RU2294099C2 - Способ продуцирования гамет у птиц - Google Patents
Способ продуцирования гамет у птиц Download PDFInfo
- Publication number
- RU2294099C2 RU2294099C2 RU2002128348/13A RU2002128348A RU2294099C2 RU 2294099 C2 RU2294099 C2 RU 2294099C2 RU 2002128348/13 A RU2002128348/13 A RU 2002128348/13A RU 2002128348 A RU2002128348 A RU 2002128348A RU 2294099 C2 RU2294099 C2 RU 2294099C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- recipient
- cells
- turkey
- species
- embryonic
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 56
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 44
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims description 33
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 11
- 230000012447 hatching Effects 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 claims description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 41
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 27
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 abstract 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 54
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 39
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 26
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 9
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 8
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 4
- 244000144980 herd Species 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000288147 Meleagris gallopavo Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 210000000542 dorsal mesentery Anatomy 0.000 description 3
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100453673 Rattus norvegicus Kdm3a gene Proteins 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002783 mesonephros Anatomy 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/02—Breeding vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K45/00—Other aviculture appliances, e.g. devices for determining whether a bird is about to lay
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K45/00—Other aviculture appliances, e.g. devices for determining whether a bird is about to lay
- A01K45/007—Injecting or otherwise treating hatching eggs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Birds (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ производства и сбора гамет птиц. Способ предусматривает получение эмбриональных стволовых клеток от птиц видов-доноров и их введение виду-реципиенту птицы in ovo. При этом. вид-реципиент птиц отличается от вида-донора. Далее инкубируют вид-реципиент до вылупления, выращивают до половой зрелости и проводят сбор гамет вида-донора у вида-реципиента. Способ позволяет ускорить получение сперматозоидов у медленно взрослеющих птиц и уменьшить затраты на поддержание стад производителей. Изобретение может быть использовано в птицеводстве. 10 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение касается способов переноса эмбриональных стволовых клеток птицам для продуцирования у них гамет. Подобные способы применимы для охраны вымирающих видов птиц, для сокращения времени, необходимого для получения сперматозоидов от медленно взрослеющих птиц, таких, как индейки, уменьшения затрат на поддержание стад производителей и изменения соотношения полов в стадах потомков (т.е. увеличения эффективности производства).
Предпосылки данного изобретения
Возможность более легкого получения гамет определенных видов птиц была бы исключительно полезна для ветеринарии птиц и в птицеводческих хозяйствах. Для вымирающих видов, таких, как американский журавль, будет крайне полезно иметь готовый запас мужских сперматозоидов. Для коммерческой птицы, такой, как индейка, было бы желательно более быстрое и экономичное получение мужских сперматозоидов. Для производства мяса желательно иметь способы изменения соотношения полов птиц в стаде. Таким образом, есть необходимость в новых способах получения сперматозоидов птиц.
Химерами называют организмы, состоящие из клеток, полученных более из чем одной зиготы. Экспериментальные химеры были использованы для изучения взаимодействия между клетками и анализа потомков клеток в процессе развития (А.McLaren, Mammalian Chimeras. Cambridge University Press, Cambridge (1976)). Когда химеры получают, используя материал, полученный от очень ранних эмбрионов, развиваются организмы, содержащие полную смесь соматических тканей. Если начальный материал включает клетки раннего зародыша или их предшественники, полученные в результате этого особи будут производить гаметы с генотипами как донора, так и реципиента. К тому же химеры могут быть внутривидовыми, т.е. между зиготами того же вида, или межвидовыми, т.е. между двумя разными видами.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) птиц, как и клетки зародыша других позвоночных, являются внегонадными по происхождению и должны претерпеть сложное путешествие для того, чтобы достичь гонады. Перенос бластодермальных клеток и эмбриональных стволовых клеток образовывал зародышевые химеры птиц.
Reynaud (J. Embryol. Exp. Morphol. 21:485-507 (1969)), пионер в получении зародышевых химер птиц, сообщал о получении зародышевых химер индейка-курица посредством внутрисосудистого переноса разделенных клеток серповидного тела зародыша в предварительно стерилизованный эмбрион цыпленка (выполнено посредством воздействия на серповидное тело реципиента ультрафиолетом). ЭСК, полученные механическим разъединением эндодермы серповидного тела зародыша (стадия 5), были инъекцированы в кровеносные сосуды эмбриона цыпленка (3-5 дней инкубации). Перед инъекцией эмбрионы реципиента были стерилизованы на стадии 8-10 (Н&Н) ультрафиолетовым излучением; однако стерилизация не была завершена. ЭСК индейки в эмбрионе цыпленка определяли исключительно на основе соотношения их нуклеоплазмы. Такой способ идентификации был сложным и тонким и не мог быть использован для активно делящихся ЭСК индейки, так как делящиеся эмбриональные клетки давали аберрантное нуклеоплазматическое соотношение. В последующих исследованиях перенесенным ЭСК позволяли созревать в гонадах хозяина, и очевидно, они могли дать начало гаметам, но они были неприменимы для оплодотворения (Wilhelm Roux Arch. Dev. Bio. 179:85-110(1976)). Эти сперматозоиды были неспособны оплодотворять индюшачьи яйца. Они оплодотворяли куриные яйца, но нормального развития не происходило. Куриные сперматозоиды были способны активировать яйца, полученные от самок межвидовых химер, но они не вызывали развитие эмбриона. Когда яйца оплодотворяли сперматозоидами индюка, они развивались в ненормальные эмбрионы, которые не жили дольше стадии 38 (Н&Н). Reynaud использовал морфологию как единственную отличительную характеристику в попытке различить зародышевые клетки индюка от эмбриональных клеток цыпленка. Одна только морфология недостаточна для определения химер и должна быть дополнена другими маркерами. Кроме этого, согласно Aig-Gill и Simkiss (Brit. Poul. Sci. 32:427-438 (1991)), присутствие гамет индюка не было показано в пробных спариваниях. Таким образом, осталась потребность в новых способах получения и переноса гамет птиц.
Сущность изобретения
Способ производства и сбора спермы птиц включает стадии: получения эмбриональных стволовых клеток от птиц вида-донора; введения эмбриональных стволовых клеток птицам вида-реципиента in ovo; инкубирования птицы вида-реципиента до вылупления; и затем сбора спермы вида донора от вида реципиента. Например, видом-донором может быть американский журавль, а реципиентом может быть канадский журавль. В другом примере видом донором может быть индюк, а видом-реципиентом может быть курица.
У птиц, в отличии от млекопитающих, самец является гомогаметным полом (ZZ) а самка является гетерогаметным полом (Zw). Поэтому у птиц самка определяет пол потомства, поскольку она продуцирует яйца, несущие Z или w хромосомы. Таким образом, как показано ниже, при переносе эмбриональных стволовых клеток самца эмбриону-хозяину самки, процент продуцируемых этим хозяином яиц, несущих Z-хромосому, увеличивается, как увеличивается и процент потомков-самцов. Увеличение процента потомков мужского пола в стадах бройлеров является экономически желательным благодаря соответствующему увеличению соотношения конверсии пищи и большей эффективности продукции мяса, достигаемой таким образом.
Таким образом, вторым аспектом настоящего изобретения является способ увеличения числа птиц-самцов, выведенных из массы яиц, включающий стадии: введения самке птицы in ovo эмбриональных стволовых клеток самца (ZZ); инкубирования самки-птицы до вылупления; выращивание самки-птицы до половой зрелости; и затем размножение для получения массы фертильных птичьих яиц (с соотношением самцы/самки в яйцах, полученных от этой птицы, большим, чем в случае, когда эмбриональные стволовые клетки самца не вводили самке птицы in ovo). В типичном случае далее этот способ включает стадию инкубирования массы птичьих яиц до вылупления (с соотношением самцы/самки, полученных во всей массе яиц, большим, чем в случае, когда эмбриональные стволовые клетки самца не вводили самке птицы in ovo). Самка птицы может быть любого подходящего вида, такого, как курица или индейка, и вводимые эмбриональные стволовые клетки предпочтительно от того же вида, что и самка, которой их вводят.
Вышеупомянутые и другие объекты и аспекты настоящего изобретения детально объясняются в описании, приведенном ниже.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления данного изобретения
Термины "птица" или "вид птиц" использованы здесь в отношении к любому виду птиц, включая курицу, индейку, утку, гусей, перепела, фазана, страуса, но не ограничиваются ими. Любой из многочисленных других видов птиц может быть использован для осуществления настоящего изобретения, в частности, когда оно используется для охраны вымирающих видов, таких, как американский журавль (где видом-реципиентом был бы канадский журавль).
Термин "яйцо" используется по отношению к птичьим яйцам, содержащим живые эмбрионы птиц.
Термин "эмбриональные стволовые клетки" или "ЭСК", используется по отношению к наиболее дифференцированной диплоидной линии клеток эмбриона, которые, в конечном итоге, разовьются в гаплоидные гаметы (как сперму, так и яйцеклетки).
Термин "антитело SSEA-1" относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфически связано со стадиоспецифическим эмбриональным антигеном-1 (SSEA-1; (M.Buehr Exp. Cell. Res. 232:194-207 (1997)). SSEA-1 является углеводным эпитопом, детерминированным связью галактоза β1→4 фруктоза α1→3N ацетилглюкозакин (Н.Gooi et al.., Nature 292, 156-158 (1981)). Моноклональное антитело на SSEA-1 развивали посредством слияния клеток миеломы мыши с клетками селезенки мыши, которая была иммунизирована клетками тератокарциномы F9 (D.Solter and B.Knowles, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 75, 5565-5569 (1978)). Антитело SSEA-1 известно как иммуногистохимический маркер зародышевых клеток птиц (L.Karagenc et al., Dev. Genet. 19, 290-301 (1996)). В частности, предпочтителен клон МС 480, который может быть получен в Developmental Studies Hybridoma Bank, университет Айова, город Айова, Айова, США.
Эмбриональные стволовые клетки можно получать и рецептуировать для проведения настоящего изобретения по любой подходящей способике, сохранять, замораживать, культурировать и тому подобное перед использованием, если необходимо. Например, эмбриональные стволовые клетки можно отбирать у эмбринонов-доноров на соответствующей эмбриональной стадии (см., например (V.Hamburger and H.L.Hamilton, A series of Normal Stages in. the Development of the Chick, Journal of Morphology, 68, 49-42 (1951) (Эти стадии относятся к Н&Н стадиям в нем) стадии 4 или эмбриональной стадии серповидного тела, до стадии 30, с клетками отобранными из крови или гонад на более поздних стадиях). Эмбриональные стволовые клетки, в большинстве случаев, по размеру вдвое больше соматических клеток и их легко отличить и отделить на основе размера. Мужские (или гомогаметные) эмбриональные стволовые клетки (ZZ) можно отличить от гетерогаметных эмбриональных стволовых клеток (Zw) любым подходящим способом, таким, как сбор эмбриональных клеток от конкретного донора и типизация других клеток от этого донора, собранных клеток того же хромосомного типа, как типизированных клеток. Клетки могут быть приготовлены для введения животным посредством разделения клеток (т.е. механического разделения) и тонкого примешивания клеток к фармацевтически приемлемому носителю (например, фосфатный буфер, солевой раствор). Эмбриональные стволовые клетки -преимущественно эмбриональные стволовые клетки гонад или эмбриональные стволовые клетки крови ("гонад" или "крови" по отношению к их ткани или происхождению в исходном эмбриональном доноре), наиболее предпочтительно эмбриональные стволовые клетки гонад. Вводимые эмбриональные стволовые клетки могут быть гетерогаметными (Zw) или гомогаметными (ZZ) в зависимости от конкретного объекта введения. ЭСК предпочтительно вводить в физиологически приемлемом носителе, предпочтительно при рН от примерно от 6 до 8 или 8,5; в подходящем количестве для достижения желаемого эффекта (например от 100 до 1000 ЭСК на эмбрион). ЭСК можно вводить без других ингредиентов или клеток, или другие клетки или ингредиенты могут вводиться вместе с ЭСК.
Введение эмбриональных стволовых клеток животному-реципиенту in ovo может проводиться в любое подходящее время, когда ЭСК все еще могут мигрировать в развивающиеся гонады. В целом предпочтительно, чтобы введение осуществлялось со стадии 13 или 14 до стадии 18 (Н&Н) развития эмбриона, и наиболее предпочтительно на стадии 15. Для цыпленка, таким образом, временем введения являются дни 1, 2, 3 или 4 эмбрионального развития, наиболее предпочтительно дни от 2 до 2,5. Обычно введение осуществляют посредством инъекции в какую-либо целевую область, такую, как область, определенную амнионом (включая эмбрион), желточный мешок и т.п. Инъекция непосредственно в эмбрион (включая стенку тела эмбриона) предпочтительна, внутрисосудистая или внутрицеломическая инъекция в эмбрион особенно предпочтительна. Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены с или без предварительной стерилизации птицы-реципиента in ovo. ("стерилизация" значит приведение к состоянию, при котором продукция гамет практически невозможна). При предпочтительном варианте осуществления данного изобретения эмбриональные стволовые клетки вводят реципиенту in ovo, без предварительной стерилизации. Когда гаметы донора собирают от такого реципиента, их можно собирать в смеси с гаметами донора и использовать в виде подобной смеси или смеси, обработанной для увеличения в ней доли гамет донора.
Введение ЭСК можно производить посредством введения ЭСК как таковых или посредством введения клеток-предшественниц, которые развиваются в ЭСК уже в субъекте (в особенности, когда изобретение применяется для того, чтобы изменить соотношение полов в потомстве). Например, введение может производиться посредством инъекции птице бластодермальных клеток, когда бластодермальные клетки дифференцируются в эмбриональные стволовые клетки в птице in vivo.
Когда эмбриональные стволовые клетки используют для получения и сбора гамет птиц (сперму, яйцеклетки), эмбриональные стволовые клетки вводят in ovo виду-реципиенту, отличному от вида-донора, от которого были получены ЭСК. Реципиента затем инкубируют до вылупления и выращивают до половой зрелости, и собирают сперматозоиды или яйцеклетки вида донора, все в соответствии со стандартными способиками. Например, в случае вымирающих видов, видом-донором может быть американский журавль, а видом-реципиентом может быть канадский журавль. В другом примере, касающемся коммерческого производства птицы, видом-донором может быть индейка, а видом реципиентом может быть курица.
При использовании для увеличения числа или соотношения птиц-самцов, выводящихся из группы яиц, данное изобретение включает введение самке птицы in ovo эмбриональных стволовых клеток самца. Пол птицы in ovo может быть определен предварительно или определен после вылупления. Птицу затем инкубируют до вылупления, при необходимости определяют пол птицы, выращивают до половой зрелости и размножают, скрещивая с подходящим самцом-производителем в соответствии с известными способиками. Всю массу фертильных яиц, отложенных этой птицей, затем собирают и обычным способом инкубируют до вылупления, и получившихся птиц выращивают в течение, как минимум, двух или трех недель. Соотношение самцов к самкам у яиц (или птиц) произведенных данной самки больше, чем полученное в отсутствии введения эмбриональных стволовых клеток самца этой самке in ovo. Подобные способы обычно используют для видов птиц, которые выращивают для производства мяса, таких, как куры, индейки, утки и т.п.
Введение эмбриональных стволовых клеток in ovo может осуществляться по любой подходящей методике как вручную, так и автоматическим способом. Предпочтительна инъекция. Механизм введения in ovo не является критичным, но предпочтительно, чтобы способ не повреждал чрезмерно ткани и органы эмбриона или экстраэмбриональные оболочки, окружающие его, так, чтобы данная обработка не уменьшала чрезмерно количество вылупившихся птенцов. Шприц для подкожных инъекций, подходящий для игл примерно от номера 18 до номера 26 удобен для этой цели. В зависимости от точной стадии развития и положения эмбриона, игла длинной в один дюйм может достать как жидкость над птенцом, так и самого птенца. Предварительное отверстие может быть пробито или просверлено в скорлупе до введения иглы, чтобы предотвратить повреждение или затупление иглы. Если нужно, яйцо можно запечатать материалом, в значительной степени непроницаемым для бактерий, таким, как воск или подобным, чтобы предотвратить последующее проникновение нежелательных бактерий. Представляется, что высокоскоростная инъекционная система для эмбрионов птиц будет особенно удобна для применения настоящего изобретения. Многочисленные устройства подобного рода доступны, образцом может служить система EMBREX INVOJECT™ (описанная в патентах США №№4681063 и 4903625 Hebrank) и патентах США №№4040388, 4469047 и 4593646 Miller. Открытия всех патентов США цитированных здесь, включено сюда во всей полноте посредством ссылки. Все подобные устройства, будучи адаптированными для практики по настоящему изобретению, включают инъектор, содержащий эмбриональные стволовые клетки, рецептуированные, как здесь обсуждалось, при этом инъектор, расположенный так, чтобы делать инъекции в яйцо, перемещаемое аппаратом с соответствующим положением яйца, как обсуждалось выше. Кроме того, инъецирующее устройство может быть снабжено запечатывающим устройством, чтобы запечатывать отверстия в яйце после инъекции.
Настоящее изобретение описано более подробно в последующих не исчерпывающих Примерах.
Примеры 1-8
Материал и способы.
ПРИМЕР 1
Выделение и верификация плазмиды.
Трансформированные DH5 альфа-клетки, полученные др. М.Мацке, были нанесены на лабораторные чашки, содержащие антибиотики ампициллин (20 мкг/л) + метициллин (80 мкг/л) и оставлены расти на ночь при 37°С. Шесть индивидуальных колоний были отобраны и выращивались в течение ночи в 10 мл лабораторных чашках, содержащих вышеуказанные антибиотики. Плазмидную ДНК изолировали из 6 разных колоний, используя подготовительный мини-протокол Qiagen. Для того чтобы проверить идентичность этой плазмиды, нерасщепленные плазмиды, линеаризованная плазмида (EcoR 1) и результат двойного расщепления (EcoR I + Hind III), были отделены на 2% агарозном геле. Две из шести колоний, содержащие вставку, были впоследствии использованы для крупномасштабной изоляции плазмиды (Qiagen). Непереваренная родительская плазмида (рuс18), нерасщепленные рекомбинантные плазмиды, линеаризованная плаэмида (EcoR I/ Hind III/ BamH I) и дважды переваренная плазмида (EcoR I + Hind III и EcoR I + BamH I) были отделены на 2% геле для подтверждения идентичности изолированных плазмид.
ПРИМЕР 2.
Мечение образца ТМ1 с помощью ПЦР.
Была синтезирована пара праймеров на основе их способности амплифицировать вставку в мультиклонируюцийся сайт родительской плазмиды рис 18. Они представляли собой М13 puc - обратный = 5' ААЦ АГЦ ТАТ ГАЦ UAT и М13 puc - прямой - 5' ГТА ААА ЦГА ЦГГ ЦЦА ГТ. Оптимизированная ПЦР смесь состояла из 3 мМ MgCl2 в Taq буфере (Idaho Tech); 0,5 мкМ каждого праймера, 50 нг ДНК (ТМ1) кольцевой денатурированной плазмиды, 5 единиц Taq полимеразы (Promega), 10 мкл ПЦР метящей (dig-labeling) смеси (Boehringer, Mannheim). Объем реакционной смеси доводится до 100 мкл стерильной водой, подготовка ПЦР состоит из начальной денатурации при 96°С в течение 5 минут, с последующими 30 циклами, состоящими из денатурации (94°С) в течение 45 секунд, восстановления (50°С) в течение 55 секунд, и последующего удлинения при 72°С в течение 60 секунд. ПЦР проводили в "Mini Cycler", модель РТС 150 (MJ Research Inc., Massachusetts). После амплификации весь образец был подвергнут электрофорезу в 2% геле. Меченую вставку элюировали из геля, используя Qia набор быстрей экстракции геля (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя. Образец сохраняли при -20°С и использовали для in situ дот-блот гибридизации. Перед хранением оценивали количество полученной DIG-меченной ДНК в соответствии с системным руководством Genius для гибридизации на фильтре (Boehringer, Mannheim).
ПРИМЕР 3
Дот-блот гибридизация
Для проверки точности, чувствительности и специфичности-вставки ТМ1 серийное разведение ДНК самца и самки индейки (0-50 нг), ДНК самца и самки курицы (0-2 мкг) и родительской плазмиды, содержащей вставку ТМ1 (10 нг - 1 пг) денатурировали и наносили на нитроцеллюлозную бумагу. Пятно нагревали при 80°С в течение часа и затем использовали для гибридизации. Предварительную гибридизацию и гибридизацию проводили с использованием процедуры Энглера-Блюма [Anal Biochem. 210:235-244 (1993)). Гибридизацию проводили в течение ночи при 68°С; использовали пробу с концентрацией 2,2 нг цДНК в пробе на мл.
После гибридизации и тщательной отмывки пятно помещали в промывочный буфер (0,1 М малеиновой кислоты; 0,15 М NaCl pH 7,5). Мембрану инкубировали в блокирующем растворе (промывочный буфер + 3% Tween 20) в течение 30 минут и затем помещали в блокирующий раствор, содержащий коньюгат антидигоксигенин алкалинфосфатазы на полчаса. Мембрану затем дважды промывали в промывочном буфере и затем инкубировали в индикаторном растворе (0,1 М Tris HCl; 0,1 М NaCl; 50 мМ MgCl2; pH 9,5). В финале гибриды регистрировали, используя хемолюминесцентный субстрат COP-STAR™ (из Boehringer-Mannheim, Германия). Пятна подвергали воздействию рентгеновской пленки в течение не менее 5 минут.
ПРИМЕР 4
Получение межвидовых индейка-курица эмбриональных зародышевых химер.
Оплодотворенные яйца индейки инкубировали при 38,5°С в течение 8-8,5 дней (стадия 27-28 Н&Н). Эмбрионы препарировали для получения гонад. Гонады собирали в DMEM и 10% FBS и диспергировали, пропуская их через иглу №30. Клетки культурировали в DMEM 10% FBS до соединения (3-5 [d] дней?). Стромальные клетки диспергировались и образовывали слитный слой, в то время как эмбриональные клетки свободно прикреплялись к стромальным клеткам. Эмбриональные клетки осторожно собирали пипеткой и подсчитывали. Приблизительно 150-300 клеток в 2-5 мкл среды вводили в синус терминалис 60 или 72-часовых эмбрионов курицы. Затем эмбрионы инкубировали в 100 мм чашках Петри или в их собственной скорлупе при 38,5°С в течение 2-5 дней. После инкубации ДНК выделяли из эмбриона (n=18) и использовали для дот-блот анализа с dig-меченным образцом ТМ1.
Пример 5
Гибридизация in situ.
Гибридизацию in situ проводкой на парафиновых срезах и криосрезах. Эта процедура основана на протоколе Ролигхеда и Линдберга (см. J. Rolighead, Direction of HPV II DNA in paraffin embedded laryngeal tissue with DIG-labeled DNA probe. Ir. Non-radioactive In Situ Hybridization Application Manual Boenringer Mannheim Second Edition, pp 122-125 (1996)) с некоторыми модификациями.
Изготовление парафиновых срезов: Гонады извлекают из эмбрионов индейки (9-й день) и эмбрионов курицы на соответствующих стадиях, фиксируют в течение ночи в 4% формальдегиде при 4°C. Гонады промывают в PBS три раза, всего 90 минут. Затем их обезвоживают, заливают в парафин и делают срезы (10 мкм). Срезы размещают на стеклах Probe-On Plustm (Fisher Scientific). Срезы нагревают при 60°С в течение 30 минут, удаляют парафин в ксилоле и регидратируют в градиенте этанола 99% - вода. Срезы обрабатывают протеиназой К (50 мкг/мл и 100 мкг/мл) в TES (50 мМ Tris HCl рН 7,4; 10 мМ EDTA и 10 мМ NaCl) в течение от 12 до 25 минут при 37°С и при комнатной температуре.
Изготовление криосрезов: Область туловища 8,5 дневного эмбриона индейки фиксируют в течение ночи при 4°С в 4% растворе формальдегида в PBS. Были протестированы различные концентрации протеиназы К в TES от 0 до 45 мкг/мл в течение 10, 15 и 20 минут при 37°С. Оптимальными условиями для протеолитической обработкой эмбриональных тканей оказалось: 1,25 мкг/мл при 37°С в течение 15 минут.
Приготовление коктейля пробы и слепого [контрольного] коктейля: Коктейль пробы состоял из 10 мкл 50 × раствора Дендхарта, 50 мкл декстран сульфата (50%), 10 мкл ДНК спермы лосося (9,4 мг/мл), 100 мкл 2С XSSC, 500 нг ТМ1 образца, меченного дигоксигенином, и доведен дистиллированной водой до конечного объема 250 мкл. В конце в коктейль было добавлено 250 мкл формамида. Слепой коктейль содержал все вышеуказанные компоненты, за исключением меченной ТМ1 пробы. Коктейль был смешан посредством турбулизации [vortexing] и сохранялся при -20°С.
Гибридизация: После протеолитического расщепления как парафиновые, так и криосрезы фиксировали в 0,4% параформальдегиде в течение 5 минут при 4°С. Затем срезы промывали в дистиллированной воде (5 минут) и высушивали на воздухе. Затем 10 или 15 мкл коктейля пробы или слепого коктейля (негативный контроль) были добавлены в каждый срез. Перед денатурацией при 95°С в течение 6 минут срезы были накрыты покрытыми силиконом покровными стеклами. Слайды были затем помещены на минуту на лед и поставлены во влажную камеру на 16-20 часов при 42°С. Тщательная отмывка и регистрация гибрида были подобны тем, которые описаны у Ролигхеда и Линдберга (см. выше), кроме готового субстрата щелочной фосфатазы NBT/BCIP (Amresco), который использовали для регистрации гибридов. После регистрации препараты пыли окрашены водным эозином на несколько секунд и промыты. Образцы монтировали в водной среде, приготовленной из 10 г желатина, растворенного в 60 мл воды при 70-80°С, в которую добавлены 70 мл глицерина и 1 мл фенола.
Пример 6.
Получение межвидовых эмбриональных химер Курица - Индейка.
Эмбрионы кур породы Barred Rock инкубировали до стадии 23-25 (Н&Н). Генитальные гребни десяти эмбрионов вместе с некоторыми прилегающими тканями были помещены в DMEM с добавлением 10% FBS, глутамина, антибиотического и противогрибкового раствора. Их затем дважды отмыли в PBS и инкубировали в 0,02 EDTA при 37°С в течение пятнадцати минут. Добавляли свежую среду и гребни разделяли с помощью игл. Всю клеточную суспензию собирали в 15 мл пробирку и позволили комочкам оседать в течение пары минут. Суспензию клеток собирали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Среду удаляли и жизнеспособность клеток определяли, используя [trypan blue] исключение. Отбирали аликвоты клеточной суспензии и окрашивали при помощи антитела SSEA-1, чтобы определить число введенных эмбриональных клеток. Приблизительно 5 мкл суспензии клеток, содержащей 25-30 ЭСК (процентное содержание ЭСК в клеточной суспензии составляло приблизительно 3,2%; вводили в кровеносный сосуд каждого эмбриона индейки Николаса (n=10) на стадиях развития 13-14 (Н&Н). Эмбрионы инкубировали в стеклянных чашках, закрытых пластиковой пленкой при 37,5°С до стадий 21-25. Всю область туловища эмбрионов-реципиентов фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи, трижды промывали в РБЗ всего в течение 90 минут, помещали в желатин/сахарозу, замораживали и делали срезы. Так как ЭСК гонад индейки SSEA-1 негативны, а ЭСК гонад курицы SSEA-1 позитивны, антитело против SSEA-1 можно использовать для определения переноса донорских ЭСК курицы в эмбриональные зародышевые химеры.
ПРИМЕР 7. Получение межвидовых индейка-курица эмбриональных зародышевых химер.
Оплодотворенные яйца индейки инкубировали при 38,5°С в течение 8 8,5 дней (стадия 27-28 Н&H). Эмбрионы препарировали для получения гонад. Их помещали в PBS и инкубировали в 0,02% EDTA при 37°С в течение 20 минут. Добавляли свежую среду и гребни осторожно разделяли с помощью игл. Собирали всю суспензию клеток и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Среду удаляли и определяли жизнеспособность клеток. Всю суспензию клеток приготавливали при 37°С в DMEM + 10% FBS в течение 6-7 часов. После культурирования неприкрепленные клетки были осторожно собраны и центрифугированы. Затем 2-3 мкл клеточной суспензии, содержащей примерно 150 ЭСК, вводили в кровеносные сосуды эмбрионам кур на 14 стадии (Н&Н). Затем яйца-реципиенты запечатывали и инкубировали при 37,5°С. Эмбрионы реципиенты собирали на разных стадиях инкубации от стадии 19 до стадии 25. Эмбрионы промывали в PBS дважды; общее время варьировало в зависимости от толщины эмбриона. Эмбрионов опускали в 50% этанол и помещали в парафин. Со срезов удаляли парафин, регидратировали и промывали в PBS.
Контролем для способики двойного окрашивания (см. ниже) являлись поперечные срезы двух эмбрионов курицы стадии 26 и двух эмбрионов индейки стадии 24. Сорок два среза генитальной области цыпленка и все серийные срезы генитальной области индейки были окрашены.
Всего из 8 куриных эмбрионов-реципиентов были сделаны серии срезов. Пять из восьми эмбрионов были зафиксированы на стадиях 19 и 20. Два эмбриона были зафиксированы на стадии 22 и 23. Последний эмбрион был зафиксирован на стадии 25. Большинство срезов стадий 19 и 20 использовали для двойного окрашивания. Только каждый второй срез эмбрионов стадии 22, 23 и 25 использовали для двойного окрашивания.
Пример 8.
Двойное окрашивание антителом SSEA-1 и красителем PAS. Иммуногистохимические исследования проводили с использованием набора АВС-АР (Vector Laboratories, Burlingame, California). Срезы трижды промывали в PBS, всего в течение 30 минут. Затем их блокировали в 1,5% козьей сыворотке в PBS в течение 20 минут для уничтожения неспецифического связывания. Затем срезы инкубировали в течение часа с первичным моноклональным антителом на SSEA-1 (клон МС 480, полученный в Developmental Studies Hybridoma Bank, университет Айова, город Айова, Айова). После промывки в PBS срезы эмбрионов инкубировали с биотинилированным вторичным антителом (30 минут), затем промывали в PBS и инкубировали в реактиве Vectastain ABC-AP (30 минут). После финальной промывки в PBS они были окрашены в субстрате щелочной фосфатазы NBT/BCIP (Amresco, Солон, Огайо) в течение 20 минут.
Следуя процессу иммуногистохимического окрашивания, срезы промывали водопроводной водой и помещали в перйодную кислоту на 6 минут. Затем срезы промывали в воде в течение 10 минут и окрашивали реактивом Chiff в течение 15 минут. После промывки в водопроводной воде срезы монтировали в водной среде.
ПРИМЕРЫ 9-15
Результаты.
Мацке и др. (Chromosoma 102: 9-14 (1992)) охарактеризовал повторяющуюся последовательность ДНК, обогащенную на микрохромосомах индейки. Она образована повторяющимся элементом из 41 нуклеотидной пары, представленным в 5% генома (приблизительно 2,2×106 копий в диплоидном геноме клетки). Таким образом, данную видоспецифичную последовательность ДНК использовали в ДНК-ДНК гибридизации, чтобы проверить, можно ли использовать это для идентификации ДНК индейки в эмбрионах кур.
ПРИМЕР 9.
Выделение и верификация плазмиды.
Анализ гелевого электрофореза показал, что родительская плазмида puc 18 составляла 2,69 тпн, в то время, как линеаризованная рекомбинантная плазмида, полученная от др. Мацке, составляла примерно 2,8 тпн в длину. Двойное расщепление плазмидной ДНК из колоний №2 и 5 выделило вставку приблизительно в 0,15-0,17 тпн. Это подтвердило, что присланные нам трансформированные клетки DH5 содержали соответствующую рексмбинантную плазмиду. Плазмида содержала фрагмент ТМ1 (149 пн), состоящий из трех копий специфического для индейки повтора в 41 пн.
ПРИМЕР 10
ПЦР меченье образца ТМ1.
ПЦР амплификация циркулярной плазмидной ДНК с нуклеоткдами, меченными дигоксигенином, привело к получению амплифицирозанного продукта примерно 0,19-0,20 тпн. Увеличение в размерах продукта амплификации по сравнению со вставкой (0,15-0,17 тпн) произошло, вероятно, по причине включения множественных DIG-меченных нуклеотидов. ПЦР меченный образец использовали затем как для экспериментов по дот-блот гибридизации, так и для ДНК-ДКК In situ гибридизации.
ПРИМЕР 11
Дот-блот гибридизация.
Результаты дот-блот гибридизации (данные не показаны) показали одинаковую интенсивность связи пробы как с образцами ДНК индейки самца, так и самки. Этим подтверждается то, что данная проба не является специфической для пола. Гибридизацию делали на серийных разведениях ДНК индейки от 500 нг до 0 нг ДНК индейки. В образце зарегистрировано всего 0,30 нг ДНК индейки. Гибридизация с 0-2 мкг ДНК курицы, как самца, так и самки, подтвердило, что образец был видоспецифическим и не связывался с ДНК курицы. Различные концентрации ДНК индейки (10 нг - 0 нг) смешивали с 0-2 мкг ДНК курицы. Гибридизация в этой смеси ДНК показала, что только 1,25 нг ДНК индейки могло быть отмечено в 1 мкг ДНК курицы.
Пример 12
Получение межвидовых индейка-курица эмбриональных germline химер.
Межвидовые эмбриональные зародышевые химеры индейка-курица не были найдены при использовании вышеуказанного протокола дот-блот гибридизации. Причиной этого могло быть существование внутреннего биологического барьера, который мог бы предотвращать миграцию ЭСК гонад индейки в гонады курицы. Это могло быть также из-за технических проблем, т.е. процедура (дот-блот гибридизация) не была достаточно чувствительна для регистрации нескольких донорских эмбриональных клеток в гонадах цыпленка. Последняя причина выглядит более правдоподобной; исходя из этого была сделана попытка создать более чувствительную способику т.е. способику in situ гибридизации для локализации ЭСК донора в реципиенте.
ПРИМЕР 13
Анализ in situ гибридизации на срезах индейки.
Теоретически маркерная система in situ была бы подходящим маркером для идентификации клеток донора (индейки) в химере. Поскольку маркер находится внутри ядер, он универсален, не проникает в другие клетки и не воздействует на развитие эмбриона реципиента. В настоящем исследовании последовательность ТМ1 избирательно связывалась с ДНК в ядрах клеток индейки (данные не показаны). Никаких позитивных сигналов не было отмечено в клетках курицы (данные не показаны) или срезах, инкубированных со слепым коктейлем (данные не показаны), что указывает на то, что образец был видоспецифичным, без неспецифических сигналов. В идеале, в положительном контроле на срезах эмбрионов индейки все ядра должны были бы окраситься положительно. Однако только небольшой процент клеток окрасился положительно (данные не показаны). Кроме того, была разница в интенсивности сигнала между разными популяциями клеток на одном и том же срезе, при одинаковых условиях ферментативной обработки. Этим показано, что данная способика может давать ложные отрицательные результаты. Уменьшения процента ложных негативных результатов можно достичь, ослабив строгость условий. Однако это может также приводить к увеличению ложных позитивных результатов. В эмбриональных зародышевых химерах клетки донора составляли бы очень маленький процент от всего эмбрионального среза или клеток. К тому же, данная маркерная система определяет лишь меньшинство положительных клеток индейки. Таким образом, in situ гибридизация с ТМ1 пробой не будет эффективным способом определения химер.
ПРИМЕР 14
Определение межвидовых эмбриональных химер курица-индейка с использованием окрашивания SSEA-1.
Для того чтобы убедиться в отсутствии технических проблем, связанных с способикой, межвидовые курица-индейка зародышевые химеры получали посредством внутрисосудистого переноса эмбриональных клеток гонад курицы. Поскольку существует видовое различие в экспрессии SSEA-1 антигена на ЭСК гонад курицы и индейки, предположили, что антитело SSEA-1 можно использовать для идентификации эмбриональных зародышевых химер курица-индейка. Из пяти выживших эмбрионов четыре были порезаны на криосрезы. В одном из 4-х эмбрионов в дорсальном мезентерии эмбриона индейки было обнаружено 19 SSEA-1 позитивных клеток (данные не показаны), еще 4 куриные зародышевые клетки, меченные SSEA-1, были идентифицированы в генитальном гребне индейки (данные не показаны). Во втором эмбрионе две SSEA-1 положительные клетки были зарегистрированы в окрестностях гонад. В двух оставшихся эмбрионах донорские ЭСК не были отмечены.
На основе этих результатов можно заключить, что ЭСК гонад куриных эмбрионов, начиная с 5 дня (стадия, на которой ЭСК являются SSSA-1 положительными), при внутрисосудистом введении в эмбрион индейки на стадии 13, способны к миграции, колонизации гонад и дают начало зародышевым химерам. Таким образом, оказалось, что хемоаттрактант, вырабатываемый гонадами индейки, не является видоспецифичным. Также еще раз подтверждено, что ЭСК гонад курицы сохраняют свою способность к миграции даже после того, как они колонизировали гонады. Низкая эффективность зародышевых химер в данном исследовании может объясняться более малым числом ЭСК донора во вводимой суспензии клеток.
Пример 15
Идентификация межвидовых эмбриональных химер индейка-курица с использованием окрашивания SSEA-1 и PAS.
Предыдущее исследование показало различие в экспрессии SSEA-1 у ЭСК индейки и курицы. Эти антигенные вариации, связанные со стандартным PAS тестом, потенциально могут быть использованы для идентификации зародышевых химер индейка-курица. Исследования дважды окрашенных срезов эмбриона курицы подтвердили, что ЭСК курицы положительны как к PAS, так и к SSEA-1 (данные не показаны). На контрольных срезах эмбриона курицы не было найдено PAS положительных и SSEA-1 отрицательных эмбриональных клеток. Двойное окрашивание 24 стадии индейки посредством PAS и SSEA-1 подтвердило, что ЭСК индейки, мигрирующие через дорсальный мезентерий и колонизирующие гонады, PAS положительны и не экспрессируют SSEA-1 эпитоп (данные не показаны). Таким образом, двойное окрашивание эмбрионов курицы и индейки установило, что способика двойного окрашивания может быть использована как маркер для идентификации эмбриональных клеток индейки в гонадах курицы. При использовании антитела SSEA-1 вместе со стандартным красителем PAS зародышевые химеры были зафиксированы в четырех из восьми куриных эмбрионов-реципиентов (Табл.1). Приблизительно через 24 часа после инъекции ЭСК индейки в кровеносные сосуды эмбриона курицы SSEA-1 отрицательные и PAS положительные эмбриональные клетки индейки были обнаружены в эмбрионах курицы. ЭСК индейки были зафиксированы вместе с ЭСК курицы в утолщенном целомическом эпителии (данные не показаны). Этот эпителий находился между целомическим углом и мезонефросом, в области будущих гонад. У более старших эмбрионов (стадия 22 и 23) ЭСК донора-индейки были отмечены у обоих эмбрионах-реципиентах курицы. Некоторые зародышевые клетки были расположены в дорсальном мезентерии (данные не показаны), другие мигрировали дальше и колонизировали гонады цыпленка (данные не показаны). Анализ потенциальных химер при помощи способики двойного окрашивания подтвердил, что ЭСК гонад индейки могут быть использованы для получения межвидовых химер.
| Таблица 1 Продукция эмбриональных зародышевых химер индейка-курица. |
||
| Стадия | Число эмбрионов, порезанных на срезы | Число зародышевых химер |
| 19/20 | 5 | 2/5 |
| 22/23 | 2 | 2/2 |
| 25 | 1 | 0/1 |
Хотя ДНК-ДНК гибридизация и была видоспецифичной, эта способика оказалась неспособна выявлять химеры. Способ дот-блот гибридизации был недостаточно чувствителен, чтобы выявлять ЭСК донора, тогда как способ гибридизации in situ имеет высокий процент ложных отрицательных результатов, связанный с способикой. Способ двойного окрашивания является успешным способом идентификации химер индейка-курица. На основе результатов, представленных выше, ЭСК гонад курицы или индейки при внутрисосудистом введении способны мигрировать в гонады и давать начало зародышевым химерам. Таким образом, оказалось, что хемоаттрактант, вырабатываемый гонадами птиц, не является видоспецифичным. Это также доказывает, что ЭСК гонад сохраняют свою способность мигрировать даже после того, как они колонизировали гонады.
Получение химер индейка-курица имеет широкое применение. Перенос ЭСК самца индейки пригоден для сперматогенеза индейки в гонадах курицы. Это может ускорить сперматогенез, поскольку время, необходимое для получения спермы у кур - 18 недель, по сравнению с 30-32 неделями у индеек. Возможность культурировать ЭСК и получать зародышевые химеры может уменьшить число высококачественных производителей, которые в настоящее время необходимы для получения потомства. Возможность получения индюшачьей спермы от меньших по размеру и более дешевых птиц также выгодно для птицеводства.
Экспериментальные химеры также могут дать модель исследования взаимодействия между зародышевыми и соматическими клетками разных генотипов, на основании чего становится возможным узнать, получают ли при этом соседние клетки какие-либо характеристики эмбриональных клеток. Эта способика может быть также использована для переноса ЭСК от пород с низкой плодовитостью к более плодовитым птицам и для сохранения ЭСК в случае неожиданной гибели или болезни или в случае видов птиц, вымирающих при естественных условиях спаривания (A.Tajima et al. Theriogenology 40:509-519 (1993)).
Предшествующее является иллюстрацией настоящего изобретения и не должно истолковываться как его ограничение. Данное изобретение определяется нижеследующими пунктами и эквивалентными положениями, включенными в них.
Claims (11)
1. Способ производства и сбора гамет птиц, предусматривающий стадии: получения эмбриональных стволовых клеток от птиц видов-доноров; введения указанных эмбриональных стволовых клеток виду-реципиенту птицы in ovo, где указанный вид-реципиент отличен от указанного вида-донора; инкубирование указанного вида реципиента до вылупления; выращивание указанного реципиента до половой зрелости; с последующим сбором гамет указанного вида-донора у указанного вида-реципиента.
2. Способ по п.1, где указанным видом-донором является американский журавль.
3. Способ по п.2, где указанным видом-реципиентом является канадский журавль.
4. Способ по п.1, где указанным видом-донором является индейка.
5. Способ по п.4, где указанным видом реципиентом является курица.
6. Способ по п.1, где указанная стадия введения осуществляется инъекцией.
7. Способ по п.1, где указанные эмбриональные стволовые клетки выбирают из группы, состоящей из эмбриональных стволовых клеток гонад и эмбриональных стволовых клеток крови.
8. Способ по п.1, где указанная стадия введения осуществляется на стадиях с 13 по 18 эмбрионального развития.
9. Способ по п.1, где указанные эмбриональные стволовые клетки несут пару хромосом (Z), определяющих пол самца.
10. Способ по п.1, где указанные эмбриональные стволовые клетки несут хромосому (w), определяющую пол самки.
11. Способ по п.1, где указанная стадия введения производится без предварительной стерилизации указанной птицы in ovo.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/533,141 | 2000-03-23 | ||
| US09/533,141 US6354242B1 (en) | 2000-03-23 | 2000-03-23 | Methods for gamete production in birds |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005133621/10A Division RU2402208C2 (ru) | 2000-03-23 | 2001-03-23 | Способы продуцирования гамет у птиц |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002128348A RU2002128348A (ru) | 2004-03-10 |
| RU2294099C2 true RU2294099C2 (ru) | 2007-02-27 |
Family
ID=24124664
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002128348/13A RU2294099C2 (ru) | 2000-03-23 | 2001-03-23 | Способ продуцирования гамет у птиц |
| RU2005133621/10A RU2402208C2 (ru) | 2000-03-23 | 2001-03-23 | Способы продуцирования гамет у птиц |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005133621/10A RU2402208C2 (ru) | 2000-03-23 | 2001-03-23 | Способы продуцирования гамет у птиц |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6354242B1 (ru) |
| EP (1) | EP1265479B1 (ru) |
| JP (2) | JP2003527120A (ru) |
| CN (1) | CN1419409A (ru) |
| AT (1) | ATE409408T1 (ru) |
| AU (2) | AU5094001A (ru) |
| BR (1) | BR0109463B1 (ru) |
| CA (1) | CA2402977C (ru) |
| CY (1) | CY1108671T1 (ru) |
| DE (1) | DE60135973D1 (ru) |
| DK (1) | DK1265479T3 (ru) |
| ES (1) | ES2315279T3 (ru) |
| HK (1) | HK1054294A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA02009320A (ru) |
| PL (1) | PL207218B1 (ru) |
| PT (1) | PT1265479E (ru) |
| RU (2) | RU2294099C2 (ru) |
| WO (1) | WO2001070015A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200207187B (ru) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993015185A1 (en) * | 1992-01-27 | 1993-08-05 | North Carolina State University | GENE TRANSFER IN POULTRY BY INTRODUCTION OF EMBRYO CELLS $i(IN OVO) |
| US6333192B1 (en) * | 1999-08-09 | 2001-12-25 | North Carolina State University | Method of producing an undifferentiated avian cell culture using avian primordial germ cells |
| US6354242B1 (en) | 2000-03-23 | 2002-03-12 | North Carolina State University | Methods for gamete production in birds |
| US20020162134A1 (en) * | 2001-02-16 | 2002-10-31 | Alexander Baguisi | Primordial germ cell-based germ line production of birds |
| US7994388B2 (en) * | 2003-01-16 | 2011-08-09 | North Carolina State University | Depletion of endogenous primordial germ cells in avian species |
| US20060174362A1 (en) * | 2005-02-01 | 2006-08-03 | Origen Therapeutics, Inc. | Long-term culture of avian primordial germ cells (PGCs) |
| US20140158050A1 (en) * | 2012-12-11 | 2014-06-12 | Once Innovations, Inc. | Methods for controlling sex of oviparous embryos using light sources |
| US11140879B2 (en) * | 2012-12-11 | 2021-10-12 | Signify North America Corporation | Methods for controlling sex of oviparous embryos using light sources |
| CN103081863A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-05-08 | 吕启金 | 麦田养鸡方法 |
| CN103355248A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-10-23 | 江苏圣农禽业发展有限公司 | 禽类种蛋的孵化方法 |
| WO2016091272A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Central Veterinary Research Laboratory | System and method for establishing a long-term culture of avian primordial germ cells and uses thereof |
| CN104509491B (zh) * | 2014-12-26 | 2017-01-25 | 荆州市和美华饲料有限公司 | 一种蛋鸡育雏期饲养方法 |
| CN104813982A (zh) * | 2015-05-25 | 2015-08-05 | 安徽省怀远县华夏药械有限责任公司 | 一种珍珠鸡蛋孵化方法 |
| CN106386676B (zh) * | 2016-08-31 | 2019-06-14 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种屠宰型优质冷鲜鸡的培育方法 |
| CN107156024B (zh) * | 2017-04-12 | 2020-08-28 | 广西金陵农牧集团有限公司 | 金陵黑凤鸡配套系的育种方法 |
| CN107810924B (zh) * | 2017-11-30 | 2020-09-18 | 广西鸿光农牧有限公司 | 一种黑鸡选育方法 |
| CN108244046B (zh) * | 2018-03-26 | 2020-09-01 | 房县忠意设备有限公司 | 一种四黑一绿高含硒乌鸡及喂养方法 |
| CN111925981A (zh) * | 2020-08-26 | 2020-11-13 | 扬州大学 | 一种分离鸡雌雄原始生殖细胞的方法 |
| CN113519453A (zh) * | 2021-06-25 | 2021-10-22 | 湖南蛋哥哥生态农业有限公司 | 一种生态型养鸡方法 |
| CN115191404B (zh) * | 2022-07-28 | 2023-04-21 | 四川省畜牧科学研究院 | 提高黄羽肉鸡后代公鸡比例的新品种选育方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5162215A (en) | 1988-09-22 | 1992-11-10 | Amgen Inc. | Method of gene transfer into chickens and other avian species |
| WO1993015185A1 (en) | 1992-01-27 | 1993-08-05 | North Carolina State University | GENE TRANSFER IN POULTRY BY INTRODUCTION OF EMBRYO CELLS $i(IN OVO) |
| CA2117429A1 (en) | 1992-01-27 | 1993-08-05 | James N. Petitte | Gene transfer in birds by introduction of dna into muscle in ovo |
| US5340740A (en) | 1992-05-15 | 1994-08-23 | North Carolina State University | Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process |
| US5438954A (en) * | 1993-11-03 | 1995-08-08 | Embrex, Inc. | Method and apparatus for early embryonic in ovo injection |
| US5817320A (en) * | 1994-06-20 | 1998-10-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Agriculture | In ovo immunization of avian embryos with oil-emulsion vaccines |
| ATE307196T1 (de) | 1997-08-04 | 2005-11-15 | Univ Massachusetts | Primordiale keimzellinie aus vögeln und verfahren zu deren langzeitkultivierung |
| US6354242B1 (en) | 2000-03-23 | 2002-03-12 | North Carolina State University | Methods for gamete production in birds |
-
2000
- 2000-03-23 US US09/533,141 patent/US6354242B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-23 BR BRPI0109463-7A patent/BR0109463B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-03-23 AU AU5094001A patent/AU5094001A/xx active Pending
- 2001-03-23 CA CA2402977A patent/CA2402977C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-03-23 EP EP01924270A patent/EP1265479B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-23 ES ES01924270T patent/ES2315279T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-23 RU RU2002128348/13A patent/RU2294099C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-03-23 HK HK03106676.5A patent/HK1054294A1/zh unknown
- 2001-03-23 AU AU2001250940A patent/AU2001250940B2/en not_active Ceased
- 2001-03-23 PL PL358273A patent/PL207218B1/pl unknown
- 2001-03-23 DE DE60135973T patent/DE60135973D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-23 WO PCT/US2001/009250 patent/WO2001070015A1/en active IP Right Grant
- 2001-03-23 PT PT01924270T patent/PT1265479E/pt unknown
- 2001-03-23 AT AT01924270T patent/ATE409408T1/de active
- 2001-03-23 MX MXPA02009320A patent/MXPA02009320A/es active IP Right Grant
- 2001-03-23 DK DK01924270T patent/DK1265479T3/da active
- 2001-03-23 RU RU2005133621/10A patent/RU2402208C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-03-23 JP JP2001568225A patent/JP2003527120A/ja not_active Ceased
- 2001-03-23 CN CN01806931A patent/CN1419409A/zh active Pending
-
2002
- 2002-02-12 US US10/074,719 patent/US6691638B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-09-06 ZA ZA200207187A patent/ZA200207187B/en unknown
-
2008
- 2008-12-30 CY CY20081101500T patent/CY1108671T1/el unknown
-
2013
- 2013-07-29 JP JP2013156509A patent/JP2013240347A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Yasuda Y. en al., "A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells", J Reprod Fertil. 1992 Nov' 96(2):521-8. Ono Т. et al., "Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads", Exp Anim. 1996 Oct; 45(4):347-52. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0109463A (pt) | 2003-06-03 |
| HK1054294A1 (zh) | 2003-11-28 |
| DK1265479T3 (da) | 2009-02-02 |
| PT1265479E (pt) | 2009-01-13 |
| CN1419409A (zh) | 2003-05-21 |
| DE60135973D1 (de) | 2008-11-13 |
| AU2001250940B2 (en) | 2005-05-19 |
| US20030111016A1 (en) | 2003-06-19 |
| RU2005133621A (ru) | 2007-05-10 |
| MXPA02009320A (es) | 2003-03-12 |
| PL358273A1 (en) | 2004-08-09 |
| CA2402977A1 (en) | 2001-09-27 |
| ATE409408T1 (de) | 2008-10-15 |
| BR0109463B1 (pt) | 2010-08-24 |
| PL207218B1 (pl) | 2010-11-30 |
| EP1265479A4 (en) | 2003-07-09 |
| CA2402977C (en) | 2013-01-15 |
| ES2315279T3 (es) | 2009-04-01 |
| JP2013240347A (ja) | 2013-12-05 |
| JP2003527120A (ja) | 2003-09-16 |
| US6354242B1 (en) | 2002-03-12 |
| EP1265479A1 (en) | 2002-12-18 |
| RU2002128348A (ru) | 2004-03-10 |
| AU5094001A (en) | 2001-10-03 |
| RU2402208C2 (ru) | 2010-10-27 |
| ZA200207187B (en) | 2003-04-30 |
| EP1265479B1 (en) | 2008-10-01 |
| US6691638B2 (en) | 2004-02-17 |
| WO2001070015A1 (en) | 2001-09-27 |
| CY1108671T1 (el) | 2014-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2294099C2 (ru) | Способ продуцирования гамет у птиц | |
| US7481179B2 (en) | In ovo activation of an egg in the shell | |
| AU2001250940A1 (en) | Methods for gamete production in birds | |
| CN113396864A (zh) | 一种鸡禽白血病净化方法 | |
| Molnár et al. | Investigation of the Guinea fowl and domestic fowl hybrids as potential surrogate hosts for avian cryopreservation programmes | |
| Ono et al. | Settlement of quail primordial germ cells in chicken gonads | |
| Sztán et al. | Successful chimera production in the Hungarian goose (Anser anser domestica) by intracardiac injection of blastodermal cells in 3-day-old embryos | |
| Ricks et al. | The embryonated egg: a practical target for genetic based advances to improve poultry production | |
| Bacon et al. | Absence of influence on immune competence by the sex-linked gene (K) determining slow feathering in white leghorn chickens | |
| CN116210647B (zh) | 一种使用原始生殖细胞干细胞系扩繁白羽肉鸡的方法 | |
| AU2001238413B2 (en) | In ovo activation of an avian egg in the shell | |
| CN100403888C (zh) | 产生存活雏鸟的方法、使产出的壳内鸟卵受精的方法以及产生含异源核酸的鸟胚胎的方法 | |
| KR101074448B1 (ko) | 효율적인 이종간 조류의 생식선 카이메라 및 형질전환체의 제조방법 | |
| Klein et al. | Analysis of chicken embryonic development after removal of blastodermal cells for sexing | |
| Rikimaru et al. | Identification of germline chimeric chickens produced by transfer of primordial germ cells using a Hinai-dori-specific microsatellite marker | |
| Ono | Ex ovo culture of quail embryos and its application for embryo manipulation | |
| AU2001238413A1 (en) | In ovo activation of an avian egg in the shell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150324 |