RU2378364C1 - Method for molecular typing chlamydia trachomatis - Google Patents
Method for molecular typing chlamydia trachomatis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2378364C1 RU2378364C1 RU2008141993/13A RU2008141993A RU2378364C1 RU 2378364 C1 RU2378364 C1 RU 2378364C1 RU 2008141993/13 A RU2008141993/13 A RU 2008141993/13A RU 2008141993 A RU2008141993 A RU 2008141993A RU 2378364 C1 RU2378364 C1 RU 2378364C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trachomatis
- chlamydia
- genes
- chlamydia trachomatis
- sequencing
- Prior art date
Links
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 title claims abstract description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 33
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims abstract description 20
- 101150116202 pmpF gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150033948 tsf gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 6
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 6
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 101100462378 Danio rerio otpb gene Proteins 0.000 description 4
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 206010061041 Chlamydial infection Diseases 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 201000000902 chlamydia Diseases 0.000 description 3
- 208000012538 chlamydia trachomatis infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 2
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 2-bromo-1-(4-bromophenyl)ethanone Chemical compound BrCC(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 FKJSFKCZZIXQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100172879 Caenorhabditis elegans sec-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100172886 Caenorhabditis elegans sec-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100027987 Chlamydia trachomatis omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 108700042132 Chlamydia trachomatis omp1 Proteins 0.000 description 1
- 101100024013 Chlamydia trachomatis ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606069 Chlamydiaceae Species 0.000 description 1
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 1
- 102100021309 Elongation factor Ts, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710105759 Major outer membrane porin Proteins 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 108010063460 elongation factor T Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 101150005487 ftsI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084188 hctB gene Proteins 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000001581 lymphogranuloma venereum Diseases 0.000 description 1
- 208000037941 meningococcal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 101150090944 otomp gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 101150060462 pbpB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и представляет собой способ молекулярного типирования Chlamydia trachomatis. Изобретение может быть использовано для изучения эпидемиологии урогенитального хламидиоза, оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза - C.trachomatis - и выявления штаммов C.trachomatis, которые определяют характер клинического течения заболевания.The invention relates to microbiology and is a method of molecular typing of Chlamydia trachomatis. The invention can be used to study the epidemiology of urogenital chlamydia, assess the genetic affinity of individual strains of the causative agent of urogenital chlamydia - C.trachomatis - and identify strains of C.trachomatis that determine the nature of the clinical course of the disease.
Хламидии как возбудитель разнообразной патологии человека являются весьма гетерогенными. Среди более 20 представителей семейства Chlamydiaceae, объединенных в два рода (Chlamydia и Chlamydophila), известно как минимум три вида хламидий, вызывающих болезни человека:Chlamydia as a causative agent of various human pathologies are very heterogeneous. Among more than 20 representatives of the Chlamydiaceae family, combined into two genera (Chlamydia and Chlamydophila), at least three types of chlamydia causing human diseases are known:
- Chlamydia pneumoniae (по современной номенклатуре Chlamydophila pneumoniae) - возбудитель инфекций дыхательных путей, в эксперименте показана роль этого микроорганизма в развитии атеросклероза, однако в клинике это однозначно не доказано;- Chlamydia pneumoniae (according to the modern nomenclature of Chlamydophila pneumoniae) is a causative agent of respiratory infections, the role of this microorganism in the development of atherosclerosis is shown in the experiment, but this has not been clearly proved in the clinic;
- Chlamydia psittaci (по современной номенклатуре Chlamydophila psittaci) - возбудитель пситтакоза;- Chlamydia psittaci (according to the modern nomenclature of Chlamydophila psittaci) - the causative agent of psittacosis;
- Chlamydia trachomatis - возбудитель инфекций урогенитального тракта и ряда других;- Chlamydia trachomatis - a causative agent of infections of the urogenital tract and several others;
- другие хламидии могут вызывать болезни животных или лишены патогенных свойств.- other chlamydia can cause animal diseases or lack pathogenic properties.
Возбудитель урогенитального хламидиоза Chlamydia trachomatis - относится к облигатным патогенам и передается от человека к человеку преимущественно половым путем. В течение последних лет в Российской Федерации заболеваемость урогенитальной хламидийной инфекцией вышла на первое место среди всех бактериальных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). В нашей стране сегодня урогенитальный хламидиоз - вторая по распространенности регистрируемая ИППП после трихомоноза.The causative agent of urogenital chlamydia Chlamydia trachomatis - refers to obligate pathogens and is transmitted from person to person mainly through sexual contact. In recent years, the incidence of urogenital chlamydial infection in the Russian Federation has come first among all sexually transmitted bacterial infections (STIs). In our country today, urogenital chlamydia is the second most common registered STI after trichomoniasis.
Разработка эффективных мероприятий по снижению уровня заболеваемости урогенитальным хламидиозом должна базироваться на четких представлениях об особенностях эпидемиологии этого заболевания. Одним из основных условий для решения этих вопросов является возможность выявления сходства и различия между штаммами бактерий одного биологического вида, выделенных от различных пациентов, то есть осуществления типирования.The development of effective measures to reduce the incidence of urogenital chlamydia should be based on clear ideas about the characteristics of the epidemiology of this disease. One of the main conditions for resolving these issues is the possibility of identifying the similarities and differences between bacterial strains of the same species isolated from different patients, that is, typing.
Одним из критериев выбора способа типирования является воспроизводимость метода и разрешающая (дискриминирующая) способность. При этом получаемые результаты должны легко учитываться и интерпретироваться без привлечения дополнительной экспертизы, под которой подразумевают способность метода оценить, как отдельные типы, штаммы, случайно отобранные из бактериальной популяции. Для количественной оценки дискриминирующей способности методов типирования применяют индекс разнообразия Симпсона (D) [Gaston, M.A. and P.R.Hunter. 1989. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol 42: 763-766; Hunter, P. R. and M. A. Gaston. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 26:2465-2466.], который рассчитывают по формуле:One of the criteria for choosing a typing method is the reproducibility of the method and the resolution (discriminatory) ability. At the same time, the results obtained should be easily taken into account and interpreted without involving additional expertise, which means the ability of the method to evaluate how individual types, strains, randomly selected from the bacterial population. The Simpson Diversity Index (D) [Gaston, M.A. and P.R. Hunter. 1989. Efficient selection of tests for bacteriological typing schemes. J Clin Pathol 42: 763-766; Hunter, P. R. and M. A. Gaston. 1988. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 26: 2465-2466.], Which is calculated by the formula:
где S - число групп, на которое данный метод разделяет всю выборку штаммов, nj - число штаммов в j-й группе и N - общее число штаммов в исследованной выборке.where S is the number of groups into which this method divides the entire sample of strains, n j is the number of strains in the jth group and N is the total number of strains in the studied sample.
В идеале для методов с максимальной разрешающей способностью индекс Симпсона должен быть равен 1. Это означает, что метод может отнести к различным типам два любых штамма.Ideally, for methods with maximum resolution, the Simpson index should be 1. This means that the method can be attributed to any type of any two strains.
Другими критериями выбора метода молекулярного типирования могут быть:Other selection criteria for molecular typing may include:
- способность осуществлять анализ большого количества образцов; для лабораторий, проводящих обширные эпидемиологические исследования, данный критерий может являться определяющим;- the ability to analyze a large number of samples; for laboratories conducting extensive epidemiological studies, this criterion may be determining;
- хранение генетических профилей, то есть создание базы данных, также является важным критерием выбора метода.- the storage of genetic profiles, that is, the creation of a database, is also an important criterion for choosing a method.
В литературе имеется описание различных методик молекулярного типирования С.trachomatis.The literature describes various molecular typing techniques for C.trachomatis.
Основным методом типирования С.trachomatis до последнего времени являлся метод серотипирования, основанный на выявлении вариантов антигенной структуры основного белка внешней мембраны микроорганизма (The Major outer membrane protein - MOMP). Описано 19 сероваров С.trachomatis и установлено, что серотипы А, В и С вызывают трахому, серотипы от D до K - урогенитальный хламидиоз и три серотипа (L1-L3) - венерическую лимфогранулему; урогенитальный хламидиоз наиболее часто ассоциируется с сероварами D-F [Spaargaren J., Verhaest I., MooiJ S. et al. Analysis of Chlamidya trachomatis. Serovar distribution changes in the Netherlands (1986-2002). Sex Transm Infect 2004, 80: 151-152]. Вместе с тем серотипирование является достаточно трудоемким и длительным процессом, требующим получения чистой культуры хламидий, высокой квалификации персонала и наличия набора моноклональных антител [Wang S.P., Kuo С.С., Bames R.C. et al. Immunotyping of Chlamidya trachomatis with monoclonal antibodies. J Infect Dis 1085, 152:791-800; Osserwarde J.M., Rieffe M. De Vries., Derksen-Navrocki R.P. et al. Comparison of two panels of monoclonal antibodies for determination of Chlamidya trachomatis serovars. J Clin Microbiol 1994, 32: 2968-2974]. В связи с указанными фактами традиционное серотипирование в настоящее время вытесняется молекулярными методами, основанными на амплификации гена, кодирующего основной белок внешней мембраны, и последующем анализе ампликона.Until recently, the main typing method for C. trachomatis was the serotyping method, based on the identification of variants of the antigenic structure of the main protein of the microorganism's outer membrane (MOMP). 19 C. trachomatis serovars have been described and it has been established that serotypes A, B and C cause trachoma, serotypes D to K - urogenital chlamydia and three serotypes (L1-L3) - venereal lymphogranuloma; urogenital chlamydia is most often associated with D-F serovars [Spaargaren J., Verhaest I., MooiJ S. et al. Analysis of Chlamidya trachomatis. Serovar distribution changes in the Netherlands (1986-2002). Sex Transm Infect 2004, 80: 151-152]. At the same time, serotyping is a rather laborious and lengthy process, requiring a pure chlamydia culture, highly qualified personnel and the presence of a set of monoclonal antibodies [Wang S.P., Kuo S.S., Bames R.C. et al. Immunotyping of Chlamidya trachomatis with monoclonal antibodies. J Infect Dis 1085,152: 791-800; Osserwarde J.M., Rieffe M. De Vries., Derksen-Navrocki R.P. et al. Comparison of two panels of monoclonal antibodies for determination of Chlamidya trachomatis serovars. J Clin Microbiol 1994, 32: 2968-2974]. In connection with these facts, traditional serotyping is currently being supplanted by molecular methods based on the amplification of a gene encoding the main protein of the outer membrane and subsequent analysis of the amplicon.
Для амплификации ДНК C.trachomatis чаще всего используют гнездную ПЦР. Получаемые ампликоны исследуются методами анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, обратной гибридизацииFor amplification of C.trachomatis DNA, nested PCR is most often used. The resulting amplicons are studied by analysis of restriction fragment length polymorphism, reverse hybridization.
[Stothard, D.R. 2001. Use of a reverse dot blot procedure to identify the presence of multiple serovars in Chlamydia trachomatis urogenital infection. J Clin Microbiol 39: 2655-2659 №; Xiong, L., F. Kong, H. Zhou, and G. L. Gilbert. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 44:1413-1418.]., олигонуклеотидных чипов [Zheng, H. P., L. F. Jiang, D.Y.Fang, Y.H.Xue, Y.A.Wu, J.M.Huang, and Z.Y.Ou. 2007. Application of an oligonucleotide array assay for rapid detecting and genotyping of Chlamydia trachomatis from urogenital specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 57: 1-6] и секвенирования [Bandea, С.I., K. Kubota, Т.M.Brown, P.H.Kilmarx, V. Bhullar, S. Yanpaisam, P. Chaisilwattana, W. Siriwasin, and C.M.Black. 2001. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompi). Sex Transm Infect 77: 419-422; Klint, M., M. Lofdahl, C. Ek, A. Airell, T. Berglund, and B. Herrmann. 2006. Lymphogranuloma venereum prevalence in Sweden among men who have sex with men and characterization of Chlamydia trachomatis ompA genotypes. J Clin Microbiol 44: 4066-4071; Stothard, D.R., G. Boguslawski, and R. B. Jones. 1998. Phylogenetic analysis of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein and examination of potential pathogenic determinants. Infect Immun. 66:3618-3625.]. Сравнительно недавно для типирования С.trachomatis был предложен метод гнездной ПЦР в реальном времени, по разрешающей способности не уступавший секвенированию omp1 гена (Jalal, В., Н. Stephen, S. Alexander, С.Came, and С.Sonnex. 2007. Development of real-time PCR assays for genotyping of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 45:2649-2653.]. Использование некоторых из современных молекулярных методов типирования позволят получать результаты, идентичные традиционному серотипированию.[Stothard, D.R. 2001. Use of a reverse dot blot procedure to identify the presence of multiple serovars in Chlamydia trachomatis urogenital infection. J Clin Microbiol 39: 2655-2659 No.; Xiong, L., F. Kong, H. Zhou, and G. L. Gilbert. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization assay for rapid simultaneous detection and serovar identification of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 44: 1413-1418.]., Oligonucleotide chips [Zheng, H. P., L. F. Jiang, D.Y. Fang, Y.H. Xue, Y.A.Wu, J.M. Huang, and Z.Y.Ou. 2007. Application of an oligonucleotide array assay for rapid detecting and genotyping of Chlamydia trachomatis from urogenital specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 57: 1-6] and sequencing [Bandea, C. I., K. Kubota, T. M. Brown, PH Kilmarx, V. Bhullar, S. Yanpaisam, P. Chaisilwattana, W. Siriwasin, and CMBlack. 2001. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompi). Sex Transm Infect 77: 419-422; Klint, M., M. Lofdahl, C. Ek, A. Airell, T. Berglund, and B. Herrmann. 2006. Lymphogranuloma venereum prevalence in Sweden among men who have sex with men and characterization of Chlamydia trachomatis ompA genotypes. J Clin Microbiol 44: 4066-4071; Stothard, D.R., G. Boguslawski, and R. B. Jones. 1998. Phylogenetic analysis of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein and examination of potential pathogenic determinants. Infect Immun. 66: 3618-3625.]. More recently, a real-time PCR method has been proposed for typing C.trachomatis that has the same resolution as the omp1 gene sequencing (Jalal, B., N. Stephen, S. Alexander, C. Came, and C. Sonnex. 2007. Development of real-time PCR assays for genotyping of Chlamydia trachomatis. J Clin Microbiol 45: 2649-2653.]. Using some of the modern molecular typing techniques will produce identical results to traditional serotyping.
Наиболее широко распространенным методом, применяемым для молекулярного типирования ряда микроорганизмов, является мультилокусное секвенирование (MultiLocus Sequence Typing - MLST).The most widely used method for molecular typing of a number of microorganisms is Multilocus Sequence Typing (MLST).
Принцип метода MLST основан на проведении секвенирования и последующего анализа нуклеотидных последовательностей большого числа (от 6 до 16) генов домашнего хозяйства микроорганизма. Одними из первых бактерий, к типированию которых был применен метод MLST, были менингококки [Feavers, I.М., S.J.Gray, R.Urwin, J.Е.Russell, J.A.Bygraves, E.B.Kaczmarski, and M.C.Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol 37:3883-3887].The principle of the MLST method is based on sequencing and subsequent analysis of the nucleotide sequences of a large number (from 6 to 16) of the microorganism's housekeeping genes. One of the first bacteria to be typed using the MLST method was meningococci [Feavers, I.M., S.J. Gray, R. Urwin, J.E. Russell, J.A. Bygraves, E.B. Kaczmarski, and M.C. Maiden. 1999. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol 37: 3883-3887].
При типировании методом MLST С.trachomatis [K-lint, М., Н.Н.Fuxelius, R.R.Goldkuhl, Н.Skarin, С.Rutemark, S.G.Andersson, К.Persson, and B.Herrmann. 2007. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol 45: 1410-1414.] в качестве мишеней для типирования были использованы высоковариабельные области: два аннотированных гена (hctB и pbpB) и три гипотетических гена (СТ058, СТ144 и СТ172).When typing using the MLST method C.trachomatis [K-lint, M., N.N. Fuxelius, R.R. Goldkuhl, N.Skarin, C.Rutemark, S.G. Andersson, K. Persson, and B. Herrmann. 2007. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol 45: 1410-1414.] Highly variable regions were used as targets for typing: two annotated genes (hctB and pbpB) and three hypothetical genes (CT058, CT144 and CT172).
Основные недостатки указанного способа: при воспроизведении описанного метода MLST возникает ряд трудностей, связанных с подбором праймеров для амплификации генов и условий реакции. Кроме этого, метод требует выделения хламидий в чистой культуре. Типирование по пяти генам является достаточно дорогостоящим и трудоемким.The main disadvantages of this method: when reproducing the described MLST method, a number of difficulties arise associated with the selection of primers for amplification of genes and reaction conditions. In addition, the method requires the isolation of chlamydia in a pure culture. Typing on five genes is quite expensive and time-consuming.
Данный способ является наиболее близким к заявляемому способу молекулярного типирования C.trachomatis. Данный способ выбран в качестве ближайшего аналога предлагаемого способа.This method is the closest to the claimed method of molecular typing of C.trachomatis. This method is selected as the closest analogue of the proposed method.
Задачей изобретения является разработка более эффективного способа молекулярного типирования C.trachomatis.The objective of the invention is to develop a more effective method of molecular typing of C.trachomatis.
Технический результат изобретения заключается в повышении разрешающей способности метода молекулярного типирования C.trachomatis, воспроизводимости и производительности способа, а также в увеличении легкости интерпретации получаемых результатов и легкости выполнения.The technical result of the invention is to increase the resolution of the method of molecular typing C.trachomatis, reproducibility and productivity of the method, as well as to increase the ease of interpretation of the results and ease of implementation.
Это достигается за счет того, что из клинического материала, полученного от пациентов с урогенитальным хламидиозом, производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis; с помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis, таких как ompA, tsf и pmpF; проводят их секвенирование, восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей.This is achieved due to the fact that from the clinical material obtained from patients with urogenital chlamydia, bacterial DNA of C.trachomatis is isolated; amplification fragments of the variable regions of the three C.trachomatis genes, such as ompA, tsf and pmpF, are obtained by polymerase chain reaction; carry out their sequencing, restoration of the sequences of the analyzed genes, alignment and comparative analysis of nucleotide sequences.
Характеристика генов, отобранных для типирования C.trachomatis:Characterization of genes selected for typing C.trachomatis:
ompA - ген, кодирующий основной белок наружной мембраны C.trachomatis;ompA is a gene encoding the main protein of the outer membrane of C.trachomatis;
tsf - ген, кодирующий фактор элонгации C.trachomatis (EF-TS); играет важную роль в биосинтезе белка, а также вовлечен в регуляцию других белков C.trachomatis, ассоциированных с циклом развития микробной клетки, что может иметь значение в изменении фенотипических свойств микроорганизма и определять фенотипические различия между сероварами C.trachomatis [Zhang Y., Tao J., Zhou M. et al. Elongation factor Ts of C.trachomatis: structure of the gene and properties of the protein. Arch Biochem Biophys 1997, 344:43-52; Brunelle В. W, Nicholson T.L., Stephens R.S. Microarrey-based genomic surveying of gene polymorphisms in C.trachomatis. Genome Biology 2004, 5:R42];tsf — gene encoding C.trachomatis elongation factor (EF-TS); plays an important role in protein biosynthesis, and is also involved in the regulation of other C.trachomatis proteins associated with the development cycle of the microbial cell, which may be important in changing the phenotypic properties of the microorganism and determine phenotypic differences between C.trachomatis serovars [Zhang Y., Tao J ., Zhou M. et al. Elongation factor Ts of C.trachomatis: structure of the gene and properties of the protein. Arch Biochem Biophys 1997, 344: 43-52; Brunelle B. W, Nicholson T.L., Stephens R.S. Microarrey-based genomic surveying of gene polymorphisms in C.trachomatis. Genome Biology 2004, 5: R42];
pmpF - член семейства генов Chlamydiales, локализованных во внешней мембране и кодирующих полиморфные мембранные белки, ответственные за аутотранспорт, транлокацию N-терминального региона клеточной поверхности C.trachomatis и адгезию микроорганизма к клеткам организма хозяина [Gomes J.P., Nunes A., Bruno W.J. et al. Polymorphisms in the Nine Polymorphic Membrane Proteins of C.trachomatis across All Serovars: Evidence for Serovar Da recombination and Correlation with Tissue Tropism. J Bacteriol Jan 2006: 275-286].pmpF is a member of the family of Chlamydiales genes located in the outer membrane and encoding polymorphic membrane proteins responsible for autotransport, translocation of the N-terminal region of the cell surface of C.trachomatis and adhesion of the microorganism to the cells of the host [Gomes J.P., Nunes A., Bruno W.J. et al. Polymorphisms in the Nine Polymorphic Membrane Proteins of C.trachomatis across All Serovars: Evidence for Serovar Da recombination and Correlation with Tissue Tropism. J Bacteriol Jan 2006: 275-286].
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Из клинического материала, полученного от больных с урогенитальным хламидиозом, стандартным способом производят выделение бактериальной ДНК C.trachomatis.From the clinical material obtained from patients with urogenital chlamydia, C.trachomatis bacterial DNA is isolated in a standard way.
С помощью полимеразной цепной реакции получают амплифицированные фрагменты вариабельных участков трех генов C.trachomatis (ompA, tsf, pmpF). Характеристика использованных в работе генов-мишеней, примененных для типирования C.trachomatis, праймеров для их амплификации и условий постановки полимеразной цепной реакции для C.trachomatis, представлена в таблице 1.Amplified fragments of the variable regions of the three C.trachomatis genes (ompA, tsf, pmpF) are obtained by polymerase chain reaction. The characteristics of the target genes used for typing C.trachomatis, primers for their amplification, and the conditions for the polymerase chain reaction for C.trachomatis are presented in Table 1.
Гены-мишени, использованные для типирования C.trachomatis, праймеры для их амплификации и условия постановки полимеразной цепной реакцииTable 1
Target genes used for typing C.trachomatis, primers for their amplification and conditions for the formulation of the polymerase chain reaction
pmpF2f
pmpF3fpmpF1f
pmpF2f
pmpF3f
ggttacattgacatccgagat
cctataccatcacgcttaataatatcctttgcttgcctcagtt
ggttacattgacatccgagat
cctataccatcacgcttaataa
pmpF2r
pmpF3rpmpF1r
pmpF2r
pmpF3r
gcgatggaggtagcagatgt
gctcctcctgcattgatgtacaggcagcagagttatttaga
gcgatggaggtagcagatgt
gctcctcctgcattgatgta
Постановку реакции секвенирования проводят с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA).Sequencing reactions are carried out using the d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) according to the manufacturer's instructions. An analysis of the results of the sequencing reaction is carried out on an ABI-3130 instrument (Applied Biosystem, USA).
Восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводят с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).The restoration of the sequences of the analyzed genes, alignment and comparative analysis of the nucleotide sequences is carried out using the ContigExprress and AlignX modules of the Vector NTI® 9.0 software package (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивают с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).The nucleotide sequences of the studied genes obtained as a result of sequencing are compared with the nucleotide sequences of the alleles of the corresponding genes in the GeneBank database using the BLAST service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
На основании нуклеотидной последовательности штамму C.trachomatis присваивают номер сиквенс-типа, который помещают в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.Based on the nucleotide sequence, the C.trachomatis strain is assigned a sequence type number, which is placed in a database for subsequent analysis of the clonal affinity of C.trachomatis strains.
Пример №1Example No. 1
Обследован пациент мужского пола (1) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациента обнаружена ДНК C.trachomatis.A male patient was examined (1) with suspected presence of a sexually transmitted infection. Examination of scraping material of the urethra by PCR (test system NPF "Liteh", "Polymik-Chl", Moscow) revealed C.trachomatis DNA in the patient.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.C.trachomatis was typed in accordance with the proposed method.
Этапы исследования включали:The stages of the study included:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);- isolation of total bacterial DNA of C.trachomatis from scraping material of the urethra using the DNA EXPRESS DNA isolation kit (LLC NPF Litekh, TU-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);- selection of primers for the polymerase chain reaction in order to identify and amplify fragments of the genes otpA, tsf and pmpF (table 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов исследуемых генов С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);- carrying out a polymerase chain reaction in order to obtain amplitudes of fragments of the studied C. trachomatis genes in accordance with the reaction conditions described in table 1 and using the following reagents: 10xReaction buffer [solution: 0.66 M Tris-HCL (Cat. No. T 6791 Sigma, USA); 25 mM magnesium chloride (Cat. No. 960-9, Sigma, USA); a solution of deoxynucleotide triphosphates (DNTF) [aqueous solution of dNTP-dATP (cat. No. T3-100, NPO Vector, Novosibirsk); dGTF (cat. No. T3-PO, NPO Vektor, Novosibirsk); DCTF (cat. No. T3-130, NPO Vector, Novosibirsk); dTTF (cat. No. T3-120, NPO Vektor, Novosibirsk)]; the concentration of each dNTP - 2.5 mm]; deposited water [Millipore, USA (Cat. No. ZPMG 23004)], Taq polymerase (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);- the results of amplification reactions were evaluated in a 2% agarose gel (agarose (Cat. No. A 9918, Sigma, USA), ethidium bromide solution (1% solution (Cat. No. 11615, Merk, Germany)), 50-fold TAE buffer: 2 M Tris-acetate (Cat. No. T 1258, Sigma, USA), 0.05 M Ethylenediaminetraacetic acid diatrium salt (Cat. No. 9884, Sigma, USA), pH 8.2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;- visualization of amplification products was carried out using a video system for documenting gel electrophoregrams on the appearance of luminous orange-red bands upon irradiation with UV radiation with a wavelength of 310 nm;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);- formulation of the sequencing reaction using the d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) according to the manufacturer's instructions; analysis of the results of the sequencing reaction is carried out on an ABI-3130 device (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).- restoration of the sequences of the analyzed genes, alignment and comparative analysis of nucleotide sequences using the ContigExprress and AlignX modules of the Vector NTI® 9.0 software package (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).The nucleotide sequences of the studied genes obtained as a result of sequencing were compared with the nucleotide sequences of the alleles of the corresponding genes in the GeneBank database using the BLAST service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.As a result of sequencing of the fragment of the gene opA, the presence of the replacement of A by G at position 35 was established.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.Sequencing of the tsf gene fragment revealed the substitution of C for T at position 44.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.As a result of sequencing of the pmpF gene fragment, the presence of the replacement of A by C at position 134 was established.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов С.trachomatis.Based on the nucleotide sequences of fragments of the ompA, tsf, and pmpF genes, the C. trachomatis strain was assigned sequence number 10; the sequence-type number is placed in the database for subsequent analysis of the clonal affinity of C.trachomatis strains.
Пример №2Example No. 2
Обследована пациентка женского пола (2) с целью исключения урогенитального хламидиоза, которая являлась половым партнером пациента (1). При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.A female patient (2) was examined to exclude urogenital chlamydia, which was the patient's sexual partner (1). Examination of scraping material of the cervix and urethra by PCR (test system NPF "Litekh", "Polymik-Chl", Moscow) revealed C.trachomatis DNA in the patient.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.C.trachomatis was typed in accordance with the proposed method.
Этапы исследования включали:The stages of the study included:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);- isolation of total bacterial DNA of C.trachomatis from scraping material of the cervix and urethra using the DNA EXPRESS DNA isolation kit (OOO NPF Litekh, TU-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);- selection of primers for the polymerase chain reaction in order to identify and amplify fragments of the genes otpA, tsf and pmpF (table 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ) [водный раствор дНТФ-дАТФ (кат. №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);- carrying out a polymerase chain reaction in order to obtain amplitudes of fragments of the C.trachomatis genome in accordance with the reaction conditions described in table 1 and using the following reagents: 10xReaction buffer [solution: 0.66 M Tris-HCL (Cat. No. T 6791, Sigma, USA); 25 mM magnesium chloride (Cat. No. 960-9, Sigma, USA); 0.05 M ethylenediaminetraacetic acid diatrium salt (Cat. No. E 9884, Sigma, USA), pH 8.2; a solution of deoxynucleotide triphosphates (DNTF) [aqueous solution of dNTP-dATP (cat. No. T3-100, NPO Vector, Novosibirsk); dGTF (cat. No. T3-PO, NPO Vektor, Novosibirsk); DCTF (cat. No. T3-130, NPO Vector, Novosibirsk); dTTF (cat. No. T3-120, NPO Vektor, Novosibirsk)]; the concentration of each dNTP - 2.5 mm]; deposited water [Millipore, USA (Cat. No. ZPMG 23004)], Taq polymerase (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);- the results of amplification reactions were evaluated in a 2% agarose gel (agarose (Cat. No. A 9918, Sigma, USA), ethidium bromide solution (1% solution (Cat. No. 11615, Merk, Germany)), 50-fold TAE buffer: 2 M Tris-acetate (Cat. No. T 1258, Sigma, USA), 0.05 M Ethylenediaminetraacetic acid diatrium salt (Cat. No. 9884, Sigma, USA), pH 8.2);
- визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;- visualization of amplification products was carried out using a video system for documenting gel electrophoregrams on the appearance of luminous orange-red bands upon irradiation with UV radiation with a wavelength of 310 nm;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе ABI-3130 (Applied Biosystem, USA);- formulation of the sequencing reaction using the d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) according to the manufacturer's instructions; analysis of the results of the sequencing reaction is carried out on an ABI-3130 device (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).- restoration of the sequences of the analyzed genes, alignment and comparative analysis of nucleotide sequences using the ContigExprress and AlignX modules of the Vector NTI® 9.0 software package (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).The nucleotide sequences of the studied genes obtained as a result of sequencing were compared with the nucleotide sequences of the alleles of the corresponding genes in the GeneBank database using the BLAST service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Г в 35 положении.As a result of sequencing of the fragment of the gene opA, the presence of the replacement of A by G at position 35 was established.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.Sequencing of the tsf gene fragment revealed the substitution of C for T at position 44.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены А на С в 134 положении.As a result of sequencing of the pmpF gene fragment, the presence of the replacement of A by C at position 134 was established.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 10 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.Based on the nucleotide sequences of fragments of the ompA, tsf, and pmpF genes, the C. trachomatis strain was assigned sequence number 10; the sequence number is placed in the database for subsequent analysis of the clonal affinity of C.trachomatis strains.
В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половыми партнерами, было установлено наличие в урогенитальном тракте обоих партнеров C.trachomatis, относившейся к одному сиквенс-типу.As a result of typing of C.trachomatis isolated from patients (1) and (2), who were sexual partners, the presence of both partners of C.trachomatis belonging to the same sequence type in the urogenital tract was established.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования C.trachomatis может быть применен для установления заражения половых партнеров (в частности, в судебно-медицинской экспертизе) и изучения путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.The data obtained allow us to conclude that the used C.trachomatis typing method can be used to establish infection of sexual partners (in particular, in a forensic medical examination) and to study the pathways of urogenital chlamydial infection.
Пример №3Example No. 3
Обследована пациентка женского пола (3) с подозрением на наличие инфекции, передаваемой половым путем. При обследовании соскобного материала шейки матки и уретры методом ПЦР (тест-система НПФ «Литех», «Полимик-Хл» г.Москва) у пациентки обнаружена ДНК C.trachomatis.A female patient was examined (3) with suspected presence of a sexually transmitted infection. Examination of scraping material of the cervix and urethra by PCR (test system NPF "Litekh", "Polymik-Chl", Moscow) revealed C.trachomatis DNA in the patient.
Проведено типирование C.trachomatis в соответствии с предлагаемым способом.C.trachomatis was typed in accordance with the proposed method.
Этапы исследования включали:The stages of the study included:
- выделение тотальной бактериальной ДНК С.trachomatis из соскобного материала шейки матки и уретры с использованием набора для выделения «ДНК ЭКСПРЕСС» (000 НПФ Литех, ТУ-9398-450-17253567-03);- Isolation of total bacterial DNA of C. trachomatis from scraping material of the cervix and urethra using the DNA EXPRESS DNA isolation kit (000 NPF Litekh, TU-9398-450-17253567-03);
- подбор праймеров для проведения полимеразной цепной реакции с целью выявления и амплификации фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF (таблица 1);- selection of primers for the polymerase chain reaction in order to identify and amplify fragments of the genes otpA, tsf and pmpF (table 1);
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения амплификатов фрагментов генома С.trachomatis в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1, и использованием следующих реактивов: 10xReaction buffer [раствор: 0,66 М трис-HCL (кат. №Т 6791, фирма Sigma, США); 25 мМ магния хлорида (кат. №960-9, фирма Sigma, США); 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2; раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНТФ)[водный раствор дНТФ - дАТФ (кат. №Т3-100, НПО "Вектор", Новосибирск); дГТФ (кат. №Т3-ПО, НПО "Вектор", Новосибирск); дЦТФ (кат. №Т3-130, НПО "Вектор", Новосибирск); дТТФ (кат. №Т3-120, НПО "Вектор", Новосибирск)]; концентрация каждого дНТФ - 2,5 мМ]; вода депонированная [фирма Millipore, США (кат. №ZPMG 23004)], Taq-полимераза (Promcga, USA);- carrying out a polymerase chain reaction in order to obtain amplitudes of fragments of the C.trachomatis genome in accordance with the reaction conditions described in table 1 and using the following reagents: 10xReaction buffer [solution: 0.66 M Tris-HCL (Cat. No. T 6791, Sigma, USA); 25 mM magnesium chloride (Cat. No. 960-9, Sigma, USA); 0.05 M ethylenediaminetraacetic acid diatrium salt (Cat. No. E 9884, Sigma, USA), pH 8.2; a solution of deoxynucleotide triphosphates (DNTF) [an aqueous solution of dNTP - dATP (cat. No. T3-100, NPO Vector, Novosibirsk); dGTF (cat. No. T3-PO, NPO Vektor, Novosibirsk); DCTF (cat. No. T3-130, NPO Vector, Novosibirsk); dTTF (cat. No. T3-120, NPO Vektor, Novosibirsk)]; the concentration of each dNTP - 2.5 mm]; deposited water [Millipore, USA (Cat. No. ZPMG 23004)], Taq polymerase (Promcga, USA);
- оценку результатов прохождения реакций амплификации проводили в 2% агарозном геле (агароза (кат. №А 9918, фирма Sigma, США), раствор бромистого этидия (1% раствор (кат. №11615, фирма Merk, Германия)), 50-кратный ТАЕ-буфер: 2 М трис-ацетат (кат. №Т 1258, фирма Sigma, США), 0,05 М этилендиаминтстрауксусной кислоты дииатриевая соль (кат. №Е 9884, фирма Sigma, США), рН 8,2);- the results of amplification reactions were evaluated in a 2% agarose gel (agarose (Cat. No. A 9918, Sigma, USA), ethidium bromide solution (1% solution (Cat. No. 11615, Merk, Germany)), 50-fold TAE buffer: 2 M Tris-acetate (Cat. No. T 1258, Sigma, USA), 0.05 M Ethylenediaminetraacetic acid diatrium salt (Cat. No. 9884, Sigma, USA), pH 8.2);
визуализацию продуктов амплификации осуществляли с помощью видеосистемы для документирования гель-электрофореграмм по появлению светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм;the amplification products were visualized using a video system for documenting gel electrophoregrams on the appearance of luminous orange-red bands upon irradiation with UV radiation with a wavelength of 310 nm;
- постановку реакции секвенирования с использованием набора d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) согласно инструкции фирмы-производителя; анализ результатов реакции секвенирования проводят на приборе АВ 1-313 0 (Applied Biosystem, USA);- formulation of the sequencing reaction using the d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) according to the manufacturer's instructions; analysis of the results of the sequencing reaction is carried out on the device AB 1-313 0 (Applied Biosystem, USA);
- восстановление последовательностей анализируемых генов, выравнивание и сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей с использованием модулей ContigExprress и AlignX программного пакета «Vector NTI® 9.0» (Informax, Inc).- restoration of the sequences of the analyzed genes, alignment and comparative analysis of nucleotide sequences using the ContigExprress and AlignX modules of the Vector NTI® 9.0 software package (Informax, Inc).
Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности исследуемых генов сравнивали с нуклеотидными последовательностями аллелей соответствующих генов в базе данных GeneBank с помощью сервиса BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).The nucleotide sequences of the studied genes obtained as a result of sequencing were compared with the nucleotide sequences of the alleles of the corresponding genes in the GeneBank database using the BLAST service (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В результате секвенирования фрагмента гена оmрА установлено наличие замены А на Ц в 97 положении.As a result of sequencing of the fragment of the gene opA, the presence of the replacement of A by C at position 97 was established.
В результате секвенирования фрагмента гена tsf установлено наличие замены С на Т в 44 положении.Sequencing of the tsf gene fragment revealed the substitution of C for T at position 44.
В результате секвенирования фрагмента гена pmpF установлено наличие замены Г на А в 347 положении.As a result of sequencing of the pmpF gene fragment, it was found that G is replaced by A at position 347.
На основании нуклеотидных последовательностей фрагментов генов оmрА, tsf и pmpF штамму C.trachomatis присвоен номер 12 сиквенс-типа; номер сиквенс-типа помещен в базу данных для последующего анализа клонального родства штаммов C.trachomatis.Based on the nucleotide sequences of the fragments of the genes otpA, tsf, and pmpF, the C. trachomatis strain was assigned sequence number 12; the sequence number is placed in the database for subsequent analysis of the clonal affinity of C.trachomatis strains.
В результате типирования C.trachomatis, выделенной от пациентов (1) и (2), являвшихся половьми партнерами, и пациентки (3) было установлено, что в урогенитальном тракте обследованных половых партнеров - пациенты (1) и (2), присутствует C.trachomatis, относящаяся к одному сиквенс-типу, а в урогенитальном тракте пациентки (3) присутствует C.trachomatis, относящаяся к другому сиквенс-типу. Таким образом, примененный метод типирования C.trachomatis позволил выявить различие между двумя штаммами C.trachomatis, полученными от лиц, не являющихся половыми партнерами, что свидетельствует о его высокой дискриминирующей способности.As a result of typing of C.trachomatis isolated from patients (1) and (2), who were half partners, and patient (3), it was found that in the urogenital tract of the examined sexual partners - patients (1) and (2), C. trachomatis, belonging to one sequence type, and in the urogenital tract of the patient (3) C. trachomatis, belonging to another sequence type, is present. Thus, the applied C.trachomatis typing method revealed a difference between the two C.trachomatis strains obtained from non-sexual partners, which indicates its high discriminatory ability.
Полученные данные позволяют заключить, что примененный метод типирования С.trachomatis может быть применен для оценки генетического родства отдельных штаммов возбудителя урогенитального хламидиоза, а также путей распространения урогенитальной хламидийной инфекции.The data obtained allow us to conclude that the applied C. trachomatis typing method can be used to assess the genetic affinity of individual strains of the pathogen of urogenital chlamydia, as well as the pathways of the distribution of urogenital chlamydial infection.
При сравнении заявленного метода типирования с другими наиболее распространенными методами были выявлены следующие преимущества указанного способа:When comparing the claimed typing method with the other most common methods, the following advantages of this method were revealed:
- проведение секвенирования вариабельных участков трех генов C.trachomatis, обладающих выраженным нуклеотидным полиморфизмом, позволяет (в сравнении с генотипированием по одному гену) значительно повысить разрешающую способность и воспроизводимость метода типирования C.trachomatis;- sequencing of variable regions of three C.trachomatis genes with pronounced nucleotide polymorphism allows (in comparison with genotyping for one gene) to significantly increase the resolution and reproducibility of the C.trachomatis typing method;
- исследование небольшого (в сравнении с методом MLST) числа генов C.trachomatis позволяет значительно снизить стоимость и сократить время проведения исследований по типированию штаммов C.trachomatis и увеличивает его производительность; а также увеличить легкость интерпретации получаемых результатов и легкость выполнения.- the study of a small (in comparison with the MLST method) number of C.trachomatis genes can significantly reduce the cost and reduce the time for conducting studies on typing of C.trachomatis strains and increase its productivity; and also increase the ease of interpretation of the results and ease of implementation.
Сравнительная характеристика предлагаемого и известных методов молекулярного типирования C.trachomatis приведена в таблице 2.Comparative characteristics of the proposed and known methods of molecular typing of C.trachomatis are shown in table 2.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008141993/13A RU2378364C1 (en) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Method for molecular typing chlamydia trachomatis |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008141993/13A RU2378364C1 (en) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Method for molecular typing chlamydia trachomatis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2378364C1 true RU2378364C1 (en) | 2010-01-10 |
Family
ID=41644193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008141993/13A RU2378364C1 (en) | 2008-10-23 | 2008-10-23 | Method for molecular typing chlamydia trachomatis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2378364C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2443782C1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for chlamydia trachomatis genotyping |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6403306B1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-06-11 | Emory University | Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto |
-
2008
- 2008-10-23 RU RU2008141993/13A patent/RU2378364C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6403306B1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-06-11 | Emory University | Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KLINT М. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis strains by multilocus sequence analysis. J Clin Microbiol. 2007 May; 45(5): 1410-4. FEAVERS IM et.al. Multilocus sequence typing and antigen gene sequencing in the investigation of a meningococcal disease outbreak. J Clin Microbiol. 1999 Dec; 37(12): 3883-7. BANDEA et.al. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompl). Sex Transm Infect. 2001 Dec; 77(6): 419-22. Rodriguez P Typing of Chlamydia trachomatis by restriction endonuclease analysis of the amplified major outer membrane protein gene. J Clin Microbiol. 1991 Jun; 29(6): 1132-6. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2443782C1 (en) * | 2010-08-03 | 2012-02-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) | Method for chlamydia trachomatis genotyping |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pantchev et al. | New real-time PCR tests for species-specific detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus from tissue samples | |
Wang et al. | Development and application of an oligonucleotide microarray for the detection of food-borne bacterial pathogens | |
Vargas et al. | Is there an association between ocular adnexal lymphoma and infection with Chlamydia psittaci?: the University of Rochester experience | |
US7625704B2 (en) | Methods and compositions for identifying bacteria associated with bacteria vaginosis | |
Kostrzynska et al. | Application of DNA microarray technology for detection, identification, and characterization of food-borne pathogens | |
Ružić-Sabljić et al. | Progress in the molecular diagnosis of Lyme disease | |
US20100075306A1 (en) | Method for diagnosis of and following a bacterial vaginosis by molecular quantification | |
Muvunyi et al. | Evaluation of a new multiplex polymerase chain reaction assay STDFinder for the simultaneous detection of 7 sexually transmitted disease pathogens | |
Gookin et al. | Identification of Pentatrichomonas hominis in feline fecal samples by polymerase chain reaction assay | |
KR20100044736A (en) | A novel method for simultaneous detection and discrimination of bacterial, fungal, parasitic and viral infections of eye and central nervous system | |
Miya et al. | Development of a multilocus variable-number of tandem repeat typing method for Listeria monocytogenes serotype 4b strains | |
Mabrok et al. | Rapid visualization in the specific detection of Flavobacterium columnare, a causative agent of freshwater columnaris using a novel recombinase polymerase amplification (RPA) combined with lateral flow dipstick (LFD) assay | |
Conrads et al. | Simultaneous detection of Bacteroides forsythus and Prevotella intermedia by 16S rRNA gene-directed multiplex PCR | |
RU2354700C2 (en) | Set of genus- and species-specific oligonucleotide primers for detection and species identification of yersinia by multiplex polymerase chain reaction method | |
Marangoni et al. | Chlamydia trachomatis serovar distribution and other sexually transmitted coinfections in subjects attending an STD outpatients clinic in Italy | |
RU2625006C1 (en) | Method for target amplification of human reproductive organs infectors genomes for simultaneous identification of infectors with primer set | |
Lovett et al. | Cervicovaginal microbiota predicts neisseria gonorrhoeae clinical presentation | |
Song | PCR-based diagnostics for anaerobic infections | |
Cai et al. | Molecular genetic methods in the veterinary clinical bacteriology laboratory: current usage and future applications | |
Lynn et al. | Genetic typing of the porin protein of Neisseria gonorrhoeae from clinical noncultured samples for strain characterization and identification of mixed gonococcal infections | |
RU2360972C1 (en) | Method detection and evaluation of biotype, serogroup and toxigenicity of cholera agent and related kit | |
KR20080020475A (en) | A Novel Type-Specific Primer for Detection of Causative Wave Disease Caused by Multi-Polymerase Chain Reaction and Its Detection Method | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
Debruyne et al. | Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
Psarrakos et al. | Chlamydia trachomatis ompA genotypes in male patients with urethritis in Greece–Conservation of the serovar distribution and evidence for mixed infections with Chlamydophila abortus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111024 |