RU2819269C2 - Polypeptide having phospholipase c activity, and use thereof - Google Patents
Polypeptide having phospholipase c activity, and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819269C2 RU2819269C2 RU2021120536A RU2021120536A RU2819269C2 RU 2819269 C2 RU2819269 C2 RU 2819269C2 RU 2021120536 A RU2021120536 A RU 2021120536A RU 2021120536 A RU2021120536 A RU 2021120536A RU 2819269 C2 RU2819269 C2 RU 2819269C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- phospholipase
- polypeptide
- set forth
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 75
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 82
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims abstract description 23
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 20
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims abstract description 17
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 52
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 11
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 claims description 10
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 6
- 102100032487 Beta-mannosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000011720 Lysophospholipase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims description 3
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010055059 beta-Mannosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 103
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 95
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 92
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 62
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 20
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 13
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 13
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010073128 phosphatidylcholine-specific phospholipase C Proteins 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 8
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 108010013563 Lipoprotein Lipase Proteins 0.000 description 7
- 102100022119 Lipoprotein lipase Human genes 0.000 description 7
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 4
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LSLIRHLIUDVNBN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N Ala-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JAQNUEWEJWBVAY-WBAXXEDZSA-N 0.000 description 2
- PEFFAAKJGBZBKL-NAKRPEOUSA-N Arg-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O PEFFAAKJGBZBKL-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N Asn-Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PBSQFBAJKPLRJY-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N Asn-Pro-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SUIJFTJDTJKSRK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N Asp-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GWTLRDMPMJCNMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N Asp-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XACXDSRQIXRMNS-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 2
- RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N Asp-Asn-Tyr Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 RYEWQKQXRJCHIO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N Asp-His-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N CRNKLABLTICXDV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N Asp-Ile-Met Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LDLZOAJRXXBVGF-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 2
- PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N Asp-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PLOKOIJSGCISHE-BYULHYEWSA-N 0.000 description 2
- LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N Gln-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LJEPDHWNQXPXMM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- OFPWCBGRYAOLMU-AVGNSLFASA-N Gln-Asp-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O OFPWCBGRYAOLMU-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- YJSCHRBERYWPQL-DCAQKATOSA-N Gln-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCC(=O)N)N YJSCHRBERYWPQL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N Glu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QYPKJXSMLMREKF-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N Glu-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IRXNJYPKBVERCW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JBRBACJPBZNFMF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N Gly-Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N CLNSYANKYVMZNM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N Ile-Val-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N ZYVTXBXHIKGZMD-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 2
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SQUFDMCWMFOEBA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N Leu-Trp-Phe Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=CC=C3)C(=O)O)N LFXSPAIBSZSTEM-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 2
- PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N Lys-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N PHHYNOUOUWYQRO-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 2
- DFXQCCBKGUNYGG-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DFXQCCBKGUNYGG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- GGNOBVSOZPHLCE-GUBZILKMSA-N Lys-Gln-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GGNOBVSOZPHLCE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N Lys-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGLAORUKDGRINI-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 2
- YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N Lys-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YFQSSOAGMZGXFT-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N Lys-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O RIPJMCFGQHGHNP-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MSSJHBAKDDIRMJ-SRVKXCTJSA-N Met-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MSSJHBAKDDIRMJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MYQCCQSMKNCNKY-KKUMJFAQSA-N Phe-His-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N MYQCCQSMKNCNKY-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RAGOJJCBGXARPO-XVSYOHENSA-N 0.000 description 2
- JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JSGWNFKWZNPDAV-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N RGMLUHANLDVMPB-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N Pro-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZPPVJIJMIKTERM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- QGLFRQCECIWXFA-RCWTZXSCSA-N Pro-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)O QGLFRQCECIWXFA-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N Pro-Phe-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 ZUZINZIJHJFJRN-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- 241000169446 Promethis Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N Ser-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O IOVHBRCQOGWAQH-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N Ser-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CO)N MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IUXGJEIKJBYKOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N Ser-Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CC1=CC=C(O)C=C1 HKHCTNFKZXAMIF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N Thr-Asn-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LXWZOMSOUAMOIA-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 2
- AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AHOLTQCAVBSUDP-PPCPHDFISA-N 0.000 description 2
- WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N Thr-Phe-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WVVOFCVMHAXGLE-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 2
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N Thr-Tyr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PELIQFPESHBTMA-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- HOJPPPKZWFRTHJ-PJODQICGSA-N Trp-Arg-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N HOJPPPKZWFRTHJ-PJODQICGSA-N 0.000 description 2
- PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N Trp-Arg-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O PNHABSVRPFBUJY-UMPQAUOISA-N 0.000 description 2
- YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N Trp-Lys-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)O)N YTYHAYZPOARHAP-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 2
- SUEGAFMNTXXNLR-WFBYXXMGSA-N Trp-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SUEGAFMNTXXNLR-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 2
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 2
- BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N Tyr-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O NRFTYDWKWGJLAR-MELADBBJSA-N 0.000 description 2
- LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N Tyr-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LOOCQRRBKZTPKO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- AXWBYOVVDRBOGU-SIUGBPQLSA-N Tyr-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N AXWBYOVVDRBOGU-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 2
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Lys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N PSALWJCUIAQKFW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- YMZYSCDRTXEOKD-IHPCNDPISA-N Tyr-Trp-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N YMZYSCDRTXEOKD-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N Val-Ala-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- -1 series Chemical compound 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HBDWQSHEVMSFGY-SCQFTWEKSA-N 4-hydroxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)C(O)=O HBDWQSHEVMSFGY-SCQFTWEKSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O REWSWYIDQIELBE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IICZCLFBILYRCU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N Gln-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)CN YDIDLLVFCYSXNY-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- LBQAHBIVXQSBIR-HVTMNAMFSA-N His-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LBQAHBIVXQSBIR-HVTMNAMFSA-N 0.000 description 1
- JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N His-Lys-Glu Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N JUIOPCXACJLRJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102220466216 Iduronate 2-sulfatase_N63D_mutation Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKIOKSLLAAZYTC-KKHAAJSZSA-N Thr-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BKIOKSLLAAZYTC-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- DOBHJKVVACOQTN-DZKIICNBSA-N Val-Tyr-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)CC1=CC=C(O)C=C1 DOBHJKVVACOQTN-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108010008685 alanyl-glutamyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010066829 alanyl-glutamyl-aspartylprolyine Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- KMZJRCPGGAQHGC-UHFFFAOYSA-N trisodium boric acid borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OB(O)O.[O-]B([O-])[O-] KMZJRCPGGAQHGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Область изобретенияField of invention
В настоящем изобретении предложен полипептид, обладающий активностью фосфолипазы С, и его применение.The present invention provides a polypeptide having phospholipase C activity and its use.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Дегуммирование является важной стадией в очистке масел и жиров. Традиционное дегуммирование путем гидратации подразумевает большие финансовые затраты, большой расход материалов и энергии и серьезное загрязнение окружающей среды. В последние годы много усилий было приложено для применения ферментативного дегуммирования в процессе дегуммирования при очистке масел и жиров. По сравнению с традиционным способом способ дегуммирования с помощью фермента имеет огромные преимущества в отношении защиты окружающей среды, экономической целесообразности и качества и так далее, поскольку он может увеличивать экономическую выгоду, уменьшать энергетические затраты и выбросы и уменьшать экологическое загрязнение окружающей среды. Одним типом ферментов, используемых в дегуммировании масел и жиров, является фосфолипаза. Фосфолипаза С (PLC) обладает существенными преимуществами, такими как увеличение выхода диацилглицеринов (DAG) и уменьшение потерь выхода масел, по сравнению с другими ферментами для дегуммирования.Degumming is an important step in the purification of oils and fats. Traditional degumming by hydration involves high financial costs, high consumption of materials and energy, and serious environmental pollution. In recent years, much effort has been put into the application of enzymatic degumming in the degumming process for refining oils and fats. Compared with the traditional method, the enzyme degumming method has great advantages in terms of environmental protection, economic feasibility and quality and so on, since it can increase economic benefits, reduce energy costs and emissions, and reduce environmental pollution. One type of enzyme used in degumming oils and fats is phospholipase. Phospholipase C (PLC) has significant advantages, such as increased diacylglycerol (DAG) yield and reduced oil yield loss, compared to other degumming enzymes.
Специфичная к фосфатидилхолину фосфолипаза С из Bacillus cereus (ВС-РС-PLC) представляет собой фосфолипазу С, изученную ранее. Полная длина BC-PC-PLC составляет 283 аминокислоты, включая сигнальный пептид из 24 аминокислот и лидерный пептид из 14 аминокислот. Зрелый пептид состоит из 245 аминокислот (см., например, Johansen, Т., Holm,T, Guddal, P.H., Sletten, К., Haugli, F.B., Little, С.(1988). "Cloning and sequencing of the gene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase С of Bacillus cereus." Gene 65(2):293-304).Phosphatidylcholine-specific phospholipase C from Bacillus cereus (BC-PC-PLC) is a phospholipase C that has been studied previously. The total length of BC-PC-PLC is 283 amino acids, including a 24 amino acid signal peptide and a 14 amino acid leader peptide. The mature peptide consists of 245 amino acids (see, for example, Johansen, T., Holm, T., Guddal, P.H., Sletten, K., Haugli, F.B., Little, S. (1988). "Cloning and sequencing of the gene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacillus cereus." Gene 65(2):293-304).
Известно, что активные сайты BC-PC-PLC дикого типа представляют собой Glu4, Asp55, Tyr56, Glul46, Ser64, Thr65, Phe66, Phe70, Ile80, Thrl33, Asnl34, Leul35, Serl43 (см., например, Hough, е., Hansen, L.K., birknes, В., jynge, K., Hansen, S., hordvik, A., little, С., Dodson, е., derewenda, Z. (1989) "High-resolution (1.5 A) crystal structure of phospholipase С from Bacillus cereus." Nature. 338:357-60).The active sites of wild type BC-PC-PLC are known to be Glu4, Asp55, Tyr56, Glul46, Ser64, Thr65, Phe66, Phe70, Ile80, Thrl33, Asnl34, Leul35, Serl43 (see, e.g., Hough, e. Hansen, L.K., birknes, V., jynge, K., Hansen, S., hordvik, A., little, S., Dodson, E., derewenda, Z. (1989) "High-resolution (1.5 A) crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus." Nature. 338:357-60).
Известна кристаллическая структура BC-PC-PLC, которая состоит из множественных спиральных доменов и по меньшей мере трех сайтов связывания Zn2+ с каталитическим сайтом на аспарагиновой кислоте в положении 55 (см., например, Hough, е., Hansen, L.K., birknes, В., jynge, К., Hansen, S., hordvik, A., little, C., Dodson, е., derewenda, Z. (1989) "High-resolution (1.5 A) crystal structure of phospholipase С from Bacillus cereus." Nature. 338:357-60). Гетерологичная экспрессия BC-PC-PLC менее изучена. Сообщали, что BC-PC-PLC экспрессируется в Bacillus subtilis и Pichia pastoris (см. например, Durban, М.А., silbersack, J., schweder, Т., Schauer, F., bornscheuer, U.T. (2007) High level expression of a recombinant phospholipase С from Bacillus cereus in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol 74(3):634-639; и Seo, К.H, Rhee J.I. (2004) High-level expression of recombinant phospholipase С from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization. Biotechnol Lett 26(19): 1475-1479).The crystal structure of BC-PC-PLC is known, which consists of multiple helical domains and at least three Zn 2+ binding sites with a catalytic site on aspartic acid at position 55 (see, for example, Hough, E., Hansen, LK, Birknes , V., jynge, K., Hansen, S., hordvik, A., little, C., Dodson, E., derewenda, Z. (1989) "High-resolution (1.5 A) crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus." Nature. 338:357-60). Heterologous expression of BC-PC-PLC is less studied. BC-PC-PLC has been reported to be expressed in Bacillus subtilis and Pichia pastoris (see e.g. Durban, M.A., Silbersack, J., Schweder, T., Schauer, F., Bornscheuer, UT (2007) High level expression of a recombinant phospholipase C from Bacillus cereus in Bacillus subtilis. Appl Microbiol Biotechnol 74(3):634-639; and Seo, K.H, Rhee JI (2004) High-level expression of recombinant phospholipase C from Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization. Biotechnol Lett 26(19): 1475-1479).
Однако, термостабильность известной фосфолипазы С является низкой, причем она не может выдерживать температуру более 60°С. Следовательно, необходимо поддерживать оптимальную температуру дегуммирования при 50°С, что ограничивает применимость в промышленности. Если термостабильность фосфолипазы С можно эффективно улучшить, это благоприятно для промышленной применимости фосфолипазы С по следующим причинам: во-первых, более высокая температура во время дегуммирования может уменьшать вязкость масла, улучшать разделение масла и фосфолипидов, уменьшать количество масла, захватываемого фосфолипидами, и дополнительно увеличивать выход масла; во-вторых, в настоящее время PLC и PLA1 (фосфолипаза А1) используют в комбинации для более глубокого дегуммирования. В CN201480017114.5 раскрыта новая PLA1 с оптимальной температурой дегуммирования 65°С, таким образом более термостабильная PLC предпочтительна для дегуммирования вместе с PLA1. Кроме того, иногда температура неочищенного масла может превышать 50°С во время хранения, особенно в погодных условиях с высокой температурой, поэтому если оптимальная температура реакции PLC ниже 50°С, больше холодной воды требуется для охлаждения неочищенного масла, что приводит к большему потреблению энергии. Следовательно, разработка нового полипептида с термостабильной активностью фосфолипазы С имеет огромную практическую и экономическую ценность.However, the thermostability of known phospholipase C is low, and it cannot withstand temperatures above 60°C. Therefore, it is necessary to maintain the optimum degumming temperature at 50°C, which limits industrial applicability. If the thermal stability of phospholipase C can be effectively improved, it is favorable for the industrial applicability of phospholipase C for the following reasons: first, higher temperature during degumming can reduce the viscosity of oil, improve the separation of oil and phospholipids, reduce the amount of oil entrapped by phospholipids, and further increase oil output; Secondly, PLC and PLA1 (phospholipase A1) are now used in combination for deeper degumming. CN201480017114.5 discloses a new PLA1 with an optimal degumming temperature of 65°C, thus the more heat-stable PLC is preferred for degumming with PLA1. In addition, sometimes the crude oil temperature may exceed 50°C during storage, especially in high temperature weather conditions, so if the optimum PLC reaction temperature is below 50°C, more cold water is required to cool the crude oil, resulting in more energy consumption . Therefore, the development of a new polypeptide with thermostable phospholipase C activity is of enormous practical and economic value.
Краткое изложение сущности изобретенияSummary of the invention
В первом аспекте настоящего изобретения предложен полипептид с активностью фосфолипазы С, где указанный полипептид: (1) имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, с аминокислотными заменами в одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из: положения 6, 8, 10, 104, 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, или любой их комбинации; илиIn a first aspect of the present invention, there is provided a polypeptide with phospholipase C activity, wherein said polypeptide: (1) has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, with amino acid substitutions at one or more positions selected from the group consisting of: position 6, 8, 10, 104, 205 amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or any combination thereof; or
(2) имеет идентичность последовательности (1) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, и по меньшей мере в одном из положений 6, 8, 10, 104 и 205 отличается от положений 6, 8, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2.(2) has at least 80% sequence identity to (1), preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97% , more preferably at least 98%, more preferably at least 99%, and at least one of positions 6, 8, 10, 104 and 205 differs from positions 6, 8, 10, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях аминокислотные замены присутствуют во всех положениях 6, 8, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2.In some embodiments, amino acid substitutions are present at all positions 6, 8, 10, 104, and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 6 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на пролин, глицин, гидроксипролин, серии или треонин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 6 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by proline, glycine, hydroxyproline, series, or threonine.
В некоторых воплощениях лизин в положении 6 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на пролин.In some embodiments, the lysine at position 6 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by proline.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на изолейцин, лейцин, валин, метионин, аланин, фенилаланин или н-лейцин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by isoleucine, leucine, valine, methionine, alanine, phenylalanine, or n-leucine.
В некоторых воплощениях лизин в положении 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на изолейцин.In some embodiments, the lysine at position 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by isoleucine.
В некоторых воплощениях аминокислота глицин в положении 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на треонин или серии.In some embodiments, the amino acid glycine at position 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by threonine or series.
В некоторых воплощениях глицин в положении 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на треонин.In some embodiments, the glycine at position 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by threonine.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на глицин или пролин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by glycine or proline.
В некоторых воплощениях лизин в положении 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на глицин.In some embodiments, the lysine at position 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by glycine.
В некоторых воплощениях аминокислота серии в положении 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на тирозин, триптофан, фенилаланин или треонин.In some embodiments, the amino acid series at position 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by tyrosine, tryptophan, phenylalanine, or threonine.
В некоторых воплощениях серии в положении 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на тирозин.In some embodiments of the series, position 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced with tyrosine.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность полипептида содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the amino acid sequence of the polypeptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность полипептида состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the amino acid sequence of the polypeptide consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полипептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и более предпочтительно по меньшей мере на 99%, и выделенный полипептид имеет пролин, изолейцин, треонин, глицин и тирозин в положениях аминокислотных остатков, соответствующих положениям 6, 8, 10, 104 и 205 в SEQ ID NO: 4, соответственно. Предпочтительно полипептид получен из Bacillus subtilis.A second aspect of the present invention provides an isolated polypeptide having 80% amino acid sequence identity as set forth in SEQ ID NO: 4, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 95 %, more preferably at least 97%, more preferably at least 98% and more preferably at least 99%, and the isolated polypeptide has proline, isoleucine, threonine, glycine and tyrosine at amino acid residue positions corresponding to positions 6 , 8, 10, 104 and 205 in SEQ ID NO: 4, respectively. Preferably the polypeptide is derived from Bacillus subtilis.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, описанный в первом или втором аспектах.In a third aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule encoding a polypeptide described in the first or second aspects.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the nucleic acid molecule contains the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
В некоторых воплощениях последовательность молекулы нуклеиновой кислоты является такой, как изложено в SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the sequence of the nucleic acid molecule is as set forth in SEQ ID NO: 3.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте.In a fourth aspect of the present invention, there is provided a vector containing a nucleic acid molecule as described in the third aspect.
В некоторых воплощениях вектор представляет собой экспрессионный вектор.In some embodiments, the vector is an expression vector.
В некоторых воплощениях вектор сконструирован для экспрессии в эукариотических или прокариотических клетках.In some embodiments, the vector is designed for expression in eukaryotic or prokaryotic cells.
В некоторых воплощениях вектор сконструирован для экспрессии в бактериальных клетках, клетках грибов, дрожжевых клетках, клетках млекопитающих, клетках насекомых или растительных клетках.In some embodiments, the vector is designed for expression in bacterial cells, fungal cells, yeast cells, mammalian cells, insect cells, or plant cells.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или вектор, как он описан в четвертом аспекте.In a fifth aspect of the present invention, there is provided a cell containing a nucleic acid molecule as described in the third aspect or a vector as described in the fourth aspect.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку.In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку грибов, дрожжевую клетку, клетку млекопитающих, клетку насекомых или растительную клетку.In some embodiments, the cell is a bacterial cell, a fungal cell, a yeast cell, a mammalian cell, an insect cell, or a plant cell.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложена фосфолипаза С, продуцируемая клеткой, как она описана в пятом аспекте.The sixth aspect of the present invention provides phospholipase C produced by a cell as described in the fifth aspect.
В седьмом аспекте настоящего изобретения предложено применение полипептида, как он описан в первом или втором аспекте, или полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или полипептида, кодируемого вектором, как он описан в четвертом аспекте, или ферментативного бульона, концентрата или полипептида, экспрессируемого клеткой, как она описана в пятом аспекте, или фосфолипазы С, как она описана в шестом аспекте, в качестве фосфолипазы С.A seventh aspect of the present invention provides the use of a polypeptide as described in the first or second aspect, or a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a polypeptide encoded by a vector as described in the fourth aspect, or an enzyme broth, a concentrate or polypeptide expressed by a cell as described in the fifth aspect, or phospholipase C as described in the sixth aspect as phospholipase C.
В некоторых воплощениях применение представляет собой применение в дегуммировании масел и жиров.In some embodiments, the use is in the degumming of oils and fats.
В восьмом аспекте настоящего изобретения предложена ферментативная композиция, содержащая полипептид, как он описан в первом или втором аспекте, или полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или полипептид, кодируемый вектором, как он описан в четвертом аспекте, или полипептид, экспрессируемый клеткой, как она описана в пятом аспекте, или фосфолипазу С, как она описана в шестом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.An eighth aspect of the present invention provides an enzymatic composition comprising a polypeptide as described in the first or second aspect, or a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a polypeptide encoded by a vector as described in the fourth aspect, or a polypeptide expressed by a cell as described in the fifth aspect, or a phospholipase C as described in the sixth aspect, and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях по меньшей мере один фермент дегуммирования выбран из группы, состоящей из: фосфолипазы A1, фосфолипазы А2, фосфолипазы В, фосфолипазы D, пектиназы и маннаназы.In some embodiments, the at least one degumming enzyme is selected from the group consisting of: phospholipase A 1 , phospholipase A 2 , phospholipase B, phospholipase D, pectinase, and mannanase.
В девятом аспекте настоящего изобретения предложено применение полипептида, как он описан в первом или втором аспекте, или молекулы нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или вектора, как он описан в четвертом аспекте, или клетки, как она описана в пятом аспекте, или ферментативной композиции, как она описана в восьмом аспекте, в изготовлении фермента для дегуммирования.A ninth aspect of the present invention provides the use of a polypeptide as described in the first or second aspect, or a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a vector as described in the fourth aspect, or a cell as described in the fifth aspect, or an enzymatic composition as described in the eighth aspect, in the manufacture of a degumming enzyme.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На Фиг. 1 представлена стандартная кривая активности фосфолипазы.In FIG. Figure 1 shows a standard curve of phospholipase activity.
На Фиг. 2 показано сравнение термостабильности между PLC-9-49 и PLC-N63DN131SN134D-Y56H, где кружками обозначена PLC-9-49, а треугольниками обозначена PLC-N63DN131SN134D-Y56H.In FIG. Figure 2 shows a comparison of thermal stability between PLC-9-49 and PLC-N63DN131SN134D-Y56H, with circles representing PLC-9-49 and triangles representing PLC-N63DN131SN134D-Y56H.
На Фиг. 3 показан прирост DAG при дегуммировании PLC-9-49 и PLC-N63DN131SN134D-Y56H при 55°С и 60°С, соответственно, по сравнению с неочищенным маслом.In FIG. Figure 3 shows the increase in DAG when degumming PLC-9-49 and PLC-N63DN131SN134D-Y56H at 55°C and 60°C, respectively, compared to crude oil.
Перечень последовательностейList of sequences
SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую PLC-N63DN131SN134D-Y56H.SEQ ID NO: 1 is the nucleic acid sequence encoding PLC-N63DN131SN134D-Y56H.
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность PLC-N63DN131SN134D-Y56H.SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of PLC-N63DN131SN134D-Y56H.
SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую PLC-9-49.SEQ ID NO: 3 is the nucleic acid sequence encoding PLC-9-49.
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность PLC-9-49.SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence of PLC-9-49.
Подробное описание изобретения ОпределенияDetailed Description of the Invention Definitions
Как их используют здесь, термины «специфичная к фосфатидилхолину фосфолипаза С» и «фосфолипаза С с предпочтением фосфатидилхолина» имеют одно и то же значение и хорошо понятны специалистам в данной области техники. Как ее используют здесь, аббревиатура «РС-PLC» предназначена для обозначения специфичной к фосфатидилхолину фосфолипазы С или фосфолипазы С с предпочтением фосфатидилхолина.As used herein, the terms “phosphatidylcholine-specific phospholipase C” and “phosphatidylcholine-preferential phospholipase C” have the same meaning and are well understood by those skilled in the art. As used herein, the abbreviation “PC-PLC” is intended to refer to phosphatidylcholine-specific phospholipase C or phospholipase C with a preference for phosphatidylcholine.
Как используют здесь, пример специфичной к фосфатидилхолину фосфолипазы С представляет собой специфичную к фосфатидилхолину фосфолипазу С Bacillus cereus, которая здесь обозначена аббревиатурой «ВС-PC-PLC». Следует понимать, что «ВС-PC-PLC» может обозначать не только специфичную к фосфатидилхолину фосфолипазу С Bacillus cereus дикого типа, но также обозначает мутант, полученный здесь на основе такой специфичной к фосфатидилхолину фосфолипазы С дикого типа.As used herein, an example of phosphatidylcholine-specific phospholipase C is Bacillus cereus phosphatidylcholine-specific phospholipase C, which is abbreviated herein as “BC-PC-PLC”. It should be understood that "BC-PC-PLC" may refer not only to the wild-type phosphatidylcholine-specific phospholipase C of Bacillus cereus, but also to the mutant derived herein from such wild-type phosphatidylcholine-specific phospholipase C.
В случае, когда положение аминокислоты обозначено здесь номерами, такие номера относятся к положению аминокислоты в SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность мутантной специфичной к фосфатидилхолину фосфолипазы С Bacillus cereus PLC-N63DN131SN134D-Y56H.Where amino acid positions are indicated by numbers herein, such numbers refer to the amino acid position in SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the Bacillus cereus PLC-N63DN131SN134D-Y56H phosphatidylcholine-specific phospholipase C mutant.
Здесь используют международные однобуквенные или трехбуквенные аббревиатуры аминокислот.International one-letter or three-letter amino acid abbreviations are used here.
Применяемые здесь термины «полипептид», «пептид» и «белок» можно использовать взаимозаменяемо для обозначения полимера, образуемого соединением множества аминокислот посредством пептидных связей. Аминокислоты могут представлять собой существующие в природе аминокислоты или искусственно синтезированные аналоги.As used herein, the terms "polypeptide", "peptide" and "protein" can be used interchangeably to refer to a polymer formed by joining multiple amino acids through peptide bonds. Amino acids may be naturally occurring amino acids or artificially synthesized analogues.
Применяемые здесь термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» можно использовать взаимозаменяемо, включая ДНК, РНК и так далее, но не ограничиваясь ими. Нуклеотиды могут представлять собой существующие в природе нуклеотиды или искусственно синтезированные аналоги.As used herein, the terms “nucleic acid” and “polynucleotide” can be used interchangeably, including but not limited to DNA, RNA, and so on. Nucleotides may be naturally occurring nucleotides or artificially synthesized analogues.
Термин «клетки», как его используют здесь, может означать эукариотические клетки или прокариотические клетки, например, бактериальные клетки, клетки грибов, дрожжевые клетки, клетки млекопитающих, клетки насекомых или растительные клетки, но не ограничиваясь ими.The term “cells” as used herein can mean eukaryotic cells or prokaryotic cells, such as, but not limited to, bacterial cells, fungal cells, yeast cells, mammalian cells, insect cells or plant cells.
Термин «консервативная замена», как его используют здесь, относится к изменению в аминокислотном составе белка, которое существенно не изменяет активность белка. Следовательно, термин «консервативная замена» в отношении данной аминокислотной последовательности относится к замене таких аминокислот, которые не являются ключевыми для активности белка, или к замене аминокислот на другие аминокислоты с похожими свойствами (такими как кислотность, основность, положительный или отрицательный заряд, полярность или ее отсутствие и так далее), так что даже замена ключевых аминокислот не будет существенно изменять активность.The term "conservative substitution" as used herein refers to a change in the amino acid composition of a protein that does not significantly alter the activity of the protein. Therefore, the term "conservative substitution" in relation to a given amino acid sequence refers to the replacement of amino acids that are not essential for the activity of the protein, or to the replacement of amino acids with other amino acids with similar properties (such as acidity, basicity, positive or negative charge, polarity or its absence, and so on), so that even replacing key amino acids will not significantly change the activity.
Термин «случайный насыщающий мутагенез», используемый здесь, относится к процессу использования NNK вырожденных кодонов в ПЦР-праймерах для введения мутаций в сайт, который может охватывать все 20 аминокислот для достижения насыщающего мутагенеза. Между тем, поскольку множественные сайты выбраны для мутагенеза, комбинация является случайной. В настоящем описании этот способ обозначают как случайный насыщающий мутагенез.The term "random saturation mutagenesis" as used herein refers to the process of using NNK degenerate codons in PCR primers to introduce mutations at a site that may span all 20 amino acids to achieve saturation mutagenesis. Meanwhile, since multiple sites are selected for mutagenesis, the combination is random. In the present description, this method is referred to as random saturation mutagenesis.
В данной области техники хорошо известно как обеспечить консервативные замены на аминокислоты, имеющие сходные функции. Например, альтернативные консервативные аминокислотные замены для каждой аминокислоты перечислены ниже:It is well known in the art to provide conservative substitutions for amino acids having similar functions. For example, alternative conservative amino acid substitutions for each amino acid are listed below:
консервативной заменой аланина (ALA) является его замена на валин (Val)*, лейцин (Leu) и изолейцин (Ilе);a conservative replacement of alanine (ALA) is its replacement with valine (Val)*, leucine (Leu) and isoleucine (Ile);
консервативной заменой аргинина (Arg) является его замена на лизин (Lys)*, глутамин (Gln) и аспарагин (Asn);a conservative replacement of arginine (Arg) is its replacement with lysine (Lys)*, glutamine (Gln) and asparagine (Asn);
консервативной заменой аспарагина (Asn) является его замена на глутамин (Gln)*, гистидин (His), лизин (Lys), аргинин (Arg) и аспарагиновую кислоту (Asp);a conservative replacement for asparagine (Asn) is its replacement with glutamine (Gln)*, histidine (His), lysine (Lys), arginine (Arg) and aspartic acid (Asp);
консервативной заменой аспарагиновой кислоты (Asp) является ее замена на глутаминовую кислоту (Glu)* и аспарагин (Asn);a conservative replacement for aspartic acid (Asp) is its replacement with glutamic acid (Glu)* and asparagine (Asn);
консервативной заменой цистеина (Cys) является его замена на серии (Ser);a conservative replacement of cysteine (Cys) is its replacement with ser (Ser);
консервативной заменой глутамина (Gln) является его замена на аспарагин (Asn)*, гистидин (His) и лизин (Lys);a conservative replacement for glutamine (Gln) is its replacement with asparagine (Asn)*, histidine (His) and lysine (Lys);
консервативной заменой глутаминовой кислоты (Glu) является ее замена на аспарагиновую кислоту (Asp)*, γ-гидроксиглутаминовую кислоту (Gla);a conservative replacement for glutamic acid (Glu) is its replacement with aspartic acid (Asp)*, γ-hydroxyglutamic acid (Gla);
консервативной заменой глицина (Gly) является его замена на пролин (Pro);a conservative replacement for glycine (Gly) is its replacement with proline (Pro);
консервативной заменой гистидина (His) является его замена на аспарагин (Asn), глутамин (Gln), лизин (Lys), аргинин (Arg)*;a conservative replacement of histidine (His) is its replacement with asparagine (Asn), glutamine (Gln), lysine (Lys), arginine (Arg)*;
консервативной заменой изолейцина (Ilе) является его замена на лейцин (Leu)*, валин (Val), метионин (Met), аланин (Ala), фенилаланин (Phe) и н-лейцин (Nle);a conservative replacement for isoleucine (Ile) is its replacement with leucine (Leu)*, valine (Val), methionine (Met), alanine (Ala), phenylalanine (Phe) and n-leucine (Nle);
консервативной заменой лейцина (Leu) является его замена на н-лейцин (Nle), изолейцин (Ilе)*, валин (Val), метионин (Met), аланин (Ala), фенилаланин (Phe);a conservative replacement for leucine (Leu) is its replacement with n-leucine (Nle), isoleucine (Ile)*, valine (Val), methionine (Met), alanine (Ala), phenylalanine (Phe);
консервативной заменой лизина (Lys) является его замена на аргинин (Arg)*, глутамин (Gln), аспарагин (Asn) и орнитин (Оrn);a conservative replacement of lysine (Lys) is its replacement with arginine (Arg)*, glutamine (Gln), asparagine (Asn) and ornithine (Orn);
консервативной заменой метионина (Met) является его замена на лейцин (Leu)*, изолейцин (Ilе), фенилаланин (Phe) и н-лейцин (Nle);a conservative replacement for methionine (Met) is its replacement with leucine (Leu)*, isoleucine (Ile), phenylalanine (Phe) and n-leucine (Nle);
консервативной заменой фенилаланина (Phe) является его замена на лейцин (Leu)*, валин (Val), изолейцин (Ilе) и аланин (Ala);a conservative replacement for phenylalanine (Phe) is its replacement with leucine (Leu)*, valine (Val), isoleucine (Ile) and alanine (Ala);
консервативной заменой пролина (Pro) является его замена на глицин (Gly)*, гидроксипролин (Hyp), серии (Ser), треонин (Thr);a conservative replacement of proline (Pro) is its replacement with glycine (Gly)*, hydroxyproline (Hyp), series (Ser), threonine (Thr);
консервативной заменой серина (Ser) является его замена на треонин (Thr);a conservative replacement of serine (Ser) is its replacement with threonine (Thr);
консервативной заменой треонина (Thr) является его замена на серии (Ser);a conservative replacement of threonine (Thr) is its replacement with ser (Ser);
консервативной заменой триптофана (Тrр) является его замена на тирозин (Туr);a conservative replacement of tryptophan (Trp) is its replacement with tyrosine (Tyr);
консервативной заменой тирозина (Туr) является его замена на триптофан (Тrр), фенилаланин (Phe)*, треонин (Thr) и серии (Ser);a conservative replacement of tyrosine (Tyr) is its replacement with tryptophan (Trp), phenylalanine (Phe)*, threonine (Thr) and series (Ser);
консервативной заменой валина (Val) является его замена на изолейцин (Ilе), лейцин (Leu)*, метионин (Met), фенилаланин (Phe), Аланин (Ala) и н-лейцин (Nle);a conservative replacement for valine (Val) is its replacement with isoleucine (Ile), leucine (Leu)*, methionine (Met), phenylalanine (Phe), Alanine (Ala) and n-leucine (Nle);
где «*» обозначает предпочтительную консервативную замену.where "*" denotes a preferred conservative substitution.
Дополнительно см. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and company, New York (2nd ed., 1992).For more information, see Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman and company, New York (2nd ed., 1992).
Описание воплощенийDescription of incarnations
В предыдущей заявке CN201510946696.1 авторов настоящего изобретения четыре аминокислоты BC-PC-PLC (а именно, аминокислоты в положениях 56, 63, 131 и 134) изменены на гистидин (Y56H), аспарагиновую кислоту (N63D), серии (N131S) и аспарагиновую кислоту (N134D), соответственно. Мутированная аминокислотная последовательность изложена в SEQ ID NO: 2, и кодирующая последовательность изложена в SEQ ID NO: 1, которую здесь также называют «PLC-N63DN131SN134D-Y56H». Специфическая ферментативная активность PLC-N63DN131SN134D-Y56H выше, чем таковая BC-PC-PLC дикого типа, но такой мутант не стабилен и не может выдерживать температуру более 60°С, при том что оптимальная температура дегуммирования составляет 50°С, что ограничивает использование этого мутанта в промышленности.In the previous application CN201510946696.1 of the authors of the present invention, four amino acids of BC-PC-PLC (namely, amino acids at positions 56, 63, 131 and 134) are changed to histidine (Y56H), aspartic acid (N63D), series (N131S) and aspartic acid acid (N134D), respectively. The mutated amino acid sequence is set forth in SEQ ID NO: 2, and the coding sequence is set forth in SEQ ID NO: 1, which is also referred to herein as “PLC-N63DN131SN134D-Y56H”. The specific enzymatic activity of PLC-N63DN131SN134D-Y56H is higher than that of wild type BC-PC-PLC, but this mutant is not stable and cannot withstand temperatures above 60°C, while the optimal degumming temperature is 50°C, which limits its use mutant in industry.
Во-первых, более высокая температура во время дегуммирования может уменьшать вязкость масла, улучшать разделение масла и фосфолипида, уменьшать количество масла, захваченного фосфолипидом, и дополнительно увеличивать выход масла; во-вторых, в настоящее время PLC и PLA1 используют в комбинации для глубокого дегуммирования. В CN201480017114.5 раскрыта новая PLA1 с оптимальной температурой дегуммирования 65°С (см. абзац [0173] в CN105073985A), поэтому более термоустойчивая PLC является желательной для совместного действия при такой температуре дегуммирования при дегуммировании вместе с PLA1. Дополнительно, иногда температура неочищенного масла может превышать 50°С во время хранения, особенно в погодных условиях с высокой температурой, поэтому если оптимальная температура реакции PLC ниже 50°С, много холодной воды требуется для охлаждения неочищенного масла, приводя к большому потреблению энергии. Следовательно, для улучшения термостабильности и/или применимости фосфолипазы С авторы настоящего изобретения улучшили PLC-N63DN131SN134D-Y56H и создали различные воплощения настоящего изобретения.Firstly, higher temperature during degumming can reduce the viscosity of oil, improve the separation of oil and phospholipid, reduce the amount of oil captured by phospholipid, and further increase the oil yield; Secondly, PLC and PLA1 are currently used in combination for deep degumming. CN201480017114.5 discloses a new PLA1 with an optimal degumming temperature of 65°C (see paragraph [0173] in CN105073985A), so a more heat-stable PLC is desirable to act together at this degumming temperature when degumming with PLA1. Additionally, sometimes the crude oil temperature may exceed 50°C during storage, especially in high temperature weather conditions, so if the optimal PLC reaction temperature is below 50°C, a lot of cold water is required to cool the crude oil, resulting in high energy consumption. Therefore, to improve the thermostability and/or applicability of phospholipase C, the present inventors improved PLC-N63DN131SN134D-Y56H and created various embodiments of the present invention.
В первом аспекте настоящего изобретения предложен полипептид с активностью фосфолипазы С. Данный полипептид: (1) имеет аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2 с заменой аминокислот в одном или более чем одном положении, выбранном из группы, состоящей из положений 6, 8, 10, 104, 205 или любой их комбинации в аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, или (2) имеет идентичность последовательности (1) по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, и по меньшей мере одно из положений 6, 8, 10, 104 и 205 отличается от положений 6, 8, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2.In a first aspect, the present invention provides a polypeptide with phospholipase C activity. The polypeptide: (1) has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 with amino acid substitution at one or more positions selected from the group consisting of positions 6, 8 , 10, 104, 205, or any combination thereof in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or (2) has at least 80% sequence identity to (1), preferably at least 85%, more preferably to at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%, and at least one of positions 6 , 8, 10, 104 and 205 are different from positions 6, 8, 10, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях аминокислотные замены присутствуют во всех положениях 6, 8, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2.In some embodiments, amino acid substitutions are present at all positions 6, 8, 10, 104, and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях аминокислота в положении 6 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту.In some embodiments, the amino acid at position 6 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by another amino acid.
В некоторых воплощениях аминокислота в положении 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту.In some embodiments, the amino acid at position 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by another amino acid.
В некоторых воплощениях аминокислота в положении 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту.In some embodiments, the amino acid at position 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by another amino acid.
В некоторых воплощениях аминокислота в положении 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту.In some embodiments, the amino acid at position 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by another amino acid.
В некоторых воплощениях аминокислота в положении 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на другую аминокислоту.In some embodiments, the amino acid at position 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by another amino acid.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6 и 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6 and 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6 и 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6 and 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8 и 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8 and 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 10 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 10 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 10 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 10 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8 и 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8 and 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8, and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8, and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 10 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 10 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 10 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 10, and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8, 10 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8, 10 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8, 10 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8, 10, and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 10, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8, 10 и 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8, 10 and 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8, 10 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8, 10 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 8, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 8, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 6, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 6, 10, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислоты в положениях 8, 10, 104 и 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменены на другие аминокислоты.In some embodiments, the amino acids at positions 8, 10, 104 and 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are replaced with other amino acids.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 6 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на пролин, глицин, гидроксипролин, серии или треонин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 6 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by proline, glycine, hydroxyproline, series, or threonine.
В некоторых воплощениях лизин в положении 6 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на пролин.In some embodiments, the lysine at position 6 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by proline.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на изолейцин, лейцин, валин, метионин, аланин, фенилаланин или н-лейцин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by isoleucine, leucine, valine, methionine, alanine, phenylalanine, or n-leucine.
В некоторых воплощениях лизин в положении 8 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на изолейцин.In some embodiments, the lysine at position 8 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by isoleucine.
В некоторых воплощениях аминокислота глицин в положении 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на треонин или серии.In some embodiments, the amino acid glycine at position 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by threonine or series.
В некоторых воплощениях аминокислота глицин в положении 10 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на треонин.In some embodiments, the amino acid glycine at position 10 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by threonine.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на глицин или пролин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by glycine or proline.
В некоторых воплощениях аминокислота лизин в положении 104 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на глицин.In some embodiments, the amino acid lysine at position 104 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by glycine.
В некоторых воплощениях аминокислота серии в положении 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменена на тирозин, триптофан, фенилаланин или треонин.In some embodiments, the amino acid series at position 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by tyrosine, tryptophan, phenylalanine, or threonine.
В некоторых воплощениях серии в положении 205 аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, заменен на тирозин.In some embodiments of the series, position 205 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is replaced by tyrosine.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность полипептида содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the amino acid sequence of the polypeptide comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
В некоторых воплощениях аминокислотная последовательность полипептида состоит из аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4.In some embodiments, the amino acid sequence of the polypeptide consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
В настоящем изобретении также предусмотрены функциональные варианты полипептида, как он описан в первом аспекте. В некоторых воплощениях функциональный вариант представляет собой вариант с консервативной заменой.The present invention also provides functional variants of the polypeptide as described in the first aspect. In some embodiments, the functional variant is a conservative substitution variant.
Во втором аспекте настоящего изобретения предложен выделенный полипептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, и этот выделенный полипептид имеет пролин, изолейцин, треонин, глицин и тирозин в положениях аминокислот, соответствующих положениям 6, 8, 10, 104 и 205 SEQ ID NO: 4, соответственно.A second aspect of the present invention provides an isolated polypeptide having at least 80% identity, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, more preferably at least 90% identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. at least 95%, more preferably at least 97%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%, and the isolated polypeptide has proline, isoleucine, threonine, glycine and tyrosine at amino acid positions, corresponding to provisions 6, 8, 10, 104 and 205 of SEQ ID NO: 4, respectively.
В некоторых воплощениях полипептид получен из Bacillus subtilis.In some embodiments, the polypeptide is derived from Bacillus subtilis.
В некоторых воплощениях полипептид имеет идентичность аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,5% или более.In some embodiments, the polypeptide has at least 97%, at least 98%, at least 99%, at least 99.5% identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
В некоторых воплощениях полипептид имеет идентичность аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 97,2%, по меньшей мере на 97,6%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,4%, по меньшей мере на 98,8%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,6% или более.In some embodiments, the polypeptide has at least 97.2%, at least 97.6%, at least 98%, and at least 98.4% identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 , at least 98.8%, at least 99.2%, at least 99.6% or more.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 6 в SEQ ID NO: 4, представляет собой пролин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 6 in SEQ ID NO: 4 is proline.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 8 в SEQ ID NO: 4, представляет собой изолейцин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 8 in SEQ ID NO: 4 is isoleucine.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 10 в SEQ ID NO: 4, представляет собой треонин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 10 in SEQ ID NO: 4 is threonine.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 104 в SEQ ID NO: 4, представляет собой глицин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 104 in SEQ ID NO: 4 is glycine.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 205 в SEQ ID NO: 4, представляет собой тирозин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 205 in SEQ ID NO: 4 is tyrosine.
В некоторых воплощениях аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 6 в SEQ ID NO: 4, представляет собой пролин, и/или аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 8 в SEQ ID NO: 4, представляет собой изолейцин, и/или аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 10 в SEQ ID NO: 4, представляет собой треонин, и/или аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 104 в SEQ ID NO: 4, представляет собой глицин, и/или аминокислотный остаток выделенного полипептида, соответствующий положению 205 в SEQ ID NO: 4, представляет собой тирозин.In some embodiments, the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 6 in SEQ ID NO: 4 is proline, and/or the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 8 in SEQ ID NO: 4 is isoleucine, and/or the amino acid residue of the isolated the polypeptide corresponding to position 10 in SEQ ID NO: 4 is threonine, and/or the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 104 in SEQ ID NO: 4 is glycine, and/or the amino acid residue of the isolated polypeptide corresponding to position 205 in SEQ ID NO: 4 is tyrosine.
В третьем аспекте настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, как он описан в первом или втором аспекте. В настоящем изобретении предусмотрены различные молекулы нуклеиновых кислот, которые можно получить на основе вырожденности генетических кодонов или предпочтения различных видов по кодонам.In a third aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid molecule encoding a polypeptide as described in the first or second aspect. The present invention provides various nucleic acid molecules that can be obtained based on the degeneracy of genetic codons or the codon preferences of different species.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, изложенную в SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the nucleic acid molecule contains the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
В некоторых воплощениях последовательность молекулы нуклеиновой кислоты изложена в SEQ ID NO: 3.In some embodiments, the sequence of the nucleic acid molecule is set forth in SEQ ID NO: 3.
В четвертом аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте.In a fourth aspect of the present invention, there is provided a vector containing a nucleic acid molecule as described in the third aspect.
В некоторых воплощениях вектор представляет собой экспрессионный вектор.In some embodiments, the vector is an expression vector.
В некоторых воплощениях вектор сконструирован для экспрессии в эукариотической или прокариотической клетке.In some embodiments, the vector is designed for expression in a eukaryotic or prokaryotic cell.
В некоторых воплощениях вектор сконструирован для экспрессии в бактериальной клетке, клетке гриба, дрожжевой клетке, клетке млекопитающего, клетке насекомого или растительной клетке.In some embodiments, the vector is designed for expression in a bacterial cell, fungal cell, yeast cell, mammalian cell, insect cell, or plant cell.
В некоторых воплощениях вектор представляет собой плазмиду.In some embodiments, the vector is a plasmid.
Подходящие векторы для эукариотической клетки или прокариотической клетки хорошо известны специалистам в данной области техники, и множество оригинальных векторов доступны в продаже. Примеры векторов включают ряд векторов, используемых в примерах настоящего изобретения, но не ограничены ими.Suitable vectors for a eukaryotic cell or prokaryotic cell are well known to those skilled in the art, and many original vectors are commercially available. Examples of vectors include, but are not limited to, a number of vectors used in examples of the present invention.
В пятом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или вектор, как он описан в четвертом аспекте.In a fifth aspect of the present invention, there is provided a cell containing a nucleic acid molecule as described in the third aspect or a vector as described in the fourth aspect.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой эукариотическую клетку или прокариотическую клетку.In some embodiments, the cell is a eukaryotic cell or a prokaryotic cell.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку гриба, дрожжевую клетку, клетку млекопитающего, клетку насекомого или растительную клетку.In some embodiments, the cell is a bacterial cell, a fungal cell, a yeast cell, a mammalian cell, an insect cell, or a plant cell.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой клетку Pichia pastoris.In some embodiments, the cell is a Pichia pastoris cell.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой клетку Bacillus subtilis.In some embodiments, the cell is a Bacillus subtilis cell.
В некоторых воплощениях клетка представляет собой клетку Escherichia coli.In some embodiments, the cell is an Escherichia coli cell.
В отношении клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, данная молекула нуклеиновой кислоты может быть локализована вне хромосом (например, в векторе) или интегрирована в хромосому клетки-хозяина. Специалистам в данной области техники хорошо известно как интегрировать молекулу нуклеиновой кислоты в хромосомы клетки-хозяина и как ввести вектор в клетку-хозяина путем трансформации или трансфекции.In relation to a cell containing a nucleic acid molecule of the present invention, the nucleic acid molecule may be located outside of chromosomes (eg, in a vector) or integrated into the chromosome of the host cell. Those skilled in the art are well aware of how to integrate a nucleic acid molecule into the chromosomes of a host cell and how to introduce a vector into a host cell by transformation or transfection.
В шестом аспекте настоящего изобретения предложена фосфолипаза С, продуцированная клеткой, как она описана в пятом аспекте. Специалистам в данной области техники хорошо известно как продуцировать целевой пептид или белок с помощью генетически сконструированной клетки-хозяина.The sixth aspect of the present invention provides phospholipase C produced by a cell as described in the fifth aspect. It is well known to those skilled in the art to produce a target peptide or protein using a genetically engineered host cell.
В седьмом аспекте настоящего изобретения предложено применение полипептида, как он описан в первом или втором аспекте, или полипептида, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или полипептида, кодируемого вектором, как он описан в четвертом аспекте, или ферментативного бульона, концентрата или полипептида, экспрессируемого клеткой, как она описана в пятом аспекте, или фосфолипазы С, как она описана в шестом аспекте, в качестве фосфолипазы С.A seventh aspect of the present invention provides the use of a polypeptide as described in the first or second aspect, or a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a polypeptide encoded by a vector as described in the fourth aspect, or an enzyme broth, a concentrate or polypeptide expressed by a cell as described in the fifth aspect, or phospholipase C as described in the sixth aspect as phospholipase C.
В некоторых воплощениях применение представляет собой применение в процессе дегуммирования масел и жиров.In some embodiments, the use is in the degumming process of oils and fats.
Применение специфичной к фосфатидилхолину фосфолипазы С в процессе дегуммирования масел и жиров известно в данной области техники. Фосфолипаза С может гидролизовать фосфолипиды глиального компонента в масле с получением гидрофильной фосфатной части и липофильного DAG. Глиальная часть удаляется, поскольку гидрофильная часть вымывается водой. DAG увеличивает выход масла. Например, процесс ферментативного дегуммирования включает нагревание неочищенного масла до 60°С, добавление раствора фосфолипазы С, перемешивание в реакторе в течение 2 ч после высокоскоростного смешивания со сдвигом и затем центрифугирование для разделения водной фазы и масляной фазы.The use of phosphatidylcholine-specific phospholipase C in the degumming process of oils and fats is known in the art. Phospholipase C can hydrolyze the phospholipids of the glial component in oil to produce the hydrophilic phosphate moiety and the lipophilic DAG. The glial part is removed as the hydrophilic part is washed away by water. DAG increases oil yield. For example, the enzymatic degumming process involves heating the crude oil to 60°C, adding a phospholipase C solution, mixing in the reactor for 2 hours after high-speed shear mixing, and then centrifuging to separate the aqueous phase and the oil phase.
В восьмом аспекте настоящего изобретения предложена ферментативная композиция, содержащая полипептид, как он описан в первом или втором аспекте, или полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или полипептид, кодируемый вектором, как он описан в четвертом аспекте, или полипептид, экспрессируемый в клетке, как она описана в пятом аспекте, или фосфолипазу С, как она описана в шестом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.An eighth aspect of the present invention provides an enzymatic composition comprising a polypeptide as described in the first or second aspect, or a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a polypeptide encoded by a vector as described in the fourth aspect, or a polypeptide expressed in a cell as described in the fifth aspect, or phospholipase C as described in the sixth aspect, and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях по меньшей мере один фермент дегуммирования выбран из группы, состоящей из: фосфолипазы A1, фосфолипазы А2, фосфолипазы В, фосфолипазы D, пектиназы и манназы.In some embodiments, the at least one degumming enzyme is selected from the group consisting of: phospholipase A 1 , phospholipase A 2 , phospholipase B, phospholipase D, pectinase, and mannase.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит полипептид, как он описан в первом или втором аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition comprises a polypeptide as described in the first or second aspect and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition comprises a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule as described in the third aspect and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит полипептид, кодируемый вектором, как он описан в четвертом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition comprises a vector-encoded polypeptide as described in the fourth aspect and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит полипептид, экспрессируемый клеткой, как она описана в пятом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition comprises a cell-expressed polypeptide as described in the fifth aspect and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит фосфолипазу С, как она описана в шестом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition contains phospholipase C, as described in the sixth aspect, and at least one degumming enzyme.
В некоторых воплощениях ферментативная композиция содержит полипептид, как он описан в первом или втором аспекте, и/или полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, и/или полипептид, кодируемый вектором, как он описан в четвертом аспекте, и/или полипептид, экспрессируемый клеткой, как она описана в пятом аспекте, и/или фосфолипазу С, как она описана в шестом аспекте, и по меньшей мере один фермент дегуммирования.In some embodiments, the enzyme composition comprises a polypeptide as described in the first or second aspect, and/or a polypeptide encoded by a nucleic acid molecule, as described in the third aspect, and/or a polypeptide encoded by a vector, as described in the fourth aspect, and /or a polypeptide expressed by a cell as described in the fifth aspect, and/or phospholipase C as described in the sixth aspect, and at least one degumming enzyme.
В девятом аспекте настоящего изобретения предложено применение полипептида, как он описан в первом или втором аспекте, или молекулы нуклеиновой кислоты, как она описана в третьем аспекте, или вектора, как он описан в четвертом аспекте, или клетки, как она описана в пятом аспекте, или ферментативной композиции, как она описана в восьмом аспекте, в изготовлении фермента для дегуммирования.A ninth aspect of the present invention provides the use of a polypeptide as described in the first or second aspect, or a nucleic acid molecule as described in the third aspect, or a vector as described in the fourth aspect, or a cell as described in the fifth aspect, or an enzymatic composition as described in the eighth aspect, in the manufacture of a degumming enzyme.
Следует понимать, что подробное описание изобретение, изложенное выше, предназначено только для ясного понимания содержания настоящего изобретения специалистами в данной области техники и не предназначено ограничивать его в каком-либо аспекте. Специалистам в данной области техники понятны различные изменения, которые можно применять к воплощениям изобретения.It should be understood that the detailed description of the invention set forth above is intended only to provide a clear understanding of the contents of the present invention to those skilled in the art and is not intended to limit the same in any aspect. Those skilled in the art will recognize various modifications that can be applied to embodiments of the invention.
ПримерыExamples
Следующие примеры предложены для дополнительного описания настоящего изобретения, без какого-либо ограничения. Экспериментальные материалыThe following examples are offered to further describe the present invention, without any limitation. Experimental materials
Основные материалы, использованные в примерах настоящего изобретения, представляют собой следующие:The main materials used in the examples of the present invention are the following:
1. Штамм1. Strain
Pichia pastoris SMD1168 (Invitrogen, номер по каталогу No. С17500), Escherichia coli DH5a (TAKARA, номер по каталогу No. D9057A).Pichia pastoris SMD1168 (Invitrogen, catalog no. C17500), Escherichia coli DH5a (TAKARA, catalog no. D9057A).
2. Культуральная среда и раствор2. Culture medium and solution
Жидкая среда LB: 0,5% дрожжевого экстракта, 1% триптона, 1% NaCl, рН 7,0.Liquid LB medium: 0.5% yeast extract, 1% tryptone, 1% NaCl, pH 7.0.
Твердая среда LB: жидкая среда LB с добавлением агара 1,5%.Solid LB medium: Liquid LB medium with 1.5% agar added.
Жидкая среда YPD: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы.Liquid YPD medium: 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose.
Твердая среда YPD: жидкая среда LB с добавлением агара 2%.YPD solid medium: LB liquid medium with 2% agar added.
Твердая среда MGYS: 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB) (содержащей сульфат аммония и не содержащая аминокислоты), 1% глицерина, 1М сорбита, 4×10-5% D-биотина, 2% агара.MGYS Solid Medium: 1.34% Yeast Nitrogen Base (YNB) (containing ammonium sulfate and no amino acid), 1% glycerol, 1M sorbitol, 4x10 -5 % D-biotin, 2% agar.
Среда ВММ для скрининга на основе фосфолипидов соевых бобов: 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB) (содержащей сульфат аммония, не содержащей аминокислоты), 4×10-5% D-биотина, 0,5% метанола (добавленный после стерилизации), 2% эмульсии лецитина соевых бобов, 0,1М буфер лимонная кислота-цитрат натрия (рН равен 6,6), 2% агара и с добавлением 10 мкМ ZnSO4⋅7 Н2О.BMM Soybean Phospholipid Screening Media: 1.34% Yeast Nitrogen Base (YNB) (containing ammonium sulfate, no amino acid), 4 x 10 -5 % D-biotin, 0.5% methanol (added after sterilization), 2% soybean lecithin emulsion, 0.1 M citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.6), 2% agar and with the addition of 10 μM ZnSO 4 ⋅ 7 H 2 O.
Получение 2% эмульсии фосфолипидов соевых бобов: 2 г фосфолипидов соевых бобов и 100 мл Н2О взвешивали и гомогенизировали при 8000 об/мин в высокоскоростном гомогенизаторе в течение 1 мин.Preparation of 2% soybean phospholipid emulsion: 2 g soybean phospholipids and 100 ml H 2 O were weighed and homogenized at 8000 rpm in a high speed homogenizer for 1 min.
Жидкая среда BMGY: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB) (содержащей сульфат аммония и не содержащей аминокислоты), 1% глицерина, 4×10-5% D-биотина, 0,1 М буфер дигидрофосфат калия гидроортофосфат калия (рН=6,0).BMGY liquid medium: 1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% Yeast Nitrogen Base (YNB) (containing ammonium sulfate and no amino acid), 1% glycerol, 4x10 -5 % D-biotin, 0 .1 M potassium dihydrogen phosphate buffer, potassium hydrogen orthophosphate (pH=6.0).
Жидкая среда BMMY: 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 1,34% основы азотного агара для дрожжей (YNB) (содержащей сульфат аммония и не содержащей аминокислоты), 0,3% ZnSO4*7Н2О, 0,5% метанола (добавленного после стерилизации), 4×10-5% D-биотина (добавленного после стерилизации), 0,1 М буфер лимонная кислота-цитрат натрия (рН=6,6).Liquid BMMY medium: 1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% Yeast Nitrogen Base (YNB) (containing ammonium sulfate and no amino acid), 0.3% ZnSO 4 *7H 2 O, 0.5% methanol (added after sterilization), 4×10 -5 % D-biotin (added after sterilization), 0.1 M citric acid-sodium citrate buffer (pH = 6.6).
3. Определение ферментативной активности: метод pNPPC3. Determination of enzymatic activity: pNPPC method
3.1 Построение стандартной кривой для определения активности фосфолипазы 0,01391 г пара-нитрофенола взвешивали и растворяли в 50 мл стерильной воды3.1 Construction of a standard curve for determining phospholipase activity 0.01391 g of para-nitrophenol was weighed and dissolved in 50 ml of sterile water
для получения 2 ммоль/л рабочего раствора. Добавляли различные реагенты, см. Таблицу 1, строили стандартную кривую, и полученная стандартная кривая представлена на Фиг. 1. Условия для определения ферментативной активности образца соответствовали таковым для построения стандартной кривой.to obtain 2 mmol/l working solution. Various reagents were added, see Table 1, a standard curve was generated, and the resulting standard curve is shown in FIG. 1. The conditions for determining the enzymatic activity of the sample corresponded to those for constructing the standard curve.
После перемешивания вышеописанных растворов их обрабатывали при 37°С в течение 15 минут, затем добавляли 500 мкл 0,5 н. NaOH. Измеряли поглощение при 410 нм.After mixing the above solutions, they were treated at 37°C for 15 minutes, then 500 μl of 0.5 N was added. NaOH. Absorbance was measured at 410 nm.
3.2 Получение реакционного буфера3.2 Preparation of reaction buffer
0,1 М буфер борная кислота-борат натрия (рН=7,6), содержащий 20 мм pNPPC.0.1 M boric acid-sodium borate buffer (pH=7.6) containing 20 mM pNPPC.
Брали 600 мкл вышеописанного буфера, добавляли 25 мкл и проводили реакцию при 37°С в течение 15 мин, затем добавляли 500 мкл 0,5 н. NaOH. Реакцию останавливали и измеряли поглощение при 410 нм.We took 600 μl of the above-described buffer, added 25 μl and carried out the reaction at 37°C for 15 minutes, then added 500 μl of 0.5 N. NaOH. The reaction was stopped and absorbance was measured at 410 nm.
4. Расчет ферментативной активности4. Calculation of enzymatic activity
Ферментативную активность рассчитывали по следующей формуле: Ферментативная активность образца (Ед/мл)=А (поглощение при 410 нм)×0,1935×фактор разведениях 10/15Enzyme activity was calculated using the following formula: Enzyme activity of sample (U/ml)=A (absorbance at 410 nm)×0.1935×dilution factor 10/15
5. Реагенты для измерения концентрации белков:5. Reagents for measuring protein concentration:
Набор реактивов для определения концентрации белка по модифицированному методу Брэдфорда (доступен от Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd.).Modified Bradford Protein Concentration Reagent Kit (available from Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd.).
6. Ферменты, используемые в эксперименте:6. Enzymes used in the experiment:
Sal I (доступна от New England Biotechnology (Beijing) Co., Ltd.); ДНК-полимераза: ДНК-полимераза PrimeSTAR®HS (доступна от Takara (Dalian) Co., Ltd.);Sal I (available from New England Biotechnology (Beijing) Co., Ltd.); DNA polymerase: PrimeSTAR®HS DNA polymerase (available from Takara (Dalian) Co., Ltd.);
T4 ДНК-лигаза (доступна от Fermentas Co., Ltd.).T4 DNA ligase (available from Fermentas Co., Ltd.).
Пример 1: Конструирование и скрининг библиотеки мутантной фосфолипазы СExample 1: Construction and Screening of a Phospholipase C Mutant Library
Вектор pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H получали согласно способу, описанному в CN 201510946696.1.The vector pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H was obtained according to the method described in CN 201510946696.1.
Вектор pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H использовали в качестве матрицы, библиотека аминокислот в положениях 6, 8, 10, 104 и 205 для случайного насыщающего мутагенеза была сконструирована Synbio Technologies (Suzhou) Co., Ltd. Плазмидной библиотекой трансформировали Е. coli DH5a и все полученные клоны Е. coli промывали жидкой средой LB (содержащей 100 мкг/мл ампициллина), культивировали при 37°С в течение 4 ч. Плазмиды экстрагировали и линеаризовали Sail, и выделяли фрагмент примерно 8,5 т.н. Брали 500 нг вектора и трансформировали им компетентные клетки штамма Pichia pastoris М314 путем электропорации. Трансформанты высевали на чашки MGYS и инкубировали при 30°С в течение трех суток для получения библиотеки Pichia pastoris, мутантных по PLC-N63DN131SN134D-Y56H. Моноклоны собирали с чашки и высевали на чашку со средой ВММ для скрининга на основе фосфолипидов соевых бобов. Отбирали клоны с большим белым кольцом преципитации. Мутантные штаммы получали и обозначали как PLC-9-49.The vector pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H was used as a template, and a library of amino acids at positions 6, 8, 10, 104 and 205 for random saturation mutagenesis was constructed by Synbio Technologies (Suzhou) Co., Ltd. E. coli DH5a was transformed with the plasmid library and all resulting E. coli clones were washed with liquid LB medium (containing 100 μg/ml ampicillin), cultured at 37°C for 4 hours. Plasmids were extracted and linearized with Sail, and a fragment of approximately 8.5 was isolated so-called We took 500 ng of vector and transformed it into competent cells of the Pichia pastoris strain M314 by electroporation. Transformants were plated on MGYS plates and incubated at 30°C for three days to obtain a library of PLC-N63DN131SN134D-Y56H mutant Pichia pastoris. Monoclones were collected from the plate and plated on a plate containing BMM soybean phospholipid screening medium. Clones with a large white precipitation ring were selected. Mutant strains were generated and designated PLC-9-49.
Пример 2: Анализ последовательности мутантной фосфолипазы СExample 2: Sequence Analysis of Mutant Phospholipase C
Штамм PLC-9-49 инокулировали в 3 мл жидкой среды YPD при 30°С в течение ночи и затем экстрагировали геномную ДНК. Геномную ДНК штамма PLC-9-49 использовали в качестве матрицы. Амплификацию ПЦР проводили с помощью ДНК-полимеразы PrimeSTAR®HS и пары праймеров АОХ1-5/АОХ1-3 для получения последовательности ДНК штамма PLC-9-49, гдеStrain PLC-9-49 was inoculated into 3 ml of liquid YPD medium at 30°C overnight and then genomic DNA was extracted. Genomic DNA of strain PLC-9-49 was used as a template. PCR amplification was performed using PrimeSTAR®HS DNA polymerase and a pair of primers AOX1-5/AOX1-3 to obtain the DNA sequence of strain PLC-9-49, where
последовательность праймера АОХ1-5 представляла собой 5'-GACTGGTTCC AATTGAC AACG-3';the AOX1-5 primer sequence was 5′-GACTGGTTCC AATTGAC AACG-3′;
последовательность праймера АОХ1-3 представляла собой 5'-GGC AAATGGCATTCTG АС АТССТС-3'.the AOX1-3 primer sequence was 5′-GGC AAATGGCATTCTG AC ATCCTC-3′.
Полученные последовательности отправляли в Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. и секвенировали с парой праймеров АОХ1-5/АОХ1-3. Результаты секвенирования ДНК PLC-9-49 представлены в SEQ ID NO: 3. После выравнивания, в сравнении с SEQ ID NO: 1, несколько оснований в SEQ ID NO: 3 подверглись мутациям, так лизин в положении 6 был заменен на пролин, лизин в положении 8 был заменен на изолейцин, глицин в положении 10 был заменен на треонин, лизин в положении 104 был заменен на глицин, и серии в положении 205 был заменен на тирозин. Аминокислотная последовательность PLC-9-49 представлена в SEQ ID NO: 4.The obtained sequences were sent to Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd. and sequenced with the primer pair AOX1-5/AOX1-3. The results of DNA sequencing of PLC-9-49 are presented in SEQ ID NO: 3. After alignment, in comparison with SEQ ID NO: 1, several bases in SEQ ID NO: 3 were mutated, so the lysine at position 6 was replaced by proline, lysine at position 8 was replaced by isoleucine, glycine at position 10 was replaced by threonine, lysine at position 104 was replaced by glycine, and series at position 205 was replaced by tyrosine. The amino acid sequence of PLC-9-49 is shown in SEQ ID NO: 4.
Пример 3: Анализ термостабильности мутантной PLC-9-49Example 3: Thermal Stability Analysis of Mutant PLC-9-49
Брали штамм PLC-9-49 и штамм PLC-N63DN131SN134D-Y56H и активировали в жидкой YPD и затем инокулировали в среду BMGY при 30°С на ночь при 220 об/мин. Культуру переносили в среду BMMY, где начальная OD600 составляла 6.Strain PLC-9-49 and strain PLC-N63DN131SN134D-Y56H were taken and activated in liquid YPD and then inoculated into BMGY medium at 30°C overnight at 220 rpm. The culture was transferred to BMMY medium, where the initial OD 600 was 6.
Сначала проводили индукцию 2% метанолом с добавлением 1% метанола через 48 ч и 56 ч, соответственно, и отбирали образцы через 72 ч. Полученные образцы концентрировали в 40 раз путем обессоливания ультрафильтрацией с помощью ультрафильтрационных трубок с порогом отсечения молекулярной массы 40 кДа. Обработанные образцы добавляли в буфер (20 мМ буфер лимонная кислота-цитрат натрия (рН 6,6), 10 мкМ ZnSO4).First, induction with 2% methanol was carried out with the addition of 1% methanol after 48 h and 56 h, respectively, and samples were collected after 72 h. The resulting samples were concentrated 40-fold by desalting by ultrafiltration using ultrafiltration tubes with a molecular weight cutoff of 40 kDa. The treated samples were added to a buffer (20 mM citric acid-sodium citrate buffer (pH 6.6), 10 μM ZnSO 4 ).
Ферментативный бульон, сконцентрированный путем ультрафильтрации, хранили при 60°С, 65°С, 70°С и 75°С в течение 2 ч, и 0,5 мкл концентрата ферментативного бульона добавляли в 600 мкл реакционного буфера pNPPC и подвергали взаимодействию при 37°С в течение 15 мин, затем добавляли 500 мкл 0,5 н. NaOH для остановки реакции и измеряли поглощение при 410 нм. Активность фосфолипазы С для каждого ферментативного образца рассчитывали по стандартной кривой.The fermentation broth concentrated by ultrafiltration was stored at 60°C, 65°C, 70°C, and 75°C for 2 h, and 0.5 μL of the enzyme broth concentrate was added to 600 μL of pNPPC reaction buffer and reacted at 37°C. C for 15 min, then 500 μl of 0.5 N was added. NaOH to stop the reaction and absorbance was measured at 410 nm. Phospholipase C activity for each enzyme sample was calculated using a standard curve.
Термостабильность PLC-9-49 и PLC-N63DN131SN134D-Y56H показана на Фиг. 2. После обработки при 60°С в течение 2 ч мутантные PLC-9-49 сохраняли жизнеспособность на 91%, в то время как жизнеспособность PLC-N63DN131SN134D-Y56H уменьшалась до 44%. После обработки при 70°С в течение 2 ч мутантные PLC-9-49 сохраняли жизнеспособность на 83%, в то время как жизнеспособность PLC-N63DN131SN134D-Y56H уменьшалась до 13%. После обработки при 75°С в течение 2 ч мутантные PLC-9-49 сохраняли жизнеспособность на 61%, в то время как жизнеспособность PLC-N63DN131SN134D-Y56H уменьшалась до 3%.The thermal stability of PLC-9-49 and PLC-N63DN131SN134D-Y56H is shown in Fig. 2. After treatment at 60°C for 2 h, the PLC-9-49 mutant retained 91% viability, while the viability of PLC-N63DN131SN134D-Y56H decreased to 44%. After treatment at 70°C for 2 h, the PLC-9-49 mutant retained 83% viability, while the viability of PLC-N63DN131SN134D-Y56H decreased to 13%. After treatment at 75°C for 2 h, the PLC-9-49 mutant retained 61% viability, while the viability of PLC-N63DN131SN134D-Y56H decreased to 3%.
Можно видеть, что термостабильность PLC-9-49 значительно выше, чем таковая у PLC-N63DN131SN134D-Y56H.It can be seen that the thermal stability of PLC-9-49 is significantly higher than that of PLC-N63DN131SN134D-Y56H.
Пример 4: Тест дегуммирования PLC-9-49Example 4: PLC-9-49 Degumming Test
100 г неочищенного соевого масла нагревали до 55°С и 60°С, соответственно, для дегуммирования. Образцы по 50 миллионных долей (м.д.) PLC-9-49 и PLC-N63DN131SN134D-Y56H добавляли соответственно для получения водной фазы 3% в системе, и центрифугировали в течение 1 мин с помощью высокоскоростной центрифуги (10000 об/мин), перемешивали при 55°С и 60°С (750 об/мин) в течение 2 ч, нагревали до 85°С и выдерживали при этой температуре в течение 5 мин. Образцы центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин и брали примерно 10 г верхнего образца масла. Уровень DAG определяли методом HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). Прирост DAG в образце PLC-9-49 и образце PLC-N63DN131SN134D-Y56H относительно неочищенного масла показан на Фиг. 3. Дегуммирование с использованием PLC-9-49 при 60°С увеличивает прирост DAG примерно на 10% по сравнению с 55°С, в то время как дегуммирование с использованием PLC-N63DN131SN134D-Y56H при 60°С уменьшает прирост DAG на 9,4% по сравнению с 55°С.100 g of crude soybean oil was heated to 55°C and 60°C, respectively, for degumming. 50 ppm samples of PLC-9-49 and PLC-N63DN131SN134D-Y56H were added respectively to obtain a 3% aqueous phase in the system, and centrifuged for 1 min using a high-speed centrifuge (10,000 rpm), stirred at 55°C and 60°C (750 rpm) for 2 hours, heated to 85°C and maintained at this temperature for 5 minutes. The samples were centrifuged at 12,000 rpm for 10 min and approximately 10 g of the top oil sample was taken. DAG levels were determined by HPLC (high performance liquid chromatography). The increase in DAG in sample PLC-9-49 and sample PLC-N63DN131SN134D-Y56H relative to the crude oil is shown in FIG. 3. Degumming using PLC-9-49 at 60°C increases DAG growth by approximately 10% compared to 55°C, while degumming using PLC-N63DN131SN134D-Y56H at 60°C reduces DAG growth by 9. 4% compared to 55°C.
Видно, что температура дегуммирования PLC-9-49 примерно на 5°С выше, чем таковая для PLC-N63DN131SN134D-Y56H. Следовательно, промышленная применимость PLC-9-49 лучше.It can be seen that the degumming temperature of PLC-9-49 is approximately 5°C higher than that of PLC-N63DN131SN134D-Y56H. Therefore, the industrial applicability of PLC-9-49 is better.
--->--->
Sequence ListingSequence Listing
<110> WILMAR (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY RESEARCH & DEVELOPMENT CENTER <110> WILMAR (SHANGHAI) BIOTECHNOLOGY RESEARCH & DEVELOPMENT CENTER
CO., LTDCO.,LTD
<120> POLYPETIDE HAVING PHOSPHOLIPASE C ACTIVITY AND USE THEREOF<120> POLYPETIDE HAVING PHOSPHOLIPASE WITH ACTIVITY AND USE THEREOF
<130> 19A592<130> 19A592
<150> CN 201811625457.6<150>CN 201811625457.6
<151> 2018-12-28<151> 2018-12-28
<160> 4<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1<210> 1
<211> 738<211> 738
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая <223> Nucleic acid sequence encoding
PLC-N63DN131SN134D-Y56HPLC-N63DN131SN134D-Y56H
<400> 1<400> 1
tggtcagctg aggacaagca taaggaaggt gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt tggtcagctg aggacaagca taaggaaggt gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt
60 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg
120 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat
180 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc
240 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca
300 300
tacaagaata aagacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg tacaagaata aagacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg
360 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacaggt
420 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat
480 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca
540 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg
600 600
aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact aaagccgcag tctcccagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact
660 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac
720 720
acttacggtg acaggtaa acttacggtg acaggtaa
738 738
<210> 2<210> 2
<211> 245<211> 245
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная последовательность PLC-N63DN131SN134D-Y56H<223> Amino acid sequence PLC-N63DN131SN134D-Y56H
<400> 2<400> 2
Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu TrpTrp Ser Ala Glu Asp Lys His Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 151 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu ValIle Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30 20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu GluLys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45 35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp SerAsn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr IleThr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 8065 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys LeuPro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95 85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe TyrAla Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110 100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met HisLeu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser LysAla Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr AspTyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp IleGly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175 165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val AsnHis Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190 180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu TyrAsp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr
195 200 205 195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg LeuAla Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220 210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe AspMet Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp ArgThr Tyr Gly Asp Arg
245 245
<210> 3<210> 3
<211> 738<211> 738
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая PLC-9-49<223> Nucleic acid sequence encoding PLC-9-49
<400> 3<400> 3
tggtcagctg aggaccctca tattgaaact gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt tggtcagctg aggaccctca tattgaaact gtgaatagtc acttatggat cgtgaaccgt
60 60
gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg gccattgata taatgtctag gaatacaact ctggttaagc aagatagagt tgctcaattg
120 120
aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat aatgaatggc gtacagagct agagaatggc atctacgctg ctgatcatga aaacccctat
180 180
tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc tacgatgaca gtaccttcgc ttctcacttt tacgatccag acaacggaaa gacatatatc
240 240
ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca ccattcgcca agcaagctaa ggagactgga gctaagtact tcaagttggc tggagagtca
300 300
tacaagaatg gggacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg tacaagaatg gggacatgaa gcaggccttc ttttatcttg ggttgtcatt gcattatttg
360 360
ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacagggt ggcgatgtca accaacctat gcatgccgca tcctttacgg acctgtccta tccacaggt
420 420
tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat tttcactcca agtacgagaa ctttgtcgat actattaaag acaactacaa agttaccgat
480 480
gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca gggaacggat attggaattg gaaaggcacc aaccctgaag aatggattca cggtgcagca
540 540
gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg gtagttgcaa aacaggacta ctctggaatt gtcaatgaca ataccaaaga ttggtttgtg
600 600
aaagccgcag tctatcagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact aaagccgcag tctatcagga atatgcagat aaatggagag ctgaagttac acctatgact
660 660
ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac ggtaaacgac taatggatgc ccaaagagtt actgctggtt acattcaatt atggttcgac
720 720
acttacggtg acaggtaa acttacggtg acaggtaa
738 738
<210> 4<210> 4
<211> 245<211> 245
<212> PRT<212>PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Аминокислотная последовательность PLC-9-49<223> Amino acid sequence of PLC-9-49
<400> 4<400> 4
Trp Ser Ala Glu Asp Pro His Ile Glu Thr Val Asn Ser His Leu TrpTrp Ser Ala Glu Asp Pro His Ile Glu Thr Val Asn Ser His Leu Trp
1 5 10 151 5 10 15
Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu ValIle Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val
20 25 30 20 25 30
Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu GluLys Gln Asp Arg Val Ala Gln Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu
35 40 45 35 40 45
Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp SerAsn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp His Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr IleThr Phe Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 8065 70 75 80
Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys LeuPro Phe Ala Lys Gln Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu
85 90 95 85 90 95
Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Gly Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe TyrAla Gly Glu Ser Tyr Lys Asn Gly Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr
100 105 110 100 105 110
Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met HisLeu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His
115 120 125 115 120 125
Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser LysAla Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr AspTyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp
145 150 155 160145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp IleGly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile
165 170 175 165 170 175
His Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val AsnHis Gly Ala Ala Val Val Ala Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn
180 185 190 180 185 190
Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Tyr Gln Glu TyrAsp Asn Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Tyr Gln Glu Tyr
195 200 205 195 200 205
Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg LeuAla Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu
210 215 220 210 215 220
Met Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe AspMet Asp Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Tyr Gly Asp ArgThr Tyr Gly Asp Arg
245 245
<---<---
Claims (10)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811625457.6 | 2018-12-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021120536A RU2021120536A (en) | 2023-01-30 |
| RU2819269C2 true RU2819269C2 (en) | 2024-05-16 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200401407A1 (en) * | 2002-04-19 | 2006-02-24 | Дайверса Корпорейшн | PHOSPHOLIPASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM, AND METHODS FOR THEIR RECEIVING AND APPLICATION |
| RU2500811C1 (en) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Recombinant bacillus subtilis bacteria strain-producer of specific phospholipase |
| WO2015140275A1 (en) * | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same |
| CN106459934A (en) * | 2014-05-15 | 2017-02-22 | 诺维信公司 | Compositions comprising polypeptides having phospholipase c activity and use thereof |
| CN106884009A (en) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | The efficient phospholipase C mutant for being independent of zinc ion |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA200401407A1 (en) * | 2002-04-19 | 2006-02-24 | Дайверса Корпорейшн | PHOSPHOLIPASES, NUCLEIC ACIDS ENCODING THEM, AND METHODS FOR THEIR RECEIVING AND APPLICATION |
| RU2500811C1 (en) * | 2012-10-10 | 2013-12-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Recombinant bacillus subtilis bacteria strain-producer of specific phospholipase |
| WO2015140275A1 (en) * | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having phospholipase c activity and polynucleotides encoding same |
| CN106459934A (en) * | 2014-05-15 | 2017-02-22 | 诺维信公司 | Compositions comprising polypeptides having phospholipase c activity and use thereof |
| CN106884009A (en) * | 2015-12-16 | 2017-06-23 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | The efficient phospholipase C mutant for being independent of zinc ion |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YAMPOLSKY L.Y. et al., The exchangeability of amino acids in proteins, Genetics, 2005, v.170, n.4, p.1459-1472, KESKIN O. et al., A new, structurally nonredundant, diverse data set of protein-protein interfaces and its implications, Protein Sci., 2004, v.13, n.4, p.1043-1055. * |
| БД UniProt последовательность под номером A0A2B1YF47_BACCE, размещена 12.09.2018, * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10144919B2 (en) | Phospholipase C mutant and use thereof | |
| EP3392336B1 (en) | Efficient phospholipase c mutant that does not rely on zinc ions | |
| CN106986922B (en) | A kind of self-assembled amphiphilic short peptide and its application | |
| CN108342407A (en) | A method of obtain high expression, high vigor and high stability enzyme mutant | |
| CN108239648B (en) | Method for efficiently expressing rhizomucor miehei lipase | |
| CN108239627B (en) | Lipase with improved activity and application thereof | |
| CN108588061A (en) | The low-temperature alkali pectin enzyme mutant that a kind of specific enzyme activity and thermal stability improve | |
| CN108118039B (en) | Phospholipase C mutant | |
| CN108251400B (en) | Lipase and application thereof | |
| RU2819269C2 (en) | Polypeptide having phospholipase c activity, and use thereof | |
| US12264340B2 (en) | Polypeptide having phospholipase C activity and use thereof | |
| US12203109B2 (en) | Phospholipase C mutant with high enzyme activity | |
| WO2019114645A1 (en) | Phospholipase c and encoding gene thereof | |
| CN108277212B (en) | Lipase mutant Gly183Cys/Gly212Cys and gene and application thereof | |
| CN106085994B (en) | An Alkaline Pectinase Mutant with Increased Specific Enzyme Activity | |
| CN110452892B (en) | Macro-gene-derived lipase, encoding gene, vector, engineering bacterium and application of macro-gene-derived lipase in preparation of lutein | |
| CN111117980B (en) | An Antarctic soil-derived esterase and its encoding gene and application | |
| RU2818353C2 (en) | Mutant of phospholipase with high enzymatic activity | |
| CN113025595A (en) | Acid-tolerant lipases | |
| CN105669841B (en) | Polypeptide, fusion enzyme, preparation method and application thereof | |
| CN113913412B (en) | Proteinase K mutants and preparation methods thereof | |
| CN103965304B (en) | A kind of oleaginous yeast fat drips albumen and encoding gene thereof and application | |
| CN103965306B (en) | A kind of oleaginous yeast fat drips albumen and encoding gene thereof and application | |
| CN103965305B (en) | A kind of oleaginous yeast fat drips albumen and encoding gene thereof and application | |
| Wardi et al. | MUTATION STUDY OF CELLOBIOSE DEHYDROGENASE FROM PHANEROCAETE CRHYSOSPORIUM IN A PROKARIOTIC SYSTEM FOR MULTIPLE BIOSENSOR APPLICATION |