RU2167425C2 - Method for identifying proteins - Google Patents
Method for identifying proteins Download PDFInfo
- Publication number
- RU2167425C2 RU2167425C2 RU98113214A RU98113214A RU2167425C2 RU 2167425 C2 RU2167425 C2 RU 2167425C2 RU 98113214 A RU98113214 A RU 98113214A RU 98113214 A RU98113214 A RU 98113214A RU 2167425 C2 RU2167425 C2 RU 2167425C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- membrane
- antibodies
- cell
- washing
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000002601 radiography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение в различных отраслях промышленности и науки. The invention relates to biology, in particular to biochemistry and molecular biology, and may find application in various industries and science.
Широко известны различные методы разделения белков, основанные на различии молекул по размеру: это диализ, ультрафильтрация, центрифугирование и гель-хроматография, электрофорез и ионообменная хроматография. Various methods for separating proteins based on the difference in molecular size are widely known: dialysis, ultrafiltration, centrifugation and gel chromatography, electrophoresis and ion exchange chromatography.
На биоселективном взаимодействии с лигандами, фиксированными на носителе, основано разделение белков с помощью афинной хроматографии. Взаимодействие белка с лигандом облегчается встраиванием между лигандом и матрицей гибкой "ножки". В качестве матрицы применяются агароза, пористое стекло, целлюлоза, сшитые декстрины и др. Афинная хроматография нашла широкое применение при разделении белков (Х.- Д. Якубке, Х.Ешкайт "Аминокислоты. Пептиды. Белки", М., Мир, 1985, с. 345-356). The separation of proteins by affinity chromatography is based on bioselective interaction with ligands fixed on a carrier. The interaction of the protein with the ligand is facilitated by the incorporation of a flexible “leg” between the ligand and the matrix. Agarose, porous glass, cellulose, crosslinked dextrins, etc. are used as matrices. Affinity chromatography has been widely used in protein separation (H.-J. Jakubke, H. Eschert “Amino acids. Peptides. Proteins”, M., Mir, 1985, p. 345-356).
Наиболее близким к изобретению является способ определения белков с использованием иммобилизованных антител против данного белка, включающий иммобилизацию антител на сорбенте, отмывку сорбента, забивку мест неспецифического связывания на сорбенте, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные на сорбенте антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку сорбента от несвязавшихся белков и идентификацию белков методом радиографии (Т. Чард. Радиоиммунологические методы. М., Мир, 1981, с. 126-127). Closest to the invention is a method for determining proteins using immobilized antibodies against this protein, including immobilizing antibodies on a sorbent, washing the sorbent, blocking sites of nonspecific binding on the sorbent, applying a sample containing pre-labeled proteins to antibodies immobilized on the sorbent, holding for a while sufficient for the interaction of antibodies with proteins, washing the sorbent from unbound proteins and identification of proteins by radiography (T. Chard. Radioimmunologists RP G methods. M., Mir, 1981, p. 126-127).
Недостатками указанных способов являются сложность осуществления, использование дорогостоящего стационарного оборудования и, соответственно, невозможность проведения исследований в полевых условиях, в условиях космического полета и малых клиниках, использование большого количества разных реактивов, включая вредные и канцерогенные, ограниченная возможность одновременного определения содержания разных белков в одной пробе. The disadvantages of these methods are the difficulty of implementation, the use of expensive stationary equipment and, accordingly, the inability to conduct research in the field, in space flight and small clinics, the use of a large number of different reagents, including harmful and carcinogenic ones, the limited ability to simultaneously determine the content of different proteins in one sample.
Техническим результатом заявленного способа является устранение вышеуказанных недостатков и возможность определять одновременно большое количество разных белков (до 1000 видов) в одной пробе при одновременном обеспечении количественного сравнения содержания белков в пробе и сохранения наглядного визуального результата анализа на длительное время. The technical result of the claimed method is the elimination of the above disadvantages and the ability to simultaneously determine a large number of different proteins (up to 1000 species) in one sample while providing a quantitative comparison of the protein content in the sample and maintaining a visual visual analysis result for a long time.
Для достижения указанного технического результата в способе определения белков, включающем иммобилизацию антител, отмывку, забивку мест неспецифического связывания, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку от несвязавшихся белков и идентификацию белков, иммобилизацию антител осуществляют на мембране, которую предварительно разбивают на ячейки, и в середину каждой ячейки наносят антитела к разным белкам по одному виду антител в ячейку, после отмывки мембраны, забивки мест неспецифического связывания на мембране, нанесения пробы на иммобилизованные на мембране антитела, выдержки и отмывки мембраны от несвязавшихся белков определяют количество белка, связавшегося с каждым видом антител. To achieve the specified technical result in a method for determining proteins, including immobilization of antibodies, washing, blocking sites of non-specific binding, applying a sample containing pre-labeled proteins to immobilized antibodies, holding for a time sufficient for the antibodies to interact with proteins, washing from unbound proteins and the identification of proteins, the immobilization of antibodies is carried out on the membrane, which is previously divided into cells, and antibodies to different proteins are applied in the middle of each cell For one type of antibody per cell, after washing the membrane, clogging the sites of non-specific binding on the membrane, applying a sample to antibodies immobilized on the membrane, holding and washing the membrane from unbound proteins determine the amount of protein bound to each type of antibody.
Кроме того, идентификацию белков осуществляют по антителу в соответствующей ячейке, а количество белка в ячейке могут определять методом радиографии или хемилюминесцентным методом. In addition, proteins are identified by the antibody in the corresponding cell, and the amount of protein in the cell can be determined by radiography or chemiluminescent.
Кроме того, можно использовать нитроцеллюлозную мембрану, а в качестве жидкости для забивки мест неспецифического связывания используют молоко порошкообразное 5%-ной концентрации или TWIN-20. In addition, a nitrocellulose membrane can be used, and milk powder 5% concentration or TWIN-20 is used as a liquid to clog nonspecific binding sites.
Помимо нитроцеллюлозной мембраны можно также использовать и другие мембраны для иммобилизации белков, например активированную бумагу или активированный нейлон. In addition to the nitrocellulose membrane, other membranes can also be used to immobilize proteins, for example, activated paper or activated nylon.
Сущность изобретения поясняется на примере. The invention is illustrated by example.
Пример. Способ осуществляется следующим образом. Вся площадь нитроцеллюлозной мембраны разбивается на ячейки, например, размером 3-5 мм. Количество ячеек на одной мембране может достигать 1000 и выше. Каждая ячейка маркируется с помощью цифровых и буквенных координат. В середину каждой ячейки наносят и иммобилизуют антитела к разным белкам по одному виду антител в одну ячейку. Диаметр пятна нанесенных антител составляет ~ 3 мм. После этого осуществляют забивку мест неспецифического связывания на мембране порошкообразным молоком 5%-ной концентрации или TWIN- 20. На следующем этапе на иммобилизованные антитела наносят пробы, содержащие меченые радиоактивной меткой белки. Далее, например, через 1-2 часа, в течение которых происходит взаимодействие белков со специфическими антителами, производят отмывку мембраны от несвязавшихся белков пробы. На мембране в конкретной ячейке остаются только белки, связавшиеся со своими антителами. Дальше определяют количество белка, связавшегося с каждым типом антител, с помощью стандартных методов подсчета радиоактивности счетчиком или радиографии на рентгеновской пленке, накладываемой на мембрану, с последующим денситометрированием. Example. The method is as follows. The entire area of the nitrocellulose membrane is divided into cells, for example, 3-5 mm in size. The number of cells on one membrane can reach 1000 and higher. Each cell is marked using numeric and alphabetic coordinates. In the middle of each cell, antibodies to different proteins are applied and immobilized, one type of antibody per cell. The spot diameter of the applied antibodies is ~ 3 mm. After this, nonspecific binding sites on the membrane are clogged with powdered milk of 5% concentration or TWIN-20. In the next step, samples containing radiolabeled proteins are applied to immobilized antibodies. Further, for example, after 1-2 hours, during which the interaction of proteins with specific antibodies occurs, the membrane is washed from unbound sample proteins. Only proteins bound to their antibodies remain on the membrane in a particular cell. Next, determine the amount of protein bound to each type of antibody using standard methods for counting radioactivity by a counter or radiography on an x-ray film applied to the membrane, followed by densitometry.
В случае использования люминесцентной метки накладывают на мембрану пленку и определяют количество белка хемилюминесцентным методом. In the case of using a luminescent label, a film is applied to the membrane and the amount of protein is determined by the chemiluminescent method.
Заявленный способ обеспечивает удобство документирования результатов анализа в виде мембраны с наложенным на нее регистрирующим покрытием (пленкой) с пятнами, параметры которых (размеры, плотность) позволяют осуществить количественное сравнение содержания различных белков в пробе. The claimed method provides the convenience of documenting the results of the analysis in the form of a membrane with a recording coating (film) applied to it with spots, the parameters of which (dimensions, density) allow a quantitative comparison of the content of various proteins in the sample.
Claims (7)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98113214A RU2167425C2 (en) | 1998-07-17 | 1998-07-17 | Method for identifying proteins |
| PCT/RU1998/000371 WO2000004385A1 (en) | 1998-07-17 | 1998-11-12 | Method for detecting proteins |
| AU15144/99A AU1514499A (en) | 1998-07-17 | 1998-11-12 | Method for detecting proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU98113214A RU2167425C2 (en) | 1998-07-17 | 1998-07-17 | Method for identifying proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU98113214A RU98113214A (en) | 2000-04-10 |
| RU2167425C2 true RU2167425C2 (en) | 2001-05-20 |
Family
ID=20208255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU98113214A RU2167425C2 (en) | 1998-07-17 | 1998-07-17 | Method for identifying proteins |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU1514499A (en) |
| RU (1) | RU2167425C2 (en) |
| WO (1) | WO2000004385A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2018107453A (en) | 2015-08-10 | 2019-09-12 | Эссенликс Корп. | DEVICES FOR ANALYSIS AND METHODS IN BIOLOGY / CHEMISTRY, PROVIDING SIMPLIFIED STAGES, SAMPLES OF SMALL VOLUME, INCREASED SPEED AND EASE OF APPLICATION |
| CN112462055B (en) | 2015-09-14 | 2024-06-07 | 上海宜晟生物科技有限公司 | Device and system for analyzing samples, especially blood, and methods of using the same |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2038600C1 (en) * | 1990-07-31 | 1995-06-27 | Институт иммунобиотехнологии | Membrane for separating components of immunologic reaction |
| WO1995025543A1 (en) * | 1994-03-18 | 1995-09-28 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| RU2095815C1 (en) * | 1994-12-22 | 1997-11-10 | Леонид Николаевич Падюков | Method of preparing immunosorbent for viral hepatitis c diagnosis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1603301A1 (en) * | 1987-12-22 | 1990-10-30 | Карагандинский государственный медицинский институт | Method of determining concentration of immunoglobulins in biological fluid |
-
1998
- 1998-07-17 RU RU98113214A patent/RU2167425C2/en active
- 1998-11-12 WO PCT/RU1998/000371 patent/WO2000004385A1/en active Application Filing
- 1998-11-12 AU AU15144/99A patent/AU1514499A/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2038600C1 (en) * | 1990-07-31 | 1995-06-27 | Институт иммунобиотехнологии | Membrane for separating components of immunologic reaction |
| WO1995025543A1 (en) * | 1994-03-18 | 1995-09-28 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| RU2095815C1 (en) * | 1994-12-22 | 1997-11-10 | Леонид Николаевич Падюков | Method of preparing immunosorbent for viral hepatitis c diagnosis |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ХРУСТАЛЕВА Н.А. Автореф. дисс. к.т.н.-М.: Университет Дружбы народов, 1987, с.6 - 7, 10 - 11. * |
| ЧАРД Т. Радиоиммунологические методы. / Под ред. Я.М.Варшавского. - М.: Мир, 1981, с.126. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1514499A (en) | 2000-02-07 |
| WO2000004385A1 (en) | 2000-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4939098A (en) | Immunoassay and measurement kit used therefor | |
| US5124041A (en) | Biomolecule sample immobilization | |
| US5395498A (en) | Method for separating biological macromolecules and means therfor | |
| JP3119802B2 (en) | Disposable affinity chromatography reaction vessels for solid-phase immunoassay | |
| JPH06315603A (en) | Device and method for affinity separation | |
| IE53295B1 (en) | New devices and kits for immunological analysis | |
| DE60137132D1 (en) | Are analytische systeme | |
| RU2115122C1 (en) | One-time reactor for solid-phase immunologic analysis and method of solid-phase immunologic analysis | |
| CA2443320A1 (en) | Separation of target material using affinity substance containing labelled nucleic acid chain by electrophoresis | |
| JPH06103300B2 (en) | Biological diagnostic device | |
| US4549011A (en) | Modified sheet of material and method of making and using same in connection with biochemical procedures | |
| US20030092056A1 (en) | Multi-column affinity detection system | |
| CN115298547A (en) | High throughput affinity sample preparation for mycotoxin analysis | |
| RU2167425C2 (en) | Method for identifying proteins | |
| US20030032201A1 (en) | Method and device for electrophoresis and blotting | |
| EP1941269B1 (en) | A method of screening a biological target for weak interactions using weak affinity chromatography | |
| RU2216021C2 (en) | Methods of retaining chromatography for separating analytes in sample | |
| AU770715B2 (en) | Analytical method and device | |
| Cole et al. | Density gradient centrifugation: fixation of bands by photopolymerization of acrylamide | |
| SU1691754A1 (en) | Method for point enzymoimmunoassay | |
| Josić et al. | The application of immobilized affinity ligands in high performance liquid chromatography | |
| Hedenmo et al. | Gyoryovi, K., see Oririak, A. 660 (1994) 67 Haberland, D., see Thede, R. 660 (1994) 25 Haginaka, J., Seyama, C., Murashima, T., Fujima,. H. and Wada, H. Retention and enantioselective properties of | |
| JPS63145961A (en) | Solid-phase bonding reagent, manufacture thereof and kit for test including said reagent | |
| RU98113214A (en) | METHOD FOR DETERMINING PROTEINS | |
| RU2001103741A (en) | Staphylococcus Protein Inhibitory Chemotaxis (CHIPS) and its Use |