RU2270023C2 - Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) - Google Patents
Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2270023C2 RU2270023C2 RU2002104499/13A RU2002104499A RU2270023C2 RU 2270023 C2 RU2270023 C2 RU 2270023C2 RU 2002104499/13 A RU2002104499/13 A RU 2002104499/13A RU 2002104499 A RU2002104499 A RU 2002104499A RU 2270023 C2 RU2270023 C2 RU 2270023C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteoglycan
- cartilage
- acetic acid
- precipitate
- crude
- Prior art date
Links
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- -1 sodium chloride saturated ethanol Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 68
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 68
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 description 21
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 18
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 18
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 6
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000277338 Oncorhynchus kisutch Species 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-2-Deoxy-Hexose Chemical compound NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 3
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 3
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- LOHGGLZYTJNUAL-UHFFFAOYSA-M sodium;ethanol;chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].CCO LOHGGLZYTJNUAL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 2
- 238000009924 canning Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 2
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000010808 liquid waste Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000011034 membrane dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000008400 supply water Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003508 trans-4-hydroxy-L-proline group Chemical group 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Область, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к новому способу экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.The present invention relates to a new method for the extraction and purification of cartilage-type proteoglycan.
Описание уровня техникиDescription of the prior art
Одна молекула протеогликана хрящевого типа, известного как конъюгированный углевод, характеризуется тем, что она имеет структуру, показанную на фиг.1, и представляет собой биополимер, имеющий нижеописанные структурные особенности. То есть от нескольких до десяти гликозаминогликановых цепей (далее сокращенно обозначаемых GAG), молекулярная масса каждой из которых составляет от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, связаны с одной каркасной молекулой белка, имеющей молекулярную массу от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, и которую называют коровым белком. По своей основной структуре GAG может быть отнесен к нескольким видам, таким как сульфат хондроитина или сульфат дерматана, а в основном, он представляет собой длинноцепочечный гетерокислотный полисахарид, состоящий из повторяющихся структур дисахарида с аминосахаром и уроновой кислотой. В указанной структуре GAG, за исключением гуалуроновой, кислоты связаны с коровым белком и образуют протеогликан.One cartilage-type proteoglycan molecule, known as a conjugated carbohydrate, is characterized in that it has the structure shown in FIG. 1 and is a biopolymer having the structural features described below. That is, from several to ten glycosaminoglycan chains (hereinafter abbreviated GAG), the molecular weight of each of which is from several tens of thousands to several hundreds of thousands, are associated with one frame protein molecule having a molecular weight of from several tens of thousands to several hundred thousand, and which is called core protein. By its basic structure, GAG can be assigned to several types, such as chondroitin sulfate or dermatan sulfate, and basically it is a long-chain heteroacid polysaccharide consisting of repeating structures of a disaccharide with amino sugar and uronic acid. In the indicated structure of GAG, with the exception of gualuronic acid, acids are bound to core protein and form proteoglycan.
Обычно протеогликан присутствует почти во всех организмах животных как один из важных компонентов внутриклеточного матрикса, который заполняет пространство между клетками (см. фиг.2) и в котором также присутствуют коллаген и гуалуроновая кислота. И он не только составляет важную часть структуры организма, но также образует физическую среду, окружающую клетки, и регулирует различные клеточные активности, такие как связывание, размножение или дифференцировка. Каждый компонент внеклеточного матрикса или GAG, взятый отдельно, имеет определенные функции, такие как удерживание и доставка воды, противоядия или анальгетика. Если эти компоненты связываются друг с другом и образуют макромолекулярную структуру, где каждый компонент действует в соответствии с другим компонентном, то наблюдается более значительный эффект.Typically, proteoglycan is present in almost all animal organisms as one of the important components of the intracellular matrix, which fills the space between cells (see figure 2) and in which collagen and gualuronic acid are also present. And it not only constitutes an important part of the structure of the body, but also forms the physical environment surrounding the cells and regulates various cellular activities, such as binding, reproduction or differentiation. Each component of the extracellular matrix or GAG, taken separately, has specific functions, such as water retention and delivery, antidotes, or analgesics. If these components bind to each other and form a macromolecular structure, where each component acts in accordance with a different component, then a more significant effect is observed.
Протеогликан хрящевого типа, который является объектом настоящего изобретения, имеет очень большую молекулярную массу по сравнению с коллагеном, гиалуроновой кислотой или GAG и имеет более сложную структуру. Поэтому даже если протеогликан взят отдельно, он обладает лучшей способностью удерживать и поставлять воду, чем другие компоненты во внеклеточном матриксе, и, кроме того, может обладать и другими функциями в зависимости от организации биологического информационного сигнала его GAG-части.The cartilage type proteoglycan, which is an object of the present invention, has a very large molecular weight compared to collagen, hyaluronic acid or GAG and has a more complex structure. Therefore, even if proteoglycan is taken separately, it has a better ability to retain and supply water than other components in the extracellular matrix, and, in addition, may have other functions depending on the organization of the biological information signal of its GAG part.
Между тем, в современном методе экстракции и очистки протеогликана в качестве исходного материала используется хрящ коров или китов, и экстракцию и очистку проводят с помощью сложной процедуры с использованием токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина. И этот способ не имеет промышленного применения. Протеогликаны некоторых типов продаются как реагенты в очень небольших количествах, и их цена составляет приблизительно десятки миллионов иен за один грамм.Meanwhile, in the modern method of extraction and purification of proteoglycan, the cartilage of cows or whales is used as the starting material, and extraction and purification are carried out using a complex procedure using toxic or harmful agents, such as chloroform, methanol or guanidine hydrochloride. And this method has no industrial application. Some types of proteoglycans are sold as reagents in very small quantities, and their price is approximately tens of millions of yen per gram.
Заявителями настоящего изобретения ранее уже был изобретен новый крупномасштабный упрощенный метод экстракции и очистки протеогликана, который может быть использован в промышленности с использованием носового хряща лосося, и была подана патентная заявка (заявка на патент Японии 11-331375, поданная 22 ноября 1999). Этот метод включает, в частности, процесс измельчения носового хряща лосося, процесс обезжиривания, процесс экстракции растворителем и процесс диализа. Благодаря этому методу, может быть осуществлен способ экстракции и очистки, отличающийся тем, что он является крупномасштабным и недорогостоящим, однако в нем используется не только хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина, но также и вредный агент, такой как агент, препятствующий разложению ферментного белка, а поэтому возможность его использования в медицине в качестве материала для введения в организм человека или в качестве диетической и пищевой добавки связана с определенными трудностями, и такое применение ограничено нелекарственными химическими средствами или косметическими средствами. Кроме того, поскольку рыночная цена вышеупомянутых химических агентов является относительно высокой, то снижение затрат на экстракцию и очистку ограничено.Applicants of the present invention had previously invented a new large-scale simplified method of extraction and purification of proteoglycan, which can be used in industry using salmon nasal cartilage, and a patent application was filed (Japanese Patent Application No. 11-331375, filed November 22, 1999). This method includes, in particular, the salmon nasal cartilage grinding process, the degreasing process, the solvent extraction process and the dialysis process. Thanks to this method, an extraction and purification method can be carried out, characterized in that it is large-scale and inexpensive, however, it uses not only chloroform, methanol or guanidine hydrochloride, but also a harmful agent, such as an agent that prevents the decomposition of the enzyme protein, and therefore, the possibility of its use in medicine as a material for introduction into the human body or as a dietary and nutritional supplement is associated with certain difficulties, and such use is limited to non-drug idents chemicals or cosmetics. In addition, since the market price of the aforementioned chemical agents is relatively high, the reduction in extraction and purification costs is limited.
При этом поскольку авторами настоящей заявки был предложен указанный недорогостоящий протеогликан, то возникает все большее стремление изготовить протеогликансодержащие продукты, которые могли бы быть использованы не только в косметической промышленности, но также и в пищевой промышленности, в промышленности по изготовлению диетических продуктов или пищевых добавок и в медицине. Однако для основательного применения протеогликана в промышленности по изготовлению пищевых продуктов, в промышленности по изготовлению диетических или пищевых добавок или в медицине особое внимание необходимо уделить методу очистки протеогликана. В стандартном методе экстракции и очистки протеогликана обычно используется гидрохлоридная соль гуанидина. Однако для нового применения протеогликана крайне необходимо избегать использования указанного гидрохлорида гуанидина, а также токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению белкового фермента. Кроме того, разработка более простого и менее дорогостоящего метода экстракции и очистки протеогликана остается крайне актуальной.Moreover, since the authors of this application proposed this inexpensive proteoglycan, there is an increasing desire to produce proteoglycan-containing products that could be used not only in the cosmetic industry, but also in the food industry, in the industry for the manufacture of dietary products or food additives and in medicine. However, for the thorough use of proteoglycan in the food industry, in the diet or food supplement industry, or in medicine, special attention must be paid to the method of purification of proteoglycan. The standard method for the extraction and purification of proteoglycan usually uses the guanidine hydrochloride salt. However, for the new use of proteoglycan, it is imperative to avoid the use of the indicated guanidine hydrochloride, as well as toxic or harmful agents such as chloroform, methanol or an agent that prevents the decomposition of the protein enzyme. In addition, the development of a simpler and less expensive method of extraction and purification of proteoglycan remains extremely urgent.
Авторами настоящего изобретения было проведено интенсивное исследование по разработке способа экстракции и очистки протеогликана, осуществление которого не требует использования токсических или вредных агентов и который, кроме того, отличается тем, что он является более простым и недорогостоящим, и на основании этого исследования было разработано настоящее изобретение. Поэтому целью настоящего изобретения является разработка более простого и менее дорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.The authors of the present invention conducted an intensive study to develop a method for the extraction and purification of proteoglycan, the implementation of which does not require the use of toxic or harmful agents and which, moreover, differs in that it is simpler and less expensive, and based on this study, the present invention was developed . Therefore, the aim of the present invention is to develop a simpler and less expensive method for the extraction and purification of cartilaginous proteoglycan.
Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к способу экстракции неочищенного протеогликана, отличающемуся тем, что в качестве элюирующего растворителя для хряща используется уксусная кислота. Настоящее изобретение также относится к способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок. Настоящее изобретение, кроме того, относится к улучшенному способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок; растворение указанного осадка, содержащего неочищенный протеогликан, с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для указанного неочищенного протеогликана; а затем, диализ.The present invention relates to a method for the extraction of crude proteoglycan, characterized in that acetic acid is used as an eluting solvent for cartilage. The present invention also relates to a method for purifying a crude proteoglycan, comprising extracting a crude proteoglycan using acetic acid as an eluting solvent for cartilage; filtering a solution containing crude proteoglycan to remove sediment from said solution; centrifuging the solution obtained by such filtration; adding saturated with sodium chloride ethanol to the supernatant obtained by the specified centrifugation; and then centrifuging said supernatant to which said saturated sodium chloride ethanol was added to concentrate said crude proteoglycan into a precipitate. The present invention further relates to an improved method for purifying crude proteoglycan, comprising extracting crude proteoglycan using acetic acid as an eluting solvent for cartilage; filtering a solution containing crude proteoglycan to remove sediment from said solution; centrifuging the solution obtained by such filtration; adding saturated with sodium chloride ethanol to the supernatant obtained by the specified centrifugation; centrifuging said supernatant to which said saturated sodium chloride-saturated ethanol was added to concentrate said crude proteoglycan into a precipitate; dissolving said precipitate containing crude proteoglycan using acetic acid as an eluting solvent for said crude proteoglycan; and then dialysis.
Таким образом, важным аспектом настоящего изобретения является использование уксусной кислоты, хлорида натрия и немодифицированного этанола во всех способах экстракции и очистки протеогликана вместо токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению ферментного белка. Эти вышеупомянутые агенты, такие как уксусная кислота, хлорид натрия и немодифицированный этанол, являются агентами, используемыми в пищевых продуктах, подвергающихся обработке. Для осуществления более простого способа экстракции и очистки можно исключить стадию замещения мочевиной и стадию разделения и очистки методом с использованием DEAE-Sephacel, которые были использованы в способе, описанном в вышеупомянутой патентной заявке (JPA 11-331375).Thus, an important aspect of the present invention is the use of acetic acid, sodium chloride and unmodified ethanol in all methods of extraction and purification of proteoglycan instead of toxic or harmful agents, such as chloroform, methanol or an agent that prevents the decomposition of the enzyme protein. These aforementioned agents, such as acetic acid, sodium chloride and unmodified ethanol, are agents used in processed foods. To implement a simpler extraction and purification method, the urea substitution step and the separation and purification step by the method using DEAE-Sephacel, which were used in the method described in the aforementioned patent application (JPA 11-331375), can be omitted.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг.1 представлена структурная модель протеогликана, на фиг.2 схематически представлен внеклеточный матрикс, а на фиг.3 представлен график, иллюстрирующий изменение в процессе элюирования неочищенного протеогликана от времени.Figure 1 presents a structural model of proteoglycan, figure 2 schematically shows the extracellular matrix, and figure 3 presents a graph illustrating the change in the process of elution of the crude proteoglycan from time to time.
Цифры, указанные на чертежах, обозначают: 1: коровый белок, 2: гликозаминогликановая цепь, 3: гиалуроновая кислота, 4: коллаген, 5: протеогликан.The numbers indicated on the drawings indicate: 1: core protein, 2: glycosaminoglycan chain, 3: hyaluronic acid, 4: collagen, 5: proteoglycan.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретенияDetailed Description of Preferred Embodiments of the Present Invention
Настоящее изобретение далее более подробно проиллюстрировано следующим описанием.The present invention is further illustrated in more detail by the following description.
В качестве исходного материала протеогликана настоящего изобретения может быть использован хрящ коровы или кита, однако с точки зрения доступности и цены, желательно использовать носовой хрящ лосося. Особенно желательно использовать части головы кижуча, являющиеся отходами процесса производства пищевых продуктов, например, рыбоконсервной промышленности, в которой используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии.As the starting material for the proteoglycan of the present invention, cow or whale cartilage can be used, however, salmon nasal cartilage is desirable in terms of affordability and price. It is especially desirable to use parts of coho salmon head that are waste products from the food manufacturing process, for example, the canning industry, which uses coho salmon caught by fishermen off the coast of Aomori Prefecture in Japan.
Уксусной кислотой, используемой в настоящем изобретении, может быть уксусная кислота любого типа, например, уксусная кислота, применяемая для приготовления пищи или в промышленности, и она может быть выбрана по усмотрению специалиста в зависимости от целей использования протеогликана. В соответствии с упомянутыми ниже результатами тестов, желаемая концентрация уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя составляет примерно 4%, однако эта концентрация не ограничивается указанным значением.The acetic acid used in the present invention can be any type of acetic acid, for example, acetic acid used for cooking or in industry, and it can be selected at the discretion of the specialist depending on the purpose of the use of proteoglycan. According to the test results mentioned below, the desired concentration of acetic acid as an eluting solvent is about 4%, but this concentration is not limited to the indicated value.
ПримерExample
В качестве исходного материала используют части головы кижуча, являющиеся отходами процесса обработки пищевых продуктов в рыбоконсервной промышленности, где используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии, и указанные части головы помещают на временное хранение при температуре -30°С.As a starting material, coho salmon heads are used as waste products from the food processing industry in the canning industry, where coho salmon are used by fishermen caught offshore belonging to Aomori Prefecture in Japan, and these halves are placed for temporary storage at a temperature of -30 ° С.
Вышеупомянутый материал размораживают при 4°С в течение 20 часов и от головной части кухонным ножом отрезают носовую часть хряща и получают исходный материал. У носового хряща лосося щипчиками удаляют твердый жир и промывают физиологическим солевым раствором. Затем этот хрящ мелко измельчают вручную на мясорубке и получают фарш из носового хряща лосося.The above material is thawed at 4 ° C for 20 hours and the nose of the cartilage is cut off from the head with a kitchen knife and the starting material is obtained. In salmon nasal cartilage, forceps are removed with tweezers and washed with physiological saline. Then this cartilage is finely chopped by hand in a meat grinder and minced salmon nasal cartilage is obtained.
Порцию указанного фарша вымачивают при 4°С в уксусе, применяемом в пивоваренной промышленности и разбавленном до 10 масс./об. (используемом путем разведения до концентрации 4%, которая аналогична концентрации уксусной кислоты в уксусе, далее сокращенно называемом 4% уксусно-кислотным растворителем), в течение 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 и 168 часов, а затем перемешивают. Изменение состояния элюирования неочищенного протеогликана наблюдают в зависимости от времени по количеству уроновой кислоты, которое определяют методом с использованием смеси карбазола и серной кислоты. Полученные результаты показаны на фиг.3. Как ясно видно из фиг.3, количество элюированного протеогликана заметно возрастает в течение первых 24 часов, а по прошествии 24 часов увеличение элюированного количества становится незначительным. Исходя из полученных результатов очевидно, что наиболее эффективное время элюирования неочищенного протеогликана 4%-ной уксусной кислотой в качестве растворителя составляет 48 часов.A portion of the specified minced meat is soaked at 4 ° C in vinegar used in the brewing industry and diluted to 10 wt./about. (used by diluting to a concentration of 4%, which is similar to the concentration of acetic acid in vinegar, hereinafter abbreviated as 4% acetic acid solvent), for 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 and 168 hours, and then stirred . The change in the state of elution of the crude proteoglycan is observed depending on time by the amount of uronic acid, which is determined by the method using a mixture of carbazole and sulfuric acid. The results are shown in figure 3. As can be clearly seen from figure 3, the amount of eluted proteoglycan significantly increases during the first 24 hours, and after 24 hours the increase in the eluted amount becomes insignificant. Based on the results obtained, it is obvious that the most effective elution time of the crude proteoglycan with 4% acetic acid as a solvent is 48 hours.
Исходя из вышеупомянутых результатов, 50 г фарша из носового хряща лосося вымачивают в 4% уксусно-кислотном растворителе при 4°С в течение 48 часов, перемешивают для элюирования носового хряща и получают неочищенный протеогликан (п.1 формулы изобретения).Based on the above results, 50 g of minced meat from salmon nasal cartilage is soaked in 4% acetic acid solvent at 4 ° C for 48 hours, stirred to elute nasal cartilage and get crude proteoglycan (claim 1).
Затем элюированный раствор фильтруют через сито из нержавеющей стали (150 мкм) для удаления неэлюированного вещества. После этого, раствор, содержащий неочищенный протеогликан, разделяют центрифугированием (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут). К полученной надосадочной жидкости добавляют трехкратное количество этанола, насыщенного хлоридом натрия, и снова разделяют на центрифуге (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут), а затем получают концентрированный осадок, содержащий неочищенный протеогликан (п.2 настоящего изобретения).Then the eluted solution is filtered through a stainless steel sieve (150 μm) to remove uneluted substance. After that, the solution containing the crude proteoglycan is separated by centrifugation (4 ° C, 1000 rpm./min, for 20 minutes). Three times the amount of ethanol saturated with sodium chloride was added to the obtained supernatant and again centrifuged (4 ° C, 1000 rpm for 20 minutes), and then a concentrated precipitate containing crude proteoglycan was obtained (
Полученный осадок, содержащий неочищенный протеогликан, снова растворяют в 4% уксусно-кислотном растворителе, а затем раствор достаточно диализуют против воды в трубке для мембранного диализа из сложного эфира целлюлозы с отсечкой молекулярной массы 1000 кДа, и получают жидкий протеогликан с высокой степенью очистки (п.3 формулы настоящего изобретения).The resulting precipitate containing crude proteoglycan is again dissolved in a 4% acetic acid solvent, and then the solution is sufficiently dialyzed against water in a membrane dialysis tube of cellulose ester with a molecular weight cut-off of 1000 kDa, and a high-purity liquid proteoglycan is obtained (p .3 claims of the present invention).
Полученный жидкий протеогликан желательно сушить вымораживанием и хранить в порошкообразной форме. В этом примере диализованный внутренний раствор подвергают сушке вымораживанием и получают 240 мг образца порошкообразного протеогликана.The resulting liquid proteoglycan is preferably freeze-dried and stored in powder form. In this example, the dialyzed internal solution is freeze-dried to obtain 240 mg of a sample of powdered proteoglycan.
Химические свойства образца протеогликана, полученного, как указано в п.3 формулы изобретения, определяют методом, описанным ниже.The chemical properties of the proteoglycan sample obtained as described in
Результаты химических анализов представлены в таблице 1.The results of chemical analyzes are presented in table 1.
Химические анализы образца протеогликана, выделенного из носового хряща лососяTable 1.
Chemical analyzes of a sample of proteoglycan isolated from salmon nasal cartilage
В таблице 1 количества уроновой кислоты и сульфата показаны в виде молярного соотношения, если количество гексозамина принято равным 1,00, и составляют соответственно 0,99 и 0,67. Понятно, что эти три компонента присутствуют почти в равных количествах. Кроме того, количество корового белка составляет 6,99% (масс./масс.), а его отношение к количеству уроновой кислоты (коровый белок/уроновая кислота) составляет 0,23 (масс./масс.). Это численное значение показывает один из показателей для определения чистоты протеогликана и близок к значению 0,2, которое является теоретическим.In table 1, the amounts of uronic acid and sulfate are shown as a molar ratio if the amount of hexosamine is taken to be 1.00, and are respectively 0.99 and 0.67. It is understood that these three components are present in almost equal amounts. In addition, the amount of core protein is 6.99% (w / w), and its ratio to the amount of uronic acid (core protein / uronic acid) is 0.23 (w / w). This numerical value shows one of the indicators for determining the purity of proteoglycan and is close to a value of 0.2, which is theoretical.
Был проанализирован тип аминокислот, составляющих белок в данном образце, и результаты этого анализа показали, что количество глицина, серина и глутаминовой кислоты являются значительно более высокими. А именно, во всех 1000 аминокислотных остатках общее число остатков глицина, серина и глутаминовой кислоты составляет 386, а число гидроксипролиновых остатков равно 2. Гидроксипролин представляет собой типичную аминокислоту в коллагеновом белке, и примесь коллагена в этом протеогликане носового хряща лосося может быть обнаружена, но это количество слишком мало и не может рассматриваться как значимое. Поэтому можно утверждать, что степень чистоты полученного протеогликана носового хряща лосося является очень высокой.The type of amino acids that make up the protein in this sample was analyzed, and the results of this analysis showed that the amounts of glycine, serine and glutamic acid are significantly higher. Namely, in all 1000 amino acid residues, the total number of glycine, serine, and glutamic acid residues is 386, and the number of hydroxyproline residues is 2. Hydroxyproline is a typical amino acid in the collagen protein, and a collagen admixture in this proteoglycan of salmon nasal cartilage can be detected, but this amount is too small and cannot be considered significant. Therefore, it can be argued that the purity of the obtained proteoglycan of salmon nasal cartilage is very high.
Затем, для получения данных о молекулярном размере протеогликана носового хряща лосося, осуществляют высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке SB805HQ (8×300 мм), и положение элюции подтверждают с помощью УФ-поглощения при 215 нм. Этот результат сравнивают с результатом, полученным для протеогликана коровьего носового хряща, который является коммерчески доступным в качестве реагента. В случае протеогликана носового хряща лосося, положение элюции (Kav), определяемое как симметричный пик с SВ805НQ-колонки, составляет 0,28, а в случае протеогликана коровьего носового хряща, этот пик составляет 0,17. Эти результаты показывают, что молекулярный размер протеогликана носового хряща лосося меньше, чем молекулярный размер протеогликана коровьего носового хряща.Then, to obtain data on the molecular size of the proteoglycan of salmon nasal cartilage, high performance liquid chromatography was performed on an SB805HQ column (8 × 300 mm), and the elution position was confirmed by UV absorption at 215 nm. This result is compared with the result obtained for proteoglycan of bovine nasal cartilage, which is commercially available as a reagent. In the case of salmon nasal cartilage proteoglycan, the elution position (Kav), defined as the symmetrical peak from the SB805HQ column, is 0.28, and in the case of cow nasal cartilage proteoglycan, this peak is 0.17. These results indicate that the molecular size of the proteoglycan of salmon nasal cartilage is smaller than the molecular size of the proteoglycan of bovine nasal cartilage.
Кроме того, часть корового белка протеогликана носового хряща лосося расщепляют проназой, а остальную часть образца GAG анализируют с помощью электрофореза на пленке, изготовленной из ацетата целлюлозы вместе с сульфатом хондроитина (Ch6S), сульфатом дерматана (DS) и гиалуроновой кислотой (НА), которые представляют собой стандартные образцы. В соответствии с полученными результатами, одна полоса соответствует сульфату хондроитина (Ch6S), который является стандартным образцом, и поэтому, очевидно, что большую часть GAG протеогликана носового хряща лосося составляет сульфат хондроитина.In addition, a portion of the salmon nasal cartilage proteoglycan core protein is cleaved with pronase, and the remainder of the GAG sample is analyzed by electrophoresis on a film made from cellulose acetate along with chondroitin sulfate (Ch6S), dermatan sulfate (DS) and hyaluronic acid (HA), which are standard samples. According to the results obtained, one lane corresponds to chondroitin sulfate (Ch6S), which is a standard sample, and therefore, it is obvious that chondroitin sulfate is the majority of salmon nasal cartilage GAG GAG.
Также были проведены исследования изомера указанного дисахаридного звена. После расщепления протеогликана проназой, а затем хондроитиназой АВС, полученный ненасыщенный дисахарид анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией (Полиамин-II). Полученные результаты показаны в таблице 2. Из данных таблицы 2 очевидно, что большую часть GAG составляет моносульфированное дисахаридное звено.Studies have also been conducted on the isomer of the indicated disaccharide unit. After digestion of proteoglycan with pronase and then ABC chondroitinase, the resulting unsaturated disaccharide is analyzed by high performance liquid chromatography (Polyamine II). The results obtained are shown in table 2. From the data of table 2 it is obvious that most of the GAG is a monosulfonated disaccharide unit.
Как было упомянуто выше, тот факт, что протеогликан, исходным материалом которого является носовой хрящ лосося, получают лишь с использованием перечисленных агентов, используемых в качестве добавок для пищевых продуктов [см.например, "Explanation of Analytical Method of Additives in Foods, part III, Food Additives Except Chemically Synthetic Compound" edited by Akio Tanimura et al (1992, Kodansha)] или агентов, используемых в качестве материала для агента консервирования пищи или для приправ ["Encyclopedia of Safety Supply of Food" edited by Kageaki Kuriihara et al (1995, Publishing Center of Sangyo Chosakai)], может рассматриваться как изобретение, имеющее мировое значение. Кроме того, установление того факта, что, благодаря настоящему изобретению, можно избежать проведения стадий, осуществление которых требует много времени и является трудоемким, таких как замещение мочевиной или разделение и очистка методом с использованием DEAE-Sephacel, может рассматриваться как важнейшее изобретение. Таким образом, благодаря настоящему изобретению, может быть осуществлена поставленная цель, а именно разработка более простого и недорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана.As mentioned above, the fact that the proteoglycan, the starting material of which is salmon nasal cartilage, is obtained only using the listed agents used as food additives [see, for example, “Explanation of Analytical Method of Additives in Foods, part III , Food Additives Except Chemically Synthetic Compound "edited by Akio Tanimura et al (1992, Kodansha)] or agents used as material for a food preservation agent or seasoning [" Encyclopedia of Safety Supply of Food "edited by Kageaki Kuriihara et al ( 1995, Publishing Center of Sangyo Chosakai)], may be regarded as an invention having a worldwide value. In addition, the establishment of the fact that, thanks to the present invention, it is possible to avoid carrying out stages which are time consuming and time-consuming, such as urea substitution or separation and purification by a method using DEAE-Sephacel, can be considered as a most important invention. Thus, thanks to the present invention, the goal can be achieved, namely the development of a simpler and inexpensive method of extraction and purification of proteoglycan.
В соответствии с вышеупомянутыми результатами, протеогликан носового хряща лосося, полученный способом настоящего изобретения, может быть введен перорально, и его чистота является почти такой же, как и чистота протеогликана, полученного стандартным методом.In accordance with the above results, salmon nasal cartilage proteoglycan obtained by the method of the present invention can be administered orally, and its purity is almost the same as the purity of proteoglycan obtained by the standard method.
Эффект настоящего изобретенияThe effect of the present invention
В настоящее время, гиалуроновая кислота может быть продуцирована бактериями безопасным способом и в больших количествах и используется в медицине. При этом известно, что протеогликан обладает превосходной способностью удерживать и доставлять воду, действует как противоядие и как анальгетик и, кроме того, предполагается, что он обладает другими функциями, обусловленными GAG-частью. Однако протеогликан, полученный стандартным методом экстракции и очистки, не может быть введен человеку, и его ценность для организма человека не может быть проверена. Более того, попытка выделения конъюгированного углевода, т.е., протеогликана, происходящего из носового хряща лосося, не была предпринята до тех пор, пока не был разработан и применен указанный метод. Однако, благодаря настоящему изобретению, появилась возможность экстракции и очистки протеогликана, который обладает превосходными безопасными свойствами и может быть получен в больших количествах. Следовательно, необходимость в получении протеогликана становится все более актуальной и ожидается, что он будет иметь более широкое применение.Currently, hyaluronic acid can be produced by bacteria in a safe manner and in large quantities and is used in medicine. It is known that proteoglycan has excellent ability to retain and deliver water, acts as an antidote and as an analgesic, and, moreover, it is assumed that it has other functions due to the GAG part. However, the proteoglycan obtained by the standard extraction and purification method cannot be administered to humans, and its value to the human body cannot be verified. Moreover, an attempt to isolate conjugated carbohydrates, i.e., proteoglycan, originating from salmon nasal cartilage, was not made until this method was developed and applied. However, thanks to the present invention, it is possible to extract and purify proteoglycan, which has excellent safe properties and can be obtained in large quantities. Therefore, the need for proteoglycan is becoming more relevant and it is expected that it will have wider application.
Кроме того, поскольку органический растворитель, такой как хлороформ, метанол или ацетон, применяемый для удаления твердого жира из головной части лосося, не используется, то переработки жидких отходов больше не требуется, а следовательно, и решаются проблемы, связанные с загрязнением окружающей среды. Способ настоящего изобретения является простым и эффективным, а протеогликан, полученный указанным способом, является безопасным и может быть введен перорально. Благодаря разработке настоящего изобретения становится возможным получение новых продуктов, которые могут применяться в косметике, немедицинской химии и медицине, а также для изготовления лекарственных препаратов, пищевых продуктов, подвергаемых обработке, диетических пищевых добавок и искусственных внутренних органов. Следовательно, настоящее изобретение вносит огромный вклад в область здравоохранения и медицины.In addition, since an organic solvent, such as chloroform, methanol, or acetone, used to remove solid fat from the salmon head, is no longer required, liquid waste is no longer required, and therefore, environmental pollution problems are solved. The method of the present invention is simple and effective, and the proteoglycan obtained by this method is safe and can be administered orally. Thanks to the development of the present invention, it becomes possible to obtain new products that can be used in cosmetics, non-medical chemistry and medicine, as well as for the manufacture of drugs, processed foods, dietary supplements and artificial internal organs. Therefore, the present invention makes a huge contribution to the field of healthcare and medicine.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (en) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (en) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002104499A RU2002104499A (en) | 2003-09-20 |
| RU2270023C2 true RU2270023C2 (en) | 2006-02-20 |
Family
ID=36051150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002104499/13A RU2270023C2 (en) | 2002-02-20 | 2002-02-20 | Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2270023C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA010724B1 (en) * | 2006-06-22 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Preparation normalizing cartilaginous tissue, and a method for manufacturing thereof |
| RU2401839C2 (en) * | 2006-02-14 | 2010-10-20 | Кусиро Индастриал Текнолоджи Сентер | Proteoglycan synthesis method |
| RU2592850C2 (en) * | 2011-01-19 | 2016-07-27 | Хиросаки Юниверсити | Method for large-scale production of proteoglycan |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0124984A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-11-14 | Arizona Board Of Regents | Marine organism extracts and their preparation |
| US4822607A (en) * | 1976-10-29 | 1989-04-18 | Lescarden Ltd. | Anti-tumor agent and method |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| RU2156132C2 (en) * | 1994-04-28 | 2000-09-20 | Ле Лабораториз Аетерна Инк. | Shark cartilage extracts showing antiangiogenic activity and influencing on tumor regression, methods of their preparing |
-
2002
- 2002-02-20 RU RU2002104499/13A patent/RU2270023C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4822607A (en) * | 1976-10-29 | 1989-04-18 | Lescarden Ltd. | Anti-tumor agent and method |
| EP0124984A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-11-14 | Arizona Board Of Regents | Marine organism extracts and their preparation |
| US5075112A (en) * | 1990-02-12 | 1991-12-24 | Cartilage Technologies Inc. | Method of and dosage unit for inhibiting angiogenesis or vascularization in an animal using shark cartilage |
| RU2156132C2 (en) * | 1994-04-28 | 2000-09-20 | Ле Лабораториз Аетерна Инк. | Shark cartilage extracts showing antiangiogenic activity and influencing on tumor regression, methods of their preparing |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2401839C2 (en) * | 2006-02-14 | 2010-10-20 | Кусиро Индастриал Текнолоджи Сентер | Proteoglycan synthesis method |
| EA010724B1 (en) * | 2006-06-22 | 2008-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс" | Preparation normalizing cartilaginous tissue, and a method for manufacturing thereof |
| RU2592850C2 (en) * | 2011-01-19 | 2016-07-27 | Хиросаки Юниверсити | Method for large-scale production of proteoglycan |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3731150B2 (en) | Purification method of cartilage-type proteoglycan | |
| JP4420470B2 (en) | Abalone polysaccharide extraction method | |
| RU2592850C2 (en) | Method for large-scale production of proteoglycan | |
| JP2011520927A (en) | Collagen peptide with immunity-enhancing activity derived from the yellow jellyfish and its preparation and use | |
| Wang et al. | Sulfated glycosaminoglycan-derived oligosaccharides produced from chicken connective tissue promote iron uptake in a human intestinal Caco-2 cell line | |
| FI104974B (en) | glycogen polysaccharides | |
| Aidos et al. | Collagen content in farmed Atlantic salmon (Salmo salar L.) | |
| Lalarukh et al. | Innovation of advanced polymers from seafood waste: Applications of chitin and chitosan | |
| RU2270023C2 (en) | Method for extraction and purification of cartilage-type proteoglycan (variants) | |
| JP2001172296A (en) | Purification method of cartilage type proteoglycan | |
| KR20180065188A (en) | pomegranate drink comprising marine collagen and manufacturing method thereof | |
| JP5043215B1 (en) | Type II collagen obtained by a simple extraction method from sturgeon notochord | |
| US20110288283A1 (en) | Process for producing glycosaminoglycans | |
| KR102180261B1 (en) | Method for extraction of heparin derived from by-product of pork | |
| CN115232203A (en) | Method for extracting collagen | |
| CN116120483B (en) | Chondroitin sulfate C derived from fish bones, preparation method and application thereof | |
| AU2021100407A4 (en) | Mollusc heparin with a mild anticoagulant effect and preparation method and use thereof | |
| CN1584044A (en) | Preparing method for antler polypeptide or tortoise plastron polypeptide | |
| CN113528605B (en) | A method for ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis to prepare monocyclic thorn viscera antioxidant peptides | |
| KR20030068215A (en) | A method for extraction and purification of cartilage type proteoglycan | |
| JP2007224286A (en) | Method for obtaining polysaccharides from biological tissues | |
| CN101481411A (en) | A group of Eriocheir sinensis allergen proteins and preparation thereof | |
| CN108314726B (en) | Giant salamander skin collagen extraction method and collagen product extracted by same | |
| RU2289956C1 (en) | Method for production of complex biologically active food supplement based on sea hydrobionts (variants) | |
| CN118620102A (en) | Method for extracting chondroitin sulfate by enzyme-deep eutectic solvent coupling |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080221 |