RU2362169C2 - Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy - Google Patents
Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2362169C2 RU2362169C2 RU2007117787/15A RU2007117787A RU2362169C2 RU 2362169 C2 RU2362169 C2 RU 2362169C2 RU 2007117787/15 A RU2007117787/15 A RU 2007117787/15A RU 2007117787 A RU2007117787 A RU 2007117787A RU 2362169 C2 RU2362169 C2 RU 2362169C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- chip
- immobilized
- registration
- protein complexes
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title abstract 4
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 title description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 52
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 claims description 21
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000010445 mica Substances 0.000 claims description 13
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 claims description 11
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical group [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000013517 stratification Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000019592 roughness Nutrition 0.000 abstract 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002648 laminated material Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Length Measuring Devices With Unspecified Measuring Means (AREA)
- Measurement Of Length, Angles, Or The Like Using Electric Or Magnetic Means (AREA)
- Treatments Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской диагностике, и касается диагностики онкологических заболеваний путем регистрации специфических белков и их комплексов в исследуемой крови. Изобретение может быть использовано для диагностики других соматических и инфекционных заболеваний. Кроме того, изобретение относится к технологии изготовления чипов, используемых в зондовой микроскопии.The invention relates to medicine, in particular to medical diagnosis, and for the diagnosis of cancer by registering specific proteins and their complexes in the test blood. The invention can be used to diagnose other somatic and infectious diseases. In addition, the invention relates to the technology of manufacturing chips used in probe microscopy.
Основной проблемой медицинской протеомики и ранней диагностики является низкий уровень чувствительности, не более 10-12 М. Для решения задачи повышения чувствительности методов в протеомике и диагностике необходимо использовать молекулярные детекторы, позволяющие проводить регистрацию белков на уровне единичных молекул. К таким детекторам относятся детекторы на базе сканирующих зондовых микроскопов, включающих атомно-силовые микроскопы (АСМ). Атомно-силовой детектор включает в себя чип с ровной поверхностью и сам атомно-силовой микроскоп. Чип, имеющий на своей модифицированной поверхности неровности не более 1 нм, с нанесенным на него молекулами-зондами, способными формировать комплексы с макромолекулами-партнерами, представляет собой нанобиочип (далее - чип).The main problem of medical proteomics and early diagnosis is a low level of sensitivity, not more than 10 -12 M. To solve the problem of increasing the sensitivity of methods in proteomics and diagnostics, it is necessary to use molecular detectors that allow the registration of proteins at the level of single molecules. Such detectors include detectors based on scanning probe microscopes, including atomic force microscopes (AFM). The atomic force detector includes a chip with a flat surface and the atomic force microscope itself. A chip having on its modified surface irregularities of not more than 1 nm, with probe molecules deposited on it capable of forming complexes with partner macromolecules, is a nanobiochip (hereinafter referred to as the chip).
Основная проблема в использовании зондовых, в том числе атомно-силовых детекторов для протеомики и диагностики, заключаетсяThe main problem in the use of probe, including atomic force detectors for proteomics and diagnostics, is
1) в создании технологии изготовления чипов с гладкой поверхностью, размер неровностей рельефа которой гораздо меньше размеров белков, адсорбированных на поверхности чипа, то есть не превышает 1 нм;1) in creating technology for manufacturing chips with a smooth surface, the size of the roughness of the relief of which is much smaller than the size of the proteins adsorbed on the surface of the chip, that is, does not exceed 1 nm;
2) в создании технологии получения биослоя биомолекул-зондов на поверхности чипа, обладающих повышенным сродством к макромолекулам-партнерам, которые вылавливаются специфически из раствора аналита, что приводит к повышению чувствительности метода на основе зондовой микроскопии.2) in the creation of a technology for producing a biolayer of biomolecule probes on the surface of the chip, which have an increased affinity for partner macromolecules, which are caught specifically from the analyte solution, which leads to an increase in the sensitivity of the method based on probe microscopy.
Уровень техникиState of the art
Известны чипы, способы регистрации макромолекул с их использованием и технологии их изготовления, в которых макромолекулы-зонды, иммобилизированы в ячейки гидрогеля на общей подложке и образуют матрицу (пат. США 5552270 и 5552271).Chips are known, methods for detecting macromolecules using them, and technologies for their manufacture, in which probe macromolecules are immobilized into hydrogel cells on a common substrate and form a matrix (US Pat. US 5,552,270 and 5,552,271).
Известен способ получения чипов, согласно которому ячейки чипа получают полимеризацией композиций в каплях, нанесенных на подложку с помощью микропипетки (F.N.Rehman, M.Audeh, E.S.Abrams, P.W.Hammond, M.Kenney and T.C.Boles, Nucleic Acids Research, 1999, v.27, 15, p.649-655).A known method for producing chips, according to which the chip cells are obtained by polymerizing the compositions in droplets deposited on a substrate using a micropipette (FNRehman, M.Audeh, ESAbrams, PWHammond, M. Kenney and TCBoles, Nucleic Acids Research, 1999, v. 27, 15, p. 649-655).
К недостаткам применительно к сканирующей зондовой микроскопии известных способов и используемых чипов относятся низкая воспроизводимость свойств ячеек. Технически сложная технология изготовления чипов, не обеспечивающая необходимой однородности и воспроизводимости свойств молекул аналита, и самое главное, это образование материалами типа адсорбированных гелей, структур с неровностями рельефа, превышающими размеры анализируемых макромолекул.The disadvantages in relation to scanning probe microscopy of the known methods and used chips include the low reproducibility of the properties of the cells. A technically sophisticated chip manufacturing technology that does not provide the necessary uniformity and reproducibility of the properties of analyte molecules, and most importantly, this is the formation of materials such as adsorbed gels, structures with bumps exceeding the size of the analyzed macromolecules.
Кроме того, известен белковый чип, способ его изготовления и способ регистрации, использующий этот чип. Чип представляет собой расположенные на твердой подложке макромолекулы (антитела, антигены или их фрагменты), с помощью чипа осуществляют диагностику путем идентификации биологических макромолекул, специфичных для инфекционного заболевания (гепатит В, С, сифилис и др. (CN 1373365).In addition, a protein chip is known, a method for its manufacture, and a registration method using this chip. The chip is a macromolecule located on a solid substrate (antibodies, antigens, or fragments thereof), and the chip is used to diagnose it by identifying biological macromolecules specific for an infectious disease (hepatitis B, C, syphilis, etc. (CN 1373365).
Недостатком данного чипа является неконтролируемый рельеф поверхности и процедуры иммобилизации.The disadvantage of this chip is the uncontrolled surface topography and immobilization procedures.
Наиболее близкими к предлагаемому чипу, способу его изготовления и регистрации макромолекул с его помощью являются решения, описанные в патентной заявке №2003109969 от 08.04.2003 г., в частности, чип на основе слюды, где макромолекулы адсорбированы на поверхность чипа. В этом патентом документе раскрыт способ регистрации макромолекул, в частности белков, с использованием сканирующей зондовой микроскопии, и чип на основе слюды.Closest to the proposed chip, the method of its manufacture and registration of macromolecules with it are the solutions described in patent application No. 2003109969 dated 04/08/2003, in particular, a mica-based chip, where the macromolecules are adsorbed onto the surface of the chip. This patent document discloses a method for registering macromolecules, in particular proteins, using scanning probe microscopy, and a mica-based chip.
Слюда является наиболее подходящей подложкой при изготовлении чипов для зондовой микроскопии, в частности для атомно-силового микроскопа при визуальной регистрации макромолекул с размерами порядка нанометров (к ним относятся белки, белковые комплексы, олигонуклеотиды и т.д.), поскольку при скалывании на ее поверхности образуются протяженные атомарно-гладкие площадки, на которых для анализа с помощью сканирующей зондовой микроскопии можно иммобилизовать макромолекулы. Недостатком же чипа на основе слюды является его способность к расслаиванию во время проведения процедуры инкубации слюды с иммобилизованными молекулами-зондами в растворе, что приводит к деструкции чипа.Mica is the most suitable substrate in the manufacture of chips for probe microscopy, in particular for atomic force microscopes, for the visual registration of macromolecules with sizes on the order of nanometers (these include proteins, protein complexes, oligonucleotides, etc.), since when chipping on its surface extended atomically smooth sites are formed on which macromolecules can be immobilized for analysis using scanning probe microscopy. The disadvantage of the mica-based chip is its ability to delaminate during the incubation procedure of mica with immobilized probe molecules in solution, which leads to the destruction of the chip.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Заявленная группа изобретений направлена на преодоление описанных недостатков известных решений.The claimed group of inventions aims to overcome the described disadvantages of the known solutions.
Технический результат заключается в повышении надежности получаемого чипа за счет исключения его расслоения и повышении достоверности диагностики за счет повышения чувствительности регистрации специфических белков и белковых комплексов.The technical result consists in increasing the reliability of the resulting chip by eliminating its stratification and increasing the reliability of diagnosis by increasing the sensitivity of registration of specific proteins and protein complexes.
Технический результат достигается за счет того, что в чипе для регистрации белков и белковых комплексов с использованием сканирующей зондовой микроскопии, выполненном в виде подложки, поверхность которой модифицирована и на которую нанесено поле иммобилизованных молекул-зондов, способных специфически взаимодействовать с исследуемыми белками и белковыми комплексами, в качестве подложки использован нерасслаивающийся материал, например поликарбонат или полистирол, на поверхность которого с помощью разогретого штампа нанесена рельефная координатная сетка для разделения зон при нанесении маркеров и затем с помощью штампа, имеющего рабочую поверхность из свежесколотой слюды, выполнена ровная поверхность с размером неровностей не более 1 нм.The technical result is achieved due to the fact that in the chip for registration of proteins and protein complexes using scanning probe microscopy, made in the form of a substrate, the surface of which is modified and on which a field of immobilized probe molecules capable of specifically interacting with the studied proteins and protein complexes is applied, as a substrate, non-delaminating material, for example polycarbonate or polystyrene, is used on the surface of which, with the help of a heated stamp, a relief is applied Single grid to separate zones of the substrate markers and then using a punch having a working surface of a freshly cleaved mica surface is made smooth with roughness of not more than 1 nm.
Чип имеет поверхность подложки, химически модифицированную силаном, к силанизированной поверхности которой иммобилизованы молекулы-зонды с использованием кросс-линкеров илиThe chip has a substrate surface chemically modified with silane, probe molecules are immobilized to the silanized surface using cross-linkers or
чип имеет поверхность подложки, подвергнутую ультрафиолетовому облучению с последующей иммобилизацией на обработанной поверхности молекул-зондов с использованием фотокросс-линкеров.the chip has a substrate surface subjected to ultraviolet irradiation, followed by immobilization on the treated surface of the probe molecules using photocross linkers.
Иммобилизованные молекулы-зонды представляют собой антитела, антигены, аптамеры, олигонуклеотиды, их фрагменты, иммобилизованные отдельно или в любых их комбинациях.Immobilized probe molecules are antibodies, antigens, aptamers, oligonucleotides, fragments thereof, immobilized separately or in any combination thereof.
Способ получения чипа для идентификации белков и белковых комплексов с использованием сканирующей зондовой микроскопии включает использование подложки, на модифицированной поверхности которой иммобилизованы молекулы-зонды, способные специфически взаимодействовать с исследуемыми белками и белковыми комплексами и которые ковалентно сшивают, новым в способе является то, что заготовку вырезают из нерасслаивающегося материала, например поликарбоната или полистирола, с помощью первого штампа наносят на поверхность заготовки рельефную координатную сетку, с помощью второго штампа, рабочая поверхность которого представляет собой свежесколотую слюду, на заготовке отпечатывают атомарно-ровную поверхность с размером неровностей не более 1 нм, разрезают готовую заготовку на чипы, после чего осуществляют модификацию поверхности подложки чипа и иммобилизацию на ней молекул-зондов.A method of producing a chip for identifying proteins and protein complexes using scanning probe microscopy involves the use of a substrate on which modified probe molecules are immobilized, which can specifically interact with the studied proteins and protein complexes and which are covalently crosslinked, a new method is that the preform is cut out from a non-stratifying material, for example polycarbonate or polystyrene, a relief is applied to the surface of the workpiece using the first stamp coordinate grid, using a second stamp, the working surface of which is freshly cleaved mica, an atomically flat surface with a roughness size of not more than 1 nm is imprinted on the workpiece, the finished workpiece is cut into chips, after which the surface of the chip substrate is modified and molecules are immobilized on it probes.
Модификацию поверхности подложки чипа осуществляют силаном или ультрафиолетовым излучением и непосредственно иммобилизируют на поверхность чипа молекулы-зонды с использованием фотокросс-линкеров.Modification of the surface of the chip substrate is carried out by silane or ultraviolet radiation and probe molecules are directly immobilized onto the chip surface using photocross linkers.
Способ регистрации белков и белковых комплексов с использованием канирующей зондовой микроскопии заключается в помещении чипа в биологическую среду, содержащую исследуемые белки и белковые комплексы, вылавливании белков и белковых комплексов за счет специфического взаимодействия с иммобилизованными на поверхности подложки чипа молекулами-зондами и ковалентного сшивания и регистрации белков и белковых комплексов после отмывания поля чипа от неспецифических белков и белковых комплексов новым в способе является использование в качестве чипа чип по пп.1-4.A method for registering proteins and protein complexes using canopy probe microscopy involves placing a chip in a biological medium containing the studied proteins and protein complexes, trapping proteins and protein complexes due to specific interaction with probe molecules immobilized on the surface of the chip substrate and covalent crosslinking and registration of proteins and protein complexes after washing the field of the chip from non-specific proteins and protein complexes, a new method is the use of Chip chip according to claims 1-4.
В качестве сканирующего зондового микроскопа используют одноканальный или многоканальный атомно-силовой микроскоп, сканирующий туннельный микроскоп или оптический ближнепольный микроскоп.As a scanning probe microscope, a single-channel or multi-channel atomic force microscope, a scanning tunneling microscope or an optical near-field microscope are used.
Регистрацию осуществляют в газовой среде, в вакууме или в жидкости.Registration is carried out in a gaseous medium, in a vacuum or in a liquid.
Описание графических материаловDescription of graphic materials
Ниже заявленные изобретения будут описаны более подробно со ссылками на графические материалы, где на фиг.1 представлено изображение поверхности чипа с иммобилизованными молекулами-зондами, в частности антителами к СА-125 (А); на фиг.2 - изображение чипа с комплексами (антител к СА-125/ СА-125) на его поверхности, изображения получены с помощью АСМ.Below the claimed invention will be described in more detail with reference to graphic materials, where Fig. 1 shows a surface image of a chip with immobilized probe molecules, in particular antibodies to CA-125 (A); figure 2 is an image of a chip with complexes (antibodies to CA-125 / CA-125) on its surface, images obtained using AFM.
Раскрытие изобретенийDisclosure of inventions
Авторы пришли к выводу, что преодоление указанных выше недостатков известных технических решений возможно за счет использования в качестве подложки неслоистого материала - специальным образом обработанного поликарбоната или полистирола.The authors came to the conclusion that overcoming the above disadvantages of the known technical solutions is possible due to the use of non-laminated material as a substrate — specially treated polycarbonate or polystyrene.
В соответствии с поставленной задачей изобретение связано с созданием чипа к сканирующему зондовому микроскопу для регистрации белков и белковых комплексов на основе специальным образом обработанного поликарбоната. В соответствии с поставленной задачей создан чип для идентификации макромолекул с использованием сканирующей зондовой микроскопии, состоящий из поля иммобилизованных молекул, расположенных на подложке, в котором в качестве подложки использован поликарбонат или полистирол. Поликарбонат (полистирол) является полимером и неслоистым материалом. Для изготовления чипа из поликарбоната (полистирола) осуществляется процедура из 3 основных операций.In accordance with the task, the invention relates to the creation of a chip for a scanning probe microscope for registration of proteins and protein complexes based on specially treated polycarbonate. In accordance with the task, a chip was created for the identification of macromolecules using scanning probe microscopy, consisting of a field of immobilized molecules located on a substrate in which polycarbonate or polystyrene was used as a substrate. Polycarbonate (polystyrene) is a polymer and non-laminated material. For the manufacture of a chip from polycarbonate (polystyrene), a procedure of 3 basic operations is carried out.
1. Вырезается заготовка чипа из поликарбоната или полистирола. На поликарбонатную основу с помощью разогретого штампа наносится координатная сетка - путем контакта разогретого металлического штампа с определенным рельефом с поликарбонатной поверхностью заготовки.1. Cut the chip blank from polycarbonate or polystyrene. A coordinate grid is applied to the polycarbonate base using a heated stamp — by contacting the heated metal stamp with a certain relief with the polycarbonate surface of the workpiece.
2. Для получения атомарно-гладкой поверхности проводится выравнивание размеченной по п.1 поверхности с помощью другого штампа, рабочая поверхность которого представляет собой свежесколотую (непосредственно перед штамповкой) слюду. Вместо слюды возможно использование кремния, алмаза или сапфира, т.е. материалов, на которых при обработке возможно получить шероховатость не более 1 нм. Таким образом получается готовая заготовка, которая затем разрезается на чипы (например, размером 7×10 мм).2. To obtain an atomically smooth surface, alignment of the surface marked according to
3. Для иммобилизации молекул зондов на поверхности поликарбонатного чипа он модифицируется.3. To immobilize probe molecules on the surface of a polycarbonate chip, it is modified.
Модификация такого чипа для получения нанобиочипа может проводится двумя способами:Modification of such a chip to obtain a nanobiochip can be carried out in two ways:
a) модификация силаном и дальнейшее использование кросс-линкеров для иммобилизации зондов;a) silane modification and further use of cross-linkers for immobilization of probes;
b) обработка ультрафиолетовым излучением и непосредственная иммобилизация на чипе зон молекул-зондов с использованием фотокросс-линкера.b) UV treatment and direct immobilization of the probe molecule zones using a photocross linker on a chip.
Такой подход обеспечивает создание чипа к сканирующему зондовому микроскопу с рельефом порядка 1 нм, что достаточно для регистрации белков в протеомике и диагностике.This approach ensures the creation of a chip for a scanning probe microscope with a relief of the order of 1 nm, which is sufficient for registration of proteins in proteomics and diagnostics.
До настоящего времени использовалась технология получения биослоя биомолекул-зондов на поверхности чипа путем модификации молекул-партнеров биотином для образования связи биотин-стрептавидин (авидин), обладающей повышенным Kd~10-15 M [http://meeting.biophysj.org/cgi/reprint/82/1/337/d.pdf]. Эта технология непригодна для чипов, используемых в протеомике и диагностике, где раствор аналита включает не одну модельную молекулу, а сразу много типов молекул. Это связано с тем, что при иммобилизации молекул-стрептавидина (авидин) на поверхности чипа можно специфически регистрировать только биотинилированные молекулы-партнеры, а не все белки из многокомпонентной смеси аналита, которые образуют комплексы с иммобилизованными молекулами-зондами.Until now, the technology of obtaining a biolayer of biomolecule probes on the chip surface by modifying partner molecules with biotin to form a biotin-streptavidin (avidin) bond with an increased Kd ~ 10-15 M [http://meeting.biophysj.org/cgi/ reprint / 82/1/337 / d.pdf]. This technology is unsuitable for chips used in proteomics and diagnostics, where the analyte solution includes not one model molecule, but many types of molecules at once. This is due to the fact that when immobilizing streptavidin (avidin) molecules on the chip surface, only biotinylated partner molecules can be specifically detected, and not all proteins from a multicomponent analyte mixture that form complexes with immobilized probe molecules.
Преодоление этого недостатка, связанного с низким Kd возможно за счет применения модификации кросс-линкерами молекул-зондов, таких как антитела, антигены, аптамеры, олигонуклеотиды или их фрагменты с помощью методов химической, электрохимической фотохимической, радиохимической обработки этих молекул как непосредственно на чипе, так и до их иммобилизации на поверхности чипа с целью проведения реакции ковалентного связывания иммобилизованных на поверхности чипов к сканирующему зондовому микроскопу молекул-зондов с макромолекулами-партнерами. Это приводит к необратимому сшиванию молекул-зондов с макромолекулами-партнерами в комплексах на поверхности чипа к зондовому микроскопу.This drawback associated with low Kd can be overcome by using cross-linker modification of probe molecules, such as antibodies, antigens, aptamers, oligonucleotides or fragments thereof, using methods of chemical, electrochemical photochemical, radiochemical processing of these molecules directly on the chip and before they are immobilized on the surface of the chip in order to carry out the reaction of covalent binding of the molecules of probes immobilized on the surface of the chip to the scanning probe microscope with macromolecules-pairs ners. This leads to irreversible crosslinking of the probe molecules with partner macromolecules in the complexes on the surface of the chip to the probe microscope.
Предложенная технология анализа белков и их комплексов с помощью сканирующей зондовой микроскопии заключается вThe proposed technology for the analysis of proteins and their complexes using scanning probe microscopy is
1) создании технологии изготовления нерасслаивающихся чипов к сканирующему зондовому микроскопу с поверхностью, что позволяет достичь размера неровностей рельефа которой меньше или, по крайней мере, не превышает размера белков, адсорбированных на поверхности чипа;1) the creation of technology for the manufacture of non-stratified chips to a scanning probe microscope with a surface, which makes it possible to achieve a relief unevenness which is less than, or at least does not exceed, the size of the proteins adsorbed on the chip surface;
2) создании технологии получения биослоя молекул-зондов на поверхности чипа, обладающих повышенным сродством с макромолекулами-партнерами, что достигается модификацией молекул-зондов как непосредственно на чипе, так и до их иммобилизации на поверхности чипа кросс-линкерами, посредством которых проводится реакции ковалентного связывания иммобилизованных на поверхности чипов к сканирующему зондовому микроскопу молекул-зондов с макромолекулами-партнерами из раствора аналита, и2) the creation of a technology for producing a biolayer of probe molecules on the surface of the chip with increased affinity for partner macromolecules, which is achieved by modifying the probe molecules both directly on the chip and before they are immobilized on the surface of the chip by cross-linkers, through which covalent binding reactions are carried out probe molecules immobilized on the surface of the chips to a scanning probe microscope with partner macromolecules from an analyte solution, and
3) регистрации образованных комплексов на поверхности чипа с помощью сканирующей зондовой микроскопии.3) registration of the formed complexes on the surface of the chip using scanning probe microscopy.
Пример 1. В качестве примера реализации поставленной задачи был создан чип, состоящий из зон молекул, иммобилизованных на подложке поликарбонатного чипа к сканирующему атомно-силовому микроскопу.Example 1. As an example of the implementation of the task, a chip was created consisting of zones of molecules immobilized on the substrate of a polycarbonate chip to a scanning atomic force microscope.
На фиг.1 в качестве примера осуществления предлагаемого изобретения представлены полученные с помощью атомно-силового микроскопа изображения чипа для антител к СА-125 - онкологического маркера (А), где изображены макромолекулы антител, ковалентно иммобилизованные на подложке из поликарбоната, модифицированной силаном; на фиг.2 изображены в позиции (В) - СА125 макромолекулы, сконцентрированные из раствора аналита на поверхности чипа и ковалентно пришитые к ковалентно иммобилизованным антителам СА-125 с помощью кросс-линкера. Изображения получены в полуконтактной моде измерения. Как видно, размеры комплексов (антитело к СА125/ СА125) превышает размеры антител СА125, что означает, что чип на поликарбонате позволяет регистрировать маркерные белки онкологических заболеваний.Figure 1 as an example implementation of the invention presents obtained using an atomic force microscope image of a chip for antibodies to CA-125 - an oncological marker (A), which shows macromolecules of antibodies covalently immobilized on a silica-modified polycarbonate substrate; figure 2 shows in position (B) - CA125 macromolecules concentrated from an analyte solution on the surface of the chip and covalently attached to covalently immobilized antibodies CA-125 using a cross-linker. Images obtained in a tapping mode of measurement. As you can see, the size of the complexes (anti-CA125 / CA125 antibody) exceeds the size of the CA125 antibodies, which means that the chip on polycarbonate allows the registration of marker proteins of cancer.
Сходные результаты получены на подложках из полистирола с площадками кремния, графита и слюды с закрепленными торцами для упрочнения ее структуры, модифицированной в поле электрического разряда.Similar results were obtained on polystyrene substrates with areas of silicon, graphite, and mica with fixed ends to strengthen its structure, modified in the field of an electric discharge.
С помощью чипа из поликарбоната и слюды с закрепленными торцами были зарегистрированы белки HCVcoreAg - маркеры заболевания гепатита, находящиеся в аналите при концентрации С до 10-17 М, что указывает на увеличение чувствительности более чем на 2 порядка по сравнению с существующими в настоящее время протеомными методами.Using a polycarbonate chip and mica with fixed ends, HCVcoreAg proteins, markers of hepatitis disease, were detected in the analyte at a concentration of C up to 10 -17 M, which indicates an increase in sensitivity by more than 2 orders of magnitude compared to current proteomic methods .
Аналогичные результаты были получены, когда в качестве иммобилизованных на подложке макромолекул использовались антигены, аптамеры, олигонуклеотиды или их фрагменты как в виде отдельного чипа, так и любые комбинациях этих молекул в виде поля.Similar results were obtained when antigens, aptamers, oligonucleotides or their fragments were used as immobilized macromolecules on a substrate, either as a separate chip or any combination of these molecules in the form of a field.
При использовании нанополя - подложки к сканирующим зондовым микроскопам с иммобилизованными молекулами разных типов с разными типами иммобилизованных зондов предлагаемый способ позволяет проводить регистрацию различных типов заболеваний по регистрации комплексов зонд/мишень одновременно.When using a nanofield - a substrate for scanning probe microscopes with immobilized molecules of different types with different types of immobilized probes, the proposed method allows the registration of various types of diseases by registering the probe / target complexes simultaneously.
Применение вместо 1-канального многоканального, например 24-50 канального атомно-силового микроскопа (АСМ), позволяет поднять производительность метода зондовой микроскопии в соответствующее число раз, например 24-50 раз, а при использовании АСМ в режиме одновременного измерения во многих точках нанополя увеличить чувствительность до зептомолярного уровня в режиме измерения, при котором в этих точках иммобилизован один и тот же тип молекул.The use of instead of a 1-channel multichannel, for example, 24-50 channel atomic force microscope (AFM), allows you to increase the performance of the probe microscopy method by the corresponding number of times, for example 24-50 times, and when using AFM in the simultaneous measurement mode at many points of the nanofield, increase sensitivity to the zeptomolar level in the measurement mode at which the same type of molecules are immobilized at these points.
В качестве сканирующих зондовых микроскопов в данном способе регистрации макромолекул и чипов с нанесенным проводящим покрытием к ним могут быть использованы, кроме атомно-силовых, также и сканирующие туннельные микроскопы.In addition to atomic force, scanning tunneling microscopes can be used as scanning probe microscopes in this method for registering macromolecules and chips coated with a conductive coating.
При использовании флуоресцирующих иммобилизованных молекул и/или макромолекул или введении специальных флуоресцирующих меток в иммобилизованные молекулы макромолекулы для получения флуоресценции в выбранном спектральном диапазоне вместо атомно-силового микроскопа могут быть использованы ближнепольные сканирующие оптические микроскопы.When using fluorescent immobilized molecules and / or macromolecules or introducing special fluorescent labels into immobilized molecules of a macromolecule, near-field scanning optical microscopes can be used instead of an atomic force microscope to obtain fluorescence in the selected spectral range.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007117787/15A RU2362169C2 (en) | 2007-05-14 | 2007-05-14 | Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007117787/15A RU2362169C2 (en) | 2007-05-14 | 2007-05-14 | Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2007117787A RU2007117787A (en) | 2008-11-20 |
| RU2362169C2 true RU2362169C2 (en) | 2009-07-20 |
Family
ID=40240981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2007117787/15A RU2362169C2 (en) | 2007-05-14 | 2007-05-14 | Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2362169C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2780656C2 (en) * | 2017-06-19 | 2022-09-28 | Сейфгард Байосистемс Холдингс Лтд. | Three-dimensional polymer meshes and their use |
-
2007
- 2007-05-14 RU RU2007117787/15A patent/RU2362169C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LIU Z et al. Mechanically engraved mica surface using the atomic force microscope tip facilitates return to a specific sample location. Microsc Res Tech. 2005 Feb; 66(2-3): 156-62. BUSTAMANTE С et al. Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy. Biochemistry. 1992 Jan 14; 31(1): 22-6. WICAKSONO DH et al. Biosens Bioelectron. 2004 Jul 15; 19(12):1573-9. On-chip biosensing of estrogen receptor-alpha at single molecular level. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2780656C2 (en) * | 2017-06-19 | 2022-09-28 | Сейфгард Байосистемс Холдингс Лтд. | Three-dimensional polymer meshes and their use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007117787A (en) | 2008-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2007217819B2 (en) | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution | |
| AU2004288228B2 (en) | Use of particulate labels in bioanalyte detection methods | |
| US8288162B2 (en) | Nano-particle biochip substrates | |
| JP4222756B2 (en) | Colloidal composition for solid phase biomolecule analysis preparation identification system | |
| US20060286682A1 (en) | Surface treatment | |
| US20020146745A1 (en) | Methods and reagents for multiplexed analyte capture, surface array self-assembly, and analysis of complex biological samples | |
| JP5538726B2 (en) | Sol composition for a sol-gel biochip for immobilizing a probe to a substrate that has not been surface-treated and a screening method thereof | |
| JP2005524849A (en) | Nanoparticle probes for analyte detection with fingerprints for Raman spectroscopy | |
| CA2487933A1 (en) | Novel high density arrays and methods for analyte analysis | |
| WO2009145818A1 (en) | Single molecule loading methods and compositions | |
| WO2010087121A1 (en) | Device for analyzing nucleic acids and apparatus for analyzing nucleic acids | |
| JP2003514224A (en) | Biosensing using surface plasmon resonance | |
| US20180327824A1 (en) | Microarrays | |
| JP2002531098A (en) | Cloning and copying on surface | |
| JP2003522962A (en) | Microarray method using semiconductor nanocrystals | |
| JP5214941B2 (en) | Single probe molecular device and method for producing single probe molecular device | |
| WO2008021614A2 (en) | Coded particle arrays for high throughput analyte analysis | |
| US20080293592A1 (en) | Method For Covalently Immobilising Biomolecules on Organic Surfaces | |
| RU2362169C2 (en) | Nano-biochip used for registration of proteins and albuminous complexes, way of its reception and way of registration of proteins and albuminous complexes with use of catheter microscopy | |
| US20040009584A1 (en) | Method for manufacturing microarrays based on the immobilization of porous substrates on thermally modifiable surfaces | |
| US20020086325A1 (en) | Affinity detecting/analytical chip, method for production thereof, detection method and detection system using same | |
| US8187829B2 (en) | Method for fabricating pattern on a biosensor substrate and biosensor using the same | |
| RU2283496C2 (en) | Method and biochip for recording macromolecules in carrying out proteomic research | |
| García-Chamé et al. | Fluidic Interface for Surface-based DNA Origami Studies | |
| Cieplak et al. | Protein Determination Using Molecularly Imprinted Polymer (MIP) Chemosensors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190515 |