KR20250081554A

KR20250081554A - 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자, 이를 포함하는 피하투여용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20250081554A
Application number: KR1020230170005A
Authority: KR
Inventors: 박영환; 정재훈; 고보성
Original assignee: 주식회사 에스엔바이오사이언스
Priority date: 2023-11-29
Filing date: 2023-11-29
Publication date: 2025-06-05
Also published as: WO2025116530A1

Abstract

본 발명은 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자, 이를 포함하는 피하투여용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법을 이용하는 경우 입도분포 유지 안정성이 우수한 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있고, 제조된 나노입자는 피하주사에 적합한 약제학적 조성물로 제조될 수 있어, 투여용량의 증진 및 투약의 편이성이 개선된다.

Description

시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자, 이를 포함하는 피하투여용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법 {Nanoparticles comprising sirolimus and albumin, pharmaceutical composition for subcutaneous administration, and method for preparing the same}

본 발명은 경기도와 경기도경제과학진흥원의 '2023년 글로벌 스타트업 사업화지원사업'의 지원으로 출원된 결과이다.

본 발명은 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자, 이를 포함하는 피하투여용 약제학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

시롤리무스(sirolimus)는 mTOR (mammalian target of rapamycin)라 불리는 라파마이신의 포유류 타겟 단백질은 세포 내 신호전달의 중앙 역할을 하는 보존된 세린/트레오닌 키나아제이다. mTOR 경로 활성화는 세포 증식 및 생존과 연관되고 mTOR 신호전달의 억제는 염증 및 세포 사멸로 이어진다. mTOR 신호전달 경로의 조절이상은 암 및 자가면역 장애를 포함하는 인간 질환에 관련되어 있기 때문에 sirolimus와 같은 mTOR 억제제를 사용하여 고형 종양, 혈액 악성종양, 기관 이식, 재협착 및 류마티스 관절염을 치료하는데 폭 넓은 용도로 사용된다. Rapamycin이라는 이명을 갖는 시롤리무스는 라파뮨정이라는 제품으로 시판되고 있으며 신장이식 환자에서의 장기 거부반응 예방, 림프관평활근종증 환자의 치료에 사용되고 있다. 난용성 약물이기 때문에 생체이용율(Biovailability, BA)는 14%로 매우 낮은 편이며 정제와 정맥주사용 액상제형으로 개발되었다. 그러나 정맥주사 제형의 경우 투여에 소요되는 시간이 적게는 30분, 많게는 60 내지 24시간이 걸리므로 환자의 순응도가 낮은 문제가 있으며, 초기의 혈중 농도가 높아 부작용의 강도가 높다는 단점이 있다.

본 발명자들은 상기 언급한 문제점을 해결한 시롤리무스의 나노입자 제형을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 시롤리무스에 알부민을 결합하고, 히알루로니다제를 첨가하여 나노입자를 제조할 경우, 수율이 높으면서도 수성 용매에 재구성시 나노입자의 크기가 급변하지 않으며, 피하주사에도 적합함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시롤리무스, 알부민, 및 히알루로니다제를 포함하는 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 나노입자를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법을 제공한다:

(a) 시롤리무스가 5 내지 75 w/v%로 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;

(b) 알부민이 5 내지 30 w/v%로 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;

(c) 부피비가 1: 5 내지 1: 70인 제1 용액과 제2 용액을 혼합 및 교반하는 단계; 및

(d) 단계 (c)를 거친 용액의 부피 기준 2 내지 10배량의 수성 용매로 희석하는 단계.

본 명세서에서 사용된 수치한정, 예를 들어 범위를 포함한, 온도, 시간, 압력, 양, 농도 등에 사용되는 용어 "약(about)"은 (+) 또는 (-) 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 사이의 범위 또는 특정 수치를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "나노입자"는 1 μm 미만의 입도 크기(dimension)를 갖는 입자를 의미한다. 본 발명의 나노입자가 정맥 내 주사를 위한 것일 경우, 상기 나노입자는 500 nm 이하의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 나노입자는 50-500 nm, 50-400 nm, 50-300 nm, 50-200 nm, 50-190 nm, 50-180 nm, 50-170 nm, 50-160 nm, 50-150 nm, 80-500 nm, 80-400 nm, 80-300 nm, 80-200 nm, 80-190 nm, 80-180 nm, 80-170 nm, 80-160 nm, 80-150 nm, 100-500 nm, 100-400 nm, 100-300 nm, 100-200 nm, 100-190 nm, 100-180 nm, 100-170 nm, 100-160 nm, 100-150 nm, 110-500 nm, 110-400 nm, 110-300 nm, 110-200 nm, 110-190 nm, 110-180 nm, 110-170 nm, 110-160 nm, 또는 110-150 nm의 크기를 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1용액의 시롤리무스의 농도는 예를 들어, 5 내지 75%(w/v), 5 내지 70%, 5 내지 65%, 5 내지 60 %(w/v), 5 내지 55 %(w/v), 5 내지 50 %(w/v), 5 내지 45 %(w/v), 5 내지 40 %(w/v), 5 내지 35 %(w/v), 5 내지 30 %(w/v), 5 내지 25 %(w/v), 5 내지 20 %(w/v), 5 내지 15 %(w/v), 5 내지 10 %(w/v), 10 내지 75 %(w/v), 15 내지 75 %(w/v), 20 내지 75 %(w/v), 25 내지 75 %(w/v), 30 내지 75 %(w/v), 35 내지 75 %(w/v), 40 내지 75 %(w/v), 45 내지 75 %(w/v), 50 내지 75 %(w/v), 55 내지 75 %(w/v), 60 내지 75%(w/v), 65 내지 75%(w/v), 70 내지 75%(w/v), 10 내지 65 %(w/v), 15 내지 60 %(w/v), 20 내지 55 %(w/v), 또는 25 내지 50 %(w/v), 30 내지 45%(w/v)일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 10 내지 60% 일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1 용액의 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜, 부탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1 용액의 시롤리무스의 농도가 본 발명에서 정의한 5 내지 75 %(w/v) 범위의 하한값 미만일 경우 물 희석 단계를 수행하여도 재수화시의 평균 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다.

또한, 제1 용액의 시롤리무스의 농도가 본 발명에서 정의한 5 내지 75 %(w/v) 범위의 상한값 초과일 경우 나노입자 제조과정에서 시롤리무스가 석출되어 고압 균질화기의 정상적인 작업이 불가능하고, 나노입자의 입자도도 증가하여 75 %(w/v) 농도 초과로는 균일한 입도의 나노입자를 생산할 수 없는 문제가 발생한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제2용액의 알부민의 농도는 예를들어, 5 내지 30 %(w/v), 5 내지 25 %(w/v), 5 내지 20 %(w/v), 5 내지 15 %(w/v), 5 내지 10 %(w/v), 10 내지 30 %(w/v), 15 내지 30 %(w/v), 20 내지 30 %(w/v), 25 내지 30 %(w/v), 10 내지 25 %(w/v), 15 내지 20 %(w/v) 일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제2 용액의 용매는 물, 증류수, 멸균수, 인산완충식염수(PBS), 메탄올, 정제수, 에탄올, 1-프로판 올, 2-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌 글라이콜, 아세톤, 2-부타논, 4-메틸-2-프로파논, 클로로포름 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수성용매이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 제2 용액 알부민 농도가 본 발명에서 정의한 5 내지 30 %(w/v) 범위의 하한값 미만일 경우, 최종 제조되는 나노입자에서 분산액의 부피가 과도하게 증가하게 되고 이에 따라 낮은 함량으로 인해 충전량이 상업적으로 생산하기 불가능한 정도로 많아지게 된다. 결과적으로 통상적인 충전 부피 범위가 벗어나기 때문에, 농축 공정이 추가로 요구되어 경제성 및 효율성이 낮아지는 문제가 생긴다. 또한, 제2 용액의 알부민 농도가 본 발명에서 정의한 5 내지 30 %(w/v) 범위의 상한값 초과일 경우, 물 희석 단계를 수행하여도 재수화시의 평균 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다.

상기 시롤리무스가 용해된 제1 용액과 알부민이 용해된 제2 용액의 부피비는 1: 5 내지 1: 70일 수 있다. 예를 들어, 제1 용액과 제2 용액의 부피비는 1: 5 내지 1: 70, 1: 5 내지 1: 65, 1: 5 내지 1: 60, 1: 5 내지 1: 55, 1: 5 내지 1: 50, 1: 5 내지 1: 45, 1: 5 내지 1: 40, 1: 5 내지 1: 35, 1: 5 내지 1: 30, 1: 5 내지 1: 25, 1: 5 내지 1: 20, 1: 5 내지 1: 15, 1: 5 내지 1: 10, 1: 10 내지 1: 70, 1: 15 내지 1: 70, 1: 20 내지 1: 70, 1: 25 내지 1: 70, 1: 30 내지 1: 70, 1: 35 내지 1: 70, 1: 40 내지 1: 70, 1: 45 내지 1: 70, 1: 50 내지 1: 70, 1: 55 내지 1: 70, 1: 60 내지 1: 70, 1: 65 내지 1: 70, 1: 10 내지 1: 65, 1: 15 내지 1: 60, 1: 20 내지 1: 55, 1: 25 내지 1: 50, 또는 1: 30 내지 1: 45 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

최종 제조되는 나노입자의 반응성 및 안정성을 고려하여 시롤리무스:알부민의 중량비가 1:5 내지 1:20이 되도록 상기 제1 용액과 제2용액의 부피비를 적절하게 채택할 수 있다. 예를 들면, 상기 시롤리무스:알부민의 중량비는 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:18, 1:5 내지 1:16, 1:5 내지 1:14, 1:5 내지 1:12, 1:5 내지 1:10, 1:5 내지 1:8, 1:7 내지 1:20, 1:9 내지 1:20, 1:11 내지 1:20, 1:13 내지 1:20, 1:15 내지 1:20, 1:17 내지 1:20, 1:6 내지 1:17, 1:6.5 내지 1:14, 1:7 내지 1:11, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20, 1:5 내지 1:20,일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (d) 단계의 희석은 현탁액의 부피 기준 2 내지 12배량, 2 내지 10 배량, 2 내지 8배량, 2 내지 6배량, 2 내지 4배량, 4 내지 12배량, 6 내지 12배량, 8 내지 12배량, 10 내지 12배량, 4 내지 10배량, 6 내지 8배량으로 희석될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 2 내지 10배량 일 수 있다.

희석에 사용되는 수성용매의 사용 배량이 본 발명에서 정의한 2 내지 10배 범위의 하한값 미만일 경우 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다. 상기 입자크기의 증가는 나노입자 간의 응집(agglomeration)에 의한 것일 수 있다. 나노입자가 응집되면 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물의 효능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 이에 따라, 응집물을 제거하는 공정을 필요로 하게 되며 이는 곧 수율 감소로 이어지기 때문에, 경제성 및 효율성이 감소하게 된다.

또한, 수성용매의 사용 배량이 본 발명에서 정의한 2 내지 10배 범위의 상한값 초과일 경우 시롤리무스의 미봉입율이 증가할 뿐만 아니라, 나노입자 입도 안정화에 필요 이상의 물을 사용하므로 스케일업 공정 측면에서 효율적 및 경제적이지 못한 문제가 발생한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (d) 단계는 1 내지 40℃의 온도 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 1 내지 40℃, 1 내지 35℃, 1 내지 30℃, 1 내지 25℃, 1 내지 20℃, 1 내지 15℃, 1 내지 10℃, 1 내지 5℃, 5 내지 40℃, 10 내지 40℃, 15 내지 40℃, 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 30 내지 40℃, 35 내지 40℃, 5 내지 35℃, 10 내지 30℃ 또는 15 내지 25℃일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 (e) 상기 희석된 용액을 감압 건조하여 유기용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 건조가 감압건조인 경우, 회전증발기(Rotary evaporator)를 사용하는 등 통상적인 감압 건조 방법을 채택하여 수행할 수 있으며, 특정 감압 건조 조건에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 감압 건조는 10 내지 70℃, 20 내지 70℃, 30 내지 70℃, 40 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 10 내지 40℃, 20 내지 60℃, 30 내지 50℃, 35 내지 45℃, 38 내지 42℃, 또는 39 내지 41℃ 범위의 온도 조건 하에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 감압 건조는 10 내지 110 hPa, 20 내지 110 hPa, 30 내지 110 hPa, 40 내지 110 hPa, 50 내지 110 hPa, 10 내지 100 hPa, 10 내지 90 hPa, 10 내지 80 hPa, 10 내지 70 hPa, 20 내지 100 hPa, 30 내지 90 hPa, 40 내지 80 hPa, 50 내지 70 hPa, 또는 55 내지 65 hPa 범위의 압력조건 하에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 100 내지 200 nm, 바람직하게는 110 내지 190 nm를 유지할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 60 내지 200 nm를 유지하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 70 내지 190 nm를 유지하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시롤리무스는 알부민과 결합도가 80% 이상인 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 알부민은 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin), 난알부민(OVA, ovalbumin), 재조합알부민(rHSA, recombinant human serum albumin), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c) 제1 용액과 제2 용액을 혼합 및 교반하는 단계는, 고압 균질화 과정을 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 고압 균질화는 5,000 내지 30,000 psi의 압력조건하에서 수행되는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 고압 균질화는 10,000 내지 30,000 psi, 12,000 내지 30,000 psi, 15,000 내지 30,000 psi, 16,000 내지 30,000 psi, 17,000 내지 30,000 psi, 18,000 내지 30,000 psi, 10,000 내지 25,000 psi, 12,000 내지 25,000 psi, 15,000 내지 25,000 psi, 16,000 내지 25,000 psi, 17,000 내지 25,000 psi, 18,000 내지 25,000 psi, 10,000 내지 20,000 psi, 12,000 내지 20,000 psi, 15,000 내지 20,000 psi, 16,000 내지 20,000 psi, 17,000 내지 20,000 psi, 또는 18,000 내지 20,000 psi 조건에서 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 고압 균질화는 1회 이상, 보다 구체적으로 1회 내지 5회, 1회 내지 4회, 또는 1회 내지 3회 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 (f) 단계 (e)를 거친 용액을 여과 및 건조하여 나노입자를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동결건조는 건조 대상 물질인 나노입자를 동결시키고, 그 후 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해 제거되는 과정을 의미한다. 상기 동결건조 과정에는 동결건조된 제품의 보관 안정성을 강화하기 위하여 선택적으로 부형제 또는 동결건조 보호제가 포함될 수 있다.

상기 부형제 또는 동결건조 보호제는 폴리머, 예컨대 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜; 당류, 예컨대, 만니톨, 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 및 락토오스; 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트; 및 아미노산, 예컨대, 글리신, 아르기닌, 및 세린을 포함하고, 바람직하게는 만니톨, 수크로오스, 또는 트레할로스이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동결건조 공정에는 히알루로니다제(hyaluronidase)가 첨가된다.

본 발명에서, 용어 '히알루로니다제(hyaluronidase)'는 세포외기질의 주 성분인 히알루론산(hyaluronic acid)을 분해할 수 있는 효소이며 반감기는 2분으로 매우 짧지만 지속 효과는 24 - 48h로 길기 때문에 피하주사 시 약물 투여 용량을 늘려주고 흡수에 도움을 준다. 상기 히알루로니다제는 포유류, 박테리아, 거머리 및 기타 기생충에서 유래된다. 이러한 hyaluronidase의 종류 중 하나로 포유류에서 유래된 pH20을 들 수 있으며 온전한 인간 유래 pH20의 경우 GPI (glycosylphosphatidylinositol) 앵커로 인해 세포막에 고정되는 특성이 있고 불용성이다. 따라서, 포유류 유래 hyaluronidase는 주로 양, 소 고환 추출물로 액상 혹은 동결건조제로 판매되며 1,500U/ml로 제조되고 있다. 동물 유래이기 때문에 nonhuman protein 등이 섞여 있을 수 있어 면역반응을 일으킬 수 있어, 재조합 인간 히알루로니다제가 사용될 수 있다. 상기 재조합 인간 히알루로니다제는 인간 재조합 유전자로 개량된 형태의 히알루로니다제로서, Genetically engineered Chinese Hamster Ovary (CHO) cells 등 동물세포에서 생산되며 가용성이고 중성 및 산성 pH 활성을 갖기 때문에 범용성이 넓다. 또한 동물 유래 hyaluronidase와 비교하여 100,000 U/mg 이상의 높은 활성 농도로 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 시롤리무스, 알부민, 및 히알루로니다제를 포함하는 나노입자를 제공한다.

상기 본 발명의 일 양태에 따른 나노입자는 상술한 나노입자의 제조방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시롤리무스 및 알부민은 서로 결합된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시롤리무스 및 알부민의 중량비는 1:5 내지 1:20이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 동결건조보호제를 추가적으로 포함하는 것이다. 동결건조 보호제는 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 환자에게 투여되기 위하여 약제학적으로 제제화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 약제학적 조성물은 유효성분인 시롤리무스가 사용되는 암종에 대한 치료용도에 사용될 수 있다. 상기 암종은 예컨대 혈관주위 상피모양세포 종양(PEComa)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제학적 조성물의 제형으로는 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 당해 기술 분야에서 이용 가능하다. 예를 들면, Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.를 참조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 다음 경로 중 하나에 의해 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다: 경구; 비경구, 예컨대 경피, 비강내(intranasal), 근육내, 정맥내, 피하, 피내, 종양내, 등.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 다음과 같은 고체, 액체, 반-고체, 또는 기체 부형제를 포함할 수 있다.

상기 고체 약제학적 부형제는 전분, 셀룰로오스, 탈크(talc), 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루(flour), 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화 나트륨, 건조 탈지유(dried skim milk), 등을 포함한다.

상기 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 및 페트롤리움, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일을 포함한 다양한 오일, 예를 들면, 땅콩유(peanut oil), 대두유, 광유(mineral oil), 참기름 등 으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 액체 담체, 특히, 주사용액용 액체 담체는 물, 염수, 덱스트로오스 수용액(aqueous dextrose), 및 글리콜을 포함한다. 기타 적합한 약제학적 부형제 및 그들의 제형이 E. W. Martin에 의해 편집된 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)에 기재된다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 피하주사를 위하여 제제화될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법을 제공한다. (b) 본 발명은 시롤리무스, 알부민, 및 히알루로니다제를 포함하는 나노입자를 제공한다. (c) 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법을 이용하는 경우 입도분포 유지 안정성이 우수한 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있고, 제조된 나노입자는 피하주사에 적합한 약제학적 조성물로 제조될 수 있어, 투여용량의 증진 및 투약의 편이성이 개선된다.

도 1은 본 발명의 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 약동학적 정보를 확인하기 위하여 정맥 또는 피하주사 후의 혈중 시롤리무스의 농도를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조

시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자를 하기와 같이 제조하였다.

보다 구체적으로, 클로로포름에 시롤리무스 3.17g을 용해시켜, 30% w/v 농도의 시롤리무스 용액(제1 용액)을 준비하였다. 또한, 20% w/v 농도의 알부민 용액을 희석하여 12% 알부민 용액(제2 용액, 녹십자알부민주20%, Greencross Human Serum Albumin Inj.)을 준비하였다. 상기 준비한 제2 용액에 제1 용액을 넣고, 혼합물을 고속균질기 (IKA, 독일)에서 5,000 - 10,000rpm으로 5분 동안 혼합하였다. 혼합물을 고압균질화기에 옮기고, 5,000 - 15,000 psi 조건에서 2~3 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을, 부피 기준 6 내지 7배량의 물로 희석하였다.

전술한 방법을 동일하게 수행하되, 제1용액 또는 제2용액의 농도, 희석에 사용한 물 사용 배량 조건을 다양하게 변화시키며 나노 입자를 제조하였으며, 실시예 별 구체적인 변수 조건을 하기 표 1에 나타내었다.

조건 별 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조 방법

실시예	제1 용액 농도, w/v %	제2 용액 농도, w/v %	물 사용 배량
1-1	10.0	12.0	6
1-2	20.0
1-3	30.0
1-4	40.0
1-5	50.0
1-6	60.0
2-1	30	5.0	6
2-2		10.0
2-3		15.0
2-4		20.0
2-5		30.0
3-1	30	12.0	4.0
3-2			6.0
3-3			8.0

실시예 2. 공정별 나노입자의 입도 경향

클로로포름에 시롤리무스 4.26 g을 용해시켜, 44% w/v 농도의 시롤리무스 용액(제1 용액)을 준비하였다. 또한, 20% w/v 농도의 알부민 용액을 희석하여 알부민 용액(제2 용액, 녹십자알부민주20%, Greencross Human Serum Albumin Inj.)을 준비하였다. 상기 준비한 제2 용액에 제1 용액을 넣고, 혼합물을 고속균질기 (IKA, 독일)에서 5,000 - 10,000rpm으로 5분 동안 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 고압균질화기에 옮기고, 5,000 - 15,000 psi 조건에서 2~3 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을, 부피 기준 6 내지 7배량의 물로 희석하였다.

희석 후 회전증발기(Rotary evaporator)를 사용해 감압 건조를 진행하며 20 내지 50℃, 30 내지 60 hPa 범위의 압력조건 하에서 유기용매를 제거하였다.

감압건조를 통해 유기용매가 제거된 분산액은 무균여과(0.22um 필터)로 여과한 뒤 vial에 충진하여 동결건조를 진행하였다.

공정별 입도 형성 여부 및 안정성을 확인하기 위해 고압 균질화가 완료된 혼합액을 물로 희석한 액, 감압건조를 진행한 액, 무균여과를 진행한 액, 동결건조 후 재수화한 액의 입도를 측정하였다. 입도의 측정은 Marlvern사의 Zetasizer를 사용했으며, 광산란법(레이저 각도는 90도, 온도는 20℃, 용매는 증류수)을 사용하여 측정하였다.

시롤리무스 및 알부민 나노입자 제조 공정별 입도 결과

공정	Z-average (nm)	PDI	Peak 1 (volume)
고압 균질화가 완료된 혼합액을 물로 희석한 액	151.7	0.140	143.5
감압건조를 진행한 액	154.9	0.132	147.7
무균여과를 진행한 액	146.6	0.117	135.6
동결건조 후 재수화한 액	191.1	0.136	193.0

입도를 측정한 결과, 무균여과 후 동결건조를 진행하면 입도가 크게 증가하는 것을 확인하였다.

이 후 여러 동결건조 샘플을 재수화하여 샘플간 입도 경향 및 편차를 확인하고자 아래 표 3과 같이 입도를 측정하였다.

시롤리무스 및 알부민 나노입자의 동결 건조 후 입도 결과

No.	Z-average (nm)	PDI	Peak 1 (volume)
1	172.0	0.096	171.9
2	186.5	0.126	193.1
3	177.8	0.127	179.0
4	187.2	0.119	190.8
5	186.9	0.129	191.2
6	186.3	0.083	190.8
7	170.1	0.110	168.1
8	176.3	0.123	179.9

동결건조 전 무균여과한 액에 비하여 동결건조 후 재수화한 액에서의 나노입자의 입도는 30 nm 내지 50 nm가량 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 동시에 진행된 동결건조 샘플 간에도 편차가 확인되었다.

실시예 3. 동결건조보호제를 혼합한 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 제조

클로로포름에 시롤리무스를 용해시킨 시롤리무스 용액(제1 용액) 알부민 용액(제2 용액)을 고속균질기 (IKA, 독일)에서 5,000 - 10,000rpm으로 5분 동안 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 고압균질화기에 옮기고, 5,000 - 15,000 psi 조건에서 2 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을 물로 희석하였다.

희석 후 회전증발기(Rotary evaporator)를 사용해 감압 건조를 진행하며 유기용매를 제거하였다.

감압건조를 통해 유기용매가 제거된 분산액은 무균여과한 뒤 동결건조 보호제인 만니톨, 수크로스, 트레할로스를 2 내지 10% w/v 농도로 녹인 후 유리 vial에 충진하여 동결건조를 진행하였다.

무균여과를 진행한 액의 입도를 측정하고 동결건조보호제의 유무에 따른 동결건조 샘플의 입도를 측정하였다.

동결건조보호제의 유무에 따른 동결건조 샘플의 입도 결과

항목	Z-average (nm)	PDI	Peak 1 (volume)
무균여과를 진행한 액	166.9	0.125	165.5
동결건조 보호제가 없음	191.0	0.125	201.7
만니톨 2%	167.7	0.125	162.5
만니톨 5%	165.2	0.148	159.9
만니톨 10%	166.2	0.112	162.5
수크로스 2%	169.7	0.134	165.3
수크로스 5%	167.5	0.122	162.6
수크로스 10%	167.3	0.125	161.6
트레할로스 2%	171.0	0.115	170.0
트레할로스 5%	167.0	0.101	164.3
트레할로스 10%	168.1	0.102	165.9

측정 결과 수크로스와 트레할로스 2% 농도를 제외하고 동결건조보호제를 혼합 시 입도 증가 경향이 보이지 않았음을 확인하였다.

실시예 4. 동결건조보호제와 히알루로니다제를 혼합한 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 제조

시롤리무스, 알부민, 및 히알루로니다제를 포함하는 나노입자를 하기와 같이 제조하였다.

보다 구체적으로, 클로로포름 4.3%에 시롤리무스 3.17 g을 용해시켜, 30% w/v 농도의 시롤리무스 용액(제1 용액)을 준비하였다. 또한, 20% w/v 농도의 알부민 용액을 희석하여 12% 알부민 용액(제2 용액, 녹십자알부민주20%, Greencross Human Serum Albumin Inj.)을 준비하였다. 상기 준비한 제2 용액에 제1 용액을 넣고, 혼합물을 고속균질기 (IKA, 독일)에서 5,000 - 10,000rpm으로 5분 동안 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 고압균질화기에 옮기고, 5,000 - 15,000 psi 조건에서 2~3 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을, 부피 기준 6 내지 7배량의 물로 희석하였다.

희석 후 회전증발기(Rotary evaporator)를 사용해 감압 건조를 진행하며 20 내지 50℃, 30 내지 60 hPa 범위의 압력조건 하에서 유기용매를 제거한다.

감압건조를 통해 유기용매가 제거된 분산액은 무균여과한 뒤 동결건조보호제 (만니톨, 수크로스, 트레할로스) 3 내지 10 % w/v 농도와 함께 용해 후 vial에 충진한다. 해당 vial에 동물유래 히알루로니다제를 2000U/ml(vial 당 10,000U), 4000U/ml(vial당 20,000U) 등 농도로 투여하여 동결건조를 진행한다.

동결건조보호제와 히알루로니다제 유무에 따른 동결건조 샘플의 입도 결과

항목	Z-average (nm)	PDI	Peak 1 (volume)
Mannitol 미첨가 Hyaluoronidase 미첨가	117.3	0.155	96.3
Mannitol 5%,Hyaluronidase 미첨가	107.3	0.104	94.6
Mannitol 5%, Hyaluronidase 2000U/ml	131.7	0.157	115.0
Mannitol 5%, Hyaluronidase 4000U/ml	110.8	0.132	95.1

상기 나타낸 바와 같이, 동결건조 보호제인 만니톨을 사용하지 않을 경우 동결건조 후 입도가 급격하게 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 히알루로니다제의 경우 2000 U/ml 보다 더 높은 4000 U/ml의 농도일 때 동결건조 후의 입도가 더 작게 유지되는 것을 확인하였다.

실시예 5. 동결건조보호제와 히알루로니다제를 혼합한 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 약동학 실험

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 제조한 바와 같은 방법으로 동결건조보호제(만니톨 5%)와 히알루로니다제(0, 2000, 4000 U/ml)를 포함하는 알부민을 나노입자를 제조하고 이들의 투여 경로에 따른 약동학시험을 하기와 같이 수행하였다.

본 발명의 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 PK 실험 정보

그룹 (n)	약물 농도		약물 용량 (Sirolimus, mg/kg)	약물 투여량 (mL/kg)	투여 경로
	Sirolimus (mg/mL)	Hyaluronidase (U/mL)
G1 (3)	2	0	2	1	정맥주사(IV)
G2 (3)					피하주사 (SC)
G3 (3)		2,000
G4 (3)		4,000

그룹 1의 경우 SD 랫트에 정맥내 주사를 수행한 반면, 그룹 2 내지 SD 랫트에 4는 피하주사를 수행하였으며, 시간대 별로 채혈을 하여 전혈 내 혈중 시롤리무스의 농도를 측정하였다. 결과는 표 7 및 도 1에 나타내었다.

본 발명의 시롤리무스 및 알부민 나노입자의 그룹별 약동학적 파라미터(평균 값 ± 표준 편차)

약동학파라미터	G1 (IV)	G2 (SC) (hyaluronidase 미투여)	G3 (SC)	G4 (SC)
약동학파라미터	G1 (IV)	G2 (SC) (hyaluronidase 미투여)	Hyaluronidase 저용량	Hyaluronidase 고용량
C ₀ (ng/mL)	235.7 ± 9.2	NA	NA	NA
C _max (ng/mL)	NA	58.9 ± 9.5	110.9 ± 17.7	119.4 ± 32.0
T _max (h)	0.3 ± 0.0	2.7 ± 1.2	1.2 ± 0.8	1.7 ± 0.6
t _1/2 (h)	14.0 ± 1.0	9.4 ± 0.7	11.3 ± 1.1	10.2 ± 1.6
AUC _last (ngh/mL)	660.8 ± 84.7	703.9 ± 83.0	748.9 ± 118.8	790.6 ± 52.7
Relative AUC (%)	100.0	106.5	113.3	119.6
Relative C _max (ng/mL)	NA	100.0	188.4	202.9

상기 표 7 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 동일 투약량 대비 투여 경로 차이에 따른 약물 노출 정도는 Relative AUC로 G2(피하주사)가 G1(정맥주사)에 비해 6.5%가 증가하였으며, 동일 투약량 및 투여 경로 대비 hyaluronidase 첨가량에 따른 약물 노출 정도는 Relative AUC로 G3(hyaluronidase포함)가 G2(hyaluronidase불포함)에 비하여 6.8%, G4(hyaluronidase 고용량 포함)는 G2에 비하여 13.1%가 증가하였다. 이는 Herceptin hylecta의 데이터와 비교하여 조금 다른 경향을 보였다. 'NDA/BLA Multi-Disciplinary Review and Evaluation (761106)'에 따르면 Herceptin hylecta의 경우 hyaluronidase를 사용하지 않은 제형에 비해 Tmax가 당겨지고 (24-29h vs 67h) Cmax나 AUC에는 큰 영향이 없다고 설명되어 있다. 그러나, 본 발명의 실시예에서 확연하게 확인할 수 있는 점은 Hyaluronidase를 혼합한 본 발명의 나노입자의 경우 Tmax가 당겨지고 Cmax 및 AUC가 증가하며 IV에 비해 초기 burst 형태의 그래프가 서서히 방출되는 그래프 양상을 보인다는 점이었다.

따라서, 상기 결과로부터, hyaluronidase를 사용 시 그렇지 않은 경우와 비교하여 상대적으로 생체이용율을 더욱 증가시킬 수 있으며, 기존 IV 투여 경로 대비 Cmax가 현저히 낮으므로 약물이상반응을 줄일 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 결과등을 종합적으로 고려할 때, 투약 편의성과 환자 순응도가 높은 피하주사제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

다음 단계를 포함하는, 시롤리무스 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법:
(a) 시롤리무스가 5 내지 75 w/v%로 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
(b) 알부민이 5 내지 30 w/v%로 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;
(c) 부피비가 1: 5 내지 1: 70인 제1 용액과 제2 용액을 혼합 및 교반하는 단계; 및
(d) 단계 (c)를 거친 용액의 부피 기준 2 내지 10배량의 수성 용매로 희석하는 단계.
제1항에 있어서, (e) 상기 희석된 용액을 감압 건조하여 유기용매를 제거하는 단계를 추가적으로 포함하는, 나노입자 제조방법.
제2항에 있어서, (f) 단계 (e)를 거친 용액을 여과 및 건조하여 나노입자를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하는, 나노입자 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 건조는 동결건조이고, 동결건조 공정에는 동결건조 보호제가 첨가되는 것인, 나노입자 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 동결건조 공정에는 히알루로니다제(hyaluronidase)가 첨가되는 것인, 나노입자 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 알부민은 인간혈청알부민(HSA, human serum albumin), 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin), 난알부민(OVA, ovalbumin), 재조합알부민(rHSA, recombinant human serum albumin), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 나노입자 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 제1 용액과 제2 용액을 혼합 및 교반하는 단계는, 고압 균질화 과정을 포함하는 것인, 나노입자 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 고압 균질화는 5,000 내지 30,000 psi의 압력조건 하에서 수행되는 것인, 나노입자 제조방법.
시롤리무스, 알부민, 및 히알루로니다제를 포함하는 나노입자.
제10항에 있어서, 상기 시롤리무스 및 알부민은 서로 정전기적으로 결합된 것인, 나노입자.
제10항에 있어서, 상기 시롤리무스 및 알부민의 중량비는 1:5 내지 1:20인, 나노입자.
제10항에 있어서, 동결건조보호제를 추가적으로 포함하는 것인, 나노입자.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 나노입자를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 피하투여 제형인, 암 치료용 내지 면역억제제 목적인 약제학적 조성물.