RU2158179C1

RU2158179C1 - Microtitration plate

Info

Publication number: RU2158179C1
Application number: RU99127934A
Authority: RU
Inventors: Н.С. Осин; В.Г. Помелова; А.С. Соколов
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Иммуноскрин"
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2000-10-27

Abstract

FIELD: medical engineering. SUBSTANCE: microtitration plate may be used for diagnostics and testing of biological specimens taken from such sources as whole blood, blood serum, cerebrospinal fluid, etc. Multi-component analysis may be performed without operation of blood specimen division into portions proportional to area or volume of microvessel with high sensitivity being preserved. Microtitration plate has individual vessels provided with walls and bottom for immunosorbent and with nontransparent matrix, hollow of which accommodates microvessels. All microvessels are divided into vertical cells by solid partitions made of the same material as walls of microvessels. Height of partitions is smaller than height of microvessel walls by at least 1-2 mm, and it equals 0.5-4 mm. EFFECT: simplified analysis. 2 cl, 5 dwg

Description

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройствам для проведения исследований, и может быть использовано для диагностики и тестирования биологических образцов из таких источников, как цельная кровь, сыворотка крови, спинномозговая жидкость, образцы тканей, а также проб, взятых из окружающей среды. The invention relates to medical equipment, namely to devices for research, and can be used for the diagnosis and testing of biological samples from sources such as whole blood, blood serum, cerebrospinal fluid, tissue samples, as well as samples taken from the environment.

В последние годы актуальной задачей является микроминиатюризация объема пробы для одновременного анализа нескольких аналитов из одного образца. Это связано с делением ограниченного объема пробы на несколько порций. В связи с этим проектирование микротитровальных плат пошло по пути уменьшения размеров лунок и увеличения их количества, так, в стандартных платах размером 8 х 12 см количество микролунок доходит до десяти тысяч. Уменьшение размеров лунок позволяет уменьшить объемы образца и реагентов, используемых при проведении анализов, что удешевляет процедуру тестирования или диагностики, а отбор микроколичеств исследуемого образца, например крови, является привлекательным при масс-скрининге населения. In recent years, the microminiaturization of the sample volume for the simultaneous analysis of several analytes from the same sample is an urgent task. This is due to the division of the limited sample volume into several portions. In this regard, the design of microtiter boards went the way of reducing the size of the holes and increasing their number, so, in standard boards with a size of 8 x 12 cm, the number of microwells reaches ten thousand. Reducing the size of the wells allows you to reduce the volume of the sample and reagents used in the analysis, which reduces the cost of the testing or diagnostic procedure, and the selection of micro quantities of the test sample, such as blood, is attractive for mass screening of the population.

Однако микроминиатюризация объема образца приводит к появлению ряда проблем. Уменьшение размеров лунок и увеличение их количества в титровальной плате стандартного размера (8 х 12 см) приводит к усложнению дозирующих устройств, значительному увеличению времени дозирования. However, microminiaturization of the sample volume leads to a number of problems. Reducing the size of the holes and increasing their number in the standard size titration board (8 x 12 cm) leads to a complication of dosing devices, a significant increase in dosing time.

Но главной проблемой является детектирование результатов анализов. Использование микрообъемов для анализа существенно уменьшает, например, интенсивность эмиссии флуоресценции исследуемого образца, делая технику детектирования чрезвычайно чувствительной к сигналам детектируемого фона. Например, микролунки с объемом 0,5 мкл производят сигнал, который составляет 0,1-0,2% от сигнала, производимого лункой в 96-луночном планшете, что связано с пропорциональным снижением концентрации иммобилизованного на твердой фазе аналита. But the main problem is the detection of test results. The use of microvolumes for analysis significantly reduces, for example, the intensity of fluorescence emission of the test sample, making the detection technique extremely sensitive to the signals of the detected background. For example, microwells with a volume of 0.5 μl produce a signal that is 0.1-0.2% of the signal produced by the well in a 96-well plate, which is associated with a proportional decrease in the concentration of analyte immobilized on the solid phase.

Кроме того, в современном масс-скрининге предпочтительно используются сухие пятна крови и микроколичества образцов цельной крови для одновременного выявления нескольких маркеров инфекционных и/или соматических заболеваний. Это связано с ограниченным объемом биологического материала, например, при масс-скрининге врожденных аномалий у новорожденных, когда требуется определение четырех и более маркеров в сухом пятне крови, взятой из пятки новорожденного. In addition, modern mass screening preferably uses dry blood stains and trace amounts of whole blood samples to simultaneously detect several markers of infectious and / or somatic diseases. This is due to the limited amount of biological material, for example, during mass screening of congenital malformations in newborns, when it is necessary to determine four or more markers in a dry spot of blood taken from the heel of a newborn.

Известны микротитровальные платы для проведения анализа химических и биологических образцов (РСТ, патент N 99/49974, ЕР, патент N 0542422, РФ, патент N 2108156, кл. МКИ B O1 L 3/00). Known microtiter plates for the analysis of chemical and biological samples (PCT, patent N 99/49974, EP, patent N 0542422, RF, patent N 2108156, class MKI B O1 L 3/00).

Платы содержат большое количество микрососудов (микролунок) и позволяют проводить большое количество анализов при использовании микроколичеств образцов и реагентов. The boards contain a large number of microvessels (microwells) and allow a large number of analyzes to be carried out using micro quantities of samples and reagents.

Однако при использовании для анализа сухих образцов крови (сухих пятен крови) возникают проблемы, связанные с тем, что сухое пятно крови либо дробится на мелкие порции, либо растворяется в дополнительных сосудах и образец крови вносится в реакционные микрососуды в виде раствора. И в том и в другом случае увеличивается время для проведения анализа за счет дополнительных операций и резко снижается чувствительность при определении отдельных аналитов за счет уменьшения объема исследуемого образца при его дроблении на порции. However, when using dry blood samples (dry blood stains) for analysis, there are problems associated with the fact that a dry blood stain is either crushed into small portions or dissolved in additional vessels and the blood sample is introduced into the reaction microvessels in the form of a solution. In both cases, the time for analysis due to additional operations increases and the sensitivity in determining individual analytes sharply decreases due to a decrease in the volume of the test sample when it is crushed into portions.

Известна микротитровальная плата, используемая в лабораторных условиях для длительных исследований биологических жидкостей, в том числе и для иммунохимических исследований (США, патент N Re.34.133, кл. НКИ 422-99). Микротитровальная плата выполнена в виде основания с углублениями, в которые вставляются индивидуальные микрососуды, образующие, при необходимости проведения большого числа анализов, ряды и колонны. Микрососуды могут быть заранее обработаны различными материалами (антигенами, антителами и т.п.), высушены и сохраняться до проведения анализов. При необходимости проведения анализов подготовленные сосуды вставляются в углубления основания в необходимом количестве и комбинации, так что одна группа микрососудов может быть использована для осуществления различных тестов в образце биологических жидкостей одного пациента. Микрососуды могут использоваться индивидуально, либо в виде группы, в которой сосуды связаны коротким стержнем, перемычкой, полоской и т.п., что позволяет, при необходимости, легко отделять их друг от друга. Дно микрососудов может быть выполнено плоским, U-образным, прямоугольным и т.п. Known microtiter plate used in laboratory conditions for long-term studies of biological fluids, including immunochemical studies (USA, patent N Re.34.133, CL NKI 422-99). The microtiter plate is made in the form of a base with recesses into which individual microvessels are inserted, forming, if necessary, a large number of analyzes, rows and columns. Microvessels can be pre-treated with various materials (antigens, antibodies, etc.), dried and stored until analysis. If necessary, analyzes prepared vessels are inserted into the recesses of the base in the required quantity and combination, so that one group of microvessels can be used to carry out various tests in a sample of biological fluids of one patient. Microvessels can be used individually, or in the form of a group in which the vessels are connected by a short rod, jumper, strip, etc., which makes it possible, if necessary, to easily separate them from each other. The bottom of the microvessels can be made flat, U-shaped, rectangular, etc.

Недостатком устройства при исследовании сухих пятен крови и микроколичеств цельной крови является большой расход исследуемых образцов при осуществлении многоаналитного анализа, т.к. каждый сосуд, независимо от его размера, предназначен для определения только одного аналита. The disadvantage of the device in the study of dry blood stains and trace amounts of whole blood is the high consumption of the studied samples in the implementation of multi-analytic analysis, because each vessel, regardless of its size, is designed to determine only one analyte.

Наиболее близкой является микроплата для проведения множества микроанализов (ЕР, патент N 0844025, кл. МКИ B O1 L 3/00). Микроплата содержит непрозрачную матрицу с отверстиями цилиндрической или любой другой формы, в которые вставляются индивидуальные микрососуды для образцов. Дно микрососудов выполнено прозрачным для пропускания света от образца, а сами микрососуды экранированы друг от друга за счет выступов у их дна и вершины, образованных непрозрачной матрицей. Микроплата может содержать от 96 до 384 микрососудов, зафиксированных относительно друг друга. The closest is a microplate for conducting multiple microanalyses (EP, patent N 0844025, class MKI B O1 L 3/00). The microplate contains an opaque matrix with holes of a cylindrical or any other shape into which individual microvessels for samples are inserted. The bottom of the microvessels is made transparent for transmitting light from the sample, and the microvessels themselves are shielded from each other due to the protrusions at their bottom and apex formed by an opaque matrix. The microplate may contain from 96 to 384 microvessels fixed relative to each other.

Недостатком 96-луночной микроплаты при проведении анализов с использованием сухого пятна и микроколичеств цельной крови является большой расход исследуемых образцов при многоаналитном тестировании, а для 384-луночной добавляется операция деления (дробления) сухого пятна крови, что резко снижает чувствительность из-за снижения концентрации маркера в пробе и соответственно порогового детектируемого уровня сигнала и увеличивает время анализа. The disadvantage of a 96-well microplate during analyzes using a dry spot and trace amounts of whole blood is the high consumption of the test samples in multi-analytic testing, and for the 384-well, the division of the dry blood spot is divided (crushing), which sharply reduces the sensitivity due to lower marker concentrations in the sample and, accordingly, the threshold detectable signal level and increases the analysis time.

Задачей изобретения является создание микротитровальной платы для одновременного выявления нескольких маркеров инфекционных и/или соматических заболеваний при использовании сухих пятен крови или микроколичеств цельной крови, в том числе при ограниченном количестве биологического материала, когда дробление его на порции приводит к существенному снижению чувствительности и точности и даже невозможности количественного детектирования ряда маркеров. The objective of the invention is the creation of a microtiter plate for the simultaneous detection of several markers of infectious and / or somatic diseases when using dry blood stains or trace amounts of whole blood, including with a limited amount of biological material, when crushing it into portions leads to a significant decrease in sensitivity and accuracy, and even the impossibility of quantitative detection of a number of markers.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность проведения мультикомпонентного анализа без операции деления образца крови на отдельные порции, пропорциональные площади или объему микрососуда, при сохранении высокой чувствительности. The technical result achieved by using the invention is the ability to conduct multicomponent analysis without the operation of dividing the blood sample into separate portions proportional to the area or volume of the microvessel, while maintaining high sensitivity.

Поставленная задача решается предлагаемым изобретением. The problem is solved by the invention.

Сущность изобретения заключается в том, что в микротитровальной плате, содержащей индивидуальные микрососуды, имеющие стенки и дно для иммуносорбента, и непрозрачную матрицу с углублениями для размещения микрососудов, все микрососуды разделены на изолированные друг от друга вертикальные ячейки сплошными перегородками, выполненными из того же материала, что и стенки микрососудов, при этом высота перегородок меньше высоты стенок микрососудов. Сущность изобретения заключается также в том, что высота перегородок равна 0,5-4 мм. The essence of the invention lies in the fact that in a microtiter plate containing individual microvessels having walls and a bottom for immunosorbent, and an opaque matrix with recesses for accommodating microvessels, all microvessels are divided into vertical cells isolated from each other by solid partitions made of the same material, as the walls of microvessels, while the height of the partitions is less than the height of the walls of microvessels. The invention also consists in the fact that the height of the partitions is 0.5-4 mm.

Сущность изобретения заключается также и в том, что высота перегородок меньше высоты стенок микрососудов по крайней мере на 1-2 мм. The invention also consists in the fact that the height of the partitions is less than the height of the walls of the microvessels by at least 1-2 mm.

Сущность изобретения заключается и в том, что объем ячеек равен 25-100 мкл. The essence of the invention lies in the fact that the volume of the cells is equal to 25-100 μl.

Авторам не известны технические решения, имеющие подобную заявляемой совокупность признаков, следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны. The authors are not aware of technical solutions having a similar claimed combination of features, therefore, the present invention meets the criterion of novelty.

Предлагаемое изобретение отличается от прототипа тем, что микрососуды разделены на изолированные друг от друга вертикальные секции сплошными перегородками, высота которых меньше высоты стенок микрососудов. Это позволяет на дне каждой изолированной секции микрососуда сорбировать различные маркеры, а сухое пятно крови или микроколичество образца цельной крови размещать в объеме всего микрососуда. При проведении реакции весь определяемый аналит, содержащийся в образце крови, связывается с сорбированным в одной из секций маркером, что позволяет при микроминиатюризации анализов сохранить высокую чувствительность детектирования сигналов и экономно расходовать образцы крови. Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность отличительных признаков в формуле изобретения, подобную заявляемой. Следовательно, предлагаемое решение отвечает критерию уровня техники. The present invention differs from the prototype in that the microvessels are divided into vertical sections isolated from each other by solid partitions, the height of which is less than the height of the walls of the microvessels. This allows you to adsorb various markers at the bottom of each isolated section of the microvessel, and place a dry blood stain or a microquantity of a whole blood sample in the entire microvessel. During the reaction, the entire analyte detected in the blood sample is bound to a marker adsorbed in one of the sections, which allows the microminiaturization of the analyzes to maintain high sensitivity of signal detection and to economically expend blood samples. The authors are not aware of technical solutions having a combination of distinctive features in the claims similar to the claimed one. Therefore, the proposed solution meets the criteria of the prior art.

Предлагаемая микроплата найдет широкое применение при проведении массовых анализов, там, где требуется высокая чувствительность детектирования при ограниченном объеме диагностируемого материала, например для скрининга врожденных аномалий новорожденных, иммунодиагностике вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекций. Микроплата может быть изготовлена из отечественных материалов АО "Медполимер" совместно с ГНЦ ГосНИИ БП. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости. The proposed microplate will be widely used in mass analyzes where high detection sensitivity is required with a limited amount of diagnosed material, for example, for screening congenital malformations of newborns, immunodiagnostics of viral hepatitis and HIV infections. The microplate can be made of domestic materials of JSC Medpolymer in conjunction with the SSC GosNII BP. Therefore, the present invention meets the criterion of industrial applicability.

На фиг.1 показаны варианты выполнения микротитровальной платы: фиг. 1 а, б - ячейки, полученные делением стандартного микрососуда (плата 8 х 12 см, 96 микрососудов) на четыре части; фиг. 1 в,г - ячейки, полученные делением стандартного микрососуда на шестнадцать частей. 1 shows embodiments of a microtiter plate: FIG. 1 a, b — cells obtained by dividing a standard microvessel (8 x 12 cm plate, 96 microvessels) into four parts; FIG. 1 c, d - cells obtained by dividing a standard microvessel into sixteen parts.

На фиг. 2 показана схема выполнения диссоциативного анализа микрообразца цельной крови в ячейках микрососуда: фиг. 2 а - введение микрообразца крови в ячейки; фиг. 2 б - введение конъюгата; фиг. 2 в - люминесцентная метка в объеме ячейки - детектирование сигнала. In FIG. 2 shows a diagram of a dissociative analysis of a whole blood microsample in microvessel cells: FIG. 2 a - the introduction of a blood microsample in the cell; FIG. 2 b - the introduction of the conjugate; FIG. 2 c - luminescent label in the cell volume - signal detection.

На фиг. З показана схема выполнения диссоциативного анализа сухого пятна крови в ячейках микрососуда: фиг. З а - введение сухого пятна крови в ячейки и экстрагирование аналита; фиг. 3 б - введение конъюгата; фиг. З в - люминесцентная метка в объеме ячейки - детектирование сигнала. In FIG. C shows a diagram of a dissociative analysis of dry blood stains in microvessel cells: FIG. Z a - the introduction of a dry spot of blood into the cells and the extraction of the analyte; FIG. 3 b - the introduction of the conjugate; FIG. З в - luminescent label in the cell volume - signal detection.

На фиг. 4 показана схема выполнения недиссоциативного анализа микрообразца цельной крови в ячейках микрососуда: фиг. 4 а - введение микрообразца крови в ячейки; фиг. 4 б - введение конъюгата; фиг.4 в - люминесцентная метка на дне ячейки - детектирование сигнала. In FIG. 4 shows a flow chart of a non-dissociative analysis of a whole blood microsample in microvessel cells: FIG. 4 a - the introduction of a blood microsample in the cell; FIG. 4 b - the introduction of the conjugate; figure 4 in the luminescent label at the bottom of the cell - signal detection.

На фиг. 5 показана схема выполнения недиссоциативного анализа сухого пятна крови в ячейках микрососуда: фиг. 5 а - введение сухого пятна крови в ячейки и экстрагирование аналита; фиг. 5 б - введение конъюгата; фиг.5 в - люминесцентная метка на дне ячейки - детектирование сигнала. In FIG. 5 shows a diagram of a non-dissociative analysis of a dry blood spot in microvessel cells: FIG. 5 a - introduction of a dry blood stain into the cells and extraction of the analyte; FIG. 5 b - the introduction of the conjugate; figure 5 in the luminescent label at the bottom of the cell - signal detection.

Микротитровальная плата 1 (фиг. 1) содержит микрососуды 2, ячейки 3; микрососуды 2 содержат стенки 4, перегородки 5 и дно 6. Microtiter plate 1 (Fig. 1) contains microvessels 2, cell 3; microvessels 2 contain walls 4, partitions 5 and bottom 6.

На фиг. 2-5 показаны микрососуд 2, ячейка 3, стенка микрососуда 4, перегородка 5 между ячейками 3, дно микрососуда 6, аналиты 7,8, сорбированные антитела 9, конъюгат с люминесцентной меткой 10, люминесцентная метка в объеме пробы 11, сухое пятно крови 12, люминесцентный комплекс антитело-аналит-меченое антитело 13 на дне 6 микрососуда 2. In FIG. 2-5 show a microvessel 2, cell 3, the wall of the microvessel 4, the septum 5 between the cells 3, the bottom of the microvessel 6, analytes 7.8, adsorbed antibodies 9, the conjugate with a luminescent label 10, a luminescent label in the sample volume 11, a dry blood stain 12 , luminescent complex antibody-analyte-labeled antibody 13 at the bottom 6 of a microvessel 2.

Микрососуды могут быть разделены на любое количество ячеек. Оптимальным является количество ячеек от 2 до 16. При более мелких ячейках начинает падать чувствительность детектирования аналитов из-за уменьшения количества реагентов, необходимых для осуществления анализа. Microvessels can be divided into any number of cells. The optimal number of cells is from 2 to 16. With smaller cells, the sensitivity of detection of analytes begins to decrease due to a decrease in the number of reagents required for the analysis.

Форма микрососудов и соответственно ячеек может быть любой: кpуглoй, овальной, прямоугольной, т.к. результаты анализа зависят только от концентрации аналита, связавшегося с антителами. The shape of microvessels and correspondingly cells can be any: round, oval, rectangular, because the results of the analysis depend only on the concentration of the analyte bound to the antibodies.

Устройство работает следующим образом. The device operates as follows.

Пример 1. Одновременное определение в одной лунке четырех маркеров сыворотки крови: тиротропина, тироксина, альфафетопротеина и хориогонадотропина осуществляют с помощью 96-луночной микротитровальной платы, емкостью 400 мкл, разделенной перегородками высотой 4 мм на 4 ячейки (по 60 мкл каждая). Example 1. Simultaneous determination in one well of four markers of blood serum: thyrotropin, thyroxin, alpha-fetoprotein and choriogonadotropin is carried out using a 96-well microtiter plate with a capacity of 400 μl, divided by 4 mm high partitions into 4 cells (60 μl each).

Дно ячеек сенсибилизируют (обрабатывают) антителами, специфичными к соответствующим маркерам, и свободные места связывания на дне и стенках ячеек блокируют сывороточным альбумином. В лунки (микрососуды) подготовленного таким образом планшета вносят пробу (сыворотку крови) в объеме 300 мкл. При этом содержимое свободно может перемещаться между ячейками, так как верхний край жидкости пробы на 1,5-2 мм выше верхнего края перегородок между ячейками. После инкубации в течение 4-х часов пробу удаляют промывкой ячеек в промывателе с 384-ячеечной моющей головкой. Затем в ячейки вносят конъюгаты в объеме 30 мкл каждый, специфичные к одному из 4-х маркеров и меченные люминесцентной меткой. После 2-х часовой инкубации с конъюгатами вновь промывают ячейки и на заключительной стадии в них вносят по 30 мкл проявляющего реагента для диссоциации люминесцентной метки в объем. В качестве люминесцентной метки используют ионы европия в составе хелатного комплекса. В качестве проявляющего реагента используют усиливающий раствор для усиления люминесценции ионов европия в пробе. Регистрацию сигнала осуществляют путем последовательного возбуждения сигнала в объеме ячеек и измерения интенсивности люминесценции в режиме временного разрешения с помощью флуориметра (см. фиг. 2). The bottom of the cells is sensitized (treated) with antibodies specific for the corresponding markers, and free binding sites on the bottom and walls of the cells are blocked with serum albumin. A sample (blood serum) in a volume of 300 μl is added to the wells (microvessels) of the thus prepared tablet. In this case, the contents can freely move between cells, since the upper edge of the sample liquid is 1.5–2 mm higher than the upper edge of the partitions between the cells. After an incubation of 4 hours, the sample is removed by washing the cells in a washer with a 384-cell washing head. Then conjugates in a volume of 30 μl each, specific for one of the 4 markers and labeled with a luminescent label, were added to the cells. After a 2-hour incubation with the conjugates, the cells are washed again and, at the final stage, 30 μl of the developing reagent is introduced into them to dissociate the luminescent label into the volume. Europium ions in the chelate complex are used as a luminescent label. An intensifying solution is used as a developing reagent to enhance the luminescence of europium ions in the sample. Signal registration is carried out by sequentially exciting the signal in the cell volume and measuring the luminescence intensity in the time resolution mode using a fluorimeter (see Fig. 2).

Предлагаемая микротитровальная плата позволяет повысить чувствительность выявления тиротропина, тироксина, хориогонадотропина и альфафетопротеина по сравнению с 384-луночным планшетом в 1,8-2,3 раза за счет существенного увеличения объема материала (300 мкл) вместо 80 мкл в каждой лунке. The proposed microtiter plate allows you to increase the sensitivity of detection of thyrotropin, thyroxine, choriogonadotropin and alpha-fetoprotein compared to the 384-well plate 1.8-2.3 times due to a significant increase in the volume of material (300 μl) instead of 80 μl in each well.

Пример 2. Одновременное определение в одной лунке 4-х маркеров из сухого пятна крови, взятой у новорожденного: тиротропина, тироксина, иммунореактивного трипсина и 17OH гидроксипрогестерона с помощью 96-луночной микротитровальной платы, каждый микрососуд которой, емкостью 400 мкл, разделен перегородками высотой 4 мм на 4 ячейки (по 50 мкл каждая). Example 2. Simultaneous determination in one well of 4 markers from a dry spot of blood taken from a newborn: thyrotropin, thyroxin, immunoreactive trypsin and 17OH hydroxyprogesterone using a 96-well microtiter plate, each microvessel of which, with a capacity of 400 μl, is separated by 4-height partitions mm per 4 cells (50 μl each).

Дно ячеек сенсибилизируют антителами, специфичными к соответствующим маркерам, и свободные места связывания на дне и стенках ячеек блокируют сывороточным альбумином. Затем в лунки вносят сухое пятно крови в виде бумажного диска диаметром 4,0 мм, заливают экстрагирующим раствором так, что он может свободно перемещаться между ячейками, так как верхний край жидкости пробы на 1-1,5 мм выше верхнего края перегородок и материала сухого пятна. После инкубации в течение 4-х часов бумажный диск с кровью удаляют отсасыванием с помощью дискоудалителя, экстрагирующий буфер удаляют промывкой ячеек промывателем с 384-ячеечной моющей головкой. Затем в каждую ячейку вносят конъюгаты в объеме 30 мкл, специфичные к одному из 4-х маркеров и меченные люминесцентной меткой. После 2-х часовой инкубации с конъюгатами ячейки вновь промывают на промывателе и на заключительной стадии в них вносят по 30 мкл проявляющего реагента для диссоциации люминесцентной метки в объем. В качестве люминесцентной метки используют ионы европия в составе хелатного комплекса. Регистрацию сигнала осуществляют на флуориметре с временным разрешением люминесценции в объеме ячейки (см. фиг.З). Предлагаемый планшет позволяет повысить чувствительность выявления тиротропина, тироксина, хориогонадотропина и альфафетопротеина из сухого пятна крови по сравнению с 384-луночным планшетом в 3-3,5 раза за счет существенного увеличения объема материала (пятно крови диаметром 5,0 мм) вместо пятна диаметром 2,5 мм при использовании 384-луночного планшета. The bottom of the cells is sensitized with antibodies specific for the corresponding markers, and free binding sites on the bottom and walls of the cells are blocked with serum albumin. Then, a dry blood stain is introduced into the wells in the form of a paper disk with a diameter of 4.0 mm, it is poured with an extracting solution so that it can freely move between the cells, since the upper edge of the sample liquid is 1-1.5 mm higher than the upper edge of the partitions and the dry material spots. After an incubation for 4 hours, a paper disk with blood is removed by suction using a discoiler, the extraction buffer is removed by washing the cells with a washer with a 384-cell washing head. Then, conjugates in a volume of 30 μl, specific for one of the 4 markers and labeled with a luminescent label, were added to each well. After a 2-hour incubation with conjugates, the cells are again washed on a washer and, at the final stage, 30 μl of the developing reagent is introduced into them to dissociate the luminescent label into the volume. Europium ions in the chelate complex are used as a luminescent label. Signal registration is carried out on a fluorimeter with a temporal resolution of luminescence in the cell volume (see Fig. 3). The proposed tablet allows you to increase the sensitivity of detection of thyrotropin, thyroxine, choriogonadotropin and alpha-fetoprotein from a dry blood spot compared to a 384-well tablet 3-3.5 times due to a significant increase in the volume of material (blood stain with a diameter of 5.0 mm) instead of a spot with a diameter of 2 , 5 mm when using a 384-well plate.

Пример 3. Одновременное определение в одной лунке четырех маркеров сыворотки крови: тиротропина, тироксина, альфафетопротеина и хориогонадотропина с помощью 96-луночной микротитровальной платы каждая лунка которой, емкостью 400 мкл, разделена перегородками высотой 0,5 мм на 4 ячейки. В качестве конъюгата с люминесцентными метками используют недиссоциативные люминесцентные метчики и регистрацию сигнала осуществляют непосредственно со дна ячеек. Example 3. Simultaneous determination of four blood serum markers in one well: thyrotropin, thyroxin, alpha-fetoprotein and choriogonadotropin using a 96-well microtiter plate, each well of which, with a capacity of 400 μl, is divided by 0.5 mm high partitions into 4 cells. As a conjugate with luminescent labels, non-dissociative luminescent taps are used and signal registration is carried out directly from the bottom of the cells.

Предварительно дно ячеек сенсибилизируют антителами, специфичными к соответствующим маркерам, свободные места связывания на дне и стенках ячеек блокируют сывороточным альбумином. В лунки вносят пробу (сыворотку крови) в объеме 300 мкл. При этом содержимое свободно может перемещаться между ячейками лунки. После инкубации в течение 4-х часов пробу удаляют промывкой ячеек лунок на промывателе с 384-ячеечной моющей головкой. Затем в ячейки вносят конъюгаты в объеме 30 мкл в виде смеси, содержащей антитела, специфичные к одному из 4-х маркеров и меченные люминесцентной меткой (металлопорфирином или хелатным комплексом ионов европия). После 2-х часовой инкубации с конъюгатами ячейки вновь промывают и на заключительной стадии в них вносят по 30 мкл проявляющего реагента для оптимизации люминесцентных характеристик без процедуры диссоциации метки, а регистрацию сигнала осуществляют непосредственно со дна ячеек (см. фиг.4). В качестве люминесцентной метки используют ионы европия в составе хелатного комплекса. Preliminarily, the bottom of the cells is sensitized with antibodies specific for the corresponding markers; free binding sites on the bottom and walls of the cells are blocked with serum albumin. A sample (blood serum) is added to the wells in a volume of 300 μl. In this case, the contents can freely move between the cells of the well. After incubation for 4 hours, the sample is removed by washing the wells in a washer with a 384-cell washing head. Then conjugates are added to the cells in a volume of 30 μl in the form of a mixture containing antibodies specific for one of the 4 markers and labeled with a luminescent label (metalloporphyrin or chelate complex of europium ions). After a 2-hour incubation with conjugates, the cells are washed again and at the final stage 30 μl of the developing reagent are introduced into them to optimize the luminescent characteristics without the label dissociation procedure, and the signal is recorded directly from the bottom of the cells (see Fig. 4). Europium ions in the chelate complex are used as a luminescent label.

Предлагаемый планшет позволяет повысить чувствительность выявления тиротропина, тироксина, хориогонадотропина и альфафетопротеина по сравнению с анализом в 384-луночном планшете в 2,8-3 раза за счет существенного увеличения объема материала 300 мкл вместо 80 мкл в случае использования 384-луночного планшета. The proposed tablet allows you to increase the sensitivity of detection of thyrotropin, thyroxine, choriogonadotropin and alpha-fetoprotein compared to the analysis in a 384-well plate by 2.8-3 times due to a significant increase in the volume of material 300 μl instead of 80 μl when using a 384-well plate.

Пример 4. Одновременное определение в одной лунке 4-х маркеров из сухого пятна крови, взятой у новорожденного: тиротропина, тироксина, иммунореактивного трипсина и 17OH гидроксипрогестерона с помощью 96-луночного планшета, каждая лунка которого, емкостью 400 мкл, разделена перегородками высотой 0,5 мм на 4 ячейки. Example 4. Simultaneous determination in one well of 4 markers from a dry spot of blood taken from a newborn: thyrotropin, thyroxin, immunoreactive trypsin and 17OH hydroxyprogesterone using a 96-well plate, each well of which, with a capacity of 400 μl, is divided by partitions with a height of 0, 5 mm into 4 cells.

Дно ячеек сенсибилизируют антителами, специфичными к соответствующим маркерам, свободные места связывания на дне и стенках ячеек блокируют сывороточным альбумином. В лунки подготовленного таким образом планшета вносят сухое пятно крови диаметром 5,0 мм. Сухое пятно заливают 30 мкл экстрагирующего раствора. Проводят инкубацию и промывку аналогично примеру 2. В качестве конъюгата с люминесцентными метками используют недиссоциативные люминесцентные метчики. Затем в ячейки вносят конъюгаты в объеме 30 мкл в виде смеси, содержащей антитела, специфичные к одному из 4-х маркеров и меченные люминесцентной меткой (металлопорфирином или хелатным комплексом ионов европия). После 2-х часовой инкубации с конъюгатами ячейки вновь промывают и на заключительной стадии в них вносят 30 мкл проявляющего реагента для оптимизации люминесцентных характеристик без процедуры диссоциации метки, а регистрацию сигнала осуществляют непосредственно со дна ячеек (см. фиг. 5). В качестве люминесцентной метки используют ионы европия в составе хелатного комплекса. Предлагаемый планшет позволяет повысить чувствительность выявления указанных маркеров по сравнению с 384-луночным планшетом в 2,8-3 раза за счет существенного увеличения объема исследуемого материала - пятно крови диаметром 5,0 мм вместо пятна диаметром 2,5 мм при использовании 384-луночного планшета. The bottom of the cells is sensitized with antibodies specific for the corresponding markers, free binding sites on the bottom and walls of the cells are blocked with serum albumin. A dry blood stain with a diameter of 5.0 mm was added to the wells of the thus prepared tablet. A dry spot is poured into 30 μl of extraction solution. Incubation and washing are carried out analogously to example 2. Non-dissociative luminescent taps are used as conjugate with luminescent labels. Then conjugates are added to the cells in a volume of 30 μl in the form of a mixture containing antibodies specific for one of the 4 markers and labeled with a luminescent label (metalloporphyrin or chelate complex of europium ions). After a 2-hour incubation with conjugates, the cells are washed again and at the final stage 30 μl of the developing reagent are introduced into them to optimize the luminescent characteristics without the label dissociation procedure, and the signal is recorded directly from the bottom of the cells (see Fig. 5). Europium ions in the chelate complex are used as a luminescent label. The proposed tablet allows you to increase the detection sensitivity of these markers in comparison with a 384-well tablet 2.8-3 times due to a significant increase in the volume of the studied material - a blood stain with a diameter of 5.0 mm instead of a spot with a diameter of 2.5 mm when using a 384-well tablet .

Минимальная высота перегородок (0,5 мм) достаточна для проведения иммобилизации антител и последующего детектирования с помощью недиссоциативного варианта иммунологического и молекулярно-генетического анализа, когда не требуется специальных буферных растворов, при считывании сигнала с твердой фазы - дна ячеек. The minimum height of the partitions (0.5 mm) is sufficient for immobilization of antibodies and subsequent detection using a non-dissociative variant of immunological and molecular genetic analysis, when special buffer solutions are not required when reading the signal from the solid phase - the bottom of the cells.

Максимальная высота перегородок в микрососудах (4 мм) необходима для проведения диссоциативного анализа с переводом маркеров (например, люминесцентной метки) в объем пробы. The maximum height of the septa in microvessels (4 mm) is necessary for dissociative analysis with the transfer of markers (for example, a luminescent label) into the sample volume.

Чтобы обеспечить размещение сухого пятна крови в микрососуде и экстракцию из него исследуемого материала с последующей иммобилизацией во все ячейки или размещение жидкой пробы образца и иммобилизацию из нее исследуемого материала в ячейки, высота перегородок в микрососудах должна быть на 1-2 мм ниже стенок микрососуда. To ensure the placement of a dry blood stain in a microvessel and the extraction of the test material from it with subsequent immobilization in all cells or the placement of a liquid sample of the sample and the immobilization of the studied material into it, the height of the partitions in the microvessels should be 1-2 mm below the walls of the microvessel.

Увеличение количества лунок у микротитровальной платы - прототипа по сравнению со стандартной платой (8 х 12 см, 96 лунок) приводит к необходимости деления сухого пятна крови или микрообразца цельной крови на более мелкие порции. Это снижает концентрацию аналита в лунке (микрососуде) и соответственно пороговый детектируемый уровень сигнала. Например, уменьшение площади сухого пятна крови до 1-2 мм² не позволяет проводить достоверный анализ такого маркера на врожденный гипотиреоз, как тиротропин, с требуемой точностью (~10%) ни одним из известных методов детектирования (хемилюминесценция, различные типы люминесцентного и иммунного анализа и т. д.).An increase in the number of holes in the microtiter plate prototype compared to the standard plate (8 x 12 cm, 96 holes) leads to the need to divide the dry blood spot or whole blood microsample into smaller portions. This reduces the concentration of the analyte in the well (microvessel) and, accordingly, the threshold detectable signal level. For example, reducing the area of a dry blood spot to 1-2 mm ² does not allow a reliable analysis of such a marker for congenital hypothyroidism, like thyrotropin, with the required accuracy (~ 10%) by any of the known detection methods (chemiluminescence, various types of luminescent and immune analysis etc.).

В предлагаемой микротитровальной плате при увеличении числа ячеек размер микрососуда, в котором они находятся, остается постоянным. Это обеспечивает возможность использования всей пробы для детектирования каждого маркера при многокомпонентном анализе. In the proposed microtiter plate with an increase in the number of cells, the size of the microvessel in which they are kept constant. This makes it possible to use the entire sample to detect each marker in a multicomponent analysis.

Claims

1. Microtiter plate containing individual microvessels having walls and a bottom for immunosorbent, and an opaque matrix with recesses for accommodating microvessels, characterized in that all microvessels are separated into vertical cells isolated from each other by solid partitions made of the same material as walls of microvessels, while the height of the partitions is less than the height of the walls of microvessels by at least 1 - 2 mm and is equal to 0.5 - 4.0 mm.

2. The microtiter plate according to claim 1, characterized in that the cell volume is 25-100 μl.