RU2686490C1 - Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations - Google Patents
Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2686490C1 RU2686490C1 RU2018120404A RU2018120404A RU2686490C1 RU 2686490 C1 RU2686490 C1 RU 2686490C1 RU 2018120404 A RU2018120404 A RU 2018120404A RU 2018120404 A RU2018120404 A RU 2018120404A RU 2686490 C1 RU2686490 C1 RU 2686490C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- antigens
- conjugate
- substrate
- analysis
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 title abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 claims description 5
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 5
- ZVNPWFOVUDMGRP-UHFFFAOYSA-N 4-methylaminophenol sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.CNC1=CC=C(O)C=C1.CNC1=CC=C(O)C=C1 ZVNPWFOVUDMGRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000008279 sol Substances 0.000 claims description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 46
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 12
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 12
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 12
- 108010027044 HIV Core Protein p24 Proteins 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 7
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 3
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 101710144117 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N Lysergic acid diethylamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 description 1
- 229910052946 acanthite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- XUARKZBEFFVFRG-UHFFFAOYSA-N silver sulfide Chemical compound [S-2].[Ag+].[Ag+] XUARKZBEFFVFRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940056910 silver sulfide Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к наборам для иммунохимического анализа и направлено на усовершенствование тест-систем для выявления специфических маркеров инфекционных заболеваний в препаратах крови, в частности маркеров гемотрансмиссивных инфекций (ГТИ): гепатитов В и С, сифилиса и инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и может быть использовано в медицинской диагностике. В России приняты и реализуются национальные программы по борьбе с этими заболеваниями, в которых одним из наиболее важных мероприятий является систематическое обследование доноров и населения из групп риска на наличие следующих маркеров: поверхностного белка (антигена) вируса гепатита В (HBsAg); раннего белка (антигена) р24 и антител к белкам gp41, gp120 и gp36 ВИЧ; антител к белкам Core, NS3, NS4 и NS5 вируса гепатита С (ВГС); а также суммарных антител к белкам возбудителя сифилиса {Treponema pallidum). В настоящее время такое обследование проводится с использованием моноспецифических (определяющих один маркер) тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА) и требует выполнения ряда тестов, что предполагает одновременное наличие всех необходимых тест-наборов и немалые затраты времени и средств.The invention relates to sets for immunochemical analysis and is aimed at improving test systems for identifying specific markers of infectious diseases in blood products, in particular markers of blood-transmissible infections (GTI): hepatitis B and C, syphilis and human immunodeficiency virus (HIV) infection and can be used in medical diagnostics. Russia has adopted and implemented national programs to combat these diseases, in which one of the most important activities is systematic screening of donors and populations at risk for the presence of the following markers: the surface protein (antigen) of the hepatitis B virus (HBsAg); the early protein (antigen) p24 and antibodies to HIV gp41, gp120 and gp36 proteins; antibodies to the Core, NS3, NS4 and NS5 proteins of the hepatitis C virus (HCV); as well as total antibodies to the proteins of the causative agent of syphilis {Treponema pallidum). Currently, such a survey is carried out using monospecific (defining one marker) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test systems and requires a series of tests, which implies the simultaneous presence of all the necessary test kits and considerable time and cost.
Известны наборы ИФА для определения суммарных антител к 4 инфекциям [1, 2]. В наборах используют смесь конъюгатов 4 антигенов с пероксидазой, выявляя антитела ко всем 4 инфекциям в одной лунке.Known ELISA kits for the determination of total antibodies to 4 infections [1, 2]. The kits use a mixture of conjugates of 4 antigens with peroxidase, detecting antibodies to all 4 infections in one well.
Недостатком этих наборов является невозможность дифференцированного выявления отдельных возбудителей.The disadvantage of these sets is the impossibility of differentiated detection of individual pathogens.
Известен также набор "Orgenics immunocomb HIV 1+2 bi-spot" фирмы «Orgenics» (Франция) для определения антител на непористых носителях [3]. Этот набор позволяет проводить одновременно выявление антител к вирусам имунодефицита человека 1 и 2 типов (HIV 1+2) в одном из вариантов дот-иммуноанализа на поверхности непористого носителя. Его рабочий элемент (твердая фаза) представлен в виде плоской пластиковой гребенки, на каждом зубце которой нанесены в виде отдельных пятен антигены HIV 1 и 2, а также человеческие иммуноглобулины - контроль для проверки работы конъюгата. Набор содержит все рабочие растворы, готовые к применению. При положительном результате анализа в месте нанесения антигена образуются визуально определяемые синие пятна. Эту тест-систему можно рассматривать как набор для дифференциального, мультиплексного анализа, но только на две близкородственные инфекции.Also known is the "Orgenics immunocomb HIV 1 + 2 bi-spot" kit from Orgenics (France) for the detection of antibodies on non-porous carriers [3]. This kit allows you to simultaneously detect antibodies to
Известен набор, описанный в патенте США №5486452 [4], где антигены или иммуноглобулины или оба из них связаны прямым применением в любой подходящей геометрии, например, как анализ точек или линий. Такие пористые носители подходят для осуществления неограниченного количества реакций антитело-антиген одновременно и за одну операцию. В состав набора входит устройство для иммунологического анализа, представляющее собой пористую подложку, содержащую множественные ограниченные области адсорбированных на ее поверхности различных антигенов, представленные в виде точек, микроточек или линий, расположенных в определенном геометрическом порядке, и полученные путем нанесения аликвот антигенов на подложку дозирующими устройствами. Свободные от антигенов участки подложки блокированы неспецифическим белком. Набор содержит также реактивы индикаторной системы, позволяющей выявлять комплексы антиген-антитело.The set described in US patent 5,456,452 [4] is known, where antigens or immunoglobulins or both of them are linked by direct application in any suitable geometry, for example, as an analysis of points or lines. Such porous carriers are suitable for performing an unlimited number of antibody-antigen reactions simultaneously and in one operation. The kit includes a device for immunological analysis, which is a porous substrate containing multiple limited regions of various antigens adsorbed on its surface, represented as points, microdots or lines arranged in a certain geometric order, and obtained by applying aliquots of antigens on the substrate with dosing devices . Substrate free from antigens are blocked by a nonspecific protein. The kit also contains reagents of the indicator system, which allows to detect antigen-antibody complexes.
Приведенный выше набор имеет следующие недостатки. В качестве плотной подложки устройства используется пористая матрица, предпочтительно из нитроцеллюлозы, с толщиной листа, предпочтительно, 0,1 мм. Такие матрицы отличаются хрупкостью и малой механической прочностью, что значительно затрудняет их рутинное использование.The above kit has the following disadvantages. As a dense substrate of the device, a porous matrix is used, preferably of nitrocellulose, with a sheet thickness of preferably 0.1 mm. Such matrices are fragile and have low mechanical strength, which makes their routine use much more difficult.
Другим недостатком таких подложек является сложность удаления не связавшихся компонентов реакции из мелких пор матрицы (длительная, многократная отмывка с активацией), что значительно усложняет методику и повышает вероятность фоновых явлений.Another disadvantage of such substrates is the difficulty of removing unbonded reaction components from the fine pores of the matrix (prolonged, repeated washing with activation), which greatly complicates the procedure and increases the likelihood of background phenomena.
С целью миниатюризации описанного устройства, зоны адсорбции антигенов представлены в виде пятен диаметром менее 2 мм или линиями с шириной менее 2 мм (получаемые нанесением аликвот антигенов в объеме менее 1 мкл), что предполагает использование специальных считывающих устройств, и не позволят проводить достоверный прямой визуальный учет результатов анализа.In order to miniaturize the described device, the antigen adsorption zones are presented as spots with a diameter of less than 2 mm or lines with a width of less than 2 mm (obtained by applying aliquots of antigens in a volume of less than 1 μl), which involves the use of special reading devices, and will not allow reliable direct visual accounting analysis results.
В качестве детекторной системы используются антитела или белок комплемента, конъюгированные с изотопной, флюоресцентной или ферментной (пероксидазой хрена) меткой. Работа с изотопами требует обеспечения специальных условий безопасности и не может широко использоваться в рутинных анализах. Использование флюоресцентных меток требует специального оборудования для инструментального учета результатов анализа. Для анализов с применением в качестве метки пероксидазы хрена в сочетании с субстратами, дающими нерастворимые продукты (4-хлоро-1-нафтол или 3,3-диаминобензидин) характерна относительно невысокая чувствительность, примерно на порядок уступающая чувствительности планшетного варианта иммунопероксидазного теста с использованием субстратов, дающих растворимые окрашенные продукты [5].As a detector system, antibodies or complement protein conjugated with an isotopic, fluorescent or enzyme (horseradish peroxidase) label are used. Work with isotopes requires the provision of special safety conditions and cannot be widely used in routine analyzes. The use of fluorescent labels requires special equipment for instrumental recording of analysis results. Analyzes using horseradish peroxidase as a label in combination with substrates producing insoluble products (4-chloro-1-naphthol or 3,3-diaminobenzidine) are characterized by relatively low sensitivity, which is approximately an order of magnitude lower than that of the tablet variant of an immunoperoxidase test using substrates, giving soluble dyed products [5].
Известен способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах, описанный в патенте РФ №2296995 [6]. Сущность такого выявления заключается в специфической иммобилизации антигенов исследуемого образца набором известных антител (первичных иммунореагентов), в определенном порядке дискретно зафиксированных на плотной подложке аналитического устройства. Иммобилизованные антигены обрабатываются смесью антител, специфичных ко всему спектру анализируемых антигенов, (вторичный иммунореагент), в результате чего образуется тройной комплекс: первичный иммунореагент - антиген - вторичный иммунореагент. Образовавшиеся комплексы затем обнаруживаются с помощью конъюгата - антител, специфичных к вторичному иммунореагенту и связанных с легко выявляемой меткой.The known method of multi-immunochemical detection of antigens in liquid samples, described in the patent of the Russian Federation No. 2296995 [6]. The essence of such detection consists in the specific immobilization of the antigens of the sample under study by a set of known antibodies (primary immunoreagents), in a certain order discretely fixed on a dense substrate of the analytical device. Immobilized antigens are treated with a mixture of antibodies specific to the entire spectrum of the antigens being analyzed (secondary immunoreagent), as a result of which a triple complex is formed: primary immunoreagent - antigen - secondary immunoreagent. The resulting complexes are then detected using a conjugate — antibodies specific for the secondary immunoreagent and associated with an easily detectable label.
Недостатками такого подхода являются подбор первичных и вторичных иммунореагентов не только по специфичности, но и по виду животного, в которых они были наработаны, а также многостадийность и длительность процедуры анализа.The disadvantages of this approach are the selection of primary and secondary immunoreagents not only by specificity, but also by the type of animal in which they were accumulated, as well as the multistage and duration of the analysis procedure.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является набор для многопрофильного иммунологического анализа антител в препаратах крови, описанный в патенте РФ №2495434 [7], в состав которого входит подложка с набором дискретно нанесенных на ее поверхность антигенами возбудителей инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами, а также емкость для проведения анализа. Подложка представляет собой пластину с зубцами в виде гребня, на поверхности каждого зубца (иммуночипа) которой расположены дискретно нанесенные антигены возбудителей вирусных инфекций и контроль (иммуноглобулины человека) для контроля качества антивидового конъюгата и проявляющей системы. В качестве отрицательного контроля один из сегментов зубца подложки оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений. Зона нанесения антигенов и контролей на каждом иммуночипе очерчена контрастной рамкой для позиционирования при инструментальном учете результатов анализа. Емкость для проведения анализа выполнена в виде многоячеистой аналитической ванны с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку. Ванна заполнена готовыми рабочими растворами: для отмывок и разведения образца, конъюгата и системы проявления. Ячейки ванны герметизированы.The closest technical solution (prototype) is a kit for multi-immunological analysis of antibodies in blood products, described in the RF patent №2495434 [7], which includes a substrate with a set of infective pathogens discretely deposited on its surface with antigens and additionally blocked by non-specific natural or synthetic polymers, as well as capacity for analysis. The substrate is a plate with teeth in the form of a comb, on the surface of each tooth (immunochip) of which there are discretely applied antigens of viral infection pathogens and controls (human immunoglobulins) to control the quality of the anti-virus conjugate and the developing system. As a negative control, one of the tine segments of the substrate is left free of specific proteins for the assessment of background phenomena. The area of application of antigens and controls on each immunochip is outlined with a contrasting frame for positioning with instrumental record of analysis results. The capacity for analysis is made in the form of a multicellular analytical bath with the possibility of introducing each tooth of the substrate into a separate cell. The bath is filled with ready-made working solutions: for washing and diluting the sample, conjugate and development system. Bath cells are sealed.
В качестве антигенов возбудителей вирусных инфекций в наборе используют антигены возбудителей вакциноуправляемых инфекций: краснухи, эпидемического паротита, кори и полиомиелита или их рекомбинантные или синтетические аналоги.As antigens of pathogens of viral infections in the set use antigens of pathogens of vaccine-controlled infections: rubella, mumps, measles and polio, or their recombinant or synthetic analogues.
В качестве конъюгата используют вторичные иммунореагенты: антитела к иммуноглобулинам человека, или стафилококковый белок А, связанный со щелочной фосфатазой, (например, Protein A, Alkaline Phosphatase Conjugate фирмы «Мегск», кат. №539251), а в качестве проявляющей системы - субстрат для выявления щелочной фосфатазы (предпочтительно, BCIP/NBT Liquid Substrate System фирмы «SIGMA-ALDRICH» кат. №В1911). В альтернативном варианте конъюгата используют вторичные иммунореагенты (антитела к иммуноглобулинам человека или стафилококковый белок А), связанные с каталитически активными золями золота, а в качестве проявляющей системы - раствор "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - азотнокислого серебра; 0,5% - лимонной кислоты, бидистиллированную воду - остальное до 100%. Частным примером прототипа является описаный в статье A. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144) [8] набор для выявления антител к возбудителям гемотрансмиссвных инфекционных заболеваний. На иммуночипах этого набора нанесены антигены 6 возбудителей ГТИ: ВИЧ, ВГС, ВГВ, сифилиса, цитомегаловирусной инфекции и токсоплазмоза, а также контроль работоспособности системы детекции - IgG из крови человека; в качестве конъюгата используются антитела против IgG человека, связанные с наночастицами золота.Secondary immunoreagents are used as a conjugate: antibodies to human immunoglobulins, or staphylococcal protein A associated with alkaline phosphatase (for example, Protein A, Alkaline Phosphatase Conjugate of Megsk, cat. No. 5339251), and as a developing system is a substrate for Alkaline phosphatase detection (preferably, BCIP / NBT Liquid Substrate System by SIGMA-ALDRICH Cat. No. B1911). Alternatively, the conjugate uses secondary immunoreagents (antibodies to human immunoglobulins or staphylococcal protein A), associated with catalytically active gold sols, and as a developing system, a solution of "physical developer", comprising: 0.2% - metol; 0.2% silver nitrate; 0.5% - citric acid, bidistilled water - the rest is up to 100%. A particular example of the prototype is described in the article A. Poltavchenko et all. "A Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Hematobotransferential Infections". OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844 / ojbsci.2016.137.144) [8] a kit for detecting antibodies to pathogens of hemato-transmissible infectious diseases. The immunochips of this kit contain antigens of 6 GTI pathogens: HIV, HCV, HBV, syphilis, cytomegalovirus infection and toxoplasmosis, as well as monitoring the performance of the detection system - IgG from human blood; Anti-human IgG antibodies bound to gold nanoparticles are used as conjugates.
Описанные выше наборы-аналоги, в том числе прототип, автономны (содержат все необходимые для анализа компоненты и не нуждается в энергообеспечении), но позволяют выявлять только спектры антител.The sets of analogues described above, including the prototype, are autonomous (they contain all the components necessary for the analysis and do not need energy supply), but they allow only the spectra of antibodies to be detected.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение информативности мультиплексного анализа и обеспечение диагностики ранних стадий инфекции за счет одновременного выявления в образцах интересующих спектров, как антител, так и антигенов.The technical result of the claimed invention is to increase the information content of multiplex analysis and the provision of diagnostics of the early stages of infection by simultaneously detecting in the samples of interest spectra, both antibodies and antigens.
Указанный технический результат достигается тем, что в наборе для мультиплексного иммунохимического анализа антител и антигенов в препаратах крови, включающем устройство в виде гребенчатой подложки - иммуночипа с набором дискретно нанесенных на поверхности зубцов подложки реагентов захвата маркеров инфекционных заболеваний и дополнительно блокированной неспецифическими природными или синтетическими полимерами; емкость для проведения анализа, содержащая несколько рядов изолированных ячеек, выполненных с возможностью введения каждого зубца подложки в отдельную ячейку ванны; растворы для разведения образца и отмывок; конъюгат для детекции; встроенные положительный контроль для контроля качества конъюгата и отрицательный контроль для оценки фоновых явлений и проявитель иммуночипа, согласно изобретению, набор нанесенных на подложку-иммуночип реагентов захвата содержит антигены и антитела к маркерам одного или нескольких возбудителей инфекционных заболеваний; иммобилизованные на каждом зубце подложки антигены представлены отдельными натуральными, или синтетическими, или рекомбинантными белками, или комбинацией белков или химерными антигенами, содержащими наборы эпитопов антигенов соответствующих белков возбудителей инфекций. Антитела захвата представлены аффинно очищенными иммуноглобулинами из поликлональных сывороток или моноклональными антителами, не конкурирующими за сайты связывания эпитопов антигенов с детекторными антителами и не реагирующими с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате. Конъюгат для детекции содержит многокомпонентный состав, включающий несколько видов детекторных антител к иммуноглобулинам человека (a/Hum IgG) и к выявляемым антигенам, связанных с каталитически активными золями золота. Положительные контроли предусматривают оценку работоспособности всех специфических компонентов конъюгата. Они расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают: зоны для контроля работоспособности антивидовых детекторных антител, зоны для контроля специфических детекторных антител к каждому выявляемому антигену и зону отрицательного контроля, свободную от специфических белков. Проявляющая система набора включает сухой таблетированный, а также жидкий компоненты и снабжена усилителем и стабилизатором окраски проявленных иммуночипов.This technical result is achieved in that in a kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood products, including a device in the form of a comb substrate - an immunochip with a set of discretely deposited markers of infectious diseases on the substrate surface and additionally blocked by nonspecific natural or synthetic polymers; capacity for analysis, containing several rows of isolated cells, made with the possibility of introducing each tooth of the substrate in a separate cell of the bath; solutions for sample dilution and washing; conjugate for detection; built-in positive control for controlling the quality of the conjugate and negative control for evaluating the background phenomena and the immunochip developer according to the invention, the kit coated on the substrate — the immunochip capture reagents contain antigens and antibodies to markers of one or more infectious disease pathogens; The antigens immobilized on each tooth of the substrate are represented by individual natural, or synthetic, or recombinant proteins, or by a combination of proteins or chimeric antigens containing sets of epitopes of antigens of the corresponding proteins of infectious agents. Antibody capture is represented by affinity purified immunoglobulins from polyclonal sera or monoclonal antibodies that do not compete for the binding sites of epitopes of antigens to detector antibodies and are not reactive with anti-species immunoglobulins in the conjugate. The conjugate for detection contains a multicomponent composition that includes several types of detector antibodies to human immunoglobulins (a / Hum IgG) and to detectable antigens associated with catalytically active gold sols. Positive controls provide an assessment of the performance of all specific components of the conjugate. They are located on separate segments of the immunochip and include: zones for monitoring the operability of anti-virus detector antibodies, zones for controlling specific detector antibodies to each detectable antigen, and a zone of negative control free of specific proteins. The developing set system includes dry tableted as well as liquid components and is equipped with an enhancer and color stabilizer for developed immunochips.
Конъюгат представлен смесью золей золота связанных с отдельными видами детекторных антител или золем золота связанным одновременно с несколькими детекторными антителами. Последний вариант предпочтительней, поскольку обеспечивает больший срок хранения разведенного (готового к применению) конъюгата.The conjugate is represented by a mixture of gold sols associated with individual types of detector antibodies or a gold sol associated simultaneously with several detector antibodies. The latter option is preferable because it provides a longer shelf life of the diluted (ready-to-use) conjugate.
Сухой таблетированный компонент проявителя содержит смесь лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 соответственно, а жидкий компонент представлен раствором, содержащим 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде.The dry tableted component of the developer contains a mixture of citric acid and metol in a ratio of 5: 2, respectively, and the liquid component is represented by a solution containing 0.4% silver nitrate in bidistilled water.
Усилитель и стабилизатор окраски проявленных иммуночипов представлен раствором, содержащим 1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в дистиллированной воде.The enhancer and color stabilizer of developed immunochips are represented by a solution containing 1% thiourea and 1% sodium hydroxide in distilled water.
В отличие от прототипа позиционирование иммуночипа при инструментальном учете результатов анализа осуществляется путем сканирования его на фоне листа темной бумаги, что позволяет избежать дополнительных операций и устройств для нанесения на иммуночип контрастной рамки.In contrast to the prototype, the positioning of the immunochip with the instrumental recording of the analysis results is carried out by scanning it against the background of a sheet of dark paper, which allows to avoid additional operations and devices for applying a contrast frame to the immunochip.
Для иллюстрации изобретения приведены графические фигуры.To illustrate the invention, graphic figures are shown.
На фиг. 1 приведены основные элементы набора для комплексного первичного тестирования препаратов крови на наличие антител к возбудителям ГТИ (см. пример 1) и схема размещения на иммуночипе тестовых и контрольных зон (реагентов захвата):FIG. 1 shows the main elements of a set for comprehensive primary testing of blood products for the presence of antibodies to GTI causative agents (see Example 1) and the layout of the test and control zones (capture reagents) on the immune chip:
К- - зона контроля фоновых явлений (без реагентов захвата);K- - control zone of the background phenomena (without capture reagents);
К1 - зона контроля работоспособности антивидовых детекторных антител (IgG человека);K1 - zone control the health of anti-detector antibodies (human IgG);
К2 - зона контроля работоспособности детекторных антител к HBsAg (HBsAg);K2 - control area of the detector antibodies to HBsAg (HBsAg);
К3 - зона контроля работоспособности детекторных антител к раннему белку р24 ВИЧ (антиген р24 ВИЧ);K3 - control area of the detector antibodies for early HIV p24 protein (HIV p24 antigen);
Т1 - зона теста на антитела к ВИЧ (комбинация антигенов gp41, gpl20 и gp36 ВИЧ);T1 - zone of the test for antibodies to HIV (a combination of antigens gp41, gpl20 and gp36 HIV);
Т2 - зона теста на антитела к ВГС (комбинация антигенов Core, NS3, NS4 и NS5 ВГС);T2 - area of the test for antibodies to HCV (a combination of antigens Core, NS3, NS4 and NS5 HCV);
Т3 - зона теста на антитела к Т. pallidum (комбинация антигенов р17, ТтрА и р47 Т. pallidum);T3 - zone of the test for antibodies to T. pallidum (combination of antigens p17, TprA and p47 T. pallidum);
Т4 - зона теста на HBsAg (антитела к HBsAg);T4 - zone test for HBsAg (antibodies to HBsAg);
Т5 - зона теста на ранний белок р24 ВИЧ (антитела к белку р24 ВИЧ)T5 - zone of the HIV early p24 protein test (antibodies to HIV p24 protein)
На фиг. 2 приведен пример результатов мультиплексного анализа сыворотки крови на маркеры гемотрансмиссивных инфекций, полученных с использованием предлагаемого набора (цифрами на иммуночипах обозначены номера образцов, соответствующих образцам, приведенным в таблице).FIG. 2 shows an example of the results of multiplex analysis of blood serum for markers of blood-transmissible infections, obtained using the proposed set (numbers on the immunochips indicate the numbers of samples corresponding to the samples given in the table).
На фиг. 3 приведена схема размещения на иммуночипе для дифференцированного выявления маркеров ВИЧ (см. пример 2) тестовых и контрольных зон (реагентов захвата):FIG. 3 shows the layout on the immunochip for differentiated detection of HIV markers (see Example 2) of test and control zones (capture reagents):
Т1 - зона теста на суммарные антитела к ВИЧ 1 и 2 (химерный белок, содержащий эпитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2)T1 - zone test for total antibodies to
Т2 - зона теста на антитела к ВИЧ 1 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp41 ВИЧ 1);T2 - area of the test for antibodies to HIV 1 (recombinant protein containing etitope of
Т3 - зона теста на антитела к ВИЧ 1 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gpl20 ВИЧ 1);T3 - zone test for antibodies to HIV 1 (recombinant protein containing etitope antigen gpl20 HIV 1);
Т4 - зона теста на антитела к ВИЧ 2 (рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp36 ВИЧ 2);T4 - zone test for antibodies to HIV 2 (recombinant protein containing etitope antigen gp36 HIV 2);
Т5 - зона теста на ранний белок р24 ВИЧ (антитела к белку р24 ВИЧ);T5 - zone of the HIV early p24 protein test (antibodies to HIV p24 protein);
К- - зона контроля фоновых явлений (без реагентов захвата);K- - control zone of the background phenomena (without capture reagents);
К1 - зона контроля работоспособности антивидовых детекторных антител (IgG человека);K1 - zone control the health of anti-detector antibodies (human IgG);
К2 - зона контроля работоспособности детекторных антител к раннему белку р24 ВИЧ (антиген р24 ВИЧ);K2 - control zone of the detector antibodies for early HIV p24 protein (HIV p24 antigen);
На фиг. 4 приведен пример результатов мультиплексного анализа сыворотки крови на отдельные маркеры ВИЧ (см. пример 2): 1 - отрицательный результат; 2 - результат, положительный по раннему белку р24 ВИЧ; 3 и 4 - результат, положительный по антителам к ВИЧ 1; 5 - результат, положительный по антителам к ВИЧ 2.FIG. 4 shows an example of the results of the multiplex analysis of serum for individual HIV markers (see example 2): 1 - negative result; 2 - the result is positive for the early protein p24 HIV; 3 and 4 - the result is positive for antibodies to
Предлагаемый набор включает следующие основные элементы:The proposed set includes the following main elements:
- плоскую подложку 1 для иммунологического анализа, выполненную в виде гребня, каждый зубец (иммуночип) 2 которого на своей поверхности содержит набор зон с нанесенными в виде пятен 3 реагентами захвата и положительными контролями и является аналитическим устройством; в качестве отрицательного контроля зона «К-» каждого зубца 2 подложки 1 оставлена свободной от специфических белков для оценки фоновых явлений;- a
- аналитическую многоячеечную ванну 4 с изолированными ячейками 5, заполненными готовыми рабочими растворами и герметизированными пленкой;- analytical
- перфоратор (на чертежах не показан) для вскрытия ячеек 5 аналитической ванны 4;a perforator (not shown in the drawings) for opening
Описание конкретного выполнения заявляемого набора.Description of the specific implementation of the proposed set.
Подложка 1 изготавливается из непористого синтетического материала (предпочтительно из синтетической бумаги) в виде плоского гребня, например, с пятью зубцами (иммуночипами) 2, на каждом из которых в определенном порядке нанесен набор (в виде пятен 3) из реагентов захвата (антигенов и антител). Встроенные контроли расположены на отдельных сегментах иммуночипа и включают зону с нанесенными IgG человека (контроль работоспособности антивидовых детекторных антител), зону с нанесенными выявляемыми антигенами (контроль работоспособности детекторных антител) и свободную от специфических белков зону для оценки фоновых явлений. Антигены на подложке могут быть представлены отдельными нативными, синтетическими, рекомбинантными белками, их комбинацией или химерными конструкциями, содержащими наборы антигенов соответствующих возбудителей. Антитела захвата могут быть представлены аффинно очищенными иммуноглобулинами из поликлональных сывороток или моноклональными антителами и не должны конкурировать за сайты связывания (эпитопы) антигенов с детекторными антителами, а также реагировать с антивидовыми иммуноглобулинами в конъюгате.The
Реагенты захвата и контроли на поверхности подложки наносятся в концентрации 5-20 мкг/мл (предпочтительно 10 нг/мл) аликвотами по 1,5-3 мкл (предпочтительно 2 мкл) в виде расположенных в определенном порядке отдельных точек (пятен 4) с диаметром от 2 до 5 мм (предпочтительно 3 мм), что позволяет прямой визуальный учет результатов анализа.Capture reagents and controls are applied on the substrate surface at a concentration of 5-20 μg / ml (preferably 10 ng / ml) in 1.5-3 μl aliquots (preferably 2 μl) in the form of individual points (spots 4) arranged in a certain order with a diameter from 2 to 5 mm (preferably 3 mm), which allows direct visual accounting of the results of the analysis.
Аналитическая ванна 4 выполнена из инертной пластмассы и имеет несколько рядов, состоящих из пяти ячеек 5 каждый. Каждый ряд ячеек 5 заполнен определенным готовым к применению рабочим раствором и герметизирован пленкой.
В качестве конъюгата в наборе используются детекторные антитела к иммуноглобулинам человека и детекторные антитела к выявляемым антигенам, связанные с каталитически активными золями золота. Конъюгат может быть представлен в виде смеси золей золота, связанных с отдельными видами детекторных антител, или золем золота, связанным одновременно с несколькими детекторными молекулами. Последний вариант предпочтительней, поскольку обеспечивает больший срок хранения разведенного (готового к применению) конъюгата.Detection antibodies to human immunoglobulins and detection antibodies to detectable antigens associated with catalytically active gold sols are used as a conjugate in the kit. The conjugate can be presented in the form of a mixture of gold sols, associated with certain types of detector antibodies, or a gold sol, associated simultaneously with several detector molecules. The latter option is preferable because it provides a longer shelf life of the diluted (ready-to-use) conjugate.
В качестве проявляющей системы применяется состав "физического проявителя", включающий: 0,2% - метола; 0,2% - серебра азотнокислого; 0,5% - лимонной кислоты в бидистиллированной воде. Принцип проявления заключается в каталитическом осаждении серебра из проявителя на поверхности частиц золота из конъюгата, связанных на поверхности подложки. Раствор проявителя нестабилен, поэтому в наборе проявитель используется в виде двух компонентов: сухого - таблетированной смеси лимонной кислоты и метола в соотношении 5:2 и жидкого - 0,4% азотнокислого серебра в бидистиллированной воде. Таблетки сухой смеси помещаются в ячейки 5 девятого ряда ванны 4. В ходе анализа в эти ячейки добавляют по х/г объема ячейки бидистиллированной воды для растворения таблеток, а непосредственно перед проявлением - Уг объема ячейки раствора азотнокислого серебра. Время проявления - 8 мин. Для усиления и стабилизации окраски проявленных пятен используется раствор, содержащий 1% тиомочевины и 1% гидроокиси натрия в дистиллированной воде. Принцип усиления и стабилизации заключается в переводе осажденного серебра в химически устойчивый сульфид серебра, имеющий интенсивную черную окраску.As a developing system, the composition of the "physical developer" is used, comprising: 0.2% - metol; 0,2% - silver nitrate; 0.5% citric acid in bidistilled water. The principle of manifestation is the catalytic deposition of silver from the developer on the surface of gold particles from the conjugate bound on the surface of the substrate. The developer solution is unstable, therefore the developer is used in the kit in the form of two components: dry - tableted mixture of citric acid and metol in a ratio of 5: 2 and liquid - 0.4% silver nitrate in bidistilled water. Tablets of the dry mixture are placed in
Дополнительно набор комплектуется:Additionally, the kit comes with:
- перфоратором;- perforator;
- флаконом с бидистиллированной водой для растворения таблеток проявителя;- a bottle of bidistilled water to dissolve the developer tablets;
- непрозрачным флаконом с жидким компонентом проявителя - 0,4% раствор AgNO3 в бидистиллированной воде;- an opaque bottle with a liquid component of the developer - 0.4% solution of AgNO 3 in bidistilled water;
- листом черной бумаги, использующейся в качестве темного фона для позиционирования иммуночипа при учете и документировании результатов.- a sheet of black paper used as a dark background for positioning the immunochip when recording and documenting the results.
Описание процесса использования заявляемого набора.Description of the use of the proposed set.
При выполнении анализа ячейки 5 вскрывают перфоратором, в первый ряд ячеек 5 вносят исследуемые образцы сыворотки крови (15 мкл) и погружают зубцы 2 подложки 1. Затем, через определенные интервалы времени подложку 1 передвигают и погружают в ячейки 5 следующего ряда ванны 4 и, после выемки из последнего ряда ячеек 5 визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения антигенов. Для одиночных анализов используют отдельные зубцы 2, которые ножницами отделяют от гребенки подложки 1. Анализ осуществляют при комнатной температуре.When performing the analysis,
Далее приведены примеры конкретного применения набора.The following are examples of a specific application kit.
Пример 1. Сравнение эффективности выявления маркеров гемотрансмессивныж инфекций в сыворотке крови в планшетных ИФА-тест-системах и мультиплексном дот-иммуноанализе.Example 1. Comparison of the efficiency of detection of markers of blood transmissible infections in blood serum in tablet ELISA test systems and multiplex dot-immunoassay.
В пробных экспериментах используют:In trial experiments using:
Зубцы (иммуночипы) 2 с нанесенными по схеме, приведенной на Фиг.1, реагентами захвата и контролями:Teeth (immunochips) 2 coated with the scheme shown in Figure 1, capture reagents and controls:
T1 - химерным белком, содержащим этитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2;T1, a chimeric protein containing the etitopes of the gp41,
Т2 - химерным белком, содержащим этитопы антигенов Core, NS3, NS4 и NS5 ВГС;T2, a chimeric protein containing ethotypes of HCV Core, NS3, NS4 and NS5 antigens;
Т3 - смесью рекомбинантных антигенов р17, ТтрА и р47 Т. pallidum;T3 - a mixture of recombinant antigens p17, TpA and p47 of T. pallidum;
Т4 - антителами захвата против антигена р24 ВИЧ;T4 - antibody capture against HIV p24 antigen;
Т5 - антителами захвата против HBsAg;T5 - antibodies capture against HBsAg;
K1 - IgG из сыворотки крови человека - контроль работоспособности антивидовых детекторных антител;K1 - IgG from human blood serum - monitoring the health of anti-virus detector antibodies;
К2 - поверхностным антигеном вируса гепатита В (HBsAg) - контроль работоспособности детекторных антител к HBsAg;K2 - hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) - monitoring the performance of detector antibodies to HBsAg;
К3 - антигеном р24 ВИЧ - контроль работоспособности детекторных антител к белку р24 ВИЧ;K3 - HIV p24 antigen - monitoring the performance of detector antibodies to HIV p24;
Один из сегментов (К-) зубцов (иммуночипов) 2 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений.One of the segments (K-) of the teeth (immunochips) 2 is left free of specific proteins for the assessment of background phenomena.
Аналитическую ванну 4 с 12 рядами ячеек 5 заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т (0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4) с 0,05% (в/о) казеина, рН 8,0;- row 1 - solution for dilution of samples - TSB-T (0.1 M Tris-HCl with 0.15 M NaCl and 0.1% Tween-20, pH 7.2-7.4) with 0.05% ( w / v) casein, pH 8.0;
- ряды 2, 3, 5 и 6 - раствор для отмывок - ТСБ-Т;-
- ряд 4 - конъюгат коллоидного золота (20 нм) со смесью детекторных антител (против иммуноглобулинов человека, против антигена р24 ВИЧ и против HBsAg);- row 4 - colloidal gold conjugate (20 nm) with a mixture of detector antibodies (against human immunoglobulins, against HIV p24 antigen and against HBsAg);
- ряды 7, 8, 10 и 12 - бидистиллированная вода.- rows 7, 8, 10 and 12 - bidistilled water.
- ряд 11 - раствор усилителя и стабилизатора окраски - 1% тиомочевины и 1% NaOH в дистиллированной воде.- Row 11 - solution of the enhancer and color stabilizer - 1% thiourea and 1% NaOH in distilled water.
- в ячейки ряда 9 вносят по 1 таблетке (3 мг) сухой смеси проявителя -лимонная кислота и метол в соотношении 5:2, соответственно.- in the cells of row 9
Заполненную ванну герметизируют пленкой. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором.The filled bath is sealed with a film. When performing the analysis, the sealing coating is opened with a perforator.
Выполнение анализа. Мультиплексный анализ пяти образцов сывороток крови проводят с использованием предлагаемого набора. Все операции выполняются при температуре не ниже 20°С. В ячейки первого ряда пипеткой вносят по 15 мкл исследуемых сывороток крови, перемешивают, помещают в них зубцы (иммуночипы) 2 и инкубируют 20 мин. В ячейки 5 девятого ряда добавляют 200 мкл бидистиллированной воды из флакона. Затем иммуночипы 2 подложки 1 переносят из ячеек 5 первого ряда в ячейки 5 следующих рядов с инкубациями: 4 ряд - 20 мин; 2, 3 и 5-8 ряды - 2 мин, 9 ряд - 8 мин, 10-12 ряды - 1 мин. Перед внесением иммуночипов в ячейки девятого ряда в них добавляют по 200 мкл раствора азотнокислого серебра из флакона. После выемки иммуночипов 2 из ячеек 5 последнего ряда визуально учитывают результаты анализа. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего реагента захвата визуально определяется четко различимое темное пятно, все контроли работоспособности системы имеют интенсивную темную окраску, а зона К- не имеет окраски или слабо окрашена.Perform analysis. Multiplex analysis of five blood serum samples is carried out using the proposed set. All operations are performed at a temperature not lower than 20 ° C. Pipette 15 µl each of the test sera into the cells of the first row, mix, place the teeth (immune chips) 2 into them and incubate for 20 minutes. 200 μl of bidistilled water from the vial is added to
Примечания:Notes:
Положительные результаты ИФА выделены жирным шрифтом.Positive ELISA results are in bold.
+ отчетливо определяемое пятно в месте нанесения антигена (положительный результат).+ a distinct spot at the site of antigen deposition (positive result).
- слабо определяемое пятно в месте нанесения антигена или чистый фон подложки (отрицательный результат).- poorly defined spot in the place of deposition of antigen or a clean background of the substrate (negative result).
Для сравнения иммунопероксидазный планшетный анализ проводят на моноспецифических тест-системах для определения маркеров отдельных инфекций, серийно выпускающихся ЗАО «Вектор Бест» (г. Новосибирск). Выполнение иммуноанализа и учет результатов проводят в соответствии с инструкциями производителя. Результаты, полученные с использованием предлагаемого набора, в сравнении с данными моноспецифического иммуноферментного анализа приведены в таблице.For comparison, immunoperoxidase tablet analysis is carried out on monospecific test systems for determining markers of individual infections, commercially produced by Vector Best (Novosibirsk). Performing an immunoassay and recording results is carried out in accordance with the manufacturer's instructions. The results obtained using the proposed kit, in comparison with the data of monospecific enzyme immunoassay are shown in the table.
Вид иммуночипов с результатами анализа образцов 1-5 приведен на фиг. 2.The type of immunochips with the analysis results of samples 1-5 is shown in FIG. 2
Пример 2. Дифференцированное выявление маркеров ВИЧ инфекции в сыворотке крови в мультиплексном дот-иммуноанализе.Example 2. Differential identification of markers of HIV infection in serum in multiplex dot-immunoassay.
В пробных экспериментах используют:In trial experiments using:
Зубцы (иммуночипы) 2 подложки 1 с нанесенными по схеме, приведенной на фиг. 3, реагентами захвата и контролями:The teeth (immunochips) 2 of the
Т1 - химерный белок, содержащий эпитопы антигенов gp41, gpl20 ВИЧ 1 и gp36 ВИЧ 2 (выявление суммарных антител к ВИЧ 1 и 2)T1 - chimeric protein containing epitopes of antigens gp41,
Т2 - рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp41 ВИЧ 1 (выявление специфических антител к ВИЧ 1);T2 - a recombinant protein containing the
Т3-рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gpl20 ВИЧ 1 (выявление специфических антител к ВИЧ 1);T3-recombinant protein containing the
Т4 - рекомбинантный белок, содержащий этитопы антигена gp36 ВИЧ 2 (выявление специфических антител к ВИЧ 2);T4 is a recombinant protein containing the
Т5 - антитела захвата против антигена р24 ВИЧ (выявление раннего белка р24 ВИЧ);T5 - capture antibodies against HIV p24 antigen (detection of HIV early p24 protein);
K1 - IgG из сыворотки крови человека - контроль работоспособности антивидовых детекторных антител;K1 - IgG from human blood serum - monitoring the health of anti-virus detector antibodies;
К2 - антиген р24 ВИЧ - контроль работоспособности детекторных антител к белку р24 ВИЧ;K2 - HIV p24 antigen - monitoring the performance of detector antibodies to HIV p24 protein;
Один из сегментов (К-) иммуночипов 2 оставлен свободным от специфических белков для оценки фоновых явлений.One of the segments (K-) of
Аналитическую ванну 4 с 12 рядами ячеек 5, заполненными так же, как в примере 1 за исключением того, что конъюгат содержит два вида детекторных антител (против иммуноглобулинов человека и против антигена р24 ВИЧ).
Выполнение мультиплексного анализа производят так же, как описано в примере 1. Результат считают положительным, если в месте нанесения соответствующего реагента захвата визуально определяется четко различимое темное пятно, все контроли работоспособности системы имеют интенсивную темную окраску, а зона К- не имеет окраски или слабо окрашена.The multiplex analysis is performed in the same way as described in example 1. The result is considered positive if a clearly visible dark spot is visually determined at the site of application of the corresponding reagent, all system health checks have intense dark coloration, and K-zone has no colouration or is slightly colored. .
Результаты анализа пяти сывороток, содержащих разные маркеры ВИЧ приведены на фиг. 4.The results of the analysis of five sera containing different HIV markers are shown in FIG. four.
Применение в заявляемом изобретении набора нанесенных на иммуночип реагентов захвата, пре дставленных ка к антигенами, так и антителами; а также использование в качестве системы детекции сложных многокомпонентных конъюгатов, представляющих собой антитела к иммуноглобулинам человека (a/Hum IgG) и антитела к антигенам выявляемых возбудителей, связанные с каталитически активными золями золота, позволяет повысить точность анализа, определять ранние маркеры (например, белок р24 ВИЧ) обеспечивающие осуществление диагностики на ранних стадиях развития инфекции (до выработки специфических антител). Предлагаемый набор позволяет за счет определения в одном анализе сразу ряда маркеров значительно сократить время на обследование пациента. Кроме того, поскольку один анализ с использованием предлагаемого набора эквивалентен нескольким анализам в моноспецифических системах и по стоимости эти анализы близки, использование изобретения в широкой медицинской практике может дать значительный экономический эффект. Предлагаемый набор содержит полный комплект компонентов, автономен и может использоваться не только в клинических лабораториях, но и во внелабораторных условиях для выполнения, как групповых, так и индивидуальных анализов. Чувствительность мультиплексного анализа с использованием предлагаемого набора не уступает чувствительности серийно выпускающихся планшетных моноспецифических иммунопероксидазных тестов (см. пример 1).The use in the claimed invention of a set of captured on immunochip capture reagents, presented as antigens and antibodies; as well as the use of complex multicomponent conjugates, which are antibodies to human immunoglobulins (a / Hum IgG) and antibodies to antigens of detectable pathogens associated with catalytically active gold sols, as a detection system, allows increasing the accuracy of the analysis and determining early markers (for example, p24 protein HIV) ensure the implementation of diagnostics in the early stages of infection (before the development of specific antibodies). The proposed set makes it possible, due to the determination of a series of markers in one analysis at a time, to significantly reduce the time for examining a patient. In addition, since a single analysis using the proposed kit is equivalent to several analyzes in monospecific systems, and these tests are similar in cost, the use of the invention in general medical practice can have a significant economic effect. The proposed set contains a complete set of components, is autonomous and can be used not only in clinical laboratories, but also in non-laboratory conditions for performing both group and individual analyzes. The sensitivity of the multiplex analysis using the proposed set is not inferior to the sensitivity of commercially available tablet monospecific immunoperoxidase tests (see Example 1).
Источники патентной и научно-технической информацииSources of patent and scientific and technical information
1. Патент Китая №1286403, МПК G01N 33/53.1. Patent of China No. 1286403, IPC G01N 33/53.
2. Патент Китая №1340712, МПК G01N 33/569.2. China Patent No. 1340712, IPC G01N 33/569.
3. www.biograd.ru; www.orgenics.com.3. www.biograd.ru; www.orgenics.com.
4. Патент США №5486452, МПК G01N 033/548.4. US patent No. 5486452, IPC G01N 033/548.
5. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. школа, 1991. - с. 360.5. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiyev B.B. et al. Theory and practice of enzyme immunoassay. - M .: Higher. school, 1991. - p. 360.
6. Патент РФ №2296995, МПК G01N 33/53.6. RF patent №2296995, IPC G01N 33/53.
7. РФ №2495434, МПК G01N 33/53 (прототип).7. Of the Russian Federation No. 2495434, IPC G01N 33/53 (prototype).
8. A. Poltavchenko et all. «А Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Agents of Hemotransmissible Infections». OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844/ojbsci.2016.137.144).8. A. Poltavchenko et all. "A Kit for Multiplexed Detection of Antibodies to Hematobotransferential Infections". OnLine Journal of Biological Sciences 2016, 16 (3): 137.144 (DOI: 10.3844 / ojbsci.2016.137.144).
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018120404A RU2686490C1 (en) | 2018-06-01 | 2018-06-01 | Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018120404A RU2686490C1 (en) | 2018-06-01 | 2018-06-01 | Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2686490C1 true RU2686490C1 (en) | 2019-04-29 |
Family
ID=66430329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018120404A RU2686490C1 (en) | 2018-06-01 | 2018-06-01 | Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2686490C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111665353A (en) * | 2020-03-12 | 2020-09-15 | 杭州布封科技有限公司 | Compact immunoassay device and analysis method |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126276A (en) * | 1984-11-27 | 1992-06-30 | Falk Fish | Method for the determination and measurements of more than one unknown material in a single surface of a multianalytic assay |
| US5486452A (en) * | 1981-04-29 | 1996-01-23 | Ciba-Geigy Corporation | Devices and kits for immunological analysis |
| RU2298795C2 (en) * | 2004-03-29 | 2007-05-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Multipurpose blood serum analysis kit for simultaneously determining specific antibodies to torch infection pathogens by applying immunoassay method |
| RU2495434C2 (en) * | 2011-12-09 | 2013-10-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Kit for multi-purpose immunological antibody assay in blood preparations |
-
2018
- 2018-06-01 RU RU2018120404A patent/RU2686490C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5486452A (en) * | 1981-04-29 | 1996-01-23 | Ciba-Geigy Corporation | Devices and kits for immunological analysis |
| US5126276A (en) * | 1984-11-27 | 1992-06-30 | Falk Fish | Method for the determination and measurements of more than one unknown material in a single surface of a multianalytic assay |
| RU2298795C2 (en) * | 2004-03-29 | 2007-05-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Multipurpose blood serum analysis kit for simultaneously determining specific antibodies to torch infection pathogens by applying immunoassay method |
| RU2495434C2 (en) * | 2011-12-09 | 2013-10-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Kit for multi-purpose immunological antibody assay in blood preparations |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111665353A (en) * | 2020-03-12 | 2020-09-15 | 杭州布封科技有限公司 | Compact immunoassay device and analysis method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU782582B2 (en) | Immunochromatographic assay devices with separators | |
| JP4040110B2 (en) | Analytical instrument for membrane-based assays | |
| US7189522B2 (en) | Dual path immunoassay device | |
| US5447837A (en) | Multi-immunoassay diagnostic system for antigens or antibodies or both | |
| AU2005309443B2 (en) | Device and method for detection of analytes | |
| US20070087450A1 (en) | Immuno-gold lateral flow assay | |
| US20030045001A1 (en) | Immunochromatographic test strip with arcuate sample application zone for ease-of-use in the field | |
| CA2457930A1 (en) | Diagnostic testing process and apparatus | |
| WO1990002950A1 (en) | Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method | |
| US20120003727A1 (en) | Immunoassay Device for Detecting Antibodies and Antigens | |
| JP2006521547A (en) | Multi-channel tester, its manufacturing method and its use | |
| RU2495434C2 (en) | Kit for multi-purpose immunological antibody assay in blood preparations | |
| RU2298795C2 (en) | Multipurpose blood serum analysis kit for simultaneously determining specific antibodies to torch infection pathogens by applying immunoassay method | |
| RU2686490C1 (en) | Kit for multiplex immunochemical analysis of antibodies and antigens in blood preparations | |
| JPH11153600A (en) | Test piece for immunoassay and measurement method using the test piece | |
| US4814269A (en) | Diagnostic testing for antibodies against microorganisms | |
| US11703507B2 (en) | Immunoassay for SARS-CoV-2 antibodies | |
| JPH01223352A (en) | Solid enzyme immunoassay system and method | |
| WO2005069002A1 (en) | Rapid test for antibodies against hiv in urine | |
| JPS63145962A (en) | High-sensitivity detection method of antibody displaying aids contact | |
| JP2549305B2 (en) | Independent multiplex immunoassay diagnostic system | |
| RU2712149C1 (en) | Kit for differentiated detection of blood serum markers at all stages of infectious disease by multiparametric dot-immunoassay | |
| WO1999045395A1 (en) | Rapid confirmatory test for microbial infections | |
| RU2242762C2 (en) | Product and method for multiple-discipline serumal immunoanalysis | |
| Dewar et al. | Principles and Procedures of Human Immunodeficiency Virus Serodiagnosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200715 Effective date: 20200715 |
|
| QC41 | Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200715 Effective date: 20210831 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210901 Effective date: 20210901 |