PT87133B

PT87133B - Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif

Info

Publication number: PT87133B
Application number: PT87133A
Authority: PT
Inventors: David Paul Gearing; Nicholas Martin Gough; Edouard Collins Nice; Douglas James Hilton; Julie Ann King; Donald Metcalf; Nicos Anthony Nicola; Richard John Simpson; Tracy Ann Willson
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1992-07-31
Also published as: JP2721123B2; KR890700610A; ES2061643T3; NO885339L; DK174970B1; FI113372B; HK33695A; FI894613L; DE3888379T2; NO885339D0; PT87133A; US5443825A; IL85961A; US6261548B1; NO178265B; NO178265C; US5187077A; EP0285448B1; JPH07138292A; DE3888379D1

Description

MEMORIA descritiva

Campo da invenção presente invento refere-se a um método para a produção do factor inibidor da leucémia (LIF) numa forma substancialmejn te pura, e à clonação e expressão de LIF recombinante.

Antecedentes da Invenção

As células sanguíneas maduras são produzidas pela proliferação clonal e diferenciação concomitante de células precursoras, imaturas, (Metcalf, D. (1984) The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, Elsevier, Amsterdam.). Para as células he mopoiéticas, os dois processos de proliferação e diferenciação estão intimamente associados por forma a que as células maduras com um tempo de vida curto sejam continuamente substituídas. Tem-se verificado, in vitro, a existência de pelo menos quatro factores, bioquimicamente distintos, os factores estimulantes de colónias (CSF's), que estimulam a proliferação e a diferenciação de células precursoras de granulocitos e macrófagos: G-CSF, M-CSF, GM-CSF e o Multi-CSF (IL-3) (ver Metcalf, D. (1987), Proc. R. Soc. B. 230, 389-423).

Em contraste com as células normais, as células mieloides leucémicas são caracterizadas por uma não associação da prolife ração e da diferenciação, de tal modo que as células progenito ras imaturas se acumulam, mantêm a sua capacidade proliferativa e não se conseguem diferenciar. Tem havido uma controvérsia considerável em relação à natureza dos factores biológicos que são capazes de induzir a diferenciação de células mielóides leu, cémicas, in vitro, e sobre se certos factores são ou não capazes de induzir a diferenciação, na ausência de proliferação. Tem sido mesmo proposto que a proliferação e a diferenciação são necessariamente mediadas por factores diferentes (Sachs, L. (1982), J. Cell Physiol. Suppl., 1, 151-164). Por um lado, dois grupos têm descrito e purificado uma actividade (MGI-2 ou factor D) capaz de induzir a diferenciação da linha de células mieloides leucémicas murinas, Ml, que não estimula a prolifera ção de células progenitoras normais (Lipton, J. H. e Sachs, L.

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(1981), Biochem. Bipphys. Acta. 673, 552-569; Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., e Hozumi, M. (1984) 3. Biol. Chem. 259, 10978-10982). Por outro ladP, ps presentes inventores mostraram anteriormente que um dos CSF’s, o G-CSF, è um forte estímu lo indutor de diferenciação da linha de células mieloides leucémicas murinas, WEHI-3B D⁺, bem como é um estímulo da prolife ração e da diferenciação de células normais (Nicola, N.A., Metcalf, D., Matsumoto, M e Oohnson, G.R. (1983), 3. Biol. Chem. 258, 9017-9023). Além disso, Tomida, et al., (Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M., Okabe, T, e Takaka, F. (1986), FEB5 Lett., 207, 271-275) têm mostrado que o G-CSF recombinante é também capaz de induzir a diferenciação de macrófagos de células Ml. 0 relacionamento entre estes factores tem sido um assunto em debate. A situação complicou-se ainda pelo facto de se ter verificado que o factor de necrose de tumor, o( (TNF<\), é capaz de estimular a diferenciação da linha de células mieloblásticas, humanas, ML-1, (Takeda, K., Iu/amoto, S., Sugimoto, H., Takuma, T., Kawatani, N., Noda, M., Masaki, A., Morise, H., Arimura, H. e Konno, K. (1986) Nature 323, 338-340).

Numa tentativa de resolver as discrepâncias verificadas entre os resultados obtidos por estes grupos, os presentes inventores fraccionaram bioquimicamente o meio condicionado por células tumorais de ascite Krebs II, usadas em vários estudos anteriores, e verificaram que ele não só contém G-CSF e GM-CSF, autênticos, activos em células progenitoras normais, bem como em células WEHI-3B D⁺, mas também contêm dois factores, bioqui micamente distintos mas funcionalmente similares, capazes de induzir a diferenciação de células Ml. Estes últimos factores têm sido designados por factor inibidor da leucémia LIF-A e LIF-B, em virtude da sua capacidade em suprimir a proliferação, in vitro, de células leucémicas Ml e têm-se verificado que não induzem a diferenciação de células WEHI-3B D e que não estimu lam a proliferação de células progenitoras normais de granulócitos/macrófagos.

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Sumário da Invenção

De acordo com o presente invento, o LIF é definido como sendo uma molécula que tem as duas propriedades seguintes:

(1) tem a capacidade de suprimir a proliferação de células mieloides leucémicas tais como as células Ml com a diferenciação associada das células leucémicasj e (2) competirá com uma molécula tendo as sequências aqui definidas do LIF murino ou do LIF humano, para ligação a receptores celulares específicos em células Ml ou em macrófagos murinos ou humanos. 0 LIF tem o potencial de ser utilizado como agente não-proliferatiuo terapêutico para supressão de algumas formas de leucémia mielóide, bem como, como um reagente para modificação da função dos macrófagos e de outras respostas a infecçães e para testes clínicos e estudos de pesquisa relacionados com estes.

termo polipéptido possuindo actividade de LIF” tal co mo é aqui utilizado designa um polipéptido ou um glicopolipépti do com as propriedades de LIF, como anteriormente definidas, incluindo, mas não se restringindo a, polipéptidos com uma sequência de aminoácidos que é completa ou parcialmente homóloga à sequência de aminoácidos quer do LIF murino quer do LIF huma no, tal como aqui se descreve. Este termo inclui, também, os polipéptidos que são completa ou parcialmente homólogos a uma porção apenas da sequência de aminoácidos do LIF murino ou humano desde que o polipéptido tenha as propriedades do LIF como definidas anteriormente. Este termo inclui também polipéptidos ou glicopolipéptidos produzidos por expressão numa célula hospedeira, que são inactivos quando expressos, mas que são processados pela célula hospedeira de forma a darem moléculas activas, bem como a polipéptidos ou glicopolipéptidos que são inactivos quando expressos mas que são selectivamente cliváveis in vitro ou in vivo de forma a darem moléculas activas.

LIF murino é uma molécula com as seguintes propriedades biológicas:

(a) indução de diferenciação de macrófagos em células da linha de células mielóides leucémicas murinas Ml, com perda da capacidade de proliferação e morte das células le_u

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-5cémias clonogénicas, uma acção que é potenciada pelo G-CSF;

(b) ligação selectiva a receptores com elevada afinidade em células Ml e em monocitos e em macrófagos murinos normais da cavidade peritoneal, baço e medula óssea, aumentando o número de receptores com a maturação ou com a activação funcional dos macrófagos, mas não com células granulocíticas, eritroides ou linfoides provenientes destes tecidos;

5 (c) a ligação específica do I-LIF a receptores com elevada afinidade não compete com o G-CSF, GM-CSF, Multi-CSF (interleucina-3), M-CSF, interleucinas 1, 2, 4 ou 6, endotoxina ou com uma variedade de outros factores de cres cimento, mas compete com o LIF não marcado;

(d) elevação pela endotoxina bacteriana no soro de ratinhos normais ou atímicos, mas não em ratinhos CJH/Hel resistentes à endotoxina;

(e) produção por vários tecidos incluindo pulmães, glândulas salivares, células peritoneais e ossos compridos;

(f) redução do tempo de sobrevivência, in vitro, das células progenitoras normais de granulócitos-macrófagos quando cultivadas na ausência de CSF;

(g) uma incapacidade em suprimir a proliferação ou em induzir a diferenciação de células mielóides murinas leucémicas, WEHI-3B D⁺ que são células mielóides murinas transformadas para leucemiagenicidade, por infecção com retrovírus expressando o GM-CSF ou o Multi-CSF, as linhas de células murinas leucémicas WEHI265 e WR19;

(h) sem capacidade para estimular a proliferação de células progenitoras normais das linhagens de granulócitos, macroVagos, eosinófilos, megacariócitos, eritróides e mastócitos, e uma incapacidade em suprimir a proliferação clonal ou em alterar a capacidade de resposta quantitati va ao estímulo por CSF’s, in vitro, de progenitores de granulócitos, macrófagos, megacariócitos, eosinófilos

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-6normais ou de células citotóxicas naturais ou a proliferação de células das linhas de células contínuas 32CD1.13 e FDCP-1;

(i) uma incapacidade em competir com os derivados iodados do factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF), na ligação a receptores celulares específicos apesar da capacidade do G-CSF de induzir a diferenciação de células mielóides leucémicas murinas Ml e WEHI-3B D⁺ e de potenciar a acção do LIF em células Ml;

(j) uma incapacidade da acção do LIF em ser inibida por anti -soros especificamente desenvolvidos contra o factor de necrose de tumores (TNF);

(k) as transcriçães para o LIF murino que estão presentes constitutivamente no citoplasma de células T LB3 e E9.D4, não são induzidas nestas células pela concavalina lectina A; e estão presentes em vários outros tipos de células ;

Têm-se verificado, também, que o LIF murino tem as seguintes propriedades:

(l) uma glicoproteína com uma única subunidade com um peso molecular de 58 000 +_ 5 000 tal como determinado por elactroforase num gradiente de 8-25% de geles de poliacrilamida contendo sulfato de dodecilo e sódio com ou sem agente redutor (2-mercaptoetanol ou ditiotreitol), e com um peso molecular de 23 000 _+ 5 000 após tratamento com a endoglicosidase, N-glicanase;

(m) um ponto isoeléctrico entre 8,6 e 9,3;

(n) a sequência de aminoácidos principal indicada nas figuras 10, 11 e 15;

(o) é codificado pela sequência de nucleótidos indicada nas Figuras 10, 11 e 15;

(p) uma actividade específica de 1-2 x 10 unidades/mg sendo 50 unidades definidas como a quantidade de LIF que, num mililitro, induz uma redução de 50% da formação de cio-

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-7nes por células mielÓides leucémicas murinas Ml);

(q) é codificado por um único gene no cromossoma murino 11 (tal como foi determinado pela análise de um painel de hibrídos de células somáticas de ovários de ratinho (hamster” chinês) ligados pelos centras de clivagem da endonuclease de restrição tal como se ilustra na Figura 19;

(r) é homólogo a uma sequência de genes humanos ligada, no ADN cromossómico, por centros de clivagem de endonuclea. ses de restrição, tal como se ilustra na Figura 27;

LIF humano é uma molécula com as seguintes propriedades biológicas do produto recombinante derivado do nativo e/ou de levadura:

(a) indução da diferenciação de macrófagos em células da linha de células da leucémia mieloide, murinas, Ml, com perda da capacidade proliferativa e morte das células clonagénicas leucémicas;

(b) sem capacidade para estimular a proliferação de células progenitoras humanas, normais das linhas dos granulocitos, macrófagos, eosinófilos e eritroides;

(c) uma capacidade, em combinação com G-CSF, em suprimir, parcialmente, a proliferação de células da linha de células leucémicas humanas U937 e, em combinação com o GM-CSF, a proliferação das linhas de células leucémicas humanas U937 e HL60;

(d) liga-se especificamente a receptores de LIF murino, em células Ml e em macrófagos murinos, e compete completa-

125 mente na ligação de I-LIF murino a essas células;

(e) liga-se a receptores celulares específicos na linha de células do hepatoma humano Hep-2G.

Verificou-se também que o LIF humano tem as seguintes proprie dades :

(f) é idêntico ao LIF murino em aproximadamente 80% dos resíduos de aminoácidos, na proteína madura;

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3470-3MS (g) a sequência de aminoácidos principal indicada nas Figuras 25, 26 e 29;

(h) é codificado por um único gene ligado no ADN cromossómico por locais de clivagem da endonuclease de restrição tal como se ilustra na Figura 27;

(i) tem como parte da sequência do seu gene, a sequência de nucleótidos indicada na Figura 25;

Num primeiro aspecto, o presente invento refere-se ao factor inibidor da leucémia (LIF), numa forma essencialmente pura. 0 presente invento também se refere a métodos para a produção de LIF essencialmente puro, particularmente para a produção de LIF murino essencialmente puro por purificação das células tumorais do líquido ascítico Krebs II, e de LIF humano essencialmente puro por purificação a partir da linha de células do carcinoma da bexiga humana, 5637 (N9. ATCC HTB 9). 0

LIF humano, essencialmente puro, pode também ser produzido por células hospedeiras, tais como células de levedura, células de mamífero e E. coli, contendo moléculas de ADN recombinante, co dificando a sequência de aminoácidos do LIF ou uma sua parte.

As referências que aqui se fazem a numa forma essencial^ mente pura designam uma forma de polipéptido ou de glicopolipéptido, no qual pelo menos 90% do polipéptido ou do glicopoli péptido aparece como uma única banda quando sujeito a electroforese num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo e sódio apropriado, sendo a referida banda coincidente com a actividade de LIF.

Num outro aspecto, o presente invento refere-se a um método para o isolamento de clones de ADN recombinante contendo as sequências de nucleótidos codificando a proteína de LIF, quer completa, quer parcialmente. 0 presente invento refere-se também a uma sequência de nucleótidos que tem a capacidade de codificar a sequência única de aminoácidos que se determinou ser característica do LIF e de, além disso, permitir a inferição da sequência de aminoácidos completa do LIF.

Ainda num outro aspecto, o presente invento visa moléculas de ADN recombinante contendo as sequências de nucleótidos

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-9anteriormente referidas, codificando o LIF (ou seus análogos substancialmente similares), quer completamente quer parcialmente, numa forma caracterizada por as referidas sequências de nucleótidos serem capazes de dirigir a síntese e a produção de LIF, quer completa quer parcialmente. Este aspecto do presente invento visa também vectores de clonação (tais como plasmídeos) e as células hospedeiras compreendendo estas moléculas de ADN recombinante, nelas inseridas. Além disso o presente invento visa também LIF sintético, quer completo quer parcial, ou aos seus análogos substancialmente similares, produzidos por expressão destas moléculas de ADN recombinante ou por síntese de peptídeos.

Descrição Detalhada da Invenção

Na presente investigação sobre o LIF, em particular com o objectivo de procurar fontes alternativas desta glicoproteína, tanto de origem murina como humana, para possibilitar a sua utilização em aplicações clínicas e noutras, purificou-se o LIF murino a partir de células tumorais do líquido ascítico Krebs II por um procedimento de purificação eficaz e sujeitou-se a uma análise parcial da sequência de aminoácidos, como primeiro passo para a produção química ou biossintética deste factor.

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Usou-se o LIF radioactivamente marcado com I num teste de competição com um receptor, para identificar as células e os tecidos de origem murina e humana, que sintetizam e produzem o LIF. Como resultado desta investigação identificou-se uma biblioteca de ADN recombinante de cópias de ADN do ARN-m de uma destas fontes e identificaram-se os clones que codificam LIF murino por hibridação com oligonucleótidos radioactivamente marcados codificando porções da sequência de aminoácidos do LIF murino previamente determinadas e sujeitaram-se os clones de ADN-c do LIF murino anteriormente referidos a uma análise da sequência de nucleótidos. Além disso, usou-se a sequência de codificação do LIF murino, clonada, como sonda de hibridação para identificar um gene humano codificando um homólogo do LIF murino e as condições de hibridação foram estabelecidas de tal modo que sob as mesmas, a referida hibridação das espécies

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-10cruzadas pode ser eficazmente realizada. Como resultado, ideri tificaram-se os clones de ADN recombinante contendo as sequências de ADN codificando o homólogo humano do LIF murino.

Como resultado desta construção das sequências de codifi cação de LIF, construiram-se moléculas de ADN recombinante que usam sequências de ADN clonadas, codificando o LIF murino ou humano, para dirigir a síntese de LIF clonalmente puro, quer completa quer parcialmente, por exemplo, em células de mamífero cultivadas, em leveduras ou em bactérias. 0 presente inveri to abrange assim o LIF substancialmente puro produzido desta forma.

Numa concretização particular o presente invento refere-se à expressão dos genes do LIF humano e murino, clonados, em células de levedura, em fibroblastos e em E. coli, e à modificação do gene clonado por forma que ele se possa assim exprimir, bem como ao estabelecimento das propriedades biológicas e bioquímicas do LIF recombinante, murino e humano.

Também nesta concretização, o presente invento refere-se a moléculas de ADN recombinante, contendo sequências de nucle.0 tidos codificando o LIF humano ou murino (ou seus análogos substancial mente similares), quer completamente, quer em parte, numa forma caracterizada por as referidas sequências de nucle.0 tidos serem capazes de dirigir a síntese e a produção de LIF humano ou murino em células de levedura, em fibroblastos ou em

E. coli, quer completa quer parcialmente. 0 presente invento descreve também vectores de clonação (tais como plasmídeos) e células de levedura compreendendo nelas inseridas estas molécu las de ADN recombinante. Além disso, a invenção abrange o LIF humano ou murino sintético, quer completo quer em parte, ou os seus homólogos substancialmente similares, produzidos pela expressão destas moléculas de ADN recombinante em células de levedura. Numa concretização do presente trabalho relacionado com o LIF, modificaram-se as sequências dos genes do LIF humano e murino e instalaram-se num vector de expressão em levedu ra, YEpsecl. Transformaram-se as células de levedura com os recombinantes resultantes e verificou-se que o meio condiciona

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-lido pelas células de levedura assim transformadas, continha um factor com propriedades biológicas análogas às dos LIF, humano e murino, nativos.

Em face do potencial do LIF para utilização no tratamento de pacientes com algumas formas de leucémia mielóide e de pacientes com certas infecções, o presente invento abrange tam bém o processo de preparação de composições farmacêuticas compreendendo o LIF, em particular LIF humano, quer completo quer em parte, produzido, por exemplo, usando sequências de ADN codificando □ LIF, clonadas, ou por síntese química, e de composições farmacêuticas de análogos do LIF, por exemplo, produzidos por síntese química ou obtidos por mutagenese das sequênci as de ADN codificando o LIF, clonadas, anteriormente referidas. As composições farmacêuticas podem também conter pelo menos um outro regulador biológico das células sanguíneas, tal como G-CSF ou o GM-CSF. Além disso a invenção descreve também reagentes de diagnóstico para utilização na detecção de rearranjos,alterações ou lesões genéticas» associadas com o gene do LIF humano, em doenças da formação das células sanguíneas, incluindo a leucémia e as doenças congénitas associadas com a susceptibilidade à infecção.

EXEMPLO 1

As Figuras anexas 1 a 5 referem-se aos vários passos do método de purificação que a seguir se descrevem, mostrando onde o LIF é recolhido em cada passo de fraccionamento e mostrajn do provas da sua pureza. Nas Figuras:

Figura 1:	refere-se	ao Passo	2	da	purificação	do	LIF	em DEAE-
-Sepharose	CL-6B. A	barra indica	as fracções	que	São	reunidas
para o Passo 3.
Figura 2:	refere-se	ao Passo	3	da	purificação	do	LIF	em lecti

na Lentil-Sepharose 4B. A barra indica as fracções que são rejj nidas para o Passo 4.

Figura 3: refere-se ao Passo 4 da purificação do LIF em CM-Sepharose CL-6B. A barra indica as fracções que são reunidas para o Passo 5,

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-12Figura 4: refere-se ao Passo 5 da purificação do LIF numa coluna de HPLC para análise de ácidos gordos. Recolhem-se as fracções de 39,6 a 41,3% de acetonitrilo.

Figura 5: mostra o peso molecular e a pureza do LIF purificado. 0 painel superior mostra a migração de padrões de proteína (peso molecular: 93 000; 67 000; 43 000, 30 000; 20 000;

e 14 000) e de LIF purificado (duas preparações) em gel SDS de poliacrilamida a 8-25%. A proteína e a actividade biológica estão, ambas, associadas a uma proteína com um peso molecular de 58 000.

Passo 1. Injectam-se intraperitonealmente células tumorais Krebs II (1 x 10^) em ratinhos C57B16/6fj/WEHI e 7 dias depois sacrificam-se os ratinhos e remove-se o fluido peritoneal. Ceri trifugam-se as células, ressuspendem-se, 5 x 10^ células/ml, em meio de Eagle modificado com Dulbecco contendo lipopolissacárido de E. coli (200 ng/ml) e incuba-se durante 24 horas a 372C num incubador humidificado contendo ar com 10% de C0₂· Centrifugam-se de novo as células, remove-se o meio condiciona do, adiciona-se 0,02% (p/v) de azida de sódio e guarda-se a 42C. Concentram-se 36 litros de meio condicionado até 100 ml usando um cartucho poroso de fibra HIP10-8 num concentrador Amicon DC2A, transfere-se para tampão Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mM, azida de sódio (0,02% p/v) e Tween 20 (0,02% v/v) e reconcentra-se até 20 ml com uma membrana YM-10 numa célula agitada Amicon.

Passo 2. Aplica-se o concentrado a uma coluna (2,5 x 30 cm) de DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão e elui-se com 200 ml de tampão de equilíbrio seguindo-se 400 ml de um gradiente linear de NaCl até 0,3 M no mesmo tampão. 0 caudal é de 25 ml/h, recolhem-se fracções de 5,8 ml e analisam-se. (l/er Fig. 1)

Passo 3. Reunem-se as fracções de proteína que não se ligaram ao gel durante o passo de pré-gradiente e que apresentavam actividade em células murinas Ml, concentram-se numa membrana YM-10, transferem-se para tampão de acetato de sódio 100 mM, pH 6,0, contendo MgCl₂ 1 mM, PMSF 1 mM, 0,2% de azida de sódio

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-13e 0,02% de Tween 20 e aplicam-se a uma coluna (1x4 cm) de lectina Lentil Sepharose 4B (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão. Elui-se a coluna com 25 ml de tampão de equilíbrio e seguindo-se 100 ml de um gradiente linear de -metil-D-manopiranósido até 0,5 M, no mesmo tampão, com um caudal de 10 ml/ /h. Recolhem-se fracções de 3 ml e analisam-se. (Ver Fig. 2)

Passo 4. Reunem-se as fracções de proteínas que se ligam ao gel, que são eluídas pelo açúcar e que apresentam actividade em células Ml, concentram-se e transferem-se para tampão de ace tato de sódio 100 mM, pH 5,0, contendo PMSF 1 mM, 0,02% de azi, da de sódio e 0,02% de Tuueen 20 e aplicam-se a uma coluna (1,0 x 4,0 cm) de CM-Sepharose CL-6B (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão. Elui-se a coluna com 25 ml de tampão de equi librio e depois com 100 ml de um gradiente linear de NaCl até 1,0 M no mesmo tampão, e depois com 25 ml de NaCl 1,0 M, ajus tada a pH 10 com NaOH. 0 caudal é de 2,0 ml/h e recolhem-se fracçães de 3,0 ml. (Ver Fig. 3)

Passo 5. Reunem-se as fracções de proteínas que se ligam ao gel, que são eluídas pelo gradiente de NaCl e que apresentam actividade em células Ml, concentram-se até 2,0 ml numa membra na YM-10 e transferem-se para tampão de acetato de amónio 20 mM, pH 5,0, contendo 0,02% de Tu/een 20 e filtram-se depois através de um filtro Millipore de 0,45 Carrega-se o volume reunido num injector de um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (Beckman) equipado com uma coluna Waters de análise de ácidos gordos e com bombas duplas com programador de gradiente. Equilibra-se a coluna em água contendo 0,1% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA), injecta-se a amostra e elui-se depois a coluna com um gradiente linear de 5 minutos até 34,8% (v/v) de acetonitrilo em água e 0,1% de TFA e elui-se depois com um gradiente linear de 50 minutos até 49,8% (v/v) de acetonitrilo em água e 0,1% de TFA. 0 caudal é de 1 ml/minuto e recolhem-se fracçães de 1 ml para tubos de polipropileno contendo 50 y^l de bicarbonato de amónio 100 mM e 0,4% de Tu/een 20. (Ver Fig. 4).

As fracções do passo 5, com actividade em células Ml con

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-14sistiam em dois picos, parcialmente sobrepostos, de absorção no ultravioleta. Cada pico estava associado a actividade em células Ml e cada pico correspondia a uma banda de proteína simples de 58 000, em geles de poliacrilamida de sulfato de do decilo e sódio usando revelação com prata. Em cada caso a bari da de proteína de 58 000 apresentava actividade biológica em células Ml tal como foi estabelecido cortando um trajecto para leio no gel (também carregado com LIF) em tiras de 1 mm, extractando a proteína das tiras de gel e testando a proteína extractada para determinar a sua capacidade em suprimir a proliferação e em induzir a diferenciação em células Ml, em cultu ras de ágar semi-sélido. (Ver Fig. 5)

EXEMPLO 2 exemplo seguinte descreve os passos usados na obtenção da sequência de aminoácidos do N-terminal e das sequências de aminoácidos dos vários péptidos gerados por clivagem proteolítica com tripsina ou com protease V8 de Staphylococcus.

Aplicou-se o LIF purificado pelo procedimento do Exemplo 1 (15 yxg) a uma coluna de pequeno diâmetro (2 mm) empacotada com pérolas de Brouinlee RP300 (CB) e eluiu-se num sistema de HPLC com um gradiente linear de 0-60% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético 0,1%. Eluiu-se a proteína como um único pico num volume de 100 yul. Aplicou-se este volume a um disco de fi bra de vidro, deixou-se secar e colocou-se depois na câmara de sequenciação, de um sequenciador de proteínas de fase gasosa Applied Biosystem (Modelo 470A). Sequenciou-se a proteína por química de Edman e identificaram-se os derivados de feniltio-hidantoína dos aminoácidos individuais por HPLC num analisador, de Applied Biosystems, 120A PTH.

Diluiu-se uma alíquota de LIF separada (20 y*g) também pjj rificada pelo procedimento anteriormente referido, até 2 ml em hidrocloreto de guanidina 6 mM, tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5 e ditiotreitol 2 mM, e incubou-se a 372C durante 2 h. Adicionou-se depois um excesso molar 30 vezes superior, de ácido iodoacético, e incubou-se a solução a 375C durante mais 15 minu^

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3470-3MS tos. Aplicou-se a solução à mesma coluna HPLC de pequeno diametro e eluiu-se como anteriormente se descreveu. Diluiu-se o derivado (200 ^cl) reduzido e carboximetilado, do LIF (RCM-LIF), eluído da coluna 3 minutos depois do LIF não tratado e do RCM-LIF, a 1 ml com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, contendo 0,02% de Tiueen 20, CaCl₂ 1 mM e 2 j^g de tripsina tratada com TPCK. Deixou-se esta solução em incubação durante 18 horas a 379C, aplicou-se de novo a mistura à coluna de pequeno diâmetro e eluiu-se da forma anteriormente descrita. Os péptidos individuais apareceram como picos de absorção no UV e foram re colhidos individualmente. Alguns destes péptidos foram sequejn ciados directamente como anteriormente se descreveu enquanto que outros foram re-purifiçados na mesma coluna, mas usando um gradiente de 0-60% de acetonitrilo em 0,9% de NaCl, pH 6,0, aji tes da sequenciação.

(2001=1 □ y^g)

7,8, contendo

Diluiu-se uma segunda alíquota de RCM-LIF até 1 ml, com tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH

EDTA 0,002 M e 0,02% de Tween 20, e digeriu-se com 2y^g de pro tease V8 de Staphylococcus aureus, durante 18 horas a 372C.

Aplicou-se a mistura reaccional à mesma coluna de pequeno diâ metro e eluiu-se como anteriormente se descreveu.

Verificou-se que os 26 aminoácidos definidores do LIF desde o terminal amino eram, em sequência:

N-Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala-Thr-X-Ala-IleA rg-His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Lys

As sequências de aminoácidos dos vários peptídeos triptjt cos eram as seguintes:

1. His-Pro-Cys-His-Gly-Asn-Leu-Met-Asn-Gln-Ile-Lys

2. Met-Ual-Ala-Tyr ...

3. Gly-Leu-Leu-Ser-Asn-Val-Leu-Cys ..

4. Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-T yr-Lys

5. Val-Leu-Asn-Pro-Thr-Ala-Val-Ser-Leu-Gln-Val-Lys

6. Asn-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-X-Gly-Ser-Ala-Asn-Ala-LeuPhe-Lau-Val-Glu-Leu-Tyr ....

7. Leu-Val-Ile-Ser-Tyr...

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8. Val-Gly-His-Val-Asp-Val-Pro-Val-Pro-Asp-His-Ser-Asp-Lys-Glu-Ala-Phe-Gln.

9. Leu-X-Ala-Thr-Ile-Asp-l/al-Met-Arg.

10. Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-X-Gln-Ala-Phe.

A sequência de aminoácidos de um peptídeo gerado por digestão do LIF com a protease V8 era a seguinte:

Ala-Phe-Gln-Arg-Lys-Lys-Leu-Gly-Cys-Gln-Leu-Leu-Gly-Thr-T yr-Lys-Gln-Val-Ile-Ser-Val-Val-Val-Gln-Ala-Phe.

EXEMPLO 3

Exemplo seguinte descreve os passos usados para obter o LIF radioactivamente marcado e para identificar as fontes de LIF por meio de um teste de competição dos receptores.

A Figura 6 anexa refere-se ao Exemplo 3: ligação do LIF puro radio-iodado (aproximadamente 2 x 10 cpm/ng) a células mielÓides da leucémia Ml, a 09C. Incubaram-se as células Ml (5 x 10°) com 'i-LIF (4 x 10^? cpm) durante 2 horas com ou sem factores de competição, após o que se separou a radioactividade ligada da radioactividade não ligada por centrifugação atra vés de soro fetal de vitelo. A,. Titulação do LIF puro, não marcado, e Multi-CSF, GM-CSF, G-CSF ou M-CSF, como factores de competição, para as diluiçães indicadas (10 pl de cada diluição adicionados para um volume final de 80 yd). As maiores concentraçães de cada um foram 10^ unidades/ml; 3,5 x 10^ uni, dades/ml; 3 x 10^ unidades/ml; 5 x 10^ unidades/ml; 4 x 10⁴unidades/ml; respectivamente. B,. Capacidade do LIF puro ou da lipopolissacárido (LPS), ou do meio concentrado (4-8 vezes), condicionado por várias células ou pelo soro de ratinhos injeç.

125 tados com endotoxina, em competir com o I-LIF na ligação a células Ml, como anteriormente.

LIF, purificado a partir de meio condicionado, de célu n c las ascíticas Krebs II, foi marcado radioactivamente com ^JI nos resíduos tirosina, tal como anteriormente se descreveu em (Nicola, N.A. e Metcalf, D., 3. Cell Physiol, 128:180-188. 1986) 125 produzindo-se I-LIF com uma radioactividade específica de

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12 5 aproximadamente 2 x 1(j cpm/ng. 0 I-LIF ligou-se especificamente a células mielóides leucémicas Ml, bem como a células da medula óssea murina de adultos, do baço, do timo e do exsuda do peritoneal. A análise autoradiográfica das células indicou 125 que o I-LIF apenas se ligou especificamente a macrofagos e às suas células precursoras, aumentando os números de receptores com a maturação das células, e não detectavelmente a nenhum outro tipo de células hemopoiéticas. Isto sugere que o LIF pos. sa ter aplicaçães clínicas úteis na modulação da função macrofa ga numa variedade de estados de doença. A ligação específica 125 do I-LIF a células mielóides leucémicas Ml ou a populaçães macrofagas peritoneais foi inibida pelo LIF não marcado, mas não por uma gama de outros factores de crescimento hemopoiético incluindo o G-CSF, GM-CSF, M-CSF (CSF-1), o Multi-CSF (intej? leucina 3), as interleucinas 1,2,4,6, a endotoxina ou outros factores de crescimento (ver, por exemplo, a Figura 6). A capacidade do meio condicionado por células ou por extractos de 125 células em inibir a ligação do I-LIF a estas populaçães de células (teste de radio-receptor para o LIF) (Figura 6B) constitui assim um teste específico para determinar a presença da produção de LIF ou o seu armazenamento por várias células e te eidos. Por exemplo, o meio condicionado por células T LB3 act^ vadas por lectina inibiu fortemente a ligação específica do 125

I-LIF a células Ml, indicando assim que as células LB3 produzem LIF.

EXEMPLO 4

Exemplo seguinte descreve os passos usados na obtenção de uma cópia de ADN clonado complementar do ARN-m que codifica o LIF murino.

As Figuras de 7 a 10 referem-se aos vários passos do méto do que a seguir se descreve. Nas Figuras:

Figura 7 refere-se ao Passo 1 da clonação dos clones do ADN-c do LIF: a acumulação dos ARN-m’s para os reguladores de crescimento hemopoiético no citoplasma de células LB3 a seguir ao estímulo com a concanavalina A de lecitina. 0 ARN citoplasmá> * 67 567

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-18tico poliadenilado (5 y^g) de células WEHI-3B D (pista 1), de células do clone LB3 de células T cultivadas com 10^ células/ /ml em 5 ^g/ml de concanavalina A durante 5 horas (pista 2) e de células LB3 não estimuladas (pista 3) foi sujeito a electro forese em geles de agarose-formaldeído, transferiu-se para nitrocelulose e sujeitou-se a uma hibridação com uma sonda

32

P-GM-CSF (painel a.) ou com uma sonda P-Multi-CSF (painel

b.) (para pormenores ver Kelso, A., Metcalf, D. e Gough, N. M.

J. Immunol. 136:1718-1725, 1986).

Figura 8 refere-se ao passo 3 da clonação dos clones de ADN-c do LIF: oligonucleótido sintético usado na identificação dos clones de LIF. Na linha superior mostra-se uma porção da sequência de aminoácidos do LIF murinD próxima do Terminal -N (resíduos 15-26, ver o Exemplo 2), na linha do meio mostram-se as combinações possíveis de sequências de ARN-m que poderiam codificar este peptídeo, e na linha inferior mostra-se a sonda de oligonucleótido complementar desta sequência de ARN-m. E de notar que para todos os resíduos aminoácidos com excepção da Cys 17 e da His 18, o oligonucleótido é complementar apenas dos codões mais frequentemente usados nas regiões de codifica ção de mamíferos (Grantham et al., Nucleic Acids Res. 9:43-77,

1981). Para o Cys 17, a sequência é complementar de ambos os codões. Para a His 18, o oligonucleótido é complementar do co dão CAU menos frequente. Considerou-se improvável a utilização do codão CAC uma vez que ele geraria, em conjunção com o codão da Gly vizinho, o dinucleótido CpG raro (Suiartz et al.,

J. 8iol. Chem. 238:1961-1967, 1962).

Figura 9 refere-se ao Passo 4 da clonação dos clones de ADN-c do LIF; a identificação dos clones de ADN-c do LIF por hibri dação com o oligonucleótido ilustrado na Figura 8.

Figura 10 refere-se ao Passo 5 da clonação dos clones de ADN-c do LIF: sequência de nucleótidos do clone de ADN-c, pLIF7.2b e a sequência de aminoácidos do LIF. A sequência da cadeia de ADN-c sinónima do ARN-m está listada de 5' a 3’ conjuntamente com a sequência de aminoácidos prevista para o LIF, descrita anteriormente, os números no final das linhas indicam a posição do resíduo final (aminoácido ou nucleótido) nessa linha. A

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-19sequência de aminoácidos está numerada consecutivamente a pa_r tir do primeiro resíduo codificado neste clone. As regiões da sequência de aminoácidos determinadas pela análise da proteína estão assinaladas com um traço; não existem quaisquer discordâncias entre as duas. 0 resíduo N-terminal determinado por análise directa da sequência de aminoácidos (Exemplo 2) foi uma Pro 9. Indicam-se com asteriscos sete locais de glico silação potenciais ligados ao N (Neuberger, A. et al. in Glycoproteins, Gottschalk, A, ed., Elsevier, Amsterdam, pp 450-490, 1972) e com ” quatro locais de glicosilação potenciais ligados ao 0 (Takahashi, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 2021-2025, 1984).

Passo 1; Preparação do ARN contendo o ARN-m do LIF

Estimularam-se células T murinas da linhagem LB3 clonadas (Kelso, A. and Metcalf, D. Exptl. Hematol. 13:7-15, 1985) com a concanavalina A de lectina, durante 6 horas, para aumentar a acumulação no citoplasma de ARN's-m codificando vários factores que regulam o crescimento e a diferenciação de células hemopoiéticas. (Kelso, A., Metcalf, D. e Gough, N. M. 0. Immunol. 136:1718-1725, 1986). (A Figura 7, por exemplo, mostra a produção aumentada de ARN's-m codificando os factores de crescimento hemopoiêtico, GM-CSF e Multi-CSF em células assim estimuladas). Preparou-se ARN citoplasmático a partir de θ x 10 células LB3 estimuladas com concanavalina A, usando uma técnica já anteriormente descrita (Gough, N.M. J. Mol. Biol. 165;683-699, 1983). Obtiveram-se moléculas de ARN-m poliadeni lado, a partir de ARN ribossómico, por dois ciclos de cromatografia em oligo-dT-celulose usando os procedimentos convencionais (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Nem York, 1982).

Verificou-se subsequentemente, por análise de manchas Northern, que, ao contrário dos ARN's-m do GM-CSF e do Multi-CSF, o ARN-m do LIF está presente constitutivamente em células LB3 e que a sua abundância não é aumentada pelo estímulo da concanavalina A (Gearing D. P. et al., EMBO 0. _6: 3995-4002, 1987).

► * 67 567

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-20Passo 2; Síntese e clonação de uma biblioteca de moléculas de fiDN-c de LB3.

Sintetizaram-se cópias de ADN de cadeia dupla do ARN-m de LB3, preparado como anteriormente se descreveu, por procedi mentos convencionais (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, Netu York, 19Θ2 e Gough, N. M. et al. Nature 309:763-767, 1984). Resumidamente, usaram-se 10 y*.g de ARN-m citoplasmático poliadenilado, de LB3, como padrão para a síntese de ADN complementar de cadeia simples (ADN-c) numa reacção catalisada por uma transcriptase inversa do avian myeloblastoses vírus e preparada com oligo-dT. Após a reacção estar completa, degradou-se o ARN-m por incubação a 652C duran te 1 hara em NaOH 0,3 M, EDTA, 1 mM. Apés neutralização da ba se e recuperação do ADN-c por precipitação com etanol, converteu-se o ADN-c de cadeia simples na forma dupla, numa reacção catalisada pelo fragmento Klenou/ da polimerase I do ADN de E. coli. A estrutura dupla helicoidal do ADN-c foi depois clivada com uma nuclease S1 específica da cadeia simples e ligaram-se depois a cada terminal do ADN-c de cadeia dupla, caudas de resíduos de desoxicitidina (com aproximadamente 20-30 resíduos de comprimento) usando a enzima terminal desoxinucleotidiltranjs ferase, tal como se descreve em (Michelson, A.M. e Orkin, S.

3. Biol. Chem. 257:14773-14782, 1982). Fraccionou-se o ADN-c com terminais dC por electroforese num gel de 1,5% de agarose, recuperaram-se as moléculas com um comprimento superior a 500 pb e adicionaram-se a uma molécula de ADN de plasmídeo (p3L3, Gough, N.M. et al., EMBO 3. 4^:645-653, 1984) que tinha sido clivada com a endonuclease de restrição Saci e à qual se tinham ligado caudas de resíduos desoxiguanosina (Nichelson, A.

M. e Orkin, 3., 3. Biol. Chem. 257:14773-14782, 1982). 3untaram-se as moléculas de ADN-c com as caudas, e as moléculas de plasmídeo, como se descreve em (Gough, N. M. et al., Biochemistry 19:2702-2710, 1980), transformou-se a E, coli MC1061 (Casadaban, M. e Cohen, S., 3. Mol. Biol. 138:179-207, 1980) com a mistura de ADN-c/plasmídeo e seleccionaram-se aproximadamente 50 000 colónias bacterianas, independentemente trans formadas, por crescimento em placas de ágar com 10 ug/ml de am

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-21picilina. Removeram-se as colónias bacterianas transformadas das placas de ágar por lavagem com meio líquido de crescimento contendo 50 yuxj/ml e armazenaram-se em 10% de glicerol a -709C, em 10 recipientes independentes.

Passo 3: Concepção das sondas de oligonucleótido

Determinaram-se (ver Exemplo 2) uma sequência de 26 aminoácidos no terminal amino do LIF e os resíduos de 11 péptidos diferentes, obtidos por digestão do LIF com tripsina e com pro. tease V8. Estas sequências de aminoácidos forneceram a base para a concepção de oligonucleótidos, complementares de certas regiães definidas do ARN-m codificando o LIF, para utilização como sondas de hibridação para identificar os clones de ADN-c correspondentes ao ARN-m do LIF.

Cada aminoácido natural está codificado no seu ARN-m correspondente por uma combinação específica de 3 trifosfatos de ribonucleósido (um codão) (ver p.e. Watson, J. Molecular Biology of the Gene, 3^. ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1976). Certos aminoácidos são especificados apenas por um codão, enquanto que outros são especificados por até 6 codães diferentes (p.e. Watson, 3. Molecular Biology of the Gene, supra). Uma vez que, deste modo, um grande número de di. ferentes combinações de sequências de nucleótidos pode de facto codificar qualquer sequência particular de aminoácidos, necessitarão de ser construídos um grande número de oligonucleótidos degenerados diferentes de forma a prever qualquer sequêri cia possível potencialmente codificando esse péptido. Existem porém certos impedimentos técnicos na utilização de oligonucleó. tidos altamente degenerados como sondas de hibridação. Contudo, uma vez que, para um dado aminoácido, nem todos os codões são utilizados com frequência equivalente (Grantham, R. et al. Nucleic Acids Res. 9j43-73, 1981) e uma vez que no genoma/rr^mí fero o dinucleótido CpG está subrepresentado, ocorrendo com apenas 20-25% da frequência esperada a partir da composição de base (Swartz, Μ. N. et al., J. Biol. Chem. 238:1961-1967, 1962) é muitas vezes possível prever a sequência de nucleótidos provável que codifica um dado péptido e assim reduzir a complexi

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-22dade de uma dada sonda de oligonucleótido. Dado as considerações anteriores, conceberam-se um certo número de oligonucleótidos correspondentes a péptidos de LIF diferentes e sintetiza ram-se pelos procedimentos convencionais.

Passo 4: Análise de uma biblioteca de ADN-c de LB3 para detex minação dos clones codificando o LIF.

Para a análise das colónias de bactérias por hibridação com sondas de oligonucleótido, cultivaram-se 10000-15000 colónias bacterianas de cada recipiente da biblioteca de ADN-c de LB3 anteriormente referida, em placas de àgar (contendo 50 jag/ /ml de ampicilina), transferiram-se para discos de filtro de nitrocelulose e amplificou-se o plasmídeo de ADN por incubação dos filtros em placas de ãgar contendo 200 y^g/ml de cloramfeni col (Hanahan, D. e Meselson, M. Gene 10:63-67, 1980). Após re -crescimento das colónias na placa original, preparou-se um s.e gundo filtro de nitrocelulose como anteriormente. Recultivou—se a placa principal uma segunda vez e armazenou-se depois a 49C. Libertou-se o plasmídeo de ADN das colónias bacterianas e fixou-se nos filtros de nitrocelulose como anteriormente se descreveu (Maniatis, T. et al. Molecular Cloninq, Cold Spring Harbor, Neui York, 1982). Antes da hibridação, incubaram-se os filtros durante várias horas a 372C em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de citrato de sódio, 0,2% de Ficoll., 0,2% de polivinilpirroli. dona, 0,2% de albumina de soro bovino, 50 yug/ml de ADN de espei* ma de salmão desnaturado com calor, 50 ^ug/ml de ARN-t de E, coli, 0,1 M de ATP e 2 mM de pirofosfato de sódio. A hibridação realizou-se na mesma solução, a 372C durante 18 horas, con tendo adicionalmente 0,1% de NP40. Marcaram-se radioactivameri te 500 ng do oligonucleótido sintético que se mostra na Figura 8, numa reacção catalisada pela quinase de polinucleótido e contendo 500 «£i de —'⁵²P__J7’ATP (actividade específica 2000* í 3*2 7

-3000 Ci/mmole). Separou-se depois ο Ζ K - P_7ATP não incorporado, do oligonucleótido radioactivamente marcado, por croma tografia de permuta iónica numa coluna NACS-PREPAC (Bethesda Research Laboratories) de acordo com as instruções do fabricajn te. Incluiu-se o oligonucleótido, radioactivamente marcado,

6Ί 567

3470-3MS

-23na reacção de hibridação numa concentração de aprox. 20 ng/ml. Após a hibridação lavaram-se os filtros extensivamente em 0,9M de NaCl, 0,09M de citrato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio, a várias temperaturas (como a seguir se descreve) e autoradiografaram-se os filtros após cada lavagem.

As razães que estão por detrás da realização de várias lavagens residem no facto de a temperaturasmais baixas todos os clones, mesmo contendo um pequeno grau de homologia com o oligonucleótido (tão pequena quanto aproximadamente 15 nucleótidos), se revelarem como manchas autoradiográficas aparecendo em filtros duplicados. A medida que a temperatura aumenta, a sonda de oligonucleótido funde-se dos clones com o mais baixo nível de homologia perdendo-se assim os sinais autoradiográficos correspondentes. Os clones com o grau de homologia mais elevado (e os clones que assim representam os melhores candidja tos para conterem as sequências de ADN-c do LIF) manterão a hi bridação à temperatura mais elevada. Por esta estratégia é as. sim possível focar directamente os clones candidatos mais fortes. Mostra-se na Figura 9 o rendimento de um conjunto de cio nes num par duplicado de filtros contendo 15000 clones de ADN-c de LB3 à medida que a temperatura de lavagem aumentou de 469C para 66QC. Vários clones mantiveram a hibridação nosoligonucleótidos apenas às temperaturas mais baixas, enquanto que vários mantiveram a hibridação, mesmo a 669C (por exemplo, os clones 1 e 2). Seleccionaram-se assim estes últimos clones pa ra análise posterior e removeram-se as colónias bacterianas correspondentes das placas principais, purificaram-se e preparou-se o plasmídeo de ADN por procedimentos convencionais (Maniatis, T. et ai. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982) a partir de cada clone bacteriano. A análise estrutural preli. minar destes clones (pelo estabelecimento da dimensão do ADN-c inserido, assinalando as localizaçães dos centros de clivagem para várias endonucleases de restrição e analisando a hibridação com vários oligonucleótidos correspondentes a vários pépti dos de LIF) indicou que cada um destes clones era de facto idêri ticoj isto é, que representavam produtos isolados diferentes da mesma clonação original. Assim, realizou-se uma análise de.

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-24talhada adicional em apenas um clone, o pLIF7.2b.

Passo 5: Determinação da sequência de nucleótidos do pLIF7.2b

A análise da sequência de nucleótidos da porção de ADN-c do clone pLIF7.2b foi realizada pelo método de terminação da cadeia de didesoxilo (Sanger, F. et al., Proc. Matl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467, 1977) usando, como padrão ADN de pias, mídeo de cadeia dupla, desnaturado sob condiçães alcalinas ou com calor, como iniciadores uma variedade de oligonucleótidos complementares tanto das regiões do vector (pJL3) flanqueando o ADNc, como das sequências da inserção de ADN-c, e usando como polimerases nas reacções de sequênciação o fragmento Klenow da polimerase I do ADN da E. coli e a transcriptase inversa do avian myeloblastosis vírus. Na Figura 10 mostra-se a sequência da porção de ADN-c do clone pLIF7.2b assim determinada. Esta análise confirmou que este clone contém de facto uma cópia de ADN de um ARN-m com a capacidade de codificar a molécula de LIF, uma vez que na única cadeia de leitura com tradução que abrange todo o ADN-c não interrompido por codões de paragem, se podiam encontrar todas as sequências de aminoácidos previamente determinadas para os vários peptídeos da molécula de LIF. Este clone não contém porém uma cópia completa da região de co dificação do LIF, uma vez que (a) não se estende no terminal 5’ a uma região codificando uma sequência líder hidrofóbica presumivelmente iniciada por um codão metionina e (b) não inclui no seu terminal 3' um codão de paragem da tradução em cadeia. Estende-se porém no seu terminal 5' para além do início da região codificando a proteína madura, determinada por comparação com a sequência de aminoácidos amino-terminal previamente determinada (resíduo Pro 9 na Figura 10).

EXEMPLO 5

Descrevem-se seguidamente os passos usados para construir uma cópia a todo o comprimento, da região de codificação do LIF murino, para instalar esta região de codificação num vector de expressão em levedura e para produzir LIF murino.

As Figuras referem-se a vários passos do método que a s_e guir se descreve. Nas Figuras:

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-25Figura 11: refere-se ao Passo 1 da expressão do LIF murino em células de levedura: sequência de aminoácidos C-terminal. Mos. tra-se a sequência de aminoácidos no terminal-C da cadeia de leitura do pLIF7.2b acima da sequência de uma protease V8 de estafilococos e de um peptídeo tríptico derivado de LIF purifi cado a partir de ascites de células de tumores de Krebs. E de notar que estes últimos peptídeos excedem a sequência LIF do pLIF7.2b em 9 aminoácidos e terminam no mesmo resíduo. Mostram-se, na linha inferior, as sequências de nucleótidos e de aminoácidos na região correspondente do clone pLIFNKl, confirmando o terminal-C atribuído por sequenciação directa dos aminoácidos, 0 sistema de numeração é o da Figura 10.

Figura 12: refere-se ao Passo 2 da expressão do LIF murino em células de levedura: reconstrução do ADN-c, pLIF7.2b para inserção no vector de expressão de levedura, YEpsecl. Mostram-se na linha superior a sequência parcial de nucleótidos do ADN-c, pLIF7.2b e a sua sequência de aminoácidos que é codificada. A numeração é a mesma que nas Figuras 10 e 11. A segun da e a terceira linha mostram, respectivamente, as sequências do pLIFmutl e pLIFmut2, Os asteriscos indicam os codões de paragem. Indicam-se os centros de restrição (Bam Hl, Hind III e Eco Rl) usados para clonação no YEpsecl (Baldari. C. et al,, EMBO 3. 6: 229-234, 1987) e no pGEX-2T (Smith, D. B. e Oohnson,

K.G., Gene, a imprimir, 1988). A linha inferior mostra uma s.e quência parcial da sequência de sinal da toxina killer da

K. lactis no YEpsecl. A sequência Gly-Ser codificada no centro de restrição Bam Hl é eficazmente reconhecida pela peptida se de sinal (Baldari, C. et al., EMBO, 3.. 6.: 229-234, 1987).

Figura 13: refere-se ao Passo 4 da expressão do LIF murino em células de levedura: a actividade biológica do LIF recombinant te, derivado de levedura, em culturas de células leucémicas Ml. Titulação em culturas Ml de LIF recombinante derivado de levedura (—·—) versus LIF-A original purificado ( — —) mostrari do uma dependência da concentração similar na indução da diferenciação em colónias Ml (painel A) e na supressão da formação de colónias (painel B). Cada ponto representa o valor médio de culturas em duplicado.

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-26Figura 14: refere-se ao Passo 5 da expressão do LIF murino em células de levedura: a capacidade de diferentes diluições de LIF-A murino original autêntico (—o—), de meio condiciona do de células de levedura contendo o LIFmutl/YEpsecl recombinante, induzido com galactose (—·—), e de meio condicionado das mesmas células de levedura mas não induzido com galactose (—+—), em competir na ligação de I-LIF-A a receptores celulares em células peritoneais murinas.

Passo 1; Determinação da sequência de aminoácidos no terminal-C do LIF murino clone de ADN-c do Exemplo 4, o pLIF7.2b, contém uma cópia incompleta do ARN-m do LIF murino. No terminal 5', o ADN-c codifica 8 resíduos desde o terminal N até ao primeiro resíduo determinado por análise da sequência de aminoácidos N-terminal (Pro 9 na Figura 10). No terminal 3’ porém, o pLIF7.2b está incompleto pois não contém em cadeia um codão de paragem da tradução. A inspecção da sequência de aminoácidos de dois peptídeos de LIF determinada por sequenciação directa dos aminoácidos (Exemplo 2) sugeriu que ao pLIF7.2b faltavam apenas 27 nucleótidos da região de codificação no terminal 3'. Como se ilustra na Figura 11, iniciou-se um péptido derivado de V8 no resíduo Ala 162 da sequência de ADN-c e prolongou a s equência de aminoácidos deduzida do clone de ADN-c em 9 resídju os. Um péptido tríptico contido no péptido V8 terminou no mes. mo resíduo, sugerindo que uma Phe 187 é o resíduo C-terminal da proteína. Por forma a confirmar esta conclusão isolou-se um clone de ADN-c do LIF sobreposto com o pLIF7.2b e estendendo-se no sentido do terminal 3’ e sujeitou-se o clone a análise da sequência de nucleótidos.

Por forma a construir e a identificar uma biblioteca de ADN-c apropriada a partir da qual se pudesse isolar um tal cio ne, analisaram-se uma série de amostras de ARN-m por hibridação de mancha Northern para identificar as amostras de ARN com a mais elevada concentração de moléculas de ARN-m do LIF. Fraccionou-se ARN citoplasmático poliadenilado, preparado essencialmente como anteriormente se descreve (Gough, N. M. J. Mol.

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-27Biol. 165: 683-699, 1983) em geles de agarose a 1% contendo 20 mM de ácido morfolinopropanossulfónico (MOPS), 5 mM de acetato de sódio, 1 mM de EDTA (pH 7,0), mais 6% u/u de formaldeído, os filtros contendo o ARN foram embebidos em 2 x SSC, contendo 0,2% de Ficol, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino, 2 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de ATP, 50 ^g/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 50 jkg/ml de ARI\l-t de E. coli, a 679C durante várias horas. A hibridação realizou-se no mesmo tampão, contendo adicionalmente 0,1% de SDS, a 675C. A sonda usada para detectar os transcritos de LIF consistiu de um fragmento Eco RI - Hind III com aprox. 750 pb, contendo a inserção de ADN-c do pLIF7.2b subclonada no pSC65. Este fragmento contêm não apenas a sequência de ADN-c mas também caudas G-C e aprox. 150 pb da sequência do vector pJL3. Obtiveram-se ribossondas com aprox. 2 x 10^ cpm/yug por transcrição deste subclone SP6 usando reagentes fornecidos pela BRESA (Adelaide). Incluiu-se a sonda na hibridação com aprox. 2 x 10 cpm/ml. Lavaram-se os filtros extensiuamente em 2 x SSC, 2 mM de EDTA, 0,1% de SDS a 673C e finalmente em 0,2 x SSC a 67QC, antes da autoradiografia.

Esta análise revelou que os transcritos de LIF estavam presentes em teores baixos numa grande variedade de linhagens de células hemopoiéticas e que existia uma variação considerável no nível de ARN-m do LIF em diferentes banhos de ARN de Krebs. Seleccionaram-se dois banhos de ARN de ascites de célu. las de tumores de Krebs para síntese de duas bibliotecas de ADN-c. Construiram-se as bibliotecas de ADN-c usando os reagentes fornecidos pela Amersham (números de produto RPN.1256 e RPN.1257) e usando as instruçães do fabricante; o vector de clonação foi o AGT10. Obtiveram-se aproximadamente 4 x 10^ clones recombinantes e analisaram-se por hibridação com um □ligonucleótido correspondente a uma sequência de 36 resíduos no terminal 3’ da sequência do pLIF7.2b: nucleótidos 500-535 (inclusivé) na Figura 10.

Cultivaram-se as placas de fagos, representando a biblio teca de ADN-c de Krebs, com uma densidade de aprox. 50000 placas por caixa de petri de 10 cm, transferiram-se em duplicado «7

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para nitrocelulose e trataram-se usando técnicas convencionais (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor,

1982). Antes da hibridação incubaram-se os filtros durante vá rias horas a 379C em 6 x SSC (SSC - 0,15M de NaCl, 0,015M de citrato de sódio), 0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino, 2 mM de pirofosfato de s.ó dio, 1 mM de ATP, 50 /-ug/ml de ADN de esperma de salmão desnatu rado e 50 de ARN-t de E. coli. Realizou-se a hibridação na mesma solução contendo 0,1% de NP40, a 379C durante 16-18 horas. Incluiu-se a sonda de oligonucleótido anteriormente re ferida, radioactivamente marcada usando se de polinucleótido até uma actividade específica de aprox.

iónica numa coluna NACS (Bethesda Research Laboratories), na hibridação numa concentração de aprox. 20 ng/ml. Após a hibri dação lavaram-se os filtros extensivamente com 6 x SSC, 0,1% de dodecilssulfato de sódio a 60QC. Recolheu-se uma placa positiva representando o clone ALIFNKl em filtros em duplicado, e re-anal is ou-se com menor densidade, como anteriormente.

Subclonou-se a inserção de ADN-c no ÂLIFNKl, com aprox. 950 pb, que se tinha hibridado com o oligonucleótido anteriormente referido, num vector plasmídeo (pEMBL8+, Dente, L, et al., Nucl. Acids Res. 11: 1645-1655,1983) para gerar o clone pLIFNKl. Realizou-se a análise da sequência de nucleótidos da inserção de ADN-c no pLIFNKl pelo método de terminação da cadeia de didesoxilo (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Açad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977) usando como padrão ADN plasmídeo de c£ deia dupla desnaturado em condições alcalinas (Chen, Ε. Y. e Seeburg, P.H., DNA 4: 165-170, 1985), como iniciadores uma variedade de oligonucleótidos complementares tanto com regiães do vector de flanqueamento do ADN-c como com sequências na inserção de ADN-c, e usando como polimerases nas reacçães de sequenciação, o fragmento Klenow de polimerase de ADN de E. coli e a transcriptase inversa de AMV. Na Figura 11 mostra-se a s_e quência de nucleótidos de uma porção da inserção de ADN-c no pLIFNKl. A sequência de aminoácidos especificada pelopLIFNKl é idêntica no terminal C aos 9 aminoácidos que se prevê, por

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-29sequenciação directa dos aminoácidos, que constituem o terminal C do LIF, e confirma que a Phe 187 ê o resíduo C-terminal do LIF, uma vez que na sequência do AON-c do pLIFNKl, o codão para este resíduo é imedistamente seguido por um codão de para, gem da tradução em cadeia.

Passo 2: Construção de uma região do codão do LIF num vector de expressão de levedura.

Conseguiu-se a produção inicial da proteína, codificada pelo clones de ADN-c do LIF, num sistema eucariótico (levedura) por forma a que o produto expresso pudesse ser glicosilado segregado e correctamente dobrado. 0 vector de expressão usado, o YEpsecl (Baldari, C. et al., EMBO 3. 6: 229-234, 1987) cons titui uma sequência líder N-terminal, derivada do gene da toxi. na killer do Kluyveromyces lactis, que anteriormente se mos. trou que dirige a eficiente secreção da interleucina 1 (Baldari,

C. et al., EMBD 3 6: 229-234, 1987) transcrita de um promotor GAL-CYC híbrido induzível pela galactose.

Por forma a exprimir neste vector a proteína codificada pelo pLIF7.2b, foi necessário modificar o ADN-c de várias formas (ver a Figura 12). No terminal 5* foi necessário não apenas remover os poucos nucleôtidos especificando a sequência li der parcial de mamífero, mas também incluir um centro de cliva, gem (Bam Hl) de endonuclease de restrição apropriado para permitir a inserção em cadeia com o líder K. lactis e manter um sinal apropriado do centro de clivagem de peptidase (Gly-Ser). No terminal 3' construiram-se duas versões da região de codifi cação do LIF. Uma versão (LIFmutl) foi construída de modo a que o último codão do pLIF7.2b (Gin 178) fosse imediatamente seguido por um codão de paragem. A outra versão (LIFmut2) foi construída para acrescentar uma sequência, codificando 9 resíduos aminoácidos, que se sabe que está ausente no pLIF7.2b (ver acima), seguida por um codão de paragem da tradução em cadeia. Um centro de clivagem de endonuclease de restrição apropriado (Hind III) completou ambas as construções. Todas estas construções foram obtidas por mutagenese mediada por oligonucleóti do: subclonou-se o fragmento Eco RI - Hind III com aprox. 750

I **

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pb compreendendo a inserção de ADN-c de 535 pb do pLIF7.2b, li gada por caudas G-C e uma porção do vectorpGL3, no plasmídeo pEMBL8+ (Dente, L. et al., Nucl. Açjds Res. 11: 1645-1655,

1983) e preparou-se ADN de cadeia simples tal como se descreve em (Cesarini, G. e Murray, 3.A.H. em Setloui, O.K. e Hollaender,

A. (eds), Genetic Engineering: Principies and Methtfds. PIenum Press, New York, Vol. 8, 1987 (a imprimir)). Realizou-se a mu tagénese in vitro como se descreve em (Nisbet, I.T. e Beilharz, M.W. Gene Anal. Techn. 2: 23-29, 1985), usando oligonucleótidos de 35, 51 e 61 bases respectivamente, para modificar o terminal 5' e o terminal 3' do ADN-c, como anteriormente se indica. Li garam-se os fragmentos Bam Hl - Hind III, contendo as sequènci as modificadas de ADN-c do LIF, ao plasmídeo YEpsecl e determi as sequências de nucleótidos das inserções nos recomresultantes.

naram-se binantes

Passo 3:

Introdução dos recombinantes de YEpsecl/LIF nas célu las de levedura

Transformou-se o S. cerevisiae, estirpe GY41 (leu 2, ura 3, ade 1, his 4, met 2, trp 5, gal 1 cir+; x 4003-5b do Yeast Genetic Stock Centre , Berkeley) pelo método do polietilenogli col (Klene, R.3. et al., Gene 25; 333-341, 1983). Seleccionaram-se os transformados e mantiveram-se em meio sintético mini mo (2% de fonte de carbono, 0,67% de base de azoto de levedura (Difco) suplementado com 50 ytg/ml dos aminoácidos necessários) com privação de uracilo. Conseguiu-se a expressão das sequências inseridas no plasmídeo YEpsecl cultivando os transformados quer em meio completo não selectivo (1% de extracto de levedura, 2% de peptona) quer em meio sintético mínimo, contendo cada um 2% de galactose.

Passo 4:

Determinação das propriedades biológicas do LIF derivado de levedura

Os testes de determinação da actividade indutora de dife renciação e de suspensão da leucémia, de meio condicionado de levedura foram realizados em culturas de 1 ml contendo 300 células Ml (fornecidas pelo Dr. M. Hozumi do Centro de Pesquisa

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Λ' *

...

-31do Cancro, Saitama, Oapão) em meio de Eagle com a modificação de Dulbecco, com uma concentração final de 20% de soro e 0,3% de agar. Adicionou-se o material a testar, em volumes de 0,1 ml cada vez mais diluídos, à placa de cultura antes da adição da suspensão de células em meio de agar. Incubaram-se as cul turas durante 7 dias numa atmosfera completamente humidificada com 10% de C0₂« Contaram-se as culturas usando um microscópio de dissecção com uma ampliação de 35x, contando como diferenciadas todas as colónias com uma coroa de células dispersas ou compostas totalmente por células dispersas. 0 exame morfológi. co das colónias foi realizado fixando toda a cultura com 1 ml de glutaraldeído a 25% e depois corando as culturas secas em lâminas de microscópico usando acetilcolinaesterase/Azul rápido de Luxol/Hemotoxilina.

Realizaram-se os testes de actividade de estímulo de co lónias usando 75000 células de medula óssea C57BL como previamente se descreveu (Metcalf, D. The Hemopoietic Colony Stimulating Factors Elsevier, Amsterdam, 1984). Realizaram-se os te.s tes de actividade indutora de diferenciação em células WEHI-3B D⁺ como previamente se descreveu (Nicola, N. et al., J. Biol. Chem. 258; 9017-9023, 1983).

meio de culturas de levedura contendo a região de codi, ficação em todo o comprimento (LIFmut2), mas não de culturas de levedura não transformada, de levedura contendo o vector YEpsecl sozinho ou de levedura contendo a região de codificação incompleta (LIFmtul), foi capaz de induzir a diferenciação macrofaga típica em culturas de colónias Ml (Figura 13A), Tal como acontece com o LIF purificado original, com concentrações cada vez maiores, o material derivado de levedura reduziu também progressivamente o número e a dimensão das colónias de Ml em desenvolvimento (Figura 13B). A comparação com o LIF purificado original indicou que o meio de levedura condicionado continha até 16000 unidades/ml (aproximadamente 130 ng/ml/ de LIF. 0 LIF derivado de levedura, tal como o LIF-A purificado original não conseguiu estimular a formação de colónias por cé lulas progenitoras granulocito-macrofago normais, nem induzir a diferenciação em, ou em suprimir a proliferação de, colónias

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leucémicas WEHI-3B D⁺.

fraccionamento por tamanhos numa coluna Sephacril S-200 indicou que o LIF derivado de levedura foi co-eluído com protei nas com peso molecular aparente de 67000 a 150000 Daltons, quajn do comparado com os 58000 Daltons para o LIF derivado de células de Krebs.

A ausência de actividade de LIF em meio condicionado por levedura contendo uma região de codificação incompleta (LIFmutl) sugere que os nove resíduos hidrofóbicos C-terminais ausentes nesta construção possam ser necessários para a função de LIF. Se bem que estes resíduos possam interactuar com o receptor, po. dem também constituir parte de um núcleo hidrofóbico na protei. na e assim a sua ausência pode evitar a dobragem adequada. A_1 ternativamente eles podem também ser de algum modo necessários para a secreção eficaz do LIF.

Passo 5: Especificidade de ligação a receptores do LIF murino derivado de levedura e do LIF-A purificado original de meio condicionado de ascites de células Krebs II

Isolou-se LIF-A murino purificado (Exemplo 1) tal como anteriormente se descreveu (Exemplo 3). Colheram-se as células por irrigação a partir de ratinhos nos quais se tinha induzido um nível elevado de macrofagos, na cavidade peritoneal, com tioglicolato, Lavaram-se estas células e ressuspenderam-se,

2,5 x 10^ células/50 juul, em meio RPMI tamponizado com Hepes contendo 10% de soro fetal de vitelo. Incubaram-se as células em alíquotas de 50 ,ul com 200 000 cpm de I-LIF-A (10 Jtl no mesmo meio) e com 10 JU1 de meio de controlo ou com séries duas vezes diluídas de LIF-A murino puro ou de LIF murino derivado de levedura, não marcados. Nas concentrações apropriadas, o sobrenadante de levedura induzida por galactose, contendo a construção LIFmut2 (Figura 12) competiu na ligação do 125

I-LIF-A aos seus receptores em células peritoneais, o mesmo não acontecendo com o sobrenadante de levedura não induzida (Figura 14). 0 grau de competição foi igual ao do LIF-A autêjn tico original, indicando que o LIF-A derivado de levedura continha toda a informação necessária para se ligar aos recepto-

4*

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-33res celulares do LIF-A.

EXEMPLO 6 exemplo seguinte descreve os passos usados para exprimir o LIF murino recombinante em células de mamífero.

A Figura 15 refere-se ao passo 1 do método que a seguir se descreve: a sequência de nucleótidos da porção de ADN-c do clone pLIFNK3. Apresenta-se a sequência de nucleótidos da cadeia de ARN-m sinónima com a orientação 5’ a 3', apresentando-se seguidamente a sequência inferida de aminoácidos do LIF. 0 resíduo aminoácido N-terminal previamente determinado está indicado por +1. Indicam-se o centro Eco Rl no terminal 5' do ADN-c e o centro Xba I abrangendo o codão de paragem (usado no passo 2 na inserção da região de codificação do LIF no pMP-Zen). Passo 1: Determinação da sequência de aminoácidos da sequência líder N-terminal do LIF murino.

Os clones de ADN-c pLIF7.2b e pLIFNKl (ver acima) contêm cópias incompletas do ARN-m do LIF. Ainda que possam conter em conjunto a região de codificação completa da porção madura da proteína LIF, eles não contêm a sequência líder hidrofóbica com pleta, necessária para a secreção do LIF por células de mamífe ro.

Por forma a isolar um clone de ADN-c contendo a região codificando a líder hidrofóbica, analisaram-se como anteriormente mais 10^ clones de ADN-c, construídos como anteriormente (Exemplo 5) usando o mesmo banho de ARN-m de Krebs como padrão, usando como sondas dois oligonucleótidos correspondentes a uma sequência de 35 resíduos no terminal 5’ e 36 resíduos no termi nal 3' da sequência pLIF7.2b (nucleótidos 67-102 e 500-535, inclusivé, na Figura 10).

Recolheram-se duas placas, representando os clones XLIFNK2 e ÀLIFNK3, positivos em filtros duplicados e reanalisaram-se a baixa densidade como anteriormente. Uma vez que se verificou que o /LIFNK3 se híbrida com cada um dos dois oliqo nucleótidos usados, foi seleccionado para mais análises.

Subclonou-se a inserção de ADN-c de aprox. 1400 pb no

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«wr

-34ÀLIFNK3, no vector plasmídeo pEMBL 8⁺ (Dente, L., et al., Nucleic Acids Res. 11:1645-1655, 1983) para gerar o clone pLIFNK3. Realizou-se a análise da sequência de nucleótidos da inserção de ADN-c do pLIFNK3 como para o pLIF7.2b e pLIFNKl (co mo anteriormente).

Na Figura 15 mostra-se a sequência de nucleótidos da inserção de ADN-c no pLIFNK3 e esta indica que o pLIFNK3 contém uma região de codificação do LIF completa; existe um codão de iniciação (AUG) na posição 23-25 na sequência pLIFNK3, prece_ dendo uma sequência codificando uma sequência líder hidrofóbi.

ca típica com 24 resíduos aminoácido. A região de codificação estende-se ac mesmo codão de paragem da tradução definido como anteriormente para o pLIFNKl (acima).

Passo 2: Introdução de uma região de codificação do LIF num vector de expressão de mamífero vector de expressão de mamífero escolhido inicialmente foi o vector de expressão retroviral pMP-Zen. Este vector é derivado do vector pZlPNeo SV(x), (Cepko, C.L. et al., Cell 37: 1053-1062, 1984) baseado no vírus murino da leucémia Moloney, R por eliminação do gene neo conjuntamente com as sequências, SV40 e plasmídeo, vizinhas deixando um centro de expressão Xho I. A região 3' do vector é também modificada para incorpo. rar o realçador da repetição de terminal longo (LTR) do sarcoma vírus mieloproliferativo (MPSV) (Bou/tel, D.D.L. et al., Mol. Biol. Ned. 4:229-250, 1987). Escolheu-se este vector, em primeiro lugar, em virtude de o LIF/pMP-Zen recombinante poder ser empacotado em partículas rectrovirais infecciosas auxiliares livres, por passagem através de células Ψ2 (Mann, R., et al., Cell, .33:153-159, 1983). Podem então usar-se estas parti, cuias virais para introduzir eficazmente (por infecção) o LIF/ /pMP-Zen recombinante numa grande variedade de tipos de células murinas (Mann, R. et al., Cell 33:153-159, 1983). Em segundo lugar tem-se verificado que este vector particular, que utiliza os LTRs do MPSV para expressão da região de codificação estranha, dirige a expressão eficaz de certos outros factores de crescimento e diferenciação hemopoiéticos, incluindo o GM-CSF.

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-35Λ* segmento de pLIFNK3 escolhido para inserção no pMP-Zen estendeu-se desde a posição 1 (um centro Eco Rl) até à posição 630 (um centro Xba 1 abrangendo o codão de paragem) - ver a Fi gura 15. Escolheu-se este segmento pois contém pouco mais do que a região de codificação de pre-LIF e exclui toda a região 3' não traduzida, que pode conter sequências que conferem instabilidade ao ARN-m (p.e. Shau/, G. e Kamen, R. Cell 46:659-667, 1986; Verma, I.M. e Sassone-Corsi, P., Cell 51? 513-514, 1987). Por forma a inserir este fragmento no pMP-Zen, inseriu-se primeiro entre os centros Eco Rl e Xba I do pIC20H (Marsh, 3. L. et al., Gene 32: 461-485, 1984) por técnicas padrão (Maniatis et al., 1982, supra). Recuperou-se então a inserção de ADN-c do polylinker do plasmídeo pIC20H por digestão com Sal I e com Xho I, gerando-se assim um fragmento de ADN-c do LIF com terminais coesos apropriado para inserção no centro de clonação Xho I do pMP-Zen. Conseguiu-se a inserção do fragmento de ADN-c do LIF no pMP-Zen por técnicas convencio. nais (Maniatis et al,, 1982, supra).

Passo 3; Introdução do pMP-Zen/LIF recombinante em fibroblastos murinos.

Introduziu-se o ADN pMP-Zen/LIF em fibroblastos Ψ2 por electroporação (Potter et al., PNAS 81:7161-7165, 1984). Misturaram-se 30 j^g de ADN pMP-Zen/LIF mais 3 de ADN pSV2Neo (Southern, P. J. e Berg, P. J. Mol. App. Genet. 1.:327-341, 1982) com 1 x 10⁶ fibroblastos ^2 em 1 ml de DME/FCS 10% (meio de Eagle com modificação de Dulbecco contendo 10% de soro fetal de vitelo) e sujeitou-se a mistura a um impulso de 500v com uma capacitância de 25 ^F (usando um BioRad Gene-Pulser modelo n2. 1652078). Seleccionaram-se inicialmente os transafectados com base na resistência ao antibiótico G41B cori ferida pelo ADN pSV2Neo. Seleccionaram-se as células Ϋ2 resistentes ao G418 em 400^g/ml de G418 por procedimentos convencionais (Mann, R. et al., Cell 33: 153-159, 1983). De 19 clones resistentes ao G418 examinados, 2 continham também a construção pMP-Zen/LIF tal como foi estabelecido pela activida. de de LIF detectável em meio condicionado de γ2.

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Passo 4: Determinação das propriedades biológicas do LIFderivado de Ψ2

Os testes de actividade indutora de diferenciação e de supressão da leucémia do meio condicionado de células Τ'2 coji tendo pMP-Zen foram realizados como anteriormente se descre veu. Testaram-se os meios de culturas de 10 células Ϋ2 ém ml de DME/FCS 10% para determinação da actividade indutora da diferenciação. Na tabela seguinte apresentam-se os resulta dos obtidos para duas culturas positivas:

Clone n9 controlo

Actividade indutora de diferenciação Ml (Unidades/10^ células/ml C.M.) não detectável

Y2-lla

000 *2-lld >16 000

Assim, neste sistema de expressão podem produzir-se níveis significativos de LIF-murino recombinante biologicamente activo.

Passo 5: Transmissão do retrovírus pMP-Zen/LIF de células Ψ2 para células hemopoiéticas.

Pode transferir-se o retrovírus pMP-Zen/LIF infeccioso das linhagens de células Ψ2 progenitoras para células hemopoiéticas da linhagem FDC-P1 (Dexter, T. M. et al., J. Exp. Med. 152:1036-1047, 1980) por cocultivação. Misturaram-se 10^ células Ψ2 com 10^ células FDC-P1 em 10 ml de DME/FCS 10% cojn tendo a concentração óptima de meio condicionado de WEHI-3B D“ para crescimento das células FDC-P1. Apés 2 dias de incubação removeram-se as células FDC-P1 não aderentes, lavaram-se para eliminar todas as células Ψ2 aderentes e cultivaram-se durante 16 horas em 3 ml do mesmo meio. Colheu-se o meio condicionado e testou-se como anteriormente se descreve para determina ção da actividade indutora de diferenciação e supressora da leucémia. Na Tabela seguinte mostram-se os resultados obtidos.

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Cultura de FD derivada do Clone n9.

'f 2-controlo

Ψ2-113

Y2-lld

-37Actividade indutora de diferenciação Ml.

(Unidades/10⁶ células FDC-P1) não detectável aprox. 3 000 aprox. 1 500

0s clones ψ2, ψ2-lla e Ψ2-lld, são assim capazes de transmitir o retrovírus pMP-Zen/LIF biologicamente activo a cé lulas hemopoiéticas. Estes clones deverão deste modo ser apli cáveis à infecção de células progenitoras hemopoiéticas murinas normais que se podem usar para reconstituir o sistema hemo poiético de ratinhos irradiados de modo a estudar os efeitos da expressão elevada de LIF original na hemopoiese murina normal, de uma forma análoga à usada para a infecção virai de Zen/GM-CSF.

EXEMPLO 7

Descrevem-se seguidamente os passos usados para exprimir o LIF murino recombinante em células ds E. coli.

A Figura 16 refere-se ao Passo 1 do método que a seguir se descreve: sequência de nucleétidos na junção de glutationa S-transferase/centro de clivagem da trombina/LIF no plasmídeo pGEX-2T/LIF, e a sequência na junção da proteína de fusão codificada. Mostram-se o terminal-C da glutationa S-transfera se, o centro de clivagem da trombina e o terminal-N das porções de LIF murino da proteína de fusão tripartida, conjuntamente com a sequência de nucleétidos codificando esta sequência de aminoâcidos. Indica-se com uma seta o centro de clivagem pela trombina esperado.

Passo 1: Introdução de uma região de codificação do LIF num vector de expressão de E, coli.

vector de expressão usado para exprimir o LIF em E. coli foi o pGEX-2T (Smith, D. B. e dohnson, K.S., Gene (a imprimir), 1988), que dirige a síntese de polipéptidos estranhos co mo fusões com o terminal-C do Sj26, uma glutationa-S-transfera ► ·'

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7 Ο-3 MS

-38se de 26 kD (E.C. 2.5.1.18) codificada pelo verme parasita Schistosoma ,japonicum. Na maioria dos casos tem-se verificado que as proteínas de fusão são solúveis em soluções aquosas e que podem ser purificadas, a partir de lisados bacterianos em bruto sob condições de não desnaturação, por cromatografia de afinidade em glutationa imobilizada. Tem-se construído o vector particular pGEX-2T de forma a que se possa clivar o transportador de glutationa S-transferase da proteína de fusão por digestão com a protease trombina específica de determinados centros.

Introduziu-se a região de codificação completa do LIF mu rino, derivada do piasmídeo pLIFmut2 (ver Exemplo 5 e Figura 12 anterior), na forma de um fragmento Bam Hl - Eco RI no centro de clonação múltipla do pGEX-2T (Smith, D.B. e Oohnson, K.S., supra), posicionando assim a região 3' de codificação do LIF de, e na mesma cadeia de leitura de tradução do, centro de clivagem da glutationa S-transferase e da trombina. A proteína LIF localizar-se-ia assim do lado do terminal-C em relação a estes elementos, na forma de uma proteína de fusão glutationa S-transferase)centro de clivagem de trombina/LIF tripartida (ver Figura 16). E de notar que a posição do centro de clivagem de trombina é tal, que após a clivagem pela trombina dois resíduos aminoácido (Gly-Ser) ficarão em apêndice ao terminal N da proteína LIF. A construção do piasmídeo anteriormente re ferido, pGEX-2T/LIF, foi conseguida por técnicas convencionais, e o piasmídeo foi introduzido na E. coli MM522 (Gough, 3. A. e Murray, N. M., 3, Mol. Bjol. 166; 1-19, 1983) de acordo com técnicas convencionais.

Passo 2; Expressão e purificação da proteína de fusão glutationa S-transferase/LIF.

Por forma a induzir a expressão da proteína de fusão glutationa S-transferase/LIF, cultivaram-se culturas de 10 ml de células E. coli NM522, contendo pGEX-2T/LIF em caldo de Luria, até à fase logarítmica e adicionou-se β -D-tiogalactopiranosido de isopropilo até uma concentração de 0,1 mM. Após um crescimento adicional de 4 horas, período durante o qual se

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exprimiu o gene glutationa S-transferase/LIF, colheram-se as células por centrifugação e ressuspenderam-se em 1 ml de solução salina tamponizada com fosfato com a tonicidade de ratinho (MTPBS: 150 mM de NaCl, 16 mM de Na^PO^, 4 _mM de Nal-^PO^, pH 7,3). Lisaram-se as células por sonicação moderada em gelo e após a adição de Triton X-100 até 1%, removeram-se os restos das células por centrifugação (10 000 g, 5 mn, 49C). Misturou, -se o sobrenadante clarificado à temperatura ambiente num tubo de polipropileno de 50 ml numa plataforma rotativa, com 200 yX de partículas de 50% de glutationa-agarose (ligação de enxofre, Sigma). (Antes da utilização, partículas foram intumescidas em MTPBS, lavadas duas vezes no mesmo tampão e armazenadas em MTPBS a 49C na forma de uma solução a 50% v/v). Apés a absorção (5 mn) recolheram-se as partículas por centrifugação (500 g, 1 mm) e lavaram-se três vezes em MTPBS/Triton X-100. Eluiu -se depois a proteína de fusão glutationa S-transferase/LIF por competição com a glutationa livre: incubaram-se as partículas com 100 yj de Tris. HC1 50 mM, 5 mM de glutationa reduzi da (pH 7,5) durante 2 mn à temperatura ambiente e removeram-se as partículas por centrifugação. Realizou-se □ passo de eluição duas vezes, e recolheram-se as duas alíquotas de 100 yil de eluido.

Trataram-se 100 yd da proteína de fusão glutationa S-transferase/LIF com trombina como se descreveu (Smith, D. B. e Oohnson, K. S., supra).

Sujeitaram-se alíquotas de 1 ykL da proteína de fusão gljj tationa S-transferase/LIF, não clivada e clivada pela trombina, a electroforese num gel Pharmacia Phast (gel com um gradiente de poliacrilamida 8-25%). Apôs coloração com Azul de Coomassie revelou-se na preparação não clivada uma única proteína princi pal com um peso molecular relativo de 46 kDa e na preparação clivada pela trombina duas bandas principais de -26 kDa e de ~20 kDa (correspondentes às dimensães esperadas da proteína de fusão (46 kDa), da glutationa S-transferase (26 kDa) e da proteína LIF (20 kDa) respectivamente). Estimando a massa das bandas manchadas com Coomassie neste gel, estimou-se c rendimento em proteína glutationa S-transferase/LIF em relação à

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cultura original de E. coli de 10 ml que foi de -1,5

Realizaram-se os testes de determinação de actividade indutora de diferenciação e da actividade supressora da leucémia de ambas as preparações, de proteína de fusão glutationa

S-transferase/LIF e de LIF clivado pela trombina, usando células murinas Ml (como anteriormente se descreveu). Determincu-se que ambas as preparações de LIF eram biologicamente acti- vas, com actividades específicas em excesso de 7x10 unidades/ /mg.

EXEMPLO 8

Descrevem-se seguidamente os passos usados para determinar se o genoma murino continha quaisquer outros genes estreitamente relacionados com o gene de codificação da sequência presente no clone pLIF7.2b (Exemple 4) e a derivação de um mapa de localização dos centros de clivagem de endonucleases de restrição na vizinhança do gene do LIF.

As figuras referem-se aos vários passos do método que a seguir se descreve:

Figura 17! refere-se ao Passo 1: hibridação de ADN de ratinho com uma sonda derivada do pLIF7.2b sob condições de alta e bai. xa severidade. Sondou-se o ADN de fígado de BALB/c digerido com as enzimas de restrição indicadas, para determinar as sequências do gene do LIF tal como se descreve no Exemplo 8, pas. so 1. No painel do lado esquerdo, a hibridação realizou-se a 659C em 2 x SSC, e com uma lavagem final a 652C em 0,2 x SSC. No painel do lado direito a hibridação e a lavagem foram ambas em 6 x SSC a 652C. No painel do lado esquerdo incluiu-se o ADN plasmídeo linear pLIF7.2b (5,6 kl ) numa quantidade equiva. lente a 10 e a 1 cópia por genoma de ratinho haploide (400 pg e 40 pg respectivamente) assumindo um peso molecular para o g.e noma de ratinho haploide de 3 x 10 pb (Laird, C. D. Chromosoma, 32: 378-406, 1971). Indicam-se as dimensões dos fragmentos genómicos de hibridação.

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-41Figura 18: refere-se ao passo 2: hibridação de ADN de ratinho clivado com várias endonucleases de restrição, individualmente ou em combinação de pares, com uma sonda de LIF de ratinho. Sujeitaram-se os ADN's digeridos a electroforese em geles de 8% de agarose e hibridaram-se com o fragmento de ADNc, pLIF7.2b, como se descreve no Exemplo 8, passo 1, sob condições de elevada severidade.

Figura 19? refere-se ao passo 2: mapa de clivagem com endonuclease de restrição do gene do LIF murino. A região de ADN cromossómico contendo as sequências correspondentes ao clone de ADN-c, pLIF7.2b está indicada por uma caixa. Os centros de restrição indicados em cima (Eco R5) e em baixo (Xba I, Bam Hl, Pst I e Stu I) não se orientou a linha central em relação à li, nha central. A localização relativa dos centros no complexo abaixo da linha é a indicada.

Figura 20: refere-se ao passo 3: atribuição cromossómica do gene do LIF murino. Na pista 1 sujeitou-se a electroforese ADN de embrião de ratinho BALB/c, na pista 2, ADN de células de ovário de hamster chinês e nas pistas de 3-8, ADN dos cio, nes híbridos Ϊ-18Α HAT, I-18A-2a- 8AG; EBS 58; EBS 11; EBS 4; e I-13A-la-8AG (Cory, S. et al., EMBD 3. 2: 213-216, 1983). Em Cory, S. et al., (EMBO 3. 2: 213-216, 1983) apresenta-se o teor em cromossoma murino destes híbridos. Digeriram-se todos os ADN’s com Bam Hl. Indica-se a posição do fragmento Bam Hl de 3 kpb compreendendo o gene do LIF murino.

Passo 1: Determinação do número de genes, relacionados com o LIF, no genoma murino.

Em face dos resultados (Exemplo 1) que mostram que o meio condicionado por células Krebs II contém dois factores, bioquimicamente distintos mas funcional mente similares, capazes de induzir a diferenciação de células Ml (LIF-A e LIF-B) pretendemos determinar quantos genes existiriam no genoma muri no, relacionados com as espécies que tínhamos purificado e cl£ nado. Deste modo hibridaram-se manchas Southern de ADN genúmi co murino, digerido com várias endonucleases de restrição, com

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3470-3MS uma sonda derivada do pLIF7.2b sob condições de elevada e baixa severidade.

Digeriram-se alíquotos de 20 ^g de ADN genómico de eleva do peso molecular, de fígados de ratinhos Balb/c, com várias endonucleases de restrição até a digestão estar completa, fraç. cionaram-se por electroforese em geles de 0,8% de agarose e transferiram-se para nitrocelulose. Antes da hibridação, incu baram-se os filtros durante várias horas a 659C quer em 6 x SSC (baixa severidade) quer em 2xSSC (elevada severidade) (SSC = = 0,15M de NaCl, 0,015M de citrato de sódio), 0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino, mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de ATP, 50 kg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 50 y*g/ml de ARN-t de E. coli. A hibridação realizou-se na mesma solução contendo 0,1% de SDS, a 65QC durante 16-18 horas. Lavaram-se depois os filtros quer em 6 x SSC, 0,1% de SDS a 653C (baixa severidade), quer em 2 x SSC, 0,1% SDS a 659C, seguido de 0,2 x SSC, 653C (elevada severidade) tal como se indica na legenda da Figura 17. A sonda de hibridação usada foi, tal como anteriormente se referiu, o fragmento Eco RI - Hind III com aprox. 75 pb, abrangendo a inserção de ADN-c de pLIF7.2b, radiomarcada até uma actividade específica de aprox. 4 x 10 cpm por tradução de incisão

e incluiu-se na hibridação numa concentração de aproximadamenn te 2 x 10 cpm/ml

Em ADN de fígado de ratinho (Figura 17) bem como em ADN de células Krebs II, células T LB3 e células de monocitos WEHI265 (que não se mostram) a sonda de LIF detectou fragmentos únicos de Eco RI, Bam Hl e Hind III com aproximadamente 11, 3 e 13 kpb respectivamente. 0 mesmo padrão de hibridação foi evidente em condições tanto de elevada (0,2 x SSC, 659C) como de baixa severidade (6 x SSC, 65?C) (Figura 17); sob cojn dições de hibridação e de lavagem de baixa severidade não se observaram bandas adicionais. Similarmente detectaram-se também fragmentos de hibridação únicos, no ADN genómico digerido com Pst I, Stu I, Sac I, Eco R5 e Bgl II (Figura 17). Além disso, na experiência ilustrada na Figura 16, incluíu-se o pla£ mídeo de ADN pLIF7.2b numa concentração equivalente a 10 e a 1 } *' 67 567

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-43cópias por genoma de ratinho haploide (pistas 1 e 2) ; a interi sidada de hibridação das sequências de LIF genomico não foi significativamente diferente da intensidade do padrão do gene único (pista 2).

Tomados em conjunto os dados anteriores indicam que o qe ne de LIF é único no genoma murino, sem ter genes muito pareci, dos. Assim, as duas espécies de LIF não são provavelmente pro, dutos de genes diferentes mas representam mais provavelmente variantes pés-transcrição ou pós-tradução do mesmo produto genético.

Passo 2: Obtenção de um mapa de clivagem de endonuclease de restrição do gene do LIF murino.

Por forma a determinar a disposição dos centros de cliva gem de endonuclease de restrição em e à volta do gene do LIF murino, e assim permitir a obtenção de uma impressão digital molecular deste gene, digeriu-se ADN de fígados de ratinho ou de ascites de células de tumor de Krebs, com vários endonuclea ses de restrição e sujeitou-se a análise por manchas Southern como se descreve no passo 1 (sob condições de hibridação e de lavagem de elevada severidade). Na Figura 18 mostram-se exemplos destas experiências. A análise da dimensão dos produtos de digestão permitiu gerar um mapa de localização de cada centro de clivagem à volta do gene do LIF (Figura 19).

Passo 3; Atribuição do cromossoma do gene do LIF murino.

Para determinar o cromossoma no qual se localiza o gene do LIF de ratinho, examinou-se o ADN de linhagens de células hibridas de células somáticas de ovários de seis híbridos ratinho-hamster chinês, que retinham vários cromossomas de ratinho (Cory, S. et al., EMBO 3. 2: 213-216, 1983; Francke, U. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 19: 57-84, 1977). A análise de mancha Southern realizada como se descreve no Passo 1 (usari do condições de hibridação e de lavagem de elevada severidade) indicou que o fragmento Bam Hl de 3 kpb contendo o gene do LIF murino estava ausente de todos os híbridos (Figura 20). Uma vez que o cromossoma 11 é o único cromossoma de ratinho qua não se mantém em nenhuma destas linhagens (Cory, S. et al.,

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Λ*

-44EMBO 3. 2: 213-216, 1983) uma característica dos híbridos rati^ nho-hamster chinês, (Francke, U. et al., Cytogenet. Cell. Genet. 19: 57-84, 1977) é provável que o gene do LIF se encontre neste cromossoma. Com a mesma base atribuiram-se também ao cromosso. ma 11 o gene do GM-CSF murino (Barloui, D.P. et al., EMBO 3. 6.: 617-623, 1987) e o gene Multi-CSF murino (ihle, 3. N. e Kozak, C.A., National Câncer Institute, Frederick Câncer Research Facility, Annual Report, 1984) uma atribuição confirmada por estudos de ligação genética (Barlow, D.P. et al., EMBO 3. 6? 617-623, 1987).

EXEMPLO 9 exemplo seguinte descreve os passos usados no estabele cimento das condições sob as quais se pode usar o ADN-c do LIF murino, clonado, para identificar por hibridação um gene humano ou o ARN-m ou clones de ADN recombinante, contendo sequêncj. as de codificação do LIF humano.

A Figura 21 refere-se ao Passo 2 do método que a seguir se descreve: hibridação de um fragmento de ADN-c do clone pLIF7.2b, marcado com P, sob várias condições, com ADN genómico de origem murina e humana. Em cada caso, a pista 1 contém 15 ^*g de ADN murino (LB3) e as pistas 2 e 3 contêm 15 jkg de ADN humano (respectivamente das linhagens de células Raji ouRAMOS). As condiçães de hibridação e lavagem aplicadas a cada filtro são as que se descrevem no Passo 2. Indicam-se por setas o fragmento Eco RI, com aproximadamente 10 kpb, contendo o gene do LIF murino e o fragmento Eco RI, com aproximadamente 9 kpb, contendo o homólogo humano. Indicam-se à esquej? da padrões de peso molecular. Mostram-se duas exposiçães auto, radiográficas diferentes (16 horas e 62 horas).

Passo 1: Preparação e marcação radioactiva de um fragmento de ADN-c do pLIF7.2b.

Amplificou-se o ADN do plasmídeo pLIF7.2b por crescimento em E. coli MC1061 (Casadaban, M. e Cohen, S., 3. Mol. Biol, 138: 179-207, 1980), extractou-se das células E, coli por procedimentos convencionais (Maniatis, 3. et al., Molecular Cio► ·' 67 567

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-45ning, Cold Spring Harbor, Neui York, 1982) e purificou-se por centrifugações de gradiente de CsCl. Clivou-se □ ADN do plasmídeo pLIF7_#2b assim purificado com as endonucleases de restrição Eco RI e Hind III para libertar do vector um fragmento de ADB-c de -770 pb (p3L3), que foi resolvido das sequências de vectores por electroforese num gel de 1,5% de agarose.

Marcaram-se radioactivamente 200 ng do fragmento de ADN-c do pLIF7.2 até uma actividade específica de aproximadamente 3 x 10⁸ cpm/^zg por tradução de incisão (Rigby, P.W.J., Dieckmann, M,, Rhodes, C. e Berg, P., 3. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) numa reacção contendo de lOOjUzCi. Pu.

rificou-se □ fragmento de ADN-c radioactivamente marcado do marcador não incorporado por precipitação na presença de perclorato de sódio 1M e de 33% de isopropanol.

Passo 2: Hibridação de Manchas Southern de ADN genómico, Murino e Humano, com uma sonda de ADN-c pLIF7.2b.

Sujeitou-se ADN genomico de elevado peso molecular (15jmg) da linhagem de células T murinas LB3 (pista 1) e de duas linha, gens de células B humanas (Raji e Ramos; pistas 2 e 3) cliv.a do com a endonuclease de restrição Eco RI, a electroforese através de um gel de 0,8% de agarose, e transferiu-se para nitrocelulose usando técnicas convencionais (Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975). Prepararam -se cinco manchas Southern idênticas contendo cada um destes três ADN's. Antes da hibridação incubaram-se os filtros durante várias horas a 5590 quer em 0,9M de NaCl, 0,09M de citrato de sódio, 0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino, 50 y*g/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado por calor, 50 y>g/ml de ARN-t de E. coli, 0,1 mM de ATP e 2 mM de pirofosfato de sódio (filtros a, b, c, d), quer em 0,3 M de NaCl, 0,03M de citrato de sódio com os mesmos componentes adicionais (filtro e). A hibridação com o ADN-c do pLlF7.2b mar32 cado com P preparado no Passo 1, foi realizada nas mesmas so luções que a pré-hibridação, contendo adicionalmente 0,1% de dodecilsulfato de sódio, a 559C (filtros a, b, c) ou a 659C (filtros d, e) durante 16 horas. Desnaturou-se o ADN-c marca67 567

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X yf^j'

-4632 do com P, por ebulição antes da hibridaçao e incluiu-se na reacção de hibridação numa concentração de ~10 cpm/ml.

Após a hibridação lavaram-se os filtros, quer em 0,9M de NaCl, 0,09M de citrato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio a 55QC (filtro a), 602C (filtro b) ou a 65SC (filtros c,

d), quer em 0,3M de NaCl, 0,03M de citrato de sódio, 0,1% de dodecilsulfato de sódio a 652C (filtro e). Após lavagem exaustiva autorradiografaram-se os filtros a -709C usando filme Kodak XAR-5 e dois écrans de intensificação. A Figura 21 mostra os resultados desta experiência na qual dois dos regimes descritos de hibridação/lavagem (filtros d e e) permitiram que se detectassem, tanto o gene do LIF murino (presente num fragmento Eco RI com aproximadamente 10 kpb), como o gene do LIF huma no (presente num fragmento Eco RI com aproximadamente 9 kpb), acima da hibridação residual de fundo não específica. Todas as outras condições testadas deram origem a um nível inaceitavelmente elevado de hibridação de fundo (filtros a, b, c).

EXEMPLO 10 exemplo seguinte descreve os passos usados na obtenção de um gene humano clonado homologo do LIF murino.

As Figuras referem-se a vários passos do método que a se, guir se descreve. Nas Figuras:

Figura 22: refere-se ao Passo 1 da clonação do gene do LIF hu mano: detecção do gene do LIF por hibridação de manchas Southern usando uma sonda de ADN-c de LIF de ratinho. Digeriu-se o ADN genomico da linhagem de células humanas RAMOS, com as endonucleases de restrição indicadas e hibridou-se sob as condições que se descrevem no Exemplo 19, Passo 1, com um fragmejn to de ADN-c de ratinho, derivado do pLIF7.2b.

Figura 23: refere-se ao Passo 1 da clonação do gene do LIF humano: detecção do gene do LIF por hibridação de manchas Sou, tbern usando uma sonda de ADN-c de LIF de ratinho sob uma vari edade de condições de hibridação. Hibridaram-se ADN genómico da linhagem de células humanas RAMOS (H) ou ADN de fígado de ratinho (M) digeridos com a endonuclease de restrição Bam Hl,

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com a sonda de ADN de LIF murino (pLIF7.2b) sob uma variedade de condições de hibridação e lavagem. As temperaturas e as concentrações de SSC usadas na hibridação estão indicadas na linha superior e as condições de Exemplo 10, Passo 1).

lavagem na segunda linha (ver

Figura 24: refere-se ao Passo 2 da clonação do gene do LIF hu mano: clivagem por endonuclease de restrição de três clones de genes de LIF candidatos. Digeriu-se 1 de ADN do fago λ dos clones ÂHGLIFl, AHGLIF2 e XHGLIF3 com Sal I, Bam Hl ou Pst I, sujeitou-se a electroforese num gel de 0,8% de agarose (painel do lado esquerdo), transferiu-se para nitrocelulose e hibridou. -se (como anteriormente se descreveu) com ADN-c e PLIF7.2. Indicam-se as dimensões aproximadas dos fragmentos a hibridar.

Figura 25: refere-se ao Passo 3 da clonação do gene do LIF humano: apresenta-se a sequência de nucleótidos da cadeia sinónima de ARN-m de um segmento de AHGLIFl com 1,3 kpb, abrangendo o gene do LIF humano (H), com uma orientação 5’ a 3'. A sequência de nucleótidos correspondente do ARN-m do LIF murino (M) derivada dos clones de ADN-c pLIF7.2b, pLIFNKl e pLIFNK3 es. tá alinhada sob o gene humano e indicada em minúsculas. As ana logias entre as sequências murina e humana estão indicadas com asteriscos. 0 presumível resíduo N-terminal do LIF humano maduro, é, por analogia com o LIF de ratinho, designado por +1.

Figura 26: refere-se ao Passo 3 da clonação do gene do LIF hu mano: sequência de aminoácidos do LIF humano e comparação com o LIF de ratinho. Na linha superior indica-se a sequência de aminoácidos do LIF murino maduro (M) tal como foi determinada por sequenciação directa dos aminoácidos e análise dos clones de ADN-c pLIF7.2b, pLIFNKl e pLIFNK3 e por baixo indica-se a sequência do LIF humano correspondente (H), tal como foi deduzida da sequência do AhGLIFI. As semelhanças estão indicadas com tracejado, as diferenças são indicadas designando o aminoácido.

Figura 27; refere-se ao Passo 4 da clonação do gene do LIF hu mano: mapa de clivagem por endonucleases de restrição do gene do LIF humano. Os exões do gene humano homólogos com o pLIF7.2b (Figura 25) estão indicadas como caixas. A direcção *' 67 567

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de transcrição do gene está indicada pela seta sob a linha. Passo 1; Detecção do gene do LIF humano com uma sonda de ratinho .

Descreveu-se anteriormente um método utilizando um fragmento, radioactivamente marcado, do clone de ADN-c do LIF de ratinho, pLIF7.2b, como sonda de hibridação para detectar o qe ne do LIF humano. A Figura 22 demonstra que este método permi te que se detecte o gene do LIF humano no ADN genómico humano digerido com uma variedade de endonucleases de restrição. Anjã lises como estas e em outros geles que não se indicam, revelaram as dimensões dos fragmentos de ADN gerados por uma varieda de de endonucleases de restrição nos quais se localiza o gene do LIF humano. Estes resultados são importantes nos passos subsequentes deste exemplo, não apenas para estabelecer as cojn dições sob as quais se pode usar a sonda de ratinho como sonda de hibridação para detectar o gene do LIF humano, mas também para permitir a obtenção de resultados em mapas de diagnóstico de restrição para auxiliar a identificação dos clones genómicos do LIF humano.

Quando se hibridou ADN genómico murino e humano digerido com Bam Hl com uma sonda de ADN-c do LIF murino sob uma varie, dade de condições de hibridação e lavagem (Figura 23) foi evidente um elevado grau de homologia entre as sequências dos genes do LIF humano e murino. A medida que a severidade da hibridação e de lavagem aumentou, reduziu-se a mancha residual, revelando um fragmento único de -3 kpb em hibridação com a sori da de ratinho. 0 gene humano mantém significativamente uma hibridação substancial mesmo a 659C em 0,2 x SSC.

Passo 2: Análise de uma biblioteca de ADN genomico humano e isolamento de um clone contendo o gene do LIF.

Analisou-se uma biblioteca de ADN genómico humano parcialmente digerido com Sau 3A e ligado num vector clonante do fa go lâmbda EMBL3A, por hibridação com ADN-c de ratinho como son da, para determinar os clones contendo o gene do LIF. Marcou-se radioactivamente o fragmento de ADN-c do LIF e usaram-se

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-49as condições de hibridação anteriormente descritas (Exemplo 4). Resumidamente, cultivaram-se placas de fagos representando a biblioteca genomica, com uma densidade de -50 000 placas por caixa de petri de 10 cm e transferiram-se para nitrocelulose tal como se descreveu (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, cold Spring Harbor, 1982). Antes da hibridação incubaram-se os filtros durante várias horas a 655C em 6 x SSC (SSC = 0,15M de NaCl e 0,015M de citrato de sódio), 0,2% de Ficoll, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de albumina de soro bovino, 2 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de ATP, 50yuj/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado e 50 ^tg/ml de ARN-t de E. coli. A hibri. dação realizou-se na mesma solução contendo 0,1% de SDS, a 659C durante 16-18 horas. Incluiu-se o fragmento de ADN-c do LIF, radioactivamente marcado por tradução de incisão usando /õ( ^ZP_7 dATP, até uma actividade específica de ~2 x 10 cpm/^g, na hibridação, numa concentração de ~2 x 10^ cpm/ml. Após a hibridação lavaram-se extensivamente os filtros em 6 x SSC, 0,1% de dodecilsulfato de sódio a 659C e depois autorradiografaram-se. Recolheram-se as placas positivas em filtros duplicados e reanalisaram a uma densidade mais baixa, como anteriojo mente.

Assim, identificaram-se e purificaram-se três clones: ÀHGLIFl, 2 e 3. De modo a determinar a relação entre estes clones e a determinar quais porventura continham o gene do LIF humano, preparou-se ADN década clone e digeriu-se com estas endonucleases de restrição: Sal I que liberta todo o segmento de ADN genomico clonado e Bam Hl e Pst I que clivam no, e à volta do.gene do LIF para gerar fragmentos com respectivamente ~3 kpb e 1,8 kpb e 0,6 kpb (tal como anteriormente se determinou). Após a digestão dos ADN’s dos fagos recombinantes e resolução por electroforese em geles de agarose (Figura 24, painel do lado esquerdo), transferiu-se o ADN para nitrocelulose e hibridou-se com a sonda de ADN-c de LIF de ratinho (sob as condições anteriormente referidas) revelando os fragmentos cori tendo o gene do LIF (Figura 24, painel do lado direito). Esta análise revelou que:

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(a) todos os três clones pareceram ser idênticos;

(b) todos contêm um segmento de ADN genomico cem -9 kpb contendo uma região homóloga com a sonda de LIF de ratinho;

(c) a região de homologia com o ADN-c de ratinho, está presente num fragmento Bam Hl de 3 kpb e em fragmentos Pst I de 1,8 e 0,6 kpb, caracteristicos do gene do LIF humano (ver acima). Concluiu-se assim que todos os três clones continham um segmento de ADN cromossómico englobando o gene do LIF humano.

Passo 3: Determinação da sequência de nucleótidos do gene do LIF humano.

Reclonou-se o fragmento Bam Hl do XHGLIFl com ~3 kpb, que anteriormente se mostrou que se híbrida com a sonda de ADN-c do LIF de ratinho, no vector plasmídeo pEMBL8 , obtendo-se o clone pHGLIFBaml, e sujeitou-se este à análise da sequêni cia de nucleótidos. A sequenciação de nucleótidos realizou-se pelo método de terminação da cadeia de didesoxilo (Sanger, F et al., Pro. Natl. Açad. Sei. USA. 74: 5463-5467, 1977) usando, como padrão ADN plasmídeo de cadeia dupla desnaturada sob condiçães alcalinas, como iniciadores uma variedade de oligonucleo. tídeos complementares com as sequências do gene, e como polime rases nas reacções de sequenciação, tanto o fragmente Klenotu da polimerase I de ADN de E. coli como a transcriptase inversa do avian myeloblastosis vírus.

Determinou-se toda a sequência de nucleótidos do fragmeri to Bam Hl englobando o gene do LIF (2840 pb), da qual se mostram na Figura 25 1297 pb. 0 alinhamento desta sequência com a sequência de ARN-m do LIF murino, revelou que as sequências codificando a proteína LIF humano madura estão presentes em dois exães separados por um intrão de 693 pb (Figura 25). Para a região codificando a proteína madura existe um elevado grau de homologia entre as duas espécies, tanto ao nível da se quência de nucleótidos como ao nível da sequência de aminoácidos. No exão 1 existe uma homologia na sequência de ácido nucleico de 88% (comparados 114/129 resíduos) e uma homologia da

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3470-3MS ··

-51sequência de aminoâcidos de 91/ (39/43) para a região codificando a proteína madura (posição 58-186). 0 exão 2 é um pouco menos homólogo, 77% ao nível dos nucleótidos (318/411) e 74.. ao nível dos aminoâcidos (101/136) na região de codificação. Considerando a proteína madura como um todo, as sequências do LIF de ratinho e humano aqui determinadas são idênticas em 140 de 179 posições (78%) sem inserções ou eliminações (Figura 26). Além disso, muitas das diferenças são substituições altamente conservativas (Lys:Arg, GluiAsp e Leu:Val:Ala).

Na região 5' do codão, para o resíduo prolina N-terminal do LIF maduro (posição 58 na Figura 25), o gene humano é homólogo com a sequência de ARN-m do LIF murino, através de uma re gião codificando a maior parte do líder hidrofóbico. Contudo, este exão não codifica o líder inteiro uma vez que as sequênci as de ARN-m e do gene divergem num centro de corte de ARN tipi, co (TCCCCAG) (Mount, S. M. , Nucleic Açids Res. 10; 459-472, 1982). 0 exão especificando a região 5’ não traduzida e os primeiros resíduos do líder, não está presente na região 5' de 1097 pb deste centro de corte. No gene do LIF de ratinho, o exão especificando os primeiros 6 resíduos aminoácido do líder hidrofóbico está localizada em ~1,5 kpb 5' do centro de corte análogo.

Passo 4: Derivação de um mapa de clivagem por endonucleases de restrição do gene do LIF humane.

Por forma a determinar a disposição dos centros de cliva, gem por endonucleases de restrição no, e na vizinhança do, gene do LIF humano, e assim obter uma impressão digital molecular deste gene, digeriu-se ADN genomico humano (da linhagem de células RAMOS) com várias endonucleases de restrição, individual, mente e em combinação de pares e sujeitou-se a uma análise de manchas Southern como se descreve no Exemplo 8, com a excepção de a sonda usada ter sido o fragmento Bam Hl de 3 kpb derivado do pHGLIFBaml descrito no Passo 3 anterior e radiomarcado por tradução de incisão. A análise dos dados assim obtidos (não apresentados), bem como dos que se mostram na Figura 22, e dos obtidos na análise do ÀHGLIFl e pHGLIFBaml, deram origem ao

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-52mapa de clivagem por endonucleases de restrição que se mostra na Figura 27.

EXEMPLO 11 exemplo seguinte descreve modificações efectuadas no gene do LIF humano, clonado por forma a permitir a expressão em células de levedura e determinação das propriedades biológicas e bioquímicas do LIF humano recombinante assim obtido.

Nas Figuras:

Figura 28: refere-se ao Passo 1: o oligonucleotidos usados para modificar o gene do LIF humano para incorporação no YEpsecl. 0 oligonucleotido (a) corresponde ao terminal 5' da região de codificação (resíduos 31 a 69 na Figura 25). 0 oligonucleótido (b) corresponde ao meio da região de codificação (resíduos 163 a 186 e 88 a 903 na Figura 25). A porção deste nucleótido complementar do exão 1 está sublinhada com traços e a complementar do exão 2 com pontos. 0 oligonucleótido (c) corresponde ao terminal 3' da região de codificação (a partir da posição 1279 na Figura 251 Os oligonucleótidos (a) e (b) apresentam os centros de clivagem com endonucleases de restrição indi. cados.

Figura 29; refere-se ao Passo 1: sequência de nucleótidos de, e sequência de resíduos aminoácido codificada por, o ADN-c do LIF humano sintético, derivado do gene clonado do LIF humano por mutagenese. Indicam-se os centras de clivagem Bam Hl e Hind III introduzidos pelos oligonucleótidos (a) e (c) (Figura 28). 0 presumível aminoácido N-terminal do LIF maduro (por analogia com o do ratinho) é designado por +1.

Figura 30: refere-se ao passo 3: indução de diferenciação em colónia de células leucémicas Ml por diluições de LIF murino purificado original (o------o) e de meio condicionado de células de levedura contendo o YEpsecl/HLIF recombinante, induzidas com galactose (·____·). 0 meio de culturas de levedura não induzidas contendo o YEpsecl/HLIF recombinante (o____o) era inactivo. Apresentam-se os valores médios de culturas de 7 dias em duplicado.

) - 67 567

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-53Figura 31: refere-se ao passo 4: competição de HLIFderivado ——————— i 2 5 de levedura com I—LIF murino original na ligação a receptores específicos em células murinas Ml. Testaram-se diluições de LIF-A murino original autêntico (Exemplo 1) (o____o), de

LIF murino recombinante (·____·) e de meio condicionado de células de levedura contendo a construção YEpsecl/HLIF não induzida ( B) e induzida com qalactose (Γ1 ........ ΓΊ), para ava.

125 liar a sua capacidade em competir na ligação do I-LIF-A ori ginal a receptores celulares em células Ml murinas a 379C, tal como anteriormente se descreveu.

Passo 1: Modificação do gane do LIF humano para expressão em levedura.

Descrevei>se anteriormente (Exemplo 10) o isolamento de um clone de ADN recombinante, contendo o gene do LIF humano, e a sequência de nucleótidos do referido gene. Na Figura 25 mos. tra-se a sequência de nucleótidos de 1297 pb de ADN englobando os 2 exões codificando a proteína de LIF humano madura.

Produziu-se anteriormente LIF murino recombinante em células de levedura, usando o vector de expressão em levedura YEpsecl (Exemplo 5). Este vector fornece uma sequência líder N-terminal derivada do gene da toxina killer do Kluyveromyces lactis, transcrita de um promotor GAL.-CYC híbrido induzível pela galactose.

Por forma a exprimir neste vector a proteína codificada pelo gene do LIF humano, foi necessário modificar o gene de vá rias formas. No terminal 5’ da região codificando a proteína madura, introduziu-se um centro de clivagem para a endonuclease de restrição Bam Hl, para permitir a inserção em cadeia com o líder K. lactis e reter um centro de clivagem da peptidase de sinal apropriado (Gly-Ser). Aplicou-se aqui a mesma modifi. cação já anteriormente aplicada ao ADN-c de ratinho (pLIF7.2b). No meio, removeu-se a sequência interveniente de 693 pb, fundindo os dois exões na mesma cadeia de leitura de tradução. No terminal 3' introduziu-se um segundo codão de paragem da tradu. ção imediatamente 3' do codão de paragem natural, seguido de um centro Hind III para inserção no YEpsecl. Todas as modifi67 567

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54cações foram conseguidas por mutagenese mediada por oligonucleótidos: subclonou-se o fragmento Bam Hl de ~3 kpb, englobando o gene do LIF, no plasmídeo pEMBL8 (Dente, L* et al., Nucleic Açjds Res. 11: 1645-1655, 1983) e preparou-se o ADN de cadeia simples por superinfecção com Fl. Realizou-se a mutagenese in vitro como se descreve em (Nisbet, I.T. e Beilharz, M. W. Gene Anal. Techn. 2t 23-29, 1985) usando oligonucleótidos com 39, 48 e 39 bases, respectivamente para modificar o terminal 5', o meio e o terminal 3' do gene, tal como anterior, mente se referiu (ver Figura 28). Na Figura 29 mostra-se a se. quência de nucleôtidos da região de codificação modificado do LIF humano.

Passo 2: Introdução do YEpsecl/HLIF recombinante em células de levedura.

Transformou-se a S. cerevisiae, estirpe GY1⁺ (leu2 ura3 ade2 trpl cir+; de G. Cesareni, EMBL Heidelberg) pelo método do polietilenoglicol (Klebe, R. 3. et al., Gene 25: 333-341, 1983). Seleccionaram-se os transformados e mantiveram-se em meio sintético mínimo (2% de fonte, de carbono, 0,67% de base de azoto de levedura (Difco) suplementado com 50 ^Ag/ml dos ami noácidos necessários) com privação de uracilo. Produziu-se o HLIF recombinante por dois métodos. Cultivaram-se os transformados Ura⁺ (1) quer em meio não selectivo contendo 2% de gja lactose, até à fase estacionária e testou-se o meio para dete£ minar a actividade de LIF, (2) quer em meio selectivo mínimo, contendo 2% de glucose, até à fase estacionária. Lavaram-se depois as células e resuspenderam-se no mesmo volume de meio selectivo mínimo contendo 2% de etanol e cultivaram-se durante 8 horas para ultrapassar a repressão da glucose. Induziu-se então a transcrição da inserção de HLIF diluindo as células (1:10) em meio sintético mínimo contendo 2% de galactose. Removeram-se alíquotas do sobrenadante da cultura,vários instantes apôs a indução, filtraram-se através de filtros Millipore (0,2 jxm) e testaram-se directamente para determinar a activida de do LIF.

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3470-JMS

-55Passo 3: Determinação das propriedades biológicas do LIF derivado de levedura.

Em face do elevado grau de semelhança entre as sequências do LIF murino e do LIF humano, estabeleceu-se a actividade do LIF humano derivado de levedura em células murinas Ml, Reja lizaram-se os testes para determinação da actividade indutora de diferenciação e da actividade supressora da leucémia, de meio condicionado de levedura, em culturas de 1 ml contendo 300 células murinas Ml (fornecidas pelo Dr, M. Hozumi, Centro de Pesquisa do Cancro de Saitama, Oapão) em meio de Eagle com a modificação de Dulbecco, com uma concentração final de 20% de soro fetal de vitelo e 0,3% de agar. Adicionou-se o material a testar, em séries de volumes diluídas de 0,1 ml, à placa de cultura antes da adição da suspensão de células em meio de agar. Incubaram-se as culturas durante 7 dias numa atmosfe ra completamente humidificada de 10% de C0₂ em ar. Cortaram-se as culturas usando um microscópio de dissecção com uma ampliação de 35x, contando como diferenciadas todas as colónias com uma coroa de células dispersas ou compostas totalmente por células dispersas. 0 exame morfológico das colónias foi realizado fixando toda a cultura com 1 ml de glutaraldeído a 2,5% e depois corando as culturas secas em lâminas de microscópio usando acetilcolinaesterase/Azul rápido de Luxo 1/H ematoxilina.

meio de culturas de leveduras, induzidas por galactose contendo a região de codificação humana no YEpsecl, mas nãq o de culturas não induzidas, das mesmas células de levedura, de culturas de levedura não transformada, ou de levedura contendo o vector YEpsecl sozinho, foi capaz de induzir a diferenciação macrófaga típica em culturas de colónias Ml (Figura 30). Tal como aconteceu com o LIF murino, com maiores concentrações de material humano derivado de levedura reduziu-se também o número e a dimensão das colónias Ml em desenvolvimento. A compara ção com o LIF murino purificado original indicou que o meio condicionado de levedura continha até 5G OCO unidades/ml de LIF humano.

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-56Passo 4; Especificidade de ligação a receptores do LIF humano derivado de levedura.

Iodou-se o LIF-A humano purificado (Exemplo 1) como ante riormente se descreveu. Lavaram-se as células Ml e ressuspenderam-se, 2,5 x 10⁶ células/50 jjX , em meio Hepes tamponizada com RPM1 contendo 10% de soro fetal de vitelo. Incubaram-se

75 as células em alíquotas de 50 jjX com 200 000 cpm de I-LIF-A (10/U no mesmo meio) e com 10 pd de meia de controlo, ou com séries de diluiçães de 1:2 de LIF murino puro não marcado, ou com meio condicionado de culturas, induzidas ou não induzidas com galactose, de transformados de levedura contendo a constrju ção YEpsecl/HLIF.

meio condicionado por células de levedura, induzidas por galactose, contendo o YEpsecl/HLIF recombinante foi capaz 125 de competir na ligação do I—LIF—A murino original a recepto res celulares específicos, num grau semelhante ao do LIF-A murino, original e recombinante, a 379C, (Figura 31), e a 05C (que não se mostra). □ mesmo não aconteceu com o meio de células de levedura não induzidas e de células de levedura contendo o vector YEpsecl sozinho. Parece pois existir uma forte conservação do domínio de ligação a receptores nos LIF’s murino e humano, compatível com o elevado grau de semelhança da s_e quência de aminoácidos principal.

Passo 5: Purificação, sequenciação e iodação do LIF humano derivado de levedura.

Purificou-se o LIF humano, em meio condicionado por célu. las de levedura induzidas por galactose contendo o YEpsecl/HLIF recombinante, usando os passos 2 e 4 do Exemplo 1, com a excepção de se ter recolhido no passo 2 a actividade do LIF ligada à coluna de DEAE-Sepharose CL-6B e eluída com o gradiente saH no. Radioiodou-se o LIF humano derivado de levedura purificado incubando 1 ^g de LIF humano em 50 de tampão de fosfato de sódio 0,2M, pH 7,2, com 1 mCi de Na (2,7 yd) e com 5 yd de 0,2 mM de IC1 em NaCl 2M durante 60 seg. Separou-se o 125 125 ^I—LIF do i não incorporado por passagem da mistura reaccional através de uma coluna de Sephadex G-25M (Pharmacia)

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-57equilibrada em solução salina (0,15M) tamponizada com fosfato (20 mM, pH 7,4), contendo 0,02% de Tween 20 e 0,02% de azida 125 de sódio. Sujeitou-se o I-LIF humano a electroforese num gel de poliacrilamida com um gradiente de 8-25% de dodecilsulfato de sódio obtendo-se uma banda simples larga com um peso 125 molecular aparente de 170 000. 0 I-LIF humano ligou-se especificamente a células murinas Ml e a células da medula óssea confirmando a capacidade do LIF humano em se ligar a receptores do LIF murino. Sujeitou-se o LIF humano derivado de levedura purificado (aprox. 10 yug) a sequenciação de aminoácidos do terminal amino, como se descreve no Exemplo 2, e obteve-se uma única sequência de

Ile-Thr-Pro-Val-X-Ala ........

Esta é idêntica à sequência de aminoácidos prevista do LIF humano (Figura 26) com a excepção de a sequência começar no quarto aminoácido, comparando-a com o início da sequência murina (ver Exemplo 2) que é:

Pro-Leu-Pro-Ile-Thr-Pro-Val-Asn-Ala ........

Isto indica que no LIF humano derivado de levedura purificado faltam os três primeiros aminoácidos correspondentes da sequência murina, mas que ele é ainda biologicamente activo e ainda capaz de se ligar ao receptor do LIF murino. 0s primeiros três aminoácidos parecem assim ser dispensáveis para a actividade biológica do LIF.

EXEMPLO 12 exemplo seguinte descreve os passos usados para identi ficar e parcialmente purificar uma molécula putativa do LIF hu mano original.

As Figuras referem-se aos vários passos do método que a seguir se descreve. Nas Figuras:

Figura 32: refere-se ao passo 2 da identificação de um LIF hu mano putativo: a capacidade de diferentes diluições de meio

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3470-JMS éfr condicionado por células do carcinoma da bexiga humana, da linhagem 5637 (ATCC ηδ. HTB9) (-Q -) em bruto ou da fracção não ligada a DEAE (— + —) ou do LIF-A murino original (— o —), 125 em competir na ligação do I-LIF-A murino a receptores celulares em células peritoneais murinas. Mostra-se também a inca pacidade do G-CSF humano (“) em competir na ligação (não diluído = 5 y^jg/ml).

Figura 33: refere-se ao passo 3 da identificação de um LIF humano putativo; o fraccionamento de meio condicionado por cé lulas do carcinoma da bexiga humana, da linhagem 5637, numa co luna de DEAE-5epharose CL-6B, eluída exactamente como para □ fraccionamento, anteriormente descrito, do LIF-A murino (Exemplo 1), β a capacidade de fracçães individuais deste fracciona mento em induzir a formação de colónias diferenciadas de células murinas Ml. 0 painel A mostra o gradiente salino; o painel B mostra o fraccionamento de meio condicionado por 5637; o painel C mostra o fraccionamento de meio condicionado por célu las Krebs II para comparação.

Figura 34: refere-se ao Passo 3 da identificação de um LIF hu mano putativo: o fraccionamento de meio condicionado por célu las de carcinoma da bexiga humana, linhagem 5637, numa coluna de lentil-lectina Sepharose 4B eluída tal como anteriormente se descreveu para o fraccionamento do LIF-A murino (Exemplo 1) e a capacidade das fracções individuais deste fraccionamento em induzir a formação de colónias diferenciadas de células murinas Ml. 0 painel A mostra o gradiente de c?c-metil-D-manopirano'sido, o painel B mostra o fraccionamento de meio condicionado por 5637 e o painel C mostra o fraccionamento de meio cojn dicionado por células Krebs II para comparação.

Passo 1: testaram-se meios condicionados por várias linhagens de células humanas para determinar a sua capacidade em induzir a diferenciação e inibir a proliferação de células murinas mie lóides leucémicas Ml em culturas de a'gar semi-sólido (tal como se descreve no Exemplo 5, Passo 4 do presente pedido de patente). Várias linhagens de células produziram esta actividade, das quais as células do carcinoma da bexiga da linhagem 5637 produziram os níveis mais elevados. Contudo, já anteriormente

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347o-0MS

-59se mostrou que a linhagem de células 5637 produz G-CSF humano (Nicola, N. A. et al., Nature 314; 625-628, 1985; Welte, K. et al., Proc. Natl. Acad. 5ci. USA 82: 1526-1530, 1985) que é também activo na diferenciação de células Ml (Tomida, M. et al·» FEBS Lett. 207; 271-275, 1986; Neckers, L. M. e Pluznik, 0. H. Exp. Hematol. 15; 700-703, 1987). Para confirmar que as células 5637 produziram LIF humano autêntico (adicionalmente ao G-CSF), sujeitou-se o meio condicionado por 5637 ainda aos passos 2 e 3 seguintes.

Passo 2: concentrou-se o meio, condicionado por células 5637, 20 vezes e testou-se para determinar a sua capacidade em compe. tir na ligação do I-LIF-A murino original a receptores celu. lares específicos em células peritoneais murinas. Este teste de competição da ligação realizou-se como se descreve no Passo 5 do Exemplo 5 do presente invento. 0 meio condicionado por células 5637 continha actividade capaz de competir na ligação 125 do I-LIF-A a receptores celulares e concentrou-se esta acti vidade na fracção de 5637 CM (LIF-A) (Figura 32) não ligada a DEAE. Uma vez que os G-CSF humano e murino não competem, mesmo em concentrações muito elevadas, na ligação a centros de li 125 gação do I-LIF-A, tal facto estabelece a presença no meio condicionado por 5637 de uma actividade de homólogo de LIF humano, capaz de reconhecer especificamente o receptor LIF murino. Este facto indica uma forte conservação dos LIF's murino e humano no seu domínio de ligação a receptores, compatível com o elevado grau de homologia da sequência de aminoácidos princi pal.

Passo 3; concentrou-se meio condicionado por células do carci noma da bexiga humana da linhagem 5637 (2 litros em 10% v/v de soro fetal de vitelo) até um volume de 40 ml e cromatografou-se sequencialmente em DEAE-Sepharose CL-6B e em lentil-lectina-Sepharose 4B tal como anteriormente se descreveu para o LIF murino de meio condicionado por ascites de células Krebs II. Cromatografou-se a actividade indutora de diferenciação Ml de células 5637, de uma forma muito semelhante à do LIF murino, em DEAE-Sepharose, com alguma actividade não se ligando

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-60à coluna (LIF-A), enquanto que a restante se ligou e Foi eluída durante o gradiente salino (LIF-B) (Figura 33). Similarmeri te, o LIF humano putativo comportou-se tal como o LIF murino na cromatografia em lentil-lectina-Sepharose com uma proporção de actividade ligada à coluna indicando a presença de carbo-hi dratos contendo manose na glicoproteína (Figura 34). Assim, pela sua reactividade cruzada na indução da diferenciação de células murinas Ml, pela sua capacidade de reconhecer especifi. camente o receptor celular do LIF murino, e pelas suas caracte rísticas de fraccionamento bioquímico, a actividade humana em meio condicionado por células 5637 satisfaz os critérios do análogo humano original do LIF murino.

Purificou-se o LIF humano original de meio condicionado por células 5637, pelos passos 2 e 4 do Exemplo 1, recolhendo-se a actividade de LIF não ligante do passo 2 e a actividade de LIF ligante do passo 4. Fraccionou-se esta actividade reco, lhida de LIF por HPLC de fase inversa como para o passo 5 do Exemplo 1, com a excepção de se ter usado duas vezes uma coluna Brownlee RP300 C8, primeiro usando um gradiente de 0-60% de CH-jCN em 0,1% de TFA e depois usando um gradiente de 45-55% de CH^CN em 0,1% de TFA. Mo segundo gradiente o LIF humano foi eluído para 50% de CH^CN, e quando foi sujeito a electroforese em geles de poliacrilamida com um gradiente de 8-25% de dodecilsulfato de sódio, mostrou uma banda principal, após coloração com prata, de peso molecular aparente de 73 000. Radioiodou-se o LIF humano original purificado, tal como se descreve no passo 5 do Exemplo 10, e ligou-se especificamente a células murinas Ml e a células da medula óssea do ratinho, tal como se descreve para o I-LIF humano derivado de levedura (passa 5 do Exemplo 11).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Método de purificação de LIF (factor inibidor da leu.

cémia) glicosilado ou não glicosilado, caracterizado por compreender: (a) cromatografar o LIF na forma bruta, numa coluna de permuta aniónica e eluir □ LIF por meio de um gradiente de sal, aumentado, (b) cromatografar o produto do passo (a) numa coluna de afinidade da lectina, tendo a referida lectina urna afinidade por manose e eluir o LIF com um derivado de manose, (c) cromatografar o produto do passo (b) numa coluna de permuta catiónica e eluir □ LIF com um gradiente de sal aumentado, (d) cromatografar o produto do passo (c) sob condições de HPLC numa coluna de fase inversa e eluir o LIF com um gradiente de acetonitrilo aumentado.
2 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o LIF na forma bruta compreender um meio condicionado de células de tumor ascíticas Krebs II e por o LIF murino ser purificado a partir do referido meio.
3 - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o LIF na forma bruta compreender meie condicionado de linha de células 5637 do carcinoma da bexiga, humano, e por se purificar o LIF humano a partir do referido meio.
4 - Método de produção de um polipéptido tendo actividade do LIF, caracterizado por compreender: a) proporcionar células hospedeiras, as quais foram transformadas com urna molécu la de ADN recombinante, b) cultivar as referidas células sob condições conducentes à expressão de um polipéptido possuindo actividade de LIF; e c) recuperar o referido polipéptido.
5 - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o referido polipéptido compreender um polipéptido maduro que é pelo menos parcialmente homólogo à sequência de aminoáci dos seleccionada do grupo que consiste em: