+

RU2818360C1 - Method of creating target panel for studying genomic regions for detecting therapeutic biomarkers of immune checkpoint (ic) inhibitors - Google Patents

Method of creating target panel for studying genomic regions for detecting therapeutic biomarkers of immune checkpoint (ic) inhibitors Download PDF

Info

Publication number
RU2818360C1
RU2818360C1 RU2023118107A RU2023118107A RU2818360C1 RU 2818360 C1 RU2818360 C1 RU 2818360C1 RU 2023118107 A RU2023118107 A RU 2023118107A RU 2023118107 A RU2023118107 A RU 2023118107A RU 2818360 C1 RU2818360 C1 RU 2818360C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
genomic regions
target genomic
cancer
dna
genes
Prior art date
Application number
RU2023118107A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Сергей Михайлович Юдин
Антон Артурович Кескинов
Валентин Владимирович Макаров
Владимир Сергеевич Юдин
Анна Сергеевна Макарова
Александр Павлович Котюргин
Николай Андреевич Бугаев-Макаровский
Павел Викторович Ершов
Екатерина Андреевна Снигирь
Антонида Викторовна Махотенко
Екатерина Дмитриевна Маралова
Юлия Николаевна Ванюшина
Александра Денисовна Кикот
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью" Федерального медико-биологического агентства
Application granted granted Critical
Publication of RU2818360C1 publication Critical patent/RU2818360C1/en

Links

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: described is a method of creating a target panel for investigating target genomic regions to identify predictive genetic biomarkers of potential effectiveness and/or resistance to immune checkpoint (CI) inhibitors. Method involves genetic analysis of resection or biopsy material of tumor tissue of patient with diagnosed malignant neoplasm (MNP) before the beginning of the course or during immunotherapy based on immune checkpoint inhibitors—anti-PD-l or anti-PD-L1 preparations, namely: laboratory extraction of DNA from a sample of tumor material, measurement of concentration of extracted DNA, preparation of DNA libraries using tumor DNA as a matrix for amplification of target genomic regions during PCR with specific primers, sequencing of DNA libraries, subsequent bioinformatic processing of sequencing results, interpretation of biological and clinical significance of genetic variants detected by results of targeted sequencing, identification of predictive genetic biomarkers of potential efficacy and/or resistance to immunotherapy with immune checkpoint inhibitors based on target genome regions including coding sequences of 34 genes: JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, B2M, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, BAP1, POLE, POLD1, EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), as well as sections of 9p24.1 locus: genes JAK2, PD-L1, and PD-L2 and intergenic regions.
EFFECT: invention can be used for selection of anticancer therapy or determination of its possible effectiveness.
12 cl, 5 tbl

Description

Область техники: изобретение относится к области биоинформатики и клинической онкологии, диагностики злокачественных новообразований (ЗНО) и оценки потенциальной эффективности иммунотерапии.Field of technology: the invention relates to the field of bioinformatics and clinical oncology, diagnosis of malignant neoplasms (malignant neoplasms) and assessment of the potential effectiveness of immunotherapy.

Описание уровня техникиDescription of the prior art

Консервативная противоопухолевая иммунотерапия ингибиторами контрольных точек иммунного ответа (ИКТ), в частности, ингибиторами рецептора программируемой клеточной гибели (PD-1) или его лиганда PD-L1, является крайне полезной терапевтической опцией при лечении многих ЗНО различной этиологии и локализации (меланома, рак легких, рак головы и шеи, лимфома Ходжкина, уротелиальный рак, рак пищевода, рак желудка, колоректальный рак, рак шейки матки, рак почки, рак эндометрия, тройной негативный рак молочной железы, рак печени) [Darvishi М, et al. (2023), Pathol Res Pract, 241, 154241]. Иммунотерапию применяют как в монорежиме, так и в комбинации с иными терапевтическими опциями (химиотерапия или лучевая терапия) [Zhang Z., et al. (2022), Sig Transduct Target Ther, 7, 258].Conservative antitumor immunotherapy with immune checkpoint inhibitors (ICIs), in particular inhibitors of the programmed cell death receptor (PD-1) or its ligand PD-L1, is an extremely useful therapeutic option in the treatment of many cancers of various etiologies and localizations (melanoma, lung cancer , head and neck cancer, Hodgkin lymphoma, urothelial cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colorectal cancer, cervical cancer, kidney cancer, endometrial cancer, triple negative breast cancer, liver cancer) [Darvishi M, et al. (2023), Pathol Res Pract, 241, 154241]. Immunotherapy is used both alone and in combination with other therapeutic options (chemotherapy or radiation therapy) [Zhang Z., et al. (2022), Sig Transduct Target Ther, 7, 258].

Прогнозирование эффективности иммунотерапии до ее начала или при необходимости - в процессе прохождения курсов лечения критично по нескольким параметрам: достижение максимальной выживаемости пациентов и повышение качества их жизни, экономия дорогостоящих препаратов и снижение избыточной токсичности при использовании комбинированных терапевтических схем. Для большинства анти-PD-L1/анти-PD-1 препаратов предиктивным маркером является уровень экспрессии PD-L1 в опухоли. Однако ввиду наличия нескольких различных клинически валидированных диагностических платформ для оценки статуса PD-L1 в разных типах ЗНО для отдельных анти-PD-L1/анти-PD-1 препаратов, данный вариант теста не может выступать в роли универсального анализа. В российской клинической практике для стратификации пациентов для назначения иммунотерапии также не используются мультипараметрические тест-системы, применение которых позволило бы одновременно оценивать наличие нескольких возможных биомаркеров эффективности и резистентности к анти-PD-L1/анти-PD-1 терапии.Predicting the effectiveness of immunotherapy before it begins or, if necessary, during treatment courses is critical in several respects: achieving maximum patient survival and improving their quality of life, saving expensive drugs and reducing excess toxicity when using combination therapeutic regimens. For most anti-PD-L1/anti-PD-1 drugs, the predictive marker is the level of PD-L1 expression in the tumor. However, due to the availability of several different clinically validated diagnostic platforms for assessing PD-L1 status in different types of cancer for individual anti-PD-L1/anti-PD-1 drugs, this test option cannot act as a universal test. In Russian clinical practice, multiparametric test systems are also not used to stratify patients for immunotherapy, the use of which would allow simultaneous assessment of the presence of several possible biomarkers of effectiveness and resistance to anti-PD-L1/anti-PD-1 therapy.

В реальной клинической практике нередко регистрируют невысокую частоту ответа на монотерапию ИКТ (в общей популяции пациентов), что может быть обусловлено различиями индивидуальных профилей иммуногенных опухолевых антигенов у пациентов и реализацией различных молекулярных механизмов резистентности - первичной или вторичной, приобретенной в результате проведения курсов иммунотерапии [Bai R, et al., Mechanisms of cancer resistance to immunotherapy. Front Oncol, 2020, 10, 1290]. В последних случаях некоторые из вариантов резистентности могут быть преодолены переходом к схемам иммунотерапии в сочетании с другими препаратами.In real clinical practice, a low response rate to ICT monotherapy is often recorded (in the general patient population), which may be due to differences in the individual profiles of immunogenic tumor antigens in patients and the implementation of various molecular mechanisms of resistance - primary or secondary, acquired as a result of courses of immunotherapy [Bai R, et al., Mechanisms of cancer resistance to immunotherapy. Front Oncol, 2020, 10, 1290]. In the latter cases, some of the resistance patterns can be overcome by switching to immunotherapy regimens in combination with other drugs.

В настоящее время в качестве предиктивных маркеров для назначения анти-PD-L1/анти-PD-1 препаратов (здесь и далее упоминаются в значении маркеров, ассоциированных с потенциальной эффективностью проводимой терапии) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) были одобрены три показателя: экспрессия PD-L1, мутационная нагрузка опухоли и микросателлитная нестабильность (MSI) [Sankar K., et al. (2022), 10(1), 1-13]. На доклинической стадии исследуют широкий профиль кандидатных предиктивных биомаркеров с использованием методик анализа экспрессии панелей генов, мультиплексного иммуногистохимического анализа (ИГХ), иммунофлуоресценции, оценки количества инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) и репертуара рецепторов Т-клеток (TCR), биомаркеров периферической крови и комплексной оценки иммунной системы [Sankar K., et al. (2022), 10(1), 1-13].Currently, as predictive markers for the prescription of anti-PD-L1/anti-PD-1 drugs (hereinafter referred to as markers associated with the potential effectiveness of therapy) by the US Food and Drug Administration (FDA ) three indicators were validated: PD-L1 expression, tumor mutational load, and microsatellite instability (MSI) [Sankar K., et al. (2022), 10(1), 1-13]. In the preclinical stage, a wide range of candidate predictive biomarkers are being explored using gene expression panels, multiplex immunohistochemistry (IHC), immunofluorescence, tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and T cell receptor repertoire (TCR), peripheral blood biomarkers and comprehensive assessments. immune system [Sankar K., et al. (2022), 10(1), 1-13].

Наиболее распространенными способами определения предиктивных маркеров является геномное и транскриптомное профилирование опухоли для выявления генетических вариантов целевых генов и количественных изменений уровней их транскриптов в клетках, соответственно, с помощью доступных коммерческих платформ (например, NanoString nCounter). Образец РНК смешивается с биотинилированным зондом и репортерным зондом, помеченным флуоресцентной меткой, уникальной для таргетного гена. Зонды и целевые транскрипты гибридизуют в течение 12-16 ч при 65°С. Тройные комплексы, специфичные для транскрипта, иммобилизуют в картридже со стрептавидином. В частности, было показано, что сигнатура экспрессии генов, ассоциированная с сигнальным каскадом интерферона гамма, может выступать в качестве биомаркера ответа на терапию пембролизумабом у пациентов с плоскоклеточной карциномой головы и шеи [Ayers М., et al. (2017), 127(8), 2930-2940]. Второй способ основан на исследовании методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) не только РНК, но и опухолевой ДНК (полноэкзомное, полногеномное или таргетное секвенирование), с использованием платформ «Illumina» или «PacBio». Так, было установлено, что уровень экспрессии PD-L1 более 5% не обладает предиктивным потенциалом для назначения ниволумаба вместо химиотерапии, однако ассоциирован с меньшим количеством нежелательных эффектов при применении ниволумаба после курса химиотерапии [Carbone D. P., et al., (2017), 376(25), 2415-2426]. Третий способ основан на хорошо воспроизводимых подходах количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Например, при наследственном опухолевом синдроме - синдроме Линча, MSI выявляют путем проведения мультиплексной ПЦР ДНК опухолевых клеток и расположенных рядом нормальных клеток слизистой оболочки кишечника. Наличие либо отсутствие микросателлитных повторов определяется при сопоставлении длины амплифицированных ПЦР-фрагментов. В зависимости от наличия или отсутствия микросателлитной нестабильности, а также от того, сколько именно локусов нестабильны, прогноз эффективности иммунотерапии может отличаться [Baretti М., et al., (2018), 189, 45-62].The most common methods for identifying predictive markers are tumor genomic and transcriptomic profiling to identify genetic variants of target genes and quantify changes in their transcript levels in cells, respectively, using commercially available platforms (e.g., NanoString nCounter). The RNA sample is mixed with a biotinylated probe and a reporter probe labeled with a fluorescent tag unique to the target gene. Probes and target transcripts are hybridized for 12–16 h at 65°C. Transcript-specific ternary complexes are immobilized in a streptavidin cartridge. In particular, it has been shown that a gene expression signature associated with the interferon gamma signaling cascade can act as a biomarker of response to pembrolizumab therapy in patients with head and neck squamous cell carcinoma [Ayers M., et al. (2017), 127(8), 2930-2940]. The second method is based on the study of high-throughput sequencing (NGS) of not only RNA, but also tumor DNA (whole exome, whole genome or targeted sequencing), using the Illumina or PacBio platforms. Thus, it was found that a PD-L1 expression level of more than 5% does not have predictive potential for prescribing nivolumab instead of chemotherapy, but is associated with fewer adverse effects when using nivolumab after a course of chemotherapy [Carbone D. P., et al., (2017), 376 (25), 2415-2426]. The third method is based on highly reproducible quantitative polymerase chain reaction (PCR) approaches. For example, in the hereditary tumor syndrome - Lynch syndrome, MSI is detected by performing multiplex PCR of DNA of tumor cells and adjacent normal cells of the intestinal mucosa. The presence or absence of microsatellite repeats is determined by comparing the length of amplified PCR fragments. Depending on the presence or absence of microsatellite instability, as well as on exactly how many loci are unstable, the prognosis for the effectiveness of immunotherapy may differ [Baretti M., et al., (2018), 189, 45-62].

ИГХ-исследование, выполняемое с использованием различных техник флуорохромной микроскопии и микродиссекции тканей, широко применяется для исследования протеомного профиля опухолевого материала, заключенного в парафиновые блоки, или свежезамороженного материала. Сущность ИГХ-анализа заключается либо в выявлении конкретного белка, ассоциированного с прогрессированием заболевания или эффективностью терапии, либо в исследовании изменений соотношений ряда белков, либо регистрации увеличения/уменьшения количества некоторого белка в опухолевых клетках. Например, посредством ИГХ-исследования была выявлена связь между повышенной экспрессией PD-L1 и наилучшими клиническими ответами у пациентов с немелклеточным раком легкого, получивших терапию пембролизумабом [Roach С, et al., (2016), Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., 24(6), 392]. С другой стороны, также удалось установить, что высокий уровень экспрессии PD-1/PD-L1 и/или IDO-1/HLA-DR в опухолевой ткани коррелирует с высокой чувствительностью метастатической меланомы к пембролизумабу или ниволумабу [Johnson D. В., et al. (2018). Clin Cancer Res, 24(21), 5250-5260]. Данный подход технически проще генетического профилирования, однако обладает меньшей точностью и меньшей предсказательной силой (особенно когда биомаркером служит некоторый диапазон значений концентрации белка).IHC studies, performed using various techniques of fluorochrome microscopy and tissue microdissection, are widely used to study the proteomic profile of tumor material embedded in paraffin blocks or fresh frozen material. The essence of IHC analysis is either to identify a specific protein associated with disease progression or the effectiveness of therapy, or to study changes in the ratios of a number of proteins, or to record an increase/decrease in the amount of a certain protein in tumor cells. For example, an IHC study found an association between increased PD-L1 expression and better clinical responses in patients with non-small cell lung cancer treated with pembrolizumab [Roach C, et al., (2016), Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol., 24(6), 392]. On the other hand, it was also possible to establish that a high level of expression of PD-1/PD-L1 and/or IDO-1/HLA-DR in tumor tissue correlates with the high sensitivity of metastatic melanoma to pembrolizumab or nivolumab [Johnson D. V., et al. (2018). Clin Cancer Res, 24(21), 5250-5260]. This approach is technically simpler than genetic profiling, but has less accuracy and less predictive power (especially when the biomarker is a certain range of protein concentrations).

Перспективным выглядит подход с применением генетической панели, при использовании которой возможно будет проанализировать в опухолевой ДНК наличие терапевтически значимых маркеров и биомаркеров в нескольких генах сразу. Важно, что геномная ДНК по сравнению с РНК и белковыми фракциями - более стабильный аналит для выявления биомаркеров. Для генетических исследований используют секвенирование целевых регионов по Сэнгеру либо аллель-специфическую ПЦР, либо варианты NGS-исследований. В настоящее время существуют патенты, в которых описаны панели, включающие участки небольшого числа генов. Большинство панелей при этом адаптированы под конкретный тип злокачественного новообразования (например, рак легкого). Из мирового уровня техники известны несколько тест-систем на основе NGS-анализа, которые используют для исследования опухолевой ДНК на предмет выявления кандидатных генетических биомаркеров, в том числе с предиктивной значимостью.An approach using a genetic panel looks promising, using which it will be possible to analyze the presence of therapeutically significant markers and biomarkers in several genes in tumor DNA at once. It is important that genomic DNA, compared to RNA and protein fractions, is a more stable analyte for identifying biomarkers. For genetic studies, Sanger sequencing of target regions or allele-specific PCR or variants of NGS studies are used. Currently, there are patents that describe panels that include sections of a small number of genes. Most panels are adapted to a specific type of malignant neoplasm (for example, lung cancer). Several test systems based on NGS analysis are known from the world level of technology, which are used to study tumor DNA to identify candidate genetic biomarkers, including those with predictive significance.

Таким образом, среди аналогов можно выделить следующие.Thus, among the analogues the following can be distinguished.

Панель для оценки наличия микросателлитной нестабильности (https://fg-onko.ru/msi/) от F-Genetics предназначена для выявления 13 микросателлитных локусов (ВАТ-25, ВАТ-26, ВАТ-40, САТ-25, NR-21, NR-22, NR-24, NR-27, ABI-16, ABI-17, ABI-19, ABI-20A, ABI-20B) и 2 высокополиморфных пентануклеотидных локусов. Так, высокий уровень микросателлитной нестабильности (MSI-H) в опухоли является предиктивным маркером, определяющим чувствительность к терапии ИКТ (пембролизумаб, ниволумаб).The panel for assessing the presence of microsatellite instability (https://fg-onko.ru/msi/) from F-Genetics is designed to identify 13 microsatellite loci (BAT-25, BAT-26, BAT-40, CAT-25, NR-21 , NR-22, NR-24, NR-27, ABI-16, ABI-17, ABI-19, ABI-20A, ABI-20B) and 2 highly polymorphic pentanucleotide loci. Thus, a high level of microsatellite instability (MSI-H) in the tumor is a predictive marker that determines sensitivity to ICT therapy (pembrolizumab, nivolumab).

РФ, RU2747746 С2, 13.05.2021. «Тест-классификатор клинического ответа на лечение сорафенибом индивидуальных пациентов с раком почки». Предложен способ определения клинической эффективности применения сорафениба для лечения почечноклеточной карциномы, основанный на определении экспрессии целевых генов в образце ткани с нормированием относительно экспрессии ряда генов. Определение уровня экспрессии целевых генов проводят методом секвенирования тотальной РНК, методом исследования на микрочипах, либо методом обратной транскрипции и ПЦР. Данный аналог от изобретения отличает то, что эффективность терапии онкологического заболевания определяется по профилю генной экспрессии.RF, RU2747746 C2, 05/13/2021. "Test classifier of clinical response to treatment with sorafenib in individual patients with kidney cancer." A method is proposed for determining the clinical effectiveness of sorafenib for the treatment of renal cell carcinoma, based on determining the expression of target genes in a tissue sample with normalization relative to the expression of a number of genes. Determination of the expression level of target genes is carried out by total RNA sequencing, microarray research, or reverse transcription and PCR. This analogue differs from the invention in that the effectiveness of cancer therapy is determined by the gene expression profile.

Кроме того, препарат (сорафениб) относится к ингибиторам протеинкиназ и не входит в схемы противоопухолевой терапии с применением ИКТ.In addition, the drug (sorafenib) is a protein kinase inhibitor and is not included in antitumor therapy regimens using ICT.

РФ, RU2741703 С1, 28.01.2021. «Платформа анализа генетической информации ОпсоЬох». Предложен способ оценки клинической эффективности таргетных лекарственных средств для лечения пациента с пролиферативным или онкологическим заболеванием, в котором получают данные по меньшей мере одного типа из образца, при этом тип данных выбирается из следующего списка: (i) данные по экспрессии тотальной мРНК, (ii) полногеномные данные по экспрессии белков, (iii) полногеномные данные по сайтам связывания транскрипционных факторов, (iv) полногеномные данные по мутациям в геномной ДНК, (v) полногеномные данные по экспрессии микроРНК. Предложен способ лечения пациента с пролиферативным или онкологическим заболеванием и система для оценки клинической эффективности таргетных лекарственных средств, выбранных из группы таргетных лекарственных средств, для пациента с пролиферативным или онкологическим заболеванием. Предложенный способ оценки клинической эффективности таргетной терапии онкологических заболеваний совпадает с подходом по использованию генной панели для оценки эффективности терапии ИКТ с точки зрения концепции оценки эффективности терапии и используемого материала. Однако в патенте не указан конкретный тип и схемы терапии, также нет совпадения генов панели.RF, RU2741703 C1, 01/28/2021. "Platform for the analysis of genetic information Opcobox." A method is proposed for assessing the clinical effectiveness of targeted drugs for the treatment of a patient with a proliferative or oncological disease, in which at least one type of data is obtained from a sample, and the data type is selected from the following list: (i) total mRNA expression data, (ii) genome-wide data on protein expression, (iii) genome-wide data on transcription factor binding sites, (iv) genome-wide data on mutations in genomic DNA, (v) genome-wide data on microRNA expression. A method for treating a patient with a proliferative or oncological disease and a system for assessing the clinical effectiveness of targeted drugs selected from a group of targeted drugs for a patient with a proliferative or oncological disease are proposed. The proposed method for assessing the clinical effectiveness of targeted therapy for oncological diseases coincides with the approach of using a gene panel to assess the effectiveness of ICT therapy from the point of view of the concept of assessing the effectiveness of therapy and the material used. However, the patent does not indicate a specific type and regimen of therapy, and there is no match between the genes of the panel.

Панель научно-клинического центра Memorial Sloan Kettering (США) - MSK-IMPACT, одобренная для клинического применения FDA (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/DEN170058.pdf) как панель для расширенного генетического профилирования, включает в себя 505 генов и предназначена для выявления в опухолевой ДНК как предиктивных генетических маркеров для назначения препаратов (в том числе ИКТ), так и терапевтически значимых биомаркеров для анализа процессов прогрессирования опухолей, и в том числе для разработки таргетных препаратов. Для интерпретации геномных данных существует портал OncoKB® (https://www.oncokb.org/), включающий сведения о клинических и биологических эффектах более 4000 геномных изменений. Существуют принципиальные различия настоящего технического решения по шести генам, включенных в мультигенную панель (пересечение составляет 28 из 34 генов), а также по отсутствию в панели MSK-IMPACT аналогичного покрытия по межгенным регионам локуса 9р24.1 (согласно опубликованным данным о таргетных генах панели).The Memorial Sloan Kettering Research Center (USA) panel - MSK-IMPACT, approved for clinical use by the FDA (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/DEN170058.pdf) as a panel for advanced genetic profiling, includes contains 505 genes and is designed to identify in tumor DNA both predictive genetic markers for prescribing drugs (including ICTs) and therapeutically significant biomarkers for analyzing tumor progression processes, including for the development of targeted drugs. For interpreting genomic data, the OncoKB® portal (https://www.oncokb.org/) includes information on the clinical and biological effects of more than 4000 genomic alterations. There are fundamental differences in the present technical solution in the six genes included in the multigene panel (the intersection is 28 of 34 genes), as well as in the absence in the MSK-IMPACT panel of similar coverage for intergenic regions of the 9p24.1 locus (according to published data on the target genes of the panel) .

Диагностический тест FoundationOne®CDx (Roche, США), одобренный FDA для клинического применения (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf17/P170019a.pdf), основан на NGS-исследовании ДНК для выявления ряда мутационных событий и изменения числа копий генов в 324 генах, а также оценки наличия MSI и мутационной нагрузки опухоли с целью стратификации пациентов, которые могут получить пользу от лечения таргетными препаратами и ИКТ в соответствии с утвержденными инструкциями по медицинскому применению лекарственных препаратов. Данный тест одобрен для клинического применения как исследование для выявления предиктивных маркеров чувствительности к ИКТ - конкретно для назначения пембролизумаба, при этом тест отдельно не валидирован для оценки предиктивных биомаркеров резистентности к ИКТ (https://assets.ctfassets.net/w98cd481qyp0/YqqKHaqQmFeqc5ueQk48w/d12f19680205941ea3fee417f08e9524/F1CDx_Technical_Specifications.pdf). Существуют принципиальные различия настоящего технического решения по девяти генам, включенным в мультигенную панель (пересечение составляет 25 из 34 генов), а также по отсутствию в панели FoundationOne®CDx аналогичного покрытия по межгенным регионам локуса 9р24.1 (согласно опубликованным данным о таргетных генах панели).The FoundationOne®CDx diagnostic test (Roche, USA), approved by the FDA for clinical use (https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf17/P170019a.pdf), is based on NGS DNA testing to identify a range of mutational events and gene copy number changes in 324 genes, as well as assessing the presence of MSI and tumor mutational burden to stratify patients who may benefit from treatment with targeted drugs and ICTs in accordance with approved drug prescribing guidelines. This test is approved for clinical use as a study to identify predictive markers of sensitivity to ICT - specifically for the prescription of pembrolizumab, while the test is not separately validated for the assessment of predictive biomarkers of resistance to ICT (https://assets.ctfassets.net/w98cd481qyp0/YqqKHaqQmFeqc5ueQk48w/d12f19680205941ea3fee4 17f08e9524 /F1CDx_Technical_Specifications.pdf). There are fundamental differences in the present technical solution in the nine genes included in the multigene panel (the intersection is 25 of 34 genes), as well as in the absence of similar coverage in the FoundationOne®CDx panel for intergenic regions of the 9p24.1 locus (according to published data on the target genes of the panel) .

Панель Illumina TruSight Oncology 500 - TSO500 (Illumina, США), включает полноразмерные кодирующие последовательности 523 генов. Разные варианты панели TSO500 позволяют выполнить NGS опухолевой ДНК и РНК, а также исследование свободно циркулирующей ДНК из плазмы крови для выявления коротких генетических вариантов, инделов, изменений копийности генов, фьюженов (https://www.illumina.com/products/by-brand/trusight-oncology/tso-500-portfolio.html). Существуют принципиальные различия настоящего технического решения по семи генам, включенным в мультигенную панель (пересечение составляет 27 из 34 генов), а также по отсутствию в панели TSO500 аналогичного покрытия по межгенным регионам локуса 9р24.1 (согласно опубликованным данным о таргетных генах панели). Кроме того, исследование с применением TSO500 пока не получило одобрения регуляторов для потокового применения в зарубежной клинической практике, в том числе для выявления предиктивных маркеров ИКТ [Wei В, et al. (2022). J Mol Diagn, 24(6), 600-608] и, в целом, панель TSO500 используется для решения широкого спектра научных и диагностических задач. Панель TSO500, как и другие широкие таргетные панели (в том числе вышеупомянутые FoundationOne®CDx, MSK-IMPACT) менее пригодна для рутинного лабораторного анализа в связи с большим спектром генов (сотни генов) и более трудоемкой интерпретацией массива выходных данных о генетических вариантах с целью определения их потенциальной клинической значимости.The Illumina TruSight Oncology 500 - TSO500 panel (Illumina, USA) includes full-length coding sequences of 523 genes. Different versions of the TSO500 panel allow you to perform NGS of tumor DNA and RNA, as well as the study of freely circulating DNA from blood plasma to identify short genetic variants, indels, gene copy number changes, fusions (https://www.illumina.com/products/by-brand /trusight-oncology/tso-500-portfolio.html). There are fundamental differences in the present technical solution in the seven genes included in the multigene panel (the intersection is 27 out of 34 genes), as well as in the lack of similar coverage in the TSO500 panel for intergenic regions of the 9p24.1 locus (according to published data on the target genes of the panel). In addition, a study using TSO500 has not yet received regulatory approval for streaming use in foreign clinical practice, including for identifying predictive markers of ICT [Wei B, et al. (2022). J Mol Diagn, 24(6), 600-608] and, in general, the TSO500 panel is used to solve a wide range of scientific and diagnostic problems. The TSO500 panel, like other broadly targeted panels (including the aforementioned FoundationOne®CDx, MSK-IMPACT) is less suitable for routine laboratory analysis due to the large range of genes (hundreds of genes) and the more labor-intensive interpretation of the array of genetic variant output data to target determining their potential clinical significance.

В качестве еще одного актуального аналога уместно рассматривать два продукта компании АО "Ферст Генетике": набор реагентов «ОнкоФокус» и NGS-панель Онкопрофиль, которые нужны для таргетного исследования.As another relevant analogue, it is appropriate to consider two products of the company First Genetics JSC: the OncoFocus reagent set and the Oncoprofile NGS panel, which are needed for targeted research.

РЗН 2022/16970, 20.04.2022. Набор реагентов "ОнкоФокус" (https://fg-onko.ru/onkofokus/) для NGS-анализа генов, ассоциированных с возникновением опухолей человека, на системе "F-Genetics" по ТУ 21.20.23-003-03569019-2019. АО "Ферст Генетике" (класс потенциального риска 2б, Вид мед изделия с соответствующей номенклатурой 339880). Анализ заключается в определении характерных мутаций (хотспотов) в 35 генах, оценки копийности генов и хромосомных перестроек в 19 и 23 генах, соответственно. Основные показания для генотипирования при помощи данного продукта - выбор противоопухолевой терапии и коррекции терапии в случае рецидива ЗНО.RZN 2022/16970, 04/20/2022. A set of reagents "OnkoFokus" (https://fg-onko.ru/onkofokus/) for NGS analysis of genes associated with the occurrence of human tumors using the F-Genetics system according to TU 21.20.23-003-03569019-2019. JSC First Genetics (potential risk class 2b, Type of medical product with the corresponding nomenclature 339880). The analysis consists of identifying characteristic mutations (hotspots) in 35 genes, assessing gene copy numbers and chromosomal rearrangements in 19 and 23 genes, respectively. The main indications for genotyping using this product are the choice of antitumor therapy and correction of therapy in case of relapse of cancer.

Панель «Онкопрофиль» (https://fg-onko.ru/onkoprofil/) составлена для определения хотспотов в 87 генах, нарушений числа копий 43 генов, интер и интра-хромосомных перестроек 51 гена, и секвенирования полной последовательности 48 генов. Показания для проведения исследования: молекулярное профилирование опухоли, выбор терапии, выявление неблагоприятного прогноза, коррекция терапии в случае рецидива, диагностика наследственного онкологического синдрома. Панель «Онкопрофиль» позволяет также выявить ряд генетических детерминант наследственных опухолевых синдромов. Главное отличие настоящего технического решения заключается в существенной разнице спектра генов, включенных в панель и пригодных для таргетного молекулярно-генетического анализа, а именно отличие по 13 уникальным генам (IFNG, IDO1, IFNGR1, HAVCR2, LAG3, CD274, CD8A, STAT1, В2М, VHL, PBRM1, POLD1, PDCD1LG2) от обоих продуктов «Онкопрофиль» и «ОнкоФокус».The “Onkoprofil” panel (https://fg-onko.ru/onkoprofil/) was compiled to identify hotspots in 87 genes, copy number disorders of 43 genes, inter and intra-chromosomal rearrangements of 51 genes, and sequencing the full sequence of 48 genes. Indications for the study: molecular profiling of the tumor, choice of therapy, identification of poor prognosis, correction of therapy in case of relapse, diagnosis of hereditary cancer syndrome. The Oncoprofile panel also allows you to identify a number of genetic determinants of hereditary tumor syndromes. The main difference of this technical solution is the significant difference in the spectrum of genes included in the panel and suitable for targeted molecular genetic analysis, namely the difference in 13 unique genes (IFNG, IDO1, IFNGR1, HAVCR2, LAG3, CD274, CD8A, STAT1, B2M, VHL, PBRM1, POLD1, PDCD1LG2) from both products “Oncoprofile” and “OncoFocus”.

Наиболее близких аналогов настоящего изобретения выявлено не было.The closest analogues of the present invention have not been identified.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является создание таргетной панели для исследования целевых геномных регионов с целью идентификации терапевтических маркеров и биомаркеров - предикторов потенциальной эффективности и/или резистентности к иммунотерапии ингибиторами ИКТ (анти-PD-1 препараты, например, пембролизумаб или ниволумаб; анти-PD-L1 препараты, например, дурвалумаб или атезолизумаб или авелумаб), который осуществляется через создание таргетной панели, включающей целевые геномные регионы, посредством дизайна специфических для них праймеров, которые используют для анализа ДНК, выделенной из образцов опухолей пациентов с ЗНО, методом высокопроизводительного секвенирования.The technical result achieved by using the present invention is the creation of a targeted panel for studying target genomic regions in order to identify therapeutic markers and biomarkers - predictors of potential effectiveness and/or resistance to immunotherapy with ICT inhibitors (anti-PD-1 drugs, for example, pembrolizumab or nivolumab; anti -PD-L1 drugs, for example, durvalumab or atezolizumab or avelumab), which is carried out through the creation of a targeted panel, including target genomic regions, through the design of primers specific to them, which are used to analyze DNA isolated from tumor samples of patients with cancer using a high-throughput method sequencing.

Технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе выполняют-создание таргетной панели для исследования целевых геномных регионов для идентификации терапевтических маркеров и биомаркеров - предикторов потенциальной эффективности и/или резистентности к иммунотерапии ингибиторами ИКТ (анти-PD-1 препараты, например, пембролизумаб или ниволумаб; анти-PD-L1 препараты, например, дурвалумаб или атезолизумаб или авелумаб, и иные анти-PD-1/анти-PD-L1 препараты), который осуществляется через формирование списка целевых геномных регионов (включающих кодирующие последовательности 34 генов (JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, В2М, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, МЕТ, В API, POLE, POLD1. EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, ST ATI, SMAD4, ROS1, ARID 1 A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), a также участки локуса 9p24.1 (гены JAK2, PD-L1 и PD-L2, и межгенные регионы)) и дизайн набора праймеров, специфических для целевых геномных регионов, которые будут использовать для анализа ДНК, выделенной из образцов опухолей пациентов с ЗНО, методом высокопроизводительного секвенирования. Исследование с использованием набора праймеров таргетной панели включает стадии лабораторного выделения ДНК из образца опухолевого материала (резекционного или биопсийного материала опухолевой ткани пациента, у которого диагностировано ЗНО (рак почки, рак шейки матки, рак легкого, рак желудка, меланома или другие типы ЗНО) до начала или в процессе иммунотерапии ингибиторами ИКТ), измерения концентрации выделенной ДНК, подготовку ДНК-библиотек с использованием опухолевой ДНК в качестве матрицы для амлификации целевых геномных регионов при ПЦР с праймерами, высокопроизводительного секвенирования ДНК-библиотек, последующей биоинформатической обработки результатов секвенирования, интерпретации биологической и клинической значимости генетических вариантов, детектированных по результатам таргетного секвенирования.The technical result is achieved by the fact that the proposed method creates a targeted panel for studying target genomic regions to identify therapeutic markers and biomarkers - predictors of potential effectiveness and/or resistance to immunotherapy with ICT inhibitors (anti-PD-1 drugs, for example, pembrolizumab or nivolumab ; anti-PD-L1 drugs, for example, durvalumab or atezolizumab or avelumab, and other anti-PD-1/anti-PD-L1 drugs), which is carried out through the formation of a list of target genomic regions (including coding sequences of 34 genes (JAK3, JAK2). , MDM2, CD274, PBRM1, B2M, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, V API, POLE, POLD1, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, ST ATI, SMAD4, ROS1, ARID 1 A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), as well as regions of the 9p24.1 locus (JAK2, PD-L1 and PD-L2 genes, and intergenic regions)) and the design of a set of specific primers for target genomic regions that will be used to analyze DNA isolated from tumor samples of patients with cancer using high-throughput sequencing. A study using a set of targeted panel primers includes the stages of laboratory isolation of DNA from a sample of tumor material (resection or biopsy material of tumor tissue of a patient diagnosed with cancer (kidney cancer, cervical cancer, lung cancer, stomach cancer, melanoma or other types of cancer) to beginning or during immunotherapy with ICT inhibitors), measuring the concentration of isolated DNA, preparing DNA libraries using tumor DNA as a template for amplification of target genomic regions during PCR with primers, high-throughput sequencing of DNA libraries, subsequent bioinformatics processing of sequencing results, interpretation of biological and clinical significance of genetic variants detected based on the results of targeted sequencing.

Предлагаемый способ позволяет получить таргетную панель для выполнения генетических исследований образцов ЗНО при выборе противоопухолевой терапии или оценки ее эффективности посредством секвенирования целевых геномных регионов в опухолевой ДНК для идентификации терапевтических маркеров и биомаркеров потенциальной эффективности и/или резистентности к иммунотерапии ингибиторами ИКТ.The proposed method makes it possible to obtain a targeted panel for performing genetic studies of cancer samples when choosing antitumor therapy or assessing its effectiveness by sequencing target genomic regions in tumor DNA to identify therapeutic markers and biomarkers of potential effectiveness and/or resistance to immunotherapy with ICT inhibitors.

Осуществление изобретенияCarrying out the invention

Список из 167 кандидатных генов, в которых, по данным литературы и анализу публичных баз геномных и транскриптомных данных, были обнаружены повреждающие генетические варианты или отмечено изменение экспрессии, ассоциированных с ответом на терапию ИКТ или резистентностью к ней, далее был проанализирован на предмет частот встречаемости мутаций в разных типах ЗНО. По результатам анализа были выбраны 34 гена и участки локуса 9р24.1 (таблица 1), целевые геномные регионы которых были включены в состав таргетной панели.A list of 167 candidate genes in which, according to the literature and analysis of public genomic and transcriptomic databases, damaging genetic variants were found or changes in expression associated with response to or resistance to ICT therapy were detected, were further analyzed for the frequency of occurrence of mutations in different types of cancer. Based on the results of the analysis, 34 genes and regions of the 9p24.1 locus were selected (Table 1), the target genomic regions of which were included in the target panel.

В таблице 1 также приведены результаты анализа частот встречаемости генетических нарушений в тканях меланомы (Мел), рака легкого (РЛ), рака почки (РП), рака желудка (РЖ), рака шейки матки (РШМ) по данным онлайн-ресурса cBioPortal (https://www.cbioportal.org/) - когорта MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort (MSK, Nat. Med. 2017, 10945 случаев), известной аннотации онкогенных и вероятно патогенных генетических изменений по данным онлайн-ресурса OncoKB (https://www.oncokb.org/), а также информация о наличии клинической аннотации генетических вариантов, относящихся к целевым геномным регионам таргетной панели, для оценки потенциальной эффективности иммунотерапии анти-PD-1/анти-PD-L1 препаратов (по данным OncoKB и PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)). Медианные значения экспрессии генов в опухолевой ткани был извлечены из базы данных онлайн-ресурса The Human Proteome Atlas (НРА, https://www.proteinatlas.org/) с выделением условных диапазонов уровней экспрессии генов: от 0,1 до 10 FPKM -низкий уровень экспрессии, от 10 до 100 FPKM - средний уровень экспрессии, свыше 100 FPKM - высокий уровень экспрессии.Table 1 also shows the results of an analysis of the frequency of occurrence of genetic disorders in tissues of melanoma (Mel), lung cancer (LC), kidney cancer (RC), gastric cancer (GC), cervical cancer (CC) according to the online resource cBioPortal (https ://www.cbioportal.org/) - a cohort of the MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort (MSK, Nat. Med. 2017, 10945 cases), a known annotation of oncogenic and likely pathogenic genetic changes according to the OncoKB online resource (https:// www.oncokb.org/), as well as information on the availability of clinical annotation of genetic variants related to the target genomic regions of the targeted panel, to assess the potential effectiveness of immunotherapy with anti-PD-1/anti-PD-L1 drugs (according to OncoKB and PharmGKB ( https://www.pharmgkb.org/)). Median gene expression values in tumor tissue were extracted from the online resource database The Human Proteome Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org/) highlighting conditional ranges of gene expression levels: from 0.1 to 10 FPKM -low expression level, from 10 to 100 FPKM - medium expression level, over 100 FPKM - high expression level.

Таргетная панель состоит из целевых геномных регионов 34 генов (JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, В2М, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, ВАР1, POLE, POLD1. EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), определяемых специфическими координатами регионов (таблица 2) и дополнительных целевых геномных регионов (обозначены как «регионы 1/2/3/4») локуса 9р24.1, содержащего гены JAK2, PD-L1 и PD-L2, связанные с осуществлением противоопухолевого иммунного ответа и межгенные регионы 9р24.1, координаты которых приведены по версии генома человека hg38 в таблице 3.The target panel consists of target genomic regions of 34 genes (JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, B2M, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, BAP1, POLE, POLD1. EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), defined by specific region coordinates (Table 2) and additional target genomic regions (designated “regions 1/2” /3/4") of the 9p24.1 locus, containing the JAK2, PD-L1 and PD-L2 genes associated with the implementation of the antitumor immune response and intergenic regions 9p24.1, the coordinates of which are given according to the hg38 version of the human genome in Table 3.

Для каждого целевого геномного региона панели, включающего кодирующие экзоны генов или последовательности прилежащих к ним 10 пар нуклеотидов или некоторые межгенные регионы, праймеры были сконструированы в программе MFEprimer (версия 3.1) с учетом следующих параметров:For each target genomic region of the panel, including coding exons of genes or sequences of the 10 base pairs adjacent to them or some intergenic regions, primers were designed in the MFEprimer program (version 3.1) taking into account the following parameters:

1) диапазон возможных длин ампликонов 100-200 п.н. (предпочтительный диапазон 130-180 п.н.), для всех целевых регионов ампликоны должны перекрываться;1) the range of possible amplicon lengths is 100-200 bp. (preferred range 130-180 bp), for all target regions the amplicons should overlap;

2) диапазон возможных длин праймеров: 22-25 п.н.;2) range of possible primer lengths: 22-25 bp;

3) Tm для обоих праймеров (прямой/forward и обратный/reverse) в каждой паре набора не должны отличаться более чем на 2°С; диапазон различий между Tm всех праймеров в целом наборе не более 4°С,3) Tm for both primers (forward and reverse) in each pair of the set should not differ by more than 2°C; the range of differences between the Tm of all primers in the whole set is no more than 4°C,

4) возможный диапазон температур отжига (Та) праймеров - плюс 60-70°С, Та для обоих праймеров в каждой паре набора не должны отличаться более чем на 2°С, диапазон различий между Та всех праймеров в целом наборе не более 4°С;4) the possible range of annealing temperatures (Ta) of primers is plus 60-70°C, Ta for both primers in each pair of the set should not differ by more than 2°C, the range of differences between Ta of all primers in the whole set is no more than 4°C ;

5) GC-состав всего праймера не менее 40% и не более 60%;5) GC composition of the entire primer is not less than 40% and not more than 60%;

6) допустимая длина гомополимеров в праймере: не более 5 нуклеотидов на всю последовательность праймера;6) permissible length of homopolymers in the primer: no more than 5 nucleotides for the entire primer sequence;

7) первые 6 нуклеотидов с 3'-конца праймера не должны быть комплементарны самому праймеру или другим праймерам в наборе.7) the first 6 nucleotides from the 3' end of the primer should not be complementary to the primer itself or other primers in the set.

Получившиеся праймеры были проверены на специфичность (т.е. наличие в наборе праймеров, специфических для конкретных целевых регионов, а значит, не картирующихся на другие последовательности в рамках генома). Для этого полученный набор праймеров был проанализирован на неспецифическое картирование праймеров, которое может привести к гибридизации с нецелевыми участками генома (версия hg38) и получению ампликонов вне целевых последовательностей панели, и проверен на возможность гибридизации праймеров с другими праймерами набора. Для этого была использована программа blastn (версия 2.9.0) с параметрами:The resulting primers were tested for specificity (i.e., the presence in the set of primers that are specific to specific target regions and, therefore, do not map to other sequences within the genome). To do this, the resulting set of primers was analyzed for non-specific primer mapping, which can lead to hybridization with non-target regions of the genome (hg38 version) and the production of amplicons outside the target sequences of the panel, and tested for the possibility of hybridization of the primers with other primers in the set. For this purpose, the blastn program (version 2.9.0) was used with the following parameters:

1) -word_size 111) -word_size 11

2) -qcov_hsp_perc (при проверке значение этого параметра не выставляли)2) -qcov_hsp_perc (during testing, the value of this parameter was not set)

3) -penalty -33) -penalty -3

4) -reward 24) -reward 2

5) -gapopen 55) -gapopen 5

6) -gapextend 26) - gapextend 2

7) -evalue 0.017) -evalue 0.01

Для оценки возможности димеризации между праймерами панели выполняли проверку на картирование праймеров на последовательности других праймеров, входящих в набор. Это было выполнено аналогично проверке на неспецифическое картирование, только вместо последовательности генома hg38 в качестве базы данных для blastn (версия 2.9.0) использовали сами последовательности праймеров, составляющие набор. Таким образом, при данной проверке все праймеры, которые картировались более одного раза в наборе, были отмечены как праймеры с высокой вероятностью образования димеров и были отбракованы по этому критерию.To assess the possibility of dimerization between primers, the panels were subjected to primer mapping tests against the sequences of other primers included in the set. This was performed in a similar manner to the nonspecific mapping test, but instead of the hg38 genome sequence, the primer sequences themselves that made up the set were used as the database for blastn (version 2.9.0). Thus, in this test, all primers that mapped more than once in the set were marked as primers with a high probability of dimer formation and were rejected according to this criterion.

После отбраковывания неспецифических праймеров (на основании выявления множественного картирования праймеров или наличия е-value>0,01) были проверены координаты картирования праймеров, прошедших критерии отбора, на пересечение с координатами полиморфизмов и хотспотов. Проверка праймеров на картирование на данные генетические варианты была выполнена с использованием программы MFEprimer (версия 3.2.6) с использованием файлов в формате bed с известными генетическими вариантами из базы dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) и с координатами хотспотов, характерных для целевых генов панели. В случае попадания полиморфизмов и хотспотов в координаты картирования праймеров, данные праймеры были исключены из набора и для данного ампликона были скорректированы координаты таким образом, чтобы новые праймеры не попадали непосредственно на регионы с полиморфизмами и хотспотами.After rejecting nonspecific primers (based on the detection of multiple primer mapping or the presence of e-value>0.01), the mapping coordinates of primers that passed the selection criteria were checked for intersection with the coordinates of polymorphisms and hotspots. Testing of primers for mapping to these genetic variants was performed using the MFEprimer program (version 3.2.6) using bed files with known genetic variants from the dbSNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ ) and with the coordinates of hotspots characteristic of the target genes of the panel. If polymorphisms and hotspots fell into the primer mapping coordinates, these primers were excluded from the set and the coordinates for a given amplicon were adjusted so that new primers did not fall directly on regions with polymorphisms and hotspots.

Также при помощи программы blastn (версия 2.9.0) проведена проверка отсутствия картирования праймеров, на так называемые (т.н.) сложные регионы генома: тандемные повторы, гомополимерные области, и во избежание образования неспецифических продуктов, - проверка отсутствия картирования праймеров на псевдогены для целевых генов панели.Also, using the blastn program (version 2.9.0), the absence of primer mapping was checked for the so-called (so-called) complex regions of the genome: tandem repeats, homopolymer regions, and in order to avoid the formation of nonspecific products, the absence of primer mapping for pseudogenes was checked for panel target genes.

Праймеры, в координаты которых попадают хотспоты, праймеры, картирующиеся в рамках т.н. сложных регионов генома, были заменены на другие праймеры путем нового дизайна с учетом следующих параметров:Primers whose coordinates fall within hotspots, primers mapped within the so-called. complex regions of the genome were replaced with other primers through a new design taking into account the following parameters:

1) диапазон возможных длин ампликонов 60-220 п.н., для всех целевых регионов ампликоны должны перекрываться,1) the range of possible amplicon lengths is 60-220 bp, for all target regions the amplicons must overlap,

2) диапазон возможных длин праймеров: 22-30 п.н.,2) range of possible primer lengths: 22-30 bp,

3) Tm для обоих праймеров в каждой паре набора не должны отличаться более чем на 2°С; диапазон различий между Tm всех праймеров в целом наборе не более 4°С,3) Tm for both primers in each pair of the set should not differ by more than 2°C; the range of differences between the Tm of all primers in the whole set is no more than 4°C,

4) возможный диапазон Та праймеров 60-70°С, Та для обоих праймеров в каждой паре набора не должны отличаться более чем на 2°С, диапазон различий между Та всех праймеров в целом наборе не более 4°С,4) the possible range of Ta primers is 60-70°C, Ta for both primers in each pair of the set should not differ by more than 2°C, the range of differences between Ta of all primers in the whole set is no more than 4°C,

5) GC-состав всего праймера не менее 30%и не более 70%5) GC composition of the entire primer is no less than 30% and no more than 70%

6) допустимая длина гомополимеров в праймере: не более 5 нуклеотидов на всю последовательность праймера,6) permissible length of homopolymers in the primer: no more than 5 nucleotides for the entire primer sequence,

7) первые 6 нуклеотидов с 3'-конца праймера не должны быть комплементарны самому праймеру или другим праймерам в наборе.7) the first 6 nucleotides from the 3' end of the primer should not be complementary to the primer itself or other primers in the set.

Для всего набора праймеров была выполнена валидация in silico для теоретической оценки результатов ПЦР с разработанными праймерами и проверки возможного покрытия ампликонами всех целевых геномных регионов, входящих в состав таргетной панели. Для валидации панели in silico были использованы программы MFEprimer (версия 3.2.6) и blastn (версия 2.9.0). Результаты in silico валидации праймеров, специфичных для целевых геномных регионов 34 генов приведены в таблице 4. В таблице 5 приведены результаты in silico валидации праймеров для дополнительных геномных регионов в локусе 9р24.1.In silico validation was performed for the entire set of primers to theoretically evaluate the PCR results with the developed primers and check the possible coverage of all target genomic regions included in the target panel by amplicons. To validate the panel in silico, the MFEprimer (version 3.2.6) and blastn (version 2.9.0) programs were used. The results of in silico validation of primers specific for target genomic regions of 34 genes are shown in Table 4. Table 5 shows the results of in silico validation of primers for additional genomic regions in the 9p24.1 locus.

В результате в составе набора праймеров остались только праймеры, специфические для целевых геномных регионов, с характеристиками, описанными ранее.As a result, only primers specific for target genomic regions with the characteristics described earlier remained in the primer set.

Claims (17)

1. Способ создания таргетной панели для исследования целевых геномных регионов для выявления предиктивных генетических биомаркеров потенциальной эффективности и/или резистентности к ингибиторам иммунных контрольных точек (ИКТ), который включает генетический анализ резекционного или биопсийного материала опухолевой ткани пациента с диагностированным злокачественным новообразованием (ЗНО) до начала курса или в ходе иммунотерапии на основе ингибиторов ИКТ - анти-PD-l или анти-PD-L1 препаратов, а именно: лабораторное выделение ДНК из образца опухолевого материала, измерение концентрации выделенной ДНК, подготовку ДНК-библиотек с использованием опухолевой ДНК в качестве матрицы для амлификации целевых геномных регионов при ПЦР со специфическими для них праймерами, секвенирование ДНК-библиотек, последующую биоинформатическую обработку результатов секвенирования, интерпретацию биологической и клинической значимости генетических вариантов, детектированных по результатам таргетного секвенирования, идентификацию предиктивных генетических биомаркеров потенциальной эффективности и/или резистентности к иммунотерапии ингибиторами ИКТ на основе целевых геномных регионов, включающих кодирующие последовательности 34 генов: JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, В2М, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, ВАР1, POLE, POLD1, EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL, а также участки локуса 9p24.1: гены JAK2, PD-L1, и PD-L2 и межгенные регионы.1. A method for creating a targeted panel for studying target genomic regions to identify predictive genetic biomarkers of potential effectiveness and/or resistance to immune checkpoint inhibitors (ICI), which includes genetic analysis of resection or biopsy material of tumor tissue of a patient diagnosed with a malignant neoplasm (MNT) before beginning of a course or during immunotherapy based on ICT inhibitors - anti-PD-l or anti-PD-L1 drugs, namely: laboratory isolation of DNA from a sample of tumor material, measurement of the concentration of isolated DNA, preparation of DNA libraries using tumor DNA as matrices for amplification of target genomic regions during PCR with primers specific for them, sequencing of DNA libraries, subsequent bioinformatic processing of sequencing results, interpretation of the biological and clinical significance of genetic variants detected based on the results of targeted sequencing, identification of predictive genetic biomarkers of potential effectiveness and/or resistance to immunotherapy with ICT inhibitors based on target genomic regions, including coding sequences of 34 genes: JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, B2M, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, BAP1, POLE, POLD1, EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2 , MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL, as well as regions of the 9p24.1 locus: JAK2, PD-L1, and PD genes -L2 and intergenic regions. 2. Способ по п. 1, в котором ЗНО локализовано в почке, шейке матки, легком, желудке, кожных покровах и кожном эпидермисе, и в других тканях, либо пациенту был поставлен диагноз рак почки или рак шейки матки или рак легкого или рак желудка или меланома.2. The method according to claim 1, in which the cancer is localized in the kidney, cervix, lung, stomach, skin and skin epidermis, and in other tissues, or the patient was diagnosed with kidney cancer or cervical cancer or lung cancer or stomach cancer or melanoma. 3. Способ по п. 1, в котором анти-PD-1 препараты представляют собой: пембролизумаб или ниволумаб, а анти-PD-L1 препараты представляют собой: дурвалумаб или атезолизумаб или авелумаб.3. The method according to claim 1, wherein the anti-PD-1 drugs are: pembrolizumab or nivolumab, and the anti-PD-L1 drugs are: durvalumab or atezolizumab or avelumab. 4. Способ по п. 1, в котором процедура таргетного секвенирования ДНК-библиотек выполняется с использованием одной из известных NGS-платформ.4. The method according to claim 1, in which the procedure for targeted sequencing of DNA libraries is performed using one of the known NGS platforms. 5. Способ по п. 1, в котором для выполнения таргетного секвенирования используют набор праймеров, специфических для целевых геномных регионов, составляющих таргетную панель.5. The method according to claim 1, in which to perform targeted sequencing, a set of primers specific for the target genomic regions that make up the targeted panel is used. 6. Способ по пп. 1-5, где таргетная панель состоит из целевых геномных регионов 34 генов: JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, В2М, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, ВАР1, POLE, POLD1, EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2, MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, ТР53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), координаты которых определены в таблице 2, а также участки локуса 9р24.1: гены JAK2, PD-L1 и PD-L2 и межгенные регионы, координаты которых определены в таблице 3.6. Method according to paragraphs. 1-5, where the target panel consists of target genomic regions of 34 genes: JAK3, JAK2, MDM2, CD274, PBRM1, B2M, ERBB2, IFNGR1, CD8A, JAK1, MET, BAP1, POLE, POLD1, EGFR, LAG3, BRAF, HAVCR2 , MLH1, KRAS, IFNG, ALK, PIK3CA, IDO1, AXL, TP53, STATI, SMAD4, ROS1, ARID1A, PTEN, PDCD1LG2, STK11, VHL), the coordinates of which are determined in Table 2, as well as sections of the 9р24.1 locus: genes JAK2, PD-L1 and PD-L2 and intergenic regions, the coordinates of which are defined in Table 3. 7. Способ по пп. 1-6, где таргетная панель включает дополнительные целевые геномные регионы - высокополиморфные локусы для оценки принадлежности образцов ДНК конкретным пациентам, биологические идентификаторы.7. Method according to paragraphs. 1-6, where the target panel includes additional target genomic regions - highly polymorphic loci for assessing the affiliation of DNA samples to specific patients, biological identifiers. 8. Способ по пп. 1-7, где результатом секвенирования ДНК с использованием таргетной панели на одной из известных NGS-платформ является массив данных либо о последовательностях целевых геномных регионов, не отличающихся от референсного генома, либо о последовательностях целевых геномных регионов, содержащих генетические варианты.8. Method according to paragraphs. 1-7, where the result of DNA sequencing using a targeted panel on one of the known NGS platforms is an array of data either on the sequences of target genomic regions that do not differ from the reference genome, or on the sequences of target genomic regions containing genetic variants. 9. Способ по пп. 1-8, где генетические варианты, выявленные в целевых геномных регионах, могут включать:9. Method according to paragraphs. 1-8, where genetic variants identified in target genomic regions may include: а) точковые замены нуклеотидов в последовательностях целевых геномных регионов;a) point nucleotide substitutions in the sequences of target genomic regions; б) короткие делеции нуклеотидов в последовательностях целевых геномных регионов до 30 пар нуклеотидов;b) short nucleotide deletions in the sequences of target genomic regions up to 30 nucleotide pairs; в) короткие вставки нуклеотидов в последовательностях целевых геномных регионов до 30 пар нуклеотидов;c) short insertions of nucleotides in the sequences of target genomic regions up to 30 nucleotide pairs; г) амплификации участков целевых геномных регионов;d) amplification of sections of target genomic regions; д) делеции участков целевых геномных регионов.e) deletions of sections of target genomic regions. 10. Способ по пп. 1-9, где генетические варианты, выявленные в целевых геномных регионах, известны из уровня техники как повреждающие, изменяющие функции гена или транскрипта, или белкового продукта, и/или ассоциированы либо с клинической эффективностью ИКТ, либо с резистентностью к ИКТ.10. Method according to paragraphs. 1-9, wherein the genetic variants identified in the target genomic regions are known in the art to be damaging, alter the function of the gene or transcript or protein product, and/or are associated with either the clinical effectiveness of ICT or resistance to ICT. 11. Способ по пп. 1-10, где генетические варианты, выявленные в целевых геномных регионах, можно рассматривать в качестве кандидатных предиктивных биомаркеров эффективности ИКТ и/или резистентности ингибиторов ИКТ для случаев диагностированного рака почки или рака шейки матки, или рака легкого, или рака желудка, или меланомы, или других типов ЗНО.11. Method according to paragraphs. 1-10, wherein genetic variants identified in targeted genomic regions can be considered as candidate predictive biomarkers of ICT efficacy and/or ICT inhibitor resistance for cases of diagnosed kidney cancer or cervical cancer or lung cancer or gastric cancer or melanoma, or other types of cancer. 12. Способ по пп. 1-11, где генетические варианты, выявленные в целевых геномных регионах, известны из уровня техники как предиктивные биомаркеры противоопухолевых препаратов для случаев диагностированного рака почки или рака шейки матки, или рака легкого, или рака желудка, или меланомы, или других типов ЗНО.12. Method according to paragraphs. 1-11, where the genetic variants identified in the target genomic regions are known in the art as predictive biomarkers of anticancer drugs for cases of diagnosed kidney cancer or cervical cancer, or lung cancer, or gastric cancer, or melanoma, or other types of cancer.
RU2023118107A 2023-07-10 Method of creating target panel for studying genomic regions for detecting therapeutic biomarkers of immune checkpoint (ic) inhibitors RU2818360C1 (en)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2818360C1 true RU2818360C1 (en) 2024-05-02

Family

ID=

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016174085A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 Cancer Research Technology Limited Method for treating cancer
RU2743858C1 (en) * 2020-04-17 2021-03-01 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» Method for obtaining a gene bank for the diagnosis of liver pathologies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016174085A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 Cancer Research Technology Limited Method for treating cancer
RU2743858C1 (en) * 2020-04-17 2021-03-01 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» Method for obtaining a gene bank for the diagnosis of liver pathologies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
А. Б. ЧУХЛОВИН Клиническая значимость молекулярно-биологической диагностики, Ученые записки СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА, 2010, ТОМ XVII, номер 01, стр.62-68. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
De Luca et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer
CN106755501B (en) Method for simultaneously detecting microsatellite locus stability and genome change based on next-generation sequencing
Kroeze et al. Evaluation of a hybrid capture–based pan-cancer panel for analysis of treatment stratifying oncogenic aberrations and processes
DK2582847T3 (en) METHODS AND MATERIALS TO ASSESS loss of heterozygosity
CN107267598B (en) Methods and materials for assessing loss of heterozygosity
Terraf et al. Comprehensive assessment of germline pathogenic variant detection in tumor-only sequencing
CA2784613C (en) Diagnostic methods based on somatically acquired rearrangement
US20210071262A1 (en) Method of detecting cancer through generalized loss of stability of epigenetic domains and compositions thereof
US20070207481A1 (en) Use of roma for characterizing genomic rearrangements
Vinayanuwattikun et al. Elucidating genomic characteristics of lung cancer progression from in situ to invasive adenocarcinoma
US12071661B2 (en) Method of predicting response to therapy by assessing tumor genetic heterogeneity
EP3788173B1 (en) Surrogate marker and method for tumor mutation burden measurement
AU2021291586B2 (en) Multimodal analysis of circulating tumor nucleic acid molecules
Vatrano et al. Detailed genomic characterization identifies high heterogeneity and histotype-specific genomic profiles in adrenocortical carcinomas
US20210292851A1 (en) Method of monitoring effectiveness of immunotherapy of cancer patients
CN107151707B (en) Kit for detecting lung cancer related gene hot spot mutation and application thereof
Kantorova et al. TP53 mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia: comparison of different detection methods
EP3580359B1 (en) Non-invasive test to predict recurrence of colorectal cancer
WO2017046714A1 (en) Methylation signature in squamous cell carcinoma of head and neck (hnscc) and applications thereof
KR102203850B1 (en) Composition for diagnosing or prognosising gliomas and a method for providing information for gliomas using same marker
RU2818360C1 (en) Method of creating target panel for studying genomic regions for detecting therapeutic biomarkers of immune checkpoint (ic) inhibitors
WO2024105220A1 (en) Method for determining microsatellite instability status, kits and uses thereof
TWI417546B (en) Dna methylation biomarkers for prognosis prediction of lung adenocarcinoma
WO2020109820A1 (en) Molecular signature
RU2812346C1 (en) Method of evaluating detection of alk gene translocations in paraffinized tumour samples using rna-sequencing
点击 这是indexloc提供的php浏览器服务,不要输入任何密码和下载