesenchymal stem cells that promote regeneration and have neuronal regenerative activity, comprising: i) стадию получения клеток, дифференцированных из мезенхимальных стволовых клеток; иi) the step of obtaining cells differentiated from mesenchymal stem cells; And ii) стадию скрининга клеток, в которых один или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD26 и CD141, является пониженным из числа дифференцированных клеток стадии i) по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками до дифференцировки.ii) a step of screening cells in which one or more markers selected from the group consisting of CD26 and CD141 are reduced from the differentiated cells of step i) compared to pre-differentiation mesenchymal stem cells. 3. Способ скрининга нейрональных способствующих регенерации клеток по п. 1 или 2, согласно которому мезенхимальные стволовые клетки получают из небной миндалины или жировой ткани.3. A method for screening neuronal regeneration-promoting cells according to claim 1 or 2, according to which mesenchymal stem cells are obtained from the palatine tonsil or adipose tissue. 4. Способ скрининга нейрональных способствующих регенерации клеток по п. 1 или 2, согласно которому дифференцированные клетки стадии i) дифференцируются из нейросфер, образованных культивируемыми мезенхимальными стволовыми клетками.4. A method for screening neuronal regeneration-promoting cells according to claim 1 or 2, according to which the differentiated cells of stage i) are differentiated from neurospheres formed by cultured mesenchymal stem cells. 5. Способ скрининга нейрональных способствующих регенерации клеток по п. 1 или 2, согласно которому нейрональная регенерационная активность включает миелинизацию периферических нервов.5. A method for screening neuronal regeneration-promoting cells according to claim 1 or 2, wherein the neuronal regenerative activity includes myelination of peripheral nerves. 6. Нейрональная способствующая регенерации клетка, индуцированная из происходящей из небных миндалин мезенхимальной стволовой клетки, при этом эта нейрональная способствующая регенерации клетка имеет следующие характеристики:6. A neuronal regeneration-promoting cell induced from a tonsil-derived mesenchymal stem cell, wherein the neuronal regeneration-promoting cell has the following characteristics: a) экспрессия маркеров CD121a, CD106 и CD112 является повышенной по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки; иa) the expression of markers CD121a, CD106 and CD112 is increased compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells; And b) экспрессия маркеров CD26 и CD141 является пониженной по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки.b) the expression of markers CD26 and CD141 is reduced compared to tonsil-derived mesenchymal stem cells. 7. Нейрональная способствующая регенерации клетка по п. 6, при этом в нейрональной способствующей регенерации клетке экспрессия маркера CD121a является повышенной на 30% или более по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки.7. The neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6, wherein in the neuronal regeneration-promoting cell, the expression of the CD121a marker is increased by 30% or more compared with the tonsil-derived mesenchymal stem cell. 8. Нейрональная способствующая регенерации клетка по п. 6, при этом в нейрональной способствующей регенерации клетке экспрессия маркера CD106 является повышенной на 5% или более по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки.8. The neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6, wherein in the neuronal regeneration-promoting cell, the expression of the CD106 marker is increased by 5% or more compared with the tonsil-derived mesenchymal stem cell. 9. Нейрональная способствующая регенерации клетка по п. 6, при этом в нейрональной способствующей регенерации клетке экспрессия маркера CD112 является повышенной на 10% или более по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки.9. The neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6, wherein in the neuronal regeneration-promoting cell, the expression of the CD112 marker is increased by 10% or more compared with the tonsil-derived mesenchymal stem cell. 10. Нейрональная способствующая регенерации клетка по п. 6, при этом в нейрональной способствующей регенерации клетке экспрессия маркера CD26 является пониженной на 5% или более по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки. 10. The neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6, wherein in the neuronal regeneration-promoting cell, the expression of the CD26 marker is reduced by 5% or more compared with the tonsil-derived mesenchymal stem cell. 11. Нейрональная способствующая регенерации клетка по п. 6, при этом в нейрональной способствующей регенерации клетке экспрессия маркера CD141 является пониженной на 5% или более по сравнению с происходящей из небной миндалины мезенхимальной стволовой клетки.11. The neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6, wherein in the neuronal regeneration-promoting cell, the expression of the CD141 marker is reduced by 5% or more compared with the tonsil-derived mesenchymal stem cell. 12. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения неврологического заболевания, содержащая нейрональную способствующую регенерации клетку по п. 6 в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель, где неврологическое заболевание является одним или более заболеваниями, выбранными из группы, состоящей из нейропатии Шарко-Мари-Тута, диабетической периферической нейропатии, повреждения спинного мозга, амиотрофического латерального склероза, туннельного синдрома запястья, детского паралича, проказы, мышечной дистрофии, полимиозита и миастении гравис.12. A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of a neurological disease, containing the neuronal regeneration-promoting cell according to claim 6 as an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier, where the neurological disease is one or more diseases selected from the group consisting of Charcot-Marie-Tooth neuropathy , diabetic peripheral neuropathy, spinal cord injury, amyotrophic lateral sclerosis, carpal tunnel syndrome, infantile paralysis, leprosy, muscular dystrophy, polymyositis and myasthenia gravis. 13. Фармацевтическая композиция по п. 12, причем нейрональная регенерационная активность включает миелинизацию периферических нервов.13. The pharmaceutical composition according to claim 12, wherein the neuronal regenerative activity includes myelination of peripheral nerves. 14. Применение нейрональной способствующей регенерации клетки по п. 6 для лечения неврологического заболевания, где неврологическое заболевание является одним или более заболеваниями, выбранными из группы, состоящей из нейропатии Шарко-Мари-Тута, диабетической периферической нейропатии, повреждения спинного мозга, амиотрофического латерального склероза, туннельного синдрома запястья, детского паралича, проказы, мышечной дистрофии, полимиозита и миастении гравис.14. The use of a neuronal cell regeneration-promoting cell according to claim 6 for the treatment of a neurological disease, wherein the neurological disease is one or more diseases selected from the group consisting of Charcot-Marie-Tooth neuropathy, diabetic peripheral neuropathy, spinal cord injury, amyotrophic lateral sclerosis, carpal tunnel syndrome, infantile paralysis, leprosy, muscular dystrophy, polymyositis and myasthenia gravis.
RU2023116247A 2021-01-12 2022-01-12 Method for screening regeneration-promoting neuronal cells having neuronal regenerative activity RU2819367C1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0003879 2021-01-12
KR10-2022-0004077 2022-01-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2819367C1 true RU2819367C1 (en) 2024-05-20

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151725A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Regenerative sera cells and mesenchymal stem cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013151725A1 (en) * 2012-04-05 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Regenerative sera cells and mesenchymal stem cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELLATOZ THERAPEUTICS, INC. A new era of cell therapies for intractable diseases (веб. страница https://www.nature.com/articles/d43747-020-00921-8 от 17.06.2020). ПЕТРОВА Е.С., Восстановление поврежденного нерва с помощью клеточной терапии (фундаментальные аспекты), Acta Naturae (русскоязычная версия), 2015, no 3(26), стр. 42-53. *
КОНОПЛЯННИКОВ М.А. и др., Клеточная терапия осложнений инсульта и позвоночно-спинномозговой травмы, Клиническая практика, 2015, no 3-4(23), стр. 48-58. UL HASSAN, ASHFAQ et al., Role of stem cells in treatment of neurological disorder, International journal of health sciences, 2009, vol. 3(2), pp. 227-233. FENG, YUPING et al., Differentiation of mesenchymal stem cells into neuronal cells on fetal bovine acellular dermal matrix as a tissue engineered nerve scaffold, Neural regeneration research, 2014, vol. 9(22), pp. 1968-1978. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. [Retracted] The Effects of Cytokines in Adipose Stem Cell‐Conditioned Medium on the Migration and Proliferation of Skin Fibroblasts In Vitro
US9034335B2 (en) Adult stem cell derived conditioned medium and/or adult stem cells for use in the therapeutic treatment of a tumor disease
US10357519B2 (en) Conditioned medium of liver progenitor cells
KR101686315B1 (en) A method for differentiation of tonsil-derived mesenchymal stem cell into schwann cells
KR101102483B1 (en) Human neural stem cells and pharmaceutical compositions for treating diseases of the central or peripheral nervous system and injury using the same
CN106916783A (en) Muscle stem cell extracorporeal culturing method and its application
US20130058903A1 (en) Stem-Cell Material and Method of Use
KR20120057784A (en) Composition for Enhancing Stability of Stem Cells
CN112384613B (en) Preparation method of nerve-like cells
IL309687A (en) Methods for obtaining cells extracted from muscle
EP4279919A1 (en) Method for screening neuronal regeneration promoting cells having neuronal regeneration activity
RU2819367C1 (en) Method for screening regeneration-promoting neuronal cells having neuronal regenerative activity
KR101656511B1 (en) Conditioned culture medium cultivated with adipose-derived stem cells having improved hair growth and hair loss prevention activity and method for preparing the same
KR100990436B1 (en) Chondrogenesis of mesenchymal stem cells using dkk-1 or sfrp-1
KR20220118709A (en) Composition for inducing proliferation and/or migration of mesenchymal stem cells
Yang et al. Transplantation of Schwann cells differentiated from adipose-derived stem cells modifies reactive gliosis after contusion brain injury in rats
KR102668084B1 (en) Method of Screening Neuronal Regeneration Promoting Cells with Nerve Regeneration Activity
Xu et al. Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
KR102384953B1 (en) Method for producing spheroid using matrilin-3 primed stem cells, and an substance for treating cartilage disease obtained thereof
CN116802501A (en) Screening method for neuron regeneration promoting cells having neuron regeneration activity
Barzilay et al. Adult stem cells for neuronal repair
KR20240000582A (en) Exosome production promoter and method for promoting exosome production
US10072247B2 (en) Composition comprising ischemic serum for promoting activation of stem cell and method for promoting activation of stem cell
CN110551204A (en) Preparation method of sub-totipotent mesenchymal stem cell secretin
JP2021512654A (en) Methods for Isolating Stem Cells from Tissues Under Thermal Conditions and Their Use
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务,不要输入任何密码和下载