RU2610665C2 - Антитело, блокирующее agr2, и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описано блокирующее AGR2 моноклональное антитело и, в частности, гуманизированное моноклональное антитело для блокирования AGR2. Также описаны фармацевтическая композиция, содержащая антитело, способ ее получения и применение антитела для блокирования роста и метастазирования опухоли. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине. 7 н. и 13 з.п. ф-лы, 28 ил., 11 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к моноклональному антителу в области генетической иммунологии и молекулярной биотехнологии, в частности, к антителу, блокирующему AGR2, и его применению.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Белок переднего градиента-2 (AGR2) впервые обнаружили посредством дифференциального скрининга клеточной линии рака молочной железы человека с экспрессией рецепторов эстрогена (Kuang, W.W., et al., Nucleic Acids Res, 1998. 26(4): p. 1116-23.), а затем получили его полноразмерный клон кДНК. При сравнении было обнаружено, что он является гомологом связанного с развитием белка жабы XA-2, этот белок был назван hAG-2 (Thompson, D.A. and R.J. Weigel, hAG-2, Biochem Biophys Res Commun, 1998. 251(1): p. 111-6.). AGR2 имеет высокую гомологию с белок-дисульфидизомеразой (PDI) (Persson, S., et al. Mol Phylogenet Evol 2005 36(3): p.734-40.), и обладает активностью PDI (Park, S.W., et al., PNAS, 2009. 106(17): p. 6950-5.). AGR2 содержит активный центр PDI "CXXS", который отличают от нормального сайта PDI "CXXC". В ходе изучения других белков PDI было показано, что активный центр "CXXS" выполняет функцию перестройки дисульфидных связей, но лишен способности создания дисульфидных связей. Это означает, что AGR2 выполняет функцию нарушения нормального роста клеток, но не обладает способностью восстанавливать функции клеток. (Anelli, T., et al., EMBO J, 2002. 21(4): p. 835-44. Anelli, T., et al., EMBO J, 2003. 22(19): p. 5015-22.).

AGR2 представляет собой маркерный белок для первичной и вторичной опухолей, обнаруживается в системе кровообращения пациентов с опухолью и тесно связан с развитием и метастазированием опухолей. AGR2 обладает эффектом стимулирования трансформации и миграции клеток рака молочной железы (Liu D, et al. Cancer Res, 2005, 65(9): 3796-3805.). AGR2 может повышать инвазивные свойства клеток рака поджелудочной железы, тем самым стимулируя метастазирование опухоли (Ramachandran V, et al. Cancer Res, 2008, 68(19): 7811-7818.). AGR2 играет ключевую роль в метастазировании рака предстательной железы (Zhang Y, et al. Cancer Res, 2010,70(1): 240-248.). Только в 2010 году Kathryn et al. показали, что поликлональное антитело к AGR2 может ингибировать рост клеток рака молочной железы (Kathryn E Vanderlaag, et al. Breast cancer, 2010, 12.).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к следующим техническим решениям:

Антитело, специфически связывающееся с белком AGR2, которое связывается с по существу тем же эпитопом белка AGR2, что и мышиное моноклональное антитело 18A4 к белку AGR2 человека.

Антитело по п.1, которое представляет собой мышиное моноклональное антитело 18A4 к AGR2 человека или его гуманизированную или химерную форму.

Антитело по п.1 или 2, где указанный эпитоп содержится в домене с протеин-дисульфидизомеразной активностью белка AGR2.

Антитело по любому из п.п.1-4, где активный домен AGR2, с которым связывается антитело, представляет собой CPHS; предпочтительно антитело связывается с обязательной связывающей областью, показанной в PLMIIHHLDE CPHSQALKKV FA (Seq ID No. 12).

Антитело по любому из приведенных выше пунктов, содержащее, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности CDR1 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 8, аминокислотной последовательности CDR2 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 9, аминокислотной последовательности CDR3 тяжелой цепи, показанной в Seq ID No. 10, аминокислотной последовательности CDR1 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 11, аминокислотной последовательности CDR2 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 12, и аминокислотной последовательности CDR3 легкой цепи, показанной в Seq ID No. 13.

Антитело по п.5, содержащее аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, показанную в DYNMD (Seq ID No.8), аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, показанную в DINPNYDTTSYNQKFQG (Seq ID No.9), аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, показанную в SM MGYGSPMDY (Seq ID No. 10), аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, показанную в RASKSVSTSGYSYMH (Seq ID No. 11), аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, показанную в LASNLES (Seq ID No. 12), и аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, показанную в QHIRELPRT (Seq ID No. 13).

Антитело по п.6, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела показана в Seq ID No. 2, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в Seq ID No. 1.

Антитело по п.6, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи показана в Seq ID No. 4, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела показана в Seq ID No. 3.

Антитело по любому из п.п.1-8, которое представляет собой гуманизированное антитело, предпочтительно гуманизированное интактное IgG1 антитело.

Антитело по любому из п.п.1-9, которое представляет собой фрагмент антитела, предпочтительно фрагмент Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv, линейное антитело или одноцепочечное антитело, более предпочтительно фрагмент Fab.

Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по любому из п.п.1-10, и фармацевтически приемлемый носитель.

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из п.п.1-10.

Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.12.

Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13.

Способ получения гуманизированного антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.14, позволяющей экспрессировать нуклеиновую кислоту и получить антитело.

Способ по п.15, далее включающий получение антитела из культуры клетки-хозяин.

Способ применением антитела по любому из пп.1-10 для лечения заболевания, ассоциированного с патологическим ангиогенезом у млекопитающего, включающий этап введения антитела млекопитающему.

Способ по п.17, где заболевание представляет собой злокачественную опухоль.

Способ по п.18, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, остеосаркомы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, колоректального рака и немелкоклеточного рака легких, злокачественной опухоли почки, рака головы и шеи, меланомы и множественной миеломы.

Способ по п.19, где лечение включает этап одновременного или последовательного введения второго терапевтического средства и антитела.

Способ по п.20, где второе терапевтическое средство выбрано из антиангиогенного средства, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства.

Применение антитела по любому из п.п.1-10 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, ассоциированного с патологическим ангиогенезом у млекопитающего, где заболевание предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль, и более предпочтительно злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, остеосаркомы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, злокачественной опухоли почки, рака головы и шеи, меланомы и множественная миелома.

Изобретение дополнительно относится к применению антитела по любому из п.п.1-10 для детектирования экспрессии AGR2 в образце ткани или клеток пациента.

Изобретение дополнительно относится к применению антитела по любому из п.п.1-10 для получения средства, набора или состава для детектирования экспрессии AGR2 в образце ткани или клеток пациента.

Изобретение относится к гибридомной клеточной линии 18A4. Эту гибридомную клеточную линию поместили в коллекцию Китайского центра типовых клеток (CCTCC) 19 января 2009 года с номером CCTCC-C200902 по адресу Wuhan University, Luojiashan, Wuchang, Wuhan, Hubei Province.

Связывание полученного приведенным выше способом по изобретению антитела с AGR2 можно детектировать посредством общепринятого в данной области способа, например, ELISA.

Способ получения включает следующие стадии:

Стадия 1: Получение культуральной жидкости гибридомных клеток.

Стадия 2: Очистка моноклонального антитела.

Антитело, полученное приведенным выше способом по изобретению, можно использовать для блокирования стимуляции роста опухоли и метастазирования белком AGR2, особенно для ингибирования скорости роста клеток рака молочной железы (аномального по сравнению с нормальными тканями) in vitro и ингибирования метастазирования опухолевых клеток in vitro, и кроме того, для ингибирования роста, миграции и инвазивного метастазирования клеток рака молочной железы T47D in vitro; также оно может ингибировать клеточный цикл клеток рака молочной железы T47D in vitro.

Аномальная скорость роста относится к скорости роста, превышающей необходимую для нормального гомеостаза in vivo и превышающую скорость роста нормальных тканей того же происхождения.

Блокирование или ингибирование относятся к уменьшению или устранению активного эффекта.

Ингибирование скорости роста клеток рака молочной железы in vitro относится увеличению или уменьшению числа опухолевых клеток in vitro. Регуляцию роста опухолевых клеток in vitro можно проводить способом, известным в данной области, например, посредством MTT, как показано в примерах.

Ингибирование метастазирования опухолевых клеток in vitro относится к уменьшению миграции и инвазивного метастазирования опухолевых клеток in vitro. Регуляцию метастазирования опухолевых клеток in vitro можно проводить способом, известным в данной области, таким как способы с применением камеры трансвелл.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством ELISA.

На фиг.2 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммуноблоттинга. A. 1 - клеточный лизат MCF7; 2 - лизат MB-231, трансфицированных AGR2-pcDNA3; 3 - лизат MB-231, трансфицированных pcDNA3; 4 - лизат 293T, трансфицированных AGR2-pcDNA3, и 5 - 293T, трансфицированные pcDNA3. B. Моноклональное антитело может давать перекрестную реакцию с мышиным AGR2.

На фиг.3 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммунопреципитации.

На фиг.4 представлено детектирование специфичности AGR2 посредством иммунофлуоресценции.

На фиг.5A и 5B представлено выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V_L) (фиг.5A) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H) (фиг.5B) (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) мышиного моноклонального антитела 18A4; домен V_L и V_H гуманизированной версии 18A4Hul (SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно) и консенсусная каркасная область человека V_L и V_H (hum κIII, легкая цепь κ подтипа III; humI, тяжелая цепь подтипа I) (SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно). Звездочкой отмечена разница между гуманизированным 18A4Hul и мышиным моноклональным антителом 18A4 или между гуманизированным 18A4Hul и консенсусной каркасной областью человека. Для сравнения определяющие комплементарность области (CDR) подчеркнуты.

На фиг.6A и 6B представлено выравнивание аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V_L) (фиг.2A) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H) (фиг.2B) мышиного моноклонального антитела 18A4 (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно); домен V_L и V_H гуманизированной версии 18A4Hul (SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно) и консенсусная каркасная область V_L и V_H зародышевой линии (hum κIII, легкая цепь κ подтипа III; humI, тяжелая цепь подтипа I) (SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно), а также консенсусная последовательность одобренного лекарственного средства, полученного с применением зародышевых линий YL и VH в качестве матриц. "-" обозначает наличие той же аминокислоты, что и в 18A4, и "*" обозначает позицию, содержащую отличающуюся аминокислоту в одобренном лекарственном средстве, что указывает на то, что изменение в этой позиции в значительной степени влияет на аффинность и специфичность антитела.

Фиг.7 представляет собой схему строения плазмиды для экспрессии интактного антитела. На этой фигуре фрагмент 2 содержит компонент IRES, а фрагмент 1 содержит промотор, терминатор, поли(A)-хвост, ген устойчивости и т.д., которые представляют собой компоненты, традиционно содержащиеся в эукариотической экспрессирующей плазмиде.

На фиг.8 представлен электрофорез SDS-PAGE очищенного антитела, где M обозначает маркер размера белков. Полоски 1, 2, 5 и 6 представляют собой образцы, полученные от мыши, а полоски 3, 4, 7 и 8 представляют собой образцы, полученные от человека. Слева показан неденатурирующий гель, а справа показан денатурирующий гель. Гель окрашен Кумасси синим.

На фиг.9 представлены результаты изучения аффинности антитела, полученные посредством конкурентного метода ELISA.

На фиг.10 представлено выравнивание измененных позиций в гуманизированном варианте антитела и изменение числа потенциальных эпитопов T-клетки. Красным цветом обозначена измененная аминокислотная последовательность.

На фиг.11 представлена кривая связывания антигена с гуманизированным вариантом антитела.

На фиг.12 представлена идентификация видоспецифичности гуманизированного антитела Agtuzumab посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а справа показаны результаты вестерн-блоттинга с применением HRP-конъюгированного антитела к белку человека в качестве вторичного антитела. Полоски 1, 2 и 3 представляют собой мышиное антитело 18A4, контрольное антитело человека IgG и гуманизированное антитело Agtuzumab, соответственно.

На фиг.13 представлено детектирование специфичности связывания антигена с гуманизированным антителом Agtuzumab посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а справа показано применение следующих первичных антител, слева направо, супернатанта трансфекции пустой плазмидой, супернатанта экспрессии Agtuzumab, супернатанта антитела к GST, применяемого в качестве отрицательного контроля, супернатанта мышиного антитела 18A4, супернатанта антитела к MBP, супернатанта антитела к MBP, супернатанта трансфекции контрольной пустой плазмидой, супернатанта экспрессии Agtuzumab и супернатанта антитела к GST, применяемого в качестве отрицательного контроля, соответственно.

На фиг.14 представлено детектирование специфичности связывания гуманизированного антитела Agtuzumab с антигенами в клеточном лизате посредством вестерн-блоттинга. Слева показаны результаты окрашивания SDS-PAGE, а образцы в полосках 1, 2, 3 и 4 справа представляют собой 293 T-клетки, трансфицированные плазмидой AGR2, 293 T-клетки, не трансфицированные плазмидой AGR2, клеточный лизат MCF-7 (с природной экспрессией AGR2) и очищенные AGR2-MBP, соответственно, где первичное антитело представляет собой гуманизированное антитело Agtuzumab. Полоска в 26 КДа представляет собой β-актин для отображения относительного количества белков в лизате.

На фиг.15 представлено детектирование способности гуманизированного антитела Agtuzumab к связыванию с природным AGR в клетках MCF7 посредством иммунопреципитации (IP). Полоски 1, 2 и 3 представляет собой клеточный лизат MCF7, белки, иммунопреципитированные белком G, конъюгированным с IgG человека, и белки, иммунопреципитированные белком G, конъюгированным с гуманизированным антителом Agtuzumab. Первичное антитело представляет собой кроличье моноклональное антитело к AGR2, а вторичное антитело представляет собой HRP-конъюгированное кроличье поликлональное антитело.

На фиг.16 представлены мутанты AGR2-MBP, полученные с применением мутаций согласно результатам анализа потенциальных эпитопов AGR2. Красные GGG обозначают, что данная позиция мутировала с получением трех глицинов.

На фиг.17 представлено связывание мышиного 18A4 и гуманизированного антитела Agtuzumab с мутантами AGR2-MBP. Полоски 1 до 12 представляют собой мутанты AGR2-MBP, AGR2-MBP 1~10 и MBP, соответственно.

На фиг.18 представлено детектирование способности антител к ингибированию инвазивного метастазирования клеток рака печени HepG2 in vitro посредством способа с применением камеры системы трансвелл.

На фиг.19 представлено детектирование способности антител к ингибированию роста и миграции клеток рака молочной железы T47D и MCF 7 in vitro посредством MTT.

На фиг.20 представлено детектирование способности антител к ингибированию миграции клеток рака молочной железы T47D in vitro посредством анализа заживления ран.

На фиг.21 представлено детектирование способности антитела к ингибированию инвазивного метастазирования клеток рака печени HepG2 in vitro посредством способа с применением камеры системы трансвелл.

На фиг.22 представлено детектирование способности антител к ингибированию клеточного цикла клеток рака молочной железы MCF-7 и T47D in vitro посредством цитометрии. Фиг.22A: после обработки антителом по изобретению в течение 48 часов наблюдается ингибирование клеточного цикла клеток рака молочной железы T47D. G1/G0 фаза в клетках T47D увеличивается на 8,56% по сравнению с контролем, в то время как S фаза и G2/M понижается на 8,56%, соответственно. Фиг.22B: после обработки антителом по изобретению в течение 48 часов наблюдается ингибирование клеточного цикла клеток рака молочной железы MCF-7. G1/G0 фаза клеток MCF-7 увеличивается на 5,37% по сравнению с контролем, в то время как S фаза и G2/M понижается на 5,37%, соответственно.

На фиг.23, 24 и 25 представлено подтверждение связывания антител с доменом активного центра AGR2 посредством вестерн-блоттинга.

Фиг.26A, B: Рост опухоли животного. C, D: Сравнение размера опухоли между экспериментальной и контрольной группами. E: Сравнение носителей.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

I. Определение

Термины "AGR2" и "белок переднего градиента человека 2" можно использовать взаимозаменяемо в настоящем документе, обозначая молекулярное семейство, содержащее полноразмерную природную аминокислотную последовательность любого AGR2 человека, как указано выше, и суперсемейство PDI, к которому относится AGR2, включая потенциальные формы и предшественники, а также ассоциированные и неассоциированные комплексы зрелого AGR2 ("потенциальный AGR2"). AGR2, имеющие отношение к изобретению, следует понимать как любые белки типа AGR2, идентифицированные ранее или подлежащие идентификации в будущем, включая полипептиды, полученные из любой последовательности AGR2 и, по меньшей мере, приблизительно на 75%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 90%, и даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 95% гомологичные этой последовательности. Термин "AGR2" относится к гену, кодирующему AGR2 человека. Предпочтительно AGR представляет собой природную последовательность AGR2 человека.

Термин "антитело" в настоящем документе применяют в самом широком смысле, в частности, он охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела, полученные из, по меньшей мере, двух интактных антител (такие как антитела с двойной специфичностью), и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желаемые виды биологической активности.

Антитело, которое "связывается с" нужным антигеном, таким как антиген AGR2, относится к антителу, способному связываться с антигеном с достаточной аффинностью, что позволяет использовать антитело в качестве терапевтического средства для воздействия на клетки, экспрессирующие указанный антиген. Если антитело представляет собой антитело, связывающееся с AGR2, то оно, как правило, предпочтительно связывается с AGR2, а не с другими членами семейства AGR2, и представляет собой антитело, которое не демонстрирует значительной перекрестной реакции с другими белками этого семейства, например, BMP, белком-активатором и т.д. Антитело, обладающее "биологическими свойствами" данного антитела, такое как моноклональное антитело, обозначенное как 18A4, относится к антителу, обладающему одним или несколькими биологическими свойствами указанного антитела и отличающемуся от других антител тем, что оно связывается с тем же антигеном (таким как AGR2). Например, антитело, обладающее биологическими свойствами 18A4, может блокировать активацию AGR2 и/или связывается с тем же эпитопом внеклеточного домена AGR2, что и 18A4.

Термин "моноклональное антитело", применяемый в настоящем документе, относится к антителам, полученным из по существу гомогенной популяции антител, т.е. такой, в которой составляющие ее антитела являются одинаковыми, за исключением возможных природных мутантов, которые, как правило, представлены в очень небольшом количестве. Моноклональное антитело является высокоспецифичным, т.е. связывается с одним эпитопом на антигене. Кроме того, в отличие от составов поликлональных антител, содержащих различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело связывается с одним детерминантом антигена.

В дополнение к специфичности, преимущество моноклональных антител заключается в том, что их можно получать, избегая контаминации другими антителами. Определение "моноклональный" указывает на свойство антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не подразумевает, что для получения такого антитела необходим какой-либо специальный способ.

Если не указано иначе, "моноклональное антитело 18A4" относится к антителу, содержащему связывающиеся с антигеном остатки мышиного антитела 18A4 по следующим примерам, или антителу, полученному от мышиного антитела 18A4 по следующим примерам. Например, моноклональное антитело 18A4 может представлять собой мышиное моноклональное антитело 18A4 или его вариант, такой как гуманизированное антитело 18A4, содержащее связывающиеся с антигеном аминокислотные остатки мышиного моноклонального антитела 18A4. Примеры гуманизированного антитела 18A4 приведены в примере 2.

"Эпитоп 18A4" представляет собой регион внеклеточного домена AGR2, с которым связывается моноклональное антитело 18A4. Для поиска антител, связывающихся с эпитопом 18A4, можно применять традиционный эпитоп-перекрестный конкурентный анализ, описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).

Моноклональное антитело в настоящем документе включает "химерное" антитело, в котором участок тяжелой цепи и/или легкой цепи идентичен или гомологичен соответствующей последовательности, полученной из другого специфичного вида или принадлежащей к специфичному типу или подтипу антитела, а остальная часть цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности, полученной из другого специфичного вида или принадлежащей к специфичному типу или подтипу антитела, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность.

"Интактное" антитело представляет собой антитело, содержащее связывающуюся с антигеном вариабельную область, а также константную область легкой цепи (C_L) и константные области тяжелой цепи C_H1, C_H2 и C_H3. Константная область может представлять собой константную область с природной последовательностью (такую как константная область с природной последовательностью человека) или варианты этой аминокислотной последовательности. Предпочтительно, интактное антитело имеет одну или несколько эффекторных функций.

"Фрагмент антитела" содержит участок интактного антитела, предпочтительно содержит его связывающую антиген область или вариабельную область. Примеры фрагмента антитела включают фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, линейное антитело и одноцепочечное антитело.

Фрагмент "Fv" представляет собой фрагмент антитела, содержащий интактные участки распознавания антигена и связывания. Этот регион состоит из тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, тесно связанных друг с другом, где связь может быть ковалентной (такой как в scFV). При такой конформации три CDR в каждой вариабельной области взаимодействуют друг с другом, формируя антигенсвязывающий участок на поверхности димера V_II-V_I.

Фрагмент "Fab" содержит вариабельную область и константную область легкой цепи и вариабельную область и первую константную область (CH1) тяжелой цепи. Фрагмент F(ab’)₂ антитела содержит пару фрагментов Fab, которые, как правило, ковалентно связаны вблизи карбоксильных концов через цистеины, расположенные между ними.

"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагмент антитела содержит домены VH и VL антитела, которые представлены одной полипептидной цепью. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv формировать структуру, идеально подходящую для связывания антигена.

Термин "линейное антитело" обозначает парные тандемные сегменты Fd (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые формируют парные антигенсвязывающие области вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи. Линейное антитело может обладать двойной специфичностью или одиночной специфичностью.

Термин "вариабельная область антитела", применяемый в настоящем документе, относится к участкам легкой цепи и тяжелой цепи молекулы антитела, которые содержат аминокислотные последовательности определяющей комплементарность области (CDR, т.е., CDR1, CDR2 и CDR3) и каркасные области (FR). V_H относится к вариабельной области тяжелой цепи. V_L относится к вариабельной области легкой цепи. Согласно способу, применяемому в изобретении, соответствующие аминокислотные позиции CDR и FR можно определять по Kabat et al. (номенклатура описана в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Термин "определяющая комплементарность область" (CDR: т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), применяемый в настоящем документе, относится к аминокислотным остаткам в вариабельных областях антитела, наличие которых необходимо для связывания антигена. Каждая вариабельная область, как правило, содержит три CDR, которые обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая определяющая комплементарность область может содержать аминокислотные остатки "определяющей комплементарность области", определенные по Кабату (т.е. приблизительно остатки (Ll), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35(Hl), 50-65(H2) и 95-102(H3) в вариабельной области тяжелой цепи.

"Каркасная область" (далее в настоящем документе FR) представляет собой те остатки в вариабельной области, которые не относятся к остаткам CDR. Каждая вариабельная область, как правило, содержит 4 FR, которые обозначают как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяют по Кабату, то остатки FR легкой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88(LCFR3) и 98-107(LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи приблизительно в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) тяжелой цепи. Если CDR содержит аминокислотные остатки из гипервариабельной петли, остатки FR легкой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи находятся приблизительно в области остатков 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) тяжелой цепи. В некоторых случаях, когда CDR содержит аминокислоты CDR, определенные по Кабату как гипервариабельная петля, остатки FR определяют соответствующим образом. Например, если CDRH1 содержит аминокислоты H26-H35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в позициях 1-25, а остатки FR2 находятся в позициях 36-49.

Термин "эпитоп T-клетки", применяемый в настоящем документе, относится к потенциальному пептидному удлинению моноклонального антитела, которое может связываться и представляться молекулой MHC и распознаваться рецептором антигенов T-клетки, когда само моноклональное антитело выступает в качестве антигена. Эти пептидные удлинения, входящие в состав моноклонального терапевтического антитела, могут усиливать иммунный ответ пациента на терапевтическое антитело. Чем сильнее степень удлинения пептидов, тем выше вероятность того развития иммунного ответа.

"Гуманизированная" форма антитела животного, отличного от человека (такого как грызун), относится к химерному антителу, которое, по меньшей мере, содержит последовательность, полученную от иммуноглобулина животного, отличного от человека. В более широком смысле гуманизированное антитело относится к иммуноглобулину, в котором остатки гипервариабельной области в иммуноглобулине человека (реципиентное антитело) заменены остатками гипервариабельной области иммуноглобулина животного, отличного от человека, такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, и имеет желаемую специфичность, аффинность и свойства (донорное антитело). В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены на соответствующие остатки, принадлежащие животному, отличному от человека. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остаток, отсутствующий в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации проводят для дальнейшего улучшения свойств антитела, где, как правило, гуманизированное антитело содержит из по существу не менее чем, по меньшей мере, одной, как правило, двух вариабельных областей, в которых все или по существу все гипервариабельные петли относятся к гипервариабельным петлям иммуноглобулина животного, отличного от человека, и все или по существу все FR представляют собой FR последовательности иммуноглобулина человека. Необязательно, гуманизированное антитело дополнительно содержит, по меньшей мере, участок константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константную область иммуноглобулина человека.

"Антиангиогенное средство" или "ингибитор ангиогенеза" относится к низкомолекулярному соединению, полинуклеотиду, полипептиду, изолированному белку, рекомбинантному белку, антителу или их конъюгату или слитому белку, который прямо или косвенно ингибирует ангиогенез, образование сосудов или нежелательную проницаемость сосудов. Следует понимать, что антиангиогенные средства включают средства, которые связываются и блокируют ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. В таблице 2 в Oncogene, 22:6549-6556 (2003) приведены известные антиангиогенные факторы. В таблице 1 в Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) првиедены антиангиогенные факторы, проходившие клинические испытания.

Термин "аномальный ангиогенез" относится к избыточному, неправильному или бесконтрольному ангиогенезу, вызывающему заболевание или его ухудшение, где заболевание представляет собой, например, злокачественную опухоль, особенно солидную опухоль или метастазирующую опухоль, ассоциированную с ангиогенезом.

Термин "цитотоксическое средство", применяемое в настоящем документе, относится к средству, которое ингибирует или блокирует клеточные функции и/или вызывает разрушение клетки. Этот термин включает радиоактивные изотопы, химиотерапевтические средства и токсины.

"Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, применяемое для лечения злокачественной опухоли, и также называется противоопухолевым лекарственным средством. Противоопухолевые лекарственные средство, как правило, на основе различий в химической структуре и происхождения лекарственного средства классифицируют на алкилирующие средства, антиметаболические лекарственные средства, противоопухолевые антибиотики, антрациклиновые антибиотики, противоопухолевые растительные лекарственные средства и гормоны. В зависимости от специфичности к фазе или циклу химиотерапевтические средства против опухолей можно классифицировать на (1) не специфичные к клеточному циклу средства (CCNSA), такие как алкилирующие средства, противоопухолвые антибиотики, координационный комплекс платины и т.д., и (2) специфичные к клеточному циклу средства (CCSA), такие как антиметаболические лекарственные средства, алкалоиды барвинка и т.д.

II. Получение гуманизированного антитела к AGR2

Способ гуманизации антитела, полученного от животного, отличного от человека, известен в данной области. Предпочтительно гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, полученных от животного, отличного от человека. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки часто называют "входящими" остатками, которые, как правило, получают из "входящей" вариабельной области. Гуманизацию можно проводить способом, предложенным Winter с коллегами (Jones et al, Nature. 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature. 332: 323-327(1988); и Verhoeyen et al, Science. 239: 1534-1536 (1988)), посредством замены последовательности гипервариабельной области антитела человека на соответствующие последовательности. Таким образом, такое "гуманизированное антитело" представляет собой химерное антитело (патент США № 4816567), в котором участок, по существу более короткий, чем полная вариабельная область человека, заменяют на соответствующие последовательности, полученные от видов, отличных от человека. На практике гуманизированное антитело, как правило, представляет собой антитело человека, в котором некоторые гипервариабельные остатки и иногда некоторые остатки FR заменены на остатки антитела грызуна, находящиеся в тех же позициях.

Выбор вариабельной области человека для получения гуманизированного антитела, включая легкую цепь и тяжелую цепь, очень важен для снижения антигенности. На основе так называемого способа "наилучшего приближения" было проведено сравнение целой библиотеки известных последовательностей вариабельных областей человека и последовательностей антитела грызуна. Затем последовательность человека, наиболее похожую на соответствующую ей последовательность грызуна, выбирали в качестве каркасной области (FR) гуманизированного антитела человека (Sims et al, J. Immunol., 151: 2296(1993); Chothia et al, J. Mol. Biol. 196: 901(1987)). В другом способе применяют специфичную каркасную область, полученную из консенсусной последовательности всех антител человека в пределах субпопуляций легкой цепи или тяжелой цепи. Тот же каркас можно использовать для нескольких других различных гуманизированных антител (Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol. 151: 2623(1993)).

При получении гуманизированного антитела важно, чтобы антитело было способно сохранять высокую аффинность к антигену и другие необходимые биологические свойства после гуманизации. Примеры, приведенные ниже, описывают получение иллюстративного гуманизированного антитела к AGR2, которое связывается с AGR2.

Гуманизированное антитело в настоящем документе содержит остатки гипервариабельной области животного, отличного от человека, остатки, встроенные в вариабельную область тяжелой цепи человека, а каркасная область (FR) содержит замены в позициях, выбранных из 57, 58, 60, 65, 67, 68 и/или 70, где обозначения вариабельной области описана согласно номенклатуре Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном из вариантов осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в двух или более позициях, выбранных из позиций 57, 58, 60, 65, 67, 68 и 70, в то время как в дополнительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в трех или четырех позициях, выбранных из позиций 57, 58, 60, 65, 67, 68 и 70. В предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в позициях 65, 67, 68 и 70 или в позициях 67, 68 и 70 или в позициях 68 и 70. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в позициях 57, 58 и 60 или в позициях 57 и 60. Предпочтительно, чтобы гуманизированное антитело по изобретению имело скорее мало, чем много замен в каркасном регионе, чтобы минимизировать антигенность, однако эффективность также является очень важным фактором. Аминокислоты, подлежащие замене, предпочтительно представляют собой консервативные аминокислоты, замена которых не изменяет иммуногенность или эффективность. Аспарагин (N) в позиции 57 предпочтительно заменяют на серин (S), лейцин (L) в позиции 58 предпочтительно заменяют на аргинин (R), серин (S) в позиции 60 предпочтительно заменяют на треонин (T), лизин (K) в позиции 65 предпочтительно заменяют на глутамин (Q), лизин (K) в позиции 67 предпочтительно заменяют на аргинин (R), аланин (A) в позиции 68 предпочтительно заменяют на валин (V), а лейцин (L) в позиции 70 предпочтительно заменяют на метионин (M).

Иллюстративные гуманизированные антитела, описанные в изоберетении, содержат определяющие комплементарность остатки DYNMD (SEQ ID NO: 8); DINPNYDTTS YNQKFKG или DINPNYDTTS YNQKFQG (SEQ ID NO: 9); и/или SMMGYGSPMD Y (SEQ ID NO: 10) вариабельной области тяжелой цепи, необязательно содержат аминокислотные модификации этих остатков CDR, например, где эти модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность этих антител. Например, указанные варианты антитела могут содержать замены приблизительно от 1 до 5 аминокислот, приблизительно от 1 до 4 аминокислот, приблизительно от 1 до 3 аминокислот и приблизительно от 1 до 2 аминокислоты в указанной вариабельной области последовательности CDR. Такие варианты антител можно получать, например, посредством созревания аффинности. Предпочтительно, вариабельная области тяжелой цепи гуманизированного антитела содержит два, наиболее предпочтительно все три последовательности CDR определяющих комплементарность остатков DYNMD (SEQ ID NO: 8); DINPNYDTTS YNQKFKG или DINPNYDTTS YNQKFQG (SEQ ID NO: 9) и SMMGYGSPMD Y (SEQ ID NO: 10). Наиболее предпочтительное гуманизированное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO:4.

Гуманизированное антитело по изобретению может содержать определяющие комплементарность остатки RASKSVSTSG YSYMH (SEQ ID NO: 11); LASNLES (SEQ ID NO: 12); и/или QHIRELPRT (SEQ ID NO: 13) вариабельной области легкой цепи. В предпочтительном варианте осуществления определяющие комплементарность остатки вариабельной области легкой цепи, описанные в настоящем документе, включены в дополнение к остаткам CDR вариабельной области тяжелой цепи, приведенным выше. Такое гуманизированное антитело необязательно содержит аминокислотные модификации приведенных выше остатков CDR легкой цепи, например, где эти модификации по существу сохраняют или повышают аффинность этих антител. Например, указанные варианты антител могут содержать замены приблизительно от 1 до 5 аминокислот, приблизительно от 1 до 4 аминокислот, приблизительно от 1 до 3 аминокислот и приблизительно от 1 до 2 аминокислот в приведенной выше CDR последовательности вариабельной области легкой цепи. Такие варианты антител можно получать посредством способа созревания аффинности. Предпочтительно, вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела содержит два, наиболее предпочтительно все три последовательности CDR определяющих комплементарность остатков RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO: 11); LASNLES (SEQ ID NO: 12) и QHIRELPRT (SEQ ID NO: 13). Наиболее предпочтительное гуманизированное антитело содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 3.

Изобретение далее относится к созреванию аффинности антитела, связывающегося с AGR2. Первичное антитело может представлять собой антитело человека или гуманизированное антитело, например, антитело, содержащее последовательности вариабельной области легкой цепи и/или тяжелой цепи, представленные в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно (т.е. версия 5). Антитело с созревшей аффинностью предпочтительно связывается с AGR2 с аффинностью, превышающей аффинность мышиного моноклонального антитела к AGR2 18A4 или его варианта 5 (например, его аффинность повышается в приблизительно от 2 раз или приблизительно 4 раз до приблизительно 100 раз или приблизительно 1000 раз, как определяют посредством ELISA для внеклеточного домена AGR2 (ECD)).

Настоящее изобретение относится ко многим формам гуманизированного антитела или антитела с созревшей аффинностью, которые связываются с AGR2. Например, гуманизированное антитело или антитело с созревшей аффинностью может представлять собой фрагмент антитела, такой как Fab, необязательно конъюгированный с одним или несколькими цитотоксическими средствами с образованием иммуноконъюгата. Альтернативно, гуманизированное антитело или антитело с созревшей аффинностью может представлять собой интактное антитело, такое как интактное антитело IgG.

III. Вектор, клетка-хозяин и способ рекомбинации

Изобретение дополнительно относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей гуманизированное антитело к AGR2, вектору и клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислота, а также способу рекомбинации для получения антитела.

Для получения антитела посредством рекомбинации нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, изолируют и встраивают в репродуцируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. ДНК, кодирующую моноклональное антитело, можно легко изолировать и секвенировать с посредством традиционных способов (таких как с применением олигонуклеотидного зонда, способного специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую цепь и легкую цепь). Можно получать множество векторов.

Компоненты векторы, как правило, включают в качестве неограничивающих примеров один или несколько следующих компонентов: сигнальная последовательность, точку начала репликации, один или несколько маркерных генов, энхансер, промотор и последовательность терминации транскрипции.

(i) Компонент сигнальной последовательности

Антитело к AGR2 по изобретению можно не только получать напрямую посредством рекомбинации, но и получать в форме слитого полипептида с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно содержит сигнальную последовательность со специфичным сайтом рестрикции в N-концевой области зрелого белка или полипептида, или другим полипептидом. Гетерологичная сигнальная последовательность, которая распознается и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином, является предпочтительной. Например, в случае дрожжей можно применять лидерную последовательность инвертазы дрожжей или лидерную последовательность α-фактора. Для экспрессии в клетках млекопитающих можно применять сигнальную последовательность и вирусную лидерную последовательность, такую как сигнальную последовательность gD Herpes simplex.

Такая ДНК прекурсорной области связана с открытой рамкой считывания ДНК, кодирующей антитело к AGR2.

(ii) Компонент точки начала репликации

Как экспрессирующие, так и клонирующие векторы содержат последовательности нуклеиновой кислоты, позволяющие векторам реплицироваться в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах. Как правило, в клонирующем векторе такая последовательность представляет собой последовательность, позволяющую вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, включая точку начала репликации или самореплицирующуюся последовательность. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов.

(iii) Компонент селективного гена

Экспрессирующий и клонирующий векторы могут содержать селективный ген, который также называют селективным маркером. Типичные селективные гены кодируют следующие белки: (a) белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, таким как ампициллин, неомицин, метотрексат или тетрациклин; (b) белки, восполняющие ауксотрофию; или (c) белки, под воздействием которых ключевые питательные вещества в комплексной среде становятся недоступными, такие как ген, кодирующий D-аланин рацемазу Bacillus subtilis.

(iv) Компонент промотора

Экспрессирующий и клонирующий вектор, как правило, содержат промоторы, которые распознает организм хозяина и которые функционально связаны с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело к AGR2.

(v) Компонент энхансера

Энхансерную последовательность часто встраивают в вектор для стимулирования транскрипции ДНК, кодирующей антитело к AGR2 по изобретению, в эукариотической клетке. Известно множество энхансерных последовательностей из генов млекопитающих. Однако применяют, как правило, энхансер из вирусов эукариотических клеток.

(vi) Компонент терминации транскрипции

Экспрессирующий вектор для эукариотической клетки-хозяина дополнительно содержит последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности можно, как правило, получать из 5’-концевой и иногда из 3’-концевой области нетранслируемого участка эукариотической или вирусной ДНК или кДНК. Эти участки содержат нуклеотидные сегменты, которые транскрибируются в полиаденилированный фрагмент в нетранслируемом участке мРНК, кодирующей антитело к AGR2.

(vii) Селекция и трансформация клетки-хозяева

Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии ДНК в векторе, в настоящем документе представляют собой прокариоты, дрожжи или высшие эукариотические клетки, как описано выше. Прокариоты, подходящие для этой цели, включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы. В дополнение к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитевидные грибы или дрожжи, также являются подходящими хозяевами для клонирующего или экспрессирующего вектора, кодирующего антитело к AGR2.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированного антитела к AGR2, получают от многоклеточных организмов, включая растения. Примеры клеток беспозвоночных организмов включают клетки насекомых, например, такие как клетки Spodoptera frugiperda и т.д.

Однако клетки позвоночных представляют наибольший интерес. Кроме того, выращивание клеток позвоночных при культивировании (культура тканей) стало традиционной процедурой. Примеры применяемых клеточных линий млекопитающих, применяемых в качестве клеток-хозяев, включают SV40 трансформированную линию почечных клеток обезьяны CV1, линию эмбриональных почечных клеток человека, линию почечных клеток новорожденного хомяка, клетки CHO, клетки DG44, клеточную лини DP 12 и т.д.

Для получения антитела к AGR2 экспрессирующие или клонирующие векторы, описанные выше, применяют для трансформации клеток-хозяев и культивируют в традиционных питательных средах, необходимым образом модифицированных для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.

(viii) Культивирование клеток-хозяев и очистка антитела к AGR2

Клетки-хозяева для получения антитела к AGR2 по изобретению можно культивировать в различных доступных в продаже средах, таких как RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM, Sigma). Кроме того, при необходимости в эти среды можно добавлять дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области, такие как гормоны и/или другие факторы роста, соли, буфер, антибиотики, микроэлементы и глюкоза. Условия культивирования, такие как температура, pH и т.д., можно устанавливать в зависимости от выбранных клеток-хозяев, как ясно специалистам в данной области.

При применении рекомбинантного способа антитело можно получать в клетке или в периплазматическом пространстве или напрямую выделять в среду. Если антитело получают внутри клетки, то сначала удаляют дебрис из макрочастиц клетки-хозяева или литические фрагменты посредством, например, центрифугирования или ультрафильтрации. Если антитело выделяют в среду, супернатант такой экспрессирующей системы, как правило, сначала концентрируют с применением доступного в продаже концентратора белков. На любом из приведенных выше этапов можно применять ингибитор протеазы для ингибирования протеолиза, а также антибиотик для предотвращения роста чужеродных контаминантов.

Композицию антител, полученную из клеток, можно очищать с применением, например, гидроксиапатитной хроматографии, электрофореза в геле, диализа и аффинной хроматографии (предпочтительный способ очистки представляет собой аффинную хроматографию). Пригодность белка A в качестве аффинного лиганда зависит от типа и изотипа домена Fc иммуноглобулина в антителе. В зависимости от подлежащего выделению антитела можно применять также другие способы очистки белка, такие как обращенно-фазовая ВЭЖХ, катион- или анионообменная хроматография, SDS-PAGE и осаждение с применением аммония сульфата.

IV. Фармацевтический состав

Терапевтический состав антитела по изобретению получают посредством смешивания антитела с желаемой степенью очистки с необязательно применяемым фармацевтически приемлемым носителем, средством или стабилизатором и хранят в форме лиофилизированного состава или водного раствора. Дозировка и концентрация, применяемая для приемлемого носителя, средства или стабилизатора должна быть нетоксической для пеципиента, как ясно специалистам в данной области.

Состав в настоящем документе может дополнительно содержать более одного активного компонента, необходимого для лечения по особым показаниям, предпочтительно компоненты, имеющие комплементарную активность и не оказывающие неблагоприятного воздействия друг на друга. Активный компонент, например, может представлять собой терапевтическое средство, цитотоксическое средство и/или антиангиогенное средство и т.д.

V. Состав и набор

В другом варианте осуществления изобретения предоставляют состав и набор, содержащий антитело, который можно использовать для лечения заболеваний, как описано в изобретении, или фармацевтическую композицию. Этот продукт содержит резервуар и этикетку или вкладыш в упаковку, прикрепленный к резервуару или помещенный отдельно в упаковку продукта. Подходящие резервуары включают, например, склянки, пузырьки, инъекторы и т.д. Резервуар можно получать с применением различных материалов, таких как стекло или пластик. Резервуар содержит фармацевтическую композицию, эффективную для лечения заболеваний, описываемых в настоящем документе. Этикетка или вкладыш в упаковку указывает на то, что данная композиция предназначена для лечения заболевания, такого как злокачественная опухоль, например, рак молочной железы (например, метастазирующий рак молочной железы), рак предстательной железы, рак легких (например, немелкоклеточный рака легких), колоректальный рак и т.д.

Кроме того, продукт может включать (a) первый резервуар, композицию, включающую моноклональное антитело по изобретению, предпочтительно гуманизированное моноклональное антитело; и (b) второй резервуар, содержащий композицию, включающую терапевтическое средство, отличное от гуманизированного антитела. Продукт по данному варианту осуществления изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, указывающий на то, что первую и вторую композиции можно комбинировать для лечения, например, злокачественной опухоли. Альтернативно/дополнительно, продукт может дополнительно содержать второй (или третий) резервуар, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI) и фосфатно-солевой буфер. Он может дополнительно содержать другие компоненты, необходимые с учетом коммерческой перспективы или перспективы пользователя.

VI. Лечение с применением моноклонального антитела к AGR2

В изобретении отмечено, что антитело к AGR2 можно использовать для лечения опухоли, такой как рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, колоректальный рак, немелкоклеточный рак легких, злокачественная опухоль почки, рак печени, рак головы и шеи, меланома, рак яичников и множественная миелома и т.п.

Другие схемы лечения можно комбинировать с введением антитела к AGR2. Комбинированное введение включает одновременное введение с применением отдельных составов или единого состава с лекарственными средствами и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, в течение которого оба (или все) активные средства вместе проявляют свою биологическую активность.

В предпочтительном варианте осуществления два разных антитела к AGR2 применяют для лечения пациента. В другом варианте осуществления введение одного или нескольких антител к AGR2 комбинируют с введением антитела к другому ассоциированному с опухолью антигену. В другом варианте осуществления антитело к AGR можно комбинировать с антиангиогенным средством, оказывающим ингибирующее действие на ангиогенез.

В одном варианте осуществления лечение по изобретению включает комбинированное введение (одного или нескольких) антител к AGR2(s) и одного или нескольких иммуномодуляторов млекопитающих, таких как цитокин, а также химиотерапевтического средства или ингибитор роста, включая одновременное введение смеси различных химиотерапевтических средств. Предпочтительные химиотерапевтические средства включают таксаны (такие как таксол и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Составы и схемы лечения с применением таких химиотерапевтических средств можно использовать по инструкциям производителя или на основе опыта специалистов в данной области.

Подходящая дозировка любых лекарственных средств, доставляемых в сочетании с антителом по изобретению, может представлять собой дозировку, применяемую в традиционном лечении, однако дозировку также можно снижать при комбинированном введении с антителом к AGR2 по изобретению.

Подходящую дозировку антител по изобретению можно определять приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг в зависимости от типа и тяжести заболевания. Введение можно проводить в форме единого или раздельного введения, а также в виде непрерывной инфузии. Типичное суточное дозирование может составлять приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг в зависимости от объекта лечения, наличия предшествующего лечения, анамнеза и восприимчивости пациента к антителу, а также осторожности врача.

VII. Применение моноклонального антитела к AGR2

для детектирования

Антитело по изобретению (например, гуманизированное антитело к AGR2) также имеет нетерапевтическое применение. Например, моноклональное антитело к AGR2 также можно использовать для детектирования экспрессии белка AGR2 в конкретных клетках, тканях или жидкостях.

С целью проведения диагностики для мечения антитела можно применять, как правило, молекулы для детектирования, такие как радиоактивный изотоп, флуоресцентная метка или метку фермент-субстрат. Специалистам в данной области известны различные способы выполнения этой задачи. Например, антитело можно конъюгировать с биотином, альтернативно, антитело можно конъюгировать с низкомолекулярным полуантигеном (таким как дигоксин).

Антитело по изобретению можно использовать для проведения любых известных анализов, таких как анализы конкурентного связывания, прямой или непрямой "сэндвич"-анализ, и иммунопреципитация.

Для удобства антитело по изобретению можно предоставлять в составе набора, который представляет собой комбинацию определенного количества средства и инструкцию для проведения диагностики. Если применяют меченое ферментом антитело, набор включает субстрат и кофактор, необходимые для фермента (например, предшественник, предоставляющий подлежащий детектированию хромофор или флуорофор). Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и т.п. Относительное количество различных средств можно широко варьировать для предоставления концентраций средств в растворе, которые в значительной степени улучшают чувствительность эксперимента. В частности, эти средства можно предоставлять в виде сухих порошков, как правило, лиофилизированных, которые содержат добавку, при растворении обеспечивающую получение раствора средства с нужной концентрацией.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение и идентификация моноклонального антитела 18A4

A. Получение бульона гибридомных клеток

Клетки непрерывно культивировали в течение трех суток с применением среды RPMI-1640 (содержащей 10% бычью сыворотку и 1% антибиотики) для поддержания количества клеток на уровне 80% и обеспечения того, что клетки находятся в логарифмической фазе роста, промывали с применением PBS, переносили в свободную от сыворотки среду RPMI-1640 на 48 часов, после чего собирали супернатант.

B. Очистка моноклонального антитела

Антитело очищали с применением белок-G иммуноаффинной хроматографии согласно инструкциям Pierce Proteine G Agarose (20399). Кратко, протокол был следующим: материал колонки и все реагенты вынимали из холодильника с температурой 4°C и оставляли при комнатной температуре до тех пор, пока они не достигали комнатной температуры; материал колонки мягко перемешивали и 2 мл 50% суспензии материала колонки добавляли в колонку, избегая появления пузырьков; 5 мл связывающего буфера добавляли для уравновешивания колонки; сначала удаляли посторонние примеси посредством фильтрации через 0,45 мкм фильтрующую мембрану, а затем образец разбавляли с соотношением связывающий буфер:образец, составляющим 1:9, с тем, чтобы концентрация соли и значение pH образца соответствовало параметрам, необходимым для связывания; разведенный образец помещали в колонку, когда максимальное связывание, достигнутое для полного образца, составляло менее 80% максимальной связывающей способности (5 мг мышиного IgG/мл материала колонки), в противном случае элюат содержал бы антитела; желаемое антитело элюировали с применением 5 мл элюирующего буфера и собирали в 1 мл/пробирку, куда предварительно добавляли 100 мкл 1M фосфата или нейтрализующего буфера Tris; концентрацию белка в каждой пробирке определяли с применением Кумасси синего G-250. Образцы с высокой концентрацией белка смешивали и систему растворителей меняли посредством диализа с применением PBS (фосфатно-солевой буфер). Колонку восстанавливали с применением 12 мл элюирующего буфера.

Пример 2: Анализ титра моноклональных антител

Способ анализа титра антител с применением ELISA был следующим: планшеты для ELISA покрывали 100 мкл/лунку (концентрация антигена 3 мкг/мл, если иммуноген представляет собой слитый белок, маркерный белок также необходим для покрытия) и инкубировали в течение ночи при 4°C или при 37°C в течение 2 часов. Раствор сливали и планшеты переворачивали и сушили. Блокирование: 200 мкл/лунку блокирующего раствора добавляли при 4°C в течение ночи или при 7°C в течение 2 часов, раствор сливали и планшеты переворачивали и сушили. Тестируемые образцы добавляли в количестве 100 мкл/лунку (коэффициенты разбавления: 0², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, положительные и отрицательные контроли разбавляли в 1000 раз по 100 мкл/лунку) и инкубировали в течение ночи при 4°C или 37°C в течение 2 час. Раствор сливали и планшеты переворачивали и сушили. Планшеты промывали отмывочным буфером в течение 3×3 минут и сушили. Добавление вторичного антитела: вторичное антитело разбавляли 1:10000 блокирующим буфером в количестве 100 мкл/лунку, после отстаивания при 37°C в течение 20 минут планшеты промывали отмывочным буфером в течение 3×3 минут и высушивали. Окраска: субстрат добавляли в количестве 100 мкл/лунку, чтобы позволить цвету достаточно потемнеть. Остановка: добавляли 100 мкл останавливающего раствора, где оптическая плотность составляла 450 нм для планшета. Фотография планшета показана на фиг.1, где видно, что титр антител превысил 10⁶.

Пример 3: Специфичность моноклонального антитела

A. Иммуноблоттинг:

Перед лизисом клетки дважды промывали 1×PBS и счищали посредством добавления 10 мл PBS. После центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 5 минут супернатант удаляли. Добавляли пятикратный объем NP40 лизисного буфера (с добавлением ингибиторов протеаз) и тщательно перемешивали для 20-минутного лизиса. Опухолевую ткань тщательно смешивали с пятикратным объемом лизисного буфера NP40 (с добавлением ингибиторов протеаз) для 20-минутного лизиса. После центрифугирования при 15000 об./мин. при 4°C собирали супернатант и количественно оценивали белок (описанные выше этапы лизирования проводили на льду). Преципитаты суспендировали в 5×PAGE загрузочном буфере (с добавлением β-меркаптоэтанола) и нагревали при 95°C в течение 5 минут. Белки разделяли с применением 15% SDS-PAGE агарозного электрофореза в геле при постоянном напряжении 80V в течение 2 часов. Белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану при 400 мА в течение 45 мин и блокировали при комнатной температуре с применением 5% белка бычьей сыворотки в течение 1 часа. Белки гибридизовали с первичным антителом при комнатной температуре в течение 2 часов и отмывали 1×PBST в течение 3×10 минут. Первичные антитела и коэффициенты разведения: антитело к AGR2 кролика, 1:10000, β-actin 1:2000. Белки гибридизовали со вторичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа и отмывали 1×PBST в течение 3×10 мин. Результаты получали с применением экспозиции, цветного проявления и сканирования.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело детектировало экспрессию AGR2 в T47D и клетках 293T, трансфектированных AGR2-pcDNA3, в то время как в 293 T-клетках, трансфектированных pcDNA3, не наблюдалось экспрессии AGR2. См. фиг.2.

B. Иммунопреципитация

Получение образца: 0,2 мл белка G (50% взвесь Protein G Agarose от Pierce) добавляли в пробирки для центрифугирования, заполненные 10 мл PBS, тщательно перемешивали и отстаивали при RT в течение 30 минут. После центрифугирования при 1500 об./мин. в течение 2 минут удаляли 10 мл супернатанта, к которым добавляли 10 мл содержащей антитело (антитело показано на фиг.3, изотип IgG применяли в качестве контрольного антитела) среды и тщательно перемешивали. После RT>2 часов или 4°C в течение ночи на качающейся платформе супернатант удаляли посредством центрифугирования. Преципитаты дважды промывали 10 мл PBS. Гранулы белка G, связанного с антителом, переносили в 1,5 мл пробирки для центрифугирования, в котороые добавляли PBS до 0,2 мл и держали при 4°C. Супернатанты клеток T47D и MCF7 (24 часов) собирали и разделяли на две пробирки по 10 мл каждая. Одну пробирку подвергали иммунопреципитации с применением белка G, связанного с антителом по изобретению, для удаления AGR2, в то время как другую пробирку с белком G, связанным с контрольным антителом, применяли в качестве контроля. После RT>2 часов или 4°C в течение ночи проводили центрифугирование, и супернатант собирали для повторения иммунопреципитации. Преципитаты промывали четыре раза 1 мл PBS и суспендировали с применением 5×PAGE загрузочного буфера (с добавлением β-меркаптоэтанола) и оставляли при 95°C в течение 5 минут. Результаты получали посредством иммуноблоттинга.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело детектировало AGR2 в супернатанте T47D и MCF7 посредством иммунопреципитации. См. фиг.3.

С. Детектирование посредством иммунофлуоресценции

Круглые покровные стекла помещали в 24-луночные планшеты и один раз промывали PBS. Далее их погружали в соответствующую среду, после чего отсасывали среду. Расщепленные трипсином клетки T47D и MCF7 переносили в 24-луночные планшеты. После прикрепления клеток к стенкам среду отсасывали и один раз проводили промывание PBS, после чего проводили фиксацию 4% формальдегидом при комнатной температуре в течение от 10 до 20 минут, один раз промывали PBS, 0,5% Triton X-100 и 0,3% овечьей сывороткой при комнатной температуре в течение 40 минут. Добавляли первичное антитело, после чего отстаивали при 4°C в течение ночи и промывали PBS в течение 3×5 минут. Добавляли флуоресцентное вторичное антитело, после чего отстаивали при комнатной температуре в течение 30 мин и промывали PBS в течение 3×5 минут. После окрашивания DAPI в течение 2-5 минут и промывания PBS в течение 2×5 минут препараты рассматривали с применением флуоресцентного микроскопа.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело детектировало экспрессию AGR2 in situ в клетках рака молочной железы T47D и MCF 7. См. фиг.4.

Пример 4: Получение гуманизированного антитела 18A4

Первую вариабельную область мышиного моноклонального антитела 18A4 клонировали в вектор, способный синтезировать химерное антитело мыши/человека. Тотальную РНК выделяли из гибридомных клеток с применением набора для выделения РНК STRAGENE™ согласно инструкциям производителя. Вариабельную область амплифицировали посредством RT-ПЦР, очищали посредством электрофореза в геле и встраивали в плазмиду, содержащую константную область человека κ и домен CHI человека, как описано выше. Плазмиды экстрагировали и секвенировали, получая последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи мышиного моноклонального антитела 18A4 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2).

Полученные последовательности антитела 18A4 подвергали выравниванию. В качестве матриц применяли гены антитела зародышевой линии человека IGHVl-46*03 и IGKV3-20*02, которые демонстрировали самую высокую гомологию, и применяли симуляцию объемной структуры 18A4 и анализ последовательности одобренного лекарственного средства с антителами, в котором в качестве матрица применяли IGHVl-46*03 и IGKV3-20*02, с получением теоретической последовательности антитела, аминокислотной последовательности тяжелой цепи и легкой цепи 18A4Hul. Результаты выравнивания показаны на фигурах 5 и 6. На основе теоретической последовательности синтезировали участок V антитела с применением мультиплексной ПЦР, и синтезированные вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела и вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела встраивали в экспрессирующую плазмиду, основанную на pGmax, для антитела, которое содержит константную область тяжелой цепи IgGl человека и константную область Kappa легкой цепи человека посредством мультиплексной ПЦР. Схема экспрессирующей плазмиды для интактного антитела показана на фиг.7 (последовательность представлена в SEQ ID NO: 7).

Успешно сконструированную экспрессирующую плазмиду для антитела 18A4 Hul использовали для трансфицирования клеток 293T для эукариотической экспрессии. В частности, 2 мг/мл PEI и экспрессирующую плазмиду смешивали в соотношении 3:1 (масс.:масс.) с получением раствора для трансфекции клеток 293T. Через 6 часов клетки культивировали с среде DMEM с 10% сывороткой в течение 12 часов, а затем переносили в свободную от сыворотки среду и культивировали в течение 4 суток. Супернатант снимали для получения антитела.

Полученный супернатант с антителом выделяли и очищали. В частности, супернатант подвергали аффинной хроматографии с применением белка A. Выделенные элюат, содержащий антитело, подвергали диализу для получения чистого антитела 18A4Hul. Концентрацию очищенного антитела определяли посредством абсорбции A280 или посредством окрашивания Кумасси синим. Очищенное антитело подвергали SDS-PAGE электрофорезу для дальнейшей оценки его чистоты (см. фиг.8).

Полученное гуманизированное антитело 18A4Hul подвергали анализу аффинности и сравнивали с мышиным антителом 18A4. В частности, 3 нг/мкл антигена AGR2 наносили на 96-луночные планшеты для ELISA по 100 мкл на лунку и блокировали блокирующим раствором. Антитела 0,1 нг/мкл смешивали в соотношении 1:1 с антигенам различной концентрации и инкубировали при 37°C в течение ночи, где концентрацию антигена устанавливали посредством серийных разведений от 1000 нМ. 100 мкл инкубированной смеси раздельно добавляли в разные планшеты для ELISA и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После промывания планшетов для ELISA добавляли меченные HRP вторичные антитела против белка человека или мыши и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Добавляли по 80 мкл растворов для проявления цвета A и B добавляли, и позволяли цвету проявиться при 37°C в течение 30 минут. Реакцию останавливали посредством добавления 50 мкл останавливающего раствора и определяли оптическую плотность при OD 450. Заполняли таблицу аффинности и рассчитывали значения аффинности антител. График аффинности для мышиного антитела 18A4 и гуманизированного антитела 18A4Hul показаны на фиг.9.

Гуманизированное антитело 18A4Hu подвергали анализу Т-клеточных эпитопов, и индивидуальные аминокислоты замещали для гуманизации с получением различных гуманизированных вариантов (информация для вариантов представлена на фиг.10). Сравнивали способность антигена к связыванию гуманизированных вариантов, выбирая антитела, содержащие меньшее количество эпитопов и имеющие более высокую аффинность, такие как антитело под названием Agtuzumab. См. фиг.11.

Описывали полученное гуманизированное антитело Agtuzumab. Видоспецифичность Agtuzumab анализировали с применением вторичного антитела к белку человека для подтверждения того, что Agtuzumab представляет собой гуманизированное антитело (см. фиг.12). Антигенную специфичность Agtuzumab анализировали с применением вестерн-блоттинга для подтверждения того, что оно может специфически связываться с экспрессированным и очищенным белком AGR2-MBP (см. фиг.13), связываться с AGR2 в лизате экспрессирующих AGR2 клеток MC7 (см. фиг.14), связываться с AGR2 в природном состоянии и детектировать природные AGR2 в супернатанте MCF7 посредством иммунопреципитации (IP) (см. фиг.15).

AGR2 подвергали анализу эпитопов, и мультипотенциальные аминокислотные позиции эпитопа подвергали индивидуальным мутациям (информаци по мутациям представлена на фиг.16). Анализ эпитопов проводили посредством вестерн-блоттинга с применением мутантов AGR2 в качестве антигена и 18A4 и Agtuzumab в качестве первичного антитела. На фиг.17 показано, что 18A4 и гуманизированное антитело Agtuzumab имеют одинаковые эпитопы.

Определяли аффинность Agtuzumab и сравнивали посредством конкурентного ELISA. На фиг.9 показано, что Agtuzumab имеет такую же аффинность к мышиному 18A4, немного выше, чем 18A4Hul. Agtuzumab имеет более высокую аффинность и более низкую потенциальную антигенность.

Посредством анализа метастазирования опухолей показано, что гуманизированное антитело Agtuzumab выполняет биологическую функцию ингибирования метастазирования HepG2, так же, как и 18A4. См. фиг.18.

Пример 5: Эксперименты ингибирования роста опухолевых клеток in vitro

Анализ MTT проводили следующим образом: клеточные линии MCF-7 и T47D пассировали с применением соответствующей среды для культивирования клеток до достижения логарифмической фазы роста (не менее двух пассажей, каждый до достижения 80% слияния), расщепляли раствором трипсин-ЭДТА, устанавливая конечную концентрацию клеток от 5×10³ до 5×10⁴/мл, и высевали в 96-луночные планшеты по 200 мкл на лунку. Каждую лунку анализировали, чтобы установить равномерность распределения клеток. После прикрепления клеток в каждой клетке добавляли среду без антител, с 20 мкг/мл антитела по изобретению или с 20 мкг/мл контрольного антитела IgG, соответственно. Через 48 часов в каждую лунку добавляли 20 мкл 5 мг/мл MTT раствора. После инкубирования в течение 4 часов удаляли исходный раствор из всех лунок 96-луночныех планшетов и в каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO для растворения преципитатов формазана. После отстаивания при комнатной температуре в течение 0,5 часа планшеты встряхивали на качающейся платформе в течение 10 минут. Определяли оптическую плотность каждой лунки при 490 нм с применением планшета-ридера ELISA.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело ингибирует рост клеток T47D и клеток MCF-7 in vitro. См. фигуру 19. Концентрации антитела по изобретению и контрольного антитела IgG составляли 20 мкг/мл.

Пример 6: Эксперименты ингибирования миграции опухолевых клеток in vitro

Эксперименты по заживлению ран проводили следующим образом: клетки рака молочной железы T47D, клетки злокачественной опухоли яичника SKOV3, клетки остеосаркомы U20S и мышиные фибробласты 3T3 помещали в 6-луночные планшеты (клетки были слитыми на 70%). После слияния центральные клетки соскабливали с применением узкого скребка для клеток и дважды промывали 1×PBS для удаления клеток. Планшеты фотографировали и маркировали. Добавляли среду, содержащую 20 мкг/мл антитела по изобретению или 20 мкг/мл контрольного антитела IgG. Запускали таймер и делали фотографии через 24 и 48 часов (нужно отметить, что следует делать фотографии маркированной области).

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело ингибирует миграцию клеток T47D, SKOV3 и 3T3 in vitro. См. фиг.20. Концентрации антитела по изобретению и контрольного антитела IgG составляли 20 мкг/мл.

Пример 7: Эксперименты ингибирования метастазирования опухолевых клеток in vitro

Эксперименты с применением камеры системы трансвелл проводили на 6 группах: 1: контроль, 2: MBP (25 мкг/мл), 3: слитый белок AGR2-MBP (25 мкг/мл), 4: AGR2-MBP (25 мкг/мл) + IgG (25 мкг/мл), 5: AGR2-MBP (25 мкг/мл) + 18A4 (25 мкг/мл), 6: 18A4 (25 мкг/мл).

Все среды в камерах системы трансвелл представляли собой среду RPMI-1640 + 1%FBS.

В ходе эксперимента сначала добавляли среду в наружные лунки. Клетки HepG2 и SKOV3 расщепляли трипсином, подсчитывали и удаляли супернатант посредством центрифугирования. Концентрацию клеток устанавливали на 5×10⁵ /мл с применением среды RPMI-1640, содержащей 1% FBS. В каждую камеру добавляли 200 мкл указанных клеток и культивировали в клеточном инкубаторе (5% CO₂, 37°C). Запускали таймер и через 24 часа и 48 часов вынимали камеру и соскребали клетки во внутренней камере. Камеру помещали в раствор метанола и фиксировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Окрашивание проводили с применением кристаллического фиолетового в течение 15 минут. Обесцвечивание проводили с применением этанола в течение 15 минут. Затем камеру помещали в PBS и фотографировали для подсчета количества клеток, проникнувших через мембрану.

Результаты указывали на то, что антитело по изобретению ингибирует метастазирование клеток рака печени HepG2 и SKOV3 in vitro. См. фиг.21.

Пример 8: Эксперименты ингибирования клеточного цикла опухолевых клеток in vitro

Анализ клеточного цикла с применением цитометрии проводили следующим образом: клеточную линию T47D пассировали с применением соответствующей среды для культивирования клеток до достижения логарифмической фазы роста (не менее двух пассажей, каждый до достижения 80% слияния), расщепляли с применением раствора трипсин-ЭДТА и помещали в 6-луночные планшеты. После прикрепления клеток среду меняли на среду, содержащую 20 мкг/мл антитела по изобретению или 20 мкг/мл контрольного антитела IgG. Клетки расщепляли с применением 1×трипсина через 6, 12, 24 и 48 часов после добавления антитела. Клетки разделяли на отдельные клетки посредством добавления 10 мл среды и помещали в 15 мл пробирки для центрифугирования. Клетки собирали посредством центрифугирования при 200×g в течение 5 минут. Супернатант удаляли и дважды промывали с применением 5 мл 1×PBS. После удаления супернатанта клетки тщательно суспендировали с применением 1 мл предварительно охлажденного 1×PBS и капельно добавляли в предварительно охлажденный 9 мл 70% этанол, тщательно перемешивали с инкубировали на льду в течение 1 часа. Клетки собирали посредством центрифугирования при 200×g в течение 5 минут, удаляли супернатант и промывали в течение 3-4 часов посредством добавления 15 мл 1×PBS на льду. Клетки собирали посредством центрифугирования при 200×g в течение 5 минут, удаляли супернатант, добавляли 500 мкл PI красящего буфера и переносили в 1,5 мл пробирки для центрифугирования. Пробирки заворачивали в алюминиевую фольгу, инкубировали при 37°C в течение 30 минут и переносили на цитометр для анализа клеточного цикла.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело ингибирует рост клеток рака молочной железы T47D и MCF7 in vitro посредством удлинения фазы G1/G0 и сокращения фазы S и G2/M клеточного цикла (фиг.22).

Пример 9: Определение последовательности вариабельной области моноклонального антитела

Последовательность антигенсвязывающего участка гена блокирующего моноклонального антитела определяли следующим образом: РНК экстрагировали из гибридомных клеток. VL и VH амплифицировали посредством ПЦР и определяли их последовательность согласно Marks et al. (Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222: 589-597, 1991). Праймеры, применяемые в эксперименте, представляли собой 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’ для легкой цепи и 5’-CCACAATCCCTGGGCACAA-3’ для тяжелой цепи, оба применяли в качестве обратных праймеров.

Пример 10: Определение последовательности моноклонального антитела, соответствующей эпитопам

Определяли аминокислотную последовательность моноклонального антитела, соответствующую эпитопам антигена AGR2 (см. фиг.23). Определение проводили следующим образом: РНК экстрагировали из клеток MCF. мРНК AGR2 получали посредством ПЦР и обратной транскрипции с получением кДНК. Конструировали эукариотическую экспрессирующую плазмиду pcDNA3-AGR2-His и подвергали AGR2 мутациям посредством делеции. Прямой праймер для мутации представлял собой 5’-GTTGCTTGTCTTGGATTTATATAGA-3’, а обратный праймер представлял собой 5’-GCTGAAAATAAAGAAATCCAGAAAT-3’. Такая мутация приводит к делеции эпитопа PLMIIHHLDECPHSQALKKVFA. Посредством вестерн-блоттинга показано, что блокирующее моноклональное антитело больше не связывается с мутированным белком AGR2, что позволило определить аминокислотную последовательность антитела, которое связывается с эпитопом AGR2. Затем AGR2 подвергали точечной мутации. Прямой праймер для мутация представлял собой 5’-ATGAATAATCATCAAGGGTTTGTTGC-3’, а обратный праймер представлял собой 5’-CACTTGGATGAGTGCCCACACA-3’, где "C" в активном центре PDI "CXXS" заменяли на "S". Связывание моноклонального антитела с этим мутированным белком значительно ухудшалось. Показано, что моноклональное антитело специфически связывается с эпитопом "PLMOHHLDECPHS QALKKVFA" и может ингибировать активность PDI. См. фиг.24 и 25.

Пример 11: Эксперименты по изучению антител на животных in vivo

Клетки SKOV3 в фазе логарифмического роста суспендировали в PBS и вводили подкожно (2×10⁶ на животное) 6-недельным самкам BALB/c голых мышей (от 180 до 220 г). Мышей, которым вводили клетки, случайным образом разделяли на две группы (8 мышей на группу): группа PBS и группа 18A4. Через 4 суток после введения клеток начинали интраперитонеальное введение с применением 8 мг/кг 18A4 [1,2] и тем же объемом PBS в качестве контроля. Введение проводили два раза в неделю и сопровождали оценкой размера опухолей. Эксперимент завершали через 14 недель лечения лекарственным средством. Объем опухоли рассчитывали с применением следующей формулы со ссылкой на публикации Герцептин и Авастин [3-5]: (L×W2)/2.

Результаты указывают на то, что моноклональное антитело ингибирует рост опухоли in vivo. См. фиг.26.

Ссылки:

1. van der Bij, G.J., et al., Experimentally induced liver metastases from colorectal cancer can be prevented by mononuclear phagocyte-mediated monoclonal antibody therapy. J Hepatol. 53(4): p. 677-85.

2. Bhuvaneswari, R., et al., Targeting EGFR with photodynamic therapy in combination with Erbitux enhances in vivo bladder tumor response. Mol Cancer, 2009. 8: p. 94.

3. Khalili, R, et al., Effect of Herceptin on the development and progression of skeletal metastases in a xenograft model of hum’an breast cancer. Oncogene, 2005. 24(44): p. 6657-66.

4. Jerome, L., et al., Recombinant human insulin-like growth factor binding protein 3 inhibits growth of human epidermal growth factor receptor-2-overexpressing breast tumors and potentiates herceptin activity in vivo. Cancer Res, 2006. 66(14): p. 7245-52.

5. Guan, H., et al., Herceptin down-regulates HER-2/neu and vascular endothelial growth factor expression and enhances taxol-induced cytotoxicity of human Ewing’s sarcoma cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2005. 11(5): p. 2008-17.

Claims (23)

1. Гуманизированное антитело, специфически связывающееся с белком AGR2, или фрагмент этого антитела, где:

- указанное антитело или фрагмент связывается с эпитопом, расположенным в SEQ ID NO: 15;

- аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или фрагмента, представленная в SEQ ID NO: 4, модифицирована четырьмя заменами в положениях 65, 67, 68 и 70;

- аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или фрагмента представлена в SEQ ID NO: 3; где указанные замены характеризуются тем, что лизин (К) в положении 65 заменен на глутамин (Q), лизин (К) в положении 67 заменен на аргинин (R), аланин (А) в положении 68 заменен на валин (V) и лейцин (L) в положении 70 заменен на метионин (М), и где номер положения соответствуют номенклатуре Kabat.

2. Антитело или его фрагмент по п. 1, где указанный эпитоп находится в домене с протеин-дисульфидизомеразной активностью AGR2.

3. Антитело или его фрагмент по п. 1, где активный домен AGR2, с которым связывается антитело, представлен в SEQ ID NO: 12.

4. Антитело или его фрагмент по п. 1, содержащее по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности CDR1 тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 8, аминокислотной последовательности CDR2 тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 9, аминокислотной последовательности CDR3 тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 10, аминокислотной последовательности CDR1 легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 11, аминокислотной последовательности CDR2 легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 12, и аминокислотной последовательности CDR3 легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 13.

5. Антитело или его фрагмент по п. 4, содержащее аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, представленную в DYNMD (SEQ ID NO: 8), аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, представленную в DINPNYDTTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 9), аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SMMGYGSPMDY (SEQ ID NO: 10), аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи, представленную в RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO: 11), аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, представленную в LASNLES (SEQ ID NO: 12), и аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в QHIRELPRT (SEQ ID NO: 13).

6. Антитело или его фрагмент по п. 5, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 2, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 1.

7. Антитело или его фрагмент по п. 5, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 4, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 3.

8. Антитело или его фрагмент по п. 1, которое представляет собой гуманизированное интактное антитело IgG1.

9. Антитело или его фрагмент по п. 1, где фрагмент представляет собой фрагмент Fab, Fab', F(ab')2 или Fv, или антитело представляет собой линейное антитело или одноцепочечное антитело.

10. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, содержащая антитело по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 1-9.

12. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 11.

13. Клетка-хозяин для получения антитела, содержащая вектор по п. 12.

14. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 13 для экспрессии нуклеиновой кислоты и получения антитела.

15. Способ по п. 14, далее включающий получение антитела из культуры клетки-хозяина.

16. Способ применения антитела или его фрагмента по любому из пп. 1-9 для лечения заболевания, связанного с патологическим ангиогенезом у млекопитающего, включающий этап введения антитела млекопитающему.

17. Способ по п. 16, где заболевание представляет собой злокачественную опухоль.

18. Способ по п. 17, где злокачественная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичников, остеосаркомы, рака печени, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, колоректального рака, немелкоклеточного рака легких, злокачественной опухоли почки, рака головы и шеи, меланомы и множественной миеломы.

19. Способ по п. 18, где лечение включает этап одновременного или последовательного введения второго терапевтического средства с антителом.

20. Способ по п. 19, где второе терапевтическое средство выбрано из антиангиогенного средства, химиотерапевтического средства и цитотоксического средства.

Images