PT88665B

PT88665B - Metodo para a marcacao com ester de acridinio e purificacao de sondas nucleotidicas

Info

Publication number: PT88665B
Application number: PT88665A
Authority: PT
Original assignee: Ml Tecnology Ventures Lp
Priority date: 1987-10-05
Filing date: 1988-10-04
Publication date: 1992-12-31
Also published as: EP0312248A3; ATE109790T1; KR890701611A; ES2056937T3; CA1314009C; DK267889D0; EP0312248A2; FI892692A7; EP0312248B1; DK267889A; WO1989002896A1; FI892692A0; JPH02502283A; DE3851031T2; DE3851031D1; KR970005899B1

Description

MÉTODO PARA A MARCAÇÃO COM ESTER DE ACRIDÍNIO E PURIFICAÇÃO DE SONDAS NUCLEOTIDICAS k

volume, e pode ser efectuado em solução, ou com um ou outro dos ésteres de acridínio, ou a sonda suspensa em solução. A purificação (a separação da sonda marcada a partir da sonda não marcada e da marca livre) compreende (1) em primeiro lugar, a remoção da maior parte da marca éster de acridínio a partir da sonda usando técnicas de separação rápidas, (2) a seguir, a remoção de substâncialmente toda a marca livre que permanece, a partir da sonda e a separação da sonda marcada ! a partir da sonda não marcada, envolvendo aplicações especíj ficas de HPLC de permuta iónica, de fase reversa ou de hidroI

I xiapatite.

j l·

A presente é, parcialmente, uma continuação de App. Ser. N° 105.800 registado a 5 de Outubro de 1987.

Campo do invento

O invento diz respeito a métodos e comI i; posições para a ligação de marcadores detectáveis a reagentes de diagnóstico. Mais especificamente diz respeito à marcação I¹ e purificação de sondas nucleotídicas com ésteres de acridi;ί nio quemiluminescentes para uso em ensaios de diagnóstico por íi i: hibridação.

j; Fundamentos do invento Conhecimentos anteriores

Nos últimos vinte anos, uma grande variedade de agentes tem sido usada como marcadores em ensaios de investigações e de diagnóstico clinico. Recentemente, ensaios de hibridação foram desenvolvidos com o fim de detectar i com grande sensibilidade a presença de sequências de polinu' cleotídos únicas. Nesses ensaios, tipicamente, um multimero de nucleotidos (sonda) é marcado com um átomo ou um grupo que pode ser imediatamente detectado.

1Quando a sonda marcada é adicionada a uma amostra a testar, suspeita de conter uma sequência de nucleotidos alvo, o alvo híbrida com a sonda marcada em condições de hibridação. A presença de uma sequência alvo na amostra pode ser determinada qualitativa ou quantitativamente, de uma forma geral por separação das sondas hibridadas e não hibridadas seguido da determinação da qualidade de sonda marcada hibridada, ou por determinação da presença do marcador em híbridos da sonda ou por determinação da quantidade do marcador em sondas não hibridadas.

Historicamente, as sondas radioactivas

têm vindo a ser usadas. Contudo, devido a acidentes de saúde e dificuldades no manuseamento criaram-se, mais tarde, marcadores não radioactivos. Tais marcadores incluem os que podem ser determinados quer directa quer indirectamente. Exemplos de marcadores directos incluem aqueles que podem ser detectados por quemiluminescência, fluorescência ou por espectroscopia. Exemplos de marcadores indirectos incluem compostos tais como a biotina e vários antigénios que podem ser detectados através de proteinas conjugadas a um marcador apropriado detectável.

Um dos métodos preferidos para introduzir marcadores em sondas de multimeros de nucleótidos consiste em introduzir braços de ligação em sondas sintatizadas enzimáticamente ou quimicamente. Por exemplo, 4-tio-UTP (H. Eshaghpour et al., Nucl. Acids Res., Vol. 7, p. 1485, 1979 foi ligado à extremidade 3' de fragmentos de DNA e marcado seguidamente na metade nucleofilica de grupos sulfohidrilicos. Um outro método incluido num Pedido PCT por Tchen (International Publication NQ WO 86/00074; publicada a 3 de Janeiro de 1986), descreve uma técnica na qual as bases nucleotidicas pirimidinicas são despiriminadas e os aneis de açúcar resultantes são abertos de tal forma que um grupo que comporta uma amina pode ser ligado.

Para além disso, os análogos precursores de trifosfato de 5-alilamina, uridina descritos por P.R. Langer et al. (Proc. of Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 78, p. 6633, 1981) podem ser usadas para incorporar grupos de aminas nucleofilicas em sondas de multimeros de nucleótidos, o que fornece sitios para a marcação.

Métodos químicos de marcação também foram propostos e permitem a ligação de marcadores a nucleotidos situados em multimeros de nucleótidos. Um desses métodos inclui a transaminação catalizada por bissulfitos, com etilenodiamina, na posição C-4 de resíduos de cisteina em sonI

das de ácidos nucleicos (R.P. Viscidi et al, , J. Clin. Biol., Vol. 23, p. 311, 1986). Outras técnicas foram descritas e permitem a ligação de um só marcador nas extremidades 5¹ ou 3¹ de um multimero de nucleótidos, geralmente um oligonucleotido. Por exemplo foram descritas abordagens da marcação terminal que permitem a junção de um braço de ligação na fase final da síntese de oligonucleotidos em fase sólida. Tais braços de ligação são utilizadas para a ligação do marcador. Como exemplo ver B.A. Connolly, Nucl. Acids Res., Vol. 13, p. 4485, 1985; S. Agrawel et al., Nucl. Acids Res., Vol 15, p. 3131, 1987.

Foram também descritos compostos que podem ser usados para inserir um resíduo de nucleótidos primário com uma amina modificada, em posições seleccionadas num oligonucleotido sintético durante os processos padrão de síntese automatizados. Tais compostos incluem análogos da deoxitimidina, deoxiadenina, deoxihuanina, etc. (G.B. Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 82, p. 968, 1985; J.L. Ruth, pedido de PCT NQ US84/00279, NQ Publicação WO84/ /03285, publicado em 30 de Agosto de 1984). Para além disso, foram descritos derivados de alquilamina de nucleótidos com grupos fosfato ligados e cujo grupo funcional amino pode ser marcado seguidamente (R.L. Letsinger and M.E. Schott, Jour. Amer. Chem. Soc., Vol. 103, p. 7394, 1981; patentes japonesas de N. Sugimoto Nos. 61 44.353 publicada a 4 de Março de 1986)

Em teoria, tais compostos podem permitir que nucleótidos marcados sejam colocados em vários locais ao longo de uma sequência podendo, deste modo, ser usados múltiplos marcadores de forma a aumentar a sensibilidade da detecção. Contudo, deve-se ter cuidado na selecção da localização dos braços de ligação uma vez que a sua presença nalguns desses locais pode reduzir a estabilidade dos híbridos formados com uma determinada sequência alvo, em particular quando estão presentes vários marcadores.

Para além dos braços de ligação des-6-

critos acima, projectamos reagentes de braços de ligação não nucleotidicos que estão descritos em dois pedidos de patente pendentes, de Arnold et al., intitulados Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes U.S. App. Ser. N2 099050 registado a 21 de Setembro de 1987 e Non-Nucleotide Reagents for Substituing the Termini of Oligo Nucleotides US. App.

Ser. N° 104330 registado a 2 de Outubro de 1987. Estes reagentes de braços de ligaçao permitem ultrapassar limitações de outros reagentes anteriores e também a junção desses braços de ligação a uma larga variedade de locais bem como a construção de polímeros de nucleõtidos e não nucleõtidos simultaneamente.

Uma das classes mais sensíveis de marcadores não isotopicos conhecida é a dos esteres de acridinio quemiluminescentes, os quais foram descritos por Compbell et al., na Patente do Reino Unido Νθ 21127798 publicada em 15 de Outubro de 1986 e por Richerdson et al., Chemiluminescence Immunoassay of Plasma Progesterone, with Progesteron-Acridinium Ester Used as the Labeled AnJigen, Clin. Chem., Vol. 31, p. 1664-1668 (1985), para a ligação a proteinas e hormonas em ensaios de imunodiagnóstico. A ligação de ésteres de acridinio a sondas de nucleõtidos Multimericas não é f ácilmenteconseguida usando os processos de marcação e purificação descritos para proteinas. A marcação de sondas de nucleõtidos multimericas com esteres de acridinio foi anteriormente sugerida. Contudo, tais propostas não forneciam métodos para a marcação e purificação (Yabusaki et al., U.S. Patent N2 4599303) uma vez que estes resultavam em fracas marcações e em graus inadequados de purificação das sondas marcadas para utilização em ensaios de hibridação (Mock et al., EPA Application N2 86306305.3 submetida a 15 de Agosto de 1986, Publication NQ 0212951). O método descrito por Mock e Septek, por exemplo, descreve um método análogo ao usado para marcação e purificação de proteinas (Weeks et al.). Não descobrimos que tais métodos são inadequados para a marcação de sondas de oligonucleotidos que contêm traços de ligação com extremidades amino

-Ίnuma quantidade significativa ( — 10%). Para além disso os métodos de filtração em gel empregues na purificação de proteínas marcadas com esteres de acridínio não só não separam as sondas marcadoras das não marcadoras como também não removem convenientemente o marcador não conjugado. Para utilização em ensaios de diagnóstico por hibridação é também necessário que não estejam presentes quantidades significativas de sondas não marcadas, uma vez que tais sondas não marcadas vão competir, nas reacções de hibridação, com as sondas marcadoras, e que a amostra purificada contenha mais de 1% de marcador não conjugado uma vez que este se liga aos suportes de separação e cria um fundo muito alto de quemiluminescência o qual reduz grandemente a sensibilidade dos ensaios de diagnóstico. São necessários meios para a marcação de multimeros de nucleotidos e para a purificação dos multimaos marcados com um grande grau de pureza. 0 invento aqui descrito fornece tais meios.

Objectivos do invento

Um dos objectivos do presente invento é a marcação de sondas com esteres de aaddinio e a purificação de tais sondas marcadas com um grande grau de pureza.

Os sistemas anteriores para 1) marcação de sondas de nucleotidos com esteres de acridínio e purificação das ditas sondas e 2) marcação de proteínas com esteres de acridínio e purificação das ditas proteinas marcadas, não se mostraram satisfatórios para esses fins. Em particular, os ensinamentos anteriores aconselham a marcação de sondas nucleotidicas usando concentrações de reagentes de esteres de acridínio da ordem dos micromolar e, a.purificação com o emprego de técnicas de filtração em gel. Tais concentrações micromoleculares apenas são úteis para a marcação de sondas de nucleotidos em pequena extensão (menor ou igual a 10%). Da mesma forma, os conhecimentos anteriores de técnicas de separação, incluindo a filtração em gel, não são aplicáveis quando usados em sondas mar

cadas com ésteres de acridinio. Não descobrimos que o marcador de éster de acridinio agregado, livre, coelui no volume de exclusão juntamente com a sonda marcada com ester de acridinio. Para além disso, o marcador de éster de acridiniolivre associa-se não covalentemente com a sonda e migra na coluna juntamente com a sonda marcada com ester de acridinio. Por fim, os processos conhecidos não são satisfatórios na separação das sondas marcadas com ésteres de acridinio de sondas não marcadas.

Deste modo, os objectivos deste invento incluem métodos de marcação, com alta eficiência, de sondas de ácidos nucleicos com ésteres de acridinio. Outro dos objectivos deste invento são métodos apara a separação, até um alto grau de pureza, da dita sonda marcada do que não reagiu bem como do éster de acridinio associado não covalentemente. Um outro objectivo deste invento é a elaboração de métodos eficientes, rápidos, reprodutíveis e capazes de produzir grandes quantidades de oligomeros marcados com ésteres de acridinio altamente puros tornando, desta forma, a dita sonda marcada utilizável em ensaios de diagnóstico.

Sumário do invento éster de acridinio fluoro-sulfonato de 4-(2-succinimidiloxicarboniletil)fenil-10-metilacridinio-9-carboxilato, é um composto altamente quemiluminescente que contem um grupo succinimidil que reage com aminas. A reacção deste composto e de outros similares com sondas de ácidos nucleicos que contêm aminas primárias resulta na formação de sondas marcadas quemiluminescentes. Num sistema de reacção análogo, as sondas de ácidos nucleicos que contêm grupos tiol e outras aminas e tióis de conjugação também podem ser levadas a reagir com esteres de acridinio de modo a formarem sondas marcadas quemiluminescentes. Este invento descreve métodos para a construção, marcação e subsequente purificação de sondas que contêm aminas primárias com ésteres de acridinio tendo como resultado a formação de sondas que contêm um único ester de acridinio que amina primária. Também são descritos sistemas análogos para a construção, marcação e subsequente purificação de sondas que contêm grupos tiol com esteres de acridinio.

A marcação de sondas torna-se dificil usando o ester activo de N-hidroxisuccinimidil em concentrações micromoleculares baixas. A marcação de sondas nucleotidicas com ésteres de acridino torna-se ainda mais complexa devido ao facto dos esteres de acridinio serem particularmente instáveis uma vez ligados às sondas. Este invento descreve um método novo de ligação de esteres de acridinio aos grupos amina e sulfohidril contidos nas sondas. Estes grupos, especialmente as aminas, são difíceis de marcar com esteres de acridinio visto que interagem com os fosfatos carregados negativamente da sonda.

método de ligação de esteres de acridinio inventado utiliza altas concentrações de 0,1 a 50 mM) de ester de acridinio. Estas altas concentrações podem ser conseguidas usando solventes orgânicos em concentrações que vão de 20% a 80% do volume total de reacção. Um pH elevado também pode ser empregue para aumentar a concentração efectiva, de aminas e tióis nucleofilicos de conjugação. O método preferêneial para a marcação de sondas utiliza concentrações de 1 a 10 mM de ester de acridinio num solvente orgânico. Tais métodos de marcação podem ser levados a cabo quer em solução quer com o éster de acridinio ou a sonda suspensos em solução.

Assim construídas, as sondas marcadas podem ser purificadas usando os métodos inventivos descritos aqui. A purificação, ou a separação da sonda marcada com éster de acridinio da sonda não marcada e do éster de acridinio livre envolve „ em primeiro lugar, a remoção da maior parte do

marcador de éster de acridinio livre da sonda, seguido da remoção de parte substancial do marcador livre restante da sonda e, finalmente, a separação da sonda marcada, da sonda não marcada e dos produtos de decomposição da sonda marcada. Estas etapas podem ser levadas a cabo sequêncialmente ou simultâneamente.

Os métodos preferenciais para a remoção da maioria do marcador livre da sonda são técnicas rápidas de separação que incluem, não sendo limitadas a estas, precipitação de ácidos nucleicos, HPLC de troca iónica e HPLC de fase reversa. Os métodos preferenciais de remoção dos restantes vestígios de ester de acridinio livre da sonda e que separam simultaneamente a sonda marcada da não marcada incluem aplicações especificas de HPLC de troca iónica, fase reversa ou em hidroxiapatite.

Deste modo, as sondas de ácidos nucleicos podem ser marcados com ésteres de acridinio e purificados até um alto grau de pureza. Tais sondas marcadas e purificadas podem então ser utilizadas no campo dos ensaios de diagnóstico para detectar quantidades diminutas de substâncias alvo especificas. Neste invento está incluída a descrição de reagentes e sistema de ensaio usados na detecção de sondas marcadas com esteres de acridinio.

Breve descrição das figuras

A figura 1 é uma representação gráfica do esquema da reacção do éster de acridinio.

A figura 2 é uma representação gráfica de uma sonda marcada internamente com éster de acridinio.

A figura 3 é um quadro que resume os participantes na conjugação, os produtos da reacção e as con-11-

dições de marcação da sonda com éster de acridinio.

A figura 4 é uma representação gráfica do perfil de HPLC de troca iónica (4A) e de fase reversa (4B) de uma sonda marcada com éster de acridinio.

A figura 5 é uma representação gráfica da detecçâo de sondas marcadas com esteres de acridinio.

Descrição detalhada da terminologia preferência! Def inições

Tal como usados nesta memória e nas reivindicações, os termos seguintes são definidos como:

Ester N-hidroxisuccinimidil de ester de acridinio: derivado da acridina que possui um centro de azoto quaternário e modificado na posição 9 de modo a formar-se um grupo ester de fenil, especialmente, fluoro-sulfonato de 4-(2-succinimidiloxicarbonil etil) fenil-10-metilacridinio-9-carboxilato:

-13ésteres de acridínio: grupos do tipo geral seguinte:

Rj. = alquilo, alquenilo, arilo, alquilo substituído, alquenilo substituído, arilo substituído, alcoxi, aciloxi, ou está ausente quando X é um halogeneo.

R2 = H, alquilo, alquenilo, arilo, alquilo substituído, alquenilo substituído, arilo substituído, alcoxi; ariloxi, apenas quando X = N.

R₃ = H, amino, hidroxi, tiol, halogeneo, nitro, amino, amido acetilo, alquilo, alquenilo, acilo, acetilo substituído, alquilo substituído, alquenilo substituído, arilo substituido, alcoxi, ariloxi.

R₄ = ^alquilo, alquenilo, arilo, alquilo substituido, alquenilo substituido, arilo substituido.

X = 0, N, S, halogeneo, fosforo substituido, enxofre substituido, boro substituido ou arsénio substituido.

Y = 0, S, ou NH.

R^ e/ou Rg e/ou Rg e/ou R^ possuem um sitio reactivo que permite a conjugação quimica.

-14Nucleotídeo: Uma subunidade de um ácido nucleico que consiste num grupo fosfato, um açúcar de 5 carbonos e uma base que contém azoto. No RNA o açúcar de 5 carbonos é a ribose. No DNA é a 2-desoxiribose. Este termo também inclui análogos de tais subunidades.

Multimero de nucleotidos: Uma cadeia de nucleotidos ou de análogos destes unida por ligações fosfodiester.

Oligonucleotido: Um multimero de nucleotidos , geralmente de 10 a 100 nucleotidos de comprimento mas que pode ser maior. Geralmente considera-se que são sintetizados a partir de monomeros de nucleotidos mas também pode ser obtida enzimáticamente.

desoxiriboligonucleotido: Um oligonucleotido formado por monomeros de desoxiribonucleotidos.

Polinucleotido: Um multimero de nucleotidos , geralmente de cerca de 100 ou mais em comprimento. São, habitualmente, de origem biológica mas também podem ser obtidas por meios enzimáticos.

Sonda de multimeros de nucleotidos:

Um multimero de nucleotidos que possui uma sequência de nucleotidos complementar á sequencia de nucleotidos alvo contida num segundo multimero de nucleotidos, geralmente um polinucleotido. Habitualmente , a sonda é seleccionada de modo a ser perfeitamente complementar à base correspondente na sequência alvo. Contudo, nalguns casos pode ser satisfatório e até desejável que um ou mais nucleotidos na sonda não sejam complementares à base correspondente na sequência alvo. Tipicamente, a sonda é marcada. A referência dactilografada sonda deverá ao longo ser usada para indicar uma sonda de nucleotidos multimérica como a aqui definida.

Polimero de nucleotidos/não nucleotidos: Um polímero composto de unidades monoméricas de nucleotidos e não nucleotidos. Quando usado como sonda é, habitualmente, marcado.

Híbrido: 0 complexo formado entre dois multimeros de nucleotidos, por emparelhamento de bases segundo Watson e Crick entre as bases complementares.

Suspensão: Uma mistura de líquidos ou uma mistura de partículas de um sólido que não sedimenta num liquido, o liquido das partículas, sendo gue as partículas formam a fase dispersa e o meio de suspensão a fase continua.

A quimica dos esteres de acridínio foi descrita genéricamente por Weeks et al. Acridinium Esters as High-Spscifie Activity Labels in Immunoassay; Clin. Chem. 2918 1474-1479 (1983). Resumindo, os esteres de acridínio existem em equilíbrio com as suas bases correspondentes. A formação de bases é favorecida por valores altos de pH. A formação de espécies de azoto quaternário é favorecida por valores baixos de pH. A reacção de quemiluminescência envolve o ataque de ião hidroperoxido às éspecies de acridínio, o que resulta na formação de metilacridona excitada electronicamente. A reacção está representada na figura 1.

1. Marcação com o éster N-hidroxisuccinimidil de éster de acridínio.

a) Selecção da sonda

Nas configurações preferidas a sonda a ser marcada contem uma amina primária. Nós utilizamos com sucesso este método usando sondas com braços de ligação aminados modificados na extremidade 5' (5’-aminoetil fosfato; braço de ligação aminado terminal), modificados internamente (braço de ligação aminado terminal não nucleotídico, dos

tipos 1 (ver Ll na patente App. Ser. NP 099050), 2 (ver L3 na patente App. Ser. NQ 099050), L2, L4, L5, L6, L7 ou L8 quando usados quer na substituição de uma base quer numa inserção entre bases), ou adicionando bases modificadas com aminas internamente (amino(12)dUTP, Calbioehem, San Diego,

CA), ou na extremidade 3' da sonda (5-alilamina UTP). Para além disto, o invento pode ser usado para marcar, por exemplo, o esqueleto de fosfatos e os residuos de açúcar. 0 presente invento contempla o uso de outras sondas de nucleotidos modificadas conhecidas anteriormente e a que se faz referência numa secção anterior incluindo sem limitação sondas com braços de ligação aminados, sondas que contêm fosfatos de tiol e sondas que contêm uridinas de tiol.

A figura 2 representa uma sonda marcada internamente com ésteres de acridinio.

b) Marcação da sonda

1. Selecção do pH: depende, em algum grau, do braço de ligação aminado. No entanto o óptimo de pH é cerca de 8 para estas reacções.

2. Selecção do tampão: deve ser um bom tampão a pH óptimo. Algumas escolhas possíveis incluem mas não são limitadas a HEPES, fosfato e bicarbonato.

3. Selecção do solvente orgânico: deve ser usado entre 20% e 80% na mistura final de reacção. As escolhas incluem mas não são limitadas a DMSO, C^CN, dimetil formamida, dioxana, acetona, metanol. Os requisitos para selecção são que a sonda e o éster de acridinio devem ser altamente solúveis no solvente escolhido e que o ester de acridinio e a sonda não sejam excessivamente degradados pelo solvente.

4. Concentração do éster de acridinio:

os limites de 0,1 mM e 50 mM são aceitáveis dependendo do tipo de reacção escolhido. Os limites óptimos para a conjugação do éster N-hidroxisuccinimidil são aproximadamente de 1 a 10 mM, dependendo das reacções usadas com obraço de ligação aminado. Adições múltiplas no decorrer da reacção aumentam a extensão final de marcação mas tornam mais dificil a purificação.

I

5. Temperatura: óptima entre 15 e 40°C

6. Duração da reacção: d=pende das

I reacções dos braços de ligação e de outros parâmetros dos mesmos e deve ser determinada por análise de aliquotas retiradas em intervalos de tempo precisos. Na análise deve-se ter em conta a relação entre a extensão da marcação e o aparecimento de produtos da degradação da sonda marcada com éster de acridinio.

7. Extinsão dos conjugados electrofilicos não reagidos de éster de acridinio N-hidroxisuccinimidil: análogos simples dos nucleofilos dos conjugados devem ser adicionados nas mesmas condições de reacção,

A figura 3 resume os produtos de reacção e condições do invento para sondas de ácidos nucleicos que contêm aminas, tióis e os seus respectivos conjugados.

c) Purficação da sonda marcada.

i Um processo de duas etapas é, habitualmente, mais eficiente. Em primeiro lugar, a maior parte do marcador deve ser removida usando um método simples e rápido. Exemplos disto incluem, masnão são limitados â precipitação; ligação do marcador livre a hidroxiapatite, Bio-Beads SM-2, Sep-pak ou outros suportes sólidos aos quais se liga o marcador livre mas não a sonda marcada ou vice-versa; filtração em gel rápida; extracção do marcador livre para uma fase

orgânica; filtração (como por exemplo Centricon); cromatografia de permuta iónica rápida (incluindo HPLC), ou cromatografia de fase reversa rápida (incluindo HPLC). De seguida, a sonda marcada deve ser separada do marcador livre restante, incluindo o éster de acridinio que não está ligado covalentemente à sonda, até um grau de pureza alto e, da sonda não marcada. Aqui, as alternativas são muito mais limitadas. 0 processo mais rápido e eficiente é HPLC incluindo, mas não limitado a HPLC de permuta iónica, fase reversa e hidroxiapatite. Outro processo que achamos adequado, embora não tão bom como HPLC e mais enfastiante e lento, é a filtração em gel num solvente orgânico, geralmente usando Biogel P-100 ou P-200 em formamida.

A purificação também pode ser conseguida numa só etapa usando HPLC e filtração em gel num solvente orgânico se as quantidades a purificar forem suficientemente pequenas. Este processo de uma só etapa é, geralmente, não tão eficiente como o processo de duas etapas descrito acima .

19Marcação e purificação com precipitação com etanol, seguida cfe HPLC de permuta iónica de diversas sondas com braços de ligação aminados.

A. Sintese e purificação de sondas com braços de ligação aminados :

EXEMPLOS DE TRABALHO

Exemplo 1

Com o objectivo de demonstrar a aplicação bem sucedida dos métodos e processo aqui descritos para diversos sondas de desoxioligonucleotidos com diversas reacçóes dos braços de ligação aminados, foi construída a seguinte sonda de braços de ligação aminados.

•

1. Sondas de braços de ligação aminados em 5 ' .

Para se unir um braço de ligação aminado em 5¹ a uma sonda foram utilizados duas abordagens. Uma delas envolve o uso do reagente comercial Aminolink de Applied Biosystems Inc. . A outra envolve a utilização do seguinte composto:

cf₃co-nh-ch ₂”(^ch2)4-CH₂-⁰-P-N

OCH (1)

Este composto será a partir daqui referido como oreagente do braço de ligação com amina terminal. Este reagente foi sintetizado da seguinte forma: 6-amino hexonol fez-se reagir com S-etiltrifluorotioacetato em etilace-20tato anidro. O produto da reacção foi precipitado em éter de petróleo, tratado com piridina a 10% numa mistura aquosa durante 10 minutos para hidrolizar todo o O-trifluoroacetilo que se tenha formado e, evaporado até ficar seco-na forma de goma. Este composto foi de seguida fosfitilado de acordo com protocolos padrão conhecidos da literatura (ver Nucleic Acids Research, 12 (11), 4539 (1984) de modo a se obter o composto desejado, nomeadamente o reagente do braço de ligação com amina terminal (1).

As sondas que contêm o braço de ligação aminado em 5' (quer Aminolink quer o braço de ligação com amina terminal) foram sintetizadas como segue. Utilizando um sintetizador de DNA Modelo 380A de Applied Biosystems, Inc., as sondas com a sequência de nucleotidos desejada foram produzidas usando reacções padrão com fosforamidite e construindo as ditas sondas da extremidade 3' até à extremidade 5'. Quando a sequência desejada é completada, o braço de ligação aminado é automaticamente unido ao grupo 5'-hidroxil da sonda utilizando quer o reagente do braço de ligação com amina terminal do mesmo modo que um nucleotido de fosforamidite seria unido, quer Aminolink utilizando o processo indicado pelo fabricante. Usando protocolos padrão, a sonda é separada do suporte sólido e desprotegida utilizando NH^OH e purificada por electroforese através de umφΐ de pdiacrilamida seguida de cromatografia em Sephadex G-25.

As sondas seguintes foram sintetizadas e purificadas usando este processo:

O

II

5¹-NH„-(CH_Ox,-O-P-O-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3'

2)6

ΟΟ

II em que NH^(CH^)θ-0-Ρ-Ο- representa o braço de ligação aminado

Óe

-215'-NH_O-(CH„)„-0-P-0-GCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACAT-3' Z Z Z |

0em que NHg-(CHg)g-O-P-O- representa o Aminolink 02. Sondas com braços de ligação aminados internos.

Para incorporar um braço de ligação aminado na parte interna de uma sonda, foi usado o reagente de braço de ligação aminado interno dos tipos 1 ou 2 como descrito na U.S. Patent App. Ser. NP 099050 intitulada Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes publicada a 21 de Setembro de 1987 por Arnold et al. Mais uma vez as sondas foram sintetizadas utilizando reacções padrão com fosforamidite e purificados usando electroforese através de um gel de poliacrilamida e cromatografia em Sephadex G25.

Foram sintetizadas as seguintes sondas usando este processo:

1.) Um 30 mer complementar à subunidade 16S de rRNA de E. coli, com um braço de ligação com amina terminal de tipo 1, substituindo o resíduo de adenina na posição 18 da sequência:

Substituída por um braço de ligação com amina interna de tipo 1

5'-CCA CTG CTG CCT CCC GTA GGA GTC TGG GCC-3¹

Desta forma também foram sintetizadas sondas em que o braço de ligação interno de tipo 1, substitui residuos de timidina , citidina ou guanosina.

2.) Um 33 mer complementar à subunidade 16S de rRNA de Chlamydia trachometis, com um braço de ligação com amina interna, de tipo 1, substitui um resíduo de adenina na posição 21 da sequência:

Substituída por um braço de ligação com amina interna de tipo 1

5'-CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG-3', ou inserida entre os resíduos 21 e 22, um braço de ligação com amina interna de tipo 1 ou tipo 2 inserido aqui

5'-CGT TAC TCG GAT GCC CAA ATA TCG CCA CAT TCG-3¹

3.) Um 24 mer complementar à subunidade 23S do rRNA de Chlamydia trachometis, com um braço de ligação interno, do tipo L7, inserido entre os resíduos 15 e 16, um braço de ligação interno, do tipo L7, inserido aqui CTC CTA TCG TTC CAT AGT CAC CCT

B. Marcação de sondas com braços de ligação aminados com o ester NHS de ester de acridinio e subsequente purificação.

Uma solução mãe 25 mM de éster NHS de ester de acridinio foi preparada em DMSO destilado. A quantidade desejada da sonda (ver uma lista de diferentes sondas marcadas na secção A acima) foi evaporado até à secura num tubo de 1,5 ml cénico de poliprolino. Foi feita a seguinte mistura por adição dos ingredientes seguintes na ordem indicada:

microlitros de HjO microlitro de HEPES IM (pH 8,0) microlitros de DMSO (destilado) microlitros de éster NHS de éster de acridinio 25 mM em DMSO (destilado ).

A mistura foi agitada num Vortêx, centrifugada numa microcentrifuga durante 2 segundos (para levar o conteúdo para o fundo do tubo) e incubada a 37°C durante 20 minutos. Foram então adicionados os componentes seguintes à mistura de reacção pela ordem indicada:

3,0 microlitros de ester NHS de ester de acridinio em DMSO (destilado).

1;5 microlitros H₂O

0,5 microlitros de HEPES IM (pH 8,0)

A mistura foi mais uma vez agitada num Vortêx, centrifugada e incubada a 37°C durante mais 20 mi nutos. O marcador que não reagiu foi extinto usando lisina em excesso (5 vezes mais), através da adição de 5 microlitros de lisina 0,125M em 0,lM HEPES (pH 8,0), 50% DMSO e incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente.

A sonda marcada com ester de acridinio foi então purificada usando os métodos seguintes. Para remover a maior parte do marcador que não reagiu, precipitou-se a sonda com etanol do seguinte modo: a 20 microlitros da mistura de reacção extinta foram adicionados 30 microlitros de NaOAc 3M (pH 5,0), 245 microlitros de H₂O e 5 microlitros de glicogêneo o qual serve de suporte (o glicogêneo foi pre-tratado de forma a ser removida toda a actividade nucleasica). A amostra foi agitada brevemente um vortêx e adicionaram-se 640 microlitros de EtOH absoluto. A amostra foi agita da brevemente num vortêx e incubado em gelo durante 5 a 10 mi

-24nutos após o que foi centrifugada durante 5 minutos a 15000 rpm numa microcentrifuga. 0 sobrenadante foi removido com cuidado e o rendimento redissolvido em 20 microlitros de NaOAc O,1M (pH 5,0), 0,1% SDS. A sonda marcada com AE foi então separada do marcador livre restante, da sonda não marcada e dos produtos de degradação da sonda marcada com AE com o auxilio de dois sistemas de HPLC descritos abaixo:

HPLC de permuta iónica sedimento redissolvido em 20 microlitros foi injectado numa coluna Nucleogen-DEAE 60-7 de HPLC de permuta iónica montada num sistema de HPLC. IBM9533. Todos os tampões foram feitos com água de grau HPLC, acetonitrilo (CH^CN) e acetato de sódio (NaOAc) de Fisher Scientific, ácido acético glacial de grau reagente (HOAC) e LiCl. Todos os tampões foram filtrados através de filtros de Nylon-66 com poros de 0,45 micromoles antes de ser usados. A eluição foi levada a cabo com um gradiente linear de 55% do tampão A,

45% do tampão B até 30% do tampão A, 70% do tampão B durante 25 minutos à razão de 0,5 ml/min. A absorbância a 260 nm foi controlada durante a cromatografia; o limite do campo foi igual a 1 unidade de densidade óptica; a velocidade de movimento do papel foi de 20 cm/hr. Foram colhidas fracções de 0,5 ml em tubos Eppendorf de 1,5 ml. Os resultados estão representados na Fig. 4A (neste caso a sonda usada foi a descrita na secção A acima e continha um braço de ligação de amina terminal e a dimensão era de 26 mer; todas as outras sondas deram perfis muito similares). Imediatamente após a cromatografia, foram adicionados 5 microlitros de SDS a 10% a cada tubo seguido de agitação em vortex de cada um (isto foi feito para assegurar que a sonda marcada com éster de acridinio não se cole às paredes do tubo). Uma aliquota de 0,5 microlitros foi retirado das fracções 21 a 42 e adicionada a 200 microlitros de água em tubos de 12x75 mm (foi utilizada uma ponta de micropipeta diferente em cada aliquota para evitar problemas de acumulação. A quemiluminescência de cada ali

A A

>s quota foi determinada num Berthold Cliniluniat usando a injecção automática e sequência de leitura seguintes: injecção de 200 microlitros de 0,25N HNO^ , 0,1% Η₂Ο₂; 1 segundo de espera; injecção de 200 microlitros de IN NaOH; leitura do rendimento de quemiluminescência durante 10 segundos.

As fracções 64 a 68 foram então precipitadas com EtOH do modo seguinte: adição de 5 microlitros de glicogeneo, agitação em vortex, adição de Iml de EtOH, agitação em vortex, incubação de 5 a 10 minutos em gelo e centrifugação durante 5 minutos a 15000 rpm ruma microcentrifuga. Cada sobrenadante foi cuidadosamente retirado, o sedimento foi redissolvido em 20 microlitros de NaOAc 0,lM pH 5, 0,1% SDS e as fracções foram reunidas.

HPLC de fase reversa

A sonda marcada com éster de acridinio foi também purificada na generalidade como descrito acima com as seguintes excepções: uma coluna Vydal C4 de fase reversa foi usada; o tampão A foi acetato de trietilamónia 0,lM (Applied Biosystems, Inc., Porter City, CA) e o tampão B foi CH^CN; a sonda marcada foi eluida usando um gradiente linear de 10 a 15%, do solvente B em 25 minutos á razão de 1 ml/min; a absorbância foi controlada a 260 nm; fracções de 0,5 ml foram colhidas. O pico de quemiluminescência principal foi então identificado e tratado como descrito acima (exceptuando que 45 microlitros de NaOAc 3M foram também adicionados a cada fracção antes da precipitação com EtOH). A Fig. 48 das representações mostra o pefil de eluição da sonda de 24 mer (braço de ligação interno de tipo L7) descrita na secção A, acima; todas as outras sondas deram perfis de eluição muito semelhantes .

Utilizando ambos os processos, foram obtidas sondas marcadas com éster de acridinio altamente puras, com resultados no essencial equivalentes para todas as

reacções de braços de ligação referidos aqui. A actividade especifica de tais sondas foi tipicamente de 5-10x10' contagens de luz quemiluminescente (Beethold Clinilumat) por picomole de sonda. A Figura 5 das representações mostra a sensibilidade com que tais sondas podem ser detectadas uma vez purificadas .

C. Marcação de sonda de braço de ligação aminado com o derivado metoxiimidato do ester de acridinio e subsequente purificação.

processo foi no geral o mesmo do descrito na Secção B com as diferenças seguintes: a sonda seca foi redissolvida em 50 microlitros de NaCOg 0,5M, pH9 mais 25 microlitros de dimetilformamida. De seguida, foram adicio nados 0,2 mg de éster do metoxiimina de acridinio (MI-AE), a mistura foi agitada em vórtex e deixada 30' à temperatura ambiente para que se desse a reacção. Foram adicionados mais 0,2 mg de MI-AE e a reacção continuou durante mais 30 minutos à temperatura ambiente. O marcador que não reagiu foi extinto com 100 microlitros de lisina 50 mM em NaHCO^ 0.5M, pH9 (10 minutos de incubação à temperatura ambiente).

A sonda marcada com ester de acridinio foi então precipitada com etanol como descrito na Secção A, exceptuando que foram usados 40 microlitros de NaOAc 3M (pH 5,0), 105 microlitros de H₂O e 750 microlitros de etanol absoluto. A sonda foi então purificada usando HPLC de permuta iónica como descrito na Secção B.

Exemplo 2Detecção de uma sequência de nucleotidos alvo em diluição em série, num meio clinico usando uma sonda marcada com ester de acridinio.

A sonda marcada internamente com éster de acridinio (33 mer, braço de ligação interno de tipo 1, substituição de adenosina; ver exemplo 1) foi hibridado com rRNA alvo (neste caso, de Chlamydia trachomatis) segundo o processo seguinte:

Mistura de hibridação microlitros de um esfregaço de garganta em lauril sulfato de litio a 3%, tampão fosfato 30 mM (PB) pH 6,8, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM.

-3 -7 microlitro de rRNA (10 ,10

10^-1 ou 0,33 microgramas).

microlitro de sonda (0,33 pmol) microlitros 4.8M PB, pH 4,7.

A mistura controle foi igual à de hibridação exceptuando que continha agua no lugar de rRNA. As misturas foram incubadas durante 60 minutos a 60 graus Celsius. 0 hibrido foi então separado da sonda não hibridada usando hidroxiapatite (HAP) como segue: a cada mistura de hibridação e controle foram adicionados 150 microlitros de 0.14M PB pH 6,8, contendo 2% HAP. Cada mistura resultante foi agitada em vortex durante 5 segundos, incubada durante 5 minutos a 60 graus Celsius, agitada em vortex durante 20 segundos e centrifugada durante 30 segundos a 15000 rpm numa microcentrifuga. 0 sobrenadante foi rejeitado, 150 microlitros de PB 0,14M pH 6,8 foram adicionados ao sedimento de HAP a mistura foi agitada em vortex durante 10 segundos e centrifugada durante 30 segundos a 15000 rpm numa microcentrifuga.

O sobrenadante foi rejeitado e este processo de lavagem foi

-28repetido mais duas vezes exactamente do mesmo modo. O sedimento de HAP restante foi resuspenso em 150 microlitros de PB 0,14M pH 6,8 e a quemiluminescência lida directamente, exactamente como descrito no Exemplo 1.

RESULTADOS:

Controle (sem rRNA) _3 microgramas de rRNA _2 microgramas de rRNA 10¹ microgramas de rRNA 0,33 microgramas de rRNA

Sinal S:B

18	-
27	1,5
117	6 .5
933	52
2 756	153

Os resultados representam a média de dois valores. Os sinais são dados em milhares de unidades relativas de luz (riu). O sinal controle representa aproximadamente 0,1% da riu fornecida. O S:B é a relação entre o sinal e o fundo, isto é, a quemiluminescência a uma concentração particular de rRNA dividida pela quemiluminescência do fundo.

Estes dados demonstram que sondas marcadas com éster de acridinio e purificadas do modo aqui descrito podem ser subsequentemente usadas para detectar com sensibilidade e especificamente sequências alvo de polinucleo tidos.

Claims

REIVINDICAÇÕES lã. - Método para a marcação de uma sonda de ácido nucleico tendo uma primeira porção de conjugação, com um reagente marcador éster de acridinio tendo uma segunda porção de conjugação, caracterizado por incluir o passo de combinação do referido reagente marcador e da referida sonda de ácido nucleico de modo a conseguir-se uma concentração de reagente marcador de aproximadamente 0,1-50 mM, a fim de se obter sondas de ácido nucleico, marcadas com éster de acridinio, com elevado rendimento.

2ã. - Método de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por o passo ser efectuado na gama de pH de 7-9.

3ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o passo ser efectuado na gama de temperaturas de 15-40 graus celsius.

4ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3, caracterizado por o passo ser efectuado em solução.

5ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3. caracterizado por o passo ser efectuado com a referida sonda de ácido nucleico em solução e por o referido reagente marcador ser suspenso na solução.

6ã. - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou 3, caracterizado por o passo ser efectuado com o referido reagente marcador em solução e por a referida

-30sonda de ácido nucleico ser suspensa na solução.

7ã. - Método para a marcação de uma sonda de ácido nucleico tendo uma primeira porção de conjugação, com um reagente marcador éster de acridinio tendo uma segunda porção de conjugação, caracterizado por incluir o passo de combinação do referido reagente marcador e da referida sonda de ácido nucleico de tal modo que se consiga uma concentração de reagente marcador de aproximadamente 0,1-50 mM e uma concentração de solvente orgânico de aproximadamente 20% a 80% em volume a fim de se obter sondas de ácido nucleico, marcadas com éster de acridinio com elevado rendimen to.

8ã. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o passo ser efectuado na gama de pH de 7-9.

9ã. - Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o passo ser efectuado numa gama de temperaturas de 15-40 graus Celsius.

lOâ. - Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8 ou 9, caracterizado por o passo ser efectuado em solução.

llã. - Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8 ou 9, caracterizado por o passo ser efectuado com a referida sonda de ácido nucleico e m solução e por o referido reagente marcador ser suspenso na solução.

12©. - Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8 ou 9. caracterizado por o passo ser efectuado com o referido reagente marcador em solução e por a referida sonda de ácido nucleico ser suspensa na solução.

13©. - Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o referido solvente orgânico ser seleccionado a partir do grupo que consiste em DMSO, CH^CN, dimetil-formamida, dioxano, acetona e metanol.

14©. - Método para a marcação de sondas de ácido nucleico tendo uma primeira porção de conjugação, com um reagente marcador éster de acridinio tendo uma segunda porção de conjugação, caracterizado por incluir os passos de:

combinação do referido reagente marcador, numa concentração de aproximadamente 0,1-50 mM, com um solvente orgânico numa concentração de aproximadamente 20% a 80% em volume a fim de obter sondas de ácido nucleico, marcadas com éster de acridinio, com elevado rendimento; e eliminação do reagente marcador que não reagiu.

15©. - Método para a marcação de sondas de ácido nucleico tendo uma primeira porção de conjugação com um reagente marcador éster de acridinio tendo uma segunda porção de conjugação, caracterizado por incluir os passos de:

combinação do referido reagente marcador numa concentração de aproximadamente 0,1-50 mM com um solvente orgânico numa concentração de 20% a 80% em volume, a fim de obter sondas de ácido nucleico, marcadas com éster de acridinio, com elevado rendimento, em que as referidas primeira e segunda porções de conjugação são seleccionadas, a partir do grupo de pares que consiste em:

na gama de pH de 7-9;

na gama de pH de 8-10;

na gama de pH de 7-9;

na gama de pH de 7-9;

na gama de pH de 7-9;

na gama de pH de 7-9;

na gama de pH de 6-8;

ύ

Sr&lg-T— na gama de pH de 6-8;

.X es-s^

VOna^-gama de pH de 6-9;

na gama de pH de 5-9.

16^. _ Método para a marcação de sondas de ácido nucleico. tendo uma primeira porção de conjugação com um reagente marcador éster de N-hidroxi-succinimido-acridinio. caracterizado por incluir um passo de combinação do referido reagente marcador numa concentração de aproximadamente 1-10 mM com um solvente orgânico numa concentração de aproximadamente 20% a 80% em volume, de modo a obter sondas de ácido nucleico marcadas com éster acridinio com elevado rendimento.

17ã. - Método para a marcação de sondas de ácido nucleico, tendo uma primeira porção de conjugação com um reagente marcador de éster acridinio-metoxi-imidato, caracterizado por compreender o passo de combiação do referido agente marcador numa concentração de aproximadamente 1-34- mM com um solvente orgânico numa concentração de aproximadamente 20% a 80%, em volume, de modo a obter sondas de ácido nucleico marcadas com éster acridinio com elevado rendimento.

18â. - Método para a separação da sonda marcada com éster de acridinio da sonda não marcada e da marca de éster de acridinio livre, até um grau elevado de pureza, caracterizado por compreender;

ligação da referida sonda marcada a uma coluna de HPLC seleccionada a partir de grupo que consiste em permuta iónica, fase reversa e hidroxi-apatite, num primeiro tampão;

contacto da referida coluna de HPLC com um segundo tampão ou um gradiente do referido primeiro tampão e do referido segundo tampão, de modo a efectuar eluição diferencial da sonda marcada da sonda não marcada e de marca de éster de acridinio livre.

19â. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida coluna ser de permuta iónica e o referido primeiro tampão ser NaOAc 20 mM, pH 5,5, CH^CN a 20%, e o referido segundo tampão ser NaOAc 20 mM pH 5,5, CH₃CN a 20%, LiCl IM.

20^. - Método de acordo com a reivindicação 18 , caracterizado por a referida coluna ser de permuta iónica e o referido gradiente ir desde um primeiro tampão que consiste em NaOAc 20 mM, pH 5,5, CH₃CN a 20%, LiCl 0,45 M a um segundo tampão que consiste em NaOAc 20 mM, pH 5,5 CH₃CN a 20%, LiCl 0,7M.

21ã, - Método de acordo com a reivindicação 18 , caracterizado por a ref sida coluna ser de fase reversa e o referido primeiro tampão ser acetato de tri-etil-35- amónio Ο,ΙΜ, pH 7,0 e o referido segundo tampão ser CH^CN.

22^a. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a referida coluna ser de fase reversa e o referido gradiente ir desde um primeiro tampão que consiste em acetato detri-etilamónio O,1M pH 7,0, CH^CN a 10% até um segundo tampão que consiste em acetato de tri-etilamónio 0,lM, pH 7.0, CH^CN a 50%.

23â. - Método para a preparação da sonda marcada com éster de acridinio da sonda não marcada e da marca de éster de acridinio livre, até um grau elevado de pureza, caracterizado por compreender:

remoção da maior parte da referida marca de éster de acridinio livre da sonda marcada usando um meio de separação rápida ;

remoção de substâncialmente toda a marca de éster de acridinio livre gue permanece na sonda e separação da sonda marcada da sonda não marcada, usando HPLC seleccionada a partir do grupo que consiste em permuta iónica, fase reversa ou hidroxi-apatite.

24^a. - Método de acordo com a reivindicação 23 , caracterizado por o referido meio de sçaração rá pida ser seleccionado a partir do grupo que consiste em:

(1) precipitação do ácido nucleico;
(2) ligação da marca livre a hidroxi-apatite, Bio-Beads SM2, Sep-pak ou a um suporte sólido ao qual a marca se liga e a sonda da marcada livre não. ou ao qual a sonda marcada se li ga e a marca livre não;
(3) filtração rápida em gel;
(4) extracção da marca de éster de acridinio livre numa fase orgânica;
(5) filtração;
(6) cromatografia rápida de permuta iónica;
(7) HPLC de permuta iónica; e (8) HPLC de fasereversa.

251. - Método de acordo com a reivindicação 23 , caracterizado por o referido meio da separação rápida ser precipitação em etanol e por a referida HPLC ser de permuta iónica e a referida remoção e separação ser alcançada usando um gradiente que vai desde um primeiro tampão que consiste em NaOAc 20 mM, pH 5,5, CH^CN a 20%, LiCl 0.45M até um segundo tampão que consiste em NaOAc 20 mM, pH 5,5, CH₃CN a 20% LiCl 0,7M.

261. - Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o referido meio de separação rápida ser precipitado em etanol e por a referida HPLC ser se fase reversa e por a referida remoção e separação ser alcançada usando um gradiente que vai desde um primeiro tampão que consiste em acetato de tri-etilamónio O,1M, pH 7,0, CH₃CN

I

-37a 10% até um segundo tampão que consiste'èm acetato de tri -etilaménio 0,lM, pH 7,0, CH₃CN a 50%.