RU2114915C1

RU2114915C1 - Method of identification of nucleic acid

Info

Publication number: RU2114915C1
Application number: RU93044928A
Authority: RU
Inventors: А.Б. Четверин; Е.В. Четверина
Original assignee: Институт белка РАН
Priority date: 1993-09-14
Filing date: 1993-09-14
Publication date: 1998-07-10

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology. SUBSTANCE: nucleic acids of the preparing sample are identified by its treatment, multiplication of nucleic acids in medium containing cell-free enzyme system and substrates that are necessary for exponential nucleic acids multiplication and contacting with medium components. Then liquid phase of medium is immobilized by its placing in solid base exhibiting the developed surface (an average pore size is from 100 mcm to 5 nm) followed by incubation under conditions providing exponential multiplication of nucleic acids and their detection in nucleic acid sample to be analyzed. EFFECT: improved method of analysis. 3 dwg

Description

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам диагностики нуклеиновых кислот в бесклеточных системах. Преимущественной областью использования является обнаружение специфических нуклеиновых кислот в анализируемом материале. The invention relates to molecular biology and biotechnology, and in particular to methods for the diagnosis of nucleic acids in cell-free systems. The preferred area of use is the detection of specific nucleic acids in the analyzed material.

Известен ряд способов диагностики на основе экспоненциального размножения нуклеиновых кислот в бесклеточных системах, таких, как размножение РНК вирусными РНК-зависимыми полимеразами (ВРП), размножение ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и изотермическая трехферментная система самоподдерживающегося размножения (ЗСР). В отличие от линейного размножения, происходящего, например, при синтезе РНК с помощью ДНК-зависимой РНК полимеразы, число молекул нуклеиновой кислоты в реакции экспоненциального размножения растет как экспоненциальная функция времени, что позволяет быстро получить большое количество нуклеиновой кислоты из небольшого числа исходных матриц-мишеней. В настоящее время реакции экспоненциального размножения проводят в жидкой среде, содержащей компоненты бесклеточной ферментной системы, включающей реакционный буфер, соответствующие ферменты, нуклеотидные субстраты и, когда необходимо, полимеризационные затравки. В этом случае нуклеиновокислотные продукты, синтезируемые на отдельных матрицах, распространяются по всему реакционному объему. A number of diagnostic methods are known based on the exponential propagation of nucleic acids in cell-free systems, such as RNA propagation by viral RNA-dependent polymerases (GRP), DNA multiplication in the polymerase chain reaction (PCR), and isothermal three-enzyme system of self-sustaining reproduction (ZSR). In contrast to the linear multiplication that occurs, for example, during RNA synthesis using DNA-dependent RNA polymerase, the number of nucleic acid molecules in the exponential propagation reaction grows as an exponential function of time, which allows one to quickly obtain a large amount of nucleic acid from a small number of initial target matrices . Currently, exponential propagation reactions are carried out in a liquid medium containing components of a cell-free enzyme system, including a reaction buffer, corresponding enzymes, nucleotide substrates and, when necessary, polymerization seeds. In this case, nucleic acid products synthesized on separate matrices are distributed throughout the reaction volume.

В ВРП реакции экспоненциальный синтез достигается благодаря тому, что как матричная РНК, так и синтезированная РНК остаются однонитевыми и обе служат одинаково эффективными матрицами в последующих циклах репликации. Эта реакция не требует затравок. Вирусные РНК полимеразы, такие, как Qβ репликаза, демонстрируют узкую матричную специфичность, основанную на узнавании ферментом особых структур, которые присутствуют в специфических матричных РНК, но отсутствуют в других РНК. РНК, содержащие такие структуры, называют "реплицирующимися РНК". Другие РНК, не являющиеся реплицирующимися, могут быть размножены в ВРП реакции, если они встроены в цепочку реплицирующейся РНК [1]. Такие рекомбинантные реплицирующиеся РНК были использованы в целях диагностики [2]. In the GRP reaction, exponential synthesis is achieved because both the messenger RNA and the synthesized RNA remain single-stranded and both serve as equally efficient matrices in subsequent replication cycles. This reaction does not require seeds. Viral RNA polymerases, such as Qβ replicase, exhibit narrow matrix specificity based on the recognition by the enzyme of specific structures that are present in specific matrix RNAs, but are absent in other RNAs. RNAs containing such structures are called “replicating RNAs”. Other RNAs that are not replicating can be propagated in the GRP reaction if they are integrated into the chain of replicating RNA [1]. Such recombinant replicating RNAs have been used for diagnostic purposes [2].

ПЦР используют для внеклеточного размножения ДНК. Для осуществления этой реакции необходимы две олигонуклеотидные затравки, которые комплементарны участкам цепочек двунитевой ДНК, ограничивающим размножаемый фрагмент (мишень). Эти затравки отжигаются с ДНК и наращиваются во взаимно встречных направлениях ДНК полимеразой. В отличие от ВРП реакции, матричная и синтезируемая цепочки ДНК оказываются в дуплексе, который необходимо расплавить при повышенной температуре, чтобы разрешить последующие циклы репликации, в которых каждая из цепочек служит матрицей. Процесс многократно повторяется путем циклической смены температур, при которых происходит отжиг затравки и плавление дуплекса ДНК, что приводит к экспоненциальному размножению ДНК-мишени [3]. В настоящее время ПЦР проводят с использованием термоустойчивых ДНК-полимераз, которые выдерживают многократную смену температур без потери активности [4] . Необходимость циклической смены температур требует наличия специального оборудования и делает ПЦР на порядок медленнее ВРП реакции. В то же время любая ДНК-мишень может быть размножена в ПЦР при наличии пары специфических затравок, без надобности в изготовлении рекомбинантной молекулы. PCR is used for extracellular DNA reproduction. To carry out this reaction, two oligonucleotide seeds are necessary, which are complementary to sections of double-stranded DNA chains that limit the propagated fragment (target). These seeds are annealed with DNA and grow in mutually opposite directions by DNA polymerase. Unlike the GRP reaction, the matrix and synthesized DNA strands end up in a duplex, which must be melted at elevated temperature to allow subsequent replication cycles in which each of the strands serves as a matrix. The process is repeated many times by cyclically changing the temperatures at which annealing of the seed and melting of the DNA duplex occurs, which leads to the exponential propagation of the target DNA [3]. Currently, PCR is carried out using heat-resistant DNA polymerases that can withstand multiple temperature changes without loss of activity [4]. The need for cyclic temperature changes requires special equipment and makes PCR an order of magnitude slower than the GRP reaction. At the same time, any target DNA can be propagated by PCR in the presence of a pair of specific seeds, without the need for the manufacture of a recombinant molecule.

Способ размножения нуклеиновых кислот в трехферментной системе самоподдерживающегося размножения (ЗСР) соединяет преимущества ПЦР и ВРП реакции. ЗСР основана на совместном действии трех ферментов: ДНК-зависимой РНК-полимеразы, обратной транскриптазы и РНКазы Н [5]. В качестве стартовой матрицы может служить как фрагмент двунитевой ДНК, несущий на каждом конце промотор какой-либо РНК-полимеразы, так и однонитевая РНК. РНК-полимераза (например, РНК-полимераза фага Т7) использует двунитевую ДНК для синтеза многочисленных однонитевых РНК-транскриптов с последовательности ДНК, лежащей вслед за промотором на каждой цепочке ДНК. Обратная транскриптаза (например, обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц) синтезирует двунитевые кДНК-копии РНК-транскриптов, используя затравки, комплементарные 3'-концам транскриптов и содержащие последовательность промотора РНК-полимеразы для восcтановления этой последовательности на каждом конце кДНК. РНКаза Н разрушает РНК-матрицу, вовлеченную в РНК/ДНК гетеродуплекс после синтеза первой цепи кДНК, тем самым позволяя синтезироваться второй цепи кДНК. Действие РНК-полимеразы и РНКазы Н приводит к образованию однонитевых матриц, что позволяет экспоненциально размножать нуклеиновые кислоты в отсутствие циклического изменения температуры. Скорость ЗСР реакции сравнима со скоростью ВРП реакции, причем подобно ПЦР использование ЗСР не требует создания рекомбинантых нуклеиновых кислот. Продуктом ЗСР реакции является смесь молекул двунитевых ДНК и однонитевых РНК. The method of propagation of nucleic acids in a three-enzyme system of self-sustaining propagation (ZSR) combines the advantages of PCR and GRP reaction. ZSR is based on the combined action of three enzymes: DNA-dependent RNA polymerase, reverse transcriptase, and RNase H [5]. As a starting matrix, a double-stranded DNA fragment carrying a promoter of any RNA polymerase and single-stranded RNA can be used at each end. RNA polymerase (for example, T7 phage RNA polymerase) uses double-stranded DNA to synthesize multiple single-stranded RNA transcripts from the DNA sequence that lies behind the promoter on each DNA strand. Reverse transcriptase (e.g., reverse transcriptase of avian myeloblastosis virus) synthesizes double-stranded cDNA copies of RNA transcripts using seeds complementary to the 3'-ends of the transcripts and containing the RNA polymerase promoter sequence to restore this sequence at each end of the cDNA. RNase H destroys the RNA matrix involved in the RNA / DNA heteroduplex after synthesis of the first cDNA strand, thereby allowing the second cDNA strand to be synthesized. The action of RNA polymerase and RNase H leads to the formation of single-stranded matrices, which allows exponentially multiply nucleic acids in the absence of cyclic temperature changes. The rate of the ZSR reaction is comparable to the rate of the GRP reaction, and like PCR, the use of ZSR does not require the creation of recombinant nucleic acids. The product of the ZSR reaction is a mixture of double-stranded DNA and single-stranded RNA molecules.

Благодаря экспоненциальной природе описанных реакций размножения, каждая из них может теоретически быть использована для быстрого получения многочисленного потомства одиночных молекул нуклеиновых кислот. Это позволило бы создать абсолютный метод диагностики нуклеиновых кислот, поскольку позволило бы размножать до легко детектируемого уровня даже одиночные молекулы мишени или мишень-зависимых реплицирующихся матриц, предложенных Крамером и Лизарди [6]. Однако такая возможность не была до сих пор реализована из-за практических проблем. Due to the exponential nature of the described propagation reactions, each of them can theoretically be used to quickly obtain numerous offspring of single nucleic acid molecules. This would make it possible to create an absolute method for the diagnosis of nucleic acids, since it would allow even single molecules of the target or target-dependent replicating matrices proposed by Kramer and Lizardi to multiply to an easily detectable level [6]. However, such an opportunity has not yet been realized due to practical problems.

Как было заявлено Левисоном и Спигельманом [7], им удалось размножить одиночные молекулы РНК, используя Qβ репликазную систему экспоненциального размножения РНК. Они наблюдали синтез РНК в примерно половине образцов после добавления РНК-матрицы, разбавленной до такой степени, чтобы в среднем получить 0,5 молекулы РНК на образец. Однако в этих экспериментах продукт синтеза не был идентифицирован, а вывод авторов был поставлен под сомнение наблюдением, что синтез РНК в Qβ репликазной системе может происходить даже в отсутствие добавленной матрицы [8]. Недавно было показано, что этот спонтанный синтез РНК вызывается реплицирующимися РНК, загрязняющими окружающее пространство [9]. Из-за этого "шума" со стороны РНКовых загрязнений не удается довести технику диагностики, использующую ВРП, до уровня детектирования одиночных молекул нуклеиновых кислот, так как в среднем образец содержит до 100 посторонних молекул реплицирующихся РНК. В настоящее время практически достижимый предел чувствительности ВРП-диагностики составляет 10³ - 10⁴ молекул мишени в образце [10]. Проблема загрязнений также присуща ПЦР и ЗСР реакции, хотя она и не столь серьезна, как в случае ВРП реакции, поскольку размножение нуклеиновых кислот находится под контролем олигонуклеотидных затравок, комплементарных мишени. Более существенной в этом случае является ограниченная специфичность затравок. Из-за наличия неправильного спаривания оснований и гетерогенности олигонуклеотидных затравок возможен отжиг затравки на чужеродной матрице, присутствующей в образце, который начинает заметно конкурировать с правильным отжигом при понижении доли специфических матриц в образце ниже определенного предела. По крайней мере 100 копий специфической матрицы должно присутствовать в образце для надежного запуска ПЦР [11]. Таким образом, ни один из существующих методов внеклеточного размножения нуклеиновых кислот не позволяет достичь диагностирования одиночных молекул нуклеиновых кислот.As stated by Levison and Spigelman [7], they were able to propagate single RNA molecules using the Qβ replicase system of exponential RNA multiplication. They observed RNA synthesis in about half of the samples after adding an RNA matrix diluted to such an extent that an average of 0.5 RNA molecules per sample was obtained. However, in these experiments, the synthesis product was not identified, and the authors' conclusion was called into question by the observation that RNA synthesis in the Qβ replicase system can occur even in the absence of an added matrix [8]. Recently, it was shown that this spontaneous RNA synthesis is caused by replicating RNAs polluting the surrounding space [9]. Because of this “noise” from the RNA contaminants, it is not possible to bring the diagnostic technique using GRP to the level of detection of single nucleic acid molecules, since the average sample contains up to 100 extraneous replicating RNA molecules. Currently, the practically achievable sensitivity limit for VRP diagnostics is 10 ³ - 10 ⁴ target molecules in the sample [10]. The contamination problem is also inherent in the PCR and ZSR reactions, although it is not as serious as in the case of the GRP reaction, since the multiplication of nucleic acids is controlled by oligonucleotide seeds complementary to the target. More significant in this case is the limited specificity of the seeds. Due to the presence of incorrect base pairing and heterogeneity of oligonucleotide seeds, it is possible to anneal the seeds on a foreign matrix present in the sample, which begins to compete noticeably with the correct annealing while lowering the proportion of specific matrices in the sample below a certain limit. At least 100 copies of the specific template must be present in the sample for reliable PCR start-up [11]. Thus, none of the existing methods for extracellular reproduction of nucleic acids can reach the diagnosis of single nucleic acid molecules.

В качестве прототипа настоящего изобретения может быть взят любой известный способ диагностики, использующий экспоненциальное размножение нуклеиновых кислот в жидкой среде, например размножение рекомбинантных РНК в ВРП реакции [2]. As a prototype of the present invention can be taken any known diagnostic method using exponential multiplication of nucleic acids in a liquid medium, for example, the propagation of recombinant RNA in the GRP reaction [2].

В отличие от известных способов диагностики на основе экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, включая указанный прототип, настоящим изобретением предлагается осуществлять размножение нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде. Возможно использование любых бесклеточных систем экспоненциального размножения нуклеиновых кислот, таких, как ВРП реакция, ПЦР или ЗСР реакция. В отличие от ранее использовавшихся способов размножения нуклеиновых кислот в жидких средах, потомство (клон) каждой одиночной молекулы нуклеиновой кислоты образует колонию молекул в ограниченной зоне вокруг родительской матрицы. Разные колонии занимают, как правило, разные зоны иммобилизованной среды, что позволяет наблюдать индивидуальные колонии по отдельности и обнаруживать в анализируемом образце одиночные молекулы специфических нуклеиновых кислот, несмотря на загрязнение образца посторонними матрицами и на неспецифический отжиг затравок на чужеродных матрицах. In contrast to known diagnostic methods based on exponential propagation of nucleic acids, including this prototype, the present invention proposes to carry out the multiplication of nucleic acids in an immobilized medium. It is possible to use any acellular systems of exponential propagation of nucleic acids, such as the GRP reaction, PCR, or ZSR reaction. Unlike previously used methods of propagation of nucleic acids in liquid media, the offspring (clone) of each single nucleic acid molecule forms a colony of molecules in a limited area around the parent matrix. Different colonies occupy, as a rule, different zones of the immobilized medium, which makes it possible to observe individual colonies separately and to detect single molecules of specific nucleic acids in the analyzed sample, despite the contamination of the sample by extraneous matrices and non-specific annealing of seeds on foreign matrices.

На фиг. 1 схематически изображен рост колоний нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде; на фиг. 2 - колонии РНК, выросшие в тонком слое иммобилизованной среды, содержащей компоненты Qβ репликазной системы; на фиг. 3, 4 - схемы образования мишень-зависимых реплицирующихся матриц. In FIG. 1 schematically depicts the growth of nucleic acid colonies in an immobilized medium; in FIG. 2 - RNA colonies grown in a thin layer of immobilized medium containing components of the Qβ replicase system; in FIG. 3, 4 are diagrams of the formation of target-dependent replicating matrices.

Иммобилизованная среда для размножения нуклеиновых кислот включает жидкую фазу, заключенную в твердой основе. Твердая основа иммобилизованной среды может иметь разнообразную структуру, например пористую, волокнистую, сетчатую, капиллярную, слоистую, складчатую. Основным требованием к твердой основе является наличие развитых поверхностей, пронизывающих жидкую фазу, среднее расстояние между которыми обеспечивает ту или иную степень иммобилизации жидкости за счет ее трения о поверхность и структурирования воды вблизи поверхности. Предпочтительно использовать твердую основу со средним расстоянием между поверхностями (размером "пор") от 100 мкм (крупнопористая основа) до 5 нм (мелкопористая основа). Верхний предел размера пор должен быть меньше расстояния, на которое размножаемые нуклеиновые кислоты способны диффундировать за время инкубации (порядка 1 мм за час инкубации при комнатной температуре для нуклеиновых кислот длиной около 100 нуклеотидов, ср. фиг. 2А - 2Б). Нижний предел размера пор должен быть несколько больше линейных размеров нуклеиновых кислот и/или ферментов, чтобы обеспечить их подвижность, необходимую для протекания реакции размножения. В качестве твердой основы может служить трехмерная сеть, образуемая отдельными молекулами полимеров или их агрегатами; склеенные, спеченные или спрессованные водонерастворимые порошки, мелкие гранулы или кристаллы; губчатые материалы; плотно упакованные волокна, капилляры или пленки (например, полимерная пленка или металлическая фольга). Основными требованиями к материалу, из которого изготавливают твердую основу, является его химическая инертность в условиях инкубации, гидрофильность формируемой им поверхности, а также отсутствие физических воздействий на ферменты (например, их необратимая сорбция на поверхности), влекущих их инактивацию. Подходящими материалами для изготовления твердой основы являются различные органические или неорганические носители, используемые в биотехнологии для хроматографии и электрофореза биополимеров, для иммобилизации ферментов, а также для выращивания микроорганизмов, клеток и вирусов. Примерами таких носителей являются агароза, полиакриламид, желатин, альгинат, карагеннан, целлюлоза, силикагель, губчатый титан, оксиапатит, химически сшитые агароза, декстран и полиэтиленгликоль, а также их комбинации и производные. The immobilized medium for propagation of nucleic acids includes a liquid phase enclosed in a solid base. The solid base of the immobilized medium may have a diverse structure, for example, porous, fibrous, mesh, capillary, layered, folded. The main requirement for a solid base is the presence of developed surfaces that penetrate the liquid phase, the average distance between which provides a degree of immobilization of the liquid due to its friction against the surface and the structuring of water near the surface. It is preferable to use a solid base with an average distance between surfaces (pore size) from 100 μm (large-pore base) to 5 nm (fine-pore base). The upper limit of the pore size should be less than the distance by which the propagated nucleic acids are able to diffuse during the incubation period (about 1 mm per hour of incubation at room temperature for nucleic acids with a length of about 100 nucleotides, cf. Figs. 2A - 2B). The lower limit of pore size should be slightly larger than the linear sizes of nucleic acids and / or enzymes to ensure their mobility necessary for the propagation reaction to proceed. A three-dimensional network formed by individual polymer molecules or their aggregates can serve as a solid base; glued, sintered or pressed water-insoluble powders, fine granules or crystals; sponge materials; tightly packed fibers, capillaries or films (e.g. polymer film or metal foil). The main requirements for the material from which the solid base is made is its chemical inertness under incubation conditions, the hydrophilicity of the surface formed by it, and the absence of physical effects on the enzymes (for example, their irreversible sorption on the surface), which entail their inactivation. Suitable materials for the manufacture of a solid base are various organic or inorganic carriers used in biotechnology for chromatography and electrophoresis of biopolymers, for immobilization of enzymes, as well as for the growth of microorganisms, cells and viruses. Examples of such carriers are agarose, polyacrylamide, gelatin, alginate, carrageenan, cellulose, silica gel, sponge titanium, hydroxyapatite, chemically crosslinked agarose, dextran and polyethylene glycol, as well as combinations and derivatives thereof.

Согласно изобретению иммобилизованная среда для размножения нуклеиновых кислот содержит также компоненты системы размножения, включающей бесклеточную ферментную систему, способную к экспоненциальному размножению нуклеиновых кислот. Примеры таких бесклеточных систем рассмотрены выше. Ферменты, входящие в состав бесклеточной системы, могут быть либо растворены в жидкой фазе, либо иммобилизованы на твердой основе. Реакционный буфер, размножаемые нуклеиновые кислоты, субстраты и (где необходимо) затравки вводят в жидкую фазу. According to the invention, the immobilized medium for propagation of nucleic acids also contains components of a propagation system comprising a cell-free enzyme system capable of exponentially multiplying nucleic acids. Examples of such acellular systems are discussed above. The enzymes that make up the cell-free system can either be dissolved in the liquid phase or immobilized on a solid basis. The reaction buffer, propagated nucleic acids, substrates, and (where necessary) seeds are introduced into the liquid phase.

При размножении в иммобилизованной среде нуклеиновые кислоты образуют колонии, как схематически показано на фиг. 1. На верхней диаграмме представлен фрагмент 11 иммобилизованной среды, образуемой сетью твердой основы 12 и водным раствором 13, содержащим молекулы фермента 14, нуклеиновокислотные матрицы 15, а также субстраты и реакционный буфер. В результате инкубации иммобилизованной среды в течение определенного времени при температурном режиме, подходящем для размножения нуклеиновых кислот, образуются колонии нуклеиновых кислот 16 в зонах локализации родительских матриц. When propagated in an immobilized medium, nucleic acids form colonies, as schematically shown in FIG. 1. The upper diagram shows a fragment 11 of an immobilized medium formed by a solid base network 12 and an aqueous solution 13 containing enzyme molecules 14, nucleic acid matrices 15, as well as substrates and reaction buffer. As a result of incubation of the immobilized medium for a certain time at a temperature suitable for the propagation of nucleic acids, colonies of nucleic acids 16 are formed in the localization zones of the parent matrices.

Предпочтительно, чтобы твердая основа иммобилизованной среды, используемой для размножения, могла обратимо взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Это позволяет существенно подавить диффузию молекул нуклеиновых кислот и получить колонии меньшего размера, с более четкими краями и большей концентрацией нуклеиновых кислот; иными словами, значительно увеличить разрешающую способность метода. Большинство гидрофильных полимеров способно к взаимодействию с нуклеиновыми кислотами благодаря образованию водородных связей. Эта способность может быть усилена путем химической модификации твердой основы положительно заряженными группами, способными к ионным взаимодействиям с фосфатными остатками нуклеиновых кислот, и/или умеренно гидрофобными группами, способными к взаимодействиям с пуриновыми или пиримидиновыми кольцами. Например, твердая основа может быть модифицирована слабокатионными группами, такими, как этиламиноэтильными или диэтиламиноэтильными, или интеркалирующими красителями, такими, как этидиум или пропидиум. Интеркалирующие красители способны к гидрофобным взаимодействиям со стекингованными основаниями нуклеиновых кислот и при этом несут положительный заряд. Preferably, the solid base of the immobilized medium used for propagation can reversibly interact with nucleic acids. This allows you to significantly suppress the diffusion of nucleic acid molecules and to obtain smaller colonies with sharper edges and a higher concentration of nucleic acids; in other words, significantly increase the resolution of the method. Most hydrophilic polymers are capable of interacting with nucleic acids due to the formation of hydrogen bonds. This ability can be enhanced by chemically modifying the solid support with positively charged groups capable of ionic interactions with phosphate nucleic acid residues and / or moderately hydrophobic groups capable of interacting with purine or pyrimidine rings. For example, a solid base can be modified with weakly cationic groups, such as ethylaminoethyl or diethylaminoethyl, or intercalating dyes, such as ethidium or propidium. Intercalating dyes are capable of hydrophobic interactions with stacked nucleic acid bases and at the same time carry a positive charge.

Чтобы предотвратить распространение нуклеиновых кислот в иммобилизованной среде в процессе роста колоний, очень важно не допускать наличие неиммобилизованной жидкости. В частности, нельзя допускать конденсации воды на поверхности иммобилизованной среды. В то же время нельзя допускать и пересыхания иммобилизованной среды, что может приводить к инактивации ферментов. Пересыхание иммобилизованной среды можно предотвратить путем проведения инкубаций в плотно закрытой камере, кассете или запаянном пластиковом пакете, а также оборачиванием среды водонепроницаемой пленкой или наслаиванием минерального масла. To prevent the spread of nucleic acids in the immobilized medium during the growth of colonies, it is very important to prevent the presence of immobilized fluid. In particular, condensation of water on the surface of the immobilized medium cannot be allowed. At the same time, drying of the immobilized medium should not be allowed, which can lead to inactivation of enzymes. Drying of the immobilized medium can be prevented by incubating in a tightly closed chamber, cassette or sealed plastic bag, as well as wrapping the medium with a waterproof film or layering mineral oil.

Предпочтительно, чтобы реакция размножения не начиналась до полной иммобилизации среды. Это условие легко выполнимо в случае ПЦР, так как в этом случае реакция запускается циклическим изменением температуры. В случае реакций изотермического размножения, таких, как ВРП или ЗСР реакция, это условие выполняется либо путем приготовления среды при или около 0^oC, когда скорость реакции мала, либо путем помещения ферментов и субстратов в разные зоны иммобилизованной среды, после чего субстраты диффундируют в ферментную зону, либо путем использования защищенных субстратов (химически недоступных ферменту) с последующим удалением защиты и высвобождением нормального субстрата. Примером защищенного субстрата является светочувствительное производное АТР, в котором γ -фосфат модифицирован 1-(2-нитро)фенилэтильной группой [12] и которое может быть превращено в АТР фотолизом для запуска реакции размножения.Preferably, the propagation reaction does not start until the medium is completely immobilized. This condition is easily satisfied in the case of PCR, since in this case the reaction is triggered by a cyclic change in temperature. In the case of isothermal propagation reactions, such as GRP or ZSR reaction, this condition is fulfilled either by preparing the medium at or about 0 ^o C, when the reaction rate is low, or by placing enzymes and substrates in different zones of the immobilized medium, after which the substrates diffuse into enzyme zone, or by using protected substrates (chemically inaccessible to the enzyme), followed by deprotection and release of the normal substrate. An example of a protected substrate is the photosensitive ATP derivative, in which γ-phosphate is modified by a 1- (2-nitro) phenylethyl group [12] and which can be converted into ATP by photolysis to initiate the propagation reaction.

Предпочтительно использовать иммобилизованную среду, приготовленную в виде тонкого слоя. В этом случае растущие колонии располагаются в двух измерениях, что облегчает их наблюдение и анализ, а также позволяет изготавливать реплики, например, путем частичного переноса колоний на мембранный фильтр. Реплики можно использовать для анализа колоний, для их пересева на новую среду, а также хранить в течение длительного времени. Малая толщина слоя уменьшает температурные градиенты в поперечном направлении (что особенно важно в случае ПЦР) и облегчает диффузию субстратов в ферментный слой при использовании сэндвичевых сред с раздельными ферментным и субстратным слоями (см. ниже). Предпочтительно, чтобы толщина слоя не превышала размера колоний (который определяется, главным образом, скоростью линейной диффузии нуклеиновых кислот), то есть была в пределах нескольких миллиметров. Наиболее предпочтительно использовать очень тонкие слои, так как это повышает разрешающую способность метода. Нижний предел толщины слоя зависит от механической прочности твердой основы, от способности предотвратить пересыхание слоя при манипуляциях и в процессе реакции размножения, а также от чувствительности метода, используемого для анализа колоний. На практике удовлетворительные результаты получаются при толщине слоя от 1 мм до 50 мкм. Конечно, могут быть использованы более толстые (например, 10 мм) и более тонкие (до 1 мкм) слои. Если используют более толстые слои, то предпочтительно помещать ферменты и субстраты в разные слои, которые накладывают друг на друга, и/или вводить анализируемый образец на поверхность слоя или между слоями, чтобы ограничить реакцию размножения и/или экспрессии узкой зоной вблизи поверхностей слоев. Более тонкие слои предпочтительно иммобилизовывать на подложке из прочного материала, такой, как стеклянная, металлическая или пластиковая пластинка или пленка. It is preferable to use an immobilized medium prepared in the form of a thin layer. In this case, the growing colonies are arranged in two dimensions, which facilitates their observation and analysis, and also allows the production of replicas, for example, by partially transferring the colonies to a membrane filter. Replicas can be used to analyze colonies, to transfer them to a new medium, and also to store for a long time. The small thickness of the layer reduces the temperature gradients in the transverse direction (which is especially important in the case of PCR) and facilitates the diffusion of substrates into the enzyme layer when using sandwich media with separate enzyme and substrate layers (see below). Preferably, the layer thickness does not exceed the size of the colonies (which is determined mainly by the linear diffusion rate of nucleic acids), that is, within a few millimeters. It is most preferable to use very thin layers, as this increases the resolution of the method. The lower limit of the layer thickness depends on the mechanical strength of the solid base, on the ability to prevent drying out of the layer during manipulations and in the process of reproduction, as well as on the sensitivity of the method used to analyze colonies. In practice, satisfactory results are obtained with a layer thickness of 1 mm to 50 μm. Of course, thicker (e.g. 10 mm) and thinner (up to 1 μm) layers can be used. If thicker layers are used, it is preferable to place the enzymes and substrates in different layers that are stacked on top of each other, and / or to inject the analyzed sample on the surface of the layer or between layers in order to limit the reaction of propagation and / or expression to a narrow zone near the surfaces of the layers. Thinner layers are preferably immobilized on a substrate of a durable material, such as a glass, metal or plastic plate or film.

Выбор техники приготовления тонких слоев зависит от свойств твердой основы, от температурного режима реакции, от свойств ферментов, используемых для реакции (как, например, их способность переносить условия формирования полимерной основы), а также от того, используют ли однослойную или многослойную иммобилизованную среду. The choice of thin layer preparation technique depends on the properties of the solid base, on the temperature of the reaction, on the properties of the enzymes used for the reaction (such as their ability to tolerate the formation of the polymer base), and whether a single-layer or multi-layer immobilized medium is used.

Однослойные среды удобно использовать, когда все компоненты ферментной системы могут быть смешаны без того, чтобы началась реакция (как в случае ПЦР). Во многих случаях предпочтительно использовать многослойные ("сэндвичевые") среды, в которых разные слои приводятся в непосредственный контакт друг с другом в нужный момент. Например, ферменты и субстраты могут быть разнесены в разные слои и реакция запускаться путем соприкосновения слоев благодаря диффузии субстратов в ферментный слой. Использование сэндвичевых сред может быть предпочтительным и в том случае, если разносить ферменты и субстраты не требуется, как, например, в ПЦР. Например, вторым слоем может быть мембранный фильтр, используемый для анализа колоний, на который нуклеиновые кислоты переносятся одновременно с их синтезом. Single-layer media can be conveniently used when all components of the enzyme system can be mixed without starting the reaction (as in the case of PCR). In many cases, it is preferable to use multilayer ("sandwich") environments in which different layers are brought into direct contact with each other at the right time. For example, enzymes and substrates can be separated into different layers and the reaction is triggered by the contact of the layers due to the diffusion of the substrates into the enzyme layer. The use of sandwich media may also be preferable if the distribution of enzymes and substrates is not required, as, for example, in PCR. For example, the second layer may be a membrane filter used to analyze colonies onto which nucleic acids are transferred simultaneously with their synthesis.

Тонкие слои могут быть изготовлены разными способами, такими, как пропитывание сухой твердой основы растворами, содержащими ферменты и/или субстраты, или включение ферментов и/или субстратов в процессе гелеобразования или синтеза (полимеризации) твердой основы. Thin layers can be made in various ways, such as impregnating a dry solid base with solutions containing enzymes and / or substrates, or incorporating enzymes and / or substrates during gelation or synthesis (polymerization) of the solid base.

Гелеобразующие растворы, такие, как основанные на агарозе, желатине, карагенане, смешивают с ферментами и/или субстратами и заливают, например, в чашки Петри или между двумя ровными поверхностями. В последнем случае можно получить очень тонкие слои геля и избежать образование мениска. Ферменты и/или субстраты могут быть также включены в слой в процессе синтеза твердой основы, например в процессе полимеризации акриламида [13] или фотоиндуцируемой полимеризации этиленгликоля [14]. В тех случаях, когда формирование твердой основы происходит в условиях, слишком жестких для ферментов и/или субстратов, сначала приготавливают твердую основу, а затем пропитывают ее соответствующим раствором. Например, повысить термоустойчивость агарозного геля (чтобы его можно было использовать в ПЦР) можно путем сшивания агарозы эпихлоргидрином или 2,3-дибромпропанолом; термоустойчивый гель можно также получить путем сшивания эпихлоргидрином или N, N-метиленбисакриламидом декстрана [15]. Однако сшивание происходит в условиях, ведущих к инактивации ферментов и субстратов реакции размножения. Поэтому тонкий слой геля сначала формируют в отсутствие ферментов и субстратов и затем пропитывают раствором, содержащим ферменты и/или субстраты. Таким же образом могут быть приготовлены слои из геля на основе полиакриламида или смеси полиакриламида и агарозы. Волокнистые слои (например, основанные на целлюлозе или нейлоне) или пористые слои (например, основанные на силикагеле или губчатом титане) могут быть приготовлены просто пропитыванием соответствующих сухих листов, мембранных фильтров или пластинок раствором, содержащим компоненты системы размножения и/или экспрессии. Gelling solutions, such as those based on agarose, gelatin, carrageenan, are mixed with enzymes and / or substrates and poured, for example, into Petri dishes or between two even surfaces. In the latter case, it is possible to obtain very thin layers of the gel and to avoid the formation of a meniscus. Enzymes and / or substrates can also be included in the layer during the synthesis of a solid base, for example, during the polymerization of acrylamide [13] or photoinduced polymerization of ethylene glycol [14]. In cases where the formation of a solid base occurs under conditions that are too harsh for enzymes and / or substrates, a solid base is first prepared and then impregnated with an appropriate solution. For example, it is possible to increase the thermal stability of an agarose gel (so that it can be used in PCR) by crosslinking the agarose with epichlorohydrin or 2,3-dibromopropanol; a heat-resistant gel can also be obtained by crosslinking dextran with epichlorohydrin or N, N-methylenebisacrylamide [15]. However, crosslinking occurs under conditions leading to the inactivation of enzymes and substrates of the propagation reaction. Therefore, a thin gel layer is first formed in the absence of enzymes and substrates and then impregnated with a solution containing enzymes and / or substrates. In the same way, polyacrylamide gel layers or a mixture of polyacrylamide and agarose can be prepared. Fibrous layers (e.g., based on cellulose or nylon) or porous layers (e.g., based on silica gel or sponge titanium) can be prepared simply by soaking the respective dry sheets, membrane filters or plates with a solution containing components of the propagation and / or expression system.

Образец, содержащий анализируемые нуклеиновые кислоты, вводят в жидкую фазу твердой среды путем включения в ферментный и/или субстратный раствор перед его иммобилизацией или путем нанесения на слой или между слоями. A sample containing the analyzed nucleic acids is introduced into the liquid phase of a solid medium by incorporation into an enzyme and / or substrate solution before its immobilization or by application to or between layers.

Реакцию запускают помещением иммобилизованной среды в соответствующие условия: повышение температуры среды, циклическое изменение температуры, воздействие света, приведение в соприкосновение слоев, содержащих ферменты и субстраты. Среду инкубируют в течение промежутка времени, позволяющего продуктам синтеза накопиться до детектируемого уровня. Необходимо, чтобы в каждой колонии образовалось по крайней мере 10⁶ копий нуклеиновой кислоты (то есть должно произойти по крайней мере 20 циклов репликации при условии, что в каждом цикле число матриц удваивается), что соответствует нижнему пределу чувствительности существующих методов обнаружения нуклеиновых кислот [16].The reaction is started by placing the immobilized medium under appropriate conditions: increasing the temperature of the medium, cyclic temperature change, exposure to light, bringing into contact the layers containing enzymes and substrates. The medium is incubated for a period of time, allowing the synthesis products to accumulate to a detectable level. It is necessary that at least 10 ⁶ copies of nucleic acid are formed in each colony (that is, at least 20 replication cycles should occur, provided that the number of matrices doubles in each cycle), which corresponds to the lower limit of sensitivity of existing nucleic acid detection methods [16 ].

Предложенный способ позволяет обнаруживать одиночные молекулы специфической нуклеиновой кислоты-мишени, даже если образец содержит большое количество чужеродных нуклеиновых кислот, и может быть использован как чрезвычайно чувствительный способ диагностики в клинической и сельскохозяйственной практике и в экологическом мониторинге. Разнообразные образцы, такие, как пробы биологических жидкостей и тканей, а также пробы воды, пищи и воздуха, могут быть исследованы на присутствие определенных вирусов, бактерий и других микроорганизмов или их останков. Способ позволяет также диагностировать наследственные и онкологические заболевания путем обнаружения соответствующих генов и их транскриптов в высших организмах. Процедура диагностики включает: (а) получение образца, подозреваемого на содержание искомых нуклеиновых кислот (мишени); (б) экспонирование мишени путем соответствующей обработки образца, такой, как экстракция фенолом, или лизис детергентами и/или гуанидинизотиоцианатом; (в) удаление (или разбавление) литического агента, и предпочтительно любого материала, который может мешать анализу, такого, как клеточный дебрис или пыль; (г) размножение мишени, ее фрагмента или мишень-зависимой реплицирующейся матрицы для получения детектируемых колоний в иммобилизованной среде, содержащей подходящую бесклеточную ферментную систему экспоненциального размножения нуклеиновых кислот; (д) обнаружение соответствующих мишени колоний (позитивных колоний) по их способности связывать специфические зонды, например гибридизоваться с мечеными олигонуклеотидами. Даже если среди множества чужеродных колоний встретится одиночная позитивная колония, она будет надежно зарегистрирована этим способом. Возможно количественное определение мишени: с этой целью приготавливают серию разведений образца и подсчитывают число позитивных колоний, полученных для каждого разведения. Способ позволяет также проводить определение одновременно нескольких мишеней (например, нескольких патогенных вирусов). В этом случае стадию (д) проводят с использованием нескольких специфических зондов; каждый зонд испытывают отдельно, либо последовательно, либо параллельно (для чего используют реплики, полученные переносом колоний на мембранные фильтры): или же используют смесь зондов, если все они мечены по-разному. The proposed method allows to detect single molecules of a specific target nucleic acid, even if the sample contains a large number of foreign nucleic acids, and can be used as an extremely sensitive diagnostic method in clinical and agricultural practice and in environmental monitoring. A variety of samples, such as samples of biological fluids and tissues, as well as samples of water, food and air, can be examined for the presence of certain viruses, bacteria and other microorganisms or their remains. The method also allows to diagnose hereditary and oncological diseases by detecting the corresponding genes and their transcripts in higher organisms. The diagnostic procedure includes: (a) obtaining a sample suspected of containing the desired nucleic acid (target); (b) exposing the target by appropriate treatment of the sample, such as phenol extraction, or lysis with detergents and / or guanidine isothiocyanate; (c) removing (or diluting) the lytic agent, and preferably any material that may interfere with analysis, such as cell debris or dust; (d) multiplying a target, a fragment thereof, or a target-dependent replicating matrix to obtain detectable colonies in an immobilized medium containing a suitable cell-free enzymatic system for exponential propagation of nucleic acids; (e) detection of the corresponding target of the colonies (positive colonies) by their ability to bind specific probes, for example, hybridize with labeled oligonucleotides. Even if a single positive colony is found among many foreign colonies, it will be reliably registered in this way. Quantification of the target is possible: a series of dilutions of the sample is prepared for this purpose and the number of positive colonies obtained for each dilution is counted. The method also allows the determination of several targets simultaneously (for example, several pathogenic viruses). In this case, stage (e) is carried out using several specific probes; each probe is tested separately, either sequentially or in parallel (for which replicas obtained by transferring colonies to membrane filters are used): or a mixture of probes is used if they are all labeled differently.

Из-за чрезвычайной чувствительности способа важно исключить возможность загрязнения образца мишенями до стадии размножения. В связи с этим предпочтительно проводить стадии, предшествующие размножению, и последующие стадии (анализ колоний) в разных лабораториях. Предпочтительно выращивать колонии в тонких слоях, помещенных в герметичные кассеты, которые вскрывают только в аналитической лаборатории. Полезно также инактивировать размноженные нуклеиновые кислоты перед вскрытием кассеты. Для этого можно использовать, например, фотоактивируемые производные изопсоралена [17], которые вводят в ростовый слой перед размножением. Эти соединения не мешают размножению, пока не разрушены под действием ультрафиолета (300 - 400 нм). Продукты их распада ковалентно модифицируют пиримидиновые основания, тем самым полностью лишая нуклеиновые кислоты способности служить матрицами для последующего размножения. В то же время сохраняется способность нуклеиновых кислот к специфической гибридизации с нуклеотидными зондами [18]. Важно также постоянно проверять надежность процедуры с помощью контрольных образцов, таких, как не содержащие добавленную мишень (для проверки уровня загрязнений) и содержащие известное количество мишени (для проверки чувствительности процедуры). Due to the extreme sensitivity of the method, it is important to eliminate the possibility of contamination of the sample with targets before the propagation stage. In this regard, it is preferable to carry out the stages preceding reproduction and the subsequent stages (analysis of colonies) in different laboratories. It is preferable to grow colonies in thin layers placed in sealed cassettes, which are opened only in the analytical laboratory. It is also useful to inactivate the multiplied nucleic acids before opening the cassette. For this, for example, photoactivated isopsoralen derivatives can be used [17], which are introduced into the growth layer before propagation. These compounds do not interfere with reproduction until they are destroyed by ultraviolet radiation (300 - 400 nm). The products of their decay covalently modify pyrimidine bases, thereby completely depriving nucleic acids of their ability to serve as matrices for subsequent reproduction. At the same time, the ability of nucleic acids to specific hybridization with nucleotide probes is preserved [18]. It is also important to constantly check the reliability of the procedure using control samples, such as those containing no added target (to check the level of contamination) and containing a known amount of the target (to check the sensitivity of the procedure).

Пример 1. Выращивание колоний РНК с помощью ВРП реакции. Этот пример иллюстрирует способ размножения РНК в тонком слое иммобилизованной среды на примере RQ-РНК, являющихся природными матрицами Qβ репликазы. Порошок низкотемпературной агарозы (ultra-low gelling temperature agarose type IX, Sigma Chemical Company) расплавляют нагреванием в автоклавированном буфере A (80 мМ Трис-HCl pH 7,8, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 20% глицерин), охлаждают до примерно 40^oC и тщательно перемешивают на роторном встряхивателе с концентрированным раствором Qβ репликазы, очищенной как описано Блюменталем [19]. Конечные концентрации агарозы и Qβ репликазы - 2% и 35 мкг/мл соответственно. Затем приготавливают сэндвичевую среду, как описано ниже. Когда необходимо, разведения РНК-мишени вводят в субстратный слой или в промежуток между ферментным и субстратным слоями в виде небольшой аликвоты.Example 1. The cultivation of RNA colonies using the GRP reaction. This example illustrates a method for propagating RNA in a thin layer of immobilized medium using RQ RNAs as natural Qβ replicase matrices. Powder low-temperature agarose (ultra-low gelling temperature agarose type IX, Sigma Chemical Company) is melted by heating in autoclaved buffer A (80 mm Tris-HCl pH 7.8, 2 mm MgCl ₂ , 1 mm EDTA, 20% glycerol), cooled to about 40 ^o C and thoroughly mixed on a rotary shaker with a concentrated solution of Qβ replicase, purified as described by Blumenthal [19]. The final concentrations of agarose and Qβ replicase are 2% and 35 μg / ml, respectively. A sandwich medium is then prepared as described below. When necessary, dilutions of the target RNA are introduced into the substrate layer or between the enzyme and substrate layers in the form of a small aliquot.

130 мкл раствора, содержащего фермент и агарозу, заливают между покровным стеклом, используемом в микроскопии, и большей по размеру пластиковой пластинкой, между которыми имеется зазор 0,4 мм. Покровное стекло осторожно снимают и на агарозу накладывают нейлоновый мембранный фильтр, пропитанный субстратным раствором (по 4 мМ ATP, GTP, CTP и UTP) и высушенный. После инкубации среды в течение 20-40 мин для размножения РНК мембранный фильтр снимают с агарозы и отмывают от невключившихся субстратов. Колонии идентифицируют с помощью гибридизации мембранного фильтра со специфическими зондами, как описано ниже. 130 μl of a solution containing the enzyme and agarose is poured between a microscopic coverslip and a larger plastic plate, between which there is a 0.4 mm gap. The coverslip was carefully removed and a nylon membrane filter impregnated with a substrate solution (4 mM ATP, GTP, CTP and UTP) and dried was applied to the agarose. After incubation of the medium for 20–40 min, the membrane filter is removed from agarose and washed from unincorporated substrates to propagate RNA. Colonies are identified by hybridization of a membrane filter with specific probes, as described below.

РНК пришивают к мембранному фильтру под действием ультрафиолета и гибридизуют с радиоактивно-меченым зондом путем инкубации в запаянном пластиковом пакете между листами фильтровальной бумаги [20]. Температуру гибридизации определяют по известной формуле [21] и оптимизируют в предварительных экспериментах. После гибридизации мембранный фильтр отмывают от негибридизовавшегося зонда и делают радиоавтограф. Для повторной гибридизации того же мембранного фильтра с другим зондом первый зонд отмывают кипячением мембранного фильтра в 0.1% растворе Na-додецилсульфата. На фиг. 2А и 2Б показаны негативы радиоавтографов, полученных в результате последовательной гибридизации одного и того же мембранного фильтра с радиоактивно-мечеными зондами, специфичными к RQ87-3 РНК и RQ135-1 РНК соответственно. Смесь этих РНК была введена в субстратный слой в количестве около 100 копий каждой из них. Этот эксперимент демонстрирует, что разные колонии содержат разные виды РНК и что число колоний соответствует количеству добавленных матриц. RNA is sewn to the membrane filter under the influence of ultraviolet radiation and hybridized with a radiolabeled probe by incubation in a sealed plastic bag between sheets of filter paper [20]. The hybridization temperature is determined by the well-known formula [21] and optimized in preliminary experiments. After hybridization, the membrane filter is washed from the non-hybridized probe and a radio autograph is made. For repeated hybridization of the same membrane filter with another probe, the first probe is washed by boiling the membrane filter in 0.1% Na-dodecyl sulfate solution. In FIG. 2A and 2B show the negatives of radio autographs obtained by sequential hybridization of the same membrane filter with radioactive labeled probes specific for RQ87-3 RNA and RQ135-1 RNA, respectively. A mixture of these RNAs was introduced into the substrate layer in an amount of about 100 copies of each of them. This experiment demonstrates that different colonies contain different types of RNA and that the number of colonies corresponds to the number of matrices added.

Пример 2. Выращивание колоний нуклеиновых кислот с помощью ЗСР реакции. Example 2. The cultivation of colonies of nucleic acids using the ZSR reaction.

Раствор низкотемпературной агарозы в буфере смешивают с ферментами и нуклеиновой кислотой, отожженной с олигонуклеотидными затравками при 65^oC, и заливают ферментный слой как описано в примере 1. В качестве мишени используют РНК, ДНК или их смесь. Используют реакционный буфер, ферменты, затравки и условия инкубации согласно рекомендациям Гуателли и др. [5]. На ферментный слой наслаивают нейлоновый мембранный фильтр, пропитанный субстратным раствором, содержащим по 4 мМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и по 16 мМ ATP, GTP, CTP, UTP в реакционном буфере. После инкубации колонии нуклеиновых кислот идентифицируют при помощи гибридизации мембранного фильтра с меченым зондом, комплементарным внутренней области мишени, как описано в примере 1.A solution of low-temperature agarose in a buffer is mixed with enzymes and nucleic acid annealed with oligonucleotide seeds at 65 ^° C, and the enzyme layer is poured as described in Example 1. RNA, DNA, or a mixture thereof is used as the target. Use reaction buffer, enzymes, seeds and incubation conditions according to the recommendations of Guatelli et al. [5]. A nylon membrane filter impregnated with a substrate solution containing 4 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP and 16 mm ATP, GTP, CTP, UTP in the reaction buffer is layered on the enzyme layer. After incubation, colonies of nucleic acids are identified by hybridization of a membrane filter with a labeled probe complementary to the inner region of the target, as described in example 1.

Пример 3. Выращивание колоний ДНК с помощью ПЦР. Example 3. The cultivation of DNA colonies using PCR.

Все компоненты реакции, включая буфер, термоустойчивую ДНК-полимеразу, образец ДНК, затравки и субстраты, смешивают с дегазированным раствором мономеров (смесь акриламида и N,N-метиленбисакриламида) и катализаторами полимеризации (персульфат аммония и N,N,N',N'-тетраметилендиамин) и заливают тонкий слой геля. По завершении полимеризации на гель наслаивают нейлоновый мембранный фильтр, смоченный в реакционном буфере, оборачивают термостойкой пленкой и помещают гель на металлический термостатируемый столик, температура которого контролируется в требуемом для ПЦР диапазоне автоматическим устройством, включающим два [22] или три [23] водяных термостата и соединенным шлангами с термостатируемым столиком. Используют реакционные компоненты и условия ПЦР, рекомендованные Сэйкай и др. [4]. После 20 - 35 температурных циклов колонии ДНК обнаруживают, как описано выше. Если в качестве образца используют РНК, ее сначала превращают в кДНК [24]. All reaction components, including buffer, heat-resistant DNA polymerase, DNA sample, seeds and substrates, are mixed with a degassed solution of monomers (a mixture of acrylamide and N, N-methylene bisacrylamide) and polymerization catalysts (ammonium persulfate and N, N, N ', N' -tetramethylenediamine) and fill in a thin layer of gel. Upon completion of the polymerization, a nylon membrane filter soaked in the reaction buffer is layered on the gel, wrapped with a heat-resistant film and the gel is placed on a metal thermostatted table, the temperature of which is controlled in the range required for PCR by an automatic device that includes two [22] or three [23] water thermostats and connected by hoses to a thermostatic table. Use the reaction components and PCR conditions recommended by Seikai et al. [4]. After 20 to 35 temperature cycles, DNA colonies are detected as described above. If RNA is used as a sample, it is first converted to cDNA [24].

Пример 4. Использование способа размножения нуклеиновых кислот в иммобилизованных средах для диагностики. Example 4. The use of the method of propagation of nucleic acids in immobilized media for diagnosis.

В этом примере описана процедура, основанная на использовании ВРП системы, так как она включает специальные стадии, связанные с мишень-зависимым синтезом реплицирующихся матриц. Процедуры, использующие ЗСР реакцию и ПЦР, отличаются от описанной главным образом тем, что в них не требуется синтеза реплицирующихся матриц, а специфическое размножение мишени или ее фрагмента достигается благодаря использованию по крайней мере двух мишень-специфичных олигонуклеотидных затравок. This example describes a procedure based on the use of the GRP system, since it involves special stages associated with the target-dependent synthesis of replicating matrices. Procedures using the ZSR reaction and PCR differ mainly from those described in that they do not require the synthesis of replicating matrices, and specific multiplication of the target or its fragment is achieved by using at least two target-specific oligonucleotide seeds.

Образец (например, пробу крови пациента, содержащую примерно 5•10⁶ клеток) обрабатывают 5 М гуанидинизотиоцианатом, что приводит к лизису клеток, денатурации белков (включая нуклеазы), а также высвобождению из клеточного дебриса и денатурации РНК и ДНК [25]. После разбавления гуанидинизотиоцианата до концентрации 2,5 М молекулы мишени вылавливают на магнитный порошок, ковалентно модифицированный олиго(dT), с помощью зондов-ловушек, которые содержат участок, комплементарный молекуле мишени, и участок, состоящий из поли(dA), комплементарный олиго(dT) [26]. Магнитный порошок промывают, отделяя его от жидкости осаждением в магнитном поле, связанные молекулы мишени высвобождают в раствор путем нагревания в буфере с низкой концентрацией соли и проводят мишень-зависимый синтез реплицирующихся матриц [6] одним из способов, описанных ниже.A sample (for example, a patient’s blood sample containing approximately 5 • 10 ⁶ cells) is treated with 5 M guanidine isothiocyanate, which leads to cell lysis, protein denaturation (including nucleases), as well as release from the cell debris and denaturation of RNA and DNA [25]. After diluting the guanidine isothiocyanate to a concentration of 2.5 M, the target molecules are captured on magnetic powder covalently modified oligo (dT) using trap probes that contain a site complementary to the target molecule and a site consisting of poly (dA), complementary oligo ( dT) [26]. The magnetic powder is washed, separating it from the liquid by magnetic field precipitation, the bound target molecules are released into the solution by heating in a buffer with a low salt concentration and the target-dependent synthesis of replicating matrices is carried out [6] using one of the methods described below.

(а) Молекулы мишени гибридизуют с частями бинарного зонда, которые затем лигируют с помощью ДНК-лигазы для получения полного ДНК- зонда (фиг. 3). Части бинарного зонда представляют собой две однонитевые молекулы ДНК, которые содержат на лигируемых концах нуклеотидные последовательности, комплементарные двум соседним участкам молекулы мишени, и также включают в себя последовательности, кодирующие взаимно дополняющие части реплицирующейся РНК. На 3' конце одной из молекул находится двунитевой промотор Т7 РНК-полимеразы, предназначенный для транскрипции лигированного зонда. Части бинарного зонда могут быть лигированы только в том случае, если они одновременно гибридизованы с соседними участками одной и той же молекулы мишени, и только в этом случае может быть получен транскрипт, способный к репликации в ВРП реакции. (a) Target molecules hybridize with parts of the binary probe, which are then ligated using DNA ligase to obtain a complete DNA probe (Fig. 3). Parts of a binary probe are two single-stranded DNA molecules that contain nucleotide sequences complementary to two adjacent regions of the target molecule at the ligated ends and also include sequences encoding the mutually complementary parts of the replicating RNA. At the 3 'end of one of the molecules is a double-stranded T7 RNA polymerase promoter designed for transcription of a ligated probe. Parts of a binary probe can be ligated only if they are simultaneously hybridized with neighboring regions of the same target molecule, and only in this case a transcript capable of replication in the GRP reaction can be obtained.

(б) Второй способ похож на первый, с той разницей, что полный бинарный зонд образуется в результате мишень-зависимой элонгации его частей (обозначено пунктирными линиями), которые здесь выступают в качестве затравок ДНК-полимеразной реакции (фиг. 4). Одна из частей зонда, несущая промотор Т7 РНК-полимеразы, гибридизуется с молекулой мишени и удлиняется с помощью ДНК-полимеразы на мишени как на матрице (или с помощью обратной транскриптазы, если в качестве мишени выступает РНК), как показано на верхней диаграмме. После расплавления полученного дуплекса удлиненная первая часть зонда выступает в качестве матрицы для удлинения второй части зонда (во встречном направлении), в результате чего образуется полный ДНК-зонд, содержащий функциональный двунитевой Т7 промотор (средняя диаграмма). Как и в первом случае, образование полного зонда возможно только при наличии в образце мишени. (b) The second method is similar to the first, with the difference that a complete binary probe is formed as a result of target-dependent elongation of its parts (indicated by dashed lines), which here act as seeds of the DNA polymerase reaction (Fig. 4). One part of the probe carrying the T7 RNA polymerase promoter hybridizes with the target molecule and is extended using DNA polymerase on the target as on a matrix (or using reverse transcriptase if the target is RNA), as shown in the upper diagram. After melting the obtained duplex, the elongated first part of the probe acts as a matrix for lengthening the second part of the probe (in the opposite direction), resulting in the formation of a complete DNA probe containing a functional double-stranded T7 promoter (middle diagram). As in the first case, the formation of a complete probe is possible only if there is a target in the sample.

В обоих способах после получения полного ДНК-зонда приготавливают серию разведений, которые вводят вместе с субстратами в нейлоновый мембранный фильтр, как описано в примере 1, или между мембранным фильтром и агарозным слоем. Помимо ВРП, агарозный слой содержит Т7 РНК-полимеразу [27], которая осуществляет транскрипцию молекул ДНК- зонда в тех местах, где они оказались в процессе приготовления иммобилизованной среды. Транскрипция приводит к образованию молекул реплицирующейся рекомбинантной РНК, несущей в средней части копию участка мишени (обозначена двойными линиями на нижних диаграммах фиг. 3 и 4). РНК-транскрипты размножают с помощью ВРП с образованием колоний РНК. Позитивные колонии идентифицируют и отличают от колоний, не несущих копии участка мишени, путем гибридизации с меченым олигонуклеотидным зондом, который комплементарен этому участку, как описано в примере 1. In both methods, after preparation of the complete DNA probe, a series of dilutions is prepared, which are introduced together with the substrates into the nylon membrane filter, as described in Example 1, or between the membrane filter and the agarose layer. In addition to GRP, the agarose layer contains T7 RNA polymerase [27], which transcribes DNA probe molecules in those places where they were in the process of preparing the immobilized medium. Transcription leads to the formation of molecules of replicating recombinant RNA carrying in the middle part a copy of the target site (indicated by double lines in the lower diagrams of Figs. 3 and 4). RNA transcripts are propagated using GRP to form RNA colonies. Positive colonies are identified and distinguished from colonies that do not carry a copy of the target region by hybridization with a labeled oligonucleotide probe, which is complementary to this region, as described in Example 1.

Литература:
1. Miele, A. A., Mills, D.R. and Kramer, F.R. (1983). Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA. J. Mol. Biol. 171, 281-295.Literature:
1. Miele, AA, Mills, DR and Kramer, FR (1983). Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA. J. Mol. Biol. 171, 281-295.

2. Lizardi, P.M., Guerra, C.E., Lomeli, H., Tussie-Luna, l. and Kramer, F. R. (1988). Exponential Amplification of Recombinant- RNA Hybridization Probes. Bio/Technology 6, 1197-1202 (прототип). 2. Lizardi, P.M., Guerra, C.E., Lomeli, H., Tussie-Luna, l. and Kramer, F. R. (1988). Exponential Amplification of Recombinant- RNA Hybridization Probes. Bio / Technology 6, 1197-1202 (prototype).

3. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnheim, N. (1985). Enzymatic Amplification of β -Globin Genomic Sequence and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 230, 1350-1354. 3. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A. and Arnheim, N. (1985). Enzymatic Amplification of β -Globin Genomic Sequence and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 230, 1350-1354.

4. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R. , Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988). Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239, 487-491. 4. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988). Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239, 487-491.

5. Guatelli, J.C., Whitfield, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richman, D.D. and Gingeras, T. R. (1990). Isothermal, in vitro Amplification of Nucleic Acids by a Multienzyme Reaction Modeled after Retroviral Replication. Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878. 5. Guatelli, J.C., Whitfield, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richman, D.D. and Gingeras, T. R. (1990). Isothermal, in vitro Amplification of Nucleic Acids by a Multienzyme Reaction Modeled after Retroviral Replication. Proc. Nail. Acad Sci. U.S.A. 87, 1874-1878.

6. Kramer, F. R. and Lizardi, P. M. (1989). Replicatable RNA Reporters. Nature 339, 401-402. 6. Kramer, F. R. and Lizardi, P. M. (1989). Replicatable RNA Reporters. Nature 339, 401-402.

7. Levisohn, R. and Spiegelman, S. (1968). The Cloning of a Self-replicating RNA Molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 866-872. 7. Levisohn, R. and Spiegelman, S. (1968). The Cloning of a Self-replicating RNA Molecule. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 60, 866-872.

8. Sumper, M. and Luce, R. (1975). Evidence for de novo Production of Self-replicating and Environmentally Adapted RNA Structures by Bacteriophage Qβ Replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 162-166. 8. Sumper, M. and Luce, R. (1975). Evidence for de novo Production of Self-replicating and Environmentally Adapted RNA Structures by Bacteriophage Qβ Replicase. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 72, 162-166.

9. Chetverin, A. B., Chetverina, H. V. and Munishkin, A. V. (1991). On the Nature of Spontaneous RNA Synthesis by Qβ Replicase. J. Mol. Biol. 222, 3-9. 9. Chetverin, A. B., Chetverina, H. V. and Munishkin, A. V. (1991). On the Nature of Spontaneous RNA Synthesis by Qβ Replicase. J. Mol. Biol. 222, 3-9.

10. Lomeli, H., Tayagi, S., Pritchard, C. G., Lizardi, P. M. and Kramer, F. R. (1989). Quantitative Assays Based on the Use of Replicatable Hybridization Probes. Clin. Chem. 35, 1826-1831. 10. Lomeli, H., Tayagi, S., Pritchard, C. G., Lizardi, P. M. and Kramer, F. R. (1989). Quantitative Assays Based on the Use of Replicatable Hybridization Probes. Clin. Chem. 35, 1826-1831.

11. Myers, T. W. and Gelfand, D. H. (1991). Reverse Transcription and DNA Amplification by a Thermus thermophilus DNA Polymerase. Biochemistry 30, 7661-7666. 11. Myers, T. W. and Gelfand, D. H. (1991). Reverse Transcription and DNA Amplification by a Thermus thermophilus DNA Polymerase. Biochemistry 30, 7661-7666.

12. Kaplan, J. H. , Forbush, B., III and Hoffman, J. F. (1978). Rapid Photolytic Release of Adenosine 5'-Triphosphate from a Protected Analogue: Utilization by the Na:K Pump of Human Red Blood Cell Ghosts. Biochemistry 17, 1929-1935. 12. Kaplan, J. H., Forbush, B., III and Hoffman, J. F. (1978). Rapid Photolytic Release of Adenosine 5'-Triphosphate from a Protected Analogue: Utilization by the Na: K Pump of Human Red Blood Cell Ghosts. Biochemistry 17, 1929-1935.

13. O'Driscoll, K. F. (1976). Techniques of Enzyme Entrapment in Gels. Methods Enzymol. 44, 169-183. 13. O'Driscoll, K. F. (1976). Techniques of Enzyme Entrapment in Gels. Methods Enzymol. 44, 169-183.

14. Nojima, S. and Yamada, T. (1987). Large-scale Production of Photo-cross-linkable Resin-immobilized Yeast and Its Application to Industrial Ethanol Production. Methods Enzymol. 136, 380-394. 14. Nojima, S. and Yamada, T. (1987). Large-scale Production of Photo-cross-linkable Resin-immobilized Yeast and Its Application to Industrial Ethanol Production. Methods Enzymol. 136, 380-394.

15. Osterman, L. A. (1986). Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Vol. 3. Springer-Verlag, New York. 15. Osterman, L. A. (1986). Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Vol. 3. Springer-Verlag, New York.

16. Landegren, U. , Kaiser, R., Caskey, C. T. and Hood, L. (1988). DNA Diagnostics - Molecular Techniques and Automation. Science 242, 229-237. 16. Landegren, U., Kaiser, R., Caskey, C. T. and Hood, L. (1988). DNA Diagnostics - Molecular Techniques and Automation. Science 242, 229-237.

17. Cimino, G. D., Metchette, K. C., Tessman, J. W., Hearst, J. E. and Isaacs, S. T. (1991). Post-PCR Sterilization: a Method to Control Carryover Contamination for the Polymerase Chain Reaction. Nucleic Acids Res. 19, 99-107. 17. Cimino, G. D., Metchette, K. C., Tessman, J. W., Hearst, J. E. and Isaacs, S. T. (1991). Post-PCR Sterilization: a Method to Control Carryover Contamination for the Polymerase Chain Reaction. Nucleic Acids Res. 19, 99-107.

18. Isaacs, S. T., Tessman, J. W., Metchette, K. C., Hearst, J. E. and Cimino, G. D. (1991) Post-PCR Sterilization: Development and Application to an HIV-I Diagnostic Assay. Nucleic Acids Res. 19, 109- 116. 18. Isaacs, S. T., Tessman, J. W., Metchette, K. C., Hearst, J. E. and Cimino, G. D. (1991) Post-PCR Sterilization: Development and Application to an HIV-I Diagnostic Assay. Nucleic Acids Res. 19, 109-116.

19. Blumenthal, T. (1979). Qβ RNA Replicase and Protein Synthesis Elongation Factors EF-Tu and EF-Ts. Methods Enzymol. 60, 628-638. 19. Blumenthal, T. (1979). Qβ RNA Replicase and Protein Synthesis Elongation Factors EF-Tu and EF-Ts. Methods Enzymol. 60, 628-638.

20. Jones, R. W. and Jones, M. J. (1992). Simplified Filter Paper Sandwich Blot Provides Rapid, Background-free Northern Blots. 20. Jones, R. W. and Jones, M. J. (1992). Simplified Filter Paper Sandwich Blot Provides Rapid, Background-free Northern Blots.

BioTechniques 12, 685-688. BioTechniques 12, 685-688.

21. Bodkin, D. K. and Knudson, D. L. (1985). Sequence Relatedness of Palyam Virus Genes to Cognates of the Palyam Serogroup Viruses by RNA-RNA Blot Hybridization. Virology 143, 55-62. 21. Bodkin, D. K. and Knudson, D. L. (1985). Sequence Relatedness of Palyam Virus Genes to Cognates of the Palyam Serogroup Viruses by RNA-RNA Blot Hybridization. Virology 143, 55-62.

22. Weier, H. U. and Gray, J. W. (1988). A Programmable System to Perform the Polymerase Chain Reaction. DNA 7, 44-47. 22. Weier, H. U. and Gray, J. W. (1988). A Programmable System to Perform the Polymerase Chain Reaction. DNA 7, 44-47.

23. Torgensen, H. , Blaas, D. and Skern, T. (1989). Low Cost Apparatus for Primer-directed DNA Amplification Using Thermus aquaticus-DNA Polymerase. Analyt. Biochem. 176, 33-35. 23. Torgensen, H., Blaas, D. and Skern, T. (1989). Low Cost Apparatus for Primer-directed DNA Amplification Using Thermus aquaticus-DNA Polymerase. Analyt. Biochem. 176, 33-35.

24. Sambrook, J. , Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 24. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.

25. Pellegrino, M. G., Lewin, M. Meyer, W. A., III, Lanciotti, R. S., Bhaduri-Hauck, L., Volsky, D. J., Sakai, K., Folks, T. M. and Gillespie, D. (1987). A Sensitive Solution Hybridization Technique for Detecting RNA in Cells: Application to HIV in Blood Cells. BioTechniques 5, 452-459. 25. Pellegrino, M. G., Lewin, M. Meyer, W. A., III, Lanciotti, R. S., Bhaduri-Hauck, L., Volsky, D. J., Sakai, K., Folks, T. M. and Gillespie, D. (1987). A Sensitive Solution Hybridization Technique for Detecting RNA in Cells: Application to HIV in Blood Cells. BioTechniques 5, 452-459.

26. Morrissey, D. V. , Lombardo, M., Eldredge, J. K., Kearney, K. R., Grody, E. P. and Collins, M. L. (1989). Nucleic Acid Hybridization Assays Employing dA-tailed Capture Probes, I. Multiple Capture Methods. Anal. Biochem. 181, 345-359. 26. Morrissey, D. V., Lombardo, M., Eldredge, J. K., Kearney, K. R., Grody, E. P. and Collins, M. L. (1989). Nucleic Acid Hybridization Assays Employing dA-tailed Capture Probes, I. Multiple Capture Methods. Anal. Biochem. 181, 345-359.

27. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W. and Uhlenbeck, O. C. (1987). Oligoribonucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase and Synthetic DNA Templates. Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798. 27. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W. and Uhlenbeck, O. C. (1987). Oligoribonucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase and Synthetic DNA Templates. Nucleic Acids Res. 15, 8783-8798.

Claims

1. A method for the diagnosis of nucleic acids, which includes obtaining a test sample, processing it, propagating nucleic acids in a medium containing a cell-free enzyme system and substrates necessary for exponential propagation of nucleic acids, contacting with the components of the medium, incubation under conditions that ensure exponential propagation of nucleic acids, and detection in the sample of the studied nucleic acids, characterized in that prior to the start of the incubation, the liquid phase of the medium is immobilized by its closure solid base, having a developed surface with an average pore size of 100 microns - 5 nm.

2. The method according to claim 1, characterized in that the solid base has a porous, fibrous, mesh, capillary, folded or layered structure.

3. The method according to claim 1, characterized in that the solid base comprises a gel-like polymeric substance.

4. The method according to claim 3, characterized in that the gelling polymer substance is selected from the group of substances including agarose, polyacrylamide, their derivatives, or a mixture thereof.

5. The method according to p. 1, characterized in that they use a solid base capable of reversible interaction with nucleic acids.

6. The method according to claim 5, characterized in that they use a solid base chemically modified with positively charged and / or hydrophobic groups.

7. The method according to claim 1, characterized in that at least one of the enzymes that make up the cell-free system is immobilized on a solid basis.

8. The method according to claim 1, characterized in that when immobilizing the liquid phase, the medium is shaped into at least one thin layer.

9. The method according to claim 1, characterized in that the medium is shaped into at least two thin layers superimposed on each other (the shape of a “sandwich”).

10. The method according to claim 8, characterized in that for the preparation of at least one thin layer using a membrane filter.

11. The method according to claim 1, characterized in that the stages preceding the immobilization of the medium are carried out under conditions that prevent the multiplication of these nucleic acids.

12. The method according to claim 11, characterized in that the reproduction of nucleic acids is prevented by spacing the enzymes and substrates that make up the reproduction system in different zones of the environment.

13. The method according to claim 1, characterized in that they use a cell-free reproduction system, including RNA-dependent RNA polymerase and ribonucleotide substrates, and the nucleic acid intended for propagation is obtained in the form of a replicating RNA.

14. The method according to claim 1, characterized in that a cell-free reproduction system is used, including a DNA-dependent RNA polymerase, reverse transcriptase, RNase H, ribonucleotide and deoxyribonucleotide substrates, and seeds complementary to the terminal are added to the nucleic acid intended for propagation. portions of the specified nucleic acid or its fragment, and including the nucleotide sequence of the specified RNA polymerase.

15. The method according to claim 1, characterized in that for the preparation of the medium using a heat-resistant solid base and cell-free reproduction system, including heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase and deoxyribonucleotide substrates, the nucleic acid intended for propagation is obtained in the form of DNA, to which add seeds complementary to the terminal sections of the indicated DNA or its fragment, and to carry out the propagation reaction, cyclic changes in the temperature of the medium between the melting temperature of DNA and rature conducive annealing said primers to the said DNA chains.