RU2194993C2 - Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction - Google Patents
Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2194993C2 RU2194993C2 RU2000132968A RU2000132968A RU2194993C2 RU 2194993 C2 RU2194993 C2 RU 2194993C2 RU 2000132968 A RU2000132968 A RU 2000132968A RU 2000132968 A RU2000132968 A RU 2000132968A RU 2194993 C2 RU2194993 C2 RU 2194993C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hcv
- hepatitis
- infected
- reaction
- antigens
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 16
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 title description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 title description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 title description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 title description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 19
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 36
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 241000272808 Anser Species 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000003811 acetone extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002048 axillary vein Anatomy 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к методу диагностики гепатита С, основанному на прямом выявлении вирусспецифических антигенов и антител к природным белкам ВГС и приспособленным для массовых ускоренных анализов проб крови больных гепатитом С с возможной автоматизацией процесса. The invention relates to medical virology, in particular to a method for the diagnosis of hepatitis C, based on the direct detection of virus-specific antigens and antibodies to natural HCV proteins and adapted for mass accelerated analysis of blood samples of patients with hepatitis C with possible automation of the process.
Существующий в настоящее время метод специфической диагностики гепатита С основан на двух тестах: метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления последовательностей РНК-генома ВГС в сыворотке крови ВГС- инфицированных больных и иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления антител к рекомбинантным структурным и неструктурным белкам ВГС. В редких случаях для диагностики гепатита С используют биопсию печени. The current method for the specific diagnosis of hepatitis C is based on two tests: the polymerase chain reaction (PCR) method for detecting the sequences of the HCV RNA genome in the blood serum of HCV-infected patients and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to detect antibodies to recombinant structural and non-structural proteins HCV. In rare cases, a liver biopsy is used to diagnose hepatitis C.
В то же время известно, что оба этих метода имеют существенные недостатки: 1) метод ПЦР, как правило, дает отрицательные результаты в первые 6 месяцев после инфекции ВГС. Кроме того, ПЦР - дорогостоящий метод, требующий высокой квалификации специалистов, дорогостоящего оборудования, праймеров и реактивов, и поэтому имеет существенные ограничения в использовании его для массового скрининга образцов крови; 2) ИФА позволяет определять специфические антитела к ВГС в крови инфицированных больных. В качестве антигенов в этой реакция используют рекомбинантный нуклеокапсидный белок ВГС и один или несколько рекомбинантных неструктурных белков ВГС. Отсутствие полного набора ВГС-специфических природных белков в этой реакции, в частности поверхностных белков вирионов ВГС - Е2 и Е1, в значительной степени снижает ее чувствительность и часто приводит к отрицательным результатам при исследовании сывороток крови от ВГС-инфицированных больных. At the same time, both of these methods are known to have significant drawbacks: 1) the PCR method, as a rule, gives negative results in the first 6 months after HCV infection. In addition, PCR is an expensive method that requires highly qualified specialists, expensive equipment, primers and reagents, and therefore has significant limitations in its use for mass screening of blood samples; 2) ELISA allows the determination of specific antibodies to HCV in the blood of infected patients. Recombinant HCV nucleocapsid protein and one or more recombinant non-structural HCV proteins are used as antigens in this reaction. The absence of a complete set of HCV-specific natural proteins in this reaction, in particular the surface proteins of HCV virions - E2 and E1, significantly reduces its sensitivity and often leads to negative results in the study of blood serum from HCV-infected patients.
Кроме того, до настоящего времени не разработаны способы прямого определения антигенов, агглютинирующих эритроциты и антигемагглютининов к ВГС в сыворотках крови инфицированных людей, что является необходимым для оценки динамики развития и тяжести инфекции ВГС у инфицированных людей, для оценки специфической и неспецифической противовирусной активности лечебно-профилактических препаратов
До сих пор нет коммерческих тест-систем для обнаружения ВГС-специфических антигенов в сыворотках крови людей и антител к природным, в том числе поверхностным белкам ВГС.In addition, to date, no methods have been developed for the direct determination of antigens that agglutinate red blood cells and anti-hemagglutinins for HCV in the blood serum of infected people, which is necessary to assess the dynamics and severity of HCV infection in infected people, to assess the specific and non-specific antiviral activity of therapeutic and prophylactic preparations
There are still no commercial test systems for the detection of HCV-specific antigens in human serum and antibodies to natural, including surface HCV proteins.
Из литературных данных известны попытки определить ВГС-специфические антигены в крови больных. Антигены ВГС в этих случаях определяют после концентрации больших объемов сыворотки крови с помощью моноклональных антител к рекомбинантному нуклеокапсиду ВГС (Кущ А.А. и др. 1997). Ясно, что этот метод не может получить широкого внедрения в практическое здравоохранение. Известны также данные определения антигенов ВГС методом иммунофлюоресценции и ИФА при биопсии печени больных гепатитом С. Однако и этот метод имеет серьезные ограничения использования его для массового скрининга сывороток крови людей. From literature data, attempts to determine HCV-specific antigens in the blood of patients are known. HCV antigens in these cases are determined after the concentration of large volumes of blood serum using monoclonal antibodies to the recombinant HCV nucleocapsid (Kushch A.A. et al. 1997). It is clear that this method cannot be widely adopted in practical public health. There are also data on the determination of HCV antigens by immunofluorescence and ELISA for liver biopsy of patients with hepatitis C. However, this method also has serious limitations on its use for mass screening of human blood serums.
Ограниченность существующих методов диагностики гепатита С, прежде всего, связана с отсутствием до настоящего времени экспериментальных моделей in vitro и in vivo, которые позволили бы выделять высокопродуктивные антигенно-активные штаммы вируса гепатита С, пригодные для конструирования экономически выгодных диагностических систем. The limitations of existing methods for the diagnosis of hepatitis C are primarily associated with the lack of experimental models in vitro and in vivo to date that would allow the isolation of highly productive antigenically active strains of the hepatitis C virus suitable for constructing cost-effective diagnostic systems.
Возможность создания экспериментальных моделей инфекции, вызванной вирусом гепатита С в культурах клеток различного происхождения и в организме инфицированных животных, реализованная нами ранее, позволила выделить из сыворотки крови людей, инфицированных вирусом гепатита С, высокопродуктивные антигенно-активные варианты вируса гепатита С, изучить их основные свойства и разработать до сих пор неизвестные для ВГС методы диагностики вызываемой им инфекции (П. Г. Дерябин и др., 1997, 1998). Штамм вируса гепатита С (Д-1), выделенный нами из культур клеток, пригодный для приготовления диагностических и профилактических препаратов (патент РФ на изобретение 2130967, приоритет от 07. 10.97 г.). The possibility of creating experimental models of hepatitis C virus infection in cell cultures of various origins and in the body of infected animals, which we realized earlier, made it possible to isolate highly productive antigenically active variants of hepatitis C virus from the blood serum of people infected with hepatitis C virus and to study their main properties and to develop until now unknown methods for diagnosing HCV infection caused by HCV (P. G. Deryabin et al., 1997, 1998). The strain of hepatitis C virus (D-1), isolated by us from cell cultures, suitable for the preparation of diagnostic and prophylactic drugs (RF patent for invention 2130967, priority 07. 10.97 g).
Предложенный способ определения антигенов ВГС основан на способности выявления в крови людей, инфицированных ВГС, антигенов ВГС, обладающих гемагглютинирующей способностью. Гемагглютинины ВГС были обнаружены нами при культивировании ВГС-содержащего материала в культурах клеток различного происхождения, а также в органах и тканях ВГС-инфицированных животных. Как известно, для других представителей семейства Flaviviridae гемагглютинирующая (ГА) активность флавивирусов связана с эпитопами на поверхности белка Е. Результаты исследований показали, что ВГС и все известные генотипы этого вируса, культивируемые в культурах клеток или на уровне организма, как и другие представители семейства Flaviviridae, способны агглютинировать эритроциты при различных значений рН фосфатного буфера. При этом ГА-активность ВГС специфически тормозится в присутствии антител (антигемагглютининов) к ВГС. Это свойство, характерное для многих представителей вирусов семейства Flaviviridae, на протяжении многих лет используется для диагностики флавивирусных инфекций в реакциях РГА и в РТГА, предложенными Clarke и Casals в 1958 г. В отношении вируса гепатита С эти методы определения антигенов и их специфической активности до сих пор не применялись. The proposed method for determining HCV antigens is based on the ability to detect in the blood of people infected with HCV, HCV antigens with hemagglutinating ability. We discovered HCV hemagglutinins during the cultivation of HCV-containing material in cell cultures of various origins, as well as in organs and tissues of HCV-infected animals. As is known, for other representatives of the Flaviviridae family, the hemagglutinating (GA) activity of flaviviruses is associated with epitopes on the surface of protein E. The results of the studies showed that HCV and all known genotypes of this virus, cultivated in cell cultures or at the body level, like other representatives of the Flaviviridae family are able to agglutinate red blood cells at different pH values of phosphate buffer. In this case, the GA activity of HCV is specifically inhibited in the presence of antibodies (antihemagglutinins) to HCV. This property, which is characteristic of many representatives of the viruses of the Flaviviridae family, has been used for many years to diagnose flavivirus infections in the reactions of RGA and in rtga, proposed by Clarke and Casals in 1958. With respect to hepatitis C virus, these methods for determining antigens and their specific activity are still since not used.
В табл.1 представлены данные, демонстрирующие ГА- активность высокопродуктивных вариантов ВГС, выделенных из сыворотки крови больных гепатитом С методом заражения культур клеток различного происхождения. Table 1 presents data demonstrating the HA activity of highly productive HCV variants isolated from the blood serum of hepatitis C patients by infection of cell cultures of various origins.
Как видно из данных табл.1, ГА-активность изолированных вариантов ВГС проявляется при культивировании в культурах клеток различного происхождения. Данные показывают, что репликация ВГС в культурах клеток на всем протяжении сопровождается продукцией антигенов-гемагглютининов ВГС, которые регистрируются до появления цитодеструктивных свойств ВГС. Причем титры гемагглютининов ВГС для культур клеток варьируют и достигают максимальных значений к 72-96 ч после инфекции (1:64 - 1:128). А при коцентрации вируссодержащей культуральной жидкости, собранной из инфицированных культур клеток через 72 или 96 ч после инфекции, после центрифугирования ее при 30000 об/мин в течение 1 ч титры ГА-активность ВГС достигают 1:1024 - 1:2048. Показано, что ГА-активностью обладают все известные генотипы (субтипы) ВГС. Получены данные о ГА-активности антигенов, содержащихся в сыворотках крови, а также в различных органах и тканях мышей, кроликов, инфицированных цитопатогенными вариантами ВГС. As can be seen from the data in Table 1, the HA activity of isolated HCV variants is manifested during cultivation in cell cultures of various origin. The data show that HCV replication in cell cultures throughout is accompanied by the production of HCV hemagglutinin antigens, which are recorded before the cyto-destructive properties of HCV appear. Moreover, the titers of HCV hemagglutinins for cell cultures vary and reach maximum values by 72-96 hours after infection (1:64 - 1: 128). And with the concentration of virus-containing culture fluid collected from infected cell cultures 72 or 96 hours after infection, after centrifuging it at 30,000 rpm for 1 hour, the hepatitis A titers of HCV activity reach 1: 1024 - 1: 2048. It was shown that all known genotypes (subtypes) of HCV possess GA activity. Data on the GA activity of antigens contained in blood serum, as well as in various organs and tissues of mice and rabbits infected with cytopathogenic variants of HCV, were obtained.
Полученные данные позволили предположить наличие антигенной активности ВГС в сыворотках крови инфицированных ВГС людей, обнаруживаемой по способности ВГС к гемагглютинации в классической реакции гемагглютинации (РГА). The data obtained suggest the presence of HCV antigenic activity in the blood serum of people infected with HCV, as detected by the ability of HCV to hemagglutination in the classical hemagglutination reaction (RGA).
Таким образом, в способе обнаружения антигенов ВГС была применена РГА, ранее известная для определения антигенов классических представителей альфа- и флавивирусов (вирусов восточного и венесуэльского энцефаломиелита лошадей, японского и клещевого энцефалитов, лихорадки Западного Нила, денге и др.) и до сих пор не использующаяся для обнаружения антигенов ВГС. Адаптация РГА для определения антигенов ВГС в сыворотках крови людей позволила обнаруживать ВГС-специфический антиген на всем протяжении инфекции, вызванной ВГС, в том числе и в случаях, когда данные высокочувствительного метода ПЦР были отрицательными, включая ранние сроки после инфекции. Определение антигенов ВГС в сыворотках крови людей оказалось наиболее чувствительным методом диагностики гепатита С у людей, использование которого позволяет в короткие сроки устанавливать диагноз инфекции. Простота постановки реакции позволяет использование ее для массового скриннинга проб крови людей на наличие инфекции, вызванной ВГС, для оценки эффективности лечения или профилактики гепатита С различными препаратами, для определения инфекции ВГС при отрицательных данных ПЦР. Показана возможность определения антигенов ВГС как в цельной крови, так и в сыворотках крови, во фракциях эритроцитов и лейкоцитов крови человека. Thus, in the method for detecting HCV antigens, RGA was previously used to determine the antigens of the classical representatives of alpha and flaviviruses (eastern and Venezuelan encephalomyelitis viruses of horses, Japanese and tick-borne encephalitis, West Nile fever, dengue, etc.) and are still not used to detect HCV antigens. Adaptation of RGA for determination of HCV antigens in human blood serum made it possible to detect HCV-specific antigen throughout the course of HCV infection, including in cases where the data of the highly sensitive PCR method were negative, including early terms after infection. The determination of HCV antigens in human blood serum has proven to be the most sensitive method for the diagnosis of hepatitis C in humans, the use of which allows the diagnosis of infection to be established in a short time. The simplicity of the formulation of the reaction allows its use for mass screening of human blood samples for the presence of HCV infection, for evaluating the effectiveness of treatment or prevention of hepatitis C with various drugs, for determining HCV infection with negative PCR data. The possibility of determining HCV antigens both in whole blood and in blood serum, in fractions of human red blood cells and white blood cells has been shown.
Сущность изобретения: основана на выявлени гемагглютинирующей способности антигенов вируса гепатита С. Пробы крови людей, подозрительных на инфекцию вирусом гепатита С, используют в качестве исследуемого антигенсодержащего материала в классической реакции гемагглютинации (РГА) в оптимальной зоне рН фосфатного буфера. Метод определения антигенов ВГС в крови людей позволяет количественно оценивать концентрацию (титры) антигенов (гемагглютининов) ВГС. SUMMARY OF THE INVENTION: based on the detection of the hemagglutinating ability of hepatitis C virus antigens. Blood samples of people suspected of being infected with hepatitis C virus are used as the test antigen-containing material in the classical hemagglutination reaction (RGA) in the optimal pH range of phosphate buffer. The method for the determination of HCV antigens in human blood allows a quantitative assessment of the concentration (titers) of HCV antigens (hemagglutinins).
Специфичность гемагглютинирующей активности (ГА-активности) ВГС подтверждают в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в классической постановке (Clarke и Casals, 1958 г.). Способ обнаружения антител к вирусу гепатита С основан на возможности использования в РТГА в качестве специфических антигенов природных структурных белков вирионов вируса гепатита С, выделенного из культур клеток или органов животных, инфицированных цитопатогенным вариантом ВГС. Использование антигенно-активных природных белков и вирионов ВГС позволяет идентифицировать гемагглютинины в крови ВГС-инфицированных людей как антигены ВГС. The specificity of HCV hemagglutinating activity (GA activity) is confirmed in the classical hemagglutination inhibition test (RTGA) (Clarke and Casals, 1958). A method for detecting antibodies to hepatitis C virus is based on the possibility of using natural structural proteins of hepatitis C virus virions isolated from cell cultures of animals infected with a cytopathic variant of HCV as specific antigens. The use of antigenically active natural proteins and HCV virions allows the identification of hemagglutinins in the blood of HCV-infected people as HCV antigens.
В реакции используют кровь или эритроцитарную или лейкоцитарную фракции крови, или сыворотку из крови человека, взятую в количестве до 100 - 200 мкл (0,1-0,2 мл). Затем сыворотку разводят до 1:10 боратным буферным раствором, содержащим 0,4% бычьего альбумина (рН 9,0). Используя тот же состав боратно-буферного раствора, делают 2-кратные разведения сыворотки, начиная с 1:10, 1: 20, 1:40 и т.д., в 96-луночных панелях с u-образным дном. Эритроциты гуся получают из подкрыльцовой вены гусей-самцов или голубей, используя антикоагулирующий раствор Альзовера. В реакции используют 0,4% взвесь эритроцитов на фосфатном буферном растворе (зона рН 6-7), который готовят перед опытом, смешивая фосфатно-буферные растворы рН 6 и 7. The reaction uses blood or a red blood cell or leukocyte fraction of blood, or serum from human blood, taken in an amount of up to 100 - 200 μl (0.1-0.2 ml). Then the serum is diluted to 1:10 with a borate buffer solution containing 0.4% bovine albumin (pH 9.0). Using the same composition of the borate-buffer solution, 2-fold dilutions of serum are made, starting at 1:10, 1: 20, 1:40, etc., in 96-well panels with a u-shaped bottom. Goose erythrocytes are obtained from the axillary vein of male geese or pigeons using an Alcover anticoagulant solution. The reaction uses a 0.4% suspension of red blood cells in a phosphate buffer solution (pH 6-7 zone), which is prepared before the experiment by mixing phosphate-buffered solutions of pH 6 and 7.
По 20 мкл взвеси эритроцитов гуся вносят в каждую из лунок с разведениями сыворотки крови человека. В качестве контролей в РГА служат: а) 0,4% взвесь эритроцитов, внесенная в лунки с боратным буферным раствором без крови ВГС-инфицированных людей или с кровью заведомо здоровых доноров. Через 1 ч учитывают результаты. Образование плотного осадка эритроцитов на дне лунки свидетельствует об отрицательных результатах. Формирование "зонда" из агглютинированных эритроцитов на всей поверхности эритроцитов свидетельствует о положительной реакции. В контрольных опытах наблюдают формирование плотного осадка эритроцитов. 20 μl of a suspension of goose erythrocytes are added to each of the wells with dilutions of human serum. The following are used as controls in the RGA: a) 0.4% suspension of erythrocytes introduced into wells with borate buffer solution without blood of HCV-infected people or with blood of obviously healthy donors. After 1 h, the results are taken into account. The formation of a dense sediment of red blood cells at the bottom of the hole indicates negative results. The formation of a “probe” from agglutinated red blood cells on the entire surface of red blood cells indicates a positive reaction. In control experiments, the formation of a dense sediment of red blood cells is observed.
Учет результатов основан на подсчете титров антигена ВГС. Результаты считаются положительными, если титр антигенов ВГС в РГА превышает 1:20 - 1: 40. The calculation of results is based on the calculation of HCV antigen titers. The results are considered positive if the titer of HCV antigens in the RGA exceeds 1:20 - 1: 40.
Данный способ определения антигенов ВГС позволяет использовать минимальные объемы сыворотки крови ВГС инфицированных людей, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, а также высокой квалификации персонала. This method of determining HCV antigens allows you to use the minimum volumes of blood serum of HCV infected people, does not require expensive equipment and reagents, as well as highly qualified personnel.
Сущность предложенного способа определения антигемагглютининов заключается в получении культуральных, в том числе концентрированных и очищенных антигенов ВГС или антигенно-активного вируса, антигенов ВГС, полученных методом щелочной или сахарозоацетоновой экстракции - классические способы получения антигенов для большинства вирусных инфекций, описанные в литературе. Антигены ВГС, полученные таким образом, должны обладать высокой гемагглютинирующей активностью, что дает возможность их использования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для определения антигемагглютининов в сыворотках крови ВГС инфицированных людей. РТГА используется в классической постановке, описанной Clarke и Casals (1958 г.). The essence of the proposed method for determining antihemagglutinins is to obtain cultural, including concentrated and purified HCV antigens or antigenically active virus, HCV antigens obtained by alkaline or sucrose acetone extraction - the classical methods for producing antigens for most viral infections described in the literature. HCV antigens obtained in this way must have high hemagglutinating activity, which makes it possible to use them in the hemagglutination inhibition test (RTGA) to determine the hemagglutinins in the blood serum of HCV infected people. RTGA is used in the classic setting described by Clarke and Casals (1958).
В табл.2 представлены данные, полученные в РТГА, о циркуляции в сыворотке крови ВГС инфицированных людей антигемагглютининов ВГС. В частности, показано, что антитела, тормозящие гемагглютинацию ВГС, циркулируют у людей в разные сроки после инфекции ВГС. В то же время антигемагглютинины в более высоких титрах обнаруживают в начале инфекции, когда данные ПЦР не позволяют обнаруживать РНК ВГС. Table 2 presents the data obtained in the rtga on the circulation in the blood serum of HCV of infected people of anti-hemagglutinin HCV. In particular, it has been shown that antibodies inhibiting HCV hemagglutination circulate in people at different times after HCV infection. At the same time, antihemagglutinins in higher titers are detected at the beginning of infection, when PCR data do not allow detection of HCV RNA.
Полученные данные позволяют проследить динамику инфекционного процесса, а наличие антигемагглютининов в сыворотке крови людей позволяет обнаруживать инфекцию ВГС в ранние сроки или оценить действие лечебных препаратов на течение инфекции. The data obtained make it possible to trace the dynamics of the infectious process, and the presence of antihemagglutinins in the blood serum of people allows one to detect HCV infection in the early stages or to evaluate the effect of therapeutic drugs on the course of infection.
Пример 1. Способ определения антигенов - гемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Табл.3, в РГА, поставленной микрометодом с использованием эритроцитов гуся в фосфатном буферном растворе были обследованы 145 образцов сыворотки крови людей, инфицированных ВГС, 182 образца сывороток от людей, не содержащих РНК ВГС и антител к ВГС. Из данных табл.3 видно, что все сыворотки от инфицированных ВГС содержали антигены ВГС, причем максимальные значения титров ГА активности наблюдаются у больных, сыворотки которых содержали как антитела, так и РНК ВГС. Значительно более низкие титры гемагглютининов (1:128 - средние данные) обнаруживали у людей, в сыворотке крови которых не выявлена РНК ВГС. Однако обнаруженная концентрация антигенов ВГС у таких больных (а это больные в ранние сроки после инфекции) дает возможность устанавливать диагноз инфекции в случаях, когда данные ПЦР являются отрицательными. Определение ГА-активности в образцах сывороток крови контрольных групп людей (182 образца) показало, что в среднем эти данные не превышают титров 1:18, что, как известно, скорее всего связано с неспецифическим проявлением ГА-активности у людей: доноров, больных гриппом, гепатитом В, пневмонией и краснухой. Example 1. A method for determining antigens - HCV hemagglutinins in human serum. Table 3, in a RGA, delivered by a micromethod using goose erythrocytes in a phosphate buffer solution, 145 samples of blood serum of people infected with HCV, 182 serum samples from people without HCV RNA and antibodies to HCV were examined. From the data in Table 3, it is clear that all sera from infected HCVs contained HCV antigens, and the maximum values of HA activity titers were observed in patients whose serum contained both antibodies and HCV RNA. Significantly lower hemagglutinin titers (1: 128 - average data) were found in people whose HCV RNA was not detected in the blood serum. However, the detected concentration of HCV antigens in such patients (and these are patients in the early stages after infection) makes it possible to establish a diagnosis of infection in cases where the PCR data are negative. Determination of GA activity in blood serum samples of control groups of people (182 samples) showed that, on average, these data do not exceed titers of 1:18, which, as is known, is most likely associated with a nonspecific manifestation of GA activity in people: donors with influenza , hepatitis B, pneumonia and rubella.
Таким образом, РГА дает возможность быстрого выявления антигенов ВГС, агглютинирующих эритроциты гуся в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей, положительных и отрицательных на РНК ВГС по данным ПЦР. Thus, RGA makes it possible to quickly detect HCV antigens agglutinating goose erythrocytes in the blood serum of HCV-infected people, positive and negative for HCV RNA according to PCR.
Пример 2. Способ определения антигемагглютининов ВГС в сыворотках крови людей. Возможность определения антител, тормозящих ГА-активность ВГС, появилась благодаря выделению из ВГС-инфицированных культур клеток антигенно-неактивных вариантов ВГС, которые и были успешно использованы в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В табл.4 представлены данные, демонстрирующие возможность РТГА для определения антител к ВГС в сыворотках крови инфицированных гепатитом С. Показано, что:
- Антигемагглютинины ВГС циркулируют в сыворотках крови людей на разных стадиях инфекции ВГС.Example 2. A method for determining anti-hemagglutinins of HCV in human serum. The possibility of determining antibodies inhibiting the GA activity of HCV appeared due to the isolation of antigenically inactive variants of HCV from HCV-infected cell cultures, which were successfully used in the inhibition of hemagglutination (RTGA). Table 4 presents data demonstrating the ability of rtga to determine antibodies to HCV in the blood serum of hepatitis C infected. It is shown that:
- HCV antigemagglutinins circulate in the blood serum of people at different stages of HCV infection.
- Максимальных значений антигемагглютинины достигают в сыворотках крови людей, содержащих антитела к ВГС (по данным ИФА), но отрицательных в ПЦР реакции (РНК ВГС отрицательные сыворотки). Вероятно, этим и объясняется низкий титр гемагглютининов ВГС, выявляемый в этих же сыворотках: ГА -активность в этом случае в значительной степени подавлена антителами к ВГС. - The maximum values of antihemagglutinins are achieved in the blood serum of people containing antibodies to HCV (according to ELISA), but negative in the PCR reaction (HCV RNA negative sera). This probably explains the low titer of HCV hemagglutinins detected in the same sera: GA activity in this case is largely suppressed by antibodies to HCV.
- Использование в РТГА в качестве антигенов ВГС сывороток крови ВГС-инфицированных людей, ВГС- инфицированных кроликов, а также культуральных антигенов ВГС позволяет выявлять антигемагглютинины во всех случаях, однако максимальные титры антител обнаруживаются при использовании культуральных антигенов (культуральная жидкость, собранная из инфицированных ВГС культур клеток, выращиваемых роллерным способом). - The use of serum from HCV-infected people, HCV-infected rabbits, as well as HCV culture antigens in RTGA as HCV antigens, as well as anti-hemagglutinins can be detected in all cases, however, the maximum antibody titers are found when using culture antigens (culture fluid collected from HCV-infected cultures cells grown by roller method).
- Атигемагглютинины ВГС не были выявлены в образцах сывороток контрольных групп людей: доноров, больных гепатитом В, краснухой, гриппом, пневмонией, что ярко демонстрирует специфичность как антигемагглютининов ВГС, так и ГА-активности ВГС в сыворотках крови ВГС-инфицированных людей. - HCV atigemagglutinins were not detected in serum samples from control groups of people: donors, patients with hepatitis B, rubella, influenza, pneumonia, which clearly demonstrates the specificity of both HCV antigemagglutinins and HCV activity in the blood serum of HCV-infected people.
- ВГС-специфические рекомбинантные белки (нуклеокапсидный и неструктурные белки), входящие в состав коммерческих тест-систем, производимых фирмой "Органон" (США), не способны выявлять в РТГА антитела в сыворотках крови ВГС- инфицированных, что свидетельствуют о том, что ГА-активность ВГС связана с белками оболочки вириона, скорее всего с белком Е2, не входящим в состав данной тест-системы. - HCV-specific recombinant proteins (nucleocapsid and non-structural proteins) that are part of commercial test systems manufactured by Organon (USA) are not able to detect antibodies in the blood serum of HCV-infected, which indicates that GA HCV-activity is associated with virion membrane proteins, most likely with E2 protein, which is not part of this test system.
Источники информации
1. Clarke D.H. and Casals J. Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with arthropod borne viruses. Am. J.Trop. Med. Hyg. 7:562(1958).Sources of information
1. Clarke DH and Casals J. Techniques for haemagglutination and haemagglutination inhibition with arthropod borne viruses. Am. J.Trop. Med. Hyg. 7: 562 (1958).
2. Дерябин П.Г., Львов Д.К., Исаева Е.И., Вязов С.О. Штамм, virus hepatitis С, Д-1, для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Патент на изобретение 2130967, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 1999 г., Москва. Приоритет по заявке 97116620 от 07.10.1997 г. 2. Deryabin P.G., Lvov D.K., Isaeva E.I., Elm S.O. Strain, virus hepatitis C, D-1, for the preparation of diagnostic and prophylactic drugs. Patent for invention 2130967, registered in the State register of inventions of the Russian Federation on May 27, 1999, Moscow. Priority on application 97116620 dated 10/07/1997
3. П. Г. Дерябин, С.О. Вязов, Е.И. Исаева и др. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга мышей-сосунков. Вопр. вирусол., 1997, Т.6., стр.254-258. 3. P. G. Deryabin, S.O. Elm, E.I. Isaeva et al. Hepatitis C virus persistence in brain cell cultures of sucker mice. Q. virusol., 1997, T.6., pp. 254-258.
4. Дерябин П.Г., Исаева Е.И., Вязов С.О. и др. Хроническая инфекция культур клеток почки эмбриона свиньи, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусол.,1997, т.6., стр.259-263. 4. Deryabin P.G., Isaeva E.I., Elm S.O. et al. Chronic infection of kidney cell cultures of a pig embryo caused by hepatitis C. Vopr. viralol., 1997, T. 6., pp. 259-263.
5. П.Г. Дерябин, Е.И. Исаева, С.О. Вязов, Д.К. Львов. Летальная инфекция новорожденных мышей, вызванная вирусом гепатита С. Вопр. вирусолог., 1997, т.6., стр.251-253. 5. P.G. Deryabin, E.I. Isaeva, S.O. Elm, D.K. Lviv Lethal infection of newborn mice caused by hepatitis C. Vopr. Virologist., 1997, T. 6., pp. 251-253.
6. П.Г. Дерябин, Д.К. Львов. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация. Доклады Академии наук РФ, 1998, т.358, N5, стр.688-691. 6.P.G. Deryabin, D.K. Lviv Highly productive variant of the hepatitis C virus. Isolation, characterization, identification. Doklady of the Academy of Sciences of the Russian Federation, 1998, vol. 358, N5, pp. 688-691.
7. А. А. Кущ, О. В. Масалова, С.Н. Атанадзе. и др. Материалы 2-й Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты B, C, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики, Москва 14-16 октября 1997 г. 7. A. A. Kushch, O. V. Masalova, S.N. Atanadze. and other materials of the 2nd Russian scientific-practical conference with international participation "Hepatitis B, C, D and G - problems of diagnosis, treatment and prevention, Moscow October 14-16, 1997
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000132968A RU2194993C2 (en) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2000132968A RU2194993C2 (en) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2000132968A RU2000132968A (en) | 2002-10-20 |
| RU2194993C2 true RU2194993C2 (en) | 2002-12-20 |
Family
ID=20244137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2000132968A RU2194993C2 (en) | 2000-12-28 | 2000-12-28 | Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2194993C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2590691C2 (en) * | 2010-08-05 | 2016-07-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Prediction of kinetics of hepatitis c virus in interferon-excluding treatment |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2542475C2 (en) * | 2013-06-18 | 2015-02-20 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for preparing diagnosticum for detecting hepatitis c antigen in reaction of volumetric agglomeration (rva) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996005513A1 (en) * | 1994-08-17 | 1996-02-22 | Biocine S.P.A. | Assay to detect hcv receptor binding |
| RU2126158C1 (en) * | 1992-07-07 | 1999-02-10 | Чирон Корпорейшн | Antibody detection method, method of blood component screening, and anti-hcy antibody detection kit |
| RU2130967C1 (en) * | 1997-10-07 | 1999-05-27 | Научно-исследовательский институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН | Strain virus hepatitis c, d-1, for preparing diagnostic and prophylactic preparations |
| RU2146825C1 (en) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Method for diagnosing extrahepatic persistence of viral antigens in tissues of children suffering from chronic d-,delta- or c-hepatitis |
| WO2000026673A1 (en) * | 1998-11-03 | 2000-05-11 | Abbott Laboratories | Methods of detecting chronic infection caused by hcv |
-
2000
- 2000-12-28 RU RU2000132968A patent/RU2194993C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2126158C1 (en) * | 1992-07-07 | 1999-02-10 | Чирон Корпорейшн | Antibody detection method, method of blood component screening, and anti-hcy antibody detection kit |
| WO1996005513A1 (en) * | 1994-08-17 | 1996-02-22 | Biocine S.P.A. | Assay to detect hcv receptor binding |
| RU2130967C1 (en) * | 1997-10-07 | 1999-05-27 | Научно-исследовательский институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН | Strain virus hepatitis c, d-1, for preparing diagnostic and prophylactic preparations |
| RU2146825C1 (en) * | 1998-05-07 | 2000-03-20 | Харламова Флора Семеновна | Method for diagnosing extrahepatic persistence of viral antigens in tissues of children suffering from chronic d-,delta- or c-hepatitis |
| WO2000026673A1 (en) * | 1998-11-03 | 2000-05-11 | Abbott Laboratories | Methods of detecting chronic infection caused by hcv |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2590691C2 (en) * | 2010-08-05 | 2016-07-10 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Prediction of kinetics of hepatitis c virus in interferon-excluding treatment |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shi et al. | Serologic diagnosis of West Nile virus infection | |
| CN1360678B (en) | Method for early detection of flaviviruses using NS1 glycoprotein and application thereof | |
| Tsai et al. | Serological and virological evidence of a Hantaan virus-related enzootic in the United States | |
| Takano et al. | Antibody-dependent enhancement occurs upon re-infection with the identical serotype virus in feline infectious peritonitis virus infection | |
| US8114408B2 (en) | Peptide fragments reacting specifically with antibodies against highly pathogenic newcastle disease virus and uses thereof | |
| Liu et al. | Comparative research on nucleocapsid and spike glycoprotein as the rapid immunodetection targets of COVID-19 and establishment of immunoassay strips | |
| Liu et al. | Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus | |
| RU2194993C2 (en) | Method for setting accelerated diagnosis of hepatitis c based on hepatitis c virus hemagglutinin and their antibodies detection in hemagglutination reaction and in hemagglutination inhibition reaction | |
| AU8735798A (en) | Use of recombinant envelope proteins for diagnosing the dengue virus | |
| Lanciotti et al. | Arboviruses | |
| Eckels et al. | Hepatitis A virus hemagglutination and a test for hemagglutination inhibition antibodies | |
| US10921323B2 (en) | Method for the immunological diagnosis of a sample with a potential infection with an arbovirus and test kits suitable for this purpose | |
| Dobler | Diagnosis. Chapter 10 | |
| Manu | Development of alternative potency test for quality control of Classical Swine Fever vaccines | |
| Groves et al. | Rapid active assay for the detection of antibodies to West Nile virus in chickens | |
| Döller et al. | Diagnostic significance of influenza subtype-specific IgG, IgA, and IgM antibodies | |
| Madani et al. | Trypsin-dependent hemagglutination of erythrocytes of a variety of mammalian and avian species by Alkhumra hemorrhagic fever virus | |
| Pramod | Serological & Molecular Characterization of Dengue Virus in a Tertiary Care Hospital of North Karnataka. | |
| RU2263144C2 (en) | Strain cod of severe acute respiratory syndrome virus of genus coronavirus designated for development of agents and methods for biological protection | |
| Dobler | Diagnostic of TBEV-infections. Chapter 11 | |
| Azhar et al. | Tariq A. Madani, El-Tayeb ME Abuelzein, Huda Abu-Araki, Esam | |
| Pattnaik et al. | Serology: A Precise Tool in Diagnosis and Epidemiology of COVID-19 | |
| Badry | Seroprevalence and Genotyping of Hepatitis C virus at Thi-Qar Province | |
| Ezzikouri et al. | SARS-CoV-2 Infection Elicits A Greater Humoral Immune Response In The Second Wave Than The First Wave In Morocco | |
| Alghamdi et al. | Recent Advances in Methods Detecting the Dengue virus. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131229 |