PT92603B

PT92603B - Processo de producao de factor de crescimento transformante, quimerico,beta

Info

Publication number: PT92603B
Application number: PT92603A
Authority: PT
Inventors: Anthony F Purchio; Linda Madisen
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1988-12-15
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1995-09-12
Also published as: CA2005120A1; HUT52550A; FI97299B; IE893984L; FI97299C; ES2063834T3; NO895028L; HU896613D0; PT92603A; DE68918248D1; US5244793A; AU4683489A; IL92669A; DK633389A; DK633389D0; EP0374044A3; IL92669A0; JPH0335794A; NO895028D0; DE68918248T2

Description

· INTRODUÇÃO presente invento refere-se ao processo de preparação de um novo factor de crescimento transformante, quimérico, beta, designado por TGE-^1^2 , de sequências de nucleótidos e de vectores de expressão codificando o TGFy)1^2 . o invento é exemplificado' pela produção e secreção de TGE-^1^Ô2 por células CHO transfectadas com vectores de expressão codificando um gene precursor q u i rné rico TGF —l/y2>2 . 0 gene quimérico produzido possui actividade biológica TGF-y) .

2. ANTECEDENTES DO INVENTO factor de crescimento beta transformante (TGF-é um membro de uma família de polipéptidos recentemente descrita que regula a diferenciação e a proliferação celular. Outros membros desta família incluem a substância inibidora de Mullerian (Cate et al., 1986, Cell 45:685-698), as inibinas (Mason et al., 1985, Nature 318:659-663) e uma proteína prevista a partir de um tran_s crito do complexo de genes decapentaplégicos da Drosofila (Padgett et al., 1987, Nature 325:Bl-84).

Foram identificados quatro tipos de TGF~y3, designados por TGF-βΐ, TGE~yi2, TGF-^1.2 e TGF-t53. 0 primeiro tipo descrito, o TGF-fòl, consiste em duas sub dades idênticas ligadas por dissuE fureto, com pesos moleculares de 13.000 (Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160; Frolik et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3676-3680; Frolik et al., 1984, J. Biol. Chem. 260: 10995-11000). Foi purificado a partir de vários tipos de tecidos incluindo a placenta (Frolik et al., 1983, Nature 325:81-84), plaquetas sanguíneas (Childs et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5312-5316; Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160), rim (Roberts et al . , 1983, Biochemistry 22:5692-5698 ), e osso desmineralizado (Seyedin et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 119-123). Foram isolados clones de ADN c codificando TGF-yi>l para o homem (Derynck et al . , 1985, Nature 316:701.705 ), ratinhos (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) e símios (Sharples et

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al . , 1987 , DNA 6:239-244). Α análise da sequência do ADN destes clones indica que o TGE-/ò 1 é sintetizado como um grande polipéptido precursor, do qual o terminal carboxilo é cindido para dar o monómero maduro TGF-y®»· Encontrou-se uma forte homologia sequencial ao longo da proteína do precursor do TGF-/31 em todos ostecidosreferidosacima. ,·

Na presença de soro a 10% e do factor de crescimento epidérmico, o TGF-βΙ promove o crescimento, independente da fixa, ção, dos fibroblastos do rim do rato normal (Roberts et al.,

1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5339-5343; Roberts et al.,

1982, Nature 295:417-419; Twardzik et al., 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297); na presença de apenas soro a 10% é possível induzir a formação de colónias de fibroblastos AKR-2B (Tucker et al., 1983, Câncer Res. 43:1518-1586). Também se demonstrou que o TGF-^l faz com que as células mesenquimais do músculo de ratazana fetal se diferenciem e produzam macromoléeulas especificas de cartilagem (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:5693-5695).

Em contraste com o seu efeito sobre a proliferação de c_é lulas, mostrou-se que o lOV-tf purificado a partir de plaquetas humanas inibe o crescimento de certas células em cultura (Tucker et al . , 1984, Science 226: 705-707). Também se mostrou que o TGF-fbl inibe o crescimento de várias linhas de células do cancro do homem (Roberts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:119-123). Este efeito inibidor/estimulante do TGF~yil pode depender de vários factores incluindo o tipo de células e o estado fisiológico das c.é lulas (passado em revista por Sporn et al., 1986, Science 233:532-534) .

TGF-^2, como o TGF-βΐ, é um polipéptido de peso molecular 26.000, composto por duas subunidades idênticas de 13.000 dalton, que estão ligadas por dissulfureto (Chiefetz et al., 1987,

Cell 48:409-415; Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410), e foi isolado a partir de osso bovino desmineralizado (seydin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949), de plaquetas de porcinos (Che_i fetz et al . , 1987, 48:409-415), de linhas de células humanas de adje

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-4nocarcinoma prostático, PC—3 (Ikeda et al . , 1987, Biochemistry 26: :2406-2410) e de uma linha de células humanas de glioblastoma (Wrann et al . , 1987, EMBO 6:1633-1636 ). Foram isolados clones de ADNc codificando o TGF-^2 do homem e de símios (Madisen et al . ,

1988, DNA 7:1-8; Webb et al., 1988, DNA 7:493-497). 0 monómero maduro TGF-/!»2 é obtido por cisão de um ou dois polipéptidos precursmaiorés '» sores/, da qual podem surgir ARN's-m via junção diferencial (Webb et al., 1988, DNA 7:493-497).

TGF-£>1 e o TGF-^>2 partilham, nas suas regiões maduras, £ ma identidade sequencial de 71 % dos aminoácidos e uma identidade de 41 % nas suas estruturas precursoras. 0 T G E 3 , do qual a s e q u ê£ cia de aminoácidos foi recentemente deduzida a partir de clones de ADNc, parece conter uma sequência C-terminal de 112 aminoácidos com cerca de 80% de homologia em relação aos monómeros do TGF-^1 e

TGF-/$2 (Dijke et al . , 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4715-4719) 0 TGF-y3l.2 é uma forma heterodimérica que compreende uma subunídade (b 1 e uma subunídade [b2 unidas por ligações dissulfureto (Cheifetz et al., 1987, Cell 48:409-415).

2.1. PROCESSAMENTO INTRACELULAR D0 TGE-/>1

A parte amino da região precursora do TGF-βΙ de origem humana, de roedores e de simios, mostra um elevado grau de homologia (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et al., 1986,0. Biol. Chem. 261:4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244), sugerindo qua uma importante função biológica pode estar associada a esta parte da molécula. Estudos recentes, que demonstram que esta parte do precursor do TGE-^1 está glicosilada e fosforilada,apoiam esta alegação pois que se pode admitir que a célula não se daria ao trabalho de realizar estas modificações secundárias se não fosse para uma função específica (Brunner et al . , 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). Estas modificações podem ser importantes para a dimerização do precursor ou para dirigir o seu movimento f£ ra da célula. Há factos que sugerem que a glicosilação do precursor está envolvida no transporte do TGF —/31 maduro fora da célula (Purchio et al . , 1988, 0. Biol. Chem. 263:14211-14215).

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Tem sido manifestada (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol . 8:4162-4168 no prelo;Gentry et al. , 1987, Mol. Cell. Biol. 7:34183427) a existência de algo que tanto pode representar complexos pre cursores intermédios como artefactos de expressão em células CHO e_x primindo o gene TGF-^?>1 do símio. Estes estudos revelaram que o precursor do TGF-y3l, sintetizado por células CHO transfectadas, consis te em pro-TGF-^1, TGF-βΐ maduro e na região pro do precursor interligada por pontes de dissulfureto. Estes complexos precursores lig_a dos por dissulfureto foram também encontrados em formas latentes isoladas de TGF-y^l (Miyazano et al . , 1988, J. Cell. Biochem. Suppl . 12(A):200; Wakefield et al., 1987, 0. Biol. Chem. Suppl. ll(A):46).

Gentry et al . (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8: :4162-4168) proposeram o seguinte esquema para o processamento do pre-pro-TGF-β 1 em células CHO transfectadas. (Os números de posição dos aminoácidos referidos são os da sequência publicada do TGF-J31 de simio (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244)). De acordo com este esquema proposto, o primeiro passo envolve a cisão do péptido de sinal na ligação péptidica Gly-29/Leu-30. Esta cisão ocorre muito provavelmente com a tradução durante a passagem do precursor através da forte membrana do retículo endoplásmico (Blobel e Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol. 67:835-851; Walter et al., 1984, Cell 38:5-8). A seguir à cisão do péptido de sinal, juntam-se unidades do núcleo _z,.. de glicosilação (Rothman et al . , 1978, Cell 15:1447-1454 ) ao pro-TGF-βΐ em cada um dos três locais previstos de N-glicosi 1 ação, localizados em Asn-82, Asn-136 e Asn-176. 0 pro-TGF-y5>l do núcleo glicosilado é então processado sequencialmente durante a passagem pelo complexo Golgi, dando uma glicoproteína fosforilada contendo oligo_s sacáridos complexos sialados. Em dado passo, durante a síntese ou na passagem, ocorre a cisão proteolítica no resíduo dibásico e a isomerização do dissulfureto, libertando TGF-y3l maduro.

Noutro estudo recente foi identificado o mano se-6-fosfa to no precursor do TGF-βΙ. 0 manose-6-fosfato, um análogo de acúcar fosfocilado, parece desempenhar um papel fundamental no transporte dirigido e na permuta intercelular de enzimas lisossomais (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:167-193). Foram identifica dos receptores específicos que reconhecem os resíduos de manose-6-fosfato de enzimas lisossómicas e que são componentes essenciais

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do sistema de transporte. Foram identificadas proteínas lisossócas segregadas contendo manose-6-fosfato rm meio condicionado de células de cultura de tecidos (Gal e Gottesman, 1986, J. Biol. Chem. 261:1760-1765; Capony et al., 1981, J. Cell. Biol. 104:253-262; Baumbach et al., 1984, Proc. Natl . Acad. Sei. USA 81:2985-2989; Sahagian e Gottesman, 1982, J. Biol. Chem. 257:

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11145-11150). E possível que os resíduos de \ do precursor de TGF-p> 1 possam dirigir o pro-TGF-βΐ de lisossomas para processamento proteol í tico, obtendo-se o TGF-y3l maduro. Em alternativa, os resíduos de mano se - 6-fosfato podem funcionar como dirigindo o precursor cindido do TGF-jSl de lisossomas para a degradação.

3. SUMARIO D0 INVENTO presente invento refere-se à produção de grandes quantidades de um novo TGF-βΐ quimérico, designado por TGF-/3 1 /β2,por células hospedeiras eucariõticas transfectas com vectores de ADN recombinante contendo a sequência de codificação do precursor de TGF-/3l/(b2 controlada por elementos reguladores de expressão. 0 ADNc do TGF-^l modificado de modo a que os nucleótidos codificari do os números de resíduos de aminoãcidos, 9-13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGF-βΐ maduro, fossem mudados para os nucleótidos que codificam os aminoãcidos correspondentes da estrutura do TGF-y52 maduro. Manteve-se o uso do códão do símio.

Construiram-se vectores de expressão, codificando o precursor quimérico do TGF-β 1/^5 2 sob o controlo regulador dos elementos reguladores de expressão do Virus 40 do Símio (SV 40), vectores usados para transfectar células de Ovário de Criceto Chinês (CHO). Obtiveram-se transfectantes de CHO que sintetizam e segregam níveis elevados do TGF-^1/^2 maduro. A expressão do TGF-^)l/^>2 foi amplificada com metotrexato e os transfectantes amplificados segregaram algo como lmg/l de TGF-^>l/^2 maduro. A acidificação do meio condicionado dos transfectantes de CHO teve como resultado níveis máximos de TGF-/3l//32 bioactivo. Crê-se que os níveis elevados de TGF-^l/(32 maduro segregado pelas células transfectas de CHO, resultam de uma eficiência fora do vulgar no

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processamento proteolítico da proteína do precurso.r quimérico. Esta eficiência de processamento aumentada pode por sua vez resultar de características estruturais afectadas pela combinação, da requerente , das sequências de aminoácidos do TGF-βΙ e do TGF-^2 no domínio do terminal amino da estrutura do TGF-β maduro.

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1.-Sequência de nucleótidos e de aminoácidos deduzidos da proteína do híbrido TGF-/Í1//32 codificada pelo plasmídeo de expressão p5/&/dhfr.

FIG. 2.-Bioactiνídade do meio condicionado de células 5(341 2.5. A bioactiνίdade foi medida pelo ensaio de inibição do crescimento de células epiteliais de pulmão de marta, CCL-64. (A) Dialisou-se um meio isento de soro condicionado por .céluias 5/541, 2.5» durante 24 horas, contra ãcido acético 0,2 M e ensaiou-se segundo a Secção 6.1.3, infra. (B) curva de inibição de crescimento normal, para o TGF-βΐ.

FIG. 3-“Anãlise de Imuno-Mancha de proteínas segregadas por células 5β41 , 2.5; fizeram-se crescer células 5/^4 1, 2.5 até confluência; dialisou-se o meio contra ãcido acético 0,2 M e submeteu-se a análise de imuno-mancha em condições não-redutoras (faixa 1) ou redutoras (faixa 2) com anti-TGF-βΐ_3Bg_₃₀j como se descreve na Secção 6.1.5. , infra.

5· DESCRIÇÃO DO INVENTO presente invento refere-se ao TGF-β 1 //θ2, ãs sequências de nucleótidos que codificam o TG F-/>1 /(3 2 e o precursor do TGF-yíl/ /(52 e ã produção do TGF-/Í1//32 por métodos de ADN recomb i nante. 0 T G F - 1 / (32 , um novo factor beta de crescimento t ran s f o r ma n te quimérico, é biologicamente activo no ensaio clássico usado para medir a bioactividade do TGF-^1 e é ίmuno-reactívo com anticorpos específicos do TGF-/>1. Uma proteína quimérica compreendendo es t r u t u r a 1 men t e uma combinação das sequências de aminoácido do TGF-jôl e do TGF-/32, que consiste no TGF-^l/(32 do invento contém provavelmente um novo conjunto de actividades biológicas algumas das quais podem ser semelhantes ou quase idênticas ãs exibidas pelas suas moléculas originais, enquanto que outras podem ser únicas do TGF-^1/^2 . Em relação ãs bioactividades

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-8que são semelhantes ou quase idênticas às do TGF-y?>l ou do TGF-^2, este novo factor pode fornecer meios mais eficazes de indução das respostas biológicas correspondentes e o seu uso pode portanto ser uma alternativa desejável ao TGF-y^l θ TGF-/Í2 em várias aplic_a ções médicas previstas para os TGF-β. Estas aplicações incluem, mas a tal não estão limitadas, a indução ou aceleração da proli^f_e ração e diferenciação de células, e a inibição da divisão de céiu las. Assim o TGF-Ji>l/(32 encontra aplicações, por exemplo, no trat_a mento do cancro e na promoção da cicatrização de feridas.

/f-aCv0 processo do invento pode dividir-se nas seguintes fases somente para fins de descrição: (a) criação de uma sequência de codificação para o precursor do TGF-pi/f^ ; (b) construção de um vector de expressão que dirigirá a expressão da sequência de codg ficação do TGF-j3l/(32 ; (c) transfecção de células hospedeiras apropriadas que são capazes de replicar, de expressar o gene e de processar o gene para que produza a forma madura do TGF-/)l/(32 θ/ /ou dos precursores do TGFy5l/J>2 ; e (d) identificação e purificação dos precursos do TGF-y5 1/(32 e do TGF-yS 1/(32 maduro, biologicamente activo.

Logo que se identifica um transfectante que exprime elevja dos níveis de precursores de TGF-/3 1/(32 e/ou de TGF-βΐ/(%2 maduro, a prática do processo do invento envolve a expressão desse clone e o isolamento do gene expresso.

processo do invento é aqui demonstrado por meio de exem pios nos quais o ADNc do precursor do TGF-^1 do simio (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) é modificado de modo a que os nucleótidos que codificam os resíduos de aminoácidos, números 9-13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGF-j}>1 maduro do simio sejam mudados para os nucleótidos que codificam os correspondentes aminoácidos na estrutura do TGF-^2 maduro, enquanto se mantém o uso do códão do simio. A resultante sequência de codificação do precursor do TGF-^>i/(32 quimérico é então usada para construir vectores de expressão que são capazes de dirigir a síntese do produto TGF-yôl//32 maduro.

Os vários aspectos do processo do invento estão descritos

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-9em maior detalhe nas subsecções abaixo e nos exemplos seguintes.

5.1. CRIAÇAO DA SEQUENCIA DE CODIFICAÇÃO DO TGE-(3l/(32 QU^

MERICO

A sequência de codificação de nucleótidos do TGE-[dl/^32 quimérico está descrito na FIG. 1. Na prática do processo do ifiyvento, esta sequência de nucleótidos, ou o seu equivalente func_i onal, pode ser usada para criar moléculas recombinantes que irão dirigir a expressão do TGF-pi/^2 . Devido à degeneração das sequências de codificação de nucleótidos, outras sequências de ADN, como as representadas na FIG. 1, podem ser usadas na prática do presente invento. Estas alterações da sequência de nucleótidos da EIG. 1 incluem delecções, adições ou substituições dos diferentes resíduos de nucleótidos que resultam numa sequência que codifica o mesmo gene ou um seu equivalente funcional. 0 gene p£ de conter delecções, adições ou substituições de residuos de am_i noácidos dentro de uma sequência, que têm como resultado uma alteração simples produzindo um produto bioactivo. Estas substitu_i ções de aminoácidos podem ser feitas na base da semelhança na pjo hidrofilia laridade, carga, solubilidade, hidro fobia,/e/ou a natureza anfipjS tica dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativam-ente incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem a lisina e a arginina; os aminoácidos com os grupos principais sem carga polar ou grupos principais não polares com valores semelhantes de hidrofilia incluem os seguintes : leucina, isoleucina, valina,glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalamina, tirosina.

A sequência de nucleótidos do TGF-βΐ do símio pode ser obtida a partir de fontes de células de símio (Sharples et al., 1989, DNA 6:239-244 ). A sequência de nucleótidos do TGF-,âl/^2 quimérico, na EIG. 1, pode ser preparada por métodos já conhecidos na arte incluindo, mas não a tal limitado, o uso de enzimas de restrição de ADN, de oligonucleótidos sintéticos e de ligases de ADN. Em alternativa, a sequência de codificação da EIG. 1 pode ser sintetizada no todo ou em parte, usando métodos químicos já bem conhecidos na arte.

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-10Num arranjo específico do invento, a sequência de codificação do TGF-βΐ do símio foi obtida a partir de um clone de ADNc de comprimento completo, obtido a partir de uma linha de células do macaco verde africano, BSC-40 (Sharples et al., 1987, supra ).

A sequência de codificação do TGF-y3l/(32 quimérico, representada na FIG. 1, foi então obtida a partir do ADNc do TGF-/31//32 do símio por remoção e substituição das sequências de codificação dos resíduos de aminoácidos números 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da molécula do TGF-J&l maduro pelas sequências de codificação de resíduos de aminoácidos números 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da molécula do TGF-^2 maduro (Madisen et al., 1988, DNA 7: :l-8) usando as técnicas de construção de genes.

5.2.CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRES5A0 CONTENDO A SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO D0 TGF-(3l//32 QUIMÉRICO

Com vista a expressar o TGF-y6l/p>2 maduro, biologicamente activo, deverá escolher-se um sistema de vector de expressão/hojs pedeiro que forneça,não só elevados níveis de transcrição e de tradução, mas também o processamento correcto do gene. Isto é es pecialmente importante quando se emprega a sequência completa de codificação do precursor do TGF-/>i/(32 quimérico na expressão das construções pois, tal como o TGF-^il e o TGF-/Ó2, crê-se que o TGF-/>l/£>2 quimérico, maduro, seja libertado de uma molécula precursora ou complexo de moléculas pelos acontecimentos do processamento celular. Além disso pode ser desejável um sistema de célula expressão/hospedeiro que forneça a secretina do produto.

Fm particular, parece que o TGF-^l/(32 maduro é um homod_í mero, ligado por dissulfuretos, de 112 aminoácidos por subunidade, formada pelos acontecimentos do processamento celular, que se crê serem semelhantes aos que formam o TGF-^1 e o TGFy32 madjj ros. Q precursor do TGF-^5 1/(32 tem três locais potenciais de N-glicosilação no seu domínio pro (Sharples et al . , 1987, DNA 6: :239-244). 0s estudos que envolvem o TGF-βΐ determinaram que a N-g1icosilação e a fosforilação no domínio pro do TGF-p>l ocorrem nas células de CHO transfectadas , implican do um papel funcional importante do percursor na síntese .<

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-11celular e libertação ou secreção da molécula madura (Brunner et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). A presença de manose-6-fosfato no precursor de TGF 1 também reforça a hipótese de que o precursor tem actividade funcional independente (Purchio et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:14211-14215). Como o precursor dn TGF-yôl/(32 quimérico contém o domínio pro do TGF-^l do símio^ a requerente crê que o precursor do TGF-^1/^2 é funcionalmeb te activo e importante para o processamento correcto da molécula madura do TGF-^l/(32.

Assim, a capacidade de uma célula hospedeira usada no sistema de expressão para exprimir correctamente e processar o TGF-^lZ/32 quimérico é importante para a produção de um produto maduro, bioactivo.

Num arranjo específico aqui descrito, o TGF-^Ô 1/(^2 maduro, bioactivo, é produzido com sucesso usando elementos de cori trolo de expressão do virus 40 do símio (SV40) num sistema de células hospedeiras do Ovário de Criceto Chinês (CHO). No entari to podem ainda ser igualmente bem utilizados pelo perito na arte diversos sistemas de vectores de expressão/outros animais hospedeiros (isto é, vectores que contêm os elementos necessári. os para dirigirem a replicação, transcrição e tradução da sequência de codificação do TGF-_zál/(32 numa célula hospedeira apropriada). Estes incluem, mas a tal não estão limitados, sistemas de vectores de expressão de vírus/célula hospedeira dum mamífero, (p. ex., citomegalovírus, vírus de vacina, adenovírus e semelhantes); os sistemas de vectores de expressão de vírus de i_n secto/célula de insecto (p. ex. , baculovírus) ; ou sistemas de expressão de promotor não virai derivados dos genomas de células de mamíferos (p. ex., promotor de metalotioneína de ratinho).

Os elementos de expressão destes factores variam na fo_r ça e especificidade. Dependendo do sistema hospedeiro/vector utilizado, podem utilizar-se guaisquer elementos adequados de transcrição e tradução. Por exemplo, quando se clonam sistemas de células de mamíferos, podem usar-se promotores isolados do genoma das células dos mamíferos (p. ex., o promotor de metalo./.7

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-12tioneína de ratinho) ou os vírus que crescem nestas células (p.ex. promotor do vírus de vacina de 7,5K) . Os promotores produzidos pelo ADN recombinante ou por técnicas de síntese podem também ser usados para fornecerem a transcrição das sequências inseridas.

Os sinais de iniciação específica são também necessários para uma tradução suficiente das sequências de codificação daà^ proteínas inseridas. Estes sinais incluem o códão de iniciação ATG e sequências adjacentes. Por exemplo, nos casos onde apenas está inserida uma parte da sequência de codificação do TGF-y&./(Í2, devem ser fornecidos sinais de controlo de tradução exógenos, incluindo o códão de iniciação ATG. Além disso, o códão de iniciação deve e_s tar em face com a estrutura de leitura das sequências de codifi_ cação do TGF-^1/^2 para assegurar a tradução de toda a parte inserida. Estes sinais de controlo de tradução exógenos e estes codões de iniciação podem ter várias origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência de expressão pode ser melhorada pela inclusão de sequências de atenuação de transcrição, elementos melhoradores e semelhantes.

Qualquer dos processos anteriormente descritos para a inserção de fragmentos de ADN num vector, pode ser usado para construir vectores de expressão contendo a sequência de codificação do TGF-β 1/^2 e os sinais adequados de controlo de tradução/transcrição. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinações in vivo (recombinação genética ) .

Nos casos onde se usa um adenovírus como vector de expres são, a sequência de codificação do TGF-^ôl/^2 pode ser ligada a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, p. ex., o tardio promotor e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma do adenovírus por recombinsi ção in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (p. ex., região El ou E3) vai resultar num vírus recombinante que é viável e capaz de exprimir o TGF-^ 1 /(32 quiméri co em hospedeiros infectados. De modo semelhante pode ser usado o pro motor da vacina de 7,5K.

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-13Um sistema de expressão alternativo que poderia ser usado para exprimir o TGF-jôl/^2 é um sistema de insectos. Num desses si_s t mas usa-se o virus de poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) como vector para exprimir genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do TG F -/> 1/(32 pode ser clonada em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de poliedrina) do vírus e colocada sob controlo de um prómc) tor de AcNPV(por exemplo, o promotor de poliedrina). A inserção bem sucedida da sequência de codificação do TGF/(32 terá como resultado a inactivação do gene de poliedrina e a produção de virus recombinante não cheio (isto é, virus a que falta a camada protei^ca codificada pelo gene de poliedrina). Estes vírus recombinantes são então usados para infectar as células de Spodoptera frugiperda onde se expressa o gene inserido.

Além disso pode escolher-se uma estirpe de células hospedeiras que module a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o gene na forma especifica pretendida. A expressão de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores (p. ex. iões de zinco e cádmio para promotores da metaloti^ neína). Pode portanto controlar-se a expressão do TGF-/Í>1/P2 criado por engenharia genética. Isto é importante se a proteína do g_e ne estranho clonado for letal para as células hospedeiras. Além disso, as modificações pós-tradução tais como a glicosilação e fe nómenos do processamento como a cisão proteolítica da proteína,p^ dem ser importantes para a funcionalidade da proteína. As diferert tes células hospedeiras têm mecanismos característicos e especiff cos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas. Podem escolher-se linhas de células apropriadas ou sistemas hosp_e deiros para assegurar a modificação correcta e processamento da proteína estranha expressa.

Num arranjo especifico do invento, constroi-se um vector de expressão, contendo a sequência de codificação do TGF-/)l/^2 em série com o gene da di-hidrofolato-redutase do ratinho (dhfr) sob o controlo de sequências reguladoras de SV40, que se usa para transfectar células CHO deficientes em dhfr. Isolam-se os transfeg tantes de CHO expressando o fenotipo do dhfr, por propagação em meios selectivos. Para aumentar o nível de expressão do TGF-y3l/(32,

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os transfectantes podem ser expostos a concentrações crescentes de metotrexato com vista a isolar os clones que transcrevem níveis elevados do ARNm do TGF-J&1/P2. Os níveis de ARNm do TGFry$l/ podem ser avaliados em várias fases da amplificação por hibri^ dação da solução (Uhler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:1300-1304)

5.3. IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFECTANTES QUE EXPRESSAM 0 TGF-|3l//?>2 QUIMÉRICO

As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação do TGF-/,l/f32 e que exprimem o produto maduro, biol ogi cameri te activo, podem ser identificadas pelo menos por 4 caminhos gerais: (a) hibridação ADN-ADN; (b) presença ou ausência de funções de marcador” do gene; (c) avaliação do nível de transcrição medido pela expressão das transcrições do ARNm do TGF-^l/j^Z na célula hospedeira ; e (d) detecção do gene maduro medido por imuno-ensaio e, por fim, pelas suas actividades biológicas.

Em primeira aproximação, a presença da sequência de cod_i ficação do TGF-y3 1//32 inserida no vector de expressão pode ser d_e tectada por hibridação ADN-ADN usando sondas que incluem sequências de nucleótidos homólogas da sequência de codificação do TGF-^ôl/732, essencialmente como se mostra na FIG. 1, ou partes sjj as ou seus derivados.

Em segunda aproximação o sistema de vector de expressão recombinante/hospedeiro pode ser identificado e escolhido com base na presença ou ausência de certas funções de marcador do gene (p. ex. a actividade quinase da timidina, a resistência a a n t i b_i óticos, a resistência ao metotraxato, o fenotipo de transformação, a formação dum corpo de oclusão no baculovírus, etc.). Por exemplo, se a sequência de codificação do TGF-y3l/^2 é inserida na sequência do gene marcador do vector, os recombinantes que contêm a sequência de codificação do TGF-Ji 1//32 podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Em alternati_ va, um gene marcador- pode ser colocado em série com a sequência do TGF-^ôl/^ sob o controlo do mesmo ou de diferente promotor usado para controlar a expressão da sequência de codificação do

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XS&.

TGF-£>1/(Ϊ2 ·

A expressão do marcador em resposta à indução ou selecção indica a expressão da sequência de codificação do TGE-^i/^·

Numa terceira aproximação, a actividade de transcrição da região de codificação do TGF-yôl/(^J2 pode ser avaliada por ensaios de hibridação. Por exemplo, o ARN poliadeni1 a do pode ser isolado e analisado por mancha Northern usando uma ronda homóloga da sequência de codificação do TGF-^>1/(32 ou de suas porções. Em alternativa, os ácidos nucleicos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e avaliados por hibridação dessas sondas.

Em quarta aproximação, a expressão da proteína madura pci de ser avaliada imunologicamente, por exemplo, por mancha Western, por imuno-ensaios tais como imuno-mancha, radioimunoprecipitação, imunoensaio ligado a enzima e outras semelhantes. 0 teste definitivo do sucesso do sistema de expressão envolve contudo a detecção do gene TGF —yfí> 1/f^2 biologicamente activo. Dnde a célula hosp£ deira segrega o gene, o meio isento de células obtido a partir da célula hospedeira transfectante cultivada, pode ser avaliado quari to à actividade do TGE-y5i/p>2 · Onde o gene não foi segregado, pode avaliar-se essa actividade nos lisados de células. Em qualquer dos casos, os ensaios biológicos, como o da inibição do crescimen to aqui descrito, ou semelhantes, podem ser usados.

Logo que se identifique um clone produzindo níveis elevados de TGE-₎ôl/(32 maduro, pode expandir-se o clone e pode purificar-se o TGF-/>1/(32 usando técnicas já bem conhecidas na arte. Estas técnicas incluem a purificação por imuno afinidade, métodos cromatográficos incluindo a cromatografia líquida de alta eficiência e semelhantes.

6. EXEMPLO: PRODUÇÃO DE TGF-^l/p2 POR EXPRESSÃO EM CÉLULAS DO OVÁRIO DE CRICETO CHINÊS

Foi construído um plasmídeo recombinante, codificando o precursor do TGE-jól, onde os aminoácidos 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 e 26 da sequência do TGE-ôl maduro foram substituídos pe-

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5624-057-11Β ,-16los aminoácidos correspondentes da sequência do TGF-f)2 maduro. Especificamente, o aminoácido 9 do TGF-y$l maduro (serina) foi subst_i tuido por arginina, o aminoácido 10 (serina) foi substituí do-por asparagina, o aminoácido 11 (treonina) foi substituído por valina, o aminoácido 12 (ácido glutâmico) foi substituído por glutamina, o aminoácido 13 (lisina) foi substituído por ácido aspártico, o aminoácido 17 (valina) foi substituído por leucina, o aminoácido l\? (glutamina) foi substituído por prolina, o aminoácido 25 (arginina) foi substituído por lisina e o aminoácido 26 (lisina) foi substituído por arginina. 0 produto construído foi usado para transfede ctar células/CHO. Foram isolados transfectantes que produzem e segregam um TGF-y)>l/^2 maduro, bioactivo, quimérico.

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. TRANSFECÇOES DE ADN

Aproximadamente 24 horas depois da sementeira de 10^ céljj las de CHO, deficientes em dhfr, em placas de 100 mm, transfectaram-se as culturas com 1 ^g de pl asmí deo. p 5/5/dh f r linearizado com NdeI e 19yxg de ADN de timo de vitela como veículo, como precipitado de fosfato de cálcio (Wigler, M., et. al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U . S . A. 76:1373-1376). Resumidamente, juntaram-se 20y<Ag de plasmídeo mais o ADN veículo a 1 ml de CaC^ estéril 250 mM. Juntou-se, gota a gota, a solução de ADN (1 ml) a uma porção de 1 ml de solução 2x HEPES (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, fosfato de s_ó dio 1,5 mM, pH 7,1) com borbulhamento, e deixou-se a mistura assentar sobre gelo durante 30 minutos. 0 precipitado foi então dijs persado gota a gota sobre as células com 10 ml de meio F12 (Gibco). Depois de incubar a 37°C durante 4 horas, o meio foi removido e substituido com 10 ml de meio F12 contendo glicerol a 25% durante 90 segundos à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez com 20 ml de meio F12 e incubadas em meio F12 (20 ml) não selectivo por mais 48 horas. A selecção de transfectantes exprimindo dhfr foi conseguida por substituição do meio por DMEM suplemer, tado com FBS dialisado a 10% (Gibco) e 150 ^g/ml de L-prolina. As colónias foram observadas após cultivo das células 10-14 dias no meio de selecção.

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6.1.2.SELECÇAO DE CÉLULAS RESISTENTES AO METOTREXATO

Foram obtidas células amplificadas de di-hidrof ol ato redjj tase (dhfr) a partir dos transfectantes primários essencialmente como foi descrito (Gasser, C.S. e Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem. 261:6938-6946). Após expansão, 10^ células foram semeadas sobre placas de 100 mm e adaptadas a concentrações crescentes de metotrexato (100 nM; 500 nM; 2.500 nM; 10.000 nM; 20.000 nM). A' concentração inicial do metotrexato foi de 100 nM. A placa que continha colónias visíveis foi tripsinizada e adaptada a essa con centração do metotrexato, pelo menos por duas passagens adicionais de células 1:5. As células (10 j foram então semeadas em placas de 100 mm na concentração seguinte mais elevada de metotrexato. A placa que contivesse colónias visíveis era de novo tripsinizada e adaptada no meio contendo metotrexato. As células foram recong_e ladas nas várias fases de amplificação em meios contendo FBS a 40%, dimetilsulfóxido a 10% e DMEM a 50%. 0 metotrexato não foi i_n cluído no meio de congelação.

6.1.3. AVALIAÇAO DA INIBIÇÃO D0 CRESCIMENTO

Para o ensaio de inibição do crescimento foram utilizadas células epiteliais de pulmão de marta, Mv 1 Lu (N^ de Acesso CCL-64, American Type Culture Collection) que são extremamente sens_í veis ao TGF-/5. 0 ensaio foi realizado usando o análogo da timidi125 125 na, a 5’-[ ij-iodo-2 ’-desoxiuridina , ( IdU), para avaliar a síntese do ADN. Definiu-se uma unidade de actividade como a quarn 125 tidade necessária para inibir 50% da incorporação de IdU comparada com a de células CCL-64 não tratadas.

Para avaliar nas células transfectadas a secreção do TGF-(3l/ /(32 activo, recolheram-se sobrenadantes isentos de soro, numa colheita de 24 horas em culturas confluentes de células e dialisaram-se intensamente contra ácido acético 0,2 M. As amostras foram diluídas, para os ensaios, em meio de cultura completamente esté^ r i 1 .

6.1.4.SÍNTESE DE PÉPTIDOS E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS

Sintetizaram-se péptidos por técnicas de fase sólida num

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-18- ·<^? ,· dispositivo Beckman 990 e separaram-se da resina como anteriormen te se descreveu (Gentry, L.E., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 11219-11228; Gentry, L.E. e Lawton, A., 1986, Virology 152:421-431). A purificação foi obtida por cromatografia liquida de alta eficiência. A composição dos péptidos foi confirmada por análise de aminoácidos.

Os péptidos sintéticos foram conjugados com gama-globulina bovina através do resíduo de cisteína. As reacções de ligação foram essencialmente realizadas como se descreveu (Gentry e Lawton,

1986, supra) . A eficiência da conjugação dos péptidos variou de 8 a 26 moléculas de péptidos ligadas covalentemente, por molécula de gama-globulina.

I na cu 1 aram-se coelhos brancos da Nova Zelândia em 3 a 6 locais por inoculações subcutâneas e intradérmicas, combinadas com péptidos conjugados (100 çjg equivalentes de péptido) emulsionados em adjuvante completo deEreunds. Administraram-se inoculações de reforço em intervalos de 2-3 semanas. As sangrias fizeram-se 7-14 dias a seguir aos reforços.

Os anticorpos anti-péptidos dirigidos para as sequências de péptidos, dentro da molécula do TGF-y3l , foram criados em coelhos usando péptidos sintéticos como imunogénios (Gentry et al.,

1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Um dos anticorpos (antiTGE~y) 1 gg g _ 3 g i ) foi dirigido para os epítopos presentes dentro da forma madura do factor de crescimento TGF-^. Os outros dois anticorpos ( anti-TGF-jS>l g ₃_g4 e ant i — TGF—/ϊ> 1 ₂25-236 ) ^s®° P^recur· sores específicos e são dirigidos para as sequências de péptido presentes apenas dentro da molécula precursora do TOF-^l.

6.1.5. EN5AI0 DE IMUNO-MANCHA

Eraccionaram-se proteínas em geles de SDS-poliacrilamida de gradiente 7,5&-17,5?í e transferiram-se para nitrocelul ose não modificada (0,45 cm; Schleicher e Schuell) durante 1 hora a 24 volts a 4°C (Burnette, W.N., 1981, Anal. Biochem. 112:195-203).

A capacidade de ligação em excesso da nitrocelulose foi bloqueada por incubação com BLOTTO a 2,5?í (Johnson, D.A., et al . , 1984, Gene Anal. Techn. 1:3-8) em soro salino tamponado com fosfato

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-19- '·>

(PBS) contendo NP-40 a 0,2%. Incubou-se anti-soro de coelho diluído a 1:75 em BLOTTO a 2,5%, com folhas de nitroceiulose bloqueada durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de retirar por lava gem o excesso de anticorpo, por 5 lavagens de 5 minutos em BLOTTO a 2,5%, as folhas de nitrocelulose foram incubadas com Proteína A conjugada cóm fosfatase alcalina, diluida a 1:500 em BLOTTO a 2,5%

T

Depois de 2 horas de incubação, as folhas de nitrocelulose f o r a*m lavadas 5 vezes em PBS (lavagem de 5 minutos) contendo NP-40 a 0,2%, e foram reveladas (Leary et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. 80:4045-4049)

6.1.6. CONSTRUÇÃO D0 PLASMÍDEO QUE PROGRAMA A SÍNTESE D0 TGF-p)l/(52 plasmídeo que programa a síntese da proteína TGF-/3l/p2 quimérica, p5/?/dhfr, foi construído como se segue. 0 pAc/^TGF-l, um vector baculovírus derivado do pAc373 (Miyamoto et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et al., 1987, Virology 158: :248-250) que contém a sequência de 1,4 Kb PstI-EcoRI de codifica ção do TGE-^»1 (Sharples et al . , 1987, DNA 6:239-244 ) clonado no local Pstl-ÊcoRI do pAcóll (Miyamoto et al.,1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et al., 1987, Virology 158:248-250), foi digerido com BamHI e EcoRI e isolou-se o fragmento de 375 bp da sequência de codificação do TGF-fo 1 (fragmento 1). 0 pSV2-^>TGE (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427) foi digerido com ApaI e EcoRI e isolou-se o fragmento de 3,5 Kb (fragmento 2).

Oligonucleótidos sintéticos complementares com as sequêri cias abaixo indicadas, foram sintetizados num Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer e purificado em gel de acrilamida. Juntaram-se fosfatos com quinase T4 e desnaturaram-se/renaturaram-se quantidades equimolares de oligonucleótidos de quinase. 0 ADN sintetizado de espiral dupla tratado foi então ligado aos fra gmentos 1 e 2 acima descritos. Usou-se a mistura de ligação para transformar E. coli e isolou-se o 5(5p5V2(Hpa E_co⁺).

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CAA	CAT	CTG	CAA	AGC	TCC	CGG	CAC	CGC	CG A	GCC
CTG	GAC	ACC	AAC	TAC	TGC	TTC	AGA	AAT	GTG	CAG
GAT	AAT	TGC	TGC	CTA	CGT	CCG	CTT	TAC	ATT	GAT
TTC	AAG	AGG	GAT	CTA	GGG	TGG	AAA	TG	- 3’
GAT	CCA	TTT	CCA	CCC	TAG	ATC	CCT	CTT	GAA	ATC
AAT	GTA	AAG	CGG	ACG	TAG	GCA	GCA	ATT	ATC	CTG
CAC	ATT	TCT	GAA	GCA	GTA	GTT	GGT	GTC	CAG	GGC
TCG	GCG	GTG	CCG	GGA	GCT	TTG	CAG	ATG	TTG	GGC C - 3

Digeriu-se 5(3pSV2 (Hpa~Eco⁺) com EcoRI , preencheu-se com enzima Klenow, digeriu-se com HindIII e isolou-se o fragmento de 1,4 Kb contendo a sequência de codificação do TGF-j2)1/(32 quimérico (Fragmento 3). 0 5ppSV2 foi construído ligando o Fragmento 3 no p5V2, neo que tinha sido previamente digerido com HindIII e Hpal para eliminar o gene neo.

5(3pSV2 foi digerido com EcoRI , preenchido com enzima Klenow, diqerido com Ndel, isolou-se o fragmento de 2,6 Kb Ndel -EcoRI (de terminais rombos) e ligou-se ao pSV2/dhfr (Gentry et al . , 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3718-3727) que tinha sido digerido com Ndel e P vu11 . Usou-se a mistura de ligação para transformar

E. coli e isolou-se o p5(3/dhfr. Na EIG. 1 estão indicadas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzidos da molécula do TGF-^>l/[32 quimérico codificado pelo p5(3/dhfr.

6.2. EXPRESSÃO DO TGE-(3l/(32 EM CÉLULAS CHO p5/Vdhfr foi transfectado para células de CHO e ampliaram-se os clones simples com metotrexato como se descreveu na Secção 6.1.,supra. Para nova caracterização escolheu-se um destes clones ampliado, o CH0-5P41,2.5.

Desenvolveram-se até â confluência células CHO-5^41,2.5 em metotrexato 2,5 yU-M. 0 meio foi substituído com meio isento de soro e, após 24 h, foi recolhido e dialisado durante 48 h contra ácido acético 0,2 M. Os sobrenadantes dialisados e condicionados foram avaliados quanto a bioactividade por inibição da síntese de

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-21! - (ν-

ADN das células CCL-64, como se descreveu na Secção 6.1.3., supra. As células CHO-5 (341,2.5 segregam aproximadamente 2 mg/1 de TGF-^l/ /(32 quimérico bioactivo (FIG. 2).

As proteínas relacionadas com TGF/i segregadas por estas células foram analisadas por ensaio de imuno-mancha usando anticoj? pos anti-péptidos dirigidos contra o TGF-^1 maduro como se descreveu na Secção 6.1.5., supra. A FIG. 3 mostra que as células CHO-5(341,2.5 segregam proteínas imuno-reactivas que migram a 90-100 quilodalton e a 24 quilodalton, quando analisadas sobre 5DS-PAGE sob condições não redutoras (FIG. 3, banda 1). A banda dos 24 qu_i lodalton representa o dimero TGF-^l/(32 maduro e a proteína de 90 a 100 quilodalton representa provavelmente T G F-β1/(32 maduro, 1 i g_a do por dissulfureto a sequências do precursor (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427).

Sob condições de redução (FIG. 3, banda 2), a maior parte das proteínas migram aos 12 quilodalton, o que representa o monómero TGF-β 1/(32 maduro. Note-se a falta de material imuno-reactivo na zona dos 45-55 quilodalton observada em análise semelhante de proteínas recombinantes expressas em células CHO transfectadas com plasmídeos que codificam o gene TGF-βΐ do símio (Gentry et al . , 1987 , Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427) o que sugere que o TGF-yõl/(32 quimérico é processado proteoliticamente de modo mais eficiente do que a molécula TGF-(3l original. Além disso, as células CHO-5(341,2.5 segregam cerca de 2,5 vezes mais produto maduro bioact_i vo do que as células CHO que expressam o TGF-j5l (Gentry et al., 1987, supra ) . Ainda que a base destas observações seja presentemente desconhecida, a estrutura secundária do precursor do TGF-β1/(32 quimérico pode diferir significativamente da estrutura secundária do TGF-(3>1, estrutura secundária esta que torna o TGF-(31/ /(32 quimérico passível de acontecimentos de processamento molecular de natureza ou intensidade diferentes. Por exemplo, o precursor do TGF-/>l/(32 pode ser um substrato mais favorável para os fa_c tores envolvidos no processamento do TGF-β. Em alternativa, as características estruturais secundárias do TGF-pi/(32 podem permitir-lhe interagir com outros factores de processamento ou caminhos não acessíveis ao T G F -β 1 .

F-*··

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-22Ί. DEPOSITO DE MICROORGANISMOS seguinte transfectante foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, MD e foi-lhe atribuído o núméro de acesso indicado.

T ransfectante

Plasmídeo

N- de Acesso

CH0-5(341,2.5 CL 5 p5(3/dh f r presente invento não tem o seu âmbito limitado à linha de células depositada ou aos arranjos aqui descritos, que se pretende que sejam simples ilustrações de um aspecto do invento ou que sejam funcionalmente equivalentes, e que estão dentro do âmbito do invento. De facto, para os peritos na arte tornam-se evidentes, na descrição anterior, várias modificações do invento além das indicadas e aqui descritas. Pretende-se que estas modificações caiam dentro do âmbito das reivindicações anexas.

Note-se que todos os pares de base e números de resíduos de aminoácidos e tamanhos dados para os nucleótidos e péptidos são aproximados e que são aqui utilizados para fins de descrição.

Claims

REIVINDICAÇOES

1 - Processo de produção' de factor de crescimento transformante βΐ/βΐ, quimérico, caracterizado por compreender:

(a) cultivar uma célula hospedeira contendo uma sequência de codificação de nucleótidos do factor de crescimento transfor nían te 1 /fi 2 quimérico, substancialmente como se segue:

Simio

Humano

-261 AGGGGATCTGTGGCAGGTCGGACA---AACA -234

CTCC..C...CCA...A..CCCT.TTC....

Simio TC---CGTCTCCTCCTACCACATCTCGCCCATCTAGGTTATTTCCGTGGGATACTGACACACCCCCGGTCCAAGCCTCC - 158

Humano C.ACC.AC..T.............G......................................................

Simio CCTCCACCACTGCGCCCTTCTCCCTGAGGA-CCTCAACTTTCCCTCCAGGCCCTCCTACCTTTTCCCGGGGGACCCCCA -80

Humano ..............................G.....G...........................G.....A........

Simio GCCCCTGCAGGGGCGGGGCCTCCCCACCAAACTAGCCCTGTTCGCGCTCTCGGCAGTGCCGGGCGGCGCCGCCTCCCCC -1

Humano .........'....................C..C..............................................

10 20

Simio Humano Het ATG Pro CCG Pro CCC Ser TCC Gly GGG Leu CTG Arg CGG Leu CTG Leu Pro CTG CCG Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp CTG CTG CTA CCA CTG CTG TGG Leu Leu Val CTA CTG GTG 60 ci» Pro 30 40 S imio Leu Thr Pro Ser Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu (20 Humano CTG ACG CCT AGC G. . CGG .C. CCG GCC GCA GGA CTA TCC ACC TGC AAG ACT ATC GAC ATG GAG CTG 50 60 Símio Vai Lys Arg Lya Arg Ile Glu Thr Ile Arg Gly Gin Ile Leu Ser Lys Leu Axg Leu Ala (80 Humano GTG AAG CGG AAG CGC ATC GAG ACC G. . ATC CGC GGC CAG ATC CTG TCC AAG CTG CGG CTC GCC 20 80 Simio Ser Pro Pro Ser Gin Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu 240 Humano AGC ccc CCG AGC CAG GGG GAG CTG CCG CCC GGC CCG CTG CCC CAG GCC GTG CTC GCC CTG 90 100 Simio Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu 300 Humano TAC AAC AGC ACC CGC GAC CGG GTG GCC GGG GAG AGT CCG GAG CCG GAG CCC GAA CCC GAG ........A . .A......... ..G ..T ... 110 120 Simio Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile 360 Humano GCC GAC TAC TAC GCC AAG GAG GTC ACC CGC GTG CTA ATG GTG GAA ACC CAC AAC GAA ATC 130 140 Simio Tyr Asp Lya Phe Lys Gin Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu 420 Humano TAT GAC AAG TTC AAG CAG AGC . .T ACA CAC AGC ATA TAT ATG TTC TTC AAC ACA TCA GAG CTC 150 Arg Simio Arg Glu Ala Vai Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu---Arg 477 Humano CGA GAA GCA GTA CCT GAA CCT GTG TTG CTC TCC CGG GCA GAG CTG CGT CTG CTG---AGG . .G . ,C ... AGG ... 160 170 Simio Leu Lys Leu Lys Vai Glu Gin His Val Glu Leu Tyr Gin Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp 537 Humano CTC AAG TTA AAA GTG GAG CAG CAT . .C GTG GAG CTG TAC CAG AAA TAC AGC AAC AAT TCC TGG 180 190 Asp Simio Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asn Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp 597 Humano CGA TAC CTC AGC AAC CGG CTG CTG CCG CCC AGC AAC TCG CCG GAG TGG TTG TCT TTT GAT . .A ... . . . G.......A........A 200 210 Simio Vai Thr Gly Vai Vai Arg Gin Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Cly Phe Arg Leu 657 Humano GTC ACC GGA GTT GTG CGG CAG TGG TTG AGC CGC GGA GGG GAA ATT GAG GGC TTT CGC CTT

70 379

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-24Simio

Humano

Simio Humano

Simio

Humano

220 Arg 230

Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Lys Asp Asn Thr Leu Gin Vai Asp Ile Asn Gly Phe 717 AGC GCC CAC TGC TCC TGT GAC AGC AAA GAT AAC ACA CTG CAA CTG GAC ATC AAC GGG TTC .........................GG.................................

240 250

Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Ket Asn Arg Pro Phe Leu Leu 777 ACT ACC GGC CCC CGA GGT GAC CTG GCC ACA ATT CAT GGC ATG AAC CGG CCT TTC CTG CTT .............................C.............................. \

I '

260 f 270 _

Leu Ket Ala Thr Pro- Leu Glu Arg Ala Gin His Leu Gin Ser Ser Arg His Arg Arg Ala 837

CTC ATG GCC ACC CCA CTG GAG AGG GCC CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CCC CGA GCC

..............G..............C...........................I· · ·

Simio

Humano

Simio

Humano

Simio

Humano

Simio

Humano

Simio

Humano

Simio

Humano

380_390

Ser Asn Ket Ile Vai Arg Ser Cys Lys Cys Ser

TCC AAC ATG ATC GTG CGC TCC GTC AAA TGC AGC TGA GGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCACCCCGGCAG ..........................G...........T..................G.........

Simio

Humano

Simio

Humano

GCCCGGCCCCGCCCCACCCCACCCCCGCTGTCTTGCCCTTGGGGGCTGTATTTAAGGACACCCGTGCCCCAAGCCCACC AGG C λ

TGGGGCCCCATTAAAGA <204

1283 >300 desde cerca do nucleótido número 836 até cerca do nucleótido número 1170, sob o controlo de uma segunda sequência de nucleótidos que rç gula a expressão dos genes, de modo que seja produzida pela célula hospedeira um péptido ou proteína possuindo actividade como factor de crescimento transformante, qu iméri co , 1 /β 2 ;

e (b) recuperar da cultura o factor de crescimento transformante, quimérico/Jl//?2.

z?

z ·

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2. Processo de produção de factor de crescimento transformante, quimérico, ^1/^2, caracterizado por compreender:

(a) cultivar uma célula hospedeira contendo uma sequência de codificação de nucleótidos do factor de crescimento transformante, quimérico, β 1/β2, substancialmente como a apresentada na reivi£ dicação 1, desde cerca do nucleótido número 1 até cerca do nucleót_i do 1170, sob o controlo de uma segunda sequência de nucleótidos que regula a expressão dos genes de modo que seja produzida pela célula hospedeira um péptido ou proteína possuindo actividade como factor de crescimento trans formante , quimérico β1/β2;

í <... · e (b) recuperar da cultura o factor de crescimento transformante, quimérico, ^1/^ 2.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri zado por a célula hospedeira compreender uma célula de ovário do criceto chinês.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracteri^ zado por a segunda sequência de nucleótidos que regula a expressão dos genes compreender um promotor 5V40.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracteri zado por a segunda sequência de nucleótidos compreender um promotor e uma sequência de codificação de um marcador seleccionável,no qual a célula hospedeira é deficiente, de modo que a célula hospedeira contendo factor de crescimento transformante, quimérico, ^1//^2, pos sa ser identificada.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o marcador seleccionável compreender di-hidrofolato-redutase.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda a exposição da célula hospedeira a metotrexato, de modo a seleccionar as colónias resistentes, que contenham níveis amplificados da sequência de codificação da di-hidrofolato-redutase e do factor de crescimento transformante, quimérico, βΐ/β 2 .
8. Processo de produção de factor de crescimento transfo£

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-26mante, quimérico, βΐ/β>2, caracterizado por compreender:

(a) cultivar o transfectante CHO -5(3 41,2.5 CL5 depositado no American Type Culture Collection e possuindo o número de acesso _ 9 (b) recuperar da cultura o factor de crescimento transfojr mante, quimérico, 1/β2. '
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o transfectante ser cultivado em presença de metotrexato.
10. Processo de preparação de uma sequência nucleotidica codificando o factor de crescimento tr ans f ormant e 1 /$ 2 quimérico, caracterizado por a sequência compreenderasequência de codificação de nucleótidos substancialmente como apresentada na reivindicação

1 desde cerca do resíduo nucleotídico número 279 até cerca do res_i duo nucleotídico número 390.
11. Processo de preparação de uma sequência nucleotidica codificando o factor de crescimento transformante β l/β2 quimérico, caracterizado por sequência compreender a sequência de codificação de nucleótidos substancialmente como apresentada na reivindicação

1 desde cerca do resíduo nucleotídico número 1 até cerca do resíduo nucleotídico número 1120.

(' '·
12. Processo de produção de uma célula caracterizado por a célula compreender uma sequência de codificação nucleotidica substancialmente como apresentada na reivindicação 1 desde cerca do r_e síduo nucleotídico número 836 até cerca do resíduo nucleotídico ng mero 1170.
13. Processo de produção de uma célula caracterizado por a célula compreender uma sequência de codificação nucleotidica substancialmente como apresentada na reivindicação 1 desde cerca do resíduo nucleotídico número 1 até cerca do resíduo nucleotídico número 1170.
14. Processo de produção de uma célula caracterizado por a célula conter uma sequência de codificação nucleotidica do factor de crescimento trans formante (3 1 /β 2 quimérico, substancialmente como apresentada na reivindicação 1, desde cerca do nucleótido núme70 379

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-27ro 836 até cerca do nucleótido número 1170, sob o controlo de uma segunda sequência nucleotídica que regula a expressão do gene, de modo que a célula produz factor de crescimento transformante βΐ/ /β2 quimérico.
15. Processo de produção de uma célula caracterizado por a célula conter uma sequência de codificação nucleotídica do \ factor de crescimento transformante β> Y/f> 2 quimérico, substancialmente como apresentada na reivindicação 1, desde cerca do nucleótido número 1 até cerca do nucleótido número 1170, sob o controlo de uma segunda sequência nucleotídica que regula a expressão do gene, de modo que a célula produz factor de crescimento transformante β1/β2 quimérico.

16. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7,caracte rizado por a célula ser uma célula de ovário de criceto chinês. 17. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7,caracte rizado por a segunda sequência nucleotídica que regula a expres- são do gene compreender um promotor de SV40. 18. Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7 , caracte rizado por a segunda sequência compreender um promotor e uma se-

quência de codificação de um marcador seleccionável .
19. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri zado por o marcador seleccionado compreender di-hidrofolato redjj tase .
20. Processo de produção de uma linha de células caractq rizado por as células compreenderem CHO-5/^ 41.2,5 CL5 tal como depositados no American Type Culture Collection com o número de acesso _.