RU2491289C2 - Полинуклеотидные праймеры - Google Patents
Полинуклеотидные праймеры Download PDFInfo
- Publication number
- RU2491289C2 RU2491289C2 RU2010116772/10A RU2010116772A RU2491289C2 RU 2491289 C2 RU2491289 C2 RU 2491289C2 RU 2010116772/10 A RU2010116772/10 A RU 2010116772/10A RU 2010116772 A RU2010116772 A RU 2010116772A RU 2491289 C2 RU2491289 C2 RU 2491289C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primer
- seq
- sequence
- polynucleotide
- pik3ca
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 56
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 102200085789 rs121913279 Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 102200085639 rs104886003 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 102200085788 rs121913279 Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102200085641 rs121913273 Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 7
- 101000605639 Homo sapiens Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Proteins 0.000 claims abstract 6
- 102100038332 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform Human genes 0.000 claims abstract 4
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 claims description 31
- 101150063858 Pik3ca gene Proteins 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 3
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 3
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000012828 PI3K inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940043441 phosphoinositide 3-kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 208000019694 serous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004548 serous cystadenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу и набору для определения наличия или отсутствия мутации в гене PIK3CA. Способ включает смешивание образца нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере фрагмент гена PIK3CA, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из E542K, E545K, H1047R и H1047L, с полинуклеотидным праймером, состоящим из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:28, где смесь также содержит второй праймер, и второй праймер соответствует области фрагмента последовательности PIK3CA, расположенного ниже области, которая комплементарна полинуклеотиду, и проведение ПЦР смеси. Детектируют гибридизацию полинуклеотида с образцом нуклеиновой кислоты, где гибридизация указывает на присутствие мутации. Набор включает по меньшей мере два праймера, где первый праймер состоит из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:28, а второй праймер соответствует области фрагмента последовательности PIK3CA, расположенного ниже области, которая комплементарна первому полинуклеотиду. Предложенное изобретение позволяет эффективно детектировать мутации в фрагментах гена PIK3CA, содержащих по меньшей мере одну мутацию, выбранную из E542K, E545K, H1047R и H1047L. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 4 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, набору, содержащему полинуклеотид, и способу определения наличия или отсутствия мутаций в гене.
Предшествующий уровень техники
Фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) входят в состав большого семейства киназ липидов, вовлеченных в систему клеточных сигналов. Метаболический путь PI3K-AKT активируется при нескольких типах опухолей, приводя к нарушению роста клеток, пролиферации и уменьшению выживаемости (добавьте ссылку 1 недавнего обзора). Не так давно определили мутации в каталитической субъединице PI3K класса 1A (PIK3CA) при злокачественных опухолях человека[1]. Точную роль таких мутаций при канцерогенезе все еще следует однозначно определить, но с продолжающейся разработкой большого количества предназначенных для PI3K ингибиторов, обнаружение мутаций станет все в большей степени важным для выявления больных. Технические проблемы для обнаружения таких мутаций являются результатом ограничений при биопсиях опухоли, которые могут содержать только небольшое количество последовательностей с мутациями. Кроме того, ДНК, выделенная из погруженной в парафин ткани, часто деградирована и плохого качества. Минимальный уровень мутантной ДНК, необходимой для определения при секвенировании составляет 15-25% и, следовательно, существует острая потребность в разработке чувствительных анализов, способных определять небольшое количество мутированных аллелей в гетерогенном образце, и в продуктах, необходимых для проведения анализов.
Настоящее изобретение направлено на разрешение вопросов, связанных с данной потребностью.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к чувствительным и устойчивым анализам мутаций PIK3CA, связанных с опухолями.
По одному из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему по меньшей мере шесть концевых нуклеотидов одной из следующих ниже последовательностей праймеров или последовательности, ей комплементарной: SEQ ID NO:3-16, 18, 20-33, 35 или 37-39. То есть, полинуклеотид содержит по меньшей мере шесть нуклеотидов с 3'-конца одной из следующих ниже последовательностей праймеров или последовательности, ей комплементарной: SEQ ID NO:3-16, 18, 20-33, 35 или 37-39.
Предпочтительно, полинуклеотид содержит по меньшей мере 75% от 8, 10, 12, 14, 16, 17, 18 или 20 нуклеотидов с 3'-конца, или целиком одну из следующих ниже последовательностей праймеров, последовательности, ей комплементарной, или последовательности, обладающей идентичностью к ней 80%, 90%, 95% или 99%: SEQ ID NO:3-16, 18, 20-33, 35 или 37-39.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему по меньшей мере 75% от десяти нуклеотидов с 3'-конца одной из следующих ниже последовательностей праймеров или последовательности, ей комплементарной: SEQ ID NO:3-16, 18, 20-33, 35 или 37-39.
Таким образом, полинуклеотид составляет менее чем 100 нуклеотидов в длину, предпочтительно, менее чем 80 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, менее чем 60 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, менее чем 40 нуклеотидов, более предпочтительно, менее чем 30 нуклеотидов в длину.
Предпочтительно, полинуклеотид дополнительно содержит группу гасителя и группу флуорофора.
Таким образом, группа гасителя и группа флуорофора разделены концевой последовательностью нуклеотидов, содержащей первый и второй участки, причем нуклеотиды первого участка комплементарны, но в обратном порядке, нуклеотидам второго участка, так что гибридизация первого участка со вторым приводит к достаточно близкому расположению группы гасителя к группе флуорофора для того, чтобы погасить группу флуорофора.
Предпочтительно, концевая последовательность дополнительно содержит третий участок, содержащий последовательность, комплементарную участку гена PIK3CA.
Предпочтительно, полинуклеотид содержит по меньшей мере шесть нуклеотидов с 3'-конца SEQ ID NO:18, и концевая последовательность содержит SEQ ID NO:17.
Альтернативно, полинуклеотид содержит по меньшей мере концевые нуклеотиды с 3'-конца SEQ ID NO:35, и концевая последовательность содержит SEQ ID NO:34.
Альтернативно, полинуклеотид содержит по меньшей мере концевые нуклеотиды с 3'-конца SEQ ID NO:39, и концевая последовательность содержит SEQ ID NO:38.
Таким образом, группа гасителя включает Dabcyl.
Предпочтительно, флуорофор включает Hex, Fam или Rox.
По другому аспекту настоящее изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере два из полинуклеотидов по изобретению.
Предпочтительно, набор содержит полинуклеотид, содержащий SEQ ID NO:18, и полинуклеотид, содержащий любую из SEQ ID NO:3-16; или полинуклеотид, содержащий SEQ ID NO:35, и полинуклеотид, содержащий любую из SEQ ID NO:20-33; или полинуклеотид, содержащий SEQ ID NO:39, и полинуклеотид, содержащий SEQ ID NO:37.
Таким образом, набор дополнительно содержит нуклеотидтрифосфаты, фермент полимеризации и/или буферный раствор.
В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к применению полинуклеотида или набора по изобретению; или полинуклеотида, содержащего четыре или пять из шести нуклеотидов с 3'-конца SEQ ID NO:3-16, 18, 20-33 или 35, или последовательности ей комплементарной для определения мутации в образце нуклеиновой кислоты, содержащем по меньшей мере фрагмент гена PIK3CA.
Предпочтительно, фрагмент гена PIK3CA в образце нуклеиновой кислоты представляет собой фрагмент длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, предпочтительно, длиной 20 нуклеотидов, более предпочтительно, длиной 30 нуклеотидов и, более предпочтительно, длиной 40 нуклеотидов.
По другому аспекту настоящего изобретения предлагается способ определения наличия или отсутствия мутации в гене PIK3CA, включающий в себя стадии:
a) смешивания образца нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере фрагмент гена PIK3CA, с полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере шесть нуклеотидов с 3'-конца одной из следующих ниже последовательностей праймера, или комплементарную ей последовательность: SEQ ID NO:3-16 или 20-33; и
b) детекции гибридизации полинуклеотида с образцом нуклеиновой кислоты, где гибридизация указывает на наличие мутации.
Таким образом, полинуклеотид содержит одну из следующих ниже последовательностей праймера: SEQ ID NO:3-16 или 20-33.
Предпочтительно, способ дополнительно включает перед стадией a) стадию амплификации количества копий фрагмента гена PIK3CA, применяя амплификацию нуклеиновой кислоты с циклическим изменением температур, предпочтительно, ПЦР.
Предпочтительно, стадия b) включает проведение полимеризации ДНК, используя полинуклеотид в качестве первого праймера, и определение продукта удлинения при полимеризации.
Таким образом, стадия b) включает стадию смешивания образца нуклеиновой кислоты и полинуклеотида со вторым праймером, который соответствует участку фрагмента последовательности PIK3CA по ходу транскрипции участка, к которому комплементарен полинуклеотид, и проведение ПЦР для смеси.
Предпочтительно, второй праймер содержит: SEQ ID NO:18, и полинуклеотид содержит по меньшей мере четыре или пять из шести нуклеотидов с 3'-конца SEQ ID NO:3-16; или второй праймер содержит SEQ ID NO:35 и полинуклеотид содержит по меньшей мере четыре или пять из шести нуклеотидов с 3'-конца SEQ ID NO:20-33.
Альтернативно, способ дополнительно включает стадию проведения ПЦР образца, используя контрольные праймеры, и сравнение амплификации гена PIK3CA с амплификацией с использованием полинуклеотида и второго праймера.
Предпочтительно, контрольные праймеры содержат SEQ ID NO:37 и 39.
Таким образом, полинуклеотид содержит группу гасителя и группу флуорофора, и где стадия b) включает воздействие на смесь светом с длиной волны, на которую флуорофор реагирует при отсутствии группы гасителя, и детекцию света при длине волны, испускаемой группой флуорофора при отсутствии группы гасителя.
Предпочтительно, ген PIK3CA представляет собой последовательность, доступную по инвентарному номеру в GenBank NM_006218, номер версии NM_006218.2 GI:54792081, включенный в настоящий документ в качестве ссылки.
В тех случаях, когда в описании изобретения указано «по меньшей мере четыре или пять из шести нуклеотидов с 3'-конца» исходной последовательности, это означает, что из шести нуклеотидов в исходной последовательности либо один, либо два нуклеотида могут отсутствовать или могут быть замещены другим нуклеотидом. Разумеется, в некоторых вариантах осуществления последовательность содержит все шесть нуклеотидов исходной последовательности.
В данном описании изобретения «ARMS» представляет собой амплификационную систему для идентификации мутаций, описанную, например, в EP-A-0332435.
В тех случаях, когда в описании изобретения указана процентная доля для полинуклеотида, сравниваемого с исходным полинуклеотидом, это можно определить при помощи алгоритмов, известных в данной области.
Например, процент идентичности между двумя последовательностями можно определить, используя алгоритм BLASTP, версию 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), используя параметры по умолчанию.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показаны результаты проведения детекции при помощи праймеров Scorpion и секвенирования образцов, содержащих мутантный ген PIK3CA.
Подробное описание
В вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотидным праймерам, которые можно использовать в анализах для определения мутаций гена PIK3CA в образце, содержащем нуклеиновые кислоты.
В определенных вариантах осуществления полинуклеотидные праймеры представляют собой прямой и обратный праймеры, которые гибридизуются с геном PIK3CA, чтобы способствовать прохождению реакции амплификации при ПЦР. Таким образом, прямой праймер гибридизуется против хода транскрипции и в противоположном направлении цепи от обратного праймера, и прямой и обратный праймеры вместе определяют последовательность ампликона, которая амплифицируется во время ПЦР. Последовательность прямого праймера выбирают таким образом, чтобы он не был комплементарен последовательности дикого типа, но обладал способностью гибридизоваться с мутантной последовательностью PIK3CA.
Для того чтобы определить наличие мутантного гена PIK3CA в образце, праймеры смешивают с образцом. Затем к образцу добавляют необходимые для ПЦР компоненты (соответствующие нуклеотидтрифосфаты, фермент ДНК-полимеразу и буферный раствор) и проводят ПЦР. Если образец содержит мутантную последовательность, к которой может гибридизоваться прямой праймер, то ампликон амплифицируется во время ПЦР и, таким образом, выявляют наличие мутантной последовательности в образце. Если образец не содержит мутантной последовательности, то прямой праймер связывается с последовательностью PIK3CA с низкой эффективностью и, таким образом, имеет место слабая амплификация или амплификации последовательности ампликона отсутствует.
Для того чтобы определить мутацию E542K, последовательность прямого праймера может представлять собой одну из SEQ ID NO:3-9, предпочтительно SEQ ID NO:5. Для того чтобы определить мутацию E545K, последовательность прямого праймера может представлять собой одну из SEQ ID NO:10-16, предпочтительно SEQ ID NO:14. Для того чтобы определить мутацию H1047R, последовательность прямого праймера может представлять собой одну из SEQ ID NO:20-26, предпочтительно 21. Для того чтобы определить мутацию H1047L, последовательность прямого праймера может представлять собой одну из SEQ ID NO:27-33, предпочтительно 28. Тем не менее, следует понимать, что точная последовательность прямого праймера не должна быть идентичной данным последовательностям, при условии, что прямой праймер гибридизуется с мутантной последовательностью лучше, чем с последовательностью дикого типа. В последовательностях, указанных выше, это шесть концевых нуклеотидов (то есть нуклеотиды с 3'-конца) праймеров, которые обеспечивают специфичность связывания, следовательно, эти нуклеотиды должны быть идентичны данной последовательности.
Для того чтобы определить наличие ампликона, полученного в образце, обратный праймер в вариантах осуществления настоящего изобретения представляет собой так называемый праймер «Scorpions». Подробное описание праймеров Scorpions предлагается в заявке WO-A-99/066071, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки. Праймер Scorpions содержит последовательность праймера, комплементарную первой целевой последовательности гена (в данном изобретении PIK3CA), и концевая последовательность содержит последовательность зонда, ограниченного двумя взаимно комплементарными последовательностями. Участок, блокирующий ДНК-полимеразу (такой как мономер гексаэтиленгликоль (HEG)) расположен между последовательностью праймера и концевой последовательностью. Группа флуорофора расположена на одном крае концевой последовательности, и группа гасителя расположена на другом крае концевой последовательности. При использовании последовательность праймера в праймере Scorpions во время ПЦР действует обычным способом в качестве обратного праймера, и, таким образом, целый праймер Scorpions, включающий в себя концевую последовательность, вводится в состав ампликона. Участок, блокирующий ДНК-полимеразу предотвращает дупликацию концевой последовательности. Таким образом, взаимно комплементарные последовательности в концевой последовательности склонны гибридизоваться друг с другом, приближая группу флуорофора к группе гасителя и предотвращая эмиссию от группы флуорофора. Однако если ампликон содержит вторую целевую последовательность, комплементарную последовательности зонда, то последовательность зонда предпочтительно связывается со второй целевой последовательностью, разделяя взаимно комплементарные последовательности. Это приводит к тому, что группа флуорофора и группа гасителя пространственно располагаются на определенном расстоянии, так что группа флуорофора испускает свет одной длины волны в ответ на падающий свет другой длины волны. Таким образом, праймер Scorpions позволяет с легкостью обнаруживать ампликоны и, кроме того, избегать появления ложно положительных результатов (вызванных димерами праймеров, например), потому что сигнал получают только тогда, когда ампликон содержит вторую целевую последовательность.
Группа флуорофора может представлять собой Hex (4,7,2',4',5',7'-гексахлор-(3',6'-дипивалоилфлуоресцеин)-6-карбоксамидогексил]-1-O-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)-фосфорамидит), Fam ([(3',6'-дипивалоилфлуоресцеин)-6-карбоксамидогексил]-1-O-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)-фосфорамидит) или Rox (5,6,-карбокси-X-родамин). Группа гасителя может представлять собой Dabcyl (5'-диметокситритилокси-5-[(N-4'-карбокси-4-(диметиламино)-азобензол)-аминогексил-3-акрилимид]-2'-дезоксиуридин-3'-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидит).
В вариантах осуществления настоящего изобретения праймер Scorpions предлагается для обнаружения мутаций E542K и E545K, где последовательность праймера представляет собой SEQ ID NO:18 и последовательность зонда представляет собой SEQ ID NO:17. Праймер Scorpions предлагается для обнаружения мутаций H1047R и H1047L, где последовательность праймера представляет собой SEQ ID NO:35 и последовательность зонда представляет собой SEQ ID NO:34.
Тем не менее, следует принять во внимание, что применение праймеров Scorpions не является обязательным для изобретения и можно применять другие способы обнаружения синтеза ампликонов, такие как обнаружение продуктов с TaqMan™, как описано в патентах №№ US-A-5487972 и US-A-5210015.
В некоторых вариантах осуществления также проводят контрольный анализ для того, чтобы определить общую концентрацию гена PIK3CA в образце. Это достигается при проведении отдельной реакции ПЦР с контрольными прямым и обратным праймерами, которые определяют ампликон в другом участке гена PIK3CA. Предпочтительно, чтобы прямой праймер представлял собой SEQ ID NO:37 и обратный праймер представлял собой праймер Scorpions, в котором последовательность прамера представляет собой SEQ ID NO:39 и последовательность зонда представляет собой SEQ ID NO:38. Количество циклов ПЦР, необходимых для получения порогового количества контрольных ампликонов, затем сравнивают с количеством циклов ПЦР, необходимых для получения порогового количества ампликонов, содержащих мутантную последовательность для того, чтобы оценить относительную долю мутантных копий гена PIK3CA в образце. Такие контрольные анализы, как правило, проводят отдельно от тестовых анализов.
Анализы ПЦР предпочтительно проводят в виде анализов мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Образец нуклеиновой кислоты для анализа обычно представляет собой образец крови, кала, мокроты, смыва из толстой кишки, смыв из бронхов или другой жидкости организма или ткани, полученной от индивидуума. Индивидуум обычно представляет собой человека, предпочтительно, Homo sapiens. Следует понимать, что образец для анализа может в равной степени представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую последовательности в образце для анализа. Это означает, что все или часть областей в нуклеиновой кислоте образца можно сначала амплифицировать, применяя любую подходящую технику, такую как амплификация нуклеиновой кислоты с циклическим изменением температур, в частности ПЦР, или амплификация целого генома (WGA) до использования в способе по изобретению.
Можно использовать любой подходящий фермент для полимеризации при условии, что он не влияет на способность ДНК-полимеразы в существенной степени различать нормальную и мутантную матрицу последовательности. Примеры подходящих ферментов включают в себя термостабильные ферменты, которые обладают незначительной 3'-5'-экзонуклеазной активностью, например, Taq ДНК-полимераза, особенно ДНК-полимераза «Ampli Taq Gold»™ (PE Applied Biosystems), фрагмент Штоффеля или другие соответствующим образом укороченные с N-конца модификации Taq или Tth (Thermus thermophilus) ДНК-полимеразы.
В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются наборы, содержащие один или несколько полинуклеотидов по изобретению и нуклеотидтрифосфаты, фермент ДНК-полимеразу и буферный раствор, необходимые для проведения реакции ПЦР. Предпочтительные наборы содержат прямые и обратные праймеры для обнаружения определенной мутации и прямые и обратные контрольные праймеры.
ПРИМЕРЫ
Материалы и способы
Праймеры конструировали для 4 наиболее распространенных мутаций в гене PIK3CA (номер доступа: NM_006218). Праймеры ARMS конструировали для определения 2 мутаций в экзоне 20: H1047R и H1047L; и 2 мутаций в экзоне 9: E452K и E454K. Контрольный праймер конструировали для положения 2450 кДНК в гене PIK3CA.
Также конструировали Scorpions. Для того чтобы обеспечить возможность объединения множества анализов, в каждой реакции три праймера scorpion метили при помощи различных флуорофоров.
Конструирование праймеров
Ряд праймеров для ARMS конструировали специфичными для каждого целевого участка. Целевой участок для мутаций E542K и E545K показан ниже в виде SEQ ID NO:1 и 2, соответственно (мутантное основание показано в скобках с нормальным вариантом на первом месте). Прямые праймеры для мутаций также показаны ниже (SEQ ID NO:3-16). Для увеличения специфичности данных реакций использовали дополнительные несовпадающие основания в праймерах ближе к 3'-концу (показаны подчеркиванием в последовательностях праймеров). Оптимальные праймеры (E542K-2 и E545K-4) использовали для описываемых экспериментов. Праймер Scorpions, пригодный для применения с последовательностями праймеров, показан в виде SEQ ID NO:17 и 18. Участки соответствия между праймером Scorpions и целевыми участками показаны одинаковым выделением или подчеркиванием.
Участок экзона 20
Целевой участок для мутаций H1047R и H1047L показан ниже в виде последовательности SEQ ID NO:19 (мутантное основание показано в скобках с нормальным вариантом на первом месте). Прямые праймеры для мутаций также показаны ниже (SEQ ID NO:20-33). Для увеличения специфичности данных реакций использовали дополнительные несовпадающие основания в праймерах ближе к 3'-концу (показаны подчеркиванием в последовательностях праймеров). Оптимальные праймеры (H1047R-1 и H1047L-1) использовали для описываемых экспериментов. Праймер Scorpions, пригодный для применения с последовательностями праймеров, показан в виде SEQ ID NO:34 и 35. Участки соответствия между праймером Scorpions и целевыми участками показаны одинаковым выделением или подчеркиванием.
Все праймеры синтезировались и предоставлялись Invitrogen. Буфер для ПЦР, Taq и магний предоставлялись Eurogentec и dNTPS приобретали в Abgene Ltd. Scorpions синтезировались и предоставлялись ATDBio.
Анализы объединяли в 2 реакциях, состоящих из контрольного анализа и 2 анализов ARMS (1 × экзон 9 и 1 × экзон 20). Анализы проводили в 25 мкл объема реакционной смеси, содержащей 1× буфер ПЦР, 4,0 мМ MgCl2, 200 мкМ смеси dNTP, 0,25 мкМ каждого праймера (контрольного праймера и 2 праймеров ARMS) и 0,25 мкМ каждого scorpion (scorpion для контроля (SEQ ID NO:38 и 39), scorpion для экзона 20 (SEQ ID NO:34 и 35) и scorpion для экзона 9 (SEQ ID NO:17 и 18)). 2,5 мкл матрицы ДНК добавляли к каждой реакции. Праймеры для H1047R и E542K объединяли с 2,5 единиц Taq полимеразы на реакцию. Праймеры для H1047L и E545K объединяли с 3,0 единиц Taq полимеразы на реакцию. Используемый праймер для E542K представлял собой E542K-2 (SEQ ID NO:5). Используемый праймер для E545K представлял собой E545K-4 (SEQ ID NO:14). Используемый праймер для H1047R представлял собой H1047R-1 (SEQ ID NO:21). Используемый праймер для H1047L представлял собой H1047L-1 (SEQ ID NO:28).
Во всех случаях реакции амплифицировали на Stratagene Mx3000P при следующих ниже условиях: 95°C в течение 10 минут, после чего следовали 45 циклов при 90°C в течение 30 секунд и при 60°C в течение 1 минуты.
Кассеты ДНК, содержащие точечные мутации, для использования в качестве положительных контролей конструировали на основе способа, описанного Higuchi et al.[2] Вкратце, соответствующие внешний праймер и праймер-мутамер применяли для получения полукассет с комплементарными концами, причем каждая из полукассет содержала мутантное основание. Данные продукты ПЦР смешивали и амплифицировали с внутренними вложенными праймерами. Самоамплификация комплементарных полукассет и последующая амплификация приводила к получению готового продукта с мутантным основанием. Продукты секвенировали, чтобы убедиться, что получена правильная последовательность. Данный процесс повторяли для каждой исследуемой мутации. Кассеты ДНК смешивали с равным количеством геномной ДНК для получения 100% положительного контроля.
Пример 1
Для того чтобы определить специфичность реакций и праймеров, каждый анализ проводили с использованием 5-50 нг геномной ДНК на реакцию, чтобы вычислить сигнал разрыва, вызванного удлинением праймера с несовпадающими основаниями. Для каждой реакции определяли величину ΔCt (контрольный Ct - мутантный Ct) (Ct = пороговый цикл). Реакции проводили шесть раз для каждой концентрации ДНК и повторяли трижды в отдельных экспериментах, чтобы определить отсечение по величине ΔCt, ниже которого любое увеличение, как можно считать, происходит вследствие присутствия мутантной последовательности и не вследствие сигнала разрыва. Отсечение по величине ΔCt, как определили, составляла 1 Ct ниже наиболее низкого значения ΔCt, наблюдаемого во всех реакциях для каждого анализа. При анализах H1047R и H1047L отсечение по ΔCt определили как 12, при анализе E542K отсечение по ΔCt составляло 9 и при анализе E545K отсечение по ΔCt составляло 8.
Пример 2
Для того чтобы оценить чувствительность анализа, 5 копий мутантной ДНК разбавляли в различных концентрациях геномной ДНК, чтобы получить в результате конечные концентрации 5, 2, 1, 0,5 и 0,1% мутантной ДНК по отношению к дикому типу. В таблице 1 проиллюстрирована чувствительность 4 анализов ARMS. В таблице показаны величины ΔCt для уменьшающихся концентраций мутантной ДНК с фоновым значение для ДНК дикого типа. Предпочтительные отсечения по ΔCt показаны в последней колонке. В анализах экзона 20 смогли определить 5 копий мутантной ДНК, когда он содержал только 0,1% от общей ДНК (с предварительно определенным отсечением по ΔCt). В анализах экзона 9 смогли определить 5 копий мутантной ДНК при концентрации 1% с предварительно определенными величинами отсечения по ΔCt (таблица 1).
| Таблица 1 | ||||||||
| ДНК дикого типа /реакция (копии) | мутантная ДНК /реакция (копии) | относительный % мутантных аллелей | ΔCT | |||||
| H1047L | H1047R | E542K | E545K | отсечение по ΔCt | ||||
| 100 | 5 | 5% | 5,9 | 4,3 | 5,1 | 5,8 | ||
| 250 | 5 | 2% | 7,2 | 6,7 | 7,2 | 6,4 | H1047L | 12 |
| 500 | 5 | 1% | 8,3 | 7,6 | 8,4 | 7,0 | H1047R | 12 |
| 1000 | 5 | 0,5% | 9,3 | 9,0 | 10,2 | 8,1 | E542K | 9 |
| 5000 | 5 | 0,1% | 11,5 | 10,5 | 12,1 | 10,1 | E545K | 8 |
Пример 3
Смешивание с клеточными линиями, содержащими мутацию H1047R (HCT-116) и E545K (MCF-7), использовали для сравнения относительной чувствительности анализов ARMS по сравнению с секвенированием. Обе клеточные линии были гетерозиготны по мутации. Секвенирование проводили, используя праймеры и условия проведения циклов ПЦР, как описано Samuels et al[1]. Анализы ARMS и секвенирование проводили при концентрациях мутантного гена 100%, 50%, 30%, 10% и 1% от общей смеси. Результаты показаны на фигуре 1, на которой результаты под заголовком «Scorpions» показывают увеличение количества копий ампликона после последовательных циклов ПЦР (результаты при использовании контрольных праймеров и мутантных праймеров показаны в виде отдельных линий). Под заголовком «Секвенирование ДНК» показаны результаты секвенирования обратной цепи гена в смеси. При секвенировании не смогли определить наличие мутантов H1047R, при количестве менее чем 50% от общей смеси и не смогли определить наличие мутантов E545K в количестве менее чем 30% от общей смеси. В анализах с использованием праймеров по изобретению, в отличие от этого, были способны определить наличие мутантов при концентрации 1%.
Пример 4
Данный анализ применяли в отношении ДНК, выделенной из свежезамороженной ткани различных типов опухолей, которые оценивали в отношении наличия мутаций PIK3CA, применяя анализ ARMS/Scorpion. Всего была доступна ДНК из 279 образцов опухоли. При анализе выявили мутации в 5 из 49 (10,2%) образцов колоректального рака, в 19 из 49 (38,7%) образцов рака молочной железы, в 1 из 51 (1,9%) образца рака легких и в 1 из 34 (2,9%) образцов меланомы. Никаких мутаций не определили в 50 образцах рака простаты или 46 образцах рака яичников. Из колоректальных образцов, положительных в отношении мутаций PIK3CA, 3 представляли собой H1047R, 1 представлял собой H1047L и 1 представлял собой E542K; из образцов рака молочной железы, положительных в отношении PIK3CA, 15 представляли собой H1047R, 1 представлял собой H1047L и 3 представляли собой E545K; обе мутации в образцах рака легких и образце меланомы, положительном в отношении мутаций PIK3CA представляли собой H1047R. При секвенировании идентифицировали только 14 от общего количества 26 (53%) определенных мутаций. При секвенировании обнаружили мутацию в одном образце рака молочной железы, для определения которой не был разработан анализ ARMS (c.1634 A>G; p E545G). Она не являлась новой мутацией и была ранее описана при раке молочной железы и колоректальном раке[3-5].
Частота мутаций PIK3CA в анализируемых образцах согласовывалась с предыдущими исследованиями за исключением рака яичников[1, 3-9]. Мутации PIK3CA ранее были описаны при раке яичников, но предполагали, что они могли быть ассоциированы с эндометриоидными и светлоклеточными раками[8, 10]. Все тестируемые в данном исследовании раки яичников представляли собой серозную аденокарциному, что может объяснить отсутствие какой-либо мутации PIK3CA.
При анализе ARMS идентифицировали значительно больше мутаций в клинических образцах, чем обнаружили посредством прямого секвенирования. Смешивание с клеточной линией подтверждает, что данный анализ более чувствителен, чем секвенирование, при определении исследуемых мутаций PI3KCA. Вероятно, гетерогенность клинических образцов, которые будут содержать и опухолевую и нормальную ткань, будет означать, что в некоторых случаях частота мутаций будет ниже, чем пригодная для определения способами секвенирования, и в силу этого анализ ARMS большее подходит для клинического применения. Недостаток заключается в том, что будут определяться только определенные специфичные мутации ARMS. Тем не менее, в данной серии из 279 образцов была определена только одна мутация в экзоне 9 или 20 гена PI3KCA, для определения которой не был разработан анализ ARMS.
В заключение, в примерах показано, что настоящее изобретение относится к чувствительному высокопроизводительному анализу для определения 4 наиболее распространенных мутаций в гене PIK3CA. Данный анализ можно применять для небольшого количества ДНК и можно определять низкие уровни мутантного PIK3CA в образце.
Список последовательностей в нестандартном формате
<210> 1
<223> E542K целевой участок
<210> 2
<223> E545K целевой участок
<210> 3
<223> E542K-0 прямой праймер
<210> 4
<223> E542K-1 прямой праймер
<210> 5
<223> E542K-2 прямой праймер
<210> 6
<223> E542K-3 прямой праймер
<210> 7
<223> E542K-4 прямой праймер
<210> 8
<223> E542K-5 прямой праймер
<210> 9
<223> E542K-6 прямой праймер
<210> 10
<223> E545K-0 прямой праймер
<210> 11
<223> E545K-1 прямой праймер
<210> 12
<223> E545K-2 прямой праймер
<210> 13
<223> E545K-3 прямой праймер
<210> 14
<223> E454K-4 прямой праймер
<210> 15
<223> E545K-5 прямой праймер
<210> 16
<223> E545K-6 прямой праймер
<210> 17
<223> праймер Scorpion для экзона 9
<210> 18
<213> праймер Scorpion 2 для экзона 9
<210> 19
<223> H1047R и H1047L целевые участки
<210> 20
<223> H1047R-0 прямой праймер
<210> 21
<223> H1047R-1 прямой праймер
<210> 22
<223> H1047R-2 прямой праймер
<210> 23
<223> H1047R-3 прямой праймер
<210> 24
<223> H1047R-4 прямой праймер
<210> 25
<223> H1047R-5 прямой праймер
<210> 26
<223> H1047R-6 прямой праймер
<210> 27
<223> H1047L-0 прямой праймер
<210> 28
<223> H1047L-1 прямой праймер
<210> 29
<223> H1047L-3 прямой праймер
<210> 30
<223> H1047-3 прямой праймер
<210> 31
<223> H1047L-4 прямой праймер
<210> 32
<223> H1047L-5 прямой праймер
<210> 33
<223> H1047L-6 прямой праймер
<210> 34
<223> праймер Scorpion для экзона 20
<210> 35
<223> праймер Scorpion 2 для экзона 20
<210> 36
<223> контрольный целевой участок
<210> 37
<223> контрольный праймер
<210> 38
<223> контрольный праймер Scorpion
<210> 39
<223> контрольный праймер Scorpion 2
Список литературы:
1. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science 2004;304(5670):554.
2. Higuchi R, Krummel B, Saiki RK. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res 1988;16(15):7351-67.
3. Wu G, Xing M, Mambo E, et al. Somatic mutation and gain of copy number of PIK3CA in human breast cancer. Breast Cancer Res 2005;7(5):R609-16.
4. Levine DA, Bogomolniy F, Yee CJ, et al. Frequent mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancers. Clin Cancer Res 2005;11(8):2875-8.
5. Velho S, Oliveira C, Ferreira A, et al. The prevalence of PIK3CA mutations in gastric and colon cancer. Eur J Cancer 2005;41(11):1649-54.
6. Lee JW, Soung YH, Kim SY, et al. PIK3CA gene is frequently mutated in breast carcinomas and hepatocellular carcinomas. Oncogene 2005;24(8):1477-80.
7. Bachman KE, Argani P, Samuels Y, et al. The PIK3CA gene is mutated with high frequency in human breast cancers. Cancer Biol Ther 2004;3(8):772-5.
8. Campbell IG, Russell SE, Choong DY, et al. Mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer. Cancer Res 2004;64(21):7678-81.
9. Omholt K, Krockel D, Ringborg U, Hansson J. Mutations of PIK3CA are rare in cutaneous melanoma. Melanoma Res 2006;16(2):197-200.
10. Wang Y, Helland A, Holm R, Kristensen GB, Borresen-Dale AL. PIK3CA mutations in advanced ovarian carcinomas. Hum Mutat 2005;25(3):322.
Claims (4)
1. Способ определения наличия или отсутствия мутации в гене PIK3CA, включающий в себя стадии:
a) смешивания образца нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере фрагмент гена PIK3CA, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из E542K, E545K, H1047R и H1047L, с полинуклеотидным праймером, состоящим из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:28, где смесь также содержит второй праймер, и второй праймер соответствует области фрагмента последовательности PIK3CA, расположенного ниже области, которая комплементарна полинуклеотиду, и проведение ПЦР смеси; и
b) детекции гибридизации полинуклеотида с образцом нуклеиновой кислоты, где гибридизация указывает на присутствие мутации.
a) смешивания образца нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере фрагмент гена PIK3CA, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из E542K, E545K, H1047R и H1047L, с полинуклеотидным праймером, состоящим из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:28, где смесь также содержит второй праймер, и второй праймер соответствует области фрагмента последовательности PIK3CA, расположенного ниже области, которая комплементарна полинуклеотиду, и проведение ПЦР смеси; и
b) детекции гибридизации полинуклеотида с образцом нуклеиновой кислоты, где гибридизация указывает на присутствие мутации.
2. Способ по п.1, где второй праймер является праймером Scorpion.
3. Способ по п.1 или 2, где второй праймер содержит группу гасителя и группу флуорофора, и где стадия b) включает воздействие на смесь светом с длиной волны, на которую флуорофор реагирует при отсутствии группы гасителя, и детекцию света при длине волны, испускаемой группой флуорофора при отсутствии группы гасителя.
4. Набор для детекции мутаций в фрагментах гена PIK3CA, содержащих по меньшей мере одну мутацию, выбранную из E542K, E545K, H1047R и H1047L, включающий по меньшей мере два праймера, где первый праймер состоит из SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:21 или SEQ ID NO:28, а второй праймер соответствует области фрагмента последовательности PIK3CA, расположенного ниже области, которая комплементарна первому полинуклеотиду.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0719034A GB2453173A (en) | 2007-09-28 | 2007-09-28 | Polynucleotide primers |
| GB0719034.1 | 2007-09-28 | ||
| PCT/GB2008/003306 WO2009040557A2 (en) | 2007-09-28 | 2008-09-29 | Polynucleotide primers for detecting pik3ca mutations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010116772A RU2010116772A (ru) | 2011-11-10 |
| RU2491289C2 true RU2491289C2 (ru) | 2013-08-27 |
Family
ID=38701889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010116772/10A RU2491289C2 (ru) | 2007-09-28 | 2008-09-29 | Полинуклеотидные праймеры |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8901285B2 (ru) |
| EP (7) | EP2205760B1 (ru) |
| JP (1) | JP5719593B2 (ru) |
| KR (4) | KR101543214B1 (ru) |
| CN (4) | CN103952466B (ru) |
| AU (1) | AU2008303400B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0817444A2 (ru) |
| CA (2) | CA2700710C (ru) |
| ES (6) | ES2531994T3 (ru) |
| GB (1) | GB2453173A (ru) |
| MX (1) | MX2010003486A (ru) |
| RU (1) | RU2491289C2 (ru) |
| WO (1) | WO2009040557A2 (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2453173A (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers |
| US8940486B2 (en) * | 2010-01-12 | 2015-01-27 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Oligonucleotides and methods for detecting KRAS and PIK3CA mutations |
| JP2013081450A (ja) * | 2011-09-27 | 2013-05-09 | Arkray Inc | 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット |
| CN102453765B (zh) * | 2011-11-03 | 2013-07-24 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | Pik3ca基因驱动突变的检测探针、引物及试剂盒 |
| KR20140138771A (ko) | 2012-03-29 | 2014-12-04 | 노파르티스 아게 | 제약학적 진단법 |
| CN102816839A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-12-12 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 用于检测结直肠癌pik3ca基因热点突变位点的试剂盒 |
| EP2711432A1 (en) * | 2012-09-21 | 2014-03-26 | Genomica S.A.U. | Method for detection of BRAF and PI3K mutations |
| CN105229171A (zh) * | 2013-03-13 | 2016-01-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 在人pi3kca (pik3ca)基因中检测突变的方法和组合物 |
| CN103773837A (zh) * | 2013-06-25 | 2014-05-07 | 宁波有成生物医药科技有限公司 | 一种pik3ca基因突变荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法 |
| RU2549682C1 (ru) * | 2013-10-21 | 2015-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ" | Способ анализа соматических мутаций в гене pi3k с использованием lna-блокирующей мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) |
| EP3132056B1 (en) * | 2014-04-18 | 2021-11-24 | Blueprint Medicines Corporation | Pik3ca fusions |
| CN105274188A (zh) * | 2014-05-29 | 2016-01-27 | 北京雅康博生物科技有限公司 | Pik3ca基因突变检测试剂盒 |
| WO2016020710A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-11 | Pharmassist Ltd | Method of determining pik3ca mutational status in a sample |
| US10276072B2 (en) * | 2014-09-03 | 2019-04-30 | Washme Properties, Llc | Illuminated sign |
| CN105441533B (zh) * | 2014-11-29 | 2019-07-05 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | Pik3ca基因突变检测体系及其试剂盒 |
| CN104531875A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-22 | 宁波有成生物医药科技有限公司 | 一种MyD88基因突变荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法 |
| KR20250078789A (ko) | 2023-11-24 | 2025-06-04 | 주식회사 캐니캐티케어 | 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 진단방법 |
| WO2025110738A1 (ko) * | 2023-11-24 | 2025-05-30 | 주식회사 캐니캐티케어 | 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 검출용 조성물 및 이를 이용한 반려동물의 pik3ca 유전자 돌연변이성 종양 진단방법 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003025175A2 (fr) * | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Molecular Engines Laboratories | Sequences impliquees dans les phenomenes de suppression tumorale, reversion tumorale, apoptose et/ou resistance aux virus et leur utilisation comme medicaments |
| RU2240350C1 (ru) * | 2003-03-11 | 2004-11-20 | НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ | Способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов |
| WO2007050465A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | The Johns Hopkins University | Improved methods for beaming |
| WO2007106407A2 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Wyeth | Microarray for monitoring gene expression in multiple strains of streptococcus pneumoniae |
Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE61148B1 (en) | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5846824A (en) | 1994-02-07 | 1998-12-08 | Ludwig Institute For Cancer Research | Polypeptides having kinase activity, their preparation and use |
| GB9208135D0 (en) | 1992-04-13 | 1992-05-27 | Ludwig Inst Cancer Res | Polypeptides having kinase activity,their preparation and use |
| US6274327B1 (en) | 1992-04-13 | 2001-08-14 | Ludwig Institute For Cancer Research | Polypeptides having kinase activity, their preparation and use |
| US20030225013A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-04 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 4, p150 expression |
| US5847972A (en) | 1993-09-24 | 1998-12-08 | Eick; Stephen Gregory | Method and apparatus for graphically analzying a log-file |
| US6043062A (en) | 1995-02-17 | 2000-03-28 | The Regents Of The University Of California | Constitutively active phosphatidylinositol 3-kinase and uses thereof |
| US5948664A (en) | 1996-02-29 | 1999-09-07 | The Regents Of The University Of California | PI 3-kinase polypeptides |
| US6133419A (en) * | 1996-11-01 | 2000-10-17 | Onyx Pharmaceuticals, Inc. | Nucleotide sequences that encode phosphatidylinositol-3' kinase associated proteins and uses thereof |
| US6277563B1 (en) | 1997-01-16 | 2001-08-21 | The Regents Of The University Of California | Genetic alterations associated with cancer |
| US5955277A (en) | 1997-05-05 | 1999-09-21 | Novo Nordisk A/S | Mutant cDNA encoding the p85α subunit of phosphatidylinositol 3-kinase |
| US5994076A (en) * | 1997-05-21 | 1999-11-30 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of assaying differential expression |
| US8101349B2 (en) | 1997-12-23 | 2012-01-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells and their methods of use II |
| US6537751B1 (en) | 1998-04-21 | 2003-03-25 | Genset S.A. | Biallelic markers for use in constructing a high density disequilibrium map of the human genome |
| AU4187499A (en) | 1998-05-14 | 1999-11-29 | Chiron Corporation | Human genes and gene expression products v |
| GB9812768D0 (en) * | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| US6274237B1 (en) * | 1999-05-21 | 2001-08-14 | Chisso Corporation | Potentially crimpable composite fiber and a non-woven fabric using the same |
| DE60025391D1 (de) * | 1999-10-26 | 2006-03-30 | Immusol Inc | Ribozym-therapie zur behandlung von proliferativen augenkranheiten |
| US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
| WO2002027028A1 (en) | 2000-09-28 | 2002-04-04 | Atairgin Technologies, Inc. | A method of determining tumor characteristics by determining abnormal copy number or expression level of lipid-associated genes |
| USH2191H1 (en) * | 2000-10-24 | 2007-06-05 | Snp Consortium | Identification and mapping of single nucleotide polymorphisms in the human genome |
| CN1358850A (zh) * | 2000-12-13 | 2002-07-17 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人磷脂酰肌醇3(PtdIns 3)－激酶17.6和编码这种多肽的多核苷酸 |
| CA2372542A1 (en) | 2001-02-20 | 2002-08-20 | Pfizer Products Inc. | Transgenic animals containing a dominant negative mutant form of the p85 subunit of pi-3 kinase |
| US20030162174A1 (en) * | 2001-06-11 | 2003-08-28 | Sutherland John W. | Detecting nucleic acid deletion sequences |
| US20030182669A1 (en) | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Rockman Howard A. | Phosphoinositide 3-kinase mediated inhibition of GPCRs |
| US7955800B2 (en) | 2002-06-25 | 2011-06-07 | Advpharma Inc. | Metastasis-associated gene profiling for identification of tumor tissue, subtyping, and prediction of prognosis of patients |
| ATE470722T1 (de) * | 2002-07-19 | 2010-06-15 | Althea Technologies Inc | Strategien zur genexpressionsanalyse |
| US7217807B2 (en) * | 2002-11-26 | 2007-05-15 | Rosetta Genomics Ltd | Bioinformatically detectable group of novel HIV regulatory genes and uses thereof |
| US20070054278A1 (en) | 2003-11-18 | 2007-03-08 | Applera Corporation | Polymorphisms in nucleic acid molecules encoding human enzyme proteins, methods of detection and uses thereof |
| ES2869167T3 (es) | 2004-03-02 | 2021-10-25 | Univ Johns Hopkins | Mutaciones del gen PIK3CA en cánceres humanos |
| EP1753875A2 (en) * | 2004-05-07 | 2007-02-21 | Applera Corporation | Genetic polymorphisms associated with vascular diseases, methods of detection and uses thereof |
| WO2005116265A2 (en) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Wyeth | Probe arrays for expression profiling of rat genes |
| CA2601936C (en) * | 2005-02-24 | 2014-06-17 | Amgen Inc. | Epidermal growth factor receptor mutations |
| WO2006094149A2 (en) | 2005-03-01 | 2006-09-08 | Exact Sciences Corporation | Methods and compositions for detecting adenoma |
| DE602006019833D1 (de) * | 2005-03-14 | 2011-03-10 | Koninkl Philips Electronics Nv | Messung und überwachung der dienstqualität in dienstdifferenzierten drahtlosen netzwerken |
| GB2424886A (en) * | 2005-04-04 | 2006-10-11 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations |
| JP4477575B2 (ja) * | 2005-12-14 | 2010-06-09 | 株式会社日立製作所 | 大腸がんの検査に使用する遺伝子セット |
| GB2453173A (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Dxs Ltd | Polynucleotide primers |
| JP2011505124A (ja) | 2007-12-03 | 2011-02-24 | エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド | Ｐｉｋ３ｃａ発現をモジュレーションするためのｒｎａアンタゴニスト化合物 |
-
2007
- 2007-09-28 GB GB0719034A patent/GB2453173A/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-09-29 ES ES10158523.0T patent/ES2531994T3/es active Active
- 2008-09-29 EP EP08806456A patent/EP2205760B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 ES ES12169604T patent/ES2531055T3/es active Active
- 2008-09-29 EP EP12169594.4A patent/EP2505672B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 CN CN201310752245.5A patent/CN103952466B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 EP EP12169604.1A patent/EP2508624B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 KR KR1020157006582A patent/KR101543214B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 CA CA2700710A patent/CA2700710C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 JP JP2010526365A patent/JP5719593B2/ja active Active
- 2008-09-29 ES ES12169599.3T patent/ES2620289T3/es active Active
- 2008-09-29 CA CA3010064A patent/CA3010064A1/en not_active Abandoned
- 2008-09-29 ES ES12169586.0T patent/ES2622885T3/es active Active
- 2008-09-29 MX MX2010003486A patent/MX2010003486A/es active IP Right Grant
- 2008-09-29 CN CN200880110038.7A patent/CN102119222B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 US US12/680,621 patent/US8901285B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 BR BRPI0817444-0A patent/BRPI0817444A2/pt active Search and Examination
- 2008-09-29 EP EP12169599.3A patent/EP2505673B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 EP EP10158523.0A patent/EP2239341B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 CN CN201310752306.8A patent/CN103834724B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 ES ES10158519.8T patent/ES2532141T3/es active Active
- 2008-09-29 CN CN201310752451.6A patent/CN103695558B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 EP EP12169586.0A patent/EP2505671B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 EP EP10158519.8A patent/EP2236627B1/en not_active Not-in-force
- 2008-09-29 KR KR1020157006584A patent/KR101543216B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 KR KR1020157006583A patent/KR101543215B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2008-09-29 ES ES12169594.4T patent/ES2532225T3/es active Active
- 2008-09-29 AU AU2008303400A patent/AU2008303400B2/en not_active Ceased
- 2008-09-29 WO PCT/GB2008/003306 patent/WO2009040557A2/en active Application Filing
- 2008-09-29 RU RU2010116772/10A patent/RU2491289C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-09-29 KR KR1020107009180A patent/KR101548758B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-10-24 US US14/062,163 patent/US9863003B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-09-18 US US14/858,188 patent/US10196692B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2015-09-18 US US14/858,196 patent/US10190171B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003025175A2 (fr) * | 2001-09-17 | 2003-03-27 | Molecular Engines Laboratories | Sequences impliquees dans les phenomenes de suppression tumorale, reversion tumorale, apoptose et/ou resistance aux virus et leur utilisation comme medicaments |
| RU2240350C1 (ru) * | 2003-03-11 | 2004-11-20 | НИИ онкологии им. проф. Н.Н.Петрова Минздрава РФ | Способ идентификации генных мутаций и полиморфизмов |
| WO2007050465A2 (en) * | 2005-10-24 | 2007-05-03 | The Johns Hopkins University | Improved methods for beaming |
| WO2007106407A2 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Wyeth | Microarray for monitoring gene expression in multiple strains of streptococcus pneumoniae |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SAMUELS Y. ET AL. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, v.304, №5670, 23.04.2004, p.554, таблицы S2 и S3. THELWELL N ET AL. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, v.28, №19, 01.10.2000, p.3752-3761, реферат. HORIIKE A. ET AL. Detection of epidermal growth factor receptor mutation in transbronchial needle aspirates of non-small cell lung cancer. CHEST JUN 2007, v.131, №6, 2007, p.1628-1634. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2491289C2 (ru) | Полинуклеотидные праймеры | |
| Tang et al. | Isocitrate dehydrogenase mutation hot spots in acute lymphoblastic leukemia and oral cancer | |
| CN110964833B (zh) | 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 | |
| JP2004097086A (ja) | エンドセリン１遺伝子中の多型を利用した高血圧症の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子 | |
| AU2017270496B2 (en) | Determination of genetic predisposition to aggressive prostate cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190930 |