RU2396345C1 - Method of obtaining population of neural differentiation induced stromal cells of fat tissue - Google Patents
Method of obtaining population of neural differentiation induced stromal cells of fat tissue Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396345C1 RU2396345C1 RU2008149105/13A RU2008149105A RU2396345C1 RU 2396345 C1 RU2396345 C1 RU 2396345C1 RU 2008149105/13 A RU2008149105/13 A RU 2008149105/13A RU 2008149105 A RU2008149105 A RU 2008149105A RU 2396345 C1 RU2396345 C1 RU 2396345C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- trkb
- bdnf
- population
- azacytidine
- Prior art date
Links
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 110
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 28
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims abstract description 25
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 claims abstract description 22
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 35
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 28
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 15
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 abstract description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 abstract description 3
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 abstract 1
- 208000023516 stroke disease Diseases 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 24
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 24
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 23
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 101150104041 eno2 gene Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 101710202239 Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 102000015534 trkB Receptor Human genes 0.000 description 9
- 108010064880 trkB Receptor Proteins 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 8
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 7
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 5
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 5
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 101150057182 GFAP gene Proteins 0.000 description 3
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N veratrole Chemical compound COC1=CC=CC=C1OC ABDKAPXRBAPSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 101150009249 MAP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000004462 astrocytic glia Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- 101150035467 BDNF gene Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 description 1
- 101000788517 Homo sapiens Tubulin beta-2A chain Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000006261 human tropomyosin-related kinase-B Human genes 0.000 description 1
- 108010058135 human tropomyosin-related kinase-B Proteins 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000037974 severe injury Diseases 0.000 description 1
- 230000009528 severe injury Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии с целью получения клеточного материала для восстановления нервной ткани, поврежденной в результате травм, инсультов или нейродегенеративных заболеваний, а также для тестирования лекарственных препаратов, влияющих на функциональную активность клеток нервной ткани и нейральных предшественников. Предлагается способ, позволяющий с помощью иммуносортинга с антителами против рецептора к нейротрофическому фактору мозга BDNF (TrkB) выделять из суммарной популяции стромальных клеток жировой ткани субпопуляцию прогениторных клеток, предрасположенных к нейральной дифференцировке, для последующей эффективной индукции нейральной дифференцировки этих клеток с помощью соответствующих факторов.The present invention relates to the field of cell biology and can be used in cell transplantology and tissue engineering to obtain cellular material for the restoration of nerve tissue damaged as a result of injuries, strokes or neurodegenerative diseases, as well as for testing drugs that affect the functional activity of nerve cells tissue and neural precursors. A method is proposed that allows using immunosorting with antibodies against the receptor for the neurotrophic brain factor BDNF (TrkB) to isolate from the total population of stromal cells of adipose tissue a subpopulation of progenitor cells predisposed to neural differentiation for the subsequent effective induction of neural differentiation of these cells using appropriate factors.
ВведениеIntroduction
Потеря трудоспособности в результате повреждений центральной нервной системы и периферических нервных волокон вследствие травм, инсультов или нейродегенеративных заболеваний связана с невозможностью полноценной регенерации нервной ткани. Как и другие соматические ткани человека, нервная ткань содержит небольшие количества так называемых стволовых клеток, которые в случае локального повреждения способны активироваться, подвергаться тканеспецифической дифференцировке и восстанавливать морфофункциональную целостность ткани. Однако при тяжелых повреждениях, а также у пациентов старшего возраста количество таких клеток оказывается недостаточным для полноценной репарации, поэтому наиболее перспективным подходом для лечения таких пациентов является трансплантация стволовых и прогениторных клеток. Эти клетки могут быть получены из собственной ткани пациента, наращены in vitro в необходимом количестве и введены в участок повреждения. В отличие от эмбриональных стволовых клеток, при использовании которых с терапевтической целью возникают этические и религиозные проблемы, опасность передачи инфекционных заболеваний и развития опухолей (тератом), а также отторжение чужеродного материала, применение собственных (аутологичных) клеток не сопряжено с подобными сложностями. Трансплантация аутологичных стволовых клеток, а также тканевых фрагментов, выращенных in vitro на их основе, уже сейчас успешно применяется для восстановления кожного покрова после ожогов, для замещения костных и хрящевых дефектов, а также для восстановления тканей после удаления раковых образований.Disability due to damage to the central nervous system and peripheral nerve fibers due to injuries, strokes or neurodegenerative diseases is associated with the inability to fully regenerate nerve tissue. Like other somatic human tissues, nerve tissue contains small amounts of so-called stem cells, which in the case of local damage can activate, undergo tissue-specific differentiation and restore the morphofunctional integrity of the tissue. However, in severe injuries, as well as in older patients, the number of such cells is insufficient for a full repair, therefore, stem cell and progenitor transplantation is the most promising approach for treating such patients. These cells can be obtained from the patient’s own tissue, grown in vitro in the required quantity and introduced into the lesion site. In contrast to embryonic stem cells, when used for therapeutic purposes, ethical and religious problems arise, the risk of transmission of infectious diseases and the development of tumors (teratomas), as well as rejection of foreign material, the use of one's own (autologous) cells is not fraught with similar difficulties. Transplantation of autologous stem cells, as well as tissue fragments grown in vitro based on them, is already successfully used to restore the skin after burns, to replace bone and cartilage defects, as well as to restore tissue after removal of cancerous formations.
В последние годы все большее внимание исследователей привлекает возможность использования в качестве источника аутологичных клеток стромальных клеток из жировой ткани, доступность получения которой в достаточном объеме практически для любого пациента сегодня позволяет рассматривать ее как оптимальный ресурс для клеточной терапии, в том числе и для регенерации нервной ткани.In recent years, researchers have been attracting more and more attention to the possibility of using stromal cells from adipose tissue as a source of autologous cells, the availability of which is sufficient for almost any patient today allows us to consider it as an optimal resource for cell therapy, including for the regeneration of nerve tissue .
Уровень техникиState of the art
Известно, что строма жировой ткани содержит малодифференцированные клетки-предшественники, которые по своему фенотипу и экспрессионному профилю сходны с мезенхимальными стволовыми клетками из костного мозга [6]. Стромальные клетки-предшественники из жировой ткани (СКЖТ) под действием различных индукторов способны дифференцироваться in vitro в различные типы клеток: остеобласты, хондробласты, адипоциты [1], гепатоциты, эндотелиальные клетки [16], миобласты [10], кардиомиоциты [12], эпителиальные клетки [3], а также нейральные предшественники [4].It is known that adipose stroma contains poorly differentiated progenitor cells, which in their phenotype and expression profile are similar to bone marrow mesenchymal stem cells [6]. Adipose tissue stromal precursor cells (SSC) under the influence of various inducers are able to differentiate in vitro into different types of cells: osteoblasts, chondroblasts, adipocytes [1], hepatocytes, endothelial cells [16], myoblasts [10], cardiomyocytes [12], epithelial cells [3], as well as neural precursors [4].
Нейральная дифференцировка стволовых клеток различного происхождения обычно сопровождается повышением экспрессии специфичных генов и, соответственно, появлением в клетке таких белков цитоскелета, как нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональная форма тубулина-β3, глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками МАР2, специфичная для нейронов енолаза Eno2 и некоторых других маркеров нейральной дифференцировки. Известно, что индуцировать нейральную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток, например клеток, происходящих из таких источников, как костный мозг, можно с помощью ретиноевой кислоты [7] и нейротрофических факторов [8, 15]. Что касается СКЖТ, то несмотря на повышенный интерес к этому источнику прогениторных клеток исследования, касающиеся их способности дифференцироваться в нейральном направлении в ответ на стимуляцию известными индукторами нейральной дифференцировки, носят эпизодический характер и пока не позволяют сделать какие-либо определенные выводы относительно механизмов нейральной дифференцировки и оптимальных условий получения популяции клеток, дифференцирующихся в этом направлении. В патенте США №7,078,230 [18] предлагается многостадийный способ получения предназначенной для трансплантации популяции стромальных клеток из жировой ткани, индуцированных к нейральной дифференцировке под действием ретиноевой кислоты, а в работе [19] в качестве индуктора нейральной дифференцировки СКЖТ, наряду с ретиноевой кислотой, предлагается использовать нейротрофический фактор BDNF. Этот способ предусматривает выделение популяции стромальных клеток из жировой ткани человека, культивирование их в стандартных условиях в течение 3-5 недель и индукцию нейральной дифференцировки, осуществляемую в два этапа: культивированием в течение 3 дней в бессывороточной среде, содержащей bFGF (20нг/мл) и hEGF (20нг/мл), которое сопровождается образованием нейросфер, и последующим 30-дневным культивированием в присутствии 10 нг/мл BDNF и 0,75 мМ ретиноевой кислоты (RA). Очевидными недостатками данного способа являются его длительность и недостаточная эффективность. Как сообщают авторы, после 30-дневной индукции BDNF и RA выраженные морфологические и иммуноцитохимические признаки нейральной дифференцировки проявляются примерно у половины клеток.Neural differentiation of stem cells of various origins is usually accompanied by an increase in the expression of specific genes and, accordingly, the appearance of cytoskeleton proteins such as nestin (a marker of early neural precursors), neuronal form of tubulin-β3, glial acidic fibrillar protein GFAP (marker of astrocytic glia), and protein interacting with MAP2 microtubules, specific for Eno2 enolase neurons and some other markers of neural differentiation. It is known that it is possible to induce neural differentiation of mesenchymal stem cells, for example, cells originating from sources such as bone marrow, using retinoic acid [7] and neurotrophic factors [8, 15]. As for SCLC, despite the increased interest in this source of progenitor cells, studies regarding their ability to differentiate in the neural direction in response to stimulation by the known inducers of neural differentiation are episodic in nature and do not yet allow any definitive conclusions to be drawn regarding the mechanisms of neural differentiation and optimal conditions for obtaining a population of cells differentiating in this direction. US patent No. 7,078,230 [18] proposes a multistage method for producing a population of stromal cells from adipose tissue intended for transplantation, induced to neural differentiation by retinoic acid, and in [19], as an inducer of neural differentiation, SCLC, along with retinoic acid, is proposed use the neurotrophic factor BDNF. This method involves isolating a population of stromal cells from human adipose tissue, culturing them under standard conditions for 3-5 weeks and inducing neural differentiation in two stages: culturing for 3 days in serum-free medium containing bFGF (20ng / ml) and hEGF (20ng / ml), which is accompanied by the formation of neurospheres, and subsequent 30-day cultivation in the presence of 10 ng / ml BDNF and 0.75 mm retinoic acid (RA). The obvious disadvantages of this method are its duration and lack of effectiveness. According to the authors, after 30-day induction of BDNF and RA, pronounced morphological and immunocytochemical signs of neural differentiation appear in about half of the cells.
Поскольку известные методы получения индуцированной к нейральной дифференцировке культуры СКЖТ, в том числе и рассмотренные выше, наиболее близкие к предлагаемому способу [19], представляются малопригодными для практических целей из-за их низкой эффективности, настоящее изобретение было направлено на решение общей задачи повышения этого показателя.Since the known methods for obtaining culture-induced SCJT culture, including those discussed above, closest to the proposed method [19], seem to be unsuitable for practical purposes because of their low efficiency, the present invention was directed to solving the general problem of increasing this indicator .
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Одной из наиболее вероятных причин низкой эффективности индукции СКЖТ под действием нейротрофических факторов может быть недостаточный уровень «чувствительности» суммарной популяции клеток к индуктору, поэтому в основу разработки нового метода получения индуцированной к нейральной дифференцировке популяции СКЖТ было положено выявление в суммарной популяции СКЖТ TrkB-позитивных клеток, чувствительных к действию избранных для индукции нейральной дифференцировки нейротрофических факторов, в частности нейротрофического фактора мозга (BDNF), и получение гомогенной культуры клеток, обогащенной TrkB-позитивными клетками, способными эффективно дифференцироваться в нейральном направлении.One of the most probable reasons for the low efficiency of induction of gastrointestinal tract under the influence of neurotrophic factors may be an insufficient level of “sensitivity” of the total cell population to the inducer, therefore, the basis for the development of a new method for obtaining an induction of neural differentiation of the gastrointestinal tract population was the identification of TrkB-positive cells in the total gastrointestinal tract population sensitive to the action of those selected for the induction of neural differentiation of neurotrophic factors, in particular the brain neurotrophic factor (BDNF), and obtaining a homogeneous culture enriched TrkB-positive cells, cells capable of differentiating into neural effectively direction.
Известно, что о готовности клеток воспринимать сигналы нейротрофических факторов можно судить по экспрессии на их поверхности рецепторов к этим факторам, в частности, к действию BDNF чувствительны клетки, экспрессирующие тирозинкиназный рецептор BDNF - TrkB. Этот рецептор экспрессируется на поверхности нейронов, а также на аксонах и дендритах во многих структурах головного мозга [17], а в эмбриогенезе TrkB обнаруживается в клетках моноцитарной-дендритной фракции во время формирования иннервации того или иного органа [5]. Именно посредством взаимодействия с этим рецептором BDNF поддерживает дифференцировку и выживаемость нейронов.It is known that the readiness of cells to receive signals of neurotrophic factors can be judged by the expression of receptors on their surface to these factors, in particular, cells expressing the tyrosine kinase BDNF receptor, TrkB, are sensitive to the action of BDNF. This receptor is expressed on the surface of neurons, as well as on axons and dendrites in many structures of the brain [17], and in embryogenesis, TrkB is found in the cells of the monocytic dendritic fraction during the formation of innervation of one or another organ [5]. It is through interaction with this receptor that BDNF supports the differentiation and survival of neurons.
С учетом этого, решаемая задача сводилась к попытке выявить в суммарной популяции СКЖТ клетки, несущие на своей поверхности рецептор нейротрофического фактора мозга (BDNF) TrkB, оценить их содержание в популяции и предложить подходящий метод для максимального обогащения культуры TrkB-содержащими клетками с тем, чтобы повысить «восприимчивость» культуры СКЖТ к последующей индукции с помощью данного фактора, а при установлении такой возможности - и другими известными индукторами нейральной дифференцировки.With this in mind, the task at hand was reduced to an attempt to identify cells containing TrkB neurotrophic brain factor receptor (BDNF) receptors on their surface, to evaluate their content in the population and to propose a suitable method for maximum enrichment of the culture with TrkB-containing cells so that to increase the “susceptibility” of the culture of gastrointestinal tract to subsequent induction using this factor, and when this possibility is established, by other well-known inducers of neural differentiation.
При осуществлении изобретения впервые было экспериментально установлено присутствие в суммарной популяции СКЖТ клеток, несущих на своей поверхности рецептор нейротрофического фактора мозга. В частности, с помощью ПЦР-анализа было обнаружено наличие клеток, экспрессирующих мРНК рецептора BDNF (пример 2а, фиг.1), а методом иммунофлуоресцентного окрашивания были выявлены клетки, содержащие антиген TrkB (пример 2б). По результатам цитометрического анализа доля клеток, несущих TrkB рецептор, в суммарной популяции была оценена как равная примерно 6%.When carrying out the invention, it was first experimentally established the presence in the total population of SCLC of cells carrying a neurotrophic factor factor receptor on their surface. In particular, using PCR analysis, the presence of cells expressing BDNF receptor mRNA was detected (Example 2a, FIG. 1), and cells containing TrkB antigen (Example 2b) were detected by immunofluorescence staining. According to the results of cytometric analysis, the proportion of cells carrying the TrkB receptor in the total population was estimated as equal to about 6%.
Для обогащения популяции СКЖТ TkrB-экспрессирующими клетками использовали два метода: метод иммуномагнитной селекции и метод проточной цитофлуориметрии; при этом в обоих случаях удалось получить по существу гомогенную популяцию клеток (более 90%) TrkB-содержащих СКЖТ.Two methods were used to enrich the SCLC population with TkrB-expressing cells: immunomagnetic selection method and flow cytofluorimetry method; in both cases, it was possible to obtain a substantially homogeneous population of cells (more than 90%) of TrkB-containing SCLC.
Анализ полученной фракции TrkB-позитивных клеток на экспрессию соответствующих маркеров, свидетельствующих о потенциальной способности этих клеток к нейральной дифференцировке, включавший определение содержания в клетках мРНК специфичных маркерных белков, выявил присутствие мРНК нестина и тубулина-β3, а также нейротрофических факторов роста HGF и BDNF; при этом содержание всех названных мРНК в этих клетках было в несколько раз выше, чем в TrkB-негативных СКЖТ (пример 4, фиг.3).Analysis of the obtained fraction of TrkB-positive cells for the expression of the corresponding markers, indicating the potential of these cells for neural differentiation, including determining the content of specific marker proteins in mRNA cells, revealed the presence of nestin and tubulin-β3 mRNA, as well as neurotrophic growth factors HGF and BDNF; at the same time, the content of all the mRNAs mentioned in these cells was several times higher than in TrkB-negative SKZhT (example 4, figure 3).
Полученную субпопуляцию TrkB-содержащих клеток индуцировали к нейральной дифференцировке путем помещения клеток в дифференцировочную среду DMEM/10% FBS, содержащую BDNF (в сравнительном эксперименте - ретиноевую кислоту в сочетании с 5-азацитидином). Оценка эффективности индукции, предусматривавшая определение экспрессии на уровне транскрипции маркерных генов нейральной дифференцировки (нестина, тубулина-β3 и нейронспецифической енолазы Eno2) показала, что в клетках, индуцированных BDNF, уже через 3 дня количество мРНК нестина, тубулина и Eno2 увеличивается в 3-6 раз. Через 7 дней после индукции в этих клетках также возрастало содержание соответствующих белков (Пример 5). При индукции TrkB-экспрессирующих СКЖТ ретиноевой кислотой в целом наблюдались сходные, хотя и менее выраженные, изменения. В результате прямого эксперимента по трансплантации гомогенной популяции Trk-экспрессирующих СКЖТ, полученной и индуцированной согласно предложенному методу, в головной мозг мыши было установлено, что в течение 10 дней наблюдения трансплантированные клетки сохраняли жизнеспособность и демонстрировали миграцию из области введения в паренхиму мозга реципиента, тогда как контрольные клетки суммарной популяции СКЖТ оставались в области трека и не обнаруживали контакта с тканью пациента.The resulting subpopulation of TrkB-containing cells was induced to neural differentiation by placing cells in a differentiation medium DMEM / 10% FBS containing BDNF (in a comparative experiment, retinoic acid in combination with 5-azacytidine). Evaluation of the effectiveness of induction, which involved the determination of expression at the level of transcription of marker genes for neural differentiation (nestin, tubulin-β3 and neuron-specific enolase Eno2) showed that in 3 days BDNF-induced cells increase the amount of nestin, tubulin and Eno2 mRNA in 3-6 time. 7 days after induction, the content of the corresponding proteins also increased in these cells (Example 5). The induction of TrkB-expressing SCLT with retinoic acid generally showed similar, albeit less pronounced, changes. As a result of a direct experiment on transplantation of a homogeneous population of Trk-expressing gastrointestinal tract, obtained and induced according to the proposed method, into the mouse brain, it was found that during the 10 days of observation the transplanted cells remained viable and showed migration from the area of introduction into the recipient brain parenchyma, whereas control cells of the total population of gastrointestinal tract remained in the region of the track and did not show contact with the patient’s tissue.
Таким образом, сущность предлагаемого изобретения заключается в получении суммарной популяции СКЖТ, выявлении и выделении из суммарной популяции субпопуляции TrkB-позитивных клеток с помощью иммуномагнитной селекции или иммуносортинга с использованием антител против рецептора TrkB, и индукции нейральной дифференцировки нейротрофическим фактором BDNF или ретиноевой кислотой в сочетании с 5-азацитидином. Преимуществом (техническим результатом) предлагаемого способа перед известными ранее способами является повышение эффективности индукции нейральной дифференцировки и сокращение общих сроков подготовки культуры к трансплантации, о возможности которой однозначно свидетельствует показанная в прямом эксперименте высокая жизнеспособность индуцированных TrkB-позитивных СКЖТ и их способность интегрироваться в ткань реципиента.Thus, the essence of the present invention is to obtain a total population of SLCT, to identify and isolate from a total population a subpopulation of TrkB-positive cells using immunomagnetic selection or immunosorting using antibodies against the TrkB receptor, and the induction of neural differentiation by neurotrophic factor BDNF or retinoic acid in combination with 5-azacytidine. An advantage (technical result) of the proposed method over previously known methods is an increase in the efficiency of the induction of neural differentiation and a reduction in the general time for preparing the culture for transplantation, the possibility of which is clearly demonstrated by the direct viability of the induced TrkB-positive SLE and their ability to integrate into the recipient tissue.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1. Содержание мРНК TrkB в суммарной популяции СКЖТ. Продукт амплификации фрагмента транскрипта TrkB (83 пн) указан стрелкой.Figure 1. The content of TrkB mRNA in the total population of SCLC. The amplification product of the TrkB transcript fragment (83 bp) is indicated by the arrow.
Фиг.2. Анализ содержания клеток, экспрессирующих TrkB, в суммарной популяции СКЖТ с помощью проточной цитометрии. Косая штриховка соответствует клеткам, инкубированным с контрольными иммуноглобулинами, вертикальная штриховка - клеткам, окрашенным антителами против TrkB). R5 - область подсчета позитивно окрашенных клеток.Figure 2. Analysis of the content of cells expressing TrkB in the total population of SCLC using flow cytometry. Oblique hatching corresponds to cells incubated with control immunoglobulins, vertical hatching corresponds to cells stained with antibodies against TrkB). R5 is the area of counting positively stained cells.
Фиг.3. Сравнительный анализ содержания мРНК маркерных генов нейральной дифференцировки и нейротрофических факторов в субпопуляциях СКЖТ, экспрессирующих и не экспрессирующих TrkB. По оси абсцисс - аббревиатуры тестируемых генов, по оси ординат - уровень мРНК анализируемых генов, нормированный по содержанию мРНК двух генов домашнего хозяйства (GAPDH, β-actin). Черные столбики - клетки, экспрессирующие TrkB, белые столбики - клетки, не экспрессирующие TrkB.Figure 3. Comparative analysis of the mRNA content of marker genes for neural differentiation and neurotrophic factors in subpopulations of SQT expressing and not expressing TrkB. On the abscissa axis are abbreviations of the tested genes, on the ordinate axis is the mRNA level of the analyzed genes, normalized by the mRNA content of two household genes (GAPDH, β-actin). Black bars are cells expressing TrkB, white bars are cells not expressing TrkB.
Фиг.4. Содержание маркерных белков нейральной дифференцировки в субпопуляциях СКЖТ, экспрессирующих и не экспрессирующих TrkB до и после индукции. Левая колонка панелей - детектирование нестина; правая колонка панелей - детектирование β3-тубулина. А, Б - субпопуляции СКЖТ, не экспрессирующих TrkB, до индукции; В, Г - субпопуляции СКЖТ, экспрессирующих TrkB, до индукции; Д, Е - субпопуляции СКЖТ, экспрессирующих TrkB, после воздействия BDNF в сочетании с 5-азацитидином.Figure 4. The content of marker proteins of neural differentiation in subpopulations of SCLC expressing and not expressing TrkB before and after induction. Left column of panels - Nestin detection; right column of panels - detection of β3-tubulin. A, B — subpopulations of SCLC not expressing TrkB before induction; C, D - subpopulations of SCLC expressing TrkB before induction; D, E - subpopulations of SLCT expressing TrkB after exposure to BDNF in combination with 5-azacytidine.
Фиг.5. Распределение GFP-меченных клеток в стриатуме мозга через 10 дней после трансплантации. Верхняя панель - индуцированная (BDNF) субпопуляция СКЖТ, не экспрессирующих TrkB; нижняя панель - индуцированная (BDNF) субпопуляция СКЖТ, экспрессирующих TrkB.Figure 5. Distribution of GFP-labeled cells in the striatum of the
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам методики по культивированию клеток, описанные также в цитированных источниках.When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, well-known cell culture techniques were used, which are also described in the cited sources.
Пример 1Example 1
Выделение стромальных клеток из жировой тканиIsolation of stromal cells from adipose tissue
Для работы использовали СКЖТ человека и мыши. СКЖТ были выделены по протоколу Zuk et al. [19]. Подкожная жировая клетчатка была получена в ходе полостных операций у неонкологических пациентов, средний возраст которых составлял 40-60 лет. Мышиные СКЖТ были выделены из подкожного жира паховой области самцов линии Black6. Жировую ткань измельчали ножницами, затем обрабатывали ферментами и коллагеназой («Invitrogen», США, 30 ед. на мл ткани) и протеазой («Gibco», США, 200 ед. на мл ткани) в течение 40 мин при 37°С при постоянном помешивании. По прошествии этого времени в суспензию добавляли равный объем среды DMEM («Gibco», США) c 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, «Gibco», США) и центрифугировали 5-10 мин при 900 оборотов в минуту. Осадок, в котором находилась фракция стромально-васкулярных клеток, ресуспендировали в DMEM, с 10% FBS и фильтровали через 100-мм клеточный фильтр (BD Biosciences, Bedford, MA), далее клетки высаживали на культуральные чашки Петри («Costar Corning», США) и помещали в CO2-инкубатор при 37°С и 5%. На следующий день в чашках меняли среду. Таким образом, в культуре оставались только прикрепившиеся клетки. По достижении монослоя клетки снимали трипсином и рассаживали в соотношении 1:2.For work, human and mouse SCLC were used. SST were isolated by protocol of Zuk et al. [19]. Subcutaneous fatty tissue was obtained during abdominal operations in non-cancer patients, the average age of which was 40-60 years. Mouse SQWs were isolated from subcutaneous fat of the inguinal region of the Black6 male line. Adipose tissue was chopped with scissors, then treated with enzymes and collagenase (Invitrogen, USA, 30 units per ml of tissue) and protease (Gibco, USA, 200 units per ml of tissue) for 40 min at 37 ° C at a constant stirring. After this time, an equal volume of DMEM medium (Gibco, USA) with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) was added to the suspension and centrifuged for 5-10 min at 900 rpm. The pellet containing the stromal-vascular cell fraction was resuspended in DMEM with 10% FBS and filtered through a 100 mm cell filter (BD Biosciences, Bedford, MA), then the cells were plated on Petri culture dishes (Costar Corning, USA ) and placed in a CO 2 incubator at 37 ° C and 5%. The next day, cups changed the environment. Thus, only adherent cells remained in the culture. Upon reaching the monolayer, the cells were removed with trypsin and planted in a ratio of 1: 2.
Пример 2Example 2
Исследование суммарной популяции СКЖТ на наличие клеток, экспрессирующих рецептор TrkBThe study of the total population of SZHT for the presence of cells expressing the TrkB receptor
а) Определение содержания мРНК TrkBa) Determination of TrkB mRNA Content
Cуммарную РНК из клеток выделяли с помощью набора для выделения РНК («RNeasy Mini Kit», «QIAGEN», США) согласно протоколу фирмы-производителя. Все процедуры по выделению РНК и синтезу кДНК проводили на льду в ламинарном боксе. Концентрацию тотальной РНК определяли на спектрофотометре Bio Photometer (Eppendorf). Качество выделенной РНК контролировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Затем на матрице синтезировали к ДНК согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго-dT-праймеры. Для этого РНК смешивали с Oligo (dT)18 primer (Fermentas, 0,5 мкг/мкл) (на каждые 10 мкл РНК необходимо добавить 1 мкл Oligo (dT)18 primer). Смесь инкубировали 5 минут при 70°С. После инкубации к смеси добавляли 4 мкл 5х reaction buffer (Fermentas) и 2 мкл 10 mM dNTP mix (Fermentas) (на каждые 10 мкл РНК). Смесь инкубировали 5 мин при 37°С. После инкубации в смесь добавляли 2 мкл M-Mul V reverse transcriptase (Fermentas, 20 u/µl) (на каждые 10 мкл PНK). Полученную смесь инкубировали 60 мин при 37°С. Останавливали реакцию нагреванием смеси до 70°С в течение 10 минут. Синтезированную кДНК замораживали и хранили на - 20°С.Total RNA from cells was isolated using an RNA isolation kit (RNeasy Mini Kit, QIAGEN, USA) according to the manufacturer's protocol. All procedures for RNA isolation and cDNA synthesis were performed on ice in a laminar box. The concentration of total RNA was determined using a Bio Photometer (Eppendorf) spectrophotometer. The quality of the isolated RNA was monitored by electrophoresis on a 1% agarose gel. Then, DNA was synthesized on a matrix according to the standard protocol of the Fermentas company using oligo-dT primers. For this, RNA was mixed with Oligo (dT) 18 primer (Fermentas, 0.5 μg / μl) (for every 10 μl of RNA, 1 μl of Oligo (dT) 18 primer must be added). The mixture was incubated for 5 minutes at 70 ° C. After incubation, 4 μl of 5x reaction buffer (Fermentas) and 2 μl of 10 mM dNTP mix (Fermentas) (for every 10 μl of RNA) were added to the mixture. The mixture was incubated for 5 min at 37 ° C. After incubation, 2 μl of M-Mul V reverse transcriptase (Fermentas, 20 u / μl) was added to the mixture (for every 10 μl of PHK). The resulting mixture was incubated for 60 min at 37 ° C. The reaction was stopped by heating the mixture to 70 ° C for 10 minutes. The synthesized cDNA was frozen and stored at - 20 ° C.
Анализ экспрессии гена TrkB проводили методом ПРЦ в реальном времени с применением Sybr Green («Синтол», Россия). При этом использовали праймеры и температуры отжига, представленные в таблице 1.TrkB gene expression analysis was performed by real-time PCR using Sybr Green (Syntol, Russia). In this case, primers and annealing temperatures shown in Table 1 were used.
Результаты электрофоретического анализа ПЦР-продукта (Фиг.1) однозначно свидетельствовали о том, что СКЖТ второго пассажа содержат мРНК TrkB.The results of the electrophoretic analysis of the PCR product (Figure 1) unequivocally indicated that the second passage SCLC contained TrkB mRNA.
б) Цитофлуориметрияb) Cytofluorimetry
Полученные СКЖТ были проанализированы на наличие экспрессии рецептора TrkB на поверхности анализируемых клеток. Для этого суспензию одиночных клеток (0,5-1 X 106 клеток) нулевого пассажа в 500 µl буфера PBS (phosphate buffered saline) инкубировали с первичными антителами против TrkB (Abeam, # ab51190) в течение 40 минут при комнатной температуре. После трехкратной отмывки в PBS проводили инкубацию клеток со вторичными антителами против антител кролика (Jacson Immunoresearch, # 111-175-144), мечеными Су5, в течение 40 минут. Флуоресценцию клеток после окрашивания оценивали методом проточной цитометрии на приборе MoFlo (Dako Cytomation) и анализировали с помощью программы Summit 4.1. В каждом эксперименте для подтверждения специфичности окрашивания использовался изотипический иммуноглобулиновый контроль: клетки, инкубированные с неспецифическими иммуноглобулинами, а затем со вторичным антителами. В результате анализа более 300000 клеток было подтверждено наличие среди них клеток, экспрессирующих рецептор TrkB. По данным проточной цитометрии доля таких клеток в суммарной популяции СКЖТ составляла 6±2,5%.The obtained SLCTs were analyzed for the expression of TrkB receptor on the surface of the analyzed cells. For this, a suspension of single cells (0.5-1
в) Оценка способности выделенных СКЖТ к нейральной дифференцировке методом иммунофлуоресцентного окрашиванияc) Evaluation of the ability of the isolated SCZH to neural differentiation by immunofluorescence staining
Для оценки способности выделенных клеток к нейральной дифференцировке определялось содержание в них основных маркерных белков после индукции in vitro. В эксперименте использовали СКЖТ 2-го пассажа. Клетки в среде, описанной в примере 1, высаживали на 8-луночные стеклянные плашки (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) и на следующий день добавляли BDNF (20 нг/мл) или ретиноевую кислоту (1mM) в сочетании с 5-азацитидином (1mM). Через 3 дня индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую соответствующие индукторы, культивировали еще 4 дня и фиксировали для анализа методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Фиксацию клеток проводили в 4% растворе формалина (Sigma, США) 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-кратной отмывкой PBS. После отмывки клетки покрывали 1% раствором БСА (бычий сывороточный альбумин) c 10% козьей сывороткой в течение 30 мин и инкубировали при комнатной температуре с кроличьими антителами против нестина (Chemicon, 1:100), Eno2 (Chemicon, 1:50) и мышиными против тубулина (Abcam, 1:100) в течение 1 часа. В качестве отрицательного контроля использовался 1% раствор БСА c 10% козлиной сывороткой. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин при комнатной температуре инкубировали в растворе PBS с флуоресцентно меченными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулинов мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США). При этом исходно в выделенных СКЖТ наблюдали либо отсутствие экспрессии нестина, либо низкий уровень экспрессии нестина и β3-тубулина, а после инкубации клеток в присутствии BDNF и 5-азацитидина наблюдали увеличение содержания обоих маркерных белков, что свидетельствовало о потенциальной возможности индукции нейральной дифференцировки в полученной популяции клеток (данные не представлены).To assess the ability of the isolated cells to neural differentiation, the content of major marker proteins after in vitro induction was determined. In the experiment used SCZT 2nd passage. Cells in the medium described in Example 1 were plated on 8-well glass plates (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) And the next day BDNF (20 ng / ml) or retinoic acid (1mM) was added in combination with 5 α-azacytidine (1mM). After 3 days, the inducing medium was changed to fresh, also containing the corresponding inducers, cultured for another 4 days and fixed for analysis by immunofluorescence staining. The cells were fixed in 4% formalin solution (Sigma, USA) for 2 min at room temperature, followed by 3-fold washing with PBS. After washing, the cells were coated with 1% BSA solution (bovine serum albumin) with 10% goat serum for 30 min and incubated at room temperature with rabbit antibodies against nestin (Chemicon, 1: 100), Eno2 (Chemicon, 1:50) and mouse against tubulin (Abcam, 1: 100) for 1 hour. A 1% BSA solution with 10% goat serum was used as a negative control. After washing in PBS, the cells were incubated for 30 min at room temperature in a PBS solution with fluorescently labeled secondary goat antibodies (1: 100) against mouse immunoglobulins (Alexa 488, Molecular Probes, USA) or against rabbit immunoglobulin (Alexa 568, Molecular Probes, USA). At the same time, either the absence of nestin expression or a low level of expression of nestin and β3-tubulin was observed in the isolated SCLTs, and after cell incubation in the presence of BDNF and 5-azacytidine, an increase in the content of both marker proteins was observed, which indicated the potential for the induction of neural differentiation in the resulting cell populations (data not shown).
Пример 3Example 3
Получение субпопуляции TrkB-содержащих клеток из суммарной популяции СКЖТObtaining a subpopulation of TrkB-containing cells from the total population of SCLC
Фракцию клеток, несущих TrkB, из суммарной популяции СКЖТ получали с помощью иммуномагнитной селекции или проточной цитофлуориметрии.A fraction of cells carrying TrkB from the total population of SCLC was obtained using immunomagnetic selection or flow cytofluorimetry.
Для иммуномагнитного сортинга клеток использовали магнитные частицы размером 40 нм, коньюгированные с антителами против кроличьих IgG, (Dynabeads®Pan Rabbit IgG, prod. No 110.41). Магнитные частицы отмывали от азида натрия и инкубировали с кроличьими антителами против TrkB человека в течение 40 минут на льду при постоянном помешивании. После окончания инкубации пробирку с магнитными частицами помещали в магнит и отмывали от несвязавшихся антител. Все манипуляции проводили в стерильных условиях культурального бокса. Затем подготовленные магнитные частицы инкубировали с суспензией СКЖТ в течение 1 часа при постоянном покачивании на льду. После инкубации клетки помещали в магнит и разделяли на две фракции: связавшиеся с магнитными частицами TrkB-позитивные клетки и оставшиеся в суспензии TrkB-негативные клетки. Чистота полученной фракции TrkB-экспрессирующих клеток составляла более 90%.For immunomagnetic cell sorting, 40 nm magnetic particles conjugated with antibodies against rabbit IgG were used (Dynabeads® Pan Rabbit IgG, prod. No 110.41). The magnetic particles were washed from sodium azide and incubated with rabbit antibodies against human TrkB for 40 minutes on ice with constant stirring. After incubation, the tube with magnetic particles was placed in a magnet and washed from unbound antibodies. All manipulations were performed under sterile conditions of the culture box. Then, the prepared magnetic particles were incubated with a suspension of SCLC for 1 hour with constant swaying on ice. After incubation, the cells were placed in a magnet and separated into two fractions: TrkB-positive cells bound to magnetic particles and TrkB-negative cells remaining in suspension. The purity of the obtained TrkB-expressing cell fraction was more than 90%.
Сортинг клеток с использованием метода проточной цитофлуориметрии проводили, как описано в примере 26. Клетки разделяли в режиме сортировки на две популяции, экспрессирующих и не экспрессирующих рецептор TrkB. Чистота полученной фракции TrkB-позитивных клеток составляла 90%-98%.Sorting of the cells using flow cytometry was performed as described in Example 26. The cells were sorted into two populations expressing and not expressing the TrkB receptor. The purity of the obtained TrkB-positive cell fraction was 90% -98%.
Пример 4Example 4
Сравнительный анализ экспрессии маркерных генов в субпопуляции Trk-позитивных и субпопуляции TrkB- негативных СКЖТComparative analysis of marker gene expression in a subpopulation of Trk-positive and a subpopulation of TrkB-negative SZHT
Суммарную РНК получали, как описано в примере 2а. Анализ экспрессии генов проводили методом ПРЦ в реальном времени с применением Sybr Green («Синтол», Россия).Total RNA was obtained as described in example 2A. Gene expression analysis was performed by real-time PCR using Sybr Green (Syntol, Russia).
Для каждого исследуемого гена готовили смесь праймеров forward и reverse в экспериментально подобранных количествах. Для приготовления одной пробы использовали 10 мкл реакционной смеси, содержащей SYBR Green (Синтол), 13 мкл ddH2O (Синтол), 1 мкл смеси праймеров и 1 мкл кДНК ДНК исследуемых клеток. Для приготовления NTC (non-template control) проб вместо кДНК добавляли 1 мкл ddH2O (Синтол). ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили на приборе IQ5 (BioRad) с помощью программного обеспечения IQ5 2.0 Optical system software (BioRad). Температура отжига для смеси праймеров для каждого исследуемого гена также была предварительно подобрана экспериментально.For each studied gene, a mixture of forward and reverse primers was prepared in experimentally selected amounts. To prepare one sample, 10 μl of the reaction mixture containing SYBR Green (Synthol), 13 μl of ddH 2 O (Synthol), 1 μl of the primer mixture and 1 μl of DNA cDNA of the studied cells were used. To prepare NTC (non-template control) samples, 1 μl of ddH 2 O (Synthol) was added instead of cDNA. Real-time PCR was performed on an IQ5 instrument (BioRad) using the IQ5 2.0 Optical system software (BioRad). The annealing temperature for the primer mixture for each studied gene was also preliminarily selected experimentally.
Последовательности праймеров и температуры отжига для каждого из тестируемых генов представлены в таблице 1.The primer sequences and annealing temperatures for each of the tested genes are presented in table 1.
При этом было установлено, что в субпопуляции TrkB- позитивных СКЖТ представлена мРНК таких маркерных генов нейральной дифференцировки, как нестин и β3 тубулин (Фиг.3). В результате анализа субпопуляции клеток, не содержащих специфического рецептора BDNF (TrkB), также было выявлено присутствие мРНК указанных генов, однако количество соответствующих мРНК в этих клетках было в несколько раз ниже, чем в клетках, экспрессирующих TrkB (Фиг.3). Следует отметить, что в TrkB-позитивных клетках также было обнаружено более высокое содержание мРНК нейротрофических факторов роста, в частности HGF и BDNF.It was found that in the subpopulation of TrkB-positive SLE, mRNA of such marker neural differentiation genes as nestin and β3 tubulin is presented (Figure 3). The analysis of a subpopulation of cells that do not contain a specific BDNF receptor (TrkB) also revealed the presence of mRNA of these genes, however, the number of corresponding mRNA in these cells was several times lower than in cells expressing TrkB (Figure 3). It should be noted that in TrkB-positive cells a higher content of mRNA of neurotrophic growth factors, in particular HGF and BDNF, was also found.
Пример 5Example 5
Индукция нейральной дифференцировки in vitro и исследование показателей нейральной дифференцировки клеток, экспрессирующих TrkBInduction of neural differentiation in vitro and study of indicators of neural differentiation of cells expressing TrkB
а) Проверка эффективности различных индукторов дифференцировкиa) Testing the effectiveness of various differentiation inducers
Нейральная дифференцировка клеток сопровождается повышением экспрессии специфичных генов. В частности, клетки, дифференцирующиеся в нейральном направлении, содержат белок цитоскелета нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональную форму тубулина-β3, глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками МАР2, специфичную для нейронов енолазу Eno2 и другие маркеры нейральной дифференцировки.Neural cell differentiation is accompanied by increased expression of specific genes. In particular, cells that differentiate in the neural direction contain the cytoskeleton protein Nestin (a marker of early neural precursors), the neuronal form of tubulin-β3, the glial acidic fibrillar protein GFAP (a marker of astrocytic glia), a protein that interacts with MAP2 microtubules specific for Enol2 enolase and other markers of neural differentiation.
Нами было проанализировано содержание продуктов перечисленных выше маркерных генов нейральной дифференцировки в СКЖТ, инкубированных в присутствии различных индукционных факторов, включая IBMX, Р-меркаптоэтанол, 5-азацитидин [1, 4, 11], а также нейротрофических факторов роста BDNF и GDNF (таблица 1). Продукт гена GFAP не детектировался ни в контрольных СКЖТ, ни в клетках, инкубированных в присутствии индукторов, перечисленных в таблице 1. Анализ содержания мРНК других маркерных генов показал, что уровень экспрессии Eno2, МАР2, TUBB и Nestin был выше в клетках, инкубированных в присутствии ретиноевой кислоты или BDNF на фоне 5-азацитидина (таблица 2).We analyzed the content of the products of the above marker neural differentiation marker genes in SQT incubated in the presence of various induction factors, including IBMX, P-mercaptoethanol, 5-azacytidine [1, 4, 11], as well as neurotrophic growth factors BDNF and GDNF (table 1 ) The GFAP gene product was not detected either in the control SQT or in the cells incubated in the presence of the inducers listed in Table 1. Analysis of the mRNA content of other marker genes showed that the expression level of Eno2, MAP2, TUBB and Nestin was higher in cells incubated in the presence of retinoic acid or BDNF on the background of 5-azacytidine (table 2).
Однако в СКЖТ, культивированных в присутствии других индукторов нейральной дифференцировки, увеличения уровня мРТПС маркерных генов не наблюдалось (таблица 3).However, in SCLC cultured in the presence of other neural differentiation inducers, no increase in the level of mRTPS marker genes was observed (table 3).
На основании полученных результатов для индукции нейральной дифференцировки СКЖТ были выбраны сочетания ретиноевой кислоты или BDNF с 5-азацитидином. При индукции дифференцировки СКЖТ, полученных от 8 доноров, было установлено, что при культивировании клеток в присутствии ретиноевой кислоты в сочетании с 5-азацитидином в них возрастает уровень мРНК нестина и тубулина. Индукция нейральной дифференцировки клеток с помощью сочетания BDNF с 5-азацитидином вызывает увеличение экспрессии всех 4 проанализированных генов (таблица 3).Based on the results, combinations of retinoic acid or BDNF with 5-azacytidine were chosen to induce the neural differentiation of SCLC. By inducing differentiation of SCLC obtained from 8 donors, it was found that upon culturing cells in the presence of retinoic acid in combination with 5-azacytidine, the levels of nestin and tubulin mRNA increase in them. Induction of neural cell differentiation using a combination of BDNF with 5-azacytidine causes an increase in the expression of all 4 analyzed genes (table 3).
Эти данные были подтверждены с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания индуцированных клеток. Так, было обнаружено, что инкубация клеток с ретиноевой кислотой приводит к повышению содержания в них нестина и β3-тубулина, а в СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF, возрастает содержание как нестина и β3-тубулина, так и специфичной для нейронов енолазы Eno2.These data were confirmed by immunofluorescence staining of induced cells. Thus, it was found that incubation of cells with retinoic acid leads to an increase in the content of nestin and β3-tubulin in them, and in the SCLC cultured in the presence of BDNF, the content of both nestin and β3-tubulin, as well as Eno2-specific enolase, increases.
б) Определение содержания мРНК до и после индукцииb) Determination of mRNA content before and after induction
Обе субпопуляции клеток СКЖТ 2-го пассажа (TrkB-позитивые и ТгкВ-негативные), полученные в результате сортинга, как описано в примере 3, высаживали в 6-луночный планшет в плотности 40-50% монослоя в среду DMEM с добавлением 10% FBS. На следующий день среду заменяли на DMEM/3% FBS, к которой добавляли BDNF в конечной концентрации 20 нг/мл в сочетании с 5-азацитидином (1 мM). Через 3 дня индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую индуктор, культивировали еще 4 дня и далее проводили определение содержания мРНК, как описано в примере 4.Both subpopulations of
Было установлено, что обе субпопуляции клеток демонстрируют после индукции BDNF in vitro возрастание уровня мРНК нестина, тубулина, белка MAP и нейронспецифичной енолазы. Однако индукция нейральной дифференцировки TrkB-экспрессирующих клеток на уровне транскрипции названных генов была выражена в значительно большей степени, чем в клетках, не экспрессирующих этот рецептор. В субпопуляции TrkB-позитивных СКЖТ уже через 3 дня количество мРНК нестина, тубулина, Eno2 и МАР-2 увеличивалось в 3-6 раз. Через 7 дней после индукции в этих клетках также возрастало содержание соответствующих белков.Both cell subpopulations were found to demonstrate an increase in mRNA levels of nestin, tubulin, MAP protein and neuron-specific enolase after BDNF induction in vitro. However, the induction of the neural differentiation of TrkB-expressing cells at the level of transcription of these genes was much more pronounced than in cells not expressing this receptor. In a subpopulation of TrkB-positive SLE, after 3 days the amount of mRNA of nestin, tubulin, Eno2 and MAP-2 increased by 3-6 times. 7 days after induction, the content of the corresponding proteins also increased in these cells.
Следует отметить, что аналогичный, хотя и несколько менее выраженный, эффект наблюдался при индукции клеток ретиноевой кислотой (1 мМ) в сочетании с 5-азацитидином (1 мМ).It should be noted that a similar, although somewhat less pronounced, effect was observed upon induction of cells with retinoic acid (1 mM) in combination with 5-azacytidine (1 mM).
в) Определение содержания специфических антигенов методом иммунофлуоресцентного окрашиванияc) Determination of the content of specific antigens by immunofluorescence staining
TrkB-экспрессирующие и TrkB-неэкспрессирующие СКЖТ 2-го пассажа клетки высаживали на 8-луночные стеклянные плашки (Lab-Tek Chamber Slide, Nalge Nunc Int.) в среде DMEM с добавлением 3% FBS. На следующий день добавляли BDNF в той же концентрации, что и в примере 5. Через 3 дня индуцирующую среду меняли на свежую, также содержащую индуктор, культивировали еще 4 дня и фиксировали для анализа. Фиксацию проводили в 4% растворе формалина (Sigma, США) в течение 2 мин при комнатной температуре с последующей 3-кратной отмывкой PBS. После отмывки клетки инкубировали в 1% растворе БСА (бычий сывороточный альбумин) с 10% козьей сывороткой в течение 30 мин, далее инкубировали с кроличьими антителами против Nestin (Chemicon, 1:100), Eno2 (Chenicon, 1:50) и мышиными против β3-tubulin (Abeam, 1:100) в течение 1 часа при комнатной температуре. После отмывки в PBS клетки в течение 30 мин инкубировали в растворе PBS с флуоресцентно-меченными вторичными козьими антителами (1:100) против иммуноглобулина мыши (Alexa 488, Molecular Probes, США) или против иммуноглобулина кролика (Alexa 568, Molecular Probes, США). В качестве контроля использовали клетки, окрашенные только вторичными антителами. Полученные результаты показали, что в TrkB-экспрессирующих СКЖТ, культивированных в присутствии BDNF и 5-азацитидина, возрастает содержание нестина и β3-тубулина, а также специфичной для нейронов енолазы Еno2. В TrkB-неэкспрессирующих клетках достоверных отличий в содержании нестина, β3-тубулина и енолазы Eno2 до и после индукции не наблюдалось (данные не приводятся).Cells expressing TrkB-expressing and TrkB-non-expressing SCLC of
В аналогичном эксперименте с индукцией ретиноевой кислотой наблюдалось повышение содержания двух белков: нестина и β3-тубулина.In a similar experiment with retinoic acid induction, an increase in the content of two proteins was observed: nestin and β3-tubulin.
Пример 6Example 6
Трансплантация индуцированных мышиных СКЖТ в стриатум мышиTransplantation of Induced Murine SLE into Mouse Striatum
Проведено сравнение способности клеток СКЖТ TrkB-позитивных и TrkB-негативных интегрироваться в ткани мозга после трансплантации. Для этого свежевыделенные СКЖТ мышей линии В16, трансгенных по гену GFP, сортировали по экспрессии TrkB, получая TrkB-позитивные и TrkВ-негативные субпопуляции клеток, индуцировали их нейральную дифференцировку, как описано в примере 5, и далее инъецировали в стриатум мышей линии В16 при помощи шприца.The ability of TrkB-positive and TrkB-negative SKJT cells to integrate into brain tissue after transplantation was compared. For this, the freshly isolated SCLC of B16 mice transgenic for the GFP gene were sorted by TrkB expression, obtaining TrkB-positive and TrkB-negative subpopulations of cells, their neural differentiation was induced, as described in Example 5, and then injected into the striatum of B16 mice using syringe.
Через 10 дней мышей перфузировали 4% формалином, извлекали головной мозг и фиксировали 3-5 часов в 4% формалине, затем инкубировали 10-16 часов в 30% сахарозе и замораживали. Далее делали срезы толщиной 20 мкм на криостате (НМ 505 Е, Microm, Германия). Готовые препараты хранили при +4°С в темноте. Полученные препараты (Фиг.5) анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Zeiss). Документирование изображений производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC (Zeiss, Германия) и обработки изображения в программе Axiovision 3.1. Индуцированные in vitro СКЖТ клетки, не экспрессирующие TrkB, за указанное время не обнаруживали вступления в контакт с тканью реципиента и оставались в области трека. За тот же период времени клетки, экспрессирующие TrkB, будучи индуцированы в направлении нейральной дифференцировки, демонстрировали выраженную миграцию в паренхиму мозга (Фиг.5).After 10 days, the mice were perfused with 4% formalin, the brain was removed and fixed for 3-5 hours in 4% formalin, then they were incubated for 10-16 hours in 30% sucrose and frozen. Next, sections were made with a thickness of 20 μm on a cryostat (NM 505 E, Microm, Germany). Finished preparations were stored at + 4 ° C in the dark. The resulting preparations (Figure 5) were analyzed using an Axiovert 200M fluorescence microscope (Zeiss). Image documentation was performed using an Axiocam HRC digital video camera (Zeiss, Germany) and image processing using Axiovision 3.1 software. Induced in vitro SLCT cells that do not express TrkB for a specified time did not show contact with the tissue of the recipient and remained in the region of the track. Over the same period of time, cells expressing TrkB, being induced in the direction of neural differentiation, showed a pronounced migration into the brain parenchyma (Figure 5).
Статистический анализ всех данных проводился с использованием программы SigmaStat 9.0. Для сравнения маленьких групп и ненормальных распределений использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.Statistical analysis of all data was performed using the SigmaStat 9.0 software. To compare small groups and abnormal distributions, the Mann-Whitney U-test was used. Differences were considered statistically significant at a significance level of p <0.05.
ЛитератураLiterature
1. Ashjian, Р.Н., et al., In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast Reconstr Surg, 2003. 111(6): p.1922-31.1. Ashjian, RN, et al., In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast Reconstr Surg, 2003. 111 (6): p. 1922-31.
2. Balmer, J.E. and R. Blomhoff, Gene expression regulation by retinoic acid. J Lipid Res, 2002. 43(11): p.1773-808.2. Balmer, J.E. and R. Blomhoff, Gene expression regulation by retinoic acid. J Lipid Res, 2002.43 (11): p. 1773-808.
3. Brzoska, M., et al, Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 330(1): p.142-50.3. Brzoska, M., et al, Epithelial differentiation of human adipose tissue-derived adult stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005.330 (1): p. 142-50.
4. Fujimura, J., et al., Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolated from GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 333(1): p.116-21.4. Fujimura, J., et al., Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolated from GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun, 2005.333 (1): p. 116-21.
5. Garcia-Suarez, O., et al., Expression of the neurotrophin receptor TrkB in the mouse liver. Anat Embryol (Berl), 2006. 211(5): p.465-73.5. Garcia-Suarez, O., et al., Expression of the neurotrophin receptor TrkB in the mouse liver. Anat Embryol (Berl), 2006.221 (5): p. 465-73.
6. Gronthos, S., et al., Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol, 2001. 189(1): p.54-63.6. Gronthos, S., et al., Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol, 2001.189 (1): p. 54-63.
7. Kim, В J., et al., Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro. Neuroreport, 2002. 13(9): p.1185-8.7. Kim, J. J., et al., Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro. Neuroreport, 2002.13 (9): p. 1185-8.
8. Lim, J.Y., et al., Brain-derived neurotrophic factor stimulates the neural differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and survival of differentiated cells through MAPK/ERK and PI3K/Akt-dependent signaling pathways. J Neurosci Res, 2008.8. Lim, J.Y., et al., Brain-derived neurotrophic factor stimulates the neural differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and survival of differentiated cells through MAPK / ERK and PI3K / Akt-dependent signaling pathways. J Neurosci Res, 2008.
9. Miranville, A., et al, Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation, 2004. 110(3): p.349-55.9. Miranville, A., et al, Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation, 2004.110 (3): p. 349-55.
10. Mizuno, H., et al., Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast Reconstr Surg, 2002. 109(1): p.199-209; discussion 210-1.10. Mizuno, H., et al., Myogenic differentiation by human processed lipoaspirate cells. Plast Reconstr Surg, 2002.109 (1): p. 199-209; discussion 210-1.
11. Ning, H., et al., Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells. Differentiation, 2006. 74(9-10): p.510-8.11. Ning, H., et al., Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells. Differentiation, 2006.44 (9-10): p. 510-8.
12. Planat-Benard, V., et al., Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ Res, 2004. 94(2): p.223-9.12. Planat-Benard, V., et al., Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ Res, 2004.94 (2): p.223-9.
13. Planat-Benard, V., et al., Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation, 2004. 109(5): p.656-63.13. Planat-Benard, V., et al., Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation, 2004.109 (5): p.656-63.
14. Reichardt, L.F., Neurotrophin-regulated signalling pathways. Philos Trans R Soc bond В Biol Sci, 2006. 361(1473): p.1545-64.14. Reichardt, L.F., Neurotrophin-regulated signaling pathways. Philos Trans R Soc bond, Biol Sci, 2006.366 (1473): p. 1545-64.
15. Rivera, F.J., et al., Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. Neurosci Lett, 2006. 406(1-2): p.49-54.15. Rivera, F.J., et al., Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. Neurosci Lett, 2006.406 (1-2): p. 49-54.
16. Seo, M.J., et al., Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 328(1): p.258-64.16. Seo, M.J., et al., Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 2005.328 (1): p. 258-64.
17. Yan, Q., et al, Immunocytochemical localization of TrkB in the central nervous system of the adult rat. J Comp Neurol, 1997. 378(1): p.135-57.17. Yan, Q., et al, Immunocytochemical localization of TrkB in the central nervous system of the adult rat. J Comp Neurol, 1997.378 (1): p. 135-57.
18. US 7,078,230; опубликован 18.07.2006.18. US 7,078,230; published on July 18, 2006.
19. Anghileri, E., et al., Neuronal differentiation potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev, 2008. 17: p.909-916.19. Anghileri, E., et al., Neuronal differentiation potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev, 2008.17: p.909-916.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008149105/13A RU2396345C1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Method of obtaining population of neural differentiation induced stromal cells of fat tissue |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008149105/13A RU2396345C1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Method of obtaining population of neural differentiation induced stromal cells of fat tissue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008149105A RU2008149105A (en) | 2010-06-20 |
| RU2396345C1 true RU2396345C1 (en) | 2010-08-10 |
Family
ID=42682351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008149105/13A RU2396345C1 (en) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | Method of obtaining population of neural differentiation induced stromal cells of fat tissue |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2396345C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2529947C2 (en) * | 2012-12-05 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр сердца, крови и Эндокринологии имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing smooth muscle cell culture |
| RU2806684C1 (en) * | 2023-03-27 | 2023-11-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for obtaining stromal-vascular fraction of adipose tissue |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2301114A (en) * | 1995-05-24 | 1996-11-27 | Bradley Michael John Stringer | Method for controlling differentiation of precursor cells |
| US7078230B2 (en) * | 2000-02-26 | 2006-07-18 | Artecel, Inc. | Adipose tissue-derived stromal cell that expresses characteristics of a neuronal cell |
-
2008
- 2008-12-15 RU RU2008149105/13A patent/RU2396345C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2301114A (en) * | 1995-05-24 | 1996-11-27 | Bradley Michael John Stringer | Method for controlling differentiation of precursor cells |
| US7078230B2 (en) * | 2000-02-26 | 2006-07-18 | Artecel, Inc. | Adipose tissue-derived stromal cell that expresses characteristics of a neuronal cell |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANGHILERI E. ET AL., Neuronal differentiation potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells, Stem Cells Dev., 2008, v.l7, n.5, p.909-916. ЛОПАТИНА Т.В. и др. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани нейротрофическими факторами и ретиноевой кислотой. - Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины 19-22 мая 2008 г.». М., 2008, с.253. KANG S.K. et al., Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats, Exp. Neurol., 2003, v.183, n.2, p.355-366. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2529947C2 (en) * | 2012-12-05 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный Центр сердца, крови и Эндокринологии имени В.А. Алмазова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for preparing smooth muscle cell culture |
| RU2806684C1 (en) * | 2023-03-27 | 2023-11-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for obtaining stromal-vascular fraction of adipose tissue |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008149105A (en) | 2010-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia | |
| Deng et al. | Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture and are neurogenic after transplantation | |
| Song et al. | Potential differentiation of human mesenchymal stem cell transplanted in rat corpus cavernosum toward endothelial or smooth muscle cells | |
| Zeng et al. | Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow | |
| JP5756039B2 (en) | Cells exhibiting neuronal progenitor cell properties | |
| KR100835034B1 (en) | Induction of myocardial cell with the use of mammalian bone marrow cell or cord blood-origin cell and fat tissue | |
| Sarig et al. | Regeneration and transdifferentiation potential of muscle‐derived stem cells propagated as myospheres | |
| US20040235165A1 (en) | In vitro differentiation of adult stem cells | |
| US9850466B2 (en) | Somatic cells with innate potential for pluripotency | |
| US20030113812A1 (en) | Proliferation and differentiation of stem cells using extracellular matrix and other molecules | |
| Pavlova et al. | In vitro neuronal induction of adipose-derived stem cells and their fate after transplantation into injured mouse brain | |
| KR101812817B1 (en) | Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes | |
| Dhar et al. | Long-term maintenance of neuronally differentiated human adipose tissue–derived stem cells | |
| EA034058B1 (en) | Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro | |
| KR100802011B1 (en) | Separation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow Using Layered Culture | |
| Moon et al. | A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation | |
| Kodama et al. | Neurogenic potential of progenitors derived from human circulating CD14+ monocytes | |
| KR102192307B1 (en) | Method for manufacturing Mesenchymal like stem cells and mesenchymal like stem cells manufactured thereby | |
| Dromard et al. | NG2 and Olig2 expression provides evidence for phenotypic deregulation of cultured central nervous system and peripheral nervous system neural precursor cells | |
| Rieske et al. | Arrested neural and advanced mesenchymal differentiation of glioblastoma cells-comparative study with neural progenitors | |
| Nizzardo et al. | iPSC-derived LewisX+ CXCR4+ β1-integrin+ neural stem cells improve the amyotrophic lateral sclerosis phenotype by preserving motor neurons and muscle innervation in human and rodent models | |
| JP3762975B2 (en) | Monocyte-derived pluripotent cells MOMC | |
| Hartmann et al. | Amniotic fluid derived stem cells give rise to neuron-like cells without a further differentiation potential into retina-like cells | |
| Kim et al. | Laminin and platelet-derived growth factor-BB promote neuronal differentiation of human urine-derived stem cells | |
| CN103620023B (en) | The multipotential stem cell of testis somatic sources, its preparation method and comprise its pharmaceutical composition for the treatment of erective dysfunction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20131025 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161216 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20180328 |