RU2366953C2

RU2366953C2 - Biochemiluminescent method for evaluation of phagocytic activity of neutrophils

Info

Publication number: RU2366953C2
Application number: RU2007139351/15A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Геннадьевич Дерябин (RU); Дмитрий Геннадьевич Дерябин; Ильшат Файзелгаянович Каримов (RU); Ильшат Файзелгаянович Каримов
Priority date: 2007-10-23
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2009-09-10
Also published as: RU2007139351A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to laboratory diagnostics and can be used for evaluation of phagocytic activity of neutrophils in human peripheral blood. Phagocytosis objects are recombinant luminescent bacteria, namely microorganisms Escherichia coli with cloned luxCDABE genes Photobacterium leiognathii, pre-opsonised during 10 min with normal human immunoglobulin in end concentration 6-10 mg/ml. Luminole is additionally introduced to the sample to end concentration 10^-3M. Intensity of luminole-dependent phagocytic chemoluminescence and bioluminescence of bacterial targets are counted separately by evaluating luminescence in two various spectral bands: <430 nm for evaluation of chemoluminescence and >540 nm for evaluation of bioluminescence.

EFFECT: possibility for complex evaluation of activation level of oxygen-dependent bactericidal phagocytic systems, and improved test accuracy.

1 ex, 1 tbl

Description

Область техники, к которой относится изобретение.The technical field to which the invention relates.

Изобретение относится к области биомедицинских измерительных технологий, а именно к способам оценки фагоцитарного звена иммунитета при ряде физиологических и патологических состояний. Необходимость проведения подобных исследований закреплена в «Номенклатуре клинических лабораторных исследований» (п.6.15.5. - Признаки реактивности нейтрофилов), утвержденной Приказом Министерства здравоохранения РФ №64 от 21.02.2000 г.The invention relates to the field of biomedical measuring technologies, and in particular to methods for assessing the phagocytic immunity in a number of physiological and pathological conditions. The need for such studies is enshrined in the "Clinical Laboratory Research Nomenclature" (Clause 6.15.5. - Signs of neutrophil reactivity), approved by Order of the Ministry of Health of the Russian Federation No. 64 of 02.21.2000.

В частности, изобретение предназначено для одновременного определения двух наиболее значимых и взаимосвязанных параметров фагоцитарной реакции: 1) интенсивности киллинга фагоцитируемых клеток-мишеней, являющегося наиболее интегральным показателем завершенности фагоцитоза; 2) активации кислородзависимого метаболизма фагоцитов, характеризующего состоятельность их бактерицидных систем и лежащего в основе развития киллингового эффекта.In particular, the invention is intended for the simultaneous determination of the two most significant and interrelated parameters of the phagocytic reaction: 1) the intensity of killing of phagocytized target cells, which is the most integral indicator of the completeness of phagocytosis; 2) activation of the oxygen-dependent metabolism of phagocytes, characterizing the viability of their bactericidal systems and underlying the development of the killing effect.

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях биологического и медицинского профиля, решающих вопросы оценки иммунного статуса организма и уровня его противоинфекционной резистентности с целью выявления их возможных нарушений и контроля эффективности соответствующих коррекционных мероприятий.Thus, the inventive method is intended for use in laboratories of a biological and medical profile, solving issues of assessing the immune status of an organism and the level of its anti-infection resistance in order to identify their possible violations and monitor the effectiveness of appropriate corrective measures.

Уровень техники.The prior art.

Реализация бактерицидного потенциала фагоцитов и обусловленный этим киллинг (умерщвление) бактериальных клеток после поглощения специализированными клетками крови являются одними из завершающих и наиболее важных этапов фагоцитарного процесса [1]. В связи с этим результаты их исследования служат интегральными показателями фагоцитоза, нарушения которого ведут к развитию пиогенных инфекций различной степени тяжести.Realization of the bactericidal potential of phagocytes and the resulting killing (killing) of bacterial cells after absorption by specialized blood cells are one of the final and most important stages of the phagocytic process [1]. In this regard, the results of their research serve as integral indicators of phagocytosis, violations of which lead to the development of pyogenic infections of varying severity.

Для оценки бактерицидности/киллинга предложен достаточно большой спектр различных способов и вариантов их выполнения.To assess bactericidal / killing a rather wide range of different methods and options for their implementation is proposed.

К наиболее простым из них следует отнести микроскопический метод, с использованием которого проводится подсчет обычных (жизнеспособных) и дегенеративных (разрушенных) микроорганизмов после совместной инкубации с фагоцитами в присутствии опсонизирующей сыворотки при 37°С в течение 1 часа и последующей окраски по Романовскому-Гимзе или иными красителями [2]. Однако, как и любая другая биомедицинская технология с визуальной оценкой, данный способ является весьма субъективным, а потому неточным.The simplest of them is the microscopic method, which is used to calculate the usual (viable) and degenerative (destroyed) microorganisms after joint incubation with phagocytes in the presence of opsonizing serum at 37 ° C for 1 hour and subsequent Romanovsky-Giemsa staining or other dyes [2]. However, like any other biomedical technology with a visual assessment, this method is very subjective, and therefore inaccurate.

Более надежен микробиологический метод, заключающийся в определении числа микроорганизмов, выживших после контакта с фагоцитами и за счет этого сохранивших способность к формированию изолированных колоний при выращивании на плотных питательных средах [3]. Для его реализации готовят смесь фагоцитов и опсонизированных микроорганизмов в соотношениях от 1:1 до 1:100, инкубируют при 37°С и через различные промежутки времени отбирают пробы, из которых, предварительно разрушив фагоциты, делают высевы на питательный агар. Еще через 18-24 часа инкубации подсчитывают количество выросших колоний, сравнивая их с таковым в контроле (посева из взвеси микроорганизмов без фагоцитов), после чего выражают киллинговую способность фагоцитов как % погибших микробных клеток. Данный способ чрезвычайно надежен, в связи с чем часто используется в качестве «золотого стандарта» при оценке киллинговой способности фагоцитов, однако достаточно трудоемок и позволяет получать результат не ранее суток от момента начала исследования.A more reliable microbiological method is to determine the number of microorganisms that survived after contact with phagocytes and, due to this, retained the ability to form isolated colonies when grown on solid nutrient media [3]. For its implementation, a mixture of phagocytes and opsonized microorganisms is prepared in ratios from 1: 1 to 1: 100, incubated at 37 ° C and samples are taken at various time intervals, from which, after destroying the phagocytes, they are plated on nutrient agar. After another 18-24 hours of incubation, the number of grown colonies is calculated by comparing them with that in the control (plating from suspension of microorganisms without phagocytes), after which the killing ability of phagocytes is expressed as% of dead microbial cells. This method is extremely reliable, and therefore is often used as the "gold standard" in assessing the killing ability of phagocytes, however, it is quite laborious and allows you to get the result no earlier than a day from the moment the study begins.

Наиболее современные методы оценки фагоцитоза основаны на введении в фагоцитарную систему дополнительных «меток», инструментальное исследование которых позволяет получить объективное и экспрессное представление об изучаемых явлениях.The most modern methods for assessing phagocytosis are based on the introduction of additional “tags” into the phagocytic system, the instrumental study of which allows you to get an objective and expressive idea of the phenomena studied.

В частности, известен радиоизотопный метод оценки фагоцитоза, основанный на предварительном маркировании микроорганизмов ³Н-тимидином [4], ³Н-глюкозой или ¹⁴С-аминокислотами. При этом о степени разрушения бактериальных клеток при фагоцитозе судят на основе учета распределения радиоактивности в супернатанте и клеточном осадке на различных сроках совместной инкубации микроорганизмов с фагоцитами. К преимуществам данного метода следует отнести его высокую чувствительность и объективность, к недостаткам же - необходимость использования радиоактивных веществ, а также относительно высокую стоимость используемого оборудования и расходных материалов.In particular, a radioisotope method for assessing phagocytosis is known, based on preliminary labeling of microorganisms with ³ H-thymidine [4], ³ H-glucose or ¹⁴ C-amino acids. At the same time, the degree of destruction of bacterial cells during phagocytosis is judged on the basis of the distribution of radioactivity in the supernatant and cell sediment at different periods of joint incubation of microorganisms with phagocytes. The advantages of this method include its high sensitivity and objectivity, but the disadvantages are the need to use radioactive substances, as well as the relatively high cost of the equipment and consumables used.

В свою очередь, цитофлюориметрический метод позволяет получить представление об интенсивности киллинга бактериальных клеток при ведении в фагоцитарную систему различных флюорохромов (карбокифлюоресцеина, пропидиума иодида и др.) - флюоресцирующих красителей, связывающимся с телами микробных клеток и при внешнем облучении сообщающих различный характер свечения их живым и убитым вариантам [5]. Применение подобного подхода с использованием специального прибора - проточного цитофлюориметра - позволяет в одном измерении анализировать несколько тысяч клеток и, тем самым, получать максимально объективные результаты. К причинам же, ограничивающим ее широкое использование, вновь следует отнести высокую стоимость используемого оборудования и расходных материалов.In turn, the cytofluorimetric method allows one to gain an idea of the intensity of bacterial cell killing when various fluorochromes (carbocifluorescein, propidium iodide, etc.) are introduced into the phagocytic system, which are fluorescent dyes that bind to the bodies of microbial cells and, when exposed to the external surface, communicate a different glow pattern to their living and killed options [5]. The application of this approach using a special device - a flow cytofluorimeter - allows you to analyze several thousand cells in one dimension and, thereby, get the most objective results. The reasons limiting its widespread use should again include the high cost of the equipment and consumables used.

По совокупности признаков наиболее близким к заявляемому и в этой связи характеризуемым как способ-прототип является биолюминесцентный метод оценки фагоцитоза [6], основанный на использовании в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных микроорганизмов вида Escherichia coli с клонированными в них генами биолюминесценции (lux⁺). Соответственно, снижение уровня биолюминесценции E.coli lux⁺ в процессе их взаимодействия с нейтрофилами периферической крови человека на 0, 10, 30 и 60 минутах инкубации по сравнению с контролем позволяет осуществить расчет фагоцитарной активности (ФА) по формуле ФА=100·(X₁-X₂)/X₁, где X₁ - интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х₂ - интенсивность биолюминесценции опытной пробы.By the totality of the characteristics, the bioluminescent method for assessing phagocytosis [6], based on the use of recombinant microorganisms of the Escherichia coli species with bioluminescence genes cloned in them (lux ⁺ ), is the closest to the claimed one and, therefore, characterized as a prototype method; Accordingly, a decrease in the level of E. coli lux ⁺ bioluminescence during their interaction with neutrophils of human peripheral blood at 0, 10, 30, and 60 minutes of incubation as compared to the control allows the calculation of phagocytic activity (FA) according to the formula FA = 100 · (X ₁ -X ₂ ) / X ₁ , where X ₁ is the intensity of the bioluminescence of the control sample, X ₂ is the intensity of the bioluminescence of the experimental sample.

Однако попытки использования данного способа заставляют констатировать существование ряда причин, препятствующих получению требуемого результата, а именно:However, attempts to use this method compel us to state the existence of a number of reasons that impede the achievement of the desired result, namely:

1) в формуле и описании способа-прототипа отсутствует процедура опсонизации бактериальных клеток, являющаяся одним из важнейших условий для воспроизведения фагоцитарной реакции [7];1) in the formula and description of the prototype method there is no procedure for the opsonization of bacterial cells, which is one of the most important conditions for reproducing the phagocytic reaction [7];

2) в формуле способа-прототипа и примере его использования описывается проведение взаимодействия бактерий с суспензией нейтрофилов, содержащей 25% аутоплазмы, которая потенциально может вести к развитию самостоятельных киллинговых эффектов, не связанных с фагоцитозом, но определяемых присутствием в ней гуморальных бактерицидных факторов [8];2) the formula of the prototype method and an example of its use describes the interaction of bacteria with a suspension of neutrophils containing 25% autoplasma, which can potentially lead to the development of independent killing effects not associated with phagocytosis, but determined by the presence of humoral bactericidal factors in it [8] ;

3) в формуле и описании способа-прототипа в качестве объекта для фагоцитоза упоминается генно-инженерный штамм E.coli lux⁺ без указания источника (донора) генетического материала, клонированного в данном микроорганизме и кодирующего ферменты, необходимые для формирования биолюминесценции. Вместе с тем рекомбинантные микроорганизмы на основе одного и того же штамма E.coli с клонированными lux-оперонами разных люминесцирующих бактерий при развитии бактерицидного эффекта демонстрируют различный, в том числе противоположный характер изменения уровня биолюминесценции [9].3) in the formula and description of the prototype method, the genetically engineered E. coli lux ⁺ strain is mentioned as an object for phagocytosis without specifying the source (donor) of the genetic material cloned in the given microorganism and encoding the enzymes necessary for the formation of bioluminescence. At the same time, recombinant microorganisms based on the same E. coli strain with cloned lux operons of different luminescent bacteria during the development of the bactericidal effect demonstrate different, including the opposite, changes in the level of bioluminescence [9].

Таким образом, отсутствие процедуры опсонизации, наличие в фагоцитарной системе дополнительных бактерицидных агентов, а также отсутствие четких требований к генно-инженерным люминесцирующим микроорганизмам, используемым в качестве объектов фагоцитоза, существенно снижает точность определения фагоцитарной активности нейтрофилов по способу-прототипу и делает его результаты сложноинтерпретируемыми.Thus, the absence of the opsonization procedure, the presence of additional bactericidal agents in the phagocytic system, as well as the lack of clear requirements for the genetic engineering luminescent microorganisms used as objects of phagocytosis, significantly reduces the accuracy of the determination of the phagocytic activity of neutrophils by the prototype method and makes its results difficult to interpret.

Еще одним недостатком способа-прототипа является невозможность получения информации об активности фагоцитарных систем, лежащих в основе киллингового эффекта и по современным представлениям определяемых существованием кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов [1], из которых первые являются ведущими. В их основе лежит активация гексозомонофосфатного шунта с окислением кислорода НАДФН-оксигеназной системой и образованием активных форм кислорода (АФК) - так называемый «респираторный взрыв» фагоцитов. При этом интенсивность респираторного взрыва может быть оценена по выраженности другого типа свечения - хемилюминесценции, возникающего при введении в фагоцитарную систему специальных люминофоров (например, люминола), при взаимодействии с АФК переходящих в возбужденное состояние с испусканием кванта света [10].Another disadvantage of the prototype method is the impossibility of obtaining information about the activity of phagocytic systems that underlie the killing effect and, according to modern concepts, are determined by the existence of oxygen-dependent and oxygen-independent mechanisms [1], of which the first are leading. They are based on the activation of the hexose monophosphate shunt with oxygen oxidation by the NADPH-oxygenase system and the formation of reactive oxygen species (ROS) - the so-called “respiratory explosion” of phagocytes. At the same time, the intensity of a respiratory explosion can be estimated by the severity of another type of glow - chemiluminescence, which occurs when special phosphors (for example, luminol) are introduced into the phagocytic system, and when they interact with ROS, they become excited with the emission of a quantum of light [10].

Вместе с тем способы раздельной одновременной или последовательной оценки хеми- и биолюминесценции в фагоцитарной системе, характеризующих как активность кислородзависимых систем фагоцитов, так и выраженность обусловленного их действием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней, неизвестны. Альтернативные подходы, ведущие к устранению данных недостатков, в доступной нам литературе также не описаны.At the same time, methods for separate simultaneous or sequential assessment of chemo- and bioluminescence in the phagocytic system, characterizing both the activity of oxygen-dependent systems of phagocytes and the severity of the killing effect associated with their action in relation to bacterial target cells, are unknown. Alternative approaches leading to the elimination of these shortcomings are also not described in the literature available to us.

Таким образом, заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.Thus, the claimed method is not known from the prior art, i.e. is new.

Сущность изобретения.SUMMARY OF THE INVENTION

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является одновременная раздельная оценка хеми- и биолюминесценции в фагоцитарной системе, позволяющая получить комплексное представление как об уровне активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов (по показателям люминолзависимой хемилюминесценции), так и выраженность обусловленного их действием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней (по показателям биолюминесценции). Дополнительной задачей, решаемой при осуществлении заявляемого способа оценки фагоцитоза, является повышение его точности за счет адаптированной процедуры опсонизации бактериальных клеток-мишеней, исключения из фагоцитарной системы иных бактерицидных факторов, а также использования биолюминесцирующего штамма с определенными биологическими (генетическими) характеристиками.The main task to be solved by the claimed method is the simultaneous separate assessment of chemiluminescence and bioluminescence in the phagocytic system, which allows to obtain a comprehensive idea of both the level of activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes (in terms of luminol-dependent chemiluminescence) and the severity of the killing effect in against bacterial target cells (in terms of bioluminescence). An additional problem to be solved when implementing the proposed method for assessing phagocytosis is to increase its accuracy due to the adapted procedure for the opsonization of bacterial target cells, the exclusion of other bactericidal factors from the phagocytic system, and the use of a bioluminescent strain with certain biological (genetic) characteristics.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, является следующее:The essence of the proposed method, formulated at the level of functional generalization and underlying it, is the following:

1) снижение уровня биолюминесценции при фагоцитозе, пропорциональное развитию киллингового эффекта, регистрируется при использовании в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi; при этом для исключения не связанных с фагоцитозом киллинговых эффектов их опсонизация проводится нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 6-10 мг/мл в течение 10 мин при 37°С.1) a decrease in the level of bioluminescence during phagocytosis, proportional to the development of the killing effect, is recorded when recombinant luminescent bacteria Escherichia coli with cloned luxCDABE genes Photobacterium leiognathi are used as phagocytized objects; in order to exclude killing effects not associated with phagocytosis, their opsonization is carried out with normal human immunoglobulin at a final concentration of 6-10 mg / ml for 10 min at 37 ° C.

2) раздельный учет интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней в фагоцитарной системе возможен в одной пробе путем оценки интенсивности свечения в двух различных диапазонах спектра (<430 нм при оценке хемилюминесценции и >540 нм при оценке биолюминесценции) или в двух отдельных пробах, в одну из которых люминесцирующие бактерии вносят после дополнительной инкубации при 42°С в течение 10 минут (для подавления биолюминесценции), а в другую не вносят люминол (для исключения хемилюминесценции).2) separate accounting of the intensity of the luminol-dependent chemiluminescence of phagocytes and the bioluminescence of bacterial target cells in the phagocytic system is possible in one sample by evaluating the luminous intensity in two different spectral ranges (<430 nm when assessing chemiluminescence and> 540 nm when assessing bioluminescence) or in two separate samples , in one of which luminescent bacteria are introduced after additional incubation at 42 ° C for 10 minutes (to suppress bioluminescence), and in the other, luminol is not added (to exclude chemilum inescence).

Соответственно, при реализации заявляемого способа оценки фагоцитоза характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления в сравнении со способом-прототипом представляются следующим образом (таблица 1).Accordingly, when implementing the proposed method for assessing phagocytosis, the characteristics of the actions, the order of their implementation and the conditions for implementation in comparison with the prototype method are presented as follows (table 1).

На первом (подготовительном) этапе готовят компоненты реакции: фагоцитируемые объекты (рекомбинантные люминесцирующие бактерии) и фагоцитирующие клетки (нейтрофилы периферической крови человека). При этом в соответствии с формулой заявляемого способа в качестве фагоцитируемых объектов используют микроорганизмы вида Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi. В частности, в качестве подобной бактериальной культуры могут использоваться генно-инженерный штамм E.coli, производимый МГУ им. М.В.Ломоносова под названием «Эколюм-9» [11], или E.coli Z905, депонированный в «Коллекции культур светящихся бактерий» Института биофизики Сибирского отделения Российской академии наук [12] и производимый ИБСО РАН под названием «Микробиосенсор E.coli Z905». Оба названных микроорганизма выпускаются в лиофилизированном состоянии, из которого перед выполнением исследований их восстанавливают добавлением холодной дистиллированной воды и выдерживают в течение 30 минут при 4°С для стабилизации уровня биолюминесценции. После этого микроорганизмы смешивают в равных объемах с коммерческим препаратом нормального иммуноглобулина человека, так чтобы его конечная концентрация составляла 6-10 мг/мл, а конечная концентрация бактерий равнялась 5×10⁸/мл. Полученную смесь выдерживают при 37°С в течение 10 мин. Для получения фагоцитов цельную кровь в количестве 2-4 мл забирают из локтевой вены в силиконированную или пластиковую пробирку, содержащую гепарин (50 Ед/мл), после чего выдерживают в течение 2 часов при 4°С для разделения эритроцитов (нижняя фаза) и обогащенной лейкоцитами плазмы (верхняя фаза). Содержимое верхней фазы наслаивают на двойной градиент фиколл-верографина с плотностями 1,077 г/мл и 1,112 г/мл, после чего центрифугируют в течение 45 мин при 1500 об/мин. После разделения нейтрофилы собирают с нижней интерфазы, отмывают холодным физиологическим раствором и ресуспендируют в среде 199 до концентрации 5×10⁶/мл.At the first (preparatory) stage, the reaction components are prepared: phagocytized objects (recombinant luminescent bacteria) and phagocytic cells (neutrophils of human peripheral blood). Moreover, in accordance with the formula of the proposed method, microorganisms of the Escherichia coli species with cloned luxCDABE genes Photobacterium leiognathi are used as phagocytized objects. In particular, a genetically engineered E. coli strain produced by Moscow State University can be used as a similar bacterial culture. M.V. Lomonosov under the name "Ekolyum-9" [11], or E.coli Z905, deposited in the "Collection of cultures of luminous bacteria" of the Institute of Biophysics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences [12] and produced by the Institute of Biotechnology RAS under the name "E. Microbiosensor coli Z905 ". Both of these microorganisms are released in a lyophilized state, from which, before performing studies, they are restored by adding cold distilled water and kept for 30 minutes at 4 ° C to stabilize the level of bioluminescence. After that, the microorganisms are mixed in equal volumes with a commercial preparation of normal human immunoglobulin, so that its final concentration is 6-10 mg / ml, and the final concentration of bacteria is 5 × 10 ⁸ / ml. The resulting mixture was maintained at 37 ° C for 10 minutes. To obtain phagocytes, whole blood in an amount of 2-4 ml is taken from the ulnar vein into a siliconized or plastic tube containing heparin (50 U / ml), and then kept for 2 hours at 4 ° C to separate red blood cells (lower phase) and enriched white blood plasma (upper phase). The contents of the upper phase are layered on a double gradient of ficoll-verographin with densities of 1.077 g / ml and 1.112 g / ml, after which they are centrifuged for 45 minutes at 1500 rpm. After separation, neutrophils are collected from the lower interphase, washed with cold saline and resuspended in medium 199 to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml.

Особенностями этапа, принципиально отличающими его от такового по способу-прототипу, являются: 1) использование в качестве объектов фагоцитоза рекомбинантных штаммов Escherichia coli с определенной характеристикой клонированных в них luxCDABE генов из природного морского люминесцирующего микроорганизма вида Photobacterium leiognathi, для которых показана количественная зависимость снижения уровня биолюминесценции от выраженности киллингового эффекта (см. ниже); 2) проведение опсонизации данного микроорганизма в режиме, обеспечивающем его последующий фагоцитоз, но исключающем развитие не связанного с ним бактерицидного эффекта (см. ниже). При выполнении способа по п.3 формулы заявляемого изобретения, кроме того, делят пробу опсонизированных люминесцирующих бактерий на две равные части, одну из которых дополнительно инкубируют при 42°С в течение 10 минут для подавления активности ферментной системы генерации свечения.The features of the stage that fundamentally distinguish it from that of the prototype method are: 1) the use of phagocytosis objects of recombinant Escherichia coli strains with a specific characteristic of the luxCDABE clones cloned in them from the natural marine luminescent microorganism of the species Photobacterium leiognathi, for which a quantitative dependence of the decrease in level is shown bioluminescence from the severity of the killing effect (see below); 2) carrying out the opsonization of this microorganism in a regimen ensuring its subsequent phagocytosis, but excluding the development of an antibacterial effect not associated with it (see below). When performing the method according to claim 3 of the claims, in addition, the sample of opsonized luminescent bacteria is divided into two equal parts, one of which is additionally incubated at 42 ° C for 10 minutes to suppress the activity of the enzymatic system for generating luminescence.

На втором (основном) этапе выполнения способа формируют фагоцитарную систему путем смешивания 1 объема опсонизированных люминесцирующих бактерий с концентрацией 5×10⁸/мл и 9 объемов фагоцитов с концентрацией 5×10⁶/мл, так что достигаемое соотношение «бактерии:фагоциты» составляет 10:1. Полученную смесь инкубируют в течение 60 минут при 37°С в термостате или измерительной ячейке люминометра (если последний имеет функцию термостатирования).At the second (main) stage of the method, a phagocytic system is formed by mixing 1 volume of opsonized luminescent bacteria with a concentration of 5 × 10 ⁸ / ml and 9 volumes of phagocytes with a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml, so that the achieved ratio of “bacteria: phagocytes” is 10 :one. The resulting mixture is incubated for 60 minutes at 37 ° C in a thermostat or measuring cell of a luminometer (if the latter has a thermostating function).

Содержание этапа - фагоцитоз с активацией кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и формированием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней - также имеет отличия от такового в способе-прототипе, т.к.: 1) в смесь не добавляют аутоплазму, способную инициировать не связанные с фагоцитозом киллинговые эффекты (см. ниже) и, тем самым, исказить результаты исследования; 2) в смесь добавляют люминол в конечной концентрации 10^-3М, при окислении генерируемыми фагоцитами активными формами кислорода формирующий собственное, отличное от биолюминесценции свечение - хемилюминесценцию. При выполнении способа по п.3 формулы заявляемого изобретения параллельно готовят две фагоцитарные системы, в одну из которых вносят опсонизированные люминесцирующие бактерии, но не вносят люминол, а в другую вносят опсонизированные люминесцирующие бактерии, дополнительно инкубированные при при 42°С в течение 10 минут, и люминол.The content of the stage — phagocytosis with activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes and the formation of a killing effect in relation to bacterial target cells — also differs from that in the prototype method, because: 1) autoplasma capable of initiating unrelated phagocytosis is not added to the mixture killing effects (see below) and, thereby, distort the results of the study; 2) luminol is added to the mixture at a final concentration of 10 ^-3 M; when oxidized by active forms of oxygen generated by phagocytes, it forms its own, different from bioluminescence, chemiluminescence. When performing the method according to claim 3 of the formula of the claimed invention, two phagocytic systems are prepared in parallel, in one of which add opsonized luminescent bacteria, but do not add luminol, and in the other add opsonized luminescent bacteria, additionally incubated at 42 ° C for 10 minutes, and luminol.

На завершающем этапе осуществления заявляемого способа проводят измерение интенсивности свечения в фагоцитарной системе с использованием прибора - люминометра, на основании чего рассчитывают показатели, характеризующие активность фагоцитоза. При этом свечение измеряется на 0, 10, 30 и 60 мин или в непрерывном режиме (в случае инкубации пробы в измерительной термостатируемой ячейке). В частности, в качестве измерительного прибора при реализации заявляемого способа может использоваться двухканальный биохемилюминометр 8802М2К (СКТБ «Наука», Красноярск), обеспечивающий термостатирование изучаемой пробы и непрерывное измерение интенсивности ее свечения, в том числе в двух диапазонах длин волн или одновременно в двух анализируемых пробах. При выполнении способа по п.3 формулы заявляемого изобретения также могут использоваться биохемилюминометр БХЛ-6 (НПО «Биофармавтоматика», Нижний Новгород), БЛМ 8802 М (СКТБ «Наука», Красноярск), а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, обеспечивающие возможность количественного измерения интенсивности свечения в области спектра 380-600 нм. В свою очередь, итоговый расчет показателей активности фагоцитоза проводят по формуле:

, где ΣимпК - сумма импульсов, испускаемых фагоцитарной системой в контроле (в том числе на 0 секунде исследования), ΣимпО - сумма импульсов, испускаемых фагоцитарной системой в опыте.At the final stage of the implementation of the proposed method, the luminescence intensity is measured in the phagocytic system using a luminometer, based on which indicators characterizing the activity of phagocytosis are calculated. In this case, the luminescence is measured for 0, 10, 30 and 60 min or in continuous mode (in the case of incubation of the sample in a measuring thermostatic cell). In particular, as a measuring device when implementing the proposed method, a 8802M2K biochemiluminometer (SKTB Nauka, Krasnoyarsk) can be used, which provides thermostating of the studied sample and continuous measurement of its luminosity, including in two wavelength ranges or simultaneously in two analyzed samples . When performing the method according to claim 3 of the claims, the BHL-6 biochemiluminometer (NPO Biofarmavtomatika, Nizhny Novgorod), BLM 8802 M (SKTB Nauka, Krasnoyarsk), as well as other domestic and foreign luminometers providing the possibility of quantitative measuring the intensity of the glow in the spectral region of 380-600 nm. In turn, the final calculation of indicators of phagocytosis activity is carried out according to the formula:

where Σimp is the sum of impulses emitted by the phagocytic system in control (including at 0 second of the study), Σimp is the sum of impulses emitted by the phagocytic system in the experiment.

Основным отличием данного этапа от такового в способе-прототипе, в значительной степени определяющим новизну всего изобретения, является то, что интенсивность свечения фагоцитарной системы оценивается раздельно в двух диапазонах спектра: <430 нм и >540 нм.The main difference between this stage and that in the prototype method, which largely determines the novelty of the entire invention, is that the luminescence intensity of the phagocytic system is evaluated separately in two spectral ranges: <430 nm and> 540 nm.

Таблица 1Table 1 Сравнительная характеристика действий, порядка их выполнения и условий осуществления при оценке фагоцитоза с использованием заявляемого способа и способа-прототипа*A comparative description of the actions, the order of their implementation and the conditions of implementation when assessing phagocytosis using the proposed method and the prototype method * Сравниваемые характеристикиCompare Features Способ - прототипMethod - prototype Заявляемый способThe inventive method I этап - подготовительныйStage I - preparatory Фагоцитируемый объект и его подготовкаPhagocytosis object and its preparation Escherichia coli lux⁺, восстановленный из лиофилизированного состоянияEscherichia coli lux ⁺ reconstituted from lyophilized state Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi, восстановленный из лиофилизированного состоянияEscherichia coli with cloned luxCDABE genes Photobacterium leiognathi, restored from the lyophilized state Опсонизация фагоцитируемого объектаOpsonization of a phagocytized object -- Инкубация в контакте с нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 6-10 мг/мл в течение 10 мин при 37°СIncubation in contact with normal human immunoglobulin at a final concentration of 6-10 mg / ml for 10 min at 37 ° C Фагоциты и их подготовкаPhagocytes and their preparation Нейтрофилы периферической крови человека, фракционированные на двойном градиенте фиколл-верграфина и разведенные до концентрации 5·10⁶/млHuman peripheral blood neutrophils fractionated on a double gradient of ficoll-vergrafin and diluted to a concentration of 5 · 10 ⁶ / ml То жеAlso II этап - основной (фагоцитоз)Stage II - the main (phagocytosis) Соотношение бактерия:фагоцитThe ratio of bacteria: phagocyte 10:110: 1 То жеAlso Присутствие аутоплазмыThe presence of autoplasma 25%25% -- Присутствие люминолаThe presence of luminol -- 10^-3М10 ^-3 M Температура инкубацииIncubation temperature 37°С37 ° C То жеAlso Время инкубацииIncubation time 60 мин60 min То жеAlso III этап - завершающий (регистрация результата реакции)Stage III - final (registration of the reaction result) Метод регистрацииRegistration method ЛюминометрияLuminometry То жеAlso Диапазон для измерения люминесценцииRange for measuring luminescence 380-600 нм380-600 nm <430 нм при измерении хемилюминесценции >540 нм при измерении биолюминесценции<430 nm when measuring chemiluminescence> 540 nm when measuring bioluminescence Формула расчетаCalculation formula

Also Research result % killing of bacterial target cells The same + degree of activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes Note: * - in accordance with paragraphs 1 and 2 of the claims

Проведение измерений в первом диапазоне позволяет оценить интенсивность люминолзависимой хемилюминесценции и на ее основе сформировать представление о степени активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов, а во втором - на основе изменения уровня биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней количественно оценить выраженность развивающегося в отношении них киллингового эффекта. При выполнении же способа по п.3 формулы заявляемого изобретения аналогичные заключения делают на основании измерения интенсивности свечения, проводится во всем спектре длин волн (380-600 нм), но в двух пробах: 1) с добавлением люминола и инкубированных при 42°С бактерий, в которой формируется только хемилюминесценция; 2) без добавления люминола с опсонизированными люминесцирующими бактериями, в которой формируется только биолюминесценция.Carrying out measurements in the first range makes it possible to evaluate the intensity of luminol-dependent chemiluminescence and on its basis to form an idea of the degree of activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes, and in the second, based on changes in the level of bioluminescence of bacterial target cells, to quantify the severity of the killing effect developing in relation to them. When performing the same method according to claim 3 of the claimed invention, similar conclusions are made on the basis of measuring the glow intensity, is carried out in the entire spectrum of wavelengths (380-600 nm), but in two samples: 1) with the addition of luminol and bacteria incubated at 42 ° C , in which only chemiluminescence is formed; 2) without the addition of luminol with opsonized luminescent bacteria, in which only bioluminescence is formed.

Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:The ability to obtain a technical result when performing the above actions in the indicated ranges of values is determined by the following complex of cause-effect relationships:

1) в качестве объекта для фагоцитоза при осуществлении биохемилюминесцентного способа его оценки может использоваться не любой рекомбинантный (генно-инженерный) штамм Escherichia coli с клонированными в нем генами люминесцентной системы, в наиболее общем виде обозначаемый E.coli lux⁺ (как в способе-прототипе), а только рекомбинантные штаммы с определенной генетической характеристикой, а именно - с клонированными luxCDABE генами морских люминесцирующих Photobacterium leiognathi. Обоснованием для подобного утверждения являются полученные экспериментальные данные о том, что именно данные микроорганизмы демонстрируют в фагоцитарной системе пропорциональность между снижением уровня биолюминесценции и выраженностью развивающегося в отношении них киллингового эффекта, отсутствующую у других генно-инженерных вариантов E.coli lux⁺.1) not any recombinant (genetically engineered) strain of Escherichia coli with luminescent system genes cloned in it, most commonly referred to as E. coli lux ⁺ (as in the prototype method) can be used as an object for phagocytosis in the implementation of the bio-chemiluminescent method of its assessment ), but only recombinant strains with a certain genetic characteristic, namely with cloned luxCDABE genes of marine luminescent Photobacterium leiognathi. The justification for such a statement is the experimental data obtained that these microorganisms in the phagocytic system demonstrate a proportionality between the decrease in the level of bioluminescence and the severity of the killing effect developing in relation to them, which is absent in other genetically engineered variants of E. coli lux ⁺ .

Так рекомбинантные штаммы E.coli с клонированными luxCDABE генами Р.leiognathi, представленные двумя независимыми вариантами, выпускаемыми под коммерческими названиями «Микробиосенсор E.coli Z905» (ИБСО РАН) и «Эколюм-9» (МГУ им. М.В.Ломоносова), при введении в фагоцитарную систему характеризовались прогрессирующим угнетением уровня биолюминесценции, что сопровождалось пропорциональным снижением количества жизнеспособных микроорганизмов при высеве на плотные питательные среды (коэффициент корреляции r=0,96; t=7,l 1; Р<0,001). В то же время другой генно-инженерный штамм E.coli с клонированными luxCDABE генами почвенного люминесцирующего микроорганизма Photorhabdus luminescence, выпускаемый под коммерческими названиями «Эколюм-8» (МГУ им. М.В.Ломоносова), в тех же условиях отвечал стимуляцией уровня свечения, противоположной динамике развития киллингового эффекта.Thus, recombinant E. coli strains with luxCDABE cloned P. leiognathi genes represented by two independent variants sold under the commercial names “E.coli Z905 Microbiosensor” (IBSO RAS) and “Ekolyum-9” (Lomonosov Moscow State University) , when introduced into the phagocytic system, they were characterized by progressive inhibition of the level of bioluminescence, which was accompanied by a proportional decrease in the number of viable microorganisms when plated on solid nutrient media (correlation coefficient r = 0.96; t = 7, l 1; P <0.001). At the same time, another genetically engineered strain of E. coli with the cloned luxCDABE genes of the soil luminescent microorganism Photorhabdus luminescence, marketed under the trade names Ecolum-8 (Lomonosov Moscow State University), responded under the same conditions with stimulation of the level of luminescence opposite to the dynamics of the development of the killing effect.

2) опсонизация фагоцитируемых частиц является одним из основных условий для эффективного фагоцитоза, однако проведение этой процедуры по способу-прототипу не предусмотрено. Причиной этого является невозможность рутинной процедуры опсонизации с использованием сыворотки/плазмы крови, так как в отличие от ее использования для опсонизации грамположительных микроорганизмов данная гуморальная система способна оказать на жизнеспособность грамотрицательных бактерий (в т.ч. E.coli) самостоятельное, предшествующее фагоцитозу, бактерицидное воздействие. При обосновании подходов к решению данного вопроса был изучен ряд факторов, потенциально обладающих опсонизирующим эффектом, а именно: плазма крови, сыворотка крови, термоинактивированная (+56°С, 10 мин) сыворотка крови, комплемент (комплемент морской свинки), иммуноглобулины (нормальный иммуноглобулин человека). В качестве критериев использовались: а) отсутствие выраженного ингибирующего влияния на биолюминесценцию бактериальных клеток; б) отсутствие киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток; в) способность активировать фагоцитоз бактериальных клеток (собственно опсонизирующий эффект).2) the opsonization of phagocytized particles is one of the main conditions for effective phagocytosis, however, this procedure is not carried out according to the prototype method. The reason for this is the impossibility of a routine opsonization procedure using serum / plasma, since, in contrast to its use for opsonization of gram-positive microorganisms, this humoral system is capable of exerting an independent bactericidal, preceding phagocytosis, viability of gram-negative bacteria (including E. coli) impact. When substantiating approaches to solving this issue, a number of factors with the potential opsonizing effect were studied, namely: blood plasma, blood serum, heat-inactivated (+ 56 ° C, 10 min) blood serum, complement (guinea pig complement), immunoglobulins (normal immunoglobulin person). The following criteria were used: a) the absence of a pronounced inhibitory effect on the bioluminescence of bacterial cells; b) the lack of a killing effect in relation to bacterial cells; c) the ability to activate phagocytosis of bacterial cells (the actual opsonizing effect).

Таблица 2table 2 Сравнительная характеристика факторов, потенциально используемых для опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coliComparative characterization of factors potentially used for the opsonization of recombinant luminescent bacteria Escherichia coli Опсонизирующие факторыOpsonizing factors критерии их оценкиevaluation criteria Ингибиция уровня свечения на этапе опсонизации*Inhibition of the level of luminescence at the stage of opsonization * Развитие собственного (не связанного с фагоцитозом) киллингового эффекта**Development of own (not associated with phagocytosis) killing effect ** Активация фагоцитов***Phagocyte activation *** 1. Контроль (без опсонизирующих агентов)1. Control (without opsonizing agents) -- -- 140,0±6,4140.0 ± 6.4 2. Плазма крови2. Blood plasma 77,7±7,377.7 ± 7.3 78,2±7,478.2 ± 7.4 191,8±8,8191.8 ± 8.8 3. Сыворотка крови3. Blood serum 80,8±6,580.8 ± 6.5 85,8±8,685.8 ± 8.6 160,7±11,4160.7 ± 11.4 4. Термоинактивированная сыворотка крови4. Thermally inactivated blood serum 22,7±3,722.7 ± 3.7 9,1±6,49.1 ± 6.4 216,6±13,3216.6 ± 13.3 5. Комплемент5. Complement 69,8±5,369.8 ± 5.3 22,2±10,422.2 ± 10.4 273,3±14,9273.3 ± 14.9 6. Иммуноглобулины6. Immunoglobulins -- -- 556,2±54,4556.2 ± 54.4 Примечания: * - в % от исходного уровня свечения; ** - в % от исходного количества колониеобразующих единиц; *** - в % от фонового (нестимулированного) уровня люминолзависимой хемилюминесценцииNotes: * - in% of the initial glow level; ** - in% of the initial number of colony forming units; *** - in% of the background (unstimulated) level of luminol-dependent chemiluminescence

Полученные результаты, обобщенные в таблице 2, свидетельствовали о том, что большинство изученных факторов оказывали на уровень биолюминесценции и жизнеспособность бактериальных клеток E.coli выраженный ингибирующий эффект, негативно влияющий на их последующий опсонофагоцитоз. На этом фоне единственным фактором, применимым для заявленной цели, оказался нормальный иммуноглобулин человека, инкубация в контакте с которым в конечной концентрации 6-10 мг/мл в течение 10 мин при 37°С вела к умеренно выраженной (<20% от исходного уровня) стимуляции биолюминесценции, не вызывала развития бактерицидного эффекта, но позволяла достичь последующей активации фагоцитов, более чем в 5 раз превышающей фоновый уровень их хемилюминесценции и в 4 раза превышающей таковую при использовании интактных (неопсонизированных) бактерий.The results obtained, summarized in table 2, showed that most of the studied factors had a pronounced inhibitory effect on the level of bioluminescence and viability of E.coli bacterial cells, negatively affecting their subsequent opsonophagocytosis. Against this background, the only factor applicable for the stated purpose was normal human immunoglobulin, incubation in contact with which at a final concentration of 6-10 mg / ml for 10 min at 37 ° C led to moderately expressed (<20% of the initial level) stimulation of bioluminescence, did not cause the development of a bactericidal effect, but allowed to achieve subsequent activation of phagocytes, more than 5 times higher than the background level of their chemiluminescence and 4 times higher than that when using intact (non-opsonized) bacteria.

При этом возможность опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий E.coli с использованием нормального иммуноглобулина человека определяется отсутствием в его составе белков системы комплемента и других гуморальных факторов, способных оказать бактерицидный эффект и, как следствие, вызвать ингибицию уровня их свечения. Одновременно формирование опсонизирующего эффекта определяется присутствием в составе нормального иммуноглобулина человека антител, специфичных к липополисахаридам энтеробактерий и после связывания с ними способных взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране нейтрофилов периферической крови человека.In this case, the possibility of opsonization of recombinant luminescent E. coli bacteria using normal human immunoglobulin is determined by the absence of complement system proteins and other humoral factors in its composition that can have a bactericidal effect and, as a result, cause inhibition of their level of luminescence. At the same time, the formation of an opsonizing effect is determined by the presence of antibodies specific to enterobacteria lipopolysaccharides in the normal human immunoglobulin and, after binding to them, capable of interacting with Fc receptors on the membrane of human peripheral blood neutrophils.

3) приведенные выше результаты экспериментальных исследований также свидетельствуют о невозможности получения результата по способу-прототипу, так как введение в фагоцитарную систему 25% аутоплазмы обуславливает развитие самостоятельного (не связанного с фагоцитозом) киллингового эффекта и, как следствие, не связанного с фагоцитозом снижение уровня биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней.3) the above results of experimental studies also indicate the impossibility of obtaining the result by the prototype method, since the introduction of 25% autoplasma into the phagocytic system causes the development of an independent (not associated with phagocytosis) killing effect and, as a consequence, a decrease in the level of bioluminescence not associated with phagocytosis bacterial target cells.

4) возможность раздельной оценки люминолзависимой хемилюминесценции, формируемой в результате активации (окислительного взрыва) фагоцитов, и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней основана на экспериментальных данных о различиях в спектрах их световой эмиссии (таблица 3).4) the possibility of a separate assessment of luminol-dependent chemiluminescence formed as a result of activation (oxidative explosion) of phagocytes and bioluminescence of bacterial target cells is based on experimental data on the differences in the spectra of their light emission (table 3).

Полученные результаты свидетельствуют о существовании достаточно существенной зоны «перекрывания» двух сравниваемых спектров. Однако спектр хемилюминесценции люминола сдвинут в сторону коротких волн, так что его отдельный учет возможен в диапазоне <430 нм. В свою очередь, спектр бактериальной биолюминесценции характеризуется сдвигом в сторону более длинных волн, так что ее отдельный учет возможен в диапазоне >540 нм.The results obtained indicate the existence of a sufficiently substantial zone of “overlap” of the two compared spectra. However, the chemiluminescence spectrum of luminol is shifted towards short waves, so that its separate accounting is possible in the range <430 nm. In turn, the spectrum of bacterial bioluminescence is characterized by a shift towards longer waves, so that its separate accounting is possible in the range> 540 nm.

Таблица 3Table 3 Сравнительная характеристика спектров хемилюминесценции люминола и бактериальной биолюминесценции*Comparative characteristics of the chemiluminescence spectra of luminol and bacterial bioluminescence * Оцениваемый диапазон спектраEstimated Spectrum Range Хемилюминесценция люминолаChemiluminescence of luminol Бактериальная биолюминесценцияBacterial Bioluminescence 400±5 нм400 ± 5 nm 4,054.05 00 420±5 нм420 ± 5 nm 8,058.05 00 440±5 нм440 ± 5 nm 11,6111.61 0,750.75 460±5 нм460 ± 5 nm 11,1511.15 5,065.06 480±5 нм480 ± 5 nm 6,456.45 12,0112.01 500±5 нм500 ± 5 nm 8,638.63 11,6111.61 520±5 нм520 ± 5 nm 3,843.84 9,159.15 540±5 нм540 ± 5 nm 00 6,226.22 560±5 нм560 ± 5 nm 00 3,133.13 Примечание: * - в % от суммарной интенсивности свечения.Note: * - in% of the total intensity of the glow.

5) возможность другого подхода к раздельной оценке люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней основана на выявленной возможности термоинактивации (42°С, 10 мин) клонированной в E.coli ферментной системы генерации свечения P.leiognathi без изменения жизнеспособности реципиентных бактериальных клеток (таблица 4). Кроме того, установлено, что в исследованном интервале температур это невозможно для другого генно-инженерного штамма E.coli, содержащего ферментную систему генерации свечения почвенного люминесцирующего микроорганизма P.luminescence, что еще раз указывает на возможность осуществления способа только с использованием рекомбинантных штаммов с определенной генетической характеристикой (см. выше).5) the possibility of another approach to the separate assessment of the luminol-dependent chemiluminescence of phagocytes and the bioluminescence of bacterial target cells is based on the revealed possibility of thermal inactivation (42 ° C, 10 min) of the P. leiognathi luminescent enzyme generation system cloned in E. coli without changing the viability of the recipient bacterial cells (table four). In addition, it was found that in the studied temperature range this is not possible for another gene engineering strain of E. coli containing the enzyme system for generating luminescence of the soil luminescent microorganism P. luminescence, which once again indicates the possibility of the method only using recombinant strains with a certain genetic characteristic (see above).

Таблица 4Table 4 Интенсивность свечения* рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli при воздействии различных температур (10 мин)Glow intensity * of recombinant luminescent E. coli strains when exposed to various temperatures (10 min) Исследуемые штаммыThe studied strains Температура инкубацииIncubation temperature 37°С37 ° C 38°С38 ° C 39°С39 ° C 40°С40 ° C 41°С41 ° C 42°С42 ° C E.coli с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi («Микробиосенсор E.coli Z905» и «Эколюм-9»)E.coli with cloned luxCDABE genes P.leiognathi ("Microbiosensor E.coli Z905" and "Ekolyum-9") 100%one hundred% 83%83% 31%31% 11%eleven% 2%2% 0%0% E.coli с клонированными luxCDABE генами P.luminescence («Эколюм-8»)E. coli with cloned luxCDABE genes P. luminescence ("Ekolyum-8") 100%one hundred% 133%133% 84%84% 65%65% 53%53% 42%42% Примечание: * - в % от исходного уровня, регистрируемого при 37°СNote: * - in% of the initial level recorded at 37 ° C

Полученные результаты явились обоснованием возможности проведения исследований во всем спектре длин волн (380-600 нм), но в двух пробах: 1) фагоциты + люминол + инкубированные при 42°С опсонизированные бактерии (учитывается только хемилюминесценция); 2) фагоциты + опсонизированные люминесцирующие бактерии (учитывается только биолюминесценция).The results obtained justified the possibility of conducting studies in the entire spectrum of wavelengths (380-600 nm), but in two samples: 1) phagocytes + luminol + opsonized bacteria incubated at 42 ° C (only chemiluminescence is taken into account); 2) phagocytes + opsonized luminescent bacteria (only bioluminescence is taken into account).

Таким образом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условия осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».Thus, summarizing the above materials about the essence of the proposed method, the characteristics of the actions, the order of their implementation and the conditions for implementation, we can state that the inventive method does not follow from the prior art and should be evaluated as meeting the criterion of "inventive step".

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.Information confirming the possibility of carrying out the invention.

Последовательность выполнения действий при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими:The sequence of actions during the implementation of the proposed method, their conditions and modes are as follows:

1) Для получения фагоцитов цельную кровь в количестве 2-4 мл забирают из локтевой вены в силиконированную или пластиковую пробирку, содержащую гепарин (50 Ед/мл), после чего выдерживают в течение 2 часов при 4°С для разделения эритроцитов (нижняя фаза) и обогащенной лейкоцитами плазмы (верхняя фаза). Содержимое верхней фазы наслаивают на двойной градиент фиколл-верографина с плотностями 1,077 г/мл и 1,112 г/мл, после чего центрифугируют в течение 45 мин при 1500 об/мин. После разделения нейтрофилы собирают с нижней интерфазы, отмывают холодным физиологическим раствором и ресуспендируют в среде 199 до концентрации 5×10⁶/мл.1) To obtain phagocytes, whole blood in an amount of 2-4 ml is taken from the ulnar vein into a silicone or plastic tube containing heparin (50 U / ml), and then kept for 2 hours at 4 ° C to separate red blood cells (lower phase) and plasma enriched with white blood cells (upper phase). The contents of the upper phase are layered on a double gradient of ficoll-verographin with densities of 1.077 g / ml and 1.112 g / ml, after which they are centrifuged for 45 minutes at 1500 rpm. After separation, neutrophils are collected from the lower interphase, washed with cold saline and resuspended in medium 199 to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml.

2) Для получения фагоцитируемых объектов готовят суспензию живых люминесцирующих бактерий - рекомбинантнтных E.coli с клонированными luxCDABE генами морских люминесцирующих Photobacterium leiognathi, используя для этого лиофилизированый препарат под коммерческим названием «Микробиосенсор E.coli Z 905» или «Эколюм-9». Непосредственно перед проведением исследований микроорганизмы в составе этих препаратов восстанавливают из лиофилизированного состояния добавлением холодной дистиллированной воды, после чего выдерживают в течение 30 минут при 4°С для стабилизации уровня биолюминесценции.2) To obtain phagocytosed objects, a suspension of live luminescent bacteria — recombinant E. coli with luxCDABE cloned marine luminescent Photobacterium leiognathi clones — is prepared using a lyophilized preparation under the commercial name E.coli Z 905 Microbiosensor or Ecolyum-9. Immediately before the studies, microorganisms in the composition of these preparations are restored from the lyophilized state by the addition of cold distilled water, after which they are kept at 4 ° C for 30 minutes to stabilize the level of bioluminescence.

3) Для проведения опсонизации фагоцитируемых объектов микроорганизмы смешивают в равных объемах с коммерческим препаратом нормального иммуноглобулина человека, так чтобы его конечная концентрация составляла 6-10 мг/мл, а конечная концентрация бактерий равнялась 5×10⁸/мл. Полученную смесь выдерживают при 37°С в течение 10 мин.3) For opsonization of phagocytosed objects, microorganisms are mixed in equal volumes with a commercial preparation of normal human immunoglobulin, so that its final concentration is 6-10 mg / ml, and the final concentration of bacteria is 5 × 10 ⁸ / ml. The resulting mixture was maintained at 37 ° C for 10 minutes.

При выполнении исследований по п.3 формулы изобретения полученную взвесь опсонизированных микроорганизмов разделяют на две равные части, одну из которых дополнительно инкубируют при 42°С в течение 10 мин для подавления активности ферментной системы генерации свечения.When performing the research according to claim 3 of the claims, the obtained suspension of opsonized microorganisms is divided into two equal parts, one of which is additionally incubated at 42 ° C for 10 min to suppress the activity of the enzymatic system for generating luminescence.

4) В измерительную кювету люминометра последовательно вносят 0,88 мл нейтрофилов периферической крови человека, суспендированных в среде 199 до концентрации 5×10⁶/мл, раствор люминола до конечной концентрации 10^-3М, а также 0,1 мл взвеси опсонизированных люминесцирующих бактерий с концентрацией 5×10⁸/мл, так что достигаемое соотношение «бактерии:фагоциты» составляет 10:1.4) 0.88 ml of human peripheral blood neutrophils, suspended in medium 199 to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml, a solution of luminol to a final concentration of 10 ^-3 M, as well as 0.1 ml of a suspension of opsonized luminescent bacteria, are successively added to a measuring cell of a luminometer with a concentration of 5 × 10 ⁸ / ml, so that the achieved ratio of "bacteria: phagocytes" is 10: 1.

При выполнении исследований по п.3 формулы изобретения готовят две кюветы, в одну из которых в указанных количествах вносят нейтрофилы и опсонизированные люминесцирующие бактерии, но не вносят люминол, а в другую вносят нейтрофилы, люминол и опсонизированные бактерии с термоинактивированной ферментной системой генерации свечения.When performing the studies according to claim 3, two cuvettes are prepared, in one of which neutrophils and opsonized luminescent bacteria are added in the indicated amounts, but not luminol, and neutrophils, luminol and opsonized bacteria with a heat-inactivated enzyme system for generating luminescence are added to the other.

5) Кювету помещают в термостатируемое кюветное отделение двухканального биохемилюминометра, имеющее выходы на два оптических регистратора (фотоэлектронных умножителя), перед первым из которых установлен светофильтр с областью пропускания <430 нм, а перед вторым светофильтр с областью пропускания >540 нм.5) The cuvette is placed in a thermostatically controlled cuvette compartment of a two-channel biochemiluminometer, which has outputs to two optical registrars (photoelectronic multipliers), in front of the first of which there is a light filter with a transmission region <430 nm, and in front of the second filter with a transmission region> 540 nm.

При выполнении исследований по п.3 формулы изобретения кюветы помещают в кюветное отделение двухканального биохемилюминометра, имеющее два отдельных гнезда - каждое с изолированным выходом на отдельный оптический регистратор (фотоэлектронный умножитель). Светофильтры в этом случае не устанавливают.When performing the research according to claim 3, the cuvettes are placed in the cuvette compartment of a two-channel biochemiluminometer, which has two separate sockets - each with an isolated output to a separate optical recorder (photoelectronic multiplier). Light filters in this case are not installed.

6) Пробы инкубируют при 37°С в течение 60 мин, осуществляя измерение интенсивности свечения на каждом канале биохемилюминометра в непрерывном режиме.6) Samples are incubated at 37 ° C for 60 min, measuring the intensity of luminescence on each channel of the biochemiluminometer in a continuous mode.

7) По результатам измерения производят расчет активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и определяемой их действием киллинговой активности в отношении бактериальных клеток по формуле:7) According to the measurement results, the activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes and their killing activity in relation to bacterial cells determined by their action are calculated according to the formula:

где ΣимпК - сумма импульсов? испускаемых фагоцитарной системой в контроле (на 0 секунде исследования), ΣимпO - сумма импульсов, испускаемых фагоцитарной системой в опыте.where Σimp is the sum of the pulses? emitted by the phagocytic system in the control (at 0 second of the study), Σimpo is the sum of the pulses emitted by the phagocytic system in the experiment.

При выполнении исследований по п.2 формулы изобретения для проведения расчетов используют величины, зафиксированные в двух диапазонах спектра: <430 нм (при оценке люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов) и >540 нм (при оценке киллингового эффекта в отношении люминесцирующих клеток-мишеней).When performing the research according to claim 2, for calculations, values recorded in two spectral ranges are used: <430 nm (when evaluating the luminol-dependent chemiluminescence of phagocytes) and> 540 nm (when evaluating the killing effect in relation to luminescent target cells).

При выполнении исследований по п.3 формулы изобретения для расчета активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов используют величины, зафиксированные при исследовании пробы, содержащей нейтрофилы, люминол и опсонизированные бактерии с термоинактивированной ферментной системой генерации свечения, а для расчета киллингового эффекта используют величины, зафиксированные при исследовании пробы, содержащей нейтрофилы, опсонизированные люминесцирующие бактерии, но не содержащей люминол.When performing the research according to claim 3, for the calculation of the activation of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes, the values recorded during the study of the sample containing neutrophils, luminol and opsonized bacteria with a heat-inactivated enzyme system for generating luminescence are used, and the values recorded during the study of the sample are used to calculate the killing effect containing neutrophils, opsonized luminescent bacteria, but not containing luminol.

Пример.Example.

В хирургическое отделение Отделенческой клинической железнодорожной больницы ст. Оренбург 12.08.07 г. поступила больная З., 58 лет, с диагнозом «Некротическая флегмона левой стопы». После предоперационной подготовки больная была оперирована, произведено вскрытие клетчаточных пространств, некрэктомия с наложением глухого шва на рану на дренажно-промывной системе, а также поставлен катетер в артерию конечности для проведения внутриартериальных инфузий. Однако несмотря на проведенное лечение и начатую антибиотикотерапию, послеоперационный период протекал неблагоприятно, что явилось основой для постановки вопроса о состоятельности иммунной системы пациента, в том числе его фагоцитарного звена.In the surgical department of the Department of Clinical Railway Hospital Art. Orenburg 12.08.07, patient Z., 58 years old, was admitted with a diagnosis of Necrotic Phlegmon of the Left Foot. After preoperative preparation, the patient was operated on, opening of the cellular spaces, necrectomy with a blind suture on the wound on the drainage-washing system was performed, and a catheter was inserted into the artery of the limb for intra-arterial infusions. However, despite the treatment and antibiotic therapy started, the postoperative period was unfavorable, which was the basis for raising the question of the viability of the patient’s immune system, including its phagocytic link.

Для проведения исследования цельную кровь пациентки в количестве 2-4 мл забрали из локтевой вены в силиконированную или пластиковую пробирку, содержащую гепарин (50 Ед/мл), выдержали в течение 2 часов при 4°С, после чего отделившуюся верхнюю фазу разделили центрифугированием при 1500 об/мин в течение 45 мин на двойном градиенте фиколл-верографина с плотностями 1,077 г/мл и 1,112 г/мл. Нейтрофилы собрали с нижней интерфазы, отмыли холодным физиологическим раствором и ресуспендировали в среде 199 до концентрации 5×10⁶/мл.To conduct the study, the patient’s whole blood in an amount of 2-4 ml was taken from the ulnar vein into a silicone or plastic tube containing heparin (50 U / ml), kept for 2 hours at 4 ° С, after which the separated upper phase was separated by centrifugation at 1500 rpm for 45 min on a double gradient of ficoll-verographin with densities of 1.077 g / ml and 1.112 g / ml. Neutrophils were collected from the lower interphase, washed with cold saline and resuspended in medium 199 to a concentration of 5 × 10 ⁶ / ml.

Параллельно провели регидратацию лиофилизированных рекомбинантных люминесцирующих бактерий E.coli с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi («Эколюм-9») добавлением во флакон 10 мл холодной дистиллированной воды с последующим выдерживанием в течение 30 минут при 4°С для стабилизации уровня биолюминесценции. После этого микроорганизмы в равных объемах смешали с коммерческим препаратом нормального иммуноглобулина человека, так чтобы его конечная концентрация составляла 8 мг/мл, а конечная концентрация бактерий равнялась 5×10⁸/мл. Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 10 мин.At the same time, lyophilized recombinant luminescent bacteria of E. coli were rehydrated with the luxCDABE cloned P.leiognathi genes (Ekolyum-9) by adding 10 ml of cold distilled water to the vial, followed by 30 min at 4 ° С to stabilize the level of bioluminescence. After that, microorganisms were mixed in equal volumes with a commercial preparation of normal human immunoglobulin, so that its final concentration was 8 mg / ml, and the final concentration of bacteria was 5 × 10 ⁸ / ml. The resulting mixture was incubated at 37 ° C for 10 min.

На следующем этапе 0,88 мл взвеси нейтрофилов, 0,02 мл раствора люминола (10^-3М), а также 0,1 мл взвеси опсонизированных люминесцирующих бактерий последовательно внесли в измерительную кювету, которую сразу после этого поместили в термостатируемое (37°С) кюветное отделение двухканального биохемилюминометра 8802М2К (СКТБ «Наука», Красноярск), имеющее выходы на два отдельных фотоэлектронных умножителя, перед первым из которых был установлен светофильтр с областью пропускания <430 нм, а перед вторым светофильтр с областью пропускания >540 нм. Измерение интенсивности свечения на каждом канале провели в течение 60 мин в непрерывном режиме.In the next step, 0.88 ml of a suspension of neutrophils, 0.02 ml of a solution of luminol (10 ^-3 M), and also 0.1 ml of a suspension of opsonized luminescent bacteria were sequentially introduced into a measuring cell, which was immediately placed in a thermostated (37 ° C) ) a cuvette compartment of a 8802M2K dual-channel biochemiluminometer (SKTB Nauka, Krasnoyarsk), which has outputs to two separate photoelectronic multipliers, in front of the first of which a light filter with a transmission region <430 nm was installed, and in front of the second one a filter with a transmission region> 540 nm. The luminescence intensity on each channel was measured for 60 min in a continuous mode.

После расчета полученных результатов по формуле:After calculating the results obtained by the formula:

где ΣимпК - сумма импульсов, испускаемых фагоцитарной системой в контроле (на 0 минуте исследования), ΣимпО - сумма импульсов испускаемых фагоцитарной системой в опыте (в интервале до 60 мин от начала исследования), были констатированы недостаточная выраженность «респираторного взрыва» фагоцитов (стимуляция на 258% при нормативных значениях >500%)), а также низкая эффективность киллинга бактериальных клеток (подавление на 37% при нормативных значениях>75%), что позволило сделать заключение об имеющемся дефекте фагоцитарного звена иммунитета.where Σimp is the sum of impulses emitted by the phagocytic system in control (at the 0 minute of the study), Σimp is the sum of impulses emitted by the phagocytic system in the experiment (in the interval up to 60 min from the start of the study), insufficient expression of the “respiratory explosion” of phagocytes (stimulation by 258% at normative values> 500%)), as well as low efficiency of bacterial cell killing (suppression by 37% at normative values> 75%), which allowed us to draw a conclusion about the existing defect in the phagocytic immunity.

При анализе причин подобной ситуации пациентке было проведено дополнительное исследование уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови, показавшее величины 8,1 ммоль/л и 7% Нb_A1с соответственно, что явилось основанием для постановки дополнительного диагноза «Сахарный диабет II типа». Для коррекции данного состояния были назначены инъекции инсулина пролонгированного действия в дозе 32 ЕД/сут.When analyzing the causes of this situation, the patient underwent an additional study of the level of glucose and glycosylated hemoglobin in the blood, showing 8.1 mmol / L and 7% _{Нb A1с,} respectively, which was the basis for an additional diagnosis of Type II diabetes mellitus. To correct this condition, prolonged-acting insulin injections were prescribed at a dose of 32 units / day.

Проведенный через 5 суток после начала инсулинотерапии биохемилюминесцентный анализ показал рост активности кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов до 580%, а киллинга бактериальных клеток-мишеней до 88%.A biochemiluminescent analysis performed 5 days after the start of insulin therapy showed an increase in the activity of oxygen-dependent bactericidal systems of phagocytes to 580%, and killing of bacterial target cells to 88%.

Рана зажила первично, больная выписана на двадцатые сутки.The wound healed initially, the patient was discharged on the twentieth day.

Таким образом, положительный эффект от использования способа проявился в комплексном и точном анализе состояния фагоцитарного звена иммунитета, что позволило провести оперативную коррекцию комплекса лечебных мероприятий.Thus, the positive effect of the use of the method was manifested in a comprehensive and accurate analysis of the state of the phagocytic immunity link, which allowed for prompt correction of the complex of therapeutic measures.

Источники информацииInformation sources

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.:Медицина, 2000. - 432 с.1. Khaitov P.M., Ignatieva G.A., Sidorovich I.G. Immunology. - M.: Medicine, 2000 .-- 432 p.

2. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса // Иммунология. - 1995. - № 3. - С.3-8.2. Khaitov P.M., Pinegin B.V. Modern approaches to assessing the main stages of the phagocytic process // Immunology. - 1995. - No. 3. - C.3-8.

3. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболического состояния фагоцитирующих клеток. - Саратов: СГУ, 2006. - 112 с.3. Rudik D.V., Tikhomirova E.I. Methods for studying the process of phagocytosis and the functional and metabolic state of phagocytic cells. - Saratov: SSU, 2006 .-- 112 p.

4. Verhoef J., Peterson P.K., Quie P.G. Kinetics of staphylococcal opsonization, attachment, ingestion and killing by human polymorphonuclear leukocytes: a quantitative assay using [3H]thymidine labeled bacteria // J. Immunol. Methods. - 1977. V.14. - № 3-4. - Р.303-311.4. Verhoef J., Peterson P.K., Quie P.G. Kinetics of staphylococcal opsonization, attachment, ingestion and killing by human polymorphonuclear leukocytes: a quantitative assay using [3H] thymidine labeled bacteria // J. Immunol. Methods - 1977. V.14. - No. 3-4. - P.303-311.

5. Martin E., Bhakdi S. Flow cytometric assay for quantifying opsonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes // J. Clin. Microbiol. - 1992. - V.30. - № 9. - P.2246-2255.5. Martin E., Bhakdi S. Flow cytometric assay for quantifying opsonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes // J. Clin. Microbiol. - 1992. - V.30. - No. 9. - P.2246-2255.

6. Патент RU2292553. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Опубл. 27.01.2007, Бюл. № 3.6. Patent RU2292553. A method for determining the phagocytic activity of neutrophils in human peripheral blood by the degree of quenching of bioluminescence. Publ. 01/27/2007, Bull. Number 3.

7. Verhoev J., Peterson P.K., Kim Y., Sabath L.D., Quie P.G. Opsonic requirements for staphylococcal phagocytosis. Heterogeneity among strains // Immunology. - 1977. - V.33. - № 2. - P.191-197.7. Verhoev J., Peterson P.K., Kim Y., Sabath L.D., Quie P.G. Opsonic requirements for staphylococcal phagocytosis. Heterogeneity among strains // Immunology. - 1977. - V.33. - No. 2. - P.191-197.

8. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Причины, определяющие характер изменения бактериальной люминесценции при воздействии сыворотки крови // Микробиология. - 2005. - № 2. - С.191-197.8. Deryabin D.G., Polyakov E.G. Reasons for determining the nature of changes in bacterial luminescence when exposed to blood serum // Microbiology. - 2005. - No. 2. - S.191-197.

9. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Влияние сыворотки крови человека на уровень свечения природных и рекомбинантных люминесцирующих бактерий // Бюлл. экспер. биол. мед. - 2004. - № 9. - С.311-315.9. Deryabin D.G., Polyakov E.G. The effect of human blood serum on the level of luminescence of natural and recombinant luminescent bacteria // Bull. an expert. biol. honey. - 2004. - No. 9. - S.311-315.

10. Albrecht D., Jungi T.W. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes: obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes // J.Leucocyte Biol. - 1993. - V.54. - № 4. - P.300-306.10. Albrecht D., Jungi T.W. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes: obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes // J. Leucocyte Biol. - 1993 .-- V.54. - No. 4. - P.300-306.

11. Данилов B.C., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий // Вестник МГУ. Сер. 16. Биология. - 2002. - № 3. - С.20-24.11. Danilov B.C., Zarubina A.P., Eroshnikov G.E. et al. Sensory bioluminescent systems based on lux operons of different types of luminescent bacteria // Vestnik MGU. Ser. 16. Biology. - 2002. - No. 3. - S.20-24.

12. Каталог светящихся бактерий / под ред. Э.К.Родичевой. - Новосибирск: Наука, 1997. - 125 с.12. Catalog of luminous bacteria / ed. E.K. Rodicheva. - Novosibirsk: Nauka, 1997 .-- 125 p.

Claims

A method for determining the phagocytic activity of neutrophils of human peripheral blood by measuring the intensity of luminescence in mixtures of recombinant luminescent bacteria with phagocytes in a ratio of 10: 1 for 60 min at 37 ° C, characterized in that microorganisms Escherichia coli with cloned luxCDABE genes are used as recombinant luminescent bacteria : Photobacterium leiognathi, pre-opsonized for 10 min by normal human immunoglobulin at a final concentration of 6-10 mg / ml, as well as by the fact that the sample contains but they add luminol to a final concentration of 10 ^-3 M, after which they separately monitor the intensity of the luminol-dependent chemiluminescence of phagocytes and the bioluminescence of bacterial target cells by measuring the luminosity in two different spectral ranges: <430 nm when assessing chemiluminescence and> 540 nm when assessing bioluminescence.