RU2342164C2 - Skin equivalent and method for its production - Google Patents
Skin equivalent and method for its production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2342164C2 RU2342164C2 RU2006110711/15A RU2006110711A RU2342164C2 RU 2342164 C2 RU2342164 C2 RU 2342164C2 RU 2006110711/15 A RU2006110711/15 A RU 2006110711/15A RU 2006110711 A RU2006110711 A RU 2006110711A RU 2342164 C2 RU2342164 C2 RU 2342164C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- keratinocytes
- skin
- collagen
- gel
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 54
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 42
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 9
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 6
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract description 15
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract description 15
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract description 15
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 abstract description 9
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 9
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 abstract description 9
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 abstract 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 abstract 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 13
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 5
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 5
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 4
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 2
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 2
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000005598 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010059480 Chondroitin Sulfate Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 241001417092 Macrouridae Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 229940009493 gel-one Drugs 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013376 serial cultivation Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к средствам медицинского назначения, содержащим культуры клеток человека, и способы их получения.The invention relates to medicine, in particular to medical devices containing cultures of human cells, and methods for their preparation.
Восстановление кожного покрова с использованием культивируемых клеток кожи имеет 30-летнюю историю. Начало заместительной кожной терапии было положено работами Рейнвальда и Грина по выделению и культивированию клеток эпидермиса человека - кератиноцитов (Rheinwald J.G. and Green H., 1975).Restoring the skin using cultured skin cells has a 30-year history. The beginning of skin substitution therapy was laid by the work of Reinwald and Green on the isolation and cultivation of human epidermal cells - keratinocytes (Rheinwald J.G. and Green H., 1975).
К настоящему времени разработаны различные виды эквивалентов кожи. Общим для них является принцип создания эквивалента по аналогии со структурой нормальной кожи: эквивалент состоит из дермального и эпидермального слоев. В основе дермального компонента - как правило, трехмерная коллагеновая матрица, содержащая мезенхимные клетки. Эпидермальный слой формируется на поверхности дермального за счет роста и дифференцировки кератиноцитов. Состав белков матрицы, клеточных элементов и способов формирования эпидермального слоя в разных моделях варьируют.To date, various types of skin equivalents have been developed. Common to them is the principle of creating an equivalent by analogy with the structure of normal skin: the equivalent consists of the dermal and epidermal layers. The basis of the dermal component is, as a rule, a three-dimensional collagen matrix containing mesenchymal cells. The epidermal layer is formed on the surface of the dermal layer due to the growth and differentiation of keratinocytes. The composition of the proteins of the matrix, cellular elements and methods for the formation of the epidermal layer in different models vary.
Одним из первых способов получения эквивалента кожи является способ, описанный Беллом (аналог 1) (Bell et al., 1983). В данном известном способе сначала формируется коллагеновый гель путем смешивания кислого раствора коллагена I типа, полной питательной среды и мезенхимных клеток - фибробластов. При физиологическом значении рН гель полимеризуется. Клетки, распластываясь внутри геля, начинают его сокращать. Степень и скорость сокращения геля зависит от концентрации коллагена и клеток. Уменьшение размеров геля может происходить до 5 раз. Авторы полагали, что такое состояние геля, в котором коллагеновые фибриллы плотно расположены, а фибробласты находятся в состоянии покоя, т.е. не пролиферируют, соответствует нормальной дерме. На поверхность сформированного дермального эквивалента помещают кусочки кожи, из которых начинают мигрировать кератиноциты и формировать на поверхности геля слой эпидермальных клеток. Культивирование кератиноцитов осуществляется в двух режимах. Сначала клетки инкубируют в среде с низким содержанием кальция, способствующей пролиферации кератиноцитов, а затем при разрастании кератиноцитов по всей поверхности геля культивирование осуществляют на границе среда - воздух со сменой среды на высокое содержание кальция, т.к. именно в этих условиях более полно осуществляется дифференцировка кератиноцитов и формируется роговой слой. Весь процесс культивирования и формирования полного эквивалента кожи занимает около 3 недель. Именно в таком виде, максимально приближенном к структуре кожи in vivo, осуществляют пересадку эквивалента кожи. Однако недостатком данного решения является тот факт, что сокращение коллагенового геля приводит к тому, что клетки перестают делиться и уходят в апоптоз (Grirmell et al., 1999).One of the first ways to get the skin equivalent is the method described by Bell (analogue 1) (Bell et al., 1983). In this known method, a collagen gel is first formed by mixing an acidic type I collagen solution, a complete nutrient medium and mesenchymal cells — fibroblasts. At physiological pH, the gel polymerizes. Cells, spreading inside the gel, begin to contract it. The degree and rate of gel contraction depends on the concentration of collagen and cells. Reducing the size of the gel can occur up to 5 times. The authors believed that such a state of the gel, in which collagen fibrils are densely located, and fibroblasts are at rest, i.e. do not proliferate, corresponds to a normal dermis. Pieces of skin are placed on the surface of the formed dermal equivalent, from which keratinocytes begin to migrate and form a layer of epidermal cells on the gel surface. The cultivation of keratinocytes is carried out in two modes. First, the cells are incubated in a medium with a low calcium content, which promotes the proliferation of keratinocytes, and then, when keratinocytes grow over the entire surface of the gel, cultivation is carried out at the medium - air interface with the medium changing to a high calcium content, because it is under these conditions that keratinocytes are differentiated more fully and the stratum corneum is formed. The whole process of cultivation and the formation of the full equivalent of the skin takes about 3 weeks. It is in this form, as close as possible to the skin structure in vivo, that the equivalent of the skin is transplanted. However, the disadvantage of this solution is the fact that the reduction of the collagen gel leads to the fact that the cells stop dividing and go into apoptosis (Grirmell et al., 1999).
Известен способ формирования полного эквивалента кожи, в котором в качестве дермального компонента используют коллагеновую губку - коммерческий препарат, где коллагеновые фибриллы поперечно сшиты, что предотвращает сокращение губки фибробластами (аналог 2) (Eisenberg M., 2000). Сверху коллагеновую губку покрывают слоем непористого коллагена, который служит подложкой для роста кератиноцитов. Кератиноциты в данной модели предварительно выделяют из кожи ферментативным путем с использованием трипсина, культивируют in vitro, снимают с культуральных флаконов в виде суспензии и затем высевают на поверхность эквивалента в виде капель. Кератиноциты культивируют традиционным способом в двух режимах на границе среда - воздух в течение 14 дней до формирования многослойного пласта.A known method of forming the full equivalent of the skin, in which a collagen sponge is used as a dermal component, is a commercial preparation, where collagen fibrils are cross-linked, which prevents the sponge from contracting with fibroblasts (analogue 2) (Eisenberg M., 2000). On top of the collagen sponge is covered with a layer of non-porous collagen, which serves as a substrate for the growth of keratinocytes. Keratinocytes in this model are preliminarily isolated from the skin by enzymatic means using trypsin, cultured in vitro, removed from culture bottles in suspension and then plated onto the surface of the equivalent in the form of drops. Keratinocytes are cultured in the traditional way in two modes at the medium-air interface for 14 days before the formation of the multilayer layer.
Формирование многослойного дифференцированного пласта кератиноцитов in vitro требует длительного культивирования и больших затрат средств. Авторы предыдущих аналогов полагали, что чем больше будет структурное сходство полученного эквивалента с интактной кожей, тем лучше произойдет его приживление. Однако данное условие является оправданным только в случае пересадки аутологичного материала, т.е. когда кожный эквивалент готовится из клеток самого пациента. В случае пересадки аллогенного материала истинного приживления эквивалента не происходит, т.к. пересаженный продукт со временем замещается клетками самого пациента (Zhao et al., 1992, Phillips T.J et al., 2002). Ранозаживляющее действие эквивалента кожи основано на том, что фибробласты и кератиноциты оказывают стимулирующее воздействие на клетки кожи пациента, а коллагеновый матрикс служит готовой подложкой, по которой возможна миграция клеток. Распластываясь внутри геля, фибробласты начинают синтезировать ряд биологически активных факторов: фактор роста кератиноцитов (Rubin et al., 1995) и фактор роста гепатоцитов (Stoker et al., 1987), которые стимулируют пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток. В свою очередь кератиноциты синтезируют интерлейкины, играющие важную роль в регуляции синтетической активности фибробластов. Роговой слой дифференцированных кератиноцитов выполняет функцию защиты и барьера от внешней среды. Дифференцированные кератиноциты прекращают синтезировать как белки внеклеточного матрикса, так и ростовые факторы, в них начинаются процессы образования роговой оболочки, соответственно они не обладают стимулирующим действием.The formation of a multilayer differentiated stratum of keratinocytes in vitro requires long-term cultivation and costly funds. The authors of previous analogues believed that the greater the structural similarity of the obtained equivalent to intact skin, the better its engraftment will occur. However, this condition is justified only in case of transplantation of autologous material, i.e. when the skin equivalent is prepared from the cells of the patient himself. In the case of transplantation of allogeneic material, true engraftment does not occur, because the transplanted product is eventually replaced by the cells of the patient himself (Zhao et al., 1992, Phillips T.J et al., 2002). The wound healing effect of the skin equivalent is based on the fact that fibroblasts and keratinocytes have a stimulating effect on the patient’s skin cells, and the collagen matrix serves as a ready-made substrate on which cell migration is possible. Flattening inside the gel, fibroblasts begin to synthesize a number of biologically active factors: keratinocyte growth factor (Rubin et al., 1995) and hepatocyte growth factor (Stoker et al., 1987), which stimulate proliferation and migration of epithelial cells. In turn, keratinocytes synthesize interleukins, which play an important role in the regulation of the synthetic activity of fibroblasts. The stratum corneum of differentiated keratinocytes serves as a protection and a barrier from the external environment. Differentiated keratinocytes stop synthesizing both extracellular matrix proteins and growth factors, the processes of formation of the cornea membrane begin in them, respectively, they do not have a stimulating effect.
В другой модели кожного эквивалента кератиноциты наносят на поверхность коллагеновой матрицы в виде суспензии или на микроносителях (аналог 3) (Терских В.В. и др., 2005). Такой комплекс используют через несколько дней, в начале роста колоний кератиноцитов.In another model of the skin equivalent, keratinocytes are applied to the surface of the collagen matrix in the form of a suspension or on microcarriers (analogue 3) (Terskih V.V. et al., 2005). Such a complex is used after a few days, at the beginning of the growth of keratinocyte colonies.
Популяция кератиноцитов состоит из клеток на различных стадиях дифференцировки, которые организованы в несколько слоев. Самый нижний, лежащий на базальной мембране, представляет собой клетки недифференцированные, которые, дифференцируясь, смещаются в вышележащие слои. Важно подчеркнуть, что популяция базальных клеток также гетерогенна: в ней различают стволовые клетки, которые составляют около 10% популяции, и клетки транзиторные (Potten and Morris, 1988). Обновление эпидермиса зависит от стволовых клеток, которые имеют максимальный пролиферативный потенциал, т.е. способны к самовоспроизведению на протяжении всей жизни индивидуума. Стволовые клетки дают начало транзиторным, которые через ряд делений уходят в дифференцировку. При ферментативном выделении получается общая популяция кератиноцитов, в которую входят клетки на разных стадиях дифференцировки. При посеве такой популяции к подложке прикрепляются не только клетки базального слоя, но и вышележащих слоев, которые имеют рецепторы к данному матриксу. Однако не все клетки начинают делиться, кератиноциты различаются по способности пролиферировать и образовывать колонии (BarrandonY. and Green H., 1987). Различают голоклоны - колонии, которые формируются стволовыми клетками с высоким пролиферативным потенциалом, и параклоны - колонии, состоящие из клеток с низким пролиферативньм потенциалом. После нескольких делений клетки таких параклонов переходят к терминальной дифференцировке. Таким образом, при посеве общей популяции кератиноцитов только небольшой процент клеток будет находиться в активном состоянии и оказывать стимулирующее действие на восстановление кожного покрова.The keratinocyte population consists of cells at various stages of differentiation, which are organized in several layers. The lowest, lying on the basement membrane, is undifferentiated cells, which, differentiating, are displaced into the overlying layers. It is important to emphasize that the basal cell population is also heterogeneous: it distinguishes between stem cells, which make up about 10% of the population, and transient cells (Potten and Morris, 1988). Epidermal renewal depends on stem cells that have maximum proliferative potential, i.e. capable of self-reproduction throughout the life of the individual. Stem cells give rise to transient cells, which, through a series of divisions, go into differentiation. Enzymatic isolation results in a general population of keratinocytes, which includes cells at different stages of differentiation. When sowing such a population, not only the cells of the basal layer are attached to the substrate, but also the overlying layers that have receptors for this matrix. However, not all cells begin to divide; keratinocytes differ in their ability to proliferate and form colonies (BarrandonY. And Green H., 1987). There are holoclones — colonies that are formed by stem cells with a high proliferative potential, and paraclones — colonies that are composed of cells with a low proliferative potential. After several divisions, the cells of such paraclones proceed to terminal differentiation. Thus, when seeding the general keratinocyte population, only a small percentage of the cells will be in an active state and have a stimulating effect on the restoration of the skin.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является эквивалент кожи, при создании которого используют не всю популяцию кератиноцитов кожи, а только недифференцированные базальные стволовые клетки (Noll М. and Grave Т., 2004). Данный эквивалент кожи выбран нами в качестве ближайшего аналога-прототипа.The closest in technical essence to the proposed invention is the equivalent of the skin, the creation of which does not use the entire population of skin keratinocytes, but only undifferentiated basal stem cells (Noll M. and Grave T., 2004). This skin equivalent is chosen by us as the closest analogue prototype.
Основу трехмерной модели кожи составляет коллагеновый гель с заключенными в него фибробластами. Коллагеновый гель готовят путем смешивания кислого раствора коллагена I типа с пятикратной концентрированной средой М 199, буфером HEPES, эмбриональной бычьей сывороткой и суспензией фибробластов. Также в коллагеновый гель добавляют протеогликан хондроитин-сульфат, являющийся компонентом внеклеточного матрикса кожи. Концентрация коллагена и клеток в конечном растворе составляют 3 мг/мл и 1.5-10×105 соответственно. На поверхность коллагенового геля наносят раствор фибронектина. Фибронектин - это гликопротеин, который является адгезивным белком и опосредует взаимодействия клеток с матриксом. Готовый коллагеновый гель с фибробластами культивируют в течение 2-3 дней перед посевом стволовых кератиноцитов. Первые 1-3 дня культивирование эквивалента кожи осуществляют в среде с низким 0,8 мМ содержанием кальция в присутствии 5% эмбриональной бычьей сыворотки, эпидермального фактора роста и экстракта из гипоталамуса быка. Полную дифференцировку кератиноцитов осуществляют в среде с высоким 1,8 мМ содержанием кальция на границе среда - воздух без ростовых добавок. Авторы данного патента идентифицируют стволовые клетки кожи по окраске на кератин 19 и по наличию рецептора β1 интегрина. К недостаткам данного технического решения можно отнести выбор маркеров, по которым производится отбор стволовых клеток базального слоя. На сегодняшний день окончательно не определены маркеры, по которым достоверно можно идентифицировать стволовые клетки кожи. Показано, что базальные кератиноциты с высокой колонеобразующей способностью имеют повышенный уровень экспрессии β1 и а6 субъединиц интегринов - рецепторов к белкам базальной мембраны (Jones et al., 1995). В качестве маркеров стволовых кератиноцитов также указывают наличие рецепторов к трансферрину и кератин 19 (Michel et al., 1996). Однако большинство из этих маркеров имеется также и у транзиторных клеток. Наиболее достоверным критерием, по которому можно определить стволовые клетки кожи, является транскрипционный фактор р63 (Pelegrini et al., 2001). Другим недостатком данного технического решения является традиционное культивирование на границе среда - воздух, что стимулирует дифференцировку кератиноцитов и образование рогового слоя. Кроме того, этот способ формирования эквивалента является длительным и дорогостоящим, т.к. на образование многослойного пласта эпидермиса уходит более 2-х недель и требуется применение ростовых добавок и сред различного состава.The basis of the three-dimensional model of the skin is a collagen gel with fibroblasts enclosed in it. A collagen gel is prepared by mixing an acidic collagen type I solution with five times concentrated M 199 medium, HEPES buffer, fetal bovine serum and a suspension of fibroblasts. Chondroitin sulfate proteoglycan, which is a component of the extracellular matrix of the skin, is also added to the collagen gel. The concentration of collagen and cells in the final solution is 3 mg / ml and 1.5-10 × 10 5, respectively. A solution of fibronectin is applied to the surface of the collagen gel. Fibronectin is a glycoprotein that is an adhesive protein and mediates cell interactions with the matrix. The finished collagen gel with fibroblasts is cultured for 2-3 days before seeding of stem keratinocytes. The first 1-3 days, the cultivation of the skin equivalent is carried out in an environment with a low 0.8 mM calcium content in the presence of 5% fetal bovine serum, epidermal growth factor and an extract from the bovine hypothalamus. Complete differentiation of keratinocytes is carried out in an environment with a high 1.8 mM calcium content at the medium – air interface without growth additives. The authors of this patent identify skin stem cells by staining for keratin 19 and by the presence of β1 integrin receptor. The disadvantages of this technical solution include the choice of markers, which are used to select stem cells of the basal layer. To date, markers that can reliably identify skin stem cells have not been definitively identified. It has been shown that basal keratinocytes with high colony forming ability have an increased level of expression of β1 and a6 subunits of integrins - receptors for basement membrane proteins (Jones et al., 1995). The presence of transferrin receptors and keratin 19 are also indicated as markers of stem keratinocytes (Michel et al., 1996). However, most of these markers are also present in transient cells. The most reliable criterion by which skin stem cells can be determined is transcription factor p63 (Pelegrini et al., 2001). Another disadvantage of this technical solution is the traditional cultivation on the border of the environment - air, which stimulates the differentiation of keratinocytes and the formation of the stratum corneum. In addition, this method of forming the equivalent is long and expensive, because the formation of a multilayer layer of the epidermis takes more than 2 weeks and requires the use of growth additives and media of various compositions.
Известно, что покоящиеся кератиноциты и кератиноциты, активированные к пролиферации, имеют существенные различия, которые отражаются на составе рецепторов к белкам внеклеточного матрикса, способности к миграции и синтетической активности (Grinnell F., 1992). Основываясь на известном стимулирующем действии эквивалента кожи, предлагается пересадку продукта осуществлять не на стадии, которая характеризуется покоем фибробластов и полной дифференцировкой эпидермиса, а в стадии активного роста как кератиноцитов, так и фибробластов. Таким образом, основным отличием предлагаемого изобретения от известных аналогов является его применение не на стадии полной дифференцировки многослойного пласта кератиноцитов, а на стадии активного роста клеток кожи.It is known that resting keratinocytes and keratinocytes activated to proliferation have significant differences that affect the composition of receptors for extracellular matrix proteins, their ability to migrate, and their synthetic activity (Grinnell F., 1992). Based on the known stimulating effect of the skin equivalent, it is proposed that the product transplantation be carried out not at the stage that is characterized by the rest of fibroblasts and the complete differentiation of the epidermis, but at the stage of active growth of both keratinocytes and fibroblasts. Thus, the main difference of the present invention from known analogues is its use not at the stage of complete differentiation of the multilayer keratinocyte layer, but at the stage of active growth of skin cells.
Решаемой задачей и техническим результатом предлагаемого изобретения является создание эквивалента кожи, содержащего клетки на стадии начального активного роста и обладающего длительным стимулирующим действием на миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента, и способ получения такого эквивалента.The problem and technical result of the present invention is the creation of an equivalent skin containing cells at the initial active growth stage and having a long stimulating effect on the migration and proliferation of the patient’s own cells, and a method for producing such an equivalent.
Целевой продукт в конкретных условиях представляет собой эквивалент кожи, в основе которого - матрица из белков внеклеточного матрикса с клетками мезенхимы внутри нее и эпидермальными клетками на ее поверхности. В качестве матрицы используется коллагеновый или фибриновый гель. В качестве эпидермальных клеток используется отселектированная популяция кератиноцитов, клетки которой обладают максимальным пролиферативным потенциалом и характеризуются наличием специфического маркера р63. Это достигается предварительной кратковременной адгезией общей суспензии кератиноцитов на коллаген IV типа. Было показано, что кератиноциты, прикрепляющиеся к коллагену IV типа за 15 мин, обладают характеристиками стволовых клеток - дают начало колониям и окрашиваются на р63 - маркер стволовых кератиноцитов. Транскрипционный фактор р63 выявляется при иммунофлюоресцентной окраске кератиноцитов коммерческими моноклональными антителами (clon 4A4, Sigma).The target product in specific conditions is the equivalent of the skin, which is based on a matrix of extracellular matrix proteins with mesenchyme cells inside it and epidermal cells on its surface. As a matrix, collagen or fibrin gel is used. A selective population of keratinocytes is used as epidermal cells, the cells of which have the maximum proliferative potential and are characterized by the presence of a specific marker p63. This is achieved by preliminary short-term adhesion of the general suspension of keratinocytes to type IV collagen. It was shown that keratinocytes that attach to type IV collagen in 15 minutes possess the characteristics of stem cells — give rise to colonies and stain with p63 — a marker of stem keratinocytes. The transcription factor p63 is detected by immunofluorescence staining of keratinocytes with commercial monoclonal antibodies (clon 4A4, Sigma).
В частном конкретном случае способ получения эквивалента кожи осуществляется следующим образом. Сначала формируется трехмерная матрица, состоящая из белков внеклеточного матрикса и мезенхимных клеток. В качестве основного белкового компонента такой матрицы используется коллагеновый гель. Коллагеновый гель готовится путем смешивания кислого раствора коллагена I типа с десятикратной ростовой средой M199 и 0,34 М NaOH до получения нейтрального раствора и последующим введением в него суспензии аллогенных фибробластов кожи человека. Используемые концентрация клеток (100 тыс./мл ) и коллагена (1,5-2,5 мг/мл) не позволяет гелю сокращаться в течение недели, таким образом, клетки внутри геля остаются в активном состоянии.In a particular case, the method of obtaining equivalent skin is as follows. First, a three-dimensional matrix is formed, consisting of extracellular matrix proteins and mesenchymal cells. Collagen gel is used as the main protein component of such a matrix. A collagen gel is prepared by mixing an acidic collagen type I solution with tenfold growth medium M199 and 0.34 M NaOH to obtain a neutral solution and then introducing a suspension of allogeneic human skin fibroblasts into it. The used concentration of cells (100 thousand / ml) and collagen (1.5-2.5 mg / ml) does not allow the gel to contract for a week, thus, the cells inside the gel remain in an active state.
Популяция стволовых кератиноцитов высевается на поверхность геля через сутки после его приготовления. Сначала из кожи человека ферментативным путем выделяется общая популяция кератиноцитов. Для этого кусочки кожи здоровых доноров, полученные в результате косметологических операций, помещают в раствор 0,5% диспазы и 0,2% коллагеназы на 12 часов при 4°С. После ферментативного расщепления базальной мембраны эпидермис механическим путем отделяется от дермы и подвергается действию трипсина 0,125% концентрации (10 мин при 37°С). Затем полученная суспензия высевается на культуральную посуду, покрытую коллагеном IV типа. Раствор коллагена IV типа в концентрации 10 мкг/мл наносится на поверхность посуды на 1 час при комнатной температуре. Через 15 мин неприкрепившиеся клетки удаляются. Прикрепившиеся клетки снимаются версеном, суспендируются в ростовой среде и высеваются на поверхность сформированного геля. Гель заливается ростовой средой, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Через 2-3 дня начинается активный рост кератиноцитов и формирование колоний. Весь технологический процесс приготовления эквивалента кожи занимает 3-4 дня, что, во-первых, существенно сокращает сроки подготовки продукта к использованию, и, во-вторых, снижает риск контаминации продукта микроорганизмами, который может произойти в процессе его культивирования.A population of stem keratinocytes is plated on the surface of the gel one day after its preparation. First, a general population of keratinocytes is isolated from human skin by an enzymatic route. For this, pieces of the skin of healthy donors obtained as a result of cosmetic operations are placed in a solution of 0.5% dispase and 0.2% collagenase for 12 hours at 4 ° C. After enzymatic cleavage of the basement membrane, the epidermis is mechanically separated from the dermis and exposed to trypsin at 0.125% concentration (10 min at 37 ° C). Then the resulting suspension is plated on a culture dish coated with type IV collagen. A solution of type IV collagen at a concentration of 10 μg / ml is applied to the surface of the dishes for 1 hour at room temperature. After 15 minutes, non-adherent cells are removed. Attached cells are removed by versene, suspended in the growth medium and plated on the surface of the formed gel. The gel is filled with growth medium containing 10% fetal bovine serum. After 2-3 days, the active growth of keratinocytes and the formation of colonies begins. The whole technological process of preparing the equivalent of the skin takes 3-4 days, which, firstly, significantly reduces the time for preparing the product for use, and, secondly, reduces the risk of contamination of the product with microorganisms that can occur during its cultivation.
Такой эквивалент кожи пригоден для использования немедленно или в течение 2-3 дней при его хранении в условиях 5% CO2 при 37°С.Such a skin equivalent is suitable for use immediately or within 2-3 days when stored under 5% CO 2 at 37 ° C.
Хотя в частном конкретном случае приведен предпочтительный вариант осуществления изобретения, в пределах сущности и объема изобретения возможны различные варианты, охватываемые приводимой формулой изобретения. Так, в качестве мезенхимных клеток могут использоваться эмбриональные или постнатальные фибробласты человека или мезенхимные стволовые клетки красного костного мозга (аутологичные или аллогенные). В качестве матрицы может использоваться фибриновый гель. Фибриновый гель готовится из фибриногена или плазмы крови при смешивании с тромбином. При этом может использоваться как плазма крови самого пациента, так и донора. В качестве минорных компонентов в гель могут добавляться такие элементы внеклеточного матрикса, как фибронектин и ламинин. Известно, что фибронектин ингибирует начальную дифференцировку кератиноцитов, а ламинин является компонентом базальной мембраны и стимулирует прикрепление и миграцию кератиноцитов. Матриксные белки в концентрациях 5-10 мкг/см2 наносятся на поверхность сформированного геля (коллагенового или фибринового) перед посевом кератиноцитов,Although a preferred embodiment of the invention is given in a particular case, various variations are possible within the spirit and scope of the invention that are covered by the claims. Thus, human embryonic or postnatal fibroblasts or red bone marrow mesenchymal stem cells (autologous or allogeneic) can be used as mesenchymal cells. As the matrix can be used fibrin gel. A fibrin gel is prepared from fibrinogen or blood plasma when mixed with thrombin. In this case, both the blood plasma of the patient and the donor can be used. Elements of the extracellular matrix such as fibronectin and laminin can be added to the gel as minor components. It is known that fibronectin inhibits the initial differentiation of keratinocytes, and laminin is a component of the basement membrane and stimulates the attachment and migration of keratinocytes. Matrix proteins in concentrations of 5-10 μg / cm 2 are applied to the surface of the formed gel (collagen or fibrin) before seeding keratinocytes,
Пример 1. Адгезивная селекция популяции базальных кератиноцитов с характеристиками стволовых клеток.Example 1. Adhesive selection of a population of basal keratinocytes with characteristics of stem cells.
Кератиноциты выделяют из кожи взрослых доноров по модифицированному методу Рейнвальда (Rheinwald J., Green H., 1975). В качестве источника эпидермальных клеток используется кожа лица, полученная в результате косметологических операций. Кусочки кожи в течение ночи инкубируют в растворе диспазы II в концентрации 0.5% (Roche Diagnostics GmbH Mannheim) и коллагеназы гидробионтов в концентрации 0.2% (ОАО "Технология", С-Петербург) при температуре 4°С, после чего производится механическое отделение эпидермиса от дермы. Для получения суспензии клеток эпидермис помещают в раствор трипсина в концентрации 0.125% (Биолот) и версена в концентрации 0.02% (Биолот), на 10 мин при 37°С. Действие фермента ингибируют добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone). Полученная суспензию клеток осаждается при 300 g в течение 5 минут, супернатант удаляется, а осадок клеток суспендируется в среде DMEM/F12 (3:1) (ICN).Keratinocytes are isolated from the skin of adult donors using the modified Reinwald method (Rheinwald J., Green H., 1975). As a source of epidermal cells, facial skin obtained as a result of cosmetic operations is used. Pieces of skin are incubated overnight in a solution of dispase II at a concentration of 0.5% (Roche Diagnostics GmbH Mannheim) and collagenase of hydrobionts at a concentration of 0.2% (Technologiya OJSC, St. Petersburg) at a temperature of 4 ° C, after which the epidermis is mechanically separated from dermis. To obtain a suspension of cells, the epidermis is placed in a trypsin solution at a concentration of 0.125% (Biolot) and versene at a concentration of 0.02% (Biolot) for 10 min at 37 ° C. The enzyme is inhibited by the addition of 5% fetal bovine serum (HyClone). The resulting cell suspension is precipitated at 300 g for 5 minutes, the supernatant is removed, and the cell pellet is suspended in DMEM / F12 (3: 1) (ICN).
Для селективной адгезии кератиноцитов поверхность культуральной посуды покрывается раствором коллагена IV типа (10 мкг/мл) на 1час при комнатной температуре. Суспензия кератиноцитов высевается в концентрации 1×106/см2 и инкубируется при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 15 мин. После этого неприкрепившиеся клетки удаляются, а прикрепившиеся снимаются версеном, суспендируются в ростовой среде DMEM/F12(ICN), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone), наносятся на поверхность заранее сформированного геля и культивируются 2-3 дня до формирования колоний кератиноцитов.For selective keratinocyte adhesion, the surface of the culture dish is coated with a type IV collagen solution (10 μg / ml) for 1 hour at room temperature. A suspension of keratinocytes is plated at a concentration of 1 × 10 6 / cm 2 and incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 for 15 minutes After this, non-adherent cells are removed, and adherent cells are removed by versene, suspended in DMEM / F12 growth medium (ICN) containing 10% fetal bovine serum (HyClone), applied to the surface of a pre-formed gel and cultured 2-3 days before the formation of keratinocyte colonies.
Пример 2. Приготовление эквивалента кожи на основе коллагенового геля.Example 2. Preparation of a skin equivalent based on a collagen gel.
Для приготовления коллагенового геля используется уксусный раствор коллагена I типа, полученный мягкой кислотной экстракцией сухожилий хвостов крыс, обеспечивающей сохранение нативной структуры молекул коллагена.To prepare the collagen gel, type I collagen acetic solution is used, obtained by soft acid extraction of rat tails tendons, which preserves the native structure of collagen molecules.
Раствор коллагена смешивается с десятикратной средой M199 (Sigma) и после подведения рН до физиологического значения добавлением 0.34 М NaOH, в раствор вводится суспензия мезенхимных клеток в ростовой среде. Конечная концентрация клеток в геле 70-100 тыс./мл и коллагена 1,5-2,5 мг/мл. Приготовление растворов осуществляется на льду во избежание преждевременной полимеризации геля. Приготовленная смесь разливается по чашкам Петри (диаметром 3 или 5 см) и помещается в СО2 инкубатор на 15-20 мин для полимеризации геля. После полимеризации на поверхность геля наносится предварительно отселектированная популяция стволовых кератиноцитов в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотик гентамицин (0,8 мкг/мл). Эквивалент кожи культивируется 2-3 дня в атмосфере 5% СО2 при 37°С.The collagen solution is mixed with tenfold M199 medium (Sigma) and after adjusting the pH to physiological value by adding 0.34 M NaOH, a suspension of mesenchymal cells in the growth medium is introduced into the solution. The final concentration of cells in the gel is 70-100 thousand / ml and collagen 1.5-2.5 mg / ml. The solutions are prepared on ice to avoid premature gel polymerization. The prepared mixture is poured into Petri dishes (with a diameter of 3 or 5 cm) and placed in a CO 2 incubator for 15-20 minutes for gel polymerization. After polymerization, a pre-selected population of stem keratinocytes in the DMEM / F12 growth medium containing 10% fetal bovine serum and the antibiotic gentamicin (0.8 μg / ml) is applied to the gel surface. The skin equivalent is cultivated for 2-3 days in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C.
Пример 3. Приготовление эквивалента кожи на основе фибринового геля с использованием плазмы крови человека.Example 3. Preparation of a skin equivalent based on a fibrin gel using human blood plasma.
Для приготовления фибринового геля используется плазма крови, полученная в результате плазмофереза. Суспензия мезенхимных клеток в ростовой среде в концентрации 2×105/мл смешивается с плазмой крови в соотношении 1:1. Приготовленная смесь разливается по чашкам Петри необходимой площади (диаметром 3 или 5 см), к каждой аликвоте добавляется тромбин (70 ед./1 мл), смесь аккуратно пипетируется и помещается в СО2 инкубатор на 15-20 мин для полимеризации геля. После полимеризации на поверхность геля наносится предварительно отселектированная популяция стволовых кератиноцитов в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотик гентамицин (0,8 мкг/мл). Эквивалент кожи культивируется 2-3 дня в атмосфере 5% СО2 при 37°С.For the preparation of a fibrin gel, blood plasma obtained by plasmapheresis is used. A suspension of mesenchymal cells in a growth medium at a concentration of 2 × 10 5 / ml is mixed with blood plasma in a ratio of 1: 1. The prepared mixture is poured into Petri dishes of the required area (diameter 3 or 5 cm), thrombin (70 units / 1 ml) is added to each aliquot, the mixture is carefully pipetted and placed in a CO 2 incubator for 15-20 minutes to gel polymerize. After polymerization, a pre-selected population of stem keratinocytes in the DMEM / F12 growth medium containing 10% fetal bovine serum and the antibiotic gentamicin (0.8 μg / ml) is applied to the gel surface. The skin equivalent is cultivated for 2-3 days in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C.
Пример 4. Приготовление эквивалента кожи на основе фибринового геля с использованием препарата фибриногена.Example 4. Preparation of a skin equivalent based on a fibrin gel using a fibrinogen preparation.
Для приготовления фибринового геля используется коммерческий человеческий фибриноген. Фибриноген разводится в дистиллированной воде до концентрации 10 мг/мл и хранится при - 20°С. Мезенхимные клетки в ростовой среде смешиваются с раствором фибриногена при температуре 30°С до конечной концентрация фибриногена 2.5 мг/мл и клеток 1×105 кл./мл. Приготовленная смесь разливается по чашкам Петри необходимой площади (диаметром 3 или 5 см), к каждой аликвоте добавляется тромбин (100 ед./1 мл), аккуратно пипетируется и помещается в CO2 инкубатор на один час для полимеризации геля. После полимеризации на поверхность геля наносится предварительно отселектированная популяция стволовых кератиноцитов в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотик гентамицин (0,8 мкг/мл). Эквивалент кожи культивируется 2-3 дня в атмосфере 5% СО2 при 37°С.To prepare the fibrin gel, commercial human fibrinogen is used. Fibrinogen is diluted in distilled water to a concentration of 10 mg / ml and stored at - 20 ° C. Mesenchymal cells in the growth medium are mixed with a solution of fibrinogen at a temperature of 30 ° C to a final concentration of fibrinogen of 2.5 mg / ml and cells 1 × 10 5 cells / ml. The prepared mixture is poured into Petri dishes of the required area (3 or 5 cm in diameter), thrombin (100 units / 1 ml) is added to each aliquot, gently pipetted and placed in a CO 2 incubator for one hour to gel polymerize. After polymerization, a pre-selected population of stem keratinocytes in the DMEM / F12 growth medium containing 10% fetal bovine serum and the antibiotic gentamicin (0.8 μg / ml) is applied to the gel surface. The skin equivalent is cultivated for 2-3 days in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C.
Источники информацииInformation sources
Терских В.В., Киселев И.В., Смирнов С.В., Роговая О.С., Васильев А.В. Биологический активный комплекс для органогенеза. Патент RU 2254146. 2005.06.20.Terskikh V.V., Kiselev I.V., Smirnov S.V., Rogovaya O.S., Vasiliev A.V. Biological active complex for organogenesis. Patent RU 2254146. 2005.06.20.
Barrandon Y. and Green H. Three clonal types of keratinocytes with different capacities for multiplication. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2302-2306.Barrandon Y. and Green H. Three clonal types of keratinocytes with different capacities for multiplication. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2302-2306.
Bell E., Sher S., Hull В., Merrill C., Rosen S. et al. The reconstitution of living skin.1983. J. Invest.Dermatol. 81: 2s-10s.Bell E., Sher S., Hull B., Merrill C., Rosen S. et al. The reconstitution of living skin. 1983. J. Invest. Dermatol. 81: 2s-10s.
Eisenberg M. Composite living skin equivalent. Патент US 6039760. 2000.03.21.Eisenberg M. Composite living skin equivalent. US patent 6039760.2000.03.21.
Grinnell F. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. 1992. J. Cell Sci. 101: 1-5.Grinnell F. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. 1992. J. Cell Sci. 101: 1-5.
Grinnell F., Zhu M., Carlson M.A., Abrans J.M. Release of mechanical tension triggers apoptosis of human fibroblast in a model of regressing granulation tissue. 1999. Exp. Cell Res. 248: 608-619.Grinnell F., Zhu M., Carlson M.A., Abrans J.M. Release of mechanical tension triggers apoptosis of human fibroblast in a model of regressing granulation tissue. 1999. Exp. Cell Res. 248: 608-619.
Jones PR, Harper S, Watt FM. Stem cell patterning and fate in human epidermis. 1995. Cell. 80: 83-93.Jones PR, Harper S, Watt FM. Stem cell patterning and fate in human epidermis. 1995. Cell. 80: 83-93.
Noll M., Grave T. Three-dimentional skin model. Патент US 2004018149. 2004.01.29.Noll M., Grave T. Three-dimentional skin model. U.S. Patent 2004018149. 2004.01.29.
Michel M., Torok N., Godbout MJ., Lussier M., Gaudreau P., Royal A., Germain L. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites and their number varies with donor age and culture stage. 1996. J. Cell Sci. 109: 1017-1028.Michel M., Torok N., Godbout MJ., Lussier M., Gaudreau P., Royal A., Germain L. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites and their number varies with donor age and culture stage. 1996. J. Cell Sci. 109: 1017-1028.
Pellegrini G., Dellambra E., Golisano О., Martinelli E., Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., Mckeon F., de Luca M. p63 identifies keratinocytes stem cells. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 3156-3161.Pellegrini G., Dellambra E., Golisano O., Martinelli E., Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., Mckeon F., de Luca M. p63 identifies keratinocytes stem cells. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 3156-3161.
Phillips T.J., Manzoor J., Rojas A., Isaacs C., Carson P., Sabolinski M., Young J., Falanga V. The longevity of bilayered skin substitute after application to venous ulcers. 2002. Arch.Dermatol. 138: 1079-1081.Phillips T.J., Manzoor J., Rojas A., Isaacs C., Carson P., Sabolinski M., Young J., Falanga V. The longevity of bilayered skin substitute after application to venous ulcers. 2002. Arch. Dermatol. 138: 1079-1081.
Potten CS, Morris RJ. Epithelial stem cells in vivo. 1988. J.Cell Sci. 10 (suppl): 45-62.Potten CS, Morris RJ. Epithelial stem cells in vivo. 1988. J. Cell Sci. 10 (suppl): 45-62.
Rheinwald J.G,. Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. 1975. Cell. 6: 331-344.Rheinwald J.G. Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. 1975. Cell. 6: 331-344.
Rubin J.S., Bottaro D.P., Chedid M., Miki Т., Ron D., Cheon G., Taylor WG., Fortney E., Sakata H., Finch P.W. Keratinocyte growth factor. 1995. Cell Biol. Int. 19 (5): 399-411.Rubin J.S., Bottaro D.P., Chedid M., Miki T., Ron D., Cheon G., Taylor WG., Fortney E., Sakata H., Finch P.W. Keratinocyte growth factor. 1995. Cell Biol. Int. 19 (5): 399-411.
Stoker M., Gherarti E., Rennyman M., Gray J. Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell motility. 1987. Nature. 327: 239-242.Stoker M., Gherarti E., Rennyman M., Gray J. Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell motility. 1987. Nature. 327: 239-242.
Zhao Y.B., Zhao X.F., Li A. Clinical observation and methods for identifying the existence of cultured epidermal allografts. 1992. Burns. 18: 4-8.Zhao Y.B., Zhao X.F., Li A. Clinical observation and methods for identifying the existence of cultured epidermal allografts. 1992. Burns. 18: 4-8.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006110711/15A RU2342164C2 (en) | 2006-04-03 | 2006-04-03 | Skin equivalent and method for its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006110711/15A RU2342164C2 (en) | 2006-04-03 | 2006-04-03 | Skin equivalent and method for its production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006110711A RU2006110711A (en) | 2007-10-10 |
| RU2342164C2 true RU2342164C2 (en) | 2008-12-27 |
Family
ID=38952613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006110711/15A RU2342164C2 (en) | 2006-04-03 | 2006-04-03 | Skin equivalent and method for its production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2342164C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010112678A1 (en) * | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Helsingin Yliopisto | Regenerative matrix comprising cells activated by nemosis and/or factors released from such cells |
| RU2530614C2 (en) * | 2012-05-04 | 2014-10-10 | Владимир Петрович Швецов | Biologically active complex for organogenesis and product of secretion of cells contained therein |
| US10273549B2 (en) | 2016-04-21 | 2019-04-30 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| RU233009U1 (en) * | 2024-07-02 | 2025-04-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН (ФГБУН ИБР РАН) | Combined biological equivalent of skin |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2135191C1 (en) * | 1990-04-24 | 1999-08-27 | Ортек Интернэшнл, Инк. | Composition equivalent of living skin, method of its preparing, test-set |
| US20040018149A1 (en) * | 2000-05-31 | 2004-01-29 | Michael Noll | Three-dimensional skin model |
| UA68906A (en) * | 2003-11-17 | 2004-08-16 | V K Husak Inst Of Urgent And R | Method for preparing equivalent of skin consisting in culturing viable keratinocytes in vitro onto collagenous gel substrate |
| RU2252787C1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-05-27 | ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ | Method for obtaining artificial skin matrix |
| RU2004131657A (en) * | 2002-03-28 | 2005-09-20 | Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх (De) | DEDIFFERENTED PROGRAMMABLE STEM CELLS OF MONOCITRAL ORIGIN AND THEIR PRODUCTION AND APPLICATION |
-
2006
- 2006-04-03 RU RU2006110711/15A patent/RU2342164C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2135191C1 (en) * | 1990-04-24 | 1999-08-27 | Ортек Интернэшнл, Инк. | Composition equivalent of living skin, method of its preparing, test-set |
| US20040018149A1 (en) * | 2000-05-31 | 2004-01-29 | Michael Noll | Three-dimensional skin model |
| RU2004131657A (en) * | 2002-03-28 | 2005-09-20 | Бластикон Биотехнологише Форшунг Гмбх (De) | DEDIFFERENTED PROGRAMMABLE STEM CELLS OF MONOCITRAL ORIGIN AND THEIR PRODUCTION AND APPLICATION |
| UA68906A (en) * | 2003-11-17 | 2004-08-16 | V K Husak Inst Of Urgent And R | Method for preparing equivalent of skin consisting in culturing viable keratinocytes in vitro onto collagenous gel substrate |
| RU2252787C1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-05-27 | ГОУ ВПО "Красноярская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ | Method for obtaining artificial skin matrix |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DAI N.T. et al. A co-cultured skin model based on cell support membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329(3), p.905-8, PMID: 15752741, реф., [он-лайн], [найдено 29.10.2007], найдено из базы данных PubMed. SAHOTA P.S. et al. Development of a reconstructed human skin model for angiogenesis. Wound Repair Regen. 2003, 11(4), p.275-84, PMID: 12846915, реф., [он-лайн], [найдено 29.10.2007], найдено из базы данных PubMed. * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010112678A1 (en) * | 2009-04-01 | 2010-10-07 | Helsingin Yliopisto | Regenerative matrix comprising cells activated by nemosis and/or factors released from such cells |
| RU2530614C2 (en) * | 2012-05-04 | 2014-10-10 | Владимир Петрович Швецов | Biologically active complex for organogenesis and product of secretion of cells contained therein |
| US10273549B2 (en) | 2016-04-21 | 2019-04-30 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US10711136B2 (en) | 2016-04-21 | 2020-07-14 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11091639B2 (en) | 2016-04-21 | 2021-08-17 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11377559B2 (en) | 2016-04-21 | 2022-07-05 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11591471B2 (en) | 2016-04-21 | 2023-02-28 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| US11999853B2 (en) | 2016-04-21 | 2024-06-04 | Vitrolabs Inc | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
| RU233009U1 (en) * | 2024-07-02 | 2025-04-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН (ФГБУН ИБР РАН) | Combined biological equivalent of skin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006110711A (en) | 2007-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mazlyzam et al. | Reconstruction of living bilayer human skin equivalent utilizing human fibrin as a scaffold | |
| US6916655B2 (en) | Cultured skin and method of manufacturing the same | |
| KR100907248B1 (en) | Volume replacement method of body by transplantation of differentiated young fat cells and biodegradable polymer | |
| US5968546A (en) | Keratinocyte culture from precursor cells | |
| ES2249928T3 (en) | MANIPULATED FABRIC CONSTRUCTS THROUGH BIOINGENIERIA AND METHODS TO PRODUCE AND USE THEM. | |
| RU2135191C1 (en) | Composition equivalent of living skin, method of its preparing, test-set | |
| AU2009228756B2 (en) | Methods for producing hair microfollicles and de novo papillae and their use for in vitro tests and in vivo implantations | |
| Kinikoglu et al. | Reconstruction of a full-thickness collagen-based human oral mucosal equivalent | |
| US9592257B2 (en) | Complete human skin organ generated from culture-expanded cells | |
| Boyce et al. | Reconstructed skin from cultured human keratinocytes and fibroblasts on a collagen-glycosaminoglycan biopolymer substrate | |
| Liu et al. | Reconstruction of a tissue‐engineered skin containing melanocytes | |
| Zhang et al. | Tissue-engineered skin regenerative units for epidermal keratinocytes expansion and wound healing | |
| KR20010072553A (en) | A Living Chimeric Skin Replacement | |
| Heng et al. | Directing stem cells into the keratinocyte lineage in vitro | |
| RU2342164C2 (en) | Skin equivalent and method for its production | |
| JP2016516394A (en) | Use of functional melanocytes easily differentiated from Muse cells, characteristic stem cells in human fibroblasts | |
| JP4859671B2 (en) | Preparation of surrogate connective tissue occupied by fibroblasts | |
| Harriger et al. | Cornification and basement membrane formation in a bilayered human skin equivalent maintained at an air-liquid interface | |
| KR100818636B1 (en) | Artificial skin containing mesenchymal stem cells and method of manufacturing the same | |
| KR100247892B1 (en) | Artificial epitheliam reconstrucred by raft culture and basement membrane component and method for reconstructing thereof | |
| Boschi et al. | Cutaneous tissue engineering and lower extremity wounds (part 1) | |
| JP2004121419A (en) | Cultured skin containing umbilical cord epitheliocyte | |
| KR20160022470A (en) | Skin equivalent comprising avian collagen and the method preparing the same | |
| CN111840656A (en) | A kind of early tissue engineering skin for wound treatment and preparation method thereof | |
| JP4313069B2 (en) | Animal cell culture medium and animal cell culture method using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120404 |