RU2265667C2 - Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis - Google Patents
Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2265667C2 RU2265667C2 RU2003138290/13A RU2003138290A RU2265667C2 RU 2265667 C2 RU2265667 C2 RU 2265667C2 RU 2003138290/13 A RU2003138290/13 A RU 2003138290/13A RU 2003138290 A RU2003138290 A RU 2003138290A RU 2265667 C2 RU2265667 C2 RU 2265667C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- isolates
- pcr
- dna
- vaccine strain
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС) и оценки эффективности противоэпизоотических мероприятий, основанных на использовании аттенуированных вакцин на основе штамма ТК-А.The invention relates to biotechnology, namely to genetic engineering, and can be used in veterinary virology to detect infectious diseases of farm animals, in particular infectious rhinotracheitis of cattle (RTI) and to evaluate the effectiveness of anti-epizootic measures based on the use of attenuated vaccines based on the strain TK-A.
Известен способ выявления ДНК вируса при помощи метода молекулярной гибридизации, включающий клонирование Hind111 фрагмента ДНК вируса ИРТ КРС в вектор, в который затем вводится биотин. При этом в качестве вектора используют однонитиевую ДНК фага М13mp8, а в качестве метки используют биотин, который вводится в вектор путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям. Чувствительность выявления ДНК вируса ИРТ КРС при этом составляет 104-5ТЦД50/мл (См. патент РФ № 2054487, кл. C 12 Q 1/68, от 1996 г.).A known method for detecting viral DNA using the method of molecular hybridization, including the cloning of the Hind111 DNA fragment of the cattle ИРТ virus into a vector into which biotin is then introduced. At the same time, single-stranded DNA of phage M13mp8 is used as a vector, and biotin is used as a label, which is introduced into the vector by chemical modification of DNA by cytosine units. The sensitivity of detecting RTI virus DNA from cattle in this case is 10 4-5 TCD 50 / ml (See RF patent No. 2054487, class C 12 Q 1/68, 1996).
К недостаткам данного способа можно отнести длительную процедуру клонирования фрагмента ДНК вируса в векторную ДНК и мечения биотином, недостаточную чувствительность выявления ДНК вируса, равную 104-5 ТЦД50/мл, а также невозможность определения различий между штаммами вируса и проведения дифференциации между вакцинным штаммом и полевыми штаммами и изолятами вируса.The disadvantages of this method include the lengthy procedure for cloning a viral DNA fragment into vector DNA and biotin labeling, the insufficient sensitivity of detecting virus DNA equal to 10 4-5 TCD 50 / ml , and the inability to determine the differences between virus strains and differentiation between the vaccine strain and field strains and isolates of the virus.
Наиболее близким решением, принятым за прототип, является следующий способ выявления ДНК вируса ИРТ КРС, а также родственных герпесвирусов жвачных, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение ДНК вируса из вируссодержащей суспензии, синтез олигонуклеотидных праймеров на ген гликопротеина В (gB), амплификацию ДНК вируса в гнездовой ПЦР, специфическую идентификацию ДНК вирусов с помощью электрофореза, которую проводят при помощи обработки продуктов ПЦР рестриктазами Fnu4H1 и Sau961. Полученные продукты разделяют путем электрофореза в 3% геле агарозы. Праймеры для первого раунда амплификации:The closest solution adopted for the prototype is the following method for detecting RTI virus DNA from cattle, as well as related ruminant herpes viruses, based on the polymerase chain reaction (PCR), including the isolation of virus DNA from a virus-containing suspension, the synthesis of oligonucleotide primers for the glycoprotein B gene (gB) amplification of virus DNA in nested PCR; specific identification of virus DNA by electrophoresis, which is carried out by processing PCR products with restriction enzymes Fnu4H1 and Sau961. The resulting products are separated by electrophoresis in 3% agarose gel. Primers for the first round of amplification:
5'-TCGAARGCCGAGTACCTGCG-3';5'-TCGAARGCCGAGTACCTGCG-3 ';
5'-CCAGTCCCAGGCRACCGTCAC-3'; положение 56494.5'-CCAGTCCCAGGCRACCGTCAC-3 '; position 56494.
Праймеры для второго раунда:Primers for the second round:
5'-TGGTGGCCTTYGACCGCGAC-3';5'-TGGTGGCCTTYGACCGCGAC-3 ';
5'-GCTCCGGCGAGTAGCTGGTGTG-3'; положение 56378.5'-GCTCCGGCGAGTAGCTGGTGTG-3 '; position 56378.
Выбор позиций основывается на анализе полного генома BHV-1 (генБанк) (С.Ros and S.Belak. Studies of Genetic Relationship between Bovine, Caprine, Cervine, and Rangiferine Alphaherpesviruses and Improved Molecular Methods for Virus Detection and Identification // Journal of Clinical Microbiology. - 1999, vol.37. № 5. - Р. - 51247-1253).The choice of positions is based on the analysis of the complete BHV-1 genome (genebank) (C. Ros and S.Belak. Studies of Genetic Relationship between Bovine, Caprine, Cervine, and Rangiferine Alphaherpesviruses and Improved Molecular Methods for Virus Detection and Identification // Journal of Clinical Microbiology. - 1999, vol. 37. No. 5. - R. - 51247-1253).
К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР, требующей синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и соответственно проведения реакции в два раунда. Кроме того, данный способ разработан только для выявления и дифференциации ДНК серологически родственных герпесвирусов: крупного рогатого скота (ИРТ КРС, герпес-вирус 2 и 4 типов), коз и оленей, и не позволяет проводить дифференциацию штаммов и изолятов внутри вида (ИРТ КРС), в частности отличать вакцинный штамм от эпизоотических штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС.The disadvantages of this method include the fact that it is carried out by the method of nested PCR, which requires the synthesis of two pairs of primers (internal and external) and, accordingly, the reaction in two rounds. In addition, this method was developed only for the detection and differentiation of DNA of serologically related herpes viruses: cattle (RTI cattle, herpes virus types 2 and 4), goats and deer, and does not allow differentiation of strains and isolates within the species (RTI) , in particular, to distinguish a vaccine strain from epizootic strains and isolates of the RTI virus of cattle.
Технической задачей изобретения является разработка нового эффективного метода выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС) с последующей дифференциацией вакцинного штамма ТК-А от эпизоотических штаммов и изолятов вируса при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, ПДРФ-анализ).An object of the invention is to develop a new effective method for detecting the virus of infectious rhinotracheitis of cattle (RTI), followed by differentiation of the vaccine strain TK-A from epizootic strains and virus isolates using PCR-RFLP analysis (analysis of restriction fragment length polymorphism, RFLP analysis )
Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности выявления ДНК вируса за счет проведения ПЦР, а также возможность проведения дифференциации вакцинного штамма от эпизоотических штаммов и изолятов вируса в ПДРФ анализе при помощи рестрикции продуктов диагностической ПЦР. При анализе продуктов диагностической ПЦР эндонуклеазой рестрикции Sac II в 2% геле агарозы штаммы и изоляты вируса образуют разное количество полос: ДНК вакцинного штамма ТК-А образует одну полосу размером 464 п.н., ДНК эпизоотических штаммов и изолятов - две размером 343 и 121 н.п.The technical result of the invention is to increase the specificity and sensitivity of detecting virus DNA by performing PCR, as well as the ability to differentiate the vaccine strain from epizootic strains and virus isolates in RFLP analysis by restriction of diagnostic PCR products. When analyzing products of diagnostic PCR with a Sac II restriction endonuclease in a 2% agarose gel, the virus strains and isolates form a different number of bands: the vaccine strain TK-A DNA forms one band of 464 bp, the DNA of epizootic strains and isolates two of 343 and 121 n.p.
Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса ИРТ КРС проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей дифференциацией вакцинного штамма ТК-А от эпизоотических штаммов и изолятов при помощи ПЦР-ПДРФ-анализа, включающий амплификацию ДНК вируса инфекционного ринотрахеита, на синтетических олигонуклеотидных праймерах, комплементарных району гена гликопротеина В (gB) вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, перенос продукта амплификации на гель агарозы и оценку проведения реакции, согласно изобретению праймеры имеют нуклеотидные последовательности:The essence of the invention lies in the fact that the detection of the RTI virus of cattle is carried out by the method of polymerase chain reaction (PCR), followed by differentiation of the vaccine strain TK-A from epizootic strains and isolates using PCR-RFLP analysis, including amplification of DNA of infectious rhinotracheitis virus, on synthetic oligonucleotide primers complementary to the region of the gene for the glycoprotein B (gB) virus of the infectious rhinotracheitis cattle, transferring the amplification product to agarose gel and evaluating the reaction, agree primers invention have the nucleotide sequence:
В1 - 5'-ACGTGCTGCTCAACGTGTAC-3'B1 - 5'-ACGTGCTGCTCAACGTGTAC-3 '
B2 - 5'-AGGACGAGCTCGCGGATATA-3'.B2 - 5'-AGGACGAGCTCGCGGATATA-3 '.
Сущность заключается также в том, что оценку проведения диагностической реакции осуществляют по размеру продукта ПЦР, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 464 пар основанийThe essence also lies in the fact that the assessment of the diagnostic reaction is carried out by the size of the PCR product, while the reaction result is considered positive if the PCR product corresponds to the fragment size of 464 base pairs
Сущность заключается также в том, что для определения различий между вакцинным и эпизоотическими штаммами и изолятами вируса проводят рестрикционный анализ продуктов диагностической ПЦР с использованием эндонуклеазы рестрикции Sac II.The essence also lies in the fact that to determine the differences between vaccine and epizootic strains and isolates of the virus restriction analysis of the products of diagnostic PCR using restriction endonuclease Sac II.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
На чертеже изображен ПДРФ-анализ ампликонов вакцинного штамма ТК-А и эпизоотических штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС при помощи эндонуклеазы рестрикции Sac II.The drawing shows the RFLP analysis of amplicons of the vaccine strain TK-A and epizootic strains and isolates of the RTI virus of cattle using restriction endonuclease Sac II.
1 - Маркер молекулярного веса; 2 - вакцинный штамм ТК-А; 3 - изолят ПВМ; 4 - эпизоотический штамм ТК; 5 - изолят П; 6 - изолят ЛК; 7 - эпизоотический штамм Оренбург; 8 - эпизоотический штамм 4016.1 - molecular weight marker; 2 - vaccine strain TK-A; 3 - PVM isolate; 4 - epizootic strain of TK; 5 - isolate P; 6 - LC isolate; 7 - epizootic strain Orenburg; 8 - epizootic strain 4016.
Пример 1. Амплификация участка ДНК вируса ИРТ КРС, кодирующего гликопротеин В.Example 1. Amplification of the DNA portion of the virus of the IRT cattle encoding glycoprotein B.
Полимеразная цепная реакция. Инкубационная смесь конечным объемом 25 мкл содержит: буфер - 60 mM Tris-HCl pH 8.5, 1,5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 10 mM 2-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100, 2 mM dNTP mix - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, 2 mM праймеров (прямой и обратный), 5 ед. термостабильной Taq ДНК-полимеразы (1u/μ1), 0,03γ ДНК-матрицы (5 мкл).Polymerase chain reaction. The incubation mixture with a final volume of 25 μl contains: buffer - 60 mM Tris-HCl pH 8.5, 1.5 mM MgCl 2 , 25 mM KCl, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100, 2 mM dNTP mix - mixture deoxynucleoside triphosphates, 2 mM primers (forward and reverse), 5 units thermostable Taq DNA polymerase (1u / μ1), 0.03γ DNA template (5 μl).
Температурный режим проведения ПЦР: денатурация при 95°С в течении 5 мин - 1 цикл, далее проводят 30 циклов при следующих температурных режимах: 95°С - 1 мин, 54°С - 1 мин, 72°С - 1,5 мин, завершающий синтез при 72°С в течение 5 мин.The temperature regime of PCR: denaturation at 95 ° C for 5 min - 1 cycle, then 30 cycles are carried out at the following temperature conditions: 95 ° C - 1 min, 54 ° C - 1 min, 72 ° C - 1.5 min, final synthesis at 72 ° C for 5 minutes
Пример 2. Определение размера продуктов диагностической ПЦР.Example 2. Sizing of diagnostic PCR products.
Продукты диагностической ПЦР анализируют методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в стандартном трис-ацетатном или трис-боратном буфере (рН 8,0).Diagnostic PCR products are analyzed by electrophoresis in 1-2% agarose gel in standard Tris-acetate or Tris-borate buffer (pH 8.0).
10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 40-60 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».10 μl of PCR product is mixed with 2 μl of sample application buffer and added to a well of agarose gel. Electrophoresis is carried out at a voltage of 10 V / cm of the gel length until the dye passes from the start of at least half of the gel (about 40-60 minutes). The results of electrophoresis are taken into account when viewing the gel in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm on a Transilluminator instrument.
Маркер молекулярного веса состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC 19 эндонуклеазой рестрикции Msp1. Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 464 нуклеотидные пары.The molecular weight marker consists of the DNA cleavage products of plasmid pUC 19 with the restriction endonuclease Msp1. The PCR result is considered positive if the PCR product corresponds to a fragment size of 464 nucleotide pairs.
Чувствительность ПЦР в таких условиях составляет 102 ТЦД50/мл.The sensitivity of PCR under such conditions is 10 2 TCD 50 / ml .
Пример 3. Определение специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на ген гликопротеина В.Example 3. Determination of the specificity of PCR based on synthetic primers synthesized on the gene of glycoprotein B.
Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в табл.1.The results of experiments to determine the specificity of the reaction are presented in table 1.
Пример 4. Выявление ДНК Российских референтных штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС, типированных в реакции нейтрализации в культуре клеток.Example 4. Detection of DNA of the Russian reference strains and isolates of the IRT virus of cattle typed in the neutralization reaction in cell culture.
К 250 мкл осветленной суспензии вируса добавляют 30 мкл 10-кратного ТЕ, 15 мкл протеиназы К (конц. 2 мг/мл), 30 мкл 10%-ного SDS. Инкубируют в суховоздушном микротермостате при 50-56°С в течение 1-2 часов. Затем добавляют равный объем (300 мкл) фенола, перемешивают и осаждают центрифугированием при 9000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают супернатант в чистую пробирку, приливают по 0,5 объема фенола и хлороформа, повторяют центрифугирование. Отобранный супернатант смешивают с равным объемом хлороформа, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 мин. К отобранному супернатанту добавляют 2,5 объема 96%-ного охлажденного этанола и 0,1 объема 3М ацетата натрия и выдерживают при -20°С в течение 2-12 часов. После этого содержимое пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 мин, сливают супернатант, а осадок промывают 2 раза 70%-ным этанолом и высушивают. Затем к осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды или ТЕ-буфера и ресуспендируют. ПЦР проводят согласно примеру 1, в качестве матрицы используют 5 мкл полученной пробы.30 μl of 10-fold TE, 15 μl of Proteinase K (conc. 2 mg / ml), 30 μl of 10% SDS are added to 250 μl of the clarified virus suspension. Incubated in a dry air microthermostat at 50-56 ° C for 1-2 hours. An equal volume (300 μl) of phenol is then added, mixed and precipitated by centrifugation at 9000 rpm for 10 minutes. Select the supernatant in a clean tube, add 0.5 volumes of phenol and chloroform, centrifugation is repeated. The selected supernatant is mixed with an equal volume of chloroform, centrifuged at 9000 rpm for 5 minutes. 2.5 volumes of 96% chilled ethanol and 0.1 volumes of 3M sodium acetate were added to the selected supernatant and kept at -20 ° C for 2-12 hours. After that, the contents of the tube are centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, the supernatant is drained, and the precipitate is washed 2 times with 70% ethanol and dried. Then, 30 μl of deionized water or TE buffer was added to the precipitate and resuspended. PCR is carried out according to example 1, as a matrix using 5 μl of the obtained sample.
Результаты тестирования штаммов и изолятов вируса представлены в табл.2.The results of testing strains and isolates of the virus are presented in table.2.
Результаты показали, что ПЦР выявляет ДНК всех исследованных штаммов и изолятов вируса, выделенных в культуре клеток от больных и инфицированных животных и типированных в реакции нейтрализации. Результаты были сходными во всех повторностях.The results showed that PCR reveals the DNA of all the studied strains and isolates of the virus isolated in cell culture from sick and infected animals and typed in the neutralization reaction. The results were similar in all replicates.
Пример 5. Проведение дифференциации между вакцинным штаммом ТК-А и эпизоотическими штаммами вируса.Example 5. Differentiation between the vaccine strain TK-A and epizootic strains of the virus.
Продукты амплификации штаммов вируса ИРТ КРС подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Sac II с целью определения различий между ними.The amplification products of strains of the IRT virus of cattle are subjected to hydrolysis by restriction endonuclease Sac II to determine the differences between them.
Для этого к 5 мкл амплифицированного фрагмента ДНК каждого штамма вируса добавляют 10 единиц активности эндонуклеазы рестрикции и инкубируют при 37°С в течение 2 ч.For this, 10 units of restriction endonuclease activity are added to 5 μl of the amplified DNA fragment of each virus strain and incubated at 37 ° C for 2 hours.
Состав реакционной смеси: буферный раствор, прилагаемый к рестриктазе, 10 единиц активности фермента, 1-2 γ амплифицированной ДНК вируса.The composition of the reaction mixture: buffer solution attached to restrictase, 10 units of enzyme activity, 1-2 γ amplified virus DNA.
Визуализацию проводят при помощи электрофореза в 2%-ном геле агарозы при силе тока 35 мА.Visualization is carried out by electrophoresis in a 2% agarose gel at a current strength of 35 mA.
В результате ДНК вакцинного штамма ТК-А после обработки ферментом образует одну полосу размером 464 п.н., а ДНК эпизоотических штаммов Оренбург, 4016, ТК и М40 - две полосы размером 343 и 121 п.н.As a result, the DNA of the vaccine strain TK-A after treatment with the enzyme forms one band of 464 bp, and the DNA of the epizootic strains Orenburg, 4016, TK and M40 two bands of 343 and 121 bp
Пример 6. Проведение дифференциации между вакцинным штаммом ТК-А и эпизоотическими изолятами вируса, выделенными от больных животных при вспышках ИРТ КРС.Example 6. Differentiation between the vaccine strain TK-A and epizootic virus isolates isolated from sick animals during outbreaks of cattle RTI.
Из проб носовых и вагинальных выделений, спермы, кусочков внутренних органов больных животных готовят 10%-ные суспензии. Суспензии центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин, затем проводят процедуру выделения в чувствительной культуре клеток и типируют при помощи моноспецифической сыворотки к вирусу ИРТ КРС. При положительных результатах типирования изолята в реакции нейтрализации в культуре клеток проводят выделение ДНК полученного изолята согласно примеру 4, затем проводят амплификацию в диагностической ПЦР согласно примерам 1 и 2. При наличии амплифицированного фрагмента размером 464 п.н. проводят его гидролиз эндонуклеазой рестрикции Sac II согласно примеру 5.10% suspensions are prepared from samples of nasal and vaginal secretions, semen, and pieces of the internal organs of sick animals. The suspensions are centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes, then the isolation procedure is carried out in a sensitive cell culture and typed using monospecific serum to the cattle IRT virus. With positive results of typing the isolate in the neutralization reaction in the cell culture, DNA of the obtained isolate is isolated according to Example 4, then amplification is carried out in diagnostic PCR according to Examples 1 and 2. If there is an amplified fragment of 464 bp in size. carry out its hydrolysis with restriction endonuclease Sac II according to example 5.
В случае получения в геле агарозы одной полосы размером 464 п.н. выделенный изолят относят к вакцинному, а в случае получения 2-х полос размером 343 и 121 п.н. его относят к эпизоотическому.In the case of receiving in a gel of agarose of one strip of size 464 bp the isolated isolate is classified as vaccine, and in the case of obtaining 2 bands of 343 and 121 bp in size it is referred to as epizootic.
Результаты типирования изолятов, выделенных от больных животных, представлены в табл.3.The results of typing of isolates isolated from sick animals are presented in Table 3.
Таким образом, изобретение обеспечивает возможность более эффективного выявления ДНК вируса ИРТ КРС, а также дифференциации вакцинного штамма от эпизоотических штаммов и изолятов вируса.Thus, the invention provides the ability to more effectively detect DNA of the RTI virus of cattle, as well as differentiation of the vaccine strain from epizootic strains and isolates of the virus.
Повышается экономическая эффективность противоэпизоотических мероприятий за счет сокращения сроков исследования и расходных материалов.Increases the economic efficiency of antiepizootic measures by reducing the duration of the study and supplies.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003138290/13A RU2265667C2 (en) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003138290/13A RU2265667C2 (en) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003138290A RU2003138290A (en) | 2005-06-10 |
| RU2265667C2 true RU2265667C2 (en) | 2005-12-10 |
Family
ID=35834125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003138290/13A RU2265667C2 (en) | 2003-12-24 | 2003-12-24 | Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2265667C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2323253C1 (en) * | 2006-08-28 | 2008-04-27 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Virulent virus strain bovine herpes virus type 1 for investigation of clinics of cattle infectious rhinotracheitis |
| RU2351656C1 (en) * | 2007-11-07 | 2009-04-10 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | METHOD OF DIFFERENTIATING STRAINS Corynebacterium diphtheriae biovar gravis |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054487C1 (en) * | 1991-07-11 | 1996-02-20 | Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока | Method of detection of cattle infectious rhino-tracheitis virus |
-
2003
- 2003-12-24 RU RU2003138290/13A patent/RU2265667C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054487C1 (en) * | 1991-07-11 | 1996-02-20 | Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока | Method of detection of cattle infectious rhino-tracheitis virus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KIBENGE F.S. et al., "Amplification of strains of bovine herpesvirus l by use of polymerase chain reaction with primers in the thymidine kinase region", Am J Vet Res. 1994 Sep; 55(9): 1206-12. ROCHA M.A. et al., "A high sensitivity-nested PCR assay for BHV-1 detection in semen of naturally infected bulls", Vet Microbiol., 1998 Aug 28; 63(1):1-11. * |
| ROS С. et al., "Studies of genetic relationships between bovine, caprine, cervine, and rangiferine alphaherpesviruses and improved molecular methods for virus detection and identification", J Clin Microbiol. 1999, May; 37(5): 1247-53. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2323253C1 (en) * | 2006-08-28 | 2008-04-27 | Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН) | Virulent virus strain bovine herpes virus type 1 for investigation of clinics of cattle infectious rhinotracheitis |
| RU2351656C1 (en) * | 2007-11-07 | 2009-04-10 | Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | METHOD OF DIFFERENTIATING STRAINS Corynebacterium diphtheriae biovar gravis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003138290A (en) | 2005-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lee et al. | Application of the polymerase chain reaction for the diagnosis of fowl poxvirus infection | |
| Tsai et al. | Development of a loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of orf virus | |
| CN113957172B (en) | Kit for simultaneously detecting various cat pathogens and detection method and application thereof | |
| CN104032037B (en) | A kind of carp simplexvirus detection kit and detection method thereof | |
| CN111118211A (en) | Bovine sarcoidosis detection kit and method based on loop-mediated isothermal amplification technology | |
| Pritchard et al. | Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis | |
| CN103160615A (en) | Multiple PCR primer used for simultaneously detecting infectious Bovine Rhinotracheitis virus and akabane virus as well as its design method | |
| RU2385943C2 (en) | Oligonucleotide primers, method and test system for detecting bluetongue virus genome by polymerase chain reaction in electrophoretic detection of amplification products | |
| CN114790490B (en) | A molecular marker and detection method for distinguishing bovine and melitensis Brucella | |
| CN111088399A (en) | Primer group, kit and method for simultaneously detecting pigeon circovirus, pigeon adenovirus and pigeon herpesvirus type 1 | |
| CN106987657B (en) | Primer combination for identification of bovine virus diarrhea virus and bovine rotavirus and its application | |
| Ihira et al. | Loop-mediated isothermal amplification for discriminating between human herpesvirus 6 A and B | |
| RU2265667C2 (en) | Method for detecting virus irt krs in polymerase chain reaction and following differentiation of vaccine strain tk-a from epizootic strains and isolates by plrf-analysis | |
| CN112831609A (en) | PCR primers, kits and methods for detecting African swine fever virus MGF-505-1R gene | |
| CN107881259A (en) | A kind of pcr amplification primer thing of quick detection infectious bovine rhinotrachetis virus and its application | |
| CN113943833B (en) | Rapid detection method for bovine sarcoidosis virus, goat pox virus and sheep pox virus | |
| CN107164511B (en) | A method for rapid detection of Haemophilus parasuis serotype 4 | |
| EP2659007B1 (en) | Methods for identifying and differentiating viral components of multivalent shipping fever vaccines | |
| RU2125089C1 (en) | Method and set for detection of african plague pig virus dna by method of polymerase chain reaction | |
| Rojas et al. | Optimization and application of a high-resolution melting protocol in the characterization of avian infectious laryngotracheitis virus | |
| KR101617142B1 (en) | Nucleic acid test based avian influenza virus detection kit with improved detection accuracy | |
| CN116334081A (en) | Method for detecting pathogenic microorganisms based on CRISPR technology | |
| RU2259398C1 (en) | Synthetic oligonucleotide primers and method for detecting cattle infectious rhinotracheitis virus dna using specific oligonucleotide primers in polymerase chain reaction (pcr) | |
| CN106319080A (en) | PCR detection kit for rapidly identifying mycoplasma hyopeumoniae, mycoplasma synoviae and mycoplasma hyorhinis, and applications of PCR detection kit | |
| Marek et al. | Characterization of Austrian koi herpesvirus samples based on the ORF40 region |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171225 |