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PT92602B - Processo de preparacao de um adn de cadeia dupla, de deteccao de sequencias de acido nucleico alvo e de amplificacao de uma sequencia de acido nucleico alvo - Google Patents

Processo de preparacao de um adn de cadeia dupla, de deteccao de sequencias de acido nucleico alvo e de amplificacao de uma sequencia de acido nucleico alvo Download PDF

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John C Guatelli
Kristina Marie Whitfield
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Siska Diagnostics Inc
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Description

PATENTE N2. 92 602
Processo de preparação de um ADN de cadeia dupla, de detecção de sequências de ácido nucleico alvo e de amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo para que
SI5KA DIAGNOSTICO, INC., pretende obter privilégio de invenção em Portugal.
RE.....S.....U......M.....0 presente invento refere-se a um sistema de amplificação para a detecção de ácidos nucleicos alvo, mais particularmente de sequências de ácidos nucleicos alvo, num ambiente isotérmico, no qual estão presentes todos os reagentes necessários à realização da amplificação, sendo as reacções auto-sustentadas e continuas. É caracterizada a digestão selectiva, enzimática, de um duplex ARN/ADN, formado por hibridação de um iniciador de ADN com uma sequência de ácido nucleico alvo, libertando assim a cadeia de ADN para posterior hibridação, seguida por extensão do iniciador de modo a proporcionar um duplex de ADN que pode servir como um molde para a produção de uma pluralidade de transcritos que podem ser reciclados e/ou detectados como tal de modo a deduzir a presença da sequência de ácido nucleico alvo.
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MEMÓRIADESCRITIVA
Pedidosreiacionados
Faz-se referência ao pedido de Patente dos E.U. n2. 07/064141, depositado em 19 de Junho de 1987, e a um seu pedido de continuação, E.U. nQ. de série 07/202978, depositado em 6 de Junho de 1988 e publicado como publicação internacional do PCT n2. W0 88/10315, estando os textos completos de cada um dos pedidos aqui incorporados com referência expressa.
Campo doInvento presente invento refere-se, de um modo geral, aos progressos em biologia molecular e à tecnologia de ADN recombinante.
Mais particularmente, o presente invento refere-se aos processos e meios, incluindo ensaios e conjuntos farmacêuticos contendo os reagentes e meios necessários, para a detecção, num meio in .vitro ou ex.......vivo, da presença de uma sequência de ácido nucleico alvo, numa amostra biológica, ou de uma sequência de ARN extrapolada de uma sequência de ADN alvo, correspondente, e por dedução do polipéptido correspondente que a sequência de ARN (ADN) codifica.
presente invento apresenta o fornecimento da amplificação de uma tal sequência alvo de ácido nucleico, particular, num sistema in vitro, de um so vaso, auto-sustentado, sendo a amplificação da sequência de ácido nucleico alvo alcançada por meio da preparação de vários produtos transcritos, que possuem a capacidade opcional de se auto-repliçarem. Este sistema de amplificação auto-sustentado evita a necessidade de desnaturação repetida dos duplexes de ácido nucleico, que requerem a temperatura por ciclos. 0 presente invento combina, de uma maneira nova, todos os reagentes necessários para formar, num só ambiente reaccionai, um produto amplificado, ou um produto adequado para detecção, numa forma amplificada, representando a presença de uma sequência de ácido nucleico alvo.
Entre as aplicações em que o presente invento pode ter uso,
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-3estão as análises de sequências de ARN, ou por extrapolação, de sequências de ADN, que são caracter isticas de uma doença ou situação patogénica, particular ou geral, por meio de ensaios de hibridação, in .vitro ou ex vivo, de sondas de ácido nucleico, de fluidos e tecidos corporais, contendo a(s) sequência(s) de ácido nucleico alvo exigidas.
^Ptecedentes......do......i nvento
É um objectivo desta arte detectar várias sequências de ácidos nucleicos numa amostra biológica, na qual uma dada sequência , o chamado ácido nucleico alvo, está presente em pequenas quantidades em relação àquelas em que existe entre uma larga variedade de outras espécies de ácidos nucleicos, incluindo ARN, ADN ou ambos. Assim, é desejável detectar os ácidos nucleicos que codificam polipéptidos, que podem estar associados com doenças ou situações patológicas, tais como, por exemplo, ácidos nucleicos correlacionados com os dos virus da imunodeficiência humana (HIV-1). Adicionalmente à detecção dos ácidos nucleicos codificando tais polipéptidos, é desejável detectar outros ácidos nucleicos caracteristicos de uma doença ou situação patológica tais como um gene defeituoso, como no caso da detecção de um gene da betaglobina humana defeituoso, como exemplificado pela hemofilia.
Caracteristicamente, os ácidos nucleicos associados de tal modo estão presentes, se o estiverem, em quantidades muito pequenas em relação aos ácidos nucleicos totais numa dada amostra biológica, tal como sangue ou outra amostra de fluido ou tecido corporal de um dado indivíduo a ser testado. A detecção de tal espécie de ácido nucleico exige uma tal especificidade que, se presente, é detectável e mensurável entre uma grande variedade de outras espécies de ácidos nucleicos, com os quais está ambientalmente associado. Algumas destas espécies podem possuir uma estreita homologia, pelo menos em segmentos isolados, com o ácido nucleico alvo. Mais ainda, como notado anteriormente, estas espécies de ácido nucleico alvo são muito frequentemente, encontradas apenas em quantidades muito diminutas na amostra biológica em teste. Ainda assim, para um diagnóstico correcto do
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-4estado da doença subjacente, é essencial que mesmo pequenas quantidades de tal ácido nucleico alvo possam ser detectadas inequivocamente, para haver exactidão do sistema de ensaio.
Têm sido avançadas várias propostas para realizar o objectivo da arte. Numa, a quantidade de ácido nucleico na amostra não está alterada ou afectada. Em vez disso, desenvolve-se um sistema informador através do qual é produzido um grande número de moléculas detectáveis correspondendo ao ácido nucleico alvo para rápida detectabi1 idade e medição. Um tal sistema informador é um sistema gerador de sinal associado com o ácido nucleico alvo, produzindo um sinal detectável, representativo do número de várias moléculas da sequência alvo.
Desenvolveu-se outra abordagem, que é fundamentalmente diferente por envolver o aumento do número de cópias da própria sequência do ácido nucleico alvo. Isto pode ser feito por amplificação selectiva da sequência de ácido nucleico alvo. Podem-se refinar as técnicas de cultura da amostra de modo que, de alguma maneira, a sequência de ácido nucleico alvo seja amplificada preferencialmente em relação a outras sequências de ácidos nucleicos. Estas técnicas são incómodas e demoradas e sujeitas a tentativa e erro.
Outro exemplo desta abordagem é a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo numa chamada reacção de cadeia com polimerase (PCR). Esta técnica foi apresentada por Saiki e colab., Science 230, 1350 (1985) e Mullis e colab., Publicações de Pedidos de Patentes Europeia NQs. 200362 e 201184 (Ver também Patentes E.U. 4683195 e 4683202) e requer, particularmente, (1) hibridação, com um segmento de sequência de ácido nucleico alvo, com um iniciador (primer), (2) extensão do referido iniciador com uma polimerase e (3) tornar de cadeia simples os duplexes resultantes da reacção de extensão do iniciador. Este procedimento pode ser repetido durante vários ciclos de modo a amplificar a sequência de ácido nucleico alvo subjacente.
Uma nova abordagem aperfeiçoada encontra-se descrita nos pedidos dos E.U. nQs. de série 07/064141 e 07/202978 e na
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publicação internacional do PCT n2. W0 88/10315, acima. Emprega um novo passo de produção de transcritos de ARN em conjunção e derivado de uma cópia de ADNc de cadeia dupla, sintetizada, da sequência alvo operativamente ligada a um seu promotor. Em virtude de o passo de transcrição ser o aspecto dominante da novidade, ele é convenientemente referido como sistema de amplificação baseado na transcrição (TAS).
Em consequência, este invento envolve a detecção invitro ou ex......vivo de pelo menos uma sequência de ácido nucleico especifica (sequência ou segmento alvo) numa amostra contendo ácido nucleico, compreendendo um processo de preparação de um ácido nucleico de cadeia dupla contendo uma sequência correspondente a uma sequência alvo, operativamente ligada a um seu promotor da ARN-polimerase, empregando a referida cadeia de ácido nucleico dupla como um molde de ácido nucleico de cadeia dupla, para a preparação de uma pluralidade de transcritos de ADN a partir dela, comportando, oada um, uma sequência de ARN correspondente à referida sequência alvo, e detecção da presença da referida sequência de ARN e, por analogia, a presença da sequência alvo.
molde de ácido nucleico de cadeia dupla é, por sua vez, preparado proporcionando um primeiro iniciador de ácido nucleico ou sonda, contendo uma sequência promotora operativamente ligada a uma sequência correspondendo a um segmento de uma sequência alvo, hibridando, sob condições adequadas, o referido primeiro iniciador de ácido nucleico com a sequência alvo, numa amostra contendo ácido nucleico, alongando o referido primeiro iniciador de ácido nucleico hibridado numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à sequência alvo para formar o referido ácido nucleico duplex, separação das cadeias do referido duplex, hibridação de um segundo iniciador de ácido nucleico com a cadeia da sequência contendo o promotor, separada, sob condições adequadas, na extremidade oposta da referida sequência promotora, e alongamento do referido segundo iniciador de ácido nucleico hibridado, numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à referida sequência contendo o promotor.
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Assim, o invento produz um transcrito de ARN de cadeia simples, ou um duplex de ARN/ADN, formado a partir daquele, quando não se tomam medidas para evitar a sua formação, o qual tem uma sequência correspondente ao ácido nucleico alvo. 0 produto transcrito de ARN de cadeia simples é'struck offmais ou menos continuamente e proporciona a detecção directa do segmento alvo, sem a necessidade de ciclos RCP repetidos e de separação de cadeia, propensos a erro e complicados. Tais vantagens não são proporcionadas pela técnica RCP, a qual fornece ADN de cadeia dupla (do qual uma cadeia compreende o segmento alvo e a outra cadeia compreende o complemento do segmento alvo), o qual necessita de ser separado antes da detecção e só depois de um grande número de ciclos repetidos necessários para alcançar níveis de amplificação aceitáveis.
É um objectivo do presente invento, como uma concretização selectiva, retirar mais vantagens do processo replicativo básico para amplificação, para facilidade de detecção das sequências de ácidos nucleicos alvo, conseguindo assim uma cópia exponencial sem necessidade de ciclos de temperatura ou de controlar, de outro modo, o desenrolar do processo de amplificação em relação às adições de reagente, etc. É um outro objectivo do presente invento combinar, de maneira nova, as vantagens dos procedimentos do produto de transcrição e extensão, como um meio para detectar e medir os ácidos nucleicos alvo correspondentes.
É um objectivo básico do presente invento utilizar uma digestão, enzimaticamente selectiva, da cadeia de ARN de um duplex ARN/ADN, formado por hibridação de um iniciador com uma sequência alvo de ácido nucleico, seguida por extensão do iniciador, como meio de fornecer a cadeia de ADN como um molde para hibridação adicional com ele, seguida por extensão do iniciador. 0 duplex de ADN de cadeia dupla}produto,contém pelo menos uma sequência promotora que é reconhecível por uma ARN polimerase dependente de ADN e serve, assim, como molde para a produção de uma pluralidade de transcritos, que são finalmente detectados e medidos como um meio para detectar e medir sequências de ácido nucleico alvo. Este objectivo proporciona as
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-7vantagens da amplificação da sequência alvo que é auto-sustentada, sem necessidade de ciclos de temperatura, numa única mistura reaccional contendo (três) actividades enzimáticas adequadas e pelo menos um iniciador, contendo um promotor operativamente reconhecível pela ARN polímerase dependente de ADN.
É, portanto, um objectivo global do presente invento alcançar os objectivos enumerados pela arte e proporcionar meios seleotivos para amplificação mais vantajosa das sequências alvo de ácido nucleico. Proporciona ainda uma técnica directa, que l pode ser utilizada reprodutivelmente, num periodo de tempo aceitavelmente curto, num sistema reaccional isotérmico, empregando, com a maior conveniência, reagentes conhecidos e possuindo a precisão necessária para alcançar resultados científicos consistentes; pode ser empregue no estabelecimento de um ensaio reprodutível e é adaptável para uso em conjuntos para análises laboratoriais/clínicas.
SUMARIODO.......INVENTO presente invento destina-se à utilização de um meio para separar a cadeia de um duplex ARN/ADN, de modo a libertar uma sua cadeia para hibridação com sequências de oligonucleótidos contendo sequências de ligação de ARN polimerases (PSS) seguida por extensão do iniciador de modo a formar um duplex de ADN que pode servir como molde para a preparação de uma pluralidade de transcritos de ARN correspondentes, os quais são capazes de detectar e medir, como um ensaio deduzido, a presença de uma sequência alvo de ácido nucleico. Por sua vez, o duplex de ARN/ADN é produzido por hibridação de um iniciador de ADN contendo operativamente uma sequência promotora, com um alvo de ARN, seguida por extensão do iniciador.
meio do presente invento para provocar a separação da cadeia envolve o uso de uma enzima possuindo actividade semelhante à RNase H, tal como a RNase H, a qual digerirá selectiva e preferencialmente a cadeia de ARN do duplex, de modo a libertar a cadeia de ADN para processamento adicional. 0 uso
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-8de tal enzima elimina o uso de ciclos de temperatura para desnaturar o referido duplex.
A sequência alvo de ãcido nucleico pode ser uma, presente intrinsecamente como tal, numa amostra de ácido nucleico ou pode ser um produto de extrapolação, correspondente, de uma sequência alvo de ADN. 0 produto da extrapolação é preparado por desnaturação de uma sequência alvo de ADN de cadeia dupla, hibridação desta com uma sequência iniciadora possuindo uma sequência promotora associada operativamente, seguida por reacção de extensão do iniciador para formar um duplex de ADN. Este duplex de ADN/ADN é por sua vez desnaturado e a cadeia contendo a sequência promotora é hibridada, na sua extremidade oposta à do promotor, com um segundo iniciador, seguida por extensão do iniciador para formar um duplex de ADN, o qual, quando posto em contacto com ARN polimerase dependente de ADN, produz o produto de extrapolação transcrito, correspondente. 0 ARN serve então como sequência de ácido nucleico alvo, para fins do presente i nvento.
Depois da sequência de ácido nucleico alvo ter sido fornecida, qualquer que seja a sua proveniência, é, de acordo com o presente invento, hibridada com uma sequência iniciadora, operativamente ligada a uma sequência promotora, seguida por extensão do iniciador, para produzir um duplex de ARN/ADN contendo a sequência promotora na extremidade 5’ da cadeia de ADN. A reacção de extensão do iniciador pode ser conduzida com qualquer polimerase adequada, tal como a transcriptase inversa.
aspecto básico do presente invento serve, portanto, para libertar a cadeia de ADN de um duplex de ARN/ADN, por tratamento do duplex de ARN/ADN com uma enzima que digere selectivamente a cadeia de ARN, tal como a RNase Η. A cadeia de ADN assim libertada é quer 1) submetida a extensão do iniciador, auto-gerada via o iniciador de ARN resultante da digestão selectiva anterior, quer 2) hibridada com um iniciador oligonucleotidico, derivado extrinsecamente, comportando operativamente, opcionaimente, uma sequência promotora. A extensão do iniciador produz um duplex de ADN de cadeia dupla contendo uma ou duas
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File 48477 sequências promotoras, que serve como molde para indução, pela RNA polimerase dependente de ADN, da transcrição para produzir uma pluralidade de transcritos.
Dado que a sequência reaccional anterior pode ser realizada isotermicamente e em mistura simultânea com três actividades enzimáticas adequadas, tal como as proporcionadas pela transcriptase inversa, a RNase H e a ARN polimerase dependente de ADN, por exemplo, os vários passos do processo anterior são feitos de modo simultâneo, continuo, num dado período de tempo. Assim no ponto dado acima como ponto final, os transcritos produzidos podem ser detectados e medidos para deduzir a presença de sequências de ácido nucleico alvo de partida. Contudo, dado que a natureza simultânea e continua da sequência reaccional acima descrita, que é independente dos ciclos de temperatura e necessita apenas de uma única adição inicial de actividades enzimáticas, necessárias para realizar estas reacções, os próprios produtos transcritos sofrem hibridação com um iniciador comportando, opcionalmente, uma sequência promotora adicional. Esta complexa hibridação é seguida por uma reacção de extensão do iniciador para produzir um segundo duplex de ARN/ADN que, por sua vez, é submetido à acção da enzima de digestão de ARN, selectiva para dele libertar a cadeia de ADN. Esta por sua vez é hibridada com um iniciador de ARN auto-produzido ou com um iniciador oligonucleotidico extrinsecamente derivado, presente na mistura reaccional, o qual pode, opcionalmente, comportar operativamente uma sequência promotora, de modo a produzir um segundo duplex de ADN, que é susceptível de ser reconhecido pela ARN polimerase dependente de ADN, para produzir uma pluralidade de transcritos possuindo o sentido oposto ao dos transcritos produzidos inicialmente.
Embora o mecanismo da(s) sequência(s) reaccional(ais) acima não esteja completamente esclarecido, crê-se que, devido ao facto de a mistuta reaccional empregar, em combinação, as três actividades enzimáticas apropriadas (tal como as proporcionadas pela transcriptase inversa, RNase H e ARN polimerase dependente de ADN, por exemplo) e pelo menos um iniciador contendo um
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-10promotor reconhecido pela polimerase e devido ao facto de as reacções não estarem dependentes de um ciclo de temperatura, se verifica que, quando se usam dois iniciadores oligonucleotidicos contendo promotor, as reacções se podem desenrolar expontânea e continuamente durante vários ciclos, produzindo transcritos tanto no sentido como anti-sentido, que podem ser detectados e medidos de várias maneiras, de modo a fornecer um ensaio de amplificação da quantidade de sequência de ácido nucleico alvo presente na amostra testada.
A essência do presente invento fornece uma mistura reaccional que é concebida essencialmente para permanecer dormente durante um periodo de tempo, a uma temperatura adequada, sem necessidade de ciclos entre temperaturas mais elevadas e mais baixas e sem necessidade de adições periódicas de enzima ou de outros reagentes, pelo que a sequência de ácido nucleico alvo é amplificada continua e espontaneamente de uma maneira auto-gerada, em presença de pelo menos um iniciador comportando, operativamente, uma sequência promotora e uma actividade enzimática, tal como a proporcionada pela ARN polimerase, que reconhece o sitio de ligação de polimerase do promotor, uma transcriptase inversa, uma enzima tal como a RNase H que digere selecti vamente ARN quando este ARN está hibridado com ADN na forma de um duplexeos substratos de trifosfato-nucleósidos necessários para a ARN polimerase e para a transcriptase inversa.
Num sistema como o aqui definido podem ser conseguidos níveis de 7 amplificação reprodutiveis tão elevados como 10 em aproximadamente duas horas à temperatura de cerca de 37SC usando, por exemplo, ARN polimerase de T7, transcriptase inversa de AMV e
RNase H de E,coli. É operável uma temperatura entre cerca de 42C e cerca de 50°C, pr ef er i velmente na gama à volta de 40°C. Nas concretizações preferidas o tamanho da sequência de ácido cerca de nucleico alvo contém menos do que /250 bases. Outras variáveis podem afectar a optimização desta amplificação, tais como a ARN polimerase empregue, a transcriptase inversa empregue, os pH, as concentrações de sal, as concentrações de trifosfato-nucleósido. Estas variáveis estão dentro do conhecimento vulgar dos técnicos experientes.
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selectiva de formado por
Assim o presente invento envolve a detecção invitro ou ex vivo, numa amostra contendo uma colecção heterogénea de ARN de, pelo menos, uma sequência alvo de ácido nucleico especifica. 0 presente invento descreve um processo que compreende a preparação de/ADN de cadeia dupla, codificando uma sequência correspondendo a uma sequência alvo e possuindo um promotor de ARN polimerase operativo, sendo o referido ADN de cadeia dupla preparado, por sua vez, por hibridação, seguida por extensão do iniciador, com uma cadeia de ADN que foi libertada do seu complemento de ARN, num duplex de ARN/ADN, por acção de uma enzima de digestão ARN, tendo o referido duplex, de ARN/ADN sido hibridação de um iniciador, comportando operativamente uma sequência promotora, com uma sequência de ácido nucleico alvo, seguida de extensão do iniciador. 0 ADN de cadeia dupla serve de molde na preparação de uma pluralidade de transcritos de ARN do mesmo, comportando, cada um, uma sequência de ARN correspondente à referida sequência de ácido nucleico alvo. Pode-se detectar e medir a presença da referida sequência de ARN e, por dedução, a presença da sequência alvo.
presente invento dirige-se a todos os processos e meios associados à preparação e uso de tais transcritos de ARN. Numa concretização, o presente invento dirige-se a um processo repetitivo, opcional, de preparação do referido molde de ácido nucleico de cadeia dupla, anteriormente definido, por fornecimento um primeiro iniciador de ácido nucleico, contendo uma sequência promotora operativamente ligada a uma sequência correspondendo a um segmento de uma sequência de ácido nucleico alvo, a hibridação, sob condições adequadas, do referido primeiro iniciador de ácido nucleico com uma sequência de ácido nucleico alvo, numa amostra contendo ácido nucleico, extensão do referido primeiro iniciador de ácido nucleico hibridado, numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à sequência alvo, de modo a formar um ácido nucleico duplex de ARN/ADN, correspondente, clivagem enzimática do ARN do referido duplex de ARN/ADN, hibridação, com a sequência de ADN contendo o promotor, libertada, de um segundo iniciador de ácido nucleico, na extremidade oposta à referida sequência promotora, por meio de 1 )
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-12um produto derivado do iniciador de ARN ou 2) um iniciador oligonucleotidico contendo a ele ligada opcionalmente, operativamente, uma sequência promotora, extensão do referido segundo iniciador de ácido nucleico hibridado, numa reacção de extensão com polimerase, complementarmente à referida sequência contendo o promotor.
Numa outra concretização, o presente invento dirige-se aos processos e meios de emprego do referido ácido nucleico de cadeia dupla supra, como molde na preparação de, a partir dele, uma pluralidade de transcritos de ARN, numa reacção catalisada pela ARN polimerase dependente de ADN, que reconhece o seu promotor e, após outra ciclização opcional, como anteriormente descrito, detecção e medição da presença dos referidos transcritos de ARN.
presente invento dirige-se, numa outra concretização, ao aperfeiçoamento de um processo de amplificação de uma sequência de ãcido nucleico alvo, produzida como tal ou como um produto de extrapolação de uma sequência de ADN alvo, compreendendo os passos de hibridação, com a referida sequência, de uma iniciador de ADN possuindo uma sequência promotora operativamente a ele ligada, seguida de extensão do iniciador de modo a produzir o duplex de ARN/ADN correspondente, hibridação da cadeia de ADN libertada, produto de extensão, comportando a sequência promotora do referido duplex, com um segundo iniciador, na extremidade oposta à sequência promotora, seguida de extensão do iniciador para formar um molde de ADN de cadeia dupla, útil na preparação, a partir do mesmo, de transcritos de ARN opcionalmente replicáveis, para detecção como tal ou para reciclização como anteriormente definido. 0 melhoramento compreende a libertação da cadeia de ADN produto de extensão, comportando a sequência promotora do referido iniciador duplex^RN/ADN, por digestão enzimática, selectiva, da cadeia de ARN do referido duplex de ARN/ADN.
Numa concretização, o presente invento dirige-se ao produto do processo de tratamento de um ARN de um duplex de ARN/ADN, tendo ligada uma sequência promotora na extremidade 5’ da sequência de ADN, com uma enzima de digestão de ARN, selectiva.
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13Numa outra concretização, o presente invento dirige-se a conjuntos compreendendo os reagentes necessários e os meios associados, úteis na detecção invitro ou ex-vivo de pelo menos uma sequência alvo de ácido nucleico, especifica, numa amostra contendo ARN, empregando os processos e meios anteriormente definidos.
transcritos de ARN
Descriçãcpor menor iz ada do invento
1. Brevedescriçãodosdesenhos
A figura 1 representa uma representação esquemática de uma concretização do presente invento. A representação esquemática fornece um total de 12 passos, os quais, nos aspectos aqui preferidos, foram concebidos como passos auto-gerados, contínuos, em presença das três enzimas necessárias, e mistura reaccional com a sequência alvo e a uma dada temperatura operável. As três enzimas são como as indicadas, p.e. transcriptase inversa (RT), utilizada para a reacção de extensão do iniciador, RNase H, que é uma enzima de digestão de ARN selectiva, representando o aspecto básico do presente invento e ARN polimerase de T7, como exemplo de uma enzima útil na preparação de transcritos a partir do molde de duplex de ADN. A essência do invento, como acima referido, é representada por três passos da representação esquemática, e compreende-se e está contemplado que o produto transcrito de ARN do passo seis pode ser detectado e medido como tal ou pode ser submetido a uma reacção continua como indicada nos passos 7 a 12, para formar a cadeia anti-sentido de um transcrito de ARN. gerados são
Os medidos como detectados resultado da presença da sequência de ácido nucleico alvo.
PBÍ representa o sítio de ligação á polimerase da sequência promotora. TCS representa a sequência complementar alvo.
- Pr qcessos......e definições gerais
Faz-se referência aos livros de texto de biologia molecular correntes, que contêm definições e processos e meios para a realização das técnicas básicas do presente invento, tais como:
preparação do iniciador ou sonda de ADN, incluindo sintese do ADN ou isolamento das sequências a partir de uma fonte
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-14jr tf— tf snatural, por meio da sua clivagem por enzima de restrição e corte, de modo a ser adequada como tal ou quando ligada a outro ADN, para utilização como iniciador ou sonda;
preparação dos oligonucleótidos, com diferentes sequências funcionais, para utilização na hibridação;
metodologia da hibridação, incluindo variações nas condições rigorosas para a maior ou menor hibridação, certamente dependentes do grau de homologia entre o iniciador e a sequência de ADN alvo;
identificação, isolamento ou preparação de promotores ou, mais especificamente, de promotores ou sítios reconhecidos pela ARN polimerase dependente de ADN de bacteriófago e pela ARN polimerase dependente de ARN de bacteriófago ou no emprego de sistemas eucarióticos, pela ARN polimerase dependente de ADN e ARN virais, por exemplo ARN polimerase codificada pelos adenovirus e ARN polimerase do vírus do mosaico da cevadinha.
identificação, isolamento ou preparação de ARN polimerase capaz de reconhecer os referidos promotores acima referidos ou capaz de realizar reacções de extensão do iniciador;
condições conducentes à produção de transcritos de ARN, incluindo as chamadas sequências melhoradoras da transcrição;
condições conducentes à iniciação e manutenção das reacções de extensão do iniciador, incluindo o uso de polimerase dependente de ADN e dNTPs;
o mecanismo e metodologia para replicação (induzida); e assim por diante.
Ver, por exemplo, Maniatis e col., MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New YorK (1982), e Colowick e...... col-, Methods.......íq Enzymology Vol. 152, Academic
Press, Inc. (1987), e as várias referências neles citadas; Hong,
B.Í9spiençe_ Repor ts......1, 243 (1981); Cooke _e col. , J. Biol-.......Chem.
255 6502 (1980); e Zoller e col., Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983); Crea ecol., nuçleiç acids Res..8, 2331 (1980); Narang e col., Me th Enzyme 68, 90 (1979); Beaucage e col.,
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-15Te:tr ahedr on Letters.22, 1859 (1981); Brown ecol. , Meth.Enzym.
68, 109 (1979); Caruthers e.col,, Meth, Enzym. 154, 287 (1985);
Hitzeman e col. , J. Bi o1 , Chem. 255, 2073 (1980); Lee e col. , Science 239, 1288 (1988); Mi 11 igan e col, , nucleic acids .Res...
.15, 8783 (1987); Miller e...... col,., Virology.......125, 236 (1983),
Ahlquist e col., J,Mol, Biol,1.53, 23 (1981); Miller e col, , .Nature 313, 68 (1985); Ahlquist e col. , J. Mol, Biol . 172, 369 (1984); Ahlquist e......col,., Plant......Mol,.........Biol,........3, 37 (1984); Ou e col,, PNAS......79, 5235 (1982); Chu e col,, Nuçl.AcidsR..??,1.4,
5591 (1986); Publ. do Pedido de Patente Europeia N°. (EPA)
194809; Marsh e......col. . Pqsi.ti..veStr and RNA Vir uses, p. 327-336,
Alan R. Liss (publ.; New York) 1987; procedimentos do UCLA
Symposium, (1986); Miller e......col,., J,........Mol,........Biol......187, 537 (1986);
Stoflet ecol,, Science239, 491 (1988); Kramer e col., J. Mol.
Biol.........89, 719 (1974); Saris e......col,, Nucl. Acids Res, 10, 4831 (1982); Bresser e cpl..,., PNAS 80, 6523 (1983); Chu e col. , nuc. leic.....acids......Research........16, 3671 (1988), Gubler e col. , Gene 25,
263 (1983) e D’Alessio e...... col,, nucleic...... acidsRes,..1.6, 1999 (1988), bem como as referências neles citadas.
Todas as publicações acima citadas, como referências, estão expressamente aqui incorporadas como referências.
Pelo termo promotor entende-se uma sequência de ácido nucleico (de ocorrência natural ou produzida sinteticamente ou um
produto de digerido de restrição) que é reconhecido
especificamente por uma ARN polimerase, que se liga a uma
sequência reconhecida, e inicia o processo de transcr ição,
através do qual se produz o transcrito de ARN. Pode, opcionalmente, conter bases nucleótídicas que se prolongam para além do sítio de reconhecimento real, de modo a conferir estabilidade adicional aos processos de degradação, e pode, também, incluir nucleótidos positivos (+) adicionais contíguos ao sitio de iniciação da transcrição. Em principio, pode-se empregar qualquer sequência promotora, para a qual haja uma polimerase conhecida e disponível, que seja capaz de reconhecer a sequência de iniciação. Tipicamente, os promotores úteis e conhecidos são aqueles que são reconhecidos por certas
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polímerases de bacteriófagos tais como as dos bacteriófagos T3, T7 ou 5P6. Ver Siebenlist e colab., Cell 20, 269 (1980). Estes não são senão exemplos das polimerases que podem ser empregues na prática do presente invento, em conjunção com as suas sequências promotoras associadas.
Aqui, transcrito de ARN é a sequência de ácido nucleico produzida após iniciação da transcrição, depois do reconhecimento, pela ARN polimerase, da sequência promotora (ver supra). A produção de tais transcritos é mais ou menos continua, dependendo, em parte, da quantidade de polimerase presente.
termo sonda ou iniciador significa, no presente contexto, uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (de ocorrência natural ou produzida sinteticamente ou um produto de digerido por restrição) que possui suficiente complementar idade com a sequência alvo para que, sob condições de hibridação adequadas, seja capaz de hibridação, isto é de ligação, com a sequência (alvo) apropriada. Uma sonda ou iniciador típica, tem pelo menos cerca de 10 nucleótidos de comprimento e mais preferivelmente tem aproximadamente 20 ou mais bases nucleÓtídicas de comprimento e, nas concretizações mais preferidas, partilha a identidade ou uma muito elevada complementaridade com a sequência (alvo) apropriada. Ver, por exemplo, EPA 128042 (publicada em 12 de Dez. 1984). Tal sonda ou iniciador é tal que se hibridará com uma sequência complementar com a finalidade de uma reacção de extensão de um iniciador, na presença dos reagentes e condições apropriados.
termo ligado operativamente ou associado, ou as suas variantes gramaticais, em particular em relação com a 1igação de uma sequência promotora numa sequência de ADN codificando ARN, refere-se à sua capacidade funcional de produzir os correspondentes transcritos de ARN, quando o promotor é reconhecido pela polimerase adequada - ver supra.
As técnicas de formação de um sinal de detecção, tais como por meio de marcação radioactiva ou por meios cromogénicos, usando uma enzima sensível, cromogénica, também são conhecidos e
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-17documentados na arte.
Uma amostra, sobre a qual se realiza o processo de ensaio do invento, pode ser um espécime em bruto de um material biológico, tal como soro ou outro fluido corporal, meio de cultura de tecidos ou material alimentar. Mais tipicamente, o processo realiza-se sobre uma amostra que é um espécime tratado, derivado de um espécime em bruto por vários tratamentos para remover materiais que interferir iam com a detecção do alvo, por exemplo por causarem ligação não especifica com moléculas com afinidade. Os processos de tratamento da amostra em bruto, de modo a obter uma amostra mais adequada aos processos de ensaio do invento, são bem conhecidos na arte.
Os transcritos (ARN) podem ser detectados por meio de várias maneiras diferentes:
a detecção pode ser feita por absorvância ultravioleta do ARN, como por exemplo pelo processo de foto-impressão por contacto (Kutateladze e......col.. , Anal............Biochem. 100 , 129 (1979)).
Pode-se empregar na reacção um ribonucleósido-5’-trifosfato marcado radioactivamente (por exemplo marcado com ou marcado 32 com alfa- PO4) de modo que o ARN fica radioactivo e pode ser detectado por qualquer dos numerosos procedimentos, conhecidos, através da sua radioactividade.
A biotina ou a iminobiotina pode ser incorporada no ARN, o qual pode ser então detectado por técnicas conhecidas com um aduto de enzima-avidina ou de enzima-estreptavidina, o qual se liga à biotina ligada ao ARN e catalisa a produção de um cromogénio adequadamente detectável. A incorporação da biotina ou da iminobiotina pode ser conseguida empregando UTP, que é biotinilado através de um espaçador do carbono 5 da porção uracilo, como um substrato para a replicase, na reacção de replicação. Tais UTP são compostos conhecidos. Além disso, sabe-se que tais UTP são substratos da QB replicase e que os ARN que incluem uracilos biotinilados, através de grupos espaçadores ligados ao carbono na posição 5 em virtude da utilização de tais UTP na sua síntese, são moldes na replicação catalisada por QB
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-18replicase.
ARN pode ser tornado fluorescente empregando uma reacção catalisada por ARN ligase de T4, para adicionar nucleótidos, modificados para serem fluorescentes, à extremidade 3’ do ARN replicativo. Ver Cosstick e ç o 1. , N u ç 1. A çi ds Res. 12 , 1791 (1984). A fluorescência do ARN resultante pode ser utilizada para detectar o ARN por qualquer uma das várias técnicas correntes.
Ainda entre outros processos que podem ser utilizados para detectar o ARN estão aqueles nos quais uma substância informadora, que se liga especificamente com ácido nucleico, é adicionada ao sistema no qual a replicação tem lugar, ou ao meio, tal como um suporte positivamente carregado, tal como papel ETCEOLA, no qual o ARN replicado foi isolado, e mede-se o sinal da substância informadora. Tais substâncias incluem: corantes cromogénicos tais como coram tudo (stains all) (Dahlberg e col. , J, Mol. B io1 41 , 139 (.1969); azul de metileno (Dingman e col., Biochemistry 7, 659 (1968), e mancha de prata (Sammons e col., Electrophoresis......2, 135 (1981); Igloi, Anal. Biochem. ..134,
184 (1983); compostos f 1 uor ogénic os que se ligam ao ARN - por exemplo brometo de etídio (Sharp e......col., Biochemistry12, 3055 (1973); Bailey e...... col. , Anal..........Biochem,. 7.0, 75 (1976); e compostos f1uorogénicos que se ligam especificamente aos ARN que são moldes na. replicação por QB replicase - por exemplo uma f i c o b i 1 i p r o t e i n a (0 i e...... col. , J . C e11 B i o1 . 93, 981 (1982);
Stryer e......col,. Patente E.U. N2. 4 520 110) conjugada com a subunidade virai da QB replicase.
Em ensaios de acordo com o invento, os ensaios são conduzidos simultaneamente sob condições tão semelhantes quanto possivel, sobre as amostras de teste e de controlo. Como conhecido na arte, as amostra de controlo são semelhantes às amostras de teste, mas sabe-se se não contêm alvo ou se contêm uma quantidade conhecida de alvo. Um controlo sem alvo determina o fundo abaixo do qual não é possivel distinguir as amostras que contêm alvo das que não contêm. Comparando a quantidade ou concentração de ARN produzido no ensaio de uma amostra de teste
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-19com a quantidade ou concentração produzida oom amostras de controlo produzidas simultaneamente, pode ser determinada a presença de alvo na amostra de teste a um nível acima do fundo. Se se empregam amostras de controlo com uma gama de concentrações de alvo conhecida, pode-se calcular a concentração de alvo na amostra de testes.
uso de uma replioase para indução (autocatalítica) da replioação dos transcritos de ARN opcionalmente replicáveis do presente invento, é de modo geral conhecido na arte. Exemplos de tais replicases, que são úteis no presente invento, incluem a chamada replioase do vírus QB que reconhece certos sítios da sequência de ácido nucleico na extremidade de um dado transcrito de ARN e o chamado vírus do mosaico da cevadinha (BMV) bem como as replicases dos vírus alfa que se pensa reconhecerem os sítios da sequência de ácido nucleico na extremidade 3’ de um dado transcrito de ARN. Estas replicases servem para replicar, isto é reproduzir, os transcritos de ARN e os complementos, de modo a multiplicar as suas cópias. Quando tal enzima está presente na reacção, durante o processo de transcrição, pode-se prever que os múltiplos transcritos que se produzem durante a transcrição, podem, eles próprios, sofrer replioação, de modo a aumentar i exponencialmente a quantidade de produto transcrito de ARN.
. Descrição por menor iza da das çonçreti zações objectivo último do presente invento é a capacidade de realizar múltiplos ciclos de amplificação in vitro, sem necessidade de ciclos térmicos ou da adição de enzimas suplementares. A figura anexa à presente especificação delineia o esquema de uma concretização preferida, de modo diagramático. 0 aspecto principal e extraordinário do presente invento é a inclusão da enzima RNase H. Fazendo novamente referência ao desenho anexo, os passos, um e dois, são idênticos aos empregues no chamado protocolo TAS - cf. os pedidos de patentes e pedido internacional PCT aos quais se fez referência no início deste pedido - mas no passo três, em vez de um passo de desnaturação térmica, o duplex híbrido de ARN/ADN é separado em cadeias por digestão selectiva do alvo de ARN pela utilização de RNase Η. A
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actividade da RNase H possui uma especificidade para o ARN, apenas quando está presente num duplex híbrido de ARN/ADN. Os produtos desta digestão podem ser um único oligómero de ARN ou múltiplos oligómeros de ARN (passo 4) e, por sua vez, estes oligómeros podem actuar como iniciadores da síntese de ADN, usando transcriptase inversa (RT) como catalisador desta reacção de ADNc (passo 5). 0 ADN de cadeia dupla mostrado no passo 5, pode actuar como molde na transcrição comandada por ARN polimerase de T7 (passo 6). Este produto de ARN amplificado serve agora como moléculas informadoras de detecção da sequência alvo e/ou serve como moléculas alvo adicionais para continuar as reacções auto-cíclicas (passos 7 a 12).
As reacções melhor sucedidas, produzindo uma amplificação do alvo de aproximadamente 106 vezes, funcionam com três enzimas e com dois iniciadores oligonucleótidos contendo a sequência de ligação ã ARN polimerase de T7 (PBS). As enzimas necessárias são a transcriptase inversa de AMV, a ARN polimerase de T7 e a RNase
H de E......... coli. A adição de RNase H de E. _ coli à reacção suplementa a actividade RNase presente na transcriptase inversa de AMV e parece ser necessária para produzir elevados níveis de amplificação. A selecção dos iniciadores oligonucleotidicos óptimos centra-se nas áreas do comprimento da sequência visada, inclusão da sequência de ligação à polimerase num ou em ambos os iniciadores e na eficácia dos iniciadores contendo a sequência de ligação à polimerase, como promotores da transcrição. Todos os três afectam o nível da amplificação. A inclusão de dois iniciadores de oligonucleótidos contendo, cada um,um PBS resultou em mais amplificação do que a inclusão de um só iniciador contendo PBS e de um iniciador não contendo PBS.
Com referência ao desenho anexo:
(1) a molécula alvo de oligodesoxirr ibonucleótido incorporando uma sequência polimerase de T7,
ARNm é desnaturada/renaturada com um alvo, sintético, específico, de ligação ao promotor de ARN (2) este iniciador é prolongado pela actividade ADN
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polimerase da transcriptase inversa de ΑΓ-IV, de modo a sintetizar a primeira cadeia de ADNc, (3) a actividade RNase H da transcriptase inversa de AMV e a da RNase H de E.coli, degrada o ARN do duplex híbrido de ARN/ADN, tornando o ADN disponível, como molde, para a sintese da segunda cadeia de ADNc, (4) os oligorribonucleótidos auto-gerados, resultantes da digestão pela RNase H, ou um oligodesoxirribonucleótido sintético, incorporando de preferência a sequência de ligação ao promotor de ARN polimerase de T7 (não mostrado no desenho) inicia a síntese da segunda cadeia de ADNc. A transcriptase inversa de AMV prolonga, então, o iniciador para formar um ADN de cadeia dupla que incorpora uma sequência de ligação ao promotor de ARN polimerase de T7 operativa, (5) a ARN polimerase de T7 liga-se à sequência de ligação do promotor de cadeia dupla e transcreve cópias de ARN complementarmente ao ácido nucleico alvo, (6) um segundo iniciador ol igodesoxirr ibonucleotí.dico oom um PBS desnatura-se/renatura-se com o transcrito de ARN, (7) a transcriptase inversa de AMV catalisa a sintese de uma cadeia de ADNc, (8) a RNase H degrada o ARN do duplex híbrido de ARN/ADN e torna o ADN disponível como molde, para a síntese da segunda cadeia, (9) um iniciador oligodesoxirribonucleotídico hibridiza-se com a segunda cadeia de ADNc e a transcr iptase inversa de AMV sintetiza o ADN. Dá-se a transcrição e os ciclos continuam.
4. Exemplos 1 Amplificação......de.......uma......primeira......região.....e ny de HIV-.1
Amplificou-se uma região de ARN de HIV-1, numa reacção enzimática isotérmica, que produziu 10^ vezes mais cópias desta região, no final da reacção.
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22a ReacÇãoHeampl ificação material de ácido nucleico de partida foi ARN pelotizado com césio, que tinha sido extraído de células CEM infectadas com HIV-1 (linha de células 1infoblastóides humanas; Folks ecolab.,
Proc........ Natl........ Sei....... USA...... 82, gradiente de cloreto de
4531 (1985)) pelo procedimento em césio- isotiocianato de guanidínio descrito por Maniatis e......colab., supra (calculou-se que as sequências específicas de HIV-1 eram de 1-10% do total de ácidos nucleicos presentes).
Colocou-se numa mistura reaccional um décimo de atomole de ácido nucleico alvo (volume total 100 u.1), contendo a mistura reaccional (concentrações finais):
Tris.HCl 40 mM, pH 8,1 MgCl2 12 mM NaCl 25 mM
Espermidina 2 mM - (HC1)3 Ditiotreitol 5 mM 80 pg/ml 8SA dATPm, dCTP, dGTP e dTTP, cada a 1 mM ATP, CTP, GTP, UTP cada a 1 mM
0,25 pg de cada oligonucleotido iniciador (88-211 e 88-347, ver infra).
Os componentes da reacção foram combinados num tubo de eppendorf de 1,5 ml e em seguida colocados sob vórtex breve e suavemente. 0 ácido nucleico alvo foi desnaturado por aquecimento do tubo a 652C, durante um minuto, num banho de água. Após arrefecimento durante um minuto a 372C, adicionaram-se as seguintes enzimas:
unidades de transcriptase inversa de AMV (15-25 unidades/pl) 100 unidades de ARN polimerase de T7 (100 unidades/pl) unidades de RNase H de E.........coli (2 unidades/pl)
A reacção continuou durante três horas a 372C, manipulação.
sem mais
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-23b. Detecção dos produtos .deamplificação
Depois de cerca de uma hora, os produtos foram detectados 32 usando oligonucleótido marcado com P, complementar de uma região com 30 pares de bases, dentro do fragmento amplificado (88-298). Desnaturou-se uma alíquota da reacção, representando 1/40 do volume total, em 95,0 pl de formaldeido a 7,4¾ e com 10 x x SSC (Maniatis e......colab., supra) a 552C num banho de água, durante 20 minutos. A alíquota foi imediatamente arrefecida em gelo e carregada sobre uma membrana de nitrocelulose através de um aparelho slot-blot. Os ácidos nucleicos foram imobilizados na nitrocelulose por radiação UV (254nm).
Após fixação, os filtros foram pré-hibridados a 552C, durante 15 minutos, em 50-100 pl de tampão /cm de filtro, contendo BSA a 0,5%, polivinilpirrolidona a 0,5%, 5 x SSPE (20x = = NaCl 3,6M, NaH2PO4 200 mM, EDTA 20 mM, pH 7-8) e SDS a 1%. A hibridação deu-se durante duas horas a 552C no mesmo tampão contendo 2-5 x 106 cpm/ml da sonda de oligonucleótido fosforilado. A sonda foi adicionada ao tampão de pré-hibridação.
Os filtros foram lavados três vezes, à temperatura ambiente, durante três minutos, usando de cada vez 1 ml de tampão/cm de filtro 1 x SSPE, SDS a 1%, em seguida durante um minuto no mesmo tampão a 552C.
Os filtros foram auto-radiografados a -702C com um écran intensificador.
Calcularam-se os níveis de amplificação comparando a intensidade do sinal produzido pelo produto amplificado com o sinal produzido por quantidades conhecidas de ARN de HIV-1 ou de pARV7A/2 (Luciw e.colab. Nature312, 760, (1984)), um plasmídeo contendo uma cópia de ADNc do genoma de HIV-1 inserida no sítio EcoRI de pUC19.
No exemplo anteriormente descrito, o nivel de amplificação foi de 1 x 10 . As análises da mancha Northern e de mancha Southern do produto, usando sondas de detecção 88-297 e 88-298 mostraram que ele era uma mistura de ADN e de ARN, sendo o ARN o tipo dominante. 0 produto tinha uma dimensão descontínua ( 210
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-24pb) numa gama estreita (20-40 pb).
- Amplificação......de.......uma......segunda região envde.....HIV-1
Seguindo os procedimentos descritos no exemplo 1, realizou-se a amplificação de uma segunda região env de HIV-1, excepto que se usaram os oligonucleótidos de iniciação 87-284 e 88-347 (infra) para a amplificação e os oligonucleótidos de detecção 86-272 e 86-273 (i nfra) para a detecção. Obteve-se uma amplificação de 10^ vezes.
- Ampl if icação......da......região......sor.......de......HIV-1
Seguindo o procedimento descrito no exemplo 1, realizou-se a amplificação da região sor de HIV-1, excepto que se usaram os oligonucleotidos de iniciação 88-77 e 87-292 (infra) na amplificação e os oligonucleótidos de detecção 86-31 e 86-32 na detecção. Obteve-se uma amplificação de 10^ vezes.
Amplificação......da.......primeira......região......env.....de HIV-1 a par tirde amostrasdesanguede.....pacientescomSIDA
Amplificaram-se os ARN de três amostras clínicas infectadas com HIV-1. Os ARN foram extraídos através do protocolo de extracção orgânica (infra).
Conduziu-se a amplificação como no exemplo 1, utilizando os oligonucleótidos de iniciação 88-211 e 88-347 (infra) e os oligonucleótidos de detecção 88-297 e 88-298 (infra).
Duas das amostras mostraram resultados positivos. Nas 5 reacções destas experiências a amplificação total foi de 10' vezes. Em virtude do sinal detectado após amplificação ser directamente proporcional à quantidade de material de partida presente no inicio da reacção (ver exemplo 5), é possível que a terceira amostra clínica não seja identificada como estando infectada por HIV-1, em consequência de conter uma quantidade demasiado pequena de sequência de HIV-1 alvo de partida.
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-255 - Amplificação da......primeira região......env......de......HIV-1emcél ulas CEM não.............infectadas...........misturadas............com............quantidades...........variáveis de células..CEM.......infectadas com HIV-1
A amplificação foi conduzida como no exemplo 4, utilizando os oligonucleótidos de iniciação 88-211 e 88-347 (infra) e os oligonucleótidos de detecção 88-297 e 88-298 (infra).
A amplificação do alvo, usando os ácidos nucleicos totais 3 extraídos (ver exemplo 7), de 10 para 1 célula CEM infectada por HIV-1, numa população de 10^ células CEM não infectadas, mostrou um sinal proporcional ao número de células infectadas presentes na amostra. 0 controlo negativo, 10 células CEM não infectadas, mostrou pouco fundo. Este sinal de fundo foi significativamente menor do que o sinal obtido com uma amostra de 10 células CEM i nfectadas.
- Reagentes e oligonucleótidos
a. 0s nucleotidos-trif os fatos são da Sigma, a transcriptase inversa de AMV é da Life Sciences, a ARN polimerase de T7 é da Stratagene, a ribonuclease H de E.coli e o BSA são dos Bethesda Research Labs.
b. QÍÍ.9..P?.'- 0s oligonucleótidos foram sintetizados por química do fosforoamideto usando um Applied Biosystems 380A, e em seguida foram purificados por HPLC.
Os oligonucleótidos usados como sondas são específicos de HIV-1 sequências referidas por Ratner 313, 277 (1985), para as regiões iniciadores e como e correspondem às ecolab., Na t ur e env e sor.
88-211: (oligonucleótido de iniciação; nt 6450-6479; env)
5’AATTTAATAC G A Ç T C A Ç T A T AGGGATCTATTGTGCCCCGGCT GTTTTGCGATTCTA-3’
88-297: (oligonucleótido de detecção; nt 6560-6531; env)
5’TGGCCTAATTCCATGTGTACATTGTACTGT-3’
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88-298: (oligonucleótido de detecção; nt 6531-6560; env)
5’ACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCA-3’
88-347: (oligonucleótido da iniciação; nt 6661-6632; env)
5’A A T T T A A T A Ç G A C T C A Ç T A T AGGGATGTACTATTATGGTTTT AGCATTGTCTGTGA-3’
88-77: (NT 5018-4988; sor) iniciação
5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGACACCTAGGGCTAACTAT GTGTCCTAATAAGG-3’
87-292: (nt 4766-4796; sor) iniciação
5’-TAATAÇGAÇTCACTATAGGGAAAGAATAAGTTC AGAAGTACACATCCCACT-3’
86-31: (nt 4901-4932; sor) detecção
5’GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3’
86- 32: (nt 4932-4901; sor) detecção
5’-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTGC-3’
87- 284: (nt 6551-6579; env) iniciação ’ -1A ATAC GACTC.AC TA TA GGGAAATTAGGCCAGT AGTATCAACTCAACT-3’
86-272: (nt 6591-6620; env) detecção
5’-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3’
86-273: (nt 6620-6591; env) detecção
5’-AGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGA-3’
Cada oligonucleótido de iniciação contém uma sequência na extremidade 5’ que é a sequência de ligação à ARN polimerase de T7 (sublinhada) e o sitio de iniciação da transcrição preferido (a negrito). A parte restante da sequência é complementar à sequência alvo.
Relativamente à sequência alvo de HIV-1, os oligonucleótidos 88-211, 88-298, 87-292, 86-31, 87-284 e 86-273 são complementares à cadeia negativa e os oligonucleótidos 88-347, 88-297, 88-77,
86-32 e 86-272 são complementares à cadeia positiva.
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-277. Extracção.....orgânicadosARN
Protocolo para a preparação de ácidos nucleicos em amostras de células infectadas:
Células pelotizadas: 5k rpm durante 10’ a partir de 1 ml de solução salina tamponada com Tris. Decantar e rejeitar o sobrenadante, deixando 50 ul com pelotas.
Ressuspender a pelota em 600 ul de tampão de lise.
Sujeitar a vórtex vigorosamente e incubar a 502C durante 45’, submeter a vórtex durante 10-15’’ cada 10’.
Adicionar 600 ul de fenol:clorofórmio:álcool isoamilico (50:48=2). Agitar e sujeitar a vórtex para emulsionar a mistura. Centrifugar a 14 k rpm durante 2’ para separar as fases.
Decantar 575 ul da fase aquosa (topo). Adicionar 600 ul de fenol:clorofórmio:álcool isoamilico (50=48:2). Agitar e sujeitar a vórtex para emulsionar a mistura. Centrifugar a 14k rpm durante 2’ para provocar a separação das fases.
Decantar 525 ul da fase aquosa. Adicionar 600 ul de clorofórmio:álcool isoamilico (24=1). Agitar e sujeitar a vórtex para emulsionar a mistura. Centrifugar a 14k rpm para provocar a separação.
Decantar 400 ul da fase aquosa. (Não transferir quaisquer resíduos celulares que possa haver na interface).
Adicionar 1/10 volume de LiCl 8M (40 ul ). Neste passo as amostras podem ser divididas para processamento.
Adicionar 3 volumes de etanol a 100¾ gelado, às amostras que foram dividas. Adicionar 2,5 volumes de Etanol a 100¾ gelado, às amostras que não foram divididas. Misturar bem. Precipitar durante a noite a -202C ou num banho de gelo seco/etanol durante 15’ .
405
File 48477
-28Reagentes
Tampão deli.se
Tris 20 mM pH 7,5 NaCl 150 mM EDTA 10 mM 0,2% SDS
200 ug/ml de proteinase K
Solução, salina tamponada com Tris
NaCl 137 mM
KC1 5,1 mM
Base Tris 24,8 mM
Ajustar o pH a 7,4 com HCl IN. Esterilizar por autoclavagem
A descrição dada anteriormente pormenoriza processos específicos que podem ser empregues na prática do presente invento. Tendo pormenorizado processes específicos, inicialmente usados para descrever o presente sistema de amplificação isotérmica, os peritos na técnica saberão projectar processos equivalentes, alternativos, resultando numa amplificação semelhante num ambiente isotérmico de um só vaso e para alargar esta informação a ácidos nucleicos alvo diferentes daqueles especificamente aqui divulgados. Em consequência, por muito detalhado que o texto anterior possa parecer, não deve ser considerado como limitador do âmbito total; pelo contrário, o âmbito do presente invento deve ser regulado apenas pela interpretação legal das reivindicações anexas.
ΊΟ 405
File 48477

Claims (28)

  1. R......Ε.......I.......V.......I.......Ν.......Ρ.......I.......Ç Α.....C Q ΕS
    1 - Processo de preparação de um ADN de cadeia dupla codificando uma sequência correspondendo a uma sequência de ácido nucleico alvo e possuindo um promotor polimerase operativo, caracterizado por compreender:
    a) proporcionar um primeiro iniciador (primer) de ADN contendo uma sequência promotora da ARN polimerase operativamente associada com uma sequência que é um complemento de um segmento de uma sequência de ácido nucleico alvo,
    b) pôr em contacto, sob condições de hibridação adequadas, o referido primeiro iniciador de ADN com uma amostra de ácido nucleico, a qual pode conter a referida sequência de ácido nucleico alvo,
    c) permitir a extensão do iniciador de qualquer produto de hibridação do referido primeiro iniciador de ADN com a refer ida sequência de ácido nucleico alvo, numa reacção de extensão com ADN polimerase, de modo a formar um ácido nucleico duplex ARN/ADN, correspondente,
    d) digerir, selectiva e enzimaticamente a cadeia de ARN do referido ácido nucleico duplex ARN/ADN,
    e) permitir a hibridação do promotor libertado, contendo a cadeia de ADNc, sob condições de hibridação adequadas, com um segundo iniciador de ácido nucleico, sendo o referido segundo iniciador de ácido nucleico um produto da referida digestão selectiva ou sendo um iniciador de oligonucleotido derivado extrinsecamente contendo opcionalmente uma sequência promotora, e
    f) permitir a extensão do iniciador do produto de hibridação do iniciador com a referida cadeia de ADN, numa reacção de extensão com ADN polimerase.
  2. 2 - Processo para a detecção de, pelo menos,uma sequência de ácido nucleico alvo, especifica, numa amostra de ácido nucleico que pode conter a referida sequência alvo de ácido nucleico, caracterizado por compreender:
    70 405
    File 48477 λΖ30g) empregar o ADN de cadeia dupla da reivindicação 1, como um molde de ADN de cadeia dupla, para a preparação de uma pluralidade de transcritos de ARN a partir dele, cada um comportando uma sequência de ARN correspondendo à referida sequência de ácido nucleico alvo.
  3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender o passo adicional de detecção e, opcionaimente, medição da presença da referida sequência de ARN.
  4. 4 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico alvo, na referida amostra de ácido nucleico, estar presente intrinsecamente como tal ou ser um produto de extrapolação de uma sequência alvo de ADN, correspondente, preparado por transcrição a partir de um molde de ADN de cadeia dupla, preparado por extensão do iniciador à base de polimerase de um iniciador hibridado com uma cadeia de ADN separada comportando, operativamente, uma sequência promotora preparada a partir do produto de extensão de iniciador/hibridação da referida sequência de ADN alvo com um iniciador comportando operativamente uma sequência promotora.
  5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender os passos adicionais de:
    h) permitir a hibridação dos referidos transcritos de ADN sob condições de hibridação adequadas, com um iniciador de ADN contendo uma sequência promotora operativamente associada com uma sequência que é um complemento de um segmento da referida sequência de transcrito de ARN,
    i) permitir a extensão iniciador do produto hibridado do passo h) numa reacção de extensão com ADN-polimerase, para formar um ácido nucleico duplex ARN/ADN, correspondente,
    3) referido digerir, selectiva e enzimaticamente, a cadeia de ARN do ácido nucleico duplex ARN/ADN do passo i),
    k) permitir a hibridação do promotor libertado contendo o produto de cadeia de ADN do passo j), sob condições de hibridação
    70 405
    File 48477 adequadas, com um iniciador de ãcido nucleico, sendo o referido iniciador de ácido nucleico um produto da referida digestão selectiva do passo j) ou sendo um iniciador de oligonucleótido derivado extrinsecamente, comportando opcionalmente uma sequência promotora operativamente,
    l) permitir a extensão do iniciador do produto da hibridação do passo k) numa reacção de extensão com ADN-polimerase, e
    m) empregar o produto de ADN de cadeia dupla do passo 1) como um molde de ADN de cadeia dupla para a preparação, a partir dele, de uma pluralidade de transcritos de ARN.
  6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os produtos transcritos de ARN terem um sentido oposto ao dos produtos transcritos de ARN da reivindicação 2.
  7. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se permitir que o processo se prolongue contínua e espontaneamente em virtude da presença no meio reaccional de actividades enzimáticas, por meio de:
    1) uma transcriptase inversa, 2) uma enzima possuindo actividade RNase H, 3) uma ARN-polimerase dependente de ADN e 4) pelo menos uma sequência de iniciador de oligonucleótidos comportando operativamente uma sequência promotora.
  8. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ser conduzido de modo substancialmente isotérmico.
  9. 9 - Processo caracterizado por compreender o emprego do ácido nucleico de cadeia dupla de acordo com a reivindicação 1 ou com o passo 1) da reivindicação 5, como um molde para a preparação, a partir dele, de uma pluralidade de transcritos de ARN, numa reacção catalisada por uma polimerase que reconhece o seu promotor, comportando cada um uma sequência de ARN correspondendo à referida sequência de ácido nucleico alvo e a detecção e opcionalmente a medição da presença dos referidos transcritos de ARN.
  10. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 9, caracterizado por os referidos transcritos conterem um local de
    70 405
    File 48477
    -32reconhecimento da ARN-replicase, para replicação dos referidos transcritos por indução da ARN-replicase.
    2, 9 ou 10, dos referidos a medir a
  11. 11 - Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por a sequência de ARN detectada, transcritos, ser medida de modo padronizado de modo quantidade de sequência de ácido nucleico alvo contida numa amostra de ãcido nucleico utilizada na preparação do molde de ácido nucleico de cadeia dupla.
  12. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a sequência de ARN detectada dos referidos transcritos de ARN ser medida de modo internamente padronizada com a presença de um número de cópias de ácido nucleico conhecido, também contidas na referida amostra.
  13. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico alvo estar associada com as caracteristicas de uma doença ou situação genética ou patogénica.
  14. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico alvo estar associada com um vírus da imunodeficiência humana.
  15. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequência de ácido nucleico alvo estar associada com um gene defeituoso.
  16. 16 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado por o promotor ser um promotor do bacteriófago T7 e os transcritos de ARN serem produzidos usando T7 ARN-polimerase.
  17. 17 - Processo caracterizado por a RNase H.
  18. 18 - Processo caracterizado por a -polimerase I de E.
    de acordo com a reivindicação 1 ou 5, digestão selectiva ser conduzida com a enzima de acordo com a reivindicação 1 ou 5, reacção de extensão ser catalisada pela ADNcoli .
    Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5,
    70 405
    File 48477
    -33caracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pelo fragmento de Klenow da ADN-polimerase I de E. coli.
  19. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pela T7 ADN-polimerase.
  20. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 5, cracterizado por a reacção de extensão ser catalisada pela transcriptase inversa.
  21. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 5, caracterizado por os referidos transcritos de ARN serem marcados antes da detecção.
  22. 23 - Processo de acordo caracterizado por os referidos radiornarcados.
    com a reivindicação 22, transcritos de ARN serem
  23. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 22, oaracterizado por os referidos transcritos de ARN serem marcados com crornóforo.
  24. 25 - Processo aperfeiçoado de amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, gerada como tal ou como um produto de extrapolação de uma sequência de ADN alvo, correspondente, que compreende os passos de hibridação oom um iniciador de ADN possuindo uma sequência promotora operativamente associada com ele, seguida por extensão do iniciador com polimerase para produzir um duplex ARN/ADN correspondente e hibridação da referida cadeia do produto de extensão de ADN, contendo a sequência promotora do referido duplex, com um segundo iniciador, seguida de extensão de iniciador com polimerase para formar um molde de ADN de cadeia dupla, útil na preparação a partir dele de transcritos de ARN opcionalmente replicáveis para detecção como tal ou para uso posterior em reacções como as acima definidas, caracterizado por a referida cadeia de produto de extensão de ADN contendo a sequência promotora do referido duplex ARN/ADN ser tornada disponível para a sua hibridação seguinte com o referido segundo iniciador por meio de digestão, selectiva e enzimática da cadeia de ARN do referido duplex ARN/ADN com uma enzima possuindo
    70 405
    File 48477
    -34a actividade da enzima RNase H.
  25. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a referida enzima ser a RNase H.
  26. 27 - Processo de produção de um conjunto, útil no processo de acordo com a reivindicação 2, na detecção de pelo menos uma sequência de ácido nucleico alvo específica numa amostra de ARN que pode conter a referida sequência de ácido nucleico alvo, caracterizado por se proporcionar uma mistura reaccional compreendendo uma transcriptase inversa, uma enzima possuindo actividade RNase H, uma ARN-polimerase dependente de ADN e pelo menos um iniciador de ADN contendo uma sequência promotora operativamente associada com uma sequência complementar de um segmento de uma sequência de ácido nucleico alvo ou de um seu complemento, por um lado, e meios através dos quais, após contacto da referida mistura com a amostra para detecção da sequência de ácido nucleico alvo, se detecta a sequência de ácido nucleico alvo após amplificação, por outro lado, e se embalarem independentemente numa mesma embalagem.
  27. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por se proporcionarem meios para realizar reacções envolvendo os seus componentes em condições isotérmicas.
  28. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a referida enzima possuindo actividade RNase H ser a RNase H.
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