PT99954B - Processo de preparacao de moleculas de ligacao labeis aos acidos e de composicoes farmaceuticas - Google Patents
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Description
MEMÓRIA DESCRITIVA
Campo do Invento
Este invento refere-se ao campo da imunoterapia do cancro, mais especificamente à preparação de imunoconjugados de uma porção citotóxica com uma porção alvejante e mais especificamente à preparação de imunoconjugados de anticorpos, fragmentos ou derivados funcionais de anticorpos acoplados a uma substância citotóxica como drogas, toxinas ou radio-isótopos. Refere-se especialmente à libertação de substâncias ligadas a uma porção alvejante por meio da utilização de moléculas de ligação cliváveis por ácidos.
Antecedentes do Invento
A imunoterapia é já uma modalidade de tratamento muitas vezes proposta no campo da terapia do cancro. Com a possibilidade de alvejamento de anticorpos ou membros de um par de ligação específico pode ser conseguida uma localização muito mais exacta dos compostos activos ao passo que, ao mesmo tempo, a dose total do composto activo pode ser diminuída, reduzindo-se assim os efeitos nocivos gerais. Em anteriores tentativas, anticorpos (monoclonais) ou outras porções alvejantes foram carregadas directamente com elementos radioactivos como 67Ga, 131I, 99mTc, 111In ou outros isotopos (por exemplo, Marchalonis J. J. , Biochem. J. 113, 299-305, 1969). Num estádio mais recente, a ligação dos isótopos aos anticorpos foi conseguida utilizando agentes guelantes como o EDTA (Krejcarek e Tucker, Biochem. Biophys. Res. Commun. 77, 581-585, 1977) ou DTPA (E.U.A. 4 454 106).
Também foi proposta a utilização de drogas ou toxinas. 0 acoplamento de drogas ou toxinas ao anticorpo ou a um suporte carregado com um ou mais anticorpos tem de ser realizado através de um agente de ligação embora também seja possível produzir proteínas de fusão recombinantes de toxinas e/ou suportes e a porção alvejante.
Os agentes de ligação são bem conhecidos, e está disponível
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0/4279-618 —3— uma gama considerável destes reagentes. Em termos gerais um reagente de ligação compreende dois ou mais grupos funcionais reactivos ligados covalentemente entre eles como grupos carbo-hidroxi-, amino-, tio- ou sulfidrilo-, A ligação covalente entre os dois grupos funcionais pode ser directa mas, em muitos casos, os grupos funcionais reactivos são separados por uma respectiva ligação covalente a um grupo de ponte ou espaçador. Os grupos funcionais reactivos podem ser iguais ou diferentes. Grupos diferentes são preferidos porque permitem um acoplamento mais controlado.
A estrutura química do ligante determina a capacidade do composto activo para ser libertado e expressar a sua actividade no local alvo. Inicialmente, usaram-se estruturas ligantes peptídicas que eram susceptíveis de clivagem por enzimas lisossómicas (Trouet et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. 79, 626-629, 1982). Esta abordagem exige o internamento dos conjugados após a ligação à célula alvo. Na célula alvo as enzimas lisossómicas libertam o composto activo da molécula alvejante.
Outro desenvolvimento é uma estrutura de ligação baseada no ácido aconítico, para prender o grupo amino contendo drogas através de uma ligação amina lábil aos ácidos (Shen e Ryser, Biochem. Biophys. Res. Comm. 102, 1048-1054, 1981). Também neste caso a libertação eficaz da droga exige o transporte dos conjugados para organelos intracelulares ácidos como os endossomas e os lisossomas (De Duve et al.. Eur. J. Biochem. 137, 391-397, 1983).
mesmo é verdade para a patente E.U.A. 4 618 492 que descreve a utilização de reagentes ligantes amino-sulfidrilo caracterizados pela capacidade de se hidrolisarem em soluções moderadamente ácidas.
Para a aplicação de um tal ligante, o conjugado tem de ser internado. Contudo, apenas uma parte menor dos anticorpos produzidos contra antigénios associados ao tumor é capaz de induzir o internamento do imuno complexo e, portanto, do composto activo a ele ligado. Isto é especialmente verdade quando o tamanho do con-
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-4jugado é aumentado pela presença de um suporte.
Esta falência na indução do internamento é um defeito maior na utilização de imuno-conjugados no campo da terapia do cancro.
Sumário do Invento
Verificámos que pode ser preparada uma classe de reagentes de ligação que permite a libertação controlada de substâncias biologicamente activas em condições neutras (o que também significa incluir o pH fisiológico) ou moderadamente ácidas. Estes ligantes permitem a libertação da substância citotóxica na vizinhança imediata do alvo, evitando assim a necessidade de internamento das porções alvejantes, embora os ligantes segundo o invento sejam também adequados para internar as porções alvej antes.
De uma maneira geral estes compreendem derivados de ácido maleico reagentes de ligação.
onde Rj é H, alquilo inferior, alquileno inferior, arilo ou aralquilo inferior ou estes acoplados com -0- orgânico divalente, -SR' ou uma porção de ligação é -Nonde R2 é H, alquilo, arilo ou aralquilo,
R3 é O
O o S
-C-, -0-C-, -S-C-, -0-C-, outra estrutura química que seja
-S-C-, -N-C-, capaz de deslocar
-N-C-, ou o par isolado
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-5de electrões do azoto adjacente e R4 é um grupo reactiv^ fendente, capaz de ligar R3 a uma molécula suporte, uma substância proteica, um anticorpo (fragmento), um polímero ou um ácido nucleico.
Outra forma de concretização compreende o conjugado
onde Rlr R2 e R3 são os anteriormente definidos e onde Rg é a substância activa acilada e R6 é R3 acoplado com o suporte, substância proteica, anticorpo (fragmento), polímero ou ácido nucleico. Estão também incluídos os compostos seguintes de harmonia com:
na qual todos os grupos são os anteriormente definidos.
As misturas de conjugados acima descritos estão também incluídas.
A vantagem do invento reside no facto dos compostos acima descritos poderem ser hidrolisados a valores de pH neutros ou muito moderadamente ácidos. Dado que existe um ambiente neutro ou moderadamente ácido no tecido do tumor, isto permite a clivagem dos conjugados na vizinhança imediata das células do tumor, evitando-se assim a necessidade de internamento do conjugado. Quer isto dizer que os conjugados podem ser feitos não só com anticorpos mas também com qualquer porção alvejante que seja capaz
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-6de reconhecer marcadores específicos nas células que os conjugados têm como alvo. Assim é possível usar ácidos nucleicos, moléculas de suporte, substâncias proteicas, polímeros ou qualquer género de pares específicos de ligação.
Portanto outra área terapêutica para estes conjugados é a morte de uma população específica de células, por exemplo, células T em doenças auto-imunes.
Outra vantagem da libertação dos compostos activos no ambiente imediato da célula alvo reside no facto dos compostos poderem também actuar sobre as células malignas adjacentes para as quais o local de reconhecimento para a parte alvejante não está presente.
Ainda outra vantagem das moléculas de ligação acima descritas reside no facto da sensibilidade à clivagem (ácida) poder ser alterada fazendo variar a dimensão e/ou a natureza dos substituintes em Rj_ e/ou R2 da porção de ácido maleâmico. De uma maneira geral também pode ser dito que quanto mais volumosos forem os substituintes mais lábil será o conjugado. Esta propriedade dá a oportunidade de fazer os conjugados à medida das exigências específicas. Primeiro que tudo, é possível contabilizar o tempo necessário para a porção alvejante localizar as células alvo bem como o tempo de residência nas referidas células.
Desta maneira, em segundo lugar pode ser conseguida uma libertação controlada do composto activo que pode ser ajustada para (a) o ambiente específico das células alvo, (b) a taxa de clearance dos conjugados não ligados e (c) o tipo de composto activo utilizado. Este último ponto é particularmente útil sabendo-se que o tamanho e o pKa dos compostos activos a utilizar podem alterar a susceptibilidade dos conjugados à clivagem. É portanto possível preparar um conjugado que libertará qualquer composto activo particular na desejada região de pH.
A estabilidade do conjugado em soro normal (pH 7,4) é tal
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-7que a clivagem do ligante se dá com um de vários dias, de modo que os conjugados não ligados tenham sido retirados do soro antes de ser gerada uma quantidade nociva de compostos citotóxicos.
Os compostos de ligação acima descritos são úteis para moléculas de reticulação tais como proteínas, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos ou derivados funcionais de anticorpos, ou outros membros de pares específicos de ligação como ligandos ou péptido hormonas, ou fragmentos de ligação de receptor ou seus derivados, especialmente para receptores de superfície celular; para moléculas efectoras tais como drogas citotóxicas, toxinas, metaloproteínas, quelatos com metais (radioactivos), ou para outras proteínas, hidratos de carbono, ácidos nucleicos ou outras moléculas biológicas eficazes, para formar conjugados destinados a ser utilizados no diagnóstico ou na terapia in vivo ou in vitro.
A porção alvejante preferida é uma molécula específica para uma célula de tumor tal como anticorpos ou fragmentos de anticorpo alvejados contra antigénios como CEA, AFP, BFP, hCG, j32 _ microglobulina ou outros marcadores de tumores, ou alvejados contra antigénios ou anticorpos relacionados com vírus como HBsAg, HBeAg, anti-HBs, NANBV, retrovírus como HTLV ou FeLV.
A substância activa preferida a ser distribuída é uma droga citotóxica. A substância activa particularmente preferida é uma droga tendo uma porção química que possa ser acilada, por exemplo, um grupo amina-, hidrazida-, hidroxifenólico-, tio- ou mercapto-, como a adriamicina, daunomicina, mitomicina C, verrucarina A ou outros tricotecenos, metotrexato, 5-fluoro-uracilo ou seus derivados, citarabina, pentostatina, vincristina ou outros vinca alcaloides, etoposido, teniposido, dactinomicina, mitoxantrona, bleomicina ou qualquer outra substância citotóxica.
Para um dado conjugado, um perito na arte reconhecerá que pode ser feita uma estimativa das taxas de libertação da droga e do rendimento de droga livre no local alvo para uma gama de
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-8- <>-'· cr condições de pH e temperaturas que se podem encontrar in vivo. Nesta base pode ser feito um cálculo da quantidade de conjugado necessário para obter um efeito citotóxico substancial nas células alvo.
invento é ainda caracterizado pelos exemplos seguintes:
Exemplos
Exemplo 1
Preparação de um reagente ligante bifuncional
Um reagente bifuncional que serve para introduzir uma estrutura lábil de ácido maleâmico foi preparado como se representa no esquema 1.
Esquema 1
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-91. Preparação de S-benzoil-mercaptoacetato de N-succinimidilo (1)
1. Ácido S-benzil-mercapto-acético (4,6 g; 23,4 mmoles) preparado segundo o procedimento descrito por R. F. Schneider et al. (J. Nucl. Medicine 25, 223-229, 1984) e N-hidroxisuccinimida (2,7 g;
23,4 mmoles) foram dissolvidos em diclorometano (50 ml).
A solução foi arrefecida a -10°C, após o que se adicionou diciclo-hexilcarbodiimida (4,86 g; 23,6 mmoles). A mistura foi agitada a -10 °C durante 1 hora e depois mantida a 4°C durante 16 horas. A diciclo-hexilureia precipitada foi separada por filtração e o filtrado foi evaporado sob vácuo. O resíduo sólido foi triturado com acetato de etilo-éter (1:1), filtrado, lavado com éter e depois seco sob vácuo para dar o composto 1 em epígrafe (4,0 g; 13,6 moles; 58%).
1H-RMN (d6DMSO)
2,82 ppm (S, 4H, -CO-CHo-CHk-CO-);
4,45 ppm (S, 2H, -S-CH2-CO-);
7,6-8,0 ppm (m, 5H, arom.).
2. Preparação de ácido fl-hidroxi-ff-metilaspártico (2)
O composto 2 foi preparado a partir de ácido pirúvico e glicinato de cobre segundo o procedimento descrito por L. Benoiton et al. (J. Am. Chem. Soc. 81, 1726-1729, 1959).
3. Preparação de ácido N-(S-benzilmercaptoacetil)-fl-hidroxi-ff-metilaspártico (3)
3. 0 composto 1 (0,58 g; 2,0 mmoles) foi dissolvido em dimetilformamida (DMF) (5,0 ml). Ácido jS-hidroxi-jS-metilaspártico (0,32 g; 2 mmoles) e trietilamina (0,28 ml) foram depois adicionados à solução de DMF. Obteve-se uma mistura límpida em 15 minutos. A mistura foi agitada durante 5 horas. Adicionaram-se algumas gotas de ácido acético e o solvente foi removido sob vácuo. 0 resíduo foi dissolvido numa solução (10 ml) aquosa de bissulfato de potássio (2% p/p). O produto foi então extractado da solução aquosa com sec-butanol/diclorometano (2:3, v/v; 3 vezes, 10 ml cada).
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-10A fase orgânica foi lavada uma vez com uma solução saturada de cloreto de sódio e seca sobre sulfato de sódio. Os solventes foram removidos sob vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia sobre sílica-60 (Merck, 40-63 /xm) empregando o sistema solvente 1-butanol-ácido acético-água (4:1:1; v/v) para dar o composto 3. (0,44 g; 64%).
1H-RMN /CD3OD): 1,38 ppm (s, ch3) e 1,50 ppm (s, CH3) (razão eritro:treo ~ 1:1; soma: 3H)
3,88-4,00 ppm (m, 1H, -NH-ÇH-CO-)
4,87 ppm (S, 2H, -S-CH2-CO-);
7,48-8,02 (m, 5H, arom.).
4. Preparação de anidrido do ácido 2-N-(S-Benzílmercapto acetil)amino-3-metilmaleico (4)
4. O derivado de ácido aspártico 3. (0,20 g; 0,58 mmoles) foi dissolvido em anidrido acético (2,0 ml). A solução foi mantida a 100°C durante 20 minutos. Depois o solvente foi evaporado sob vácuo para deixar um resíduo sólido que foi triturado com éter-hexano (1:1, v/v) filtrado e seco sob vácuo para dar o composto puro 4 em epígrafe (0,092 g; 52%).
^H-RMN (CDC13): 2,23 ppm (s, 3H, CH3), 3,89 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO-); 7,46-8,05 (m, 5H, arom.)
8,75 ppm (s, largo, 1H, NH)
Exemplo 2
Derivação de adriamicina com o reagente ligante bifuncional 4 fEsquema II) (segue Esquema II)
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-11Esquema II
O OH Ο
Ο
517 0/4279-618
-12., ’ fu. Λ» ' (fi-y ÍS
Adriamicina.HCl (66 mg? 0,11 mmoles) foi suspensa em DMF (1,0 ml). O derivado de anidrido maleico 4 (39 mg; 0,13 mmoles) e etil-diisopropilamina (63 μΐ; 0,36 mmoles) foram adicionados sucessivamente. Obteve-se uma solução límpida em 5 minutos, A CCF (sílica; Merck) no sistema solvente diclorometano-metanol-água-trietilamina (70:30:5:0,1; v/v) indicou a completa conversão da adriamicina. A mistura de reacção foi adicionada gota a gota a acetato de etilo frio (30 ml) sob agitação, após o que os produtos se precipitaram. 0 precipitado foi isolado por centrifugação e depois lavado 3 vezes com acetato de etilo e finalmente com éter e seco (56 mg; 58%).
1H-RMN (DMSO, D6) confirmou a presença da estrutura ligante e indicou as duas estruturas isoméricas possíveis, produtos de reacção da função amina da adriamicina na posição carbonilo C1 ou C4 do reagente anidrido do maleico (ver esquema II) como estando presentes em quantidades aproximadamente iguais.
Adriamicina: isómero 1: isómero 2:
Libertação da
Os dois produtos isoméricos foram claramente separados durante a análise por HPLC numa coluna Bondapak-CI8 (ver figura IA) com eluição isocrática utilizando o sistema solvente A:B = 92:8 v/v, sendo A = metanol-água (3:2, v/v) contendo 0,3% (p/v) de acetato de amónio, e B = metanol, com um caudal de 1,0 ml/min e detecção a 254 nm.
Rt
9,8 min.
11,0 min.
15,5 min.
Exemplo 3 adriamicina do seu derivado ligante, em função do pH
A taxa de libertação da adriamicina do derivado ligante foi estudada para vários valores de pH que iam de 5,0 a 7,5. Preparou-se uma solução base (10 mg/ml) do composto descrito no exemplo 2. Alíquotas desta solução foram diluídas com 50 mM de tampão fosfato de sódio com pH 5,0; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5 res-
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13pectivamente, até uma concentração de 0,1 mg/ml. A vários intervalos de tempo, até 24 horas, as amostras foram submetidas a análise por HPLC. Exemplos destas análises, a pH 6,5 e 7,0 estão representadas na fig. 2.
Como se vê na fig. IB, a taxa de libertação da adriamicina depende do pH, sendo catalisada por ácido. Da fig. 2 também se concluí que a sensibilidade à hidrólise é qualitativamente igual para ambos os derivados ligantes isoméricos. É também evidente que a libertação quantitativa da adriamicina dos derivados ligantes é atingida a tempo.
(segue Exemplo 4)
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-14Exemplo 4
Conjugação do derivado adriamicina-liqante com a albumina do soro humano (HSA) (esquema III)
Esquema III
HSA
HSA
PH7.5 nh2oh
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-15A: Maleoílação da HSA
Uma solução recém preparada de N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC) (2,0 mg) em DMF (0,4 ml) foi adicionada a uma solução agitada (2,0 ml) de HSA (10 mg/ml) em 50 mM de tampão fosfato de sódio, pH 7,5.
A mistura foi agitada durante 30 minutos e depois filtrada através de uma coluna de Sephadex G-25 (PD-10), a qual foi equilibrada e eluída com 50 mM de tampão fosfato de sódio, pH 7,5. A concentração de proteína (7,3 mg/ml) da fracção de HSA foi determinada pelo método de Lowry.
A concentração dos grupos maleimido foi determinada fazendo reagir estas funções com um excesso conhecido de cisteamina e subsequente determinação espectrofotométrica da quantidade de cisteamina remanescente depois de reacção com 2,2'-ditiodipiridina de harmonia com o procedimento de D.R. Grassetti et al.. Arch. Biochem. Biophys. 119. 41-49, 1967.
B: Conjugação do derivado de adriamicina com HSA
Uma solução do derivado adriamicina-ligante (1,5 mg) descrito no exemplo 2, em dimetilformamida (0,5 ml) foi adicionada a 1,3 ml de HSA maleoílada, obtida como se descreveu na alínea A. Hidroxilamina 0,5M (0,072 ml) tamponada a pH 7,0, foi adicionada à mistura sob agitação. A solução foi mantida à temperatura ambiente durante 15 minutos e, depois, durante 15 horas a 4°C.
Adicionou-se uma solução 20 mM de cisteamina (0,10 ml), tamponada a pH 7,5. Após 15 minutos a solução foi aplicada a uma coluna de Sephadex LH-20, equilibrada e eluída com 50 mM de tampão fosfato de sódio-DMF (2:1; v/v) a pH 7,5. 0 eluído contendo proteína foi recolhido e filtrado através de uma coluna de Sephadex G-25 que foi eluída com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5. A quantidade de HSA foi determinada pelo método de Lowry. A quantidade de adriamicina ligada à HSA foi determinada por espectrofotometria (eM487 = 9 000). Verificou-se que a razão de substituição era de 3,7 moles de adriamicina por mole de HSA.
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-16Exemplo 5
Preparação de um reagente ligante bifuncional Um reagente bifuncional diferindo do composto A (esquema I) pela substituição da função mercaptobenzilo pela mercaptoacetilo, foi preparado conforme se representa no esquema IV.
(segue Esquema IV)
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-17Esquema IV
-1873 517
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1. Preparação do ácido S-acetilmercaptoacético (5}
Cloreto de acetilo (175 ml) foi adicionado lentamente a ácido mercaptoacético (100 ml). A mistura foi aquecida à temperatura de refluxo, durante 1 hora. A subsequente destilação sob vácuo deu o composto em epígrafe puro (84,1 g).
^•H-RMN (CDC13): 2,41 ppm (s, 3H); 3,74 ppm (s, 2H) .
2. Preparação de S-acetilmercaptoacetato de N-succinimidilo 6 composto 5. (84 g; 0,62 mole) e N-hidroxisuccinimida (72 g; 0,62 mole) foram dissolvidos em diclorometano (600 ml). A solução foi arrefecida a 0°C e depois adicionou-se diciclo-hexilcarbodiimida (129,8 g; 0,627 mole). A mistura foi agitada a 0°C durante 1 hora e durante mais 20 horas à temperatura ambiente. Após arrefecimento da mistura a 0°C, o precipitado de diciclo-hexilureia foi separado por filtração. 0 filtrado foi evaporado sob vácuo para deixar um resíduo sólido. 0 produto foi triturado com 2-propanol (400 ml) a 0°C e depois isolado por filtração. O produto 6. cristalino foi obtido com um rendimento de 92,5% (134,2 g)·
-'H-RMN (CDC13): 2,43 ppm (s, 3H); 2,85 ppm (s, 4H); 3,98 ppm (s, 2H).
3. Preparação da N-fS-acetilmercaptoacetil)-g-alanina (7)
A uma solução de 0-alanina (24,36 g; 0,27 mole) em água (300 ml), adicionou-se uma solução a 20% (v/v) de etil-diisopropilamina em dimetilf ormamida até o pH ser 8,5. Após diluição da mistura com dimetilformamida (100 ml) adicionou-se lentamente (30 minutos) uma solução do composto 6 (60 g; 0,20 mole) em dimetilformamida (200 ml) à mistura de reacção agitada, enquanto o pH da solução era mantido a 6,5-7,0 por adição simultânea de etil-diisopropilamina (20% v/v em DMF). A mistura foi agitada durante uma hora à temperatura ambiente. O pH da solução foi ajustado a 1-2 por adição de bissulfito de potássio aquoso a 5% (p/p), depois o produto foi extractado com diclorometano-2-butanol (3:2, v/v; 4 vezes 250 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com uma solução saturada de cloreto de sódio e depois com água. Os solventes foram removidos por evaporação sob vácuo, o resíduo foi dissolvido em diclorometano. A solução foi
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-19seca sobre sulfato de sódio. Após remoção dos sais inorgânicos por filtração, o solvente foi evaporado sob vácuo para dar o composto em epígrafe como um sólido (53,8 g) constituído por uma mistura de aproximadamente 1:1 do composto em epígrafe Ί. (0/19 mole; 74%) e dimetilformamida.
l-H-RMN (CDC13): 2,40 ppm (s, 3H); 2,56 ppm (t, 2H; -CH2-CO-O); 3,50 ppm (q, 2H; -NH-ÇH2-CH2-); 3,58 ppm (s, 2H; -S-CH2-CO); 7,01 ppm (t largo, 1H; -NH-CH2-).
4. Preparação do éster p-nitrofenilico derivado de N-(S-acetilmercaptoacetil)-g-alanina (8) composto 2 (22,0 g; 0,107 mole) e p-nitrofenol (14,95 g) foram dissolvidos em diclorometano. A solução foi arrefecida a -5°C, após o que se adicionou a diciclo-hexilcarbodiimida (24,46 g). A mistura foi agitada a -5°C durante 30 minutos, deixando-se depois aquecer até à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi arrefecida até -5°C. A diciclo-hexilureia precipitada foi eliminada por filtração. 0 filtrado foi evaporado sob vácuo para deixar um resíduo que cristalizou espontaneamente. O sólido foi triturado com éter diisopropílico, filtrado, lavado três vezes com éter diisopropílico-acetato de etilo (2:1, v/v) e depois seco sob vácuo para dar o composto em epígrafe homogéneo (18,6 g).
1H-RMN (CDC13): 2,37 ppm (s, 3H, CH3); 2,86 ppm (t, 2H, -CH2-CO-0); 3,54 ppm (S, 2H, -S-CH2-CO-); 3,62 ppm (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-); 6,78 ppm (t largo, 1H, -NH-); 7,33 ppm (d, 2H, arom.); 8,30 ppm (d, 2H, arom.).
5. Preparação de ácido N-(S-acetilmercaptoacetil)-j3-hidroxi-g-metilaspártico (9)
O composto 2 (l/θ 9r 3,07 mmoles) foi dissolvido em dimetilformamida (7 ml). Ácido j8-hidroxi-j0-metilaspártico (0,5 g; 3,07 mmoles) foi adicionado à solução. Trietilamina (0,64 ml; 4,5 mmoles) foi adicionada à suspensão agitada. A agitação continuou durante 2,5 horas, após o que foi obtida uma solução límpida. 0 solvente foi então evaporado sob vácuo. O resíduo foi dissolvido
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0/4279-618 —20—
Ga •^9 em água e a solução aquosa foi depois extractada três vezes com acetato de etilo para se eliminar o p-nitrofenol. Após acidificação da solução aquosa até pH 1-2 por meio da adição de bissulfato de potássio aquoso a 5% (p/p) a solução foi extractada quatro vezes com diclorometano-2-butanol (3:2; v/v). Os extractos orgânicos combinados foram evaporados sob vácuo para dar o composto 9. sob a forma de xarope. 0 produto foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica(R) (Merck 40-63 /im) empregando-se como eluente 1-butanol-ácido acético-água (4:1:1; v/v). As fracções contendo o produto 9_ puro foram combinadas e evaporadas sob vácuo. 0 resíduo foi dissolvido em água e depois o produto foi isolado por liofilização (450 mg; 42%).
1H-RMN (DMSO, D6): 1,30 ppm (s, 3H, CH3); 2,32 ppm (t, 2H, -CH2-CH2-CO-); 2,37 ppm (s, 3H, CH3-CO-); 3,24 ppm (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2“)? 3,58 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO-); 4,57 ppm (d, 1H, -NH-ÇH-COOH); 7,98 ppm (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,04 ppm (t, 1H, -nh-ch2-ch2-).
6. Preparação de anidrido de ácido 2-fN-fS-acetil-mercaptoacetil)-ff-alanil)amino-3-metilmaleico (10) composto 9. (0,284 g) foi dissolvido em anidrido acético recém destilado (4,0 ml). A solução foi mantida a 100°C durante 15 minutos. Depois o solvente foi evaporado sob vácuo para dar um xarope que foi agitado com éter dietílico-hexano (1:1, v/v). Os solventes foram removidos por decantação e depois o óleo foi seco sob vácuo (0,256 g).
^H-RMN (DMSO, D6): 2,01 ppm (s, 3H, CH3-); 2,37 ppm (s, 3H, CH3CO); 2,65 ppm (t, 2H, -CH2-CH2-CO); 3,32 ppm (q, 2H, -NH-CHo-CH2-); 3,58 ppm (s, 2H, -S-CH2-CO); 8,22 ppm (t, 1H, -NH-CH2-);
10,8 ppm (s muito largo, 1H, -NH-C).
7. Preparação de análogos do reagente liqante bifuncional 10
Reagentes bifuncionais, diferindo do composto 10 pelo substituinte na posição 3 do sistema anidrido do ácido maleico, foram preparados como se representa no esquema V.
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-21Esquema V
OH
R.
HoN'
COOH ‘COOH
12a-d
COOH
COOH
14a-d a:R = H b: R = -CH2CH3 c : R « -CH2CH2CH3 d: R = -CH2-CH(CH3)2
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-22Estas sínteses foram realizadas de maneira análoga à descrita para o reagente 10.
Derivados do ácido p-hidroxiaspártico 12b-d foram preparados a partir de glicinato de cobre e ácido 2-oxobutanóico, ácido 2-oxopentanóico e ácido 4-metil-2-oxopentanóico respectivamente, segundo o método descrito por L. Benoiton e outros (J. Am. Chem. Soc., 81, 1726-1729, 1959). 0 ácido 0-hidroxiaspártico foi obtido da Sigma Chem. Comp..
A cromatografia em camada fina (CCF) foi realizada sobre placas pré-revestidas com sílica-gel 60 F254 (Merck”) utilizando o sistema solvente 1-butanol:ácido acético:água = 4:1:1. Os espectros de RMN foram registados num espectrometro Bruker 200 MHz FT. Os desvios químicos são dados em valores S (partes por milhão) em relação ao tetrametilsilano como referência interna. Os espectros de massa FAB de ião positivo foram obtidos num espectrometro de massa de geometria inversa Finigan MAT 90.
A: anidrido de ácido 2-rN-(S-acetilmercaptoacetil)-iS-alanil1aminomaleico (14a)
SATA-/?-Ala-ONP 8. (0,50 g, 1,53 mmoles) e ácido jS-hidroxiaspártico (0,228 g, 1,53 mmoles) foram deixados reagir em solução de dimetilformamida (4 ml) na presença de trietilamina (0,43 ml, 3,06 mmoles) durante 16 horas à temperatura ambiente. 0 produto de reacção 13a foi isolado e purificado como se descreveu para o composto 9.· θ rendimento foi de 0,22 g (43%). CCF: Rf = 0,18.
1H-RMN (6d-DMSO, δ em ppm): 2,32 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-); 2,37 (s, 3H, CH3-CO-); 3,25 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-); 3,58 (S, 2H, -S-CH2~ -C0-); 4,37 (d, 1H, -CHOH-COOH); 4,66 e 4,71 (dd, soma 1H, -NH-ÇH-COOH); 7,96 (d, 1H, -NH-CH-COOH); 8,80 (t, 1H, -NH-CHg-ch2-).
composto 13a (0,206 g) foi dissolvido em anidrido acético recém destilado (3 ml). A solução foi mantida a 100eC durante 30 minutos. 0 solvente foi depois evaporado sob vácuo para dar um xarope. 0 anidrido acético residual foi eliminado por meio de co-
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-23-evaporação (três vezes) com tolueno sob vácuo. O rendimento era quantitativo.
^H-RMN (6d-DMSO, δ em ppm): 2,35 (s, 3H, CH-j-CO-); 2,70 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO); 3,27 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-) ; 3,66 (s, 2H, -S-CH2-C0-); 6,72 (s, intensidade <1, H-C=C-)? 8,23 (t, ÍH,
-NH-CH2-CH2-); 9,0 (s largo, ÍH, -NH-OC-I.
B: anidrido de ácido de 2-rN-(S-acetilmercaptoacetil)-jS-alanil1amino-3-etilmaleico
Ácido 0-hidroxi-jS-etilaspártico 12b (2,17 g, 12 mmoles) foi suspenso em dimetilformamida (15 ml). Juntou-se trietilamina (3,41 ml, 25 mmoles) e depois a mistura foi aquecida a 100°C durante 5 minutos para se obter uma solução límpida.
A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, após o que se adicionou SATA-jS-Ala-ONP 8. (4,0 g, 12 mmoles) em dimetilformamida. A mistura de reacção foi agitada durante 16 horas. O isolamento e a purificação por cromatografia em coluna foram realizados como se descreveu para o composto 9 dando 3,96 g (89%) de 13b. CCF: Rf = 0,30.
1H-RMN (6d-DMSO, δ em ppm): 0,74 (t, 3H, ÇH3-CH2-); 1,52 (q, 2H, CH3-ÇH2-); 2,38 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-); 2,34 (s, 3H, CH3-CO-)? 3,23 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-); 3,56 (S, 2H, -S-CH2-CO-); 4,88 (d, ÍH, -NH-ÇH-COOH); 8,05 (2H, -NH-CH-COOH e -NH-CH2-CH2-).
derivado de ácido aspártico 13b foi tratado com anidrido acético como se descreveu para 13a para dar 14b em rendimento quantitativo.
1H-RMN (6d-DMSO, δ em ppm): 1,04 (t, 3H, ÇH3-CH2-); 2,48 (q, 2H, CH3-ÇH2-); 2,64 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-)· 2'34 (s/ 3H' CH3-CO-); 3,28 (q, 2H, -NH-CHn-CHn-); 3,56 (s, 2H, -S-CH2-CO-); 8,22 (t, ÍH, -NH-CH2-CH2-); 10,5 (s largo, -NH-C=c-).
EMFAB (glicerol) m/z 329 (MH+); C13H16O6N2S exige 328,33
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-24C: anidrido do ácido 2-rN-(S-acetilmercaptoacetil)-g-alanillamino-3-n-propilmaleico f14c)
Ácido )3-hidroxi-j8-n-propilaspártico 12c (0,293 g; 1,53 mmoles) e trietilamina (0,43 ml; 3,06 mmoles) foram aquecidos em dimetilformamida (2 ml) até se obter uma solução límpida. À temperatura ambiente adicionou-se SATA-jS-Ala-ONp 8 (0,50 g; 1,53 mmoles). A mistura foi agitada durante 3 horas. 0 isolamento e a purificação do derivado do ácido aspártico 13c foi feita como se descreveu para o composto 9. 0 rendimento em 13c foi de 0,46 g (79%). CCF: Rf = 0,38.
^-H-RMN (6d-DMSO, 5 em ppm): 0,85 (t, 3H, ÇH3-CH2-CH2-); 1,37 (m, 2H, CH3-ÇH2-CH2-); 1,67 (t largo, 2H, CH3-CH2-ÇH2-); 2,29 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-); 2,37 (s, 3H, CH3-CO-); 3.24 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-);
3,57 (S, 2H, -S-CH2-CO-); 4,56 (d, 11Hz, ÍH, -NH-ÇH-COOH); 7,96 (d, ÍH, -NH-CH—COOH); 8,08 (t, ÍH, -NH-CHn-CHn-).
O composto 13c (0,3 g) foi ciclizado e desidratado por meio de tratamento com anidrido acético para dar 14c (93%).
Ir-RMN (6d-DMSO, 5 em ppm): 0,85 (t, 3H, ÇH3-CH2-CH2-); 1,46 (m, 2H, CH3-ÇH2-CH2-); 2,48 (t, 2H, CH3-CH2-CH2-); 2,63 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-); 2,34 (s, 3H, CH3-CO-); 3,27 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-);
3,57 (s, 2H, -S-CH2-CO-); 8,25 (t, ÍH, NH-CH2-CH2-); 10,6 (s largo, -NH-C=C-)
D: anidrido do ácido 2-rN-(S-acetilmercaptoacetil)-6-alanillamino-3-isobutilmaleico (14d)
Ácido jS-hidroxi-jS-isobutil-aspártico 12d (0,314 g; 1,53 mmoles) foi acilado com SATA-0-Ala-ONp (8.) (0,5 g; 1,53 mmoles) empregando o método acima descrito para dar 0,444 g (74%) de derivado do ácido aspártico I3d. CCF: Rf = 0,44.
EMFAB (glicerol) m/z 393 (MH+); C15H24N2O8S exige 392,4.
tratamento 13d com anidrido acético de (0,40 g) deu o derivado de anidrido maleico 14d com um rendimento de 96% (0,35 g).
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-251H-RMN (6d-DMSO, 5 em ppm): 0,83 (t, 6H, (ÇH3)2CH-CH2-); 1,79 (m, 1H, (CH3)2ÇH-CH2-); 2,67 (t, 2H, -CH2-ÇH2-CO-); 2,37 (s, 3H, CH3CO-); 3,27 (q, 2H, -NH-ÇH2-CH2-); 3,57 (s, 2H, -S-CH2-CO-)? 8,20 (t, 1H, -NH-CH2-CH2-); 10,6 (s largo, -NH-C=C-).
EMFAB (glicerol) m/z 357 (MH+); C15H20N2O6S exige 356,4,
E: anidrido do ácido N-(S-acetilmercaptoacetil)-ff-alanilaspártico (I4e)
O composto em epígrafe é um reagente bifuncional, a que falta a dupla ligação do ácido maleico, destinado a permitir a preparação de conjugados de referência entre droga e proteína, nos quais a ligação é feita através de uma ligação de amida estável. em oposição às ligações lábeis de ácido maleâmico que são obtidas com os reagentes 10 e 14a-d.
Esquema VI
14e
Ácido L-aspártico (0,408 g; 3,06 mmoles) foi acilado numa solução de dimetilformamida (7 ml) com SATA-p-Ala-ONp 8. (1,0 g; 3,06 mmoles) na presença de trietilamina (0,64 ml; 4,6 mmoles). 0 isolamento e a purificação do produto da reacção 13e por meio de cromatografia em sílica foram realizados como se descreveu para o composto 9_· 0 rendimento em SATA-/?-Ala-Asp-OH foi de 61% (0,59 g). CCF: Rf = 0,38.
EMFAB (glicerol) m/z 321 (MH+); C11H16N2O7S exige 320,3.
derivado de ácido aspártico 13e (0,34 g) foi aquecido em anidrido acético (5 ml) a 100°C durante 60 minutos. Os solventes
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-26foram removidos por evaporação sob vácuo seguida de co-evaporação sob vácuo com tolueno (três vezes) para dar o derivado anidrido de ácido aspártico I4e sob a forma de um xarope amarelado.
EMFAB (glicerol) m/z 303 (MH+)? C1;LH14N2O6S exige 302,3,
Exemplo 6
Derivação de adriamicina com o reagente liqante bifuncional 10 (Esquema VII) (segue Esquema VII)
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-27Esquema VII
: R = -CH3 14a:R = -H 14b: R = -CH0-CH3 14c: R = -CH2-CH2-CH3 14d: R = -CH2CH(CH3)2
ADRIAMICINA
H,C
isómero C-l
isómero C-4
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-28Adriamicina.HCl (275 mg; 0,47 mmoles) foi suspensa em Ν,Ν-dimetilformamida (2,0 ml). N-etildiisopropilamina (248 μΐ; 1,42 mmoles) e uma solução de reagente de anidrido maleico 10. (179 mg; 0,57 mmoles) em N,N-dimetilformamida (1,0 ml) foram adicionados sucessivamente. Em 2 minutos foi obtida uma solução límpida. Acetato de etilo frio (0°C) (40 ml) foi adicionado lentamente à mistura de reacção sob agitação, após o que o produto precipitou. 0 precipitado foi isolado por centrifugação e depois lavado 2 vezes com acetato de etilo e finalmente com éter dietilico e seco (325 mg; 80%).
^-H-RMN (DMSO, D6) confirmou a presença da estrutura ligante, estando as duas estruturas isoméricas possíveis presentes numa razão aproximada de 1:2.
B: derivação de adriamicina com os reagentes liqantes bifuncionais 14a-e (Esquema VII)
Utilizando as condições experimentais descritas anteriormente em A, a adriamicina foi feita reagir com os reagentes bifuncionais 14a-e (Esquema V e VI) para dar derivados adriamicina-ligante diferindo no substituinte na dupla ligação de ácido maleâmico.
Por comodidade estes produtos serão denominados: derivado H-ligante (obtido por meio de 14a) derivado metil-ligante (obtido por meio de 10) derivado etil-ligante (obtido por meio de 14b) derivado propil-ligante (obtido por meio de 14c) derivado isobutil-ligante (obtido por meio de 14d) derivado ligante estável (obtido por meio de 14e)
Os derivados adriamicina-ligante foram, em todos os casos, obtidos como uma mistura de duas estruturas isoméricas, o resultado de reacção do grupo amino de daunosamina no local do carbonilo C-l ou C-4 da parte anidrido dos reagentes ligantes.
Os derivados adriamicina-ligante foram caracterizados por
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-291H-RMN, EMFAB e cromatografia em camada fina. Os dados analíticos estão expostos na Tabela i.
Tabela I
| Derivado | Isómero2 relação | EMFAB (DMSO) modo positivo | ||
| adriamicina- -ligador | Rendi- mento | CCF1 Rf | ||
| H | 76% 354 mg | 0,53 | 2,5:1 | 866 MNa+ CggH^^^O^S (843,8) |
| metilo | 80% 325 mg | 0,40 | 2:1 | 880 MNa+ CggH^NgO-j^S (857,83) 902 MNa2-H+ |
| etilo | 87% 154 mg | 0,42 | 3,5:1 | 894 MNa+ C40H45N3O17S 910 MK+ (871,86) |
| propilo | 83% 412 mg | 0,67 | 4:1 | 908 MNa+ C41H47N3O17S (885,89) |
| isobutilo | 86% 434 mg | 0,56 | 4:1 | 922 MNa+ C42H49N3O17S 944 MNa2-H+ (899,9) |
| estável | 80% 651 mg | 0,38 | 3,5:1 | 868 MNa+ C3gH43N3O^7S 884 MK+ |
| 1: cromatografia em | camada | fina (CCF) | sobre sílica 60 F254 (Mer- |
ck) no sistema solvente diclorometano-metanol-água-trietilamina (70:30:5:0,1; v/v)
É dado o valor Rf do isómero principal.
2: razão entre isómeros Cj/C4 ou conforme estimada a partir dos espectros de ^H-RMN.
ΊΖ 517
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-30Exemplo 7
Conjugação do derivado adriamicina-liqante com albumina do soro humano (HSA) (Esquema VIII)
Esquema VIII
HSA
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-31Uma solução do derivado adriamicina-ligante (119 mg) descrito no exemplo 6., em dimetilformamida (2,0 ml) foi adicionada a uma solução (30 ml) de HSA maleoílada (13 mg/ml; 16 grupos maleimido por mole de HSA) preparada como se descreveu no exemplo 4A. Hidroxilamina 0,5M (1,04 ml), tamponada a pH 7,0, foi adicionada à mistura sob agitação.
A solução foi mantida à temperatura ambiente durante 15 minutos e depois, a 4°C, durante 15 horas.
isolamento do conjugado HSA-adriamicina foi feito por cromatografia em sequência em Sephadex LH-20 e em Sephadex G-50, como se descreveu no exemplo 4B. Verificou-se que a razão de substituição era de 15,8 ± 0,5 moles de adriamicina por mole de HSA, no conjugado final. 0 valor baseia-se na quantidade de β-alanina no conjugado determinada por meio de análises de aminoácidos.
Empregando o processo acima descrito, os derivados H-, metil-, etil-, propil-, isobutil- e estável (Asp)-ligante da adriamicina (descritos no exemplo 6B) foram conjugados com a albumina do soro humano, que foi previamente substituída com funções maleimido empregando o N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato (SMCC).
A Tabela II sumariza os dados das análises de aminoácidos num certo número de diferentes preparações adriamicina-ligante-HSA. Os dados indicam que as reacções de acoplamento entre o grupo tiol nos derivados adriamicina-ligante e grupos maleimido com a HSA prosseguem de maneira aproximadamente quantitativa. Os dados indicam também que os métodos cromatográficos (Sephadex LH- -20 e Sephadex G-50) aplicados eram eficazes na remoção do excesso de derivados de adriamicina não ligados, dos conjugados.
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Tabela 2
Composição de conjugados adriamicina-liqante-HSA
| Estrutura ligante | Razão molar: adriamicina/HSA1 | Razão molar: grupos maleimido/HSA1'2 |
| H | 16,3 | 16,4 |
| 11,6 | 10,8 | |
| metilo | 18,2 | 15,2 |
| 11,6 | 10,8 | |
| 15,8 | 16,0 | |
| 15,1 | 15,3 | |
| 12,2 | 10,7 | |
| etilo | 16,6 | 15,8 |
| 16,9 | 15,9 | |
| 13,6 | 14,8 | |
| 15,9 | 16,0 | |
| propilo | 17,0 | 15,9 |
| 15,6 | 15,4 | |
| 14,7 | 15,9 | |
| estável (Asp) | 17,0 | 16,2 |
| 16,7 | 15,9 | |
| 15,7 | 16,2 | |
| 14,4 | 16,5 | |
| 16,4 | 14,2 | |
| 14,4 | 17,1 | |
| isobutilo | 13,3 | 14,6 |
1: Razão molar adriamicina/HSA, determinada pelas análises de aminoácido como o número de resíduos de /3-alanina por mole de albumina do soro humano (foi adicionada norleucina antes da hidrólise como padrão interno)
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-332. A razão molar grupos maleimido (introduzidos na HSA utilizando SMCC)/HSA, determinada por análises de aminoácido como número de resíduos de ácido 4-(aminometil)ciclo-hexanocarboxílico por mole de albumina do soro humano.
Exemplo 8
Ensaio de citotoxicidade
Uma linha de células ováricas humanas, a Α27θ0, foi cultivada em balões de Roux, em meio 505. Para cada experiência, as células foram tripsinizadas e suspensas no meio até uma concentração final de 2 x 104 células por mililitro. Cem microlitros da suspensão de células foram pipetados para cada cavidade de uma placa de microtitulação e as placas foram, durante 16 h, deixadas a 37°C para se obter a aderência máxima. Após uma mudança com meio fresco, uma série de diluições de adriamicina (ADR) e conjugado HSA-ADR, nas quais a droga estava ligada à porção proteica por meio da estrutura ácido metil-substituído maleâmico, foi adicionada às células. A incubação foi feita durante 1 a 7 dias, a pH 6,0 e 7,3 e a 37“C nas condições normais de cultura de células. No fim do período de incubação, adicionaram-se 50 μΐ de MTT 1 g/1 em meio sem FCS, a cada cavidade e a incubação prosseguiu durante 4 h. Depois, o meio foi retirado cuidadosamente, as placas foram secas por absorção e os cristais de formazano formados nas células foram dissolvidos com 100 μΐ de DMSO. Após completa mistura por agitação foi lida a absorvância a 570 nm num TitertekMultiskan. Das curvas obtidas, foram derivados os ID50 (ID^q = 50% de mortalidade das células tratadas) para as condições experimentais individuais. Os resultados estão expostos na fig. 3.
O ID50 de HSA-ADR a pH 6,0 é idêntico ao da ADR livre após uma semana de incubação a pH 6,0 indicando um de 2-3 dias para este tipo de ligante lábil ao pH. O IDgg de HSA-ADR a pH 7,5 muda de 0,14 para 0,11 /xg/ml. Corresponde a um Tj, de cerca de 10 dias a este pH.
Da mesma maneira, como acima se descreveu, o conjugado ligante estável HSA-adriamicina foi testado e comparado com os
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-34ligantes derivados de hidrogénio e metilo (fig. 4).
Também foram testados e comparados os ligantes metilo, etilo e propilo nos conjugados HSA-adriamicina derivados (fig. 5).
Finalmente, na fig. 6, representa-se o teste e comparação dos ligantes metilo e isobutilo.
Exemplo 9
Este exemplo descreve a aplicação de reagentes bifuncionais de harmonia com o presente invento à anguidina e verrucarina A, membros da família dos tricotecenos, micotoxinas com uma citotoxidade extremamente elevada.
A: Derivados de ácido maleâmico de anguidina (Esquema IX) 3-0-famino-isobutiril)anguidina 16
θ O υ
10: RsCH3 14a. R = H
17a:R-H 17b : R « CH-,
O
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-35A uma solução de anguidina (diacetoxi-escirpenol); 72 mg; 0,2 mmoles; adquirida na Sigma Chem. Comp.) em diclorometano seco (1,0 ml), adicionaram-se sucessivamente fluoreto de N-(terc-butiloxicarbonil)-a-aminoisobutirilo (Boc-Aib-F; 80,6 mg; 0,4 mmoles; preparado a partir de ácido N-(terc-butiloxicarbonil)-a-aminoisobutírico, Boc-Aib-0H, e fluoreto cianúrico de harmonia com um método da literatura : Tet. Letters 32, 1303-1306, 1991), 1,5-diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno (DBN 0,2 mmoles) e trietilamina (0,4 mmoles). A mistura de reacção foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente, sendo depois o solvente removido sob vácuo. 0 composto 16 em epígrafe foi obtido com um rendimento de 85% (77 mg) após cromatografia sobre sílica (sistema solvente: diclorornetano-metanol = 97,5:2,5).
1H-RMN (CDC13): 1,41 ppm (ds, 6H, CH3(AÍb)); 3,90 (d, 1H, J=5 H, H-2); 4,15 (dd (AB), 2H, J=12 Hz, H-15); 5,13 (dd, 1H, J=5 Hz, H-4); 5,79 (d, 1H, J=3 Hz, H-3).
EMFAB (glicerol) m/z 452 (MH+); C23H33NO8 exige 451,22.
3-0-ΓΝ-(S-Acetilmercaptoacetil)-ff-Alanil-desidroaspartilaminoisobutirinanguidina (3-0-(Sata-B-ala-desidroAsp-Aib)anguidina) 17a
A uma solução de H-Aib-anguidina 16 (30 mg; 66 /xmoles) em dimetilformamida (0,40 ml) adicionaram-se sucessivamente N,N-diisopropil-N-etilamina (12 μΐ, 66 /imoles) e reagente de anidrido maleico 14a (20 mg; 66 /imoles). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois, sob agitação, adicionada lentamente a éter dietílico frio. 0 precipitado do produto 17a foi recolhido por filtração, lavado três vezes com éter dietílico e seco sob vácuo (33 mg; 66%).
1H-RMN (CDC13): 1,58 (ds, 6H, CH3 (Aib)); 2,40 (s, 3H, CH3-CO-S-); 3,54 (S, 2H, CO-CH2-S-); 5,16 (dd, 1H, J=5 Hz, H-4); 5,75 (d, 1H, J=3 Hz, H-3); 7,04 (s, 1H, HC=C).
EMFAB m/z 752 (MH+); C34H45N3014S exige 751,26.
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-363-Ο-Γ Ν-( S-acetilmercaptoaceti1)-g-alani1-fl-metiIdesidro-asparti1-aminoisobutirillanguidina; f S-O-fSata-g-Ala-iB-CHg-desidroAspAib)anguidina)) 17b
A uma solução de H-Aib-anguidina 16 (28 mg; 62 /imoles) em diclorometano (1,0 ml) adicionaram-se sucessivamente N,N-diisopropil-N-etilamina (11 /il; 62 /imoles) e reagente de anidrido maleico 10 (20 mg; 66 /imoles). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos.
O produto de reacção bruto foi purificado por cromatografia sobre sílica (sistema solvente: diclorometano-metanol-N,N-diisopropil-N-etilamina (80:20:2) para dar o composto 17b em epígrafe (16,1 mg; 35%).
^-H-RMN (CDC13): 1,38 (s, 3H, CH3(Aib)); 1,41 (s, 3H, CH3(AÍb))? 1,48 (S, 3H, CH3-C=C); 2,37 (s, 3H, CH3CO-S-); 3,58 (S, 2H,
S-CH2-CO-); 5,15 (dd, 1H, J=5 Hz, H-4); 5,76 (d, 1H, J=3 Hz, H-3).
B: Derivados de ácido maleâmico de verrucarina A (Esquema X)
O tricoteceno verrucarina A contém uma função hidroxilo única na posição 2' da estrutura do anel macrocíclico. Empregando as condições de reacção descritas em A para a anguidina, fez-se reagir a verrucarina A com Boc-Aib-F 15 para dar, o derivado 2'-0-(2-aminoisobutiril) 18 (27 mg; 93% de rendimento após cromatografia sobre sílica). O derivado 18 foi subsequentemente acilado com os reagentes de anidrido maleico 10 ou 14a, para dar derivados de ácido maleâmico 19a (derivado H-ligante) e 19b (derivado metil-ligante) respectivamente.
Os dois compostos foram purificados por cromatografia sobre sílica no sistema solvente diclorometano-metanol-N,N-diisopropil-N-etilamina (90:10:1; v/v). Rendimentos: 19a, 88% (28 mg); 19b, 62% (17 mg).
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Ο
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Legendas das Figuras
A figura IA é um cromatograma de HPLC mostrando que os derivados do ácido 2-N-(S-benzoilmercaptoacetil)amino-3-metilmaleâmico de adriamicina é uma mistura aproximadamente 1:1 das duas estruturas isoméricas possíveis contendo uma ligação amida C-l ou C-4 (os locais estão indicados na fórmula estrutural do derivado de adriamicina).
A figura IB mostra graficamente a sensibilidade aos ácidos das ligações de ácido maleâmico segundo o invento tal como é indicado, pela taxa crescente de libertação de adriamicina à medida que o pH do meio de incubação se torna mais ácido.
A fig. 2 mostra uma série de cromatogramas de HPLC mostrando as taxas diferenciais de libertação de adriamicina a partir de um derivado de ácido maleâmico substituído com metilo. Os gráficos também mostram que as duas estruturas isoméricas têm uma sensibilidade aproximadamente igual em relação à hidrólise. Estes gráficos representando dados não tratados foram utilizados para construir o gráfico da figura IB.
As figuras 3 a 6 estão descritas no exemplo 8.
Claims (19)
- REIVINDICACÕES1 - Processo de preparação de um composto de acordo com a fórmula:y<R2>^c r4-r3 / Õ na qual:R-L = H, alquilo inferior, -N-alquilo inferior, -0-alquilo inferior, -S-alquilo inferior, -N-aralquilo inferior, -O-aralquilo inferior, -S-aralquilo inferior, -N-alquileno inferior, -0-alquileno inferior, -S-alquileno inferior, -N-arilo inferior, -0-arilo inferior, -S-arilo inferior?R2 = H, alquilo inferior, aralquilo inferior, arilo inferior;R3 éO 0 O S S O S-c-,-O-C-, -S-C-, -O-C-, -S-C-, -N-C-, -N-C-,OU outra estrutura química que seja capaz de deslocalizar o par de electrões isolado do azoto e R4 é um grupo reactivo pendente, ca| paz de ligar R3 a uma molécula suporte, uma substância proteica, um anticorpo (fragmento), um polímero ou um ácido nucleico em que o grupo reactivo pendente é capaz de ligar R3 a um suporte, uma substância proteica, um anticorpo (fragmento), um polímero ou um ácido nucleico, caracterizado por um composto com a fórmula:em que R1# R2, R3 e R4 têm os significados dados anteriormente ser ciclizado por dissolução, e preferivelmente aquecimento, num anidrido de ácido orgânico.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado73 5170/4279-618-40por ser H, metilo, etilo, propilo ou isobutilo, R2 ser H, metilo ou etilo, R3 ser C=0 e R4 ser CgH5-CO-S-CH2- ou CH3-CO-S-ch2-co-nh-ch2-ch2-.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anidrido de ácido orgânico ser anidrido acético.
- 4 - Processo para ligar conjuntamente uma substância proteica, um suporte, um polímero ou um ácido nucleico e uma substância activa tendo um grupo reactivo nucleofílico, caracterizado por se utilizar um composto preparado de acordo com a reivindicação 1.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 4, de preparação de um conjugado hidroliticamente lábil de uma substância proteica, um suporte, um polímero ou um ácido nucleico e uma substância activa tendo um grupo reactivo nucleofílico, de acordo com a fórmula geralOOH na qual:Rj e R2 são os definidos na reivindicação 1,R5 = a substância activa acilada eRg = R3, conforme definido na reivindicação l, caracterizado por se acoplar uma substância proteica, um anticorpo ou um seu fragmento, um suporte, um polímero ou um ácido nucleico.
- 6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, de preparação de um conjugado hidroliticamente lábil de uma substância proteica, um suporte, um anticorpo ou um seu fragmento, um polímero, ou um ácido nucleico e uma substância activa tendo um grupo reactivo nucleofílico, de acordo com a fórmula geral73 5170/4279-618 na qual:R-L e R2 são os definidos na reivindicação 1,Rg = a substância aetiva acilada eRg = r3, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por se acoplar a uma substância proteica, um anticorpo ou um seu fragmento, um suporte, um polímero ou um ácido nucleico.
- 7 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por Rj = metilo e R2 = HOIIR3 = -C-R4, R4 ser o definido na reivindicação 1 e Rg ser o definido na reivindicação 5.
- 8 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por R-l = etilo; R2 = H,IIR3 = -C-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e Rg o definido na reivindicação 5.
- 9 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por Rj = isopropilo e R2 = H,OIIR3 = -c-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e Rg o definido na reivindicação 5.73 5170/4279-618-4210 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por R-l = H, R2 = H,R3 = -C-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e Rg o definido na reivindicação 5.
- 11 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por Rj = isobutilo, R2 = H,IIR3 = -C-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e R6 o definido na reivindicação 5.
- 12 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por RT = H, R2 = metilo,OIIR3 = -C-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e Rg o definido na reivindicação 5.
- 13 - Processo de preparação de um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1, 5 e 6 caracterizado por Rj = H, R2 = etilo,IIR3 = -C-R4, sendo R4 o definido na reivindicação 1 e Rg o definido na reivindicação 5.
- 14 - Processo de preparação de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 13, caracterizado por o suporte ser uma albumina do soro.
- 15 - Processo de preparação de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 14, caracterizado por o73 5170/4279-618 —43 — suporte ser albumina do soro humano.
- 16 - Processo de preparação de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 15, caracterizado por a substância activa ser um agente citotóxico.
- 17 - Processo de preparação de ura conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 16, caracterizado por a substância activa ser adriamicina.
- 18 - Processo de preparação de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 16, caracterizado por a substância activa ser anguidina.
- 19 - Processo de preparação de um conjugado de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 5 a 16, caracterizado por a substância activa ser verrucarina A.
- 20 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se associar um composto ou conjugado de acordo com qualquer das reivindicações l ou 5 a 19 com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
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