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KR20250074353A - Novel antibody-drug conjugate having a high DAR, preparation method therefor, and use thereof - Google Patents

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KR20250074353A KR1020230161296A KR20230161296A KR20250074353A KR 20250074353 A KR20250074353 A KR 20250074353A KR 1020230161296 A KR1020230161296 A KR 1020230161296A KR 20230161296 A KR20230161296 A KR 20230161296A KR 20250074353 A KR20250074353 A KR 20250074353A
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Abstract

본 발명은 신규한 항체-약물 중합체, 이의 제조방법 및 이를 유효 성분으로 함유하는 암 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 ADC는 높은 DAR을 갖는 유용한 효과가 있다.The present invention provides a novel antibody-drug polymer, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient for treating cancer. The ADC of the present invention has a useful effect of having a high DAR.

Description

높은 DAR를 갖는 신규한 항체-약물 중합체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Novel antibody-drug conjugate having a high DAR, preparation method therefor, and use thereof}{Novel antibody-drug conjugate having a high DAR, preparation method therefor, and use thereof}

본 발명은 신규한 항체-약물 중합체, 이의 제조방법 및 이를 유효 성분으로 함유하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a novel antibody-drug polymer, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient for preventing or treating cancer.

항체-약물 중합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)는 항체의 specificity와 약물의 cytotoxicity를 조합하여 TI를 높인 신약이다. 현재까지 약 10여종의 ADC가 FDA 승인을 받았고, 네이티브 항체(Native antibody)의 사슬간 이황화 결합(inter-chain disulfide bond)을 환원하여 얻은 cysteine을 이용한 결합을 사용하고 있다. Antibody-Drug Conjugate (ADC) is a new drug that combines the specificity of antibodies and the cytotoxicity of drugs to increase TI. About 10 types of ADC have been approved by the FDA so far, and they use a bond using cysteine obtained by reducing the inter-chain disulfide bond of native antibodies.

Paul Ehrlich의 "마법의 총알"이 도입된 이후 다양한 단일클론항체(mAb) 치료법이 개발되었다. 이러한 mAb는 암 치료를 위해 저분자량 화합물을 효과적으로 대체하여 정확한 표적화라는 놀라운 이점을 제공한다. 항체-약물 접합체(ADC)의 등장은 2000년대 초반 시장에서 주목할만한 이정표였다. 2020년부터 2026년까지 ADC의 전 세계 판매 전망에 따르면 T-DM1(Kadcyla®)과 T-Dxd(Enhertu®)의 시장 점유율은 각각 24억 달러와 62억 달러가 넘는다. 이는 이전에 mAb와 소분자 약물이 지배했던 영역에서 ADC가 현재 입지를 굳히고 있음을 분명히 보여준다.Since the introduction of Paul Ehrlich’s “magic bullet,” a variety of monoclonal antibody (mAb) therapeutics have been developed. These mAbs have effectively replaced small-molecule compounds for cancer therapy, offering the remarkable advantage of precise targeting. The advent of antibody-drug conjugates (ADCs) was a notable milestone in the market in the early 2000s. According to the global sales forecast of ADCs from 2020 to 2026, the market shares of T-DM1 (Kadcyla®) and T-Dxd (Enhertu®) are projected to exceed $2.4 billion and $6.2 billion, respectively. This clearly shows that ADCs are now gaining ground in a space previously dominated by mAbs and small-molecule drugs.

한편, 전이성 유방암은 유방암 중 15-20% 차지하며 50세 이하의 젊은 연령층에서 빈발하며 빠른 암세포 성장, 높은 재발율 및 전이성을 나타내는 예후가 불량한 질환이다.Meanwhile, metastatic breast cancer accounts for 15-20% of breast cancers, occurs frequently in young people under 50 years of age, and is a disease with a poor prognosis that exhibits rapid cancer cell growth, high recurrence rate, and metastasis.

국내 여성 암 1위로 올라선 유방암은 2019년에 환자 수 22만2000여명을 기록, 2015년 대비 약 41.8% 증가한 것으로 나타나 발병률이 가파르게 증가하고 있다. 2019년 사망원인통계 결과 자료에 따르면 국내의 유방암 사망률은 10만명당 5.1명으로 전년대비 6.8%가 증가하였으며 암으로 인한 사망률 중 30대 사망 원인 1위로 나타났다.Breast cancer, which has risen to the top of the list of cancers for women in Korea, recorded approximately 222,000 patients in 2019, an increase of approximately 41.8% compared to 2015, showing a steep increase in incidence. According to the 2019 cause of death statistics, the breast cancer mortality rate in Korea was 5.1 per 100,000 people, an increase of 6.8% compared to the previous year, and it was the number one cause of death for people in their 30s among cancer-related deaths.

유방암의 가장 기본적인 치료는 병변의 외과적인 절제이며, 전이성 유방암 치료의 경우 주로 내분비요법, 항암화학요법, 표적치료제 등이 사용된다. 많은 유방암 환자들이 1차 치료로 내분비요법을 받지만 치료 도중 내성이 생겨 질병이 진행되는 경험을 하며 항암화학요법을 받아야 하는 환자들의 경우 구토, 전신쇠약, 탈모 등의 부작용으로 인해 삶의 질이 더욱 악화될 수밖에 없는 문제가 있다. The most basic treatment for breast cancer is surgical resection of the lesion, and for metastatic breast cancer treatment, endocrine therapy, chemotherapy, and targeted therapy are mainly used. Many breast cancer patients receive endocrine therapy as a first-line treatment, but they experience disease progression due to resistance during treatment, and in the case of patients who must receive chemotherapy, there is a problem that their quality of life inevitably worsens due to side effects such as vomiting, general weakness, and hair loss.

기존 항암제의 경우 끊임없이 분열하는 암세포를 타겟하는 체내에서 증식이 왕성한 다른 신체기관에 심각한 부작용을 일으키기 때문에 암세포의 특정 표적인자만을 타겟으로 하는 표적항암제의 개발이 대두되고 있으며 대표적인 유방암 표적항암제로 허셉틴 (트라스트주맙), 퍼제타 (퍼투주맙), 아바스틴 (베바시주맙) 등이 있다.In the case of existing anticancer drugs, since they target cancer cells that are constantly dividing and cause serious side effects in other organs of the body where proliferation is active, the development of targeted anticancer drugs that target only specific target factors of cancer cells is emerging, and representative breast cancer targeted anticancer drugs include Herceptin (trastuzumab), Perjeta (pertuzumab), and Avastin (bevacizumab).

항암제에 적용되는 항체-약물 중합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)는 기존의 항체 표적항암제가 갖는 내성 및 효능을 극대화하는 방법으로 항체에 질병 치료에 효능을 보이는 화학물질, 독소, 방사성물질, 효소 등을 접합(conjugation)시키는 기술이다.Antibody-Drug Conjugate (ADC) applied to anticancer drugs is a technology that conjugates chemicals, toxins, radioactive substances, enzymes, etc. that are effective in treating diseases to antibodies as a way to maximize the resistance and efficacy of existing antibody-targeted anticancer drugs.

현재 전이성 유방암을 적응증으로 하는 항체-약물 중합체로는 2013년 FDA 승인을 받은 캐싸일라 (트라스트주맙 엠탄신)을 비롯하여 엔허투 (라스트주맙 데룩스테칸), 트로델비 (사시투주맙 고비테칸)가 있다. Current antibody-drug conjugates indicated for the treatment of metastatic breast cancer include Kadcyla (trastuzumab emtansine), which was approved by the FDA in 2013, Enhertu (lastuzumab deruxtecan), and Trodelvy (sasituzumab govitecan).

기존 항체-약물 중합체에 사용되는 약물은 대부분 Maytansinoid 계열의 DM1이나 Auristatin 계열의 MMAE 등 DNA 절단이나 미세소관 저해에 관여하는 독성이 강한 물질인데, 항체와 약물을 연결하는 링커는 불안정하고, 약물-항체의 비율(DAR)이 일정하지 않아 혈중 내 흡수율은 낮아지고 혈중에 노출되는 시간이 길어져 세포독성의 문제가 발생할 수 있다. Most of the drugs used in existing antibody-drug polymers are highly toxic substances that are involved in DNA cleavage or microtubule inhibition, such as DM1 of the maytansinoid series or MMAE of the auristatin series. However, the linker connecting the antibody and the drug is unstable and the drug-antibody ratio (DAR) is not constant, so the absorption rate in the blood is low and the exposure time in the blood is long, which may cause cytotoxicity problems.

최근 새롭게 허가받은 엔허투와 트로델비가 상대적으로 독성이 낮은 약물을 사용하고 있으나 여전히 보다 안정적이고 독성 부작용이 적은 새로운 항체-약물 접합 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.Although the recently approved Enhertu and Trodelvy use relatively less toxic drugs, there is still a need for the development of new antibody-drug conjugate anticancer agents that are more stable and have fewer toxic side effects.

의약품으로써 정확한 효능을 나타내기 위해서는 항상 일정한 비율로 항체와 약물이 결합되는 것이 중요하다. 또한 결합된 약물의 개수는 ADC의 in vivo 약동학적 특성(pharmacokinetic properties)에도 영향을 준다. In order to exhibit accurate efficacy as a pharmaceutical, it is important that the antibody and drug are always combined at a constant ratio. In addition, the number of drugs combined also affects the in vivo pharmacokinetic properties of the ADC.

현재 FDA 승인된 ADC 중 HER2 포지티브(positive) BC를 타겟하는 약물은 Kadcyla(T-DM1), Enhertu 두 종류로 알려져 있다. 두 ADC 모두 anti-HER2 positive BC IgG1인 Trastuzumab을 사용하였고, 항체의 사슬간 이황화 결합(inter-chain disulfide bond)과 결합하는 링커 말단 작용기로 maleimide를 사용한다. Among the currently FDA-approved ADCs, two drugs are known to target HER2 positive BC: Kadcyla (T-DM1) and Enhertu. Both ADCs use Trastuzumab, an anti-HER2 positive BC IgG1, and use maleimide as a linker terminal functional group that binds to the inter-chain disulfide bond of the antibody.

엔허투(Enhertu)는 데룩스테칸(Deruxtecan)을 약물로 사용했으며 DAR가 약 7.7로 비교적 균일성(Homogeneity)를 높였으나 여전히 헤테로지니어스(Heterogeneous)하다. Enhertu uses deruxtecan as the drug and has a DAR of approximately 7.7, which is relatively homogeneous, but is still heterogeneous.

캐사일라(Kadcyla®)는 튜불린 억제제 약물 DM1이 트라스트주맙의 라이신 잔기를 통해 비절단 링커인 SMCC 링커와 결합된 DAR ~3.5의 ADC이다. 고형 종양(유방암)에 대해 최초로 승인된 ADC인 Kadcyla®는 지난 몇 년간 블록버스터 약물로 성장했다. Kadcyla®의 페이로드인 DM1은 치료 지수(TI) 범위가 좁아 환자에게 단독으로 사용하기 어렵다. 그러나 상대적으로 용해도가 좋고 안정성이 높으며 효능이 뛰어난 약물인 DM1은 ADC 개발에 매우 적합한 약물이기도 하다. Kadcyla® is an ADC with a DAR of ~3.5, in which a tubulin inhibitor drug DM1 is conjugated to a non-cleavable linker, SMCC linker, via the lysine residue of trastuzumab. Kadcyla®, the first ADC approved for solid tumors (breast cancer), has grown into a blockbuster drug in the past few years. The payload of Kadcyla®, DM1, has a narrow therapeutic index (TI) range, making it difficult to use alone in patients. However, DM1, a drug with relatively good solubility, high stability, and excellent efficacy, is also a very suitable drug for ADC development.

Kadcyla®의 항체인 트라스트주맙(trastuzumab)은 HER2를 표적으로 하는 재조합 단클론 항체이다. 트라스트주맙의 표적인 HER2 단백질은 유방암, 위암, 대장암, 난소암, 폐암, 두경부암 등 다양한 암 유형에서 과발현된다. Kadcyla® 이후 많은 HER2 표적 ADC가 개발되었으며 현재까지 HER2가 ADC 표적의 상당 부분을 차지하고 있다. Trastuzumab, the antibody of Kadcyla®, is a recombinant monoclonal antibody targeting HER2. The target of trastuzumab, HER2 protein, is overexpressed in various cancer types, including breast cancer, stomach cancer, colon cancer, ovarian cancer, lung cancer, and head and neck cancer. Since Kadcyla®, many HER2-targeting ADCs have been developed, and HER2 currently accounts for a significant portion of ADC targets.

기존에는 사슬간 이황화 결합(inter-chain disulfide bond)를 환원하여 합성한 ADC는 DAR의 적정값이 2~4로 알려져 있었는데, 이는 DAR가 높을 수록 효능(efficacy)이 좋음에도 PK값(PK property)에서 약점을 보일 수 있기 때문이다. 그러나 ADC의 높은 DAR를 유지하면서 독성과 안정성을 컨트롤할 수 있다면 DAR는 높고 균일할 수록 좋은 ADC로 평가 받을 수 있다.Previously, ADC synthesized by reducing inter-chain disulfide bonds was known to have an optimal DAR value of 2 to 4. This is because a higher DAR may show weakness in PK properties even though the efficacy is better. However, if the ADC can maintain a high DAR while controlling toxicity and stability, the higher and more uniform the DAR, the better the ADC can be evaluated.

현재 페이로드를 DM1, DM4로 하여 전임상, 임상 진행 중인 ADC약물을 보면 SMCC, SPP (N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트), SPDB (N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부타노에이트) 등을 사용하였으며 페이로드의 말단의 SH와 링커를 연결하고 항체의 라이신 잔기에 연결하는 구조를 취하고 있다.Looking at ADC drugs currently in preclinical and clinical trials with payloads of DM1 and DM4, SMCC, SPP (N-succinimidyl 4-(2-pyridyldithio)pentanoate), SPDB (N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)butanoate) etc. are used, and the structure is to connect the SH at the end of the payload with a linker and then connect it to the lysine residue of the antibody.

위에서 언급한 바와 같이 라이신 잔기의 결합은 비특이적이고 다양한 DAR 생성으로 인한 부작용 및 규제에 대한 이슈 등 다양한 문제점이 발생하기 때문에 DM1을 항체의 시스테인 잔기에 연결하는 전략을 선택하였다.As mentioned above, the conjugation of lysine residues causes various problems such as non-specific and diverse DAR generation-induced side effects and regulatory issues, so we chose the strategy of conjugating DM1 to cysteine residues of antibodies.

숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)는 양쪽에 말레이미드 작용기와 숙신이미드 에스테르 작용기가 존재하는 것을 특징으로 하는 상당한 효능과 단순성을 지닌 링커이다. DM1의 자유 티올에 부착되면 SMCC는 1, 4-첨가를 통해 말레이미드 작용기와 연결을 형성한다. 결과적으로, SMCC-DM1은 항체 표면 라이신의 유리 아민으로 숙신이미드 에스테르를 공격하여 항체에 결합할 것으로 예상된다. IgG1은 약 70~80개의 라이신 잔기가 분포된 표면을 표시하므로 항체 조작 없이도 고유한 이질성을 나타낸다. 이종 ADC는 임상 약동학 평가 중에 여러 가지 취약성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 SMCC-DM1은 간단하고 편리한 합성 접근 방식을 제공하지만 명확한 한계가 존재한다.Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) is a linker with considerable efficiency and simplicity, characterized by the presence of maleimide and succinimide ester functionalities on both sides. Upon attachment to the free thiol of DM1, SMCC forms a linkage with the maleimide functionality via 1, 4-addition. Consequently, SMCC-DM1 is expected to bind to antibodies by attacking the succinimide ester with the free amine of antibody surface lysines. IgG1 displays a surface distributed with approximately 70–80 lysine residues, thereby exhibiting inherent heterogeneity even without antibody engineering. Heterologous ADCs are known to have several vulnerabilities during clinical pharmacokinetic evaluation. Therefore, SMCC-DM1 offers a simple and convenient synthetic approach, but has clear limitations.

이에, 본 발명의 발명자들은 간단한 합성을 통해 SMCC와 유사한 링커를 생성하기 위해 노력한 결과, Kadcyla®에서 검증된 항체-약물(trastuzumab-DM1) 조합을 사용하여 SMCC 링커에 비해 향상된 링커를 활용하는 균일한 ADC를 개발하였다. 구체적으로, DM1을 페이로드로 사용할 때 DM1의 유리 티올과 말레이미드 작용기의 손쉬운 조합을 고려하였다. 트라스트주맙(Trastuzumab)과 DM1 모두에 있는 유리 티올의 존재를 활용하여 양쪽 끝에 말레이미드 작용기를 특징으로 하는 디말레이미드 링커를 고안하였다. 이후 디말레이미드 링커의 길이에 따라 ADC의 안정성과 효능이 달라지는지 확인하기 위한 실험을 실시하였다. Herein, the inventors of the present invention have endeavored to generate a linker similar to SMCC through a simple synthesis, and as a result, developed a homogeneous ADC utilizing an improved linker compared to SMCC linker using the antibody-drug (trastuzumab-DM1) combination validated in Kadcyla®. Specifically, when using DM1 as a payload, the facile combination of free thiol and maleimide functionalities of DM1 was considered. Taking advantage of the presence of free thiols in both trastuzumab and DM1, a dimaleimide linker featuring maleimide functionalities at both ends was designed. Subsequently, experiments were conducted to determine whether the stability and efficacy of the ADC differ depending on the length of the dimaleimide linker.

또한, Kadcyla®보다 더 균일한 ADC를 합성하기 위해 링커 페이로드를 획득된 유리 티올 작용기의 대부분에 접합하기 전에 4개의 사슬 간 이황화 결합을 모두 감소시켰다. 이후, 이렇게 합성된 모든 ADC를 분석한 결과, T-Dxd(Enhertu®)를 연상시키는 8에 가까운 DAR이 나타났으며, 이 새로운 ADC는 DM1을 페이로드로 하면서도, 종래(DAR = 2~4)에 비해 높은 DAR (DAR = 7~8)을 갖고, 굉장히 단순한 합성과정을 통해 만들 수 있으며, 높은 컨주게이션 수율로 높은 DAR을 갖는 ADC를 제공할 수 있음을 확인하였다. Furthermore, to synthesize a more homogeneous ADC than Kadcyla®, all four interchain disulfide bonds were reduced before conjugating the linker payload to most of the obtained free thiol functionalities. Subsequently, all synthesized ADCs were analyzed and showed a DAR close to 8, reminiscent of T-Dxd (Enhertu®), confirming that this novel ADC has a higher DAR (DAR = 7~8) than the conventional one (DAR = 2~4) while carrying DM1 as a payload, can be prepared through a very simple synthetic process, and can provide an ADC with a high DAR and a high conjugation yield.

또한, 전이성 유방암 치료제의 제공을 목적으로 개선된 약효와 낮은 부작용의 신규한 단일 ADC 화합물을 개발하였으며, 본 발명에 따른 신규한 ADC가 in vivo 마우스 모델에서 목적하는 수준의 약효를 나타내며 이로부터 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.In addition, for the purpose of providing a treatment for metastatic breast cancer, a novel single ADC compound with improved efficacy and low side effects was developed, and the novel ADC according to the present invention exhibited the desired level of efficacy in an in vivo mouse model, and it was confirmed that it can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating metastatic breast cancer, thereby completing the present invention.

대한민국 등록특허 제10-2442906호Republic of Korea Patent No. 10-2442906 대한민국 공개특허 제10-2023-0008723호Republic of Korea Publication Patent No. 10-2023-0008723 대한민국 공개특허 제10-2019-0038579호Republic of Korea Publication Patent No. 10-2019-0038579

Chemical Science (2022), 13(10), 2909-2918 Chemical Science (2022), 13(10), 2909-2918 Bioconjugate Chem.　2021, 32, 8, 1525-1534 Bioconjugate Chem.　2021, 32, 8, 1525-1534 Clin Cancer Res　(2004) 10 (20): 7063-7070 Clin Cancer Res (2004) 10 (20): 7063-7070 J. Med. Chem.　2014, 57, 16, 6949-6964 J. Med. Chem.　2014, 57, 16, 6949-6964 Mol. Pharmaceutics 12, 3986-3998 Mol. Pharmaceutics 12, 3986-3998

본 발명은 신규한 항체-약물 중합체(ADC), 이의 제조방법 및 이를 유효 성분으로 함유하는 암 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다. The present invention provides a novel antibody-drug polymer (ADC), a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient for preventing or treating cancer.

이와 같은 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에서는, 하기 화학식(Ⅰ)의 구조식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드-약물 접합체를 제공한다:In one embodiment of the present invention for achieving such a task, a ligand-drug conjugate is provided, characterized by including a structural formula of the following chemical formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

(Ⅰ) (Ⅰ)

여기서, SU는 스페이서 유닛(spacer unit)이고,Here, SU is the spacer unit,

SU1, SU2, 및 SU3는 각각 동일하거나 상이할 수 있으며,SU1, SU2, and SU3 may be the same or different,

a, b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이고,a, b and c are each independently an integer from 0 to 3,

L은 리간드(ligand) 유닛이고,L is the ligand unit,

D는 약물 유닛(Drug Unit)이다.D is Drug Unit.

본 발명의 다른 일 실시예에서는, 상기 리간드-약물 접합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In another embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the ligand-drug conjugate is provided.

본 발명에 따른 신규 ADC 화합물은 간단한 합성 방법에 의해 높은 컨주게이션 수율로 높은 DAR을 갖는 ADC를 제공한다. The novel ADC compound according to the present invention provides an ADC having a high DAR with a high conjugation yield by a simple synthetic method.

특히, 본 발명에 따른 신규 ADC 화합물은 ADCHER2 양성 유방암 세포주 SK-BR3를 이용한 이종이식(Xenograft) 증식 억제 및 세포 사멸 효과가 있는 것으로 확인된 바, 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 전이성 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있는 유용한 효과가 있다.In particular, the novel ADC compound according to the present invention was confirmed to have a xenograft proliferation inhibition and cell death effect using the ADCHER2 positive breast cancer cell line SK-BR3, and thus, a pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient has a useful effect that can be provided as a pharmaceutical composition for preventing or treating metastatic breast cancer.

도 1은 본 발명의 일 실시예(실시예 3)에 따른 ADC 1-5의 접합 방식을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예(실험예 1)에 따른 (a) 트라스트주맙; (b)-(f) 각각 ADC 1-5의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 데이터를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예(실험예 2)에 따른 MS분석 결과로, 경쇄에서 감지된 1개의 링커-페이로드(좌측) 및 중쇄에서 감지된 3개의 링커-페이로드(우측)를 나타내며, (a) 링커-페이로드 2(MW ~972); (b) 링커-페이로드 3(MW ~986); (c) 링커-페이로드 4(MW ~1,000)이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예(실험예 2)에 따른 ADC 2-4의 질량분석 결과; TIC 스펙트럼 및 DAR 계산표를 나타낸다. (a) ADC 2; (b) ADC 3; (c) ADC 4이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예(실험예 3)에 따른 ADC 2-4의 응집체에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스펙트럼으로, (a) ADC 2; (b) ADC 3; (c) ADC 4이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예(실험예 4)에 따른 종양 세포 SK-BR-3에 대한 세포 독성을 비교한 in vitro 테스트 결과로, (a) DM1 및 링커-페이로드 2; (b) 트라스트주맙 및 ADC 2이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예(실험예 5)에 따른 결합 친화도에 대한 ELISA 분석 결과로, 일주일 동안 트라스트주맙, T-Dxd 및 ADC 2의 결합력을 비교한 그래프를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예(실험예 6)에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 링커 및 링커 페이로드의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 각각 (a) 링커 1; (b) 링커-페이로드 1; (c) 링커 2; (d) 링커-페이로드 2; (e) 링커 3; (f) 링커-페이로드 3; (g) 링커 4; (h) 링커-페이로드 4; (i) 링커 5; (j) 링커-페이로드 5이다. Figure 1 shows a connection method of ADC 1-5 according to one embodiment (Embodiment 3) of the present invention.
Figure 2 shows hydrophobic interaction chromatography (HIC) data of (a) trastuzumab; (b)-(f) ADC 1-5, respectively, according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 1).
Figure 3 shows the MS analysis results according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 2), showing one linker-payload detected in the light chain (left) and three linker-payloads detected in the heavy chain (right), namely (a) linker-payload 2 (MW ~972); (b) linker-payload 3 (MW ~986); and (c) linker-payload 4 (MW ~1,000).
Figure 4 shows the mass analysis results of ADC 2-4 according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 2); TIC spectra and DAR calculation table. (a) ADC 2; (b) ADC 3; and (c) ADC 4.
FIG. 5 is a size exclusion chromatography (SEC) spectrum of aggregates of ADC 2-4 according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 3), namely (a) ADC 2; (b) ADC 3; and (c) ADC 4.
Figure 6 shows the results of an in vitro test comparing cytotoxicity against tumor cells SK-BR-3 according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 4): (a) DM1 and linker-payload 2; (b) trastuzumab and ADC 2.
Figure 7 shows a graph comparing the binding affinity of trastuzumab, T-Dxd, and ADC 2 for one week as a result of ELISA analysis for binding affinity according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 5).
Figure 8 shows the results of SDS-PAGE analysis according to one embodiment of the present invention (Experimental Example 6).
FIG. 9 shows 1 H- and 13 C-NMR spectra of linkers and linker payloads of the present invention, respectively: (a) linker 1; (b) linker-payload 1; (c) linker 2; (d) linker-payload 2; (e) linker 3; (f) linker-payload 3; (g) linker 4; (h) linker-payload 4; (i) linker 5; and (j) linker-payload 5.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또한 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in this specification may be used with a meaning that can be commonly understood by a person of ordinary skill in the art to which the present invention belongs. In addition, terms defined in commonly used dictionaries shall not be ideally or excessively interpreted unless explicitly specifically defined.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. As used herein, the singular form may include the plural form unless the context clearly indicates otherwise.

본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. When it is said in this specification that a part “includes” a certain component, this does not exclude other components, but rather may include other components, unless otherwise specifically stated.

또한, 본 명세서에 기재된 구성성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자 및 표현은 특별한 기재가 없는 한 모든 경우에 “약”이라는 용어로써 수식되는 것으로 이해하여야 한다. In addition, all numbers and expressions indicating the amounts of components, reaction conditions, etc. described in this specification should be understood as being modified by the term “about” in all cases unless otherwise specified.

본 명세서에서 “약학적으로 허용 가능”이란 통상의 의약적 복용량으로 이용할 때 상당한 독성 효과를 피함으로써, 동물, 더 구체적으로는 인간에게 사용할 수 있는 정부 또는 이에 준하는 규제 기구의 숭인을 받을 수 있는 것, 약전에 열거되는 것, 또는 기타 일반적인 약전으로 인지되는 것을 의미한다. As used herein, “pharmaceutically acceptable” means that which is approved by a governmental or similar regulatory body for use in animals, and more particularly in humans, by avoiding significant toxic effects when used at typical pharmaceutical doses, is listed in a pharmacopoeia, or is otherwise generally recognized by the pharmacopoeia.

또한, 본 명세서에서 명시된 실험 과정은 특별히 설명되지 않는 이상 그 기술분야에서 통상적으로 수행되는 실험 과정과 동일하다. Additionally, the experimental procedures specified in this specification are identical to the experimental procedures commonly performed in the art unless specifically described.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 측면은 하기 화학식(Ⅰ)의 구조식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드-약물 접합체를 제공한다:One aspect of the present invention provides a ligand-drug conjugate characterized by comprising a structural formula of the following chemical formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

(Ⅰ) (Ⅰ)

여기서, SU는 스페이서 유닛(spacer unit)이고,Here, SU is the spacer unit,

SU1, SU2, 및 SU3는 각각 동일하거나 상이할 수 있으며,SU1, SU2, and SU3 may be the same or different,

a, b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이고,a, b and c are each independently an integer from 0 to 3,

L은 리간드(ligand) 유닛이고,L is the ligand unit,

D는 약물 유닛(Drug Unit)이다.D is Drug Unit.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 SU1, SU2 및 SU3는, 각각 독립적으로In one specific embodiment of the present invention, SU1, SU2 and SU3 are each independently

-(CH2)n-, -C3-6사이클로알킬-, -C3-6사이클로아릴-, -C3-6헤테로아릴- 및 -(CH2CH2O)m-으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있고, -(CH 2 )n-, -C 3-6 cycloalkyl-, -C 3-6 cycloaryl-, -C 3-6 heteroaryl- and -(CH 2 CH 2 O)m- may be selected from the group consisting of

여기에서 n은 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며, Here, n is an integer from 1 to 10, independently.

여기에서 m은 1 내지 10의 정수일 수 있다. Here, m can be an integer from 1 to 10.

본 발명의 일 구체예에서, a, b 및 c는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2일 수 있다.In one specific embodiment of the present invention, a, b and c can each independently be 0, 1 or 2.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리간드는 항체일 수 있으며, 상기 항체는 트라스트주맙(trastuzumab)일 수 있다. In one specific embodiment of the present invention, the ligand may be an antibody, and the antibody may be trastuzumab.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 약물은 DM1일 수 있으며, 링커-약물 접합체는 하기 화학식 (Ⅱ)로 나타내어진다:In one specific embodiment of the present invention, the drug may be DM1, and the linker-drug conjugate is represented by the following chemical formula (II):

(Ⅱ). (Ⅱ).

본 발명의 일 구체예에서, 상기 링커-약물 접합체는 하기 반응식Ⅰ의 과정에 의해 제조될 수 있다.In one specific example of the present invention, the linker-drug conjugate can be prepared by the process of the following reaction scheme I.

[반응식 Ⅰ] [Reaction Formula I]

. .

도 1은 본 발명의 일 실시예(실시예 3)에 따른 ADC 1-5의 접합 방식을 나타낸다. Figure 1 shows a connection method of ADC 1-5 according to one embodiment (Embodiment 3) of the present invention.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리간드-약물 접합체는 5 내지 10의 DAR(Drug-to-Antibody Ratio)을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, DAR = 5 내지 10, 6 내지 10, 7 내지 10, 7 내지 9, 7 내지 8, 보다 구체적으로 8일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In one specific embodiment of the present invention, the ligand-drug conjugate is characterized by having a Drug-to-Antibody Ratio (DAR) of 5 to 10. Specifically, DAR may be, but is not limited to, 5 to 10, 6 to 10, 7 to 10, 7 to 9, 7 to 8, and more specifically 8.

본 발명의 일 측면은 상기 리간드-약물 접합체 조성물을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the ligand-drug conjugate composition.

상기 암은 Her2 발현과 관련된 암으로, 전이성 유방암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The above cancer is a cancer associated with Her2 expression, and may be, but is not limited to, metastatic breast cancer.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples. However, the following examples and experimental examples are only intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<실시예 1> Di-말레이미드 링커의 제조<Example 1> Preparation of Di-maleimide linker

본 발명의 ADC를 제조하기 위하여, 다양한 길이의 디말레이미드 링커를 제조하였다. To manufacture the ADC of the present invention, dimaleimide linkers of various lengths were manufactured.

<1-1> 1,1'-(에탄-1,2-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온): 링커 1<1-1> 1,1'-(ethane-1,2-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione): linker 1

DMF(3ml)에 용해된 말레산 무수물(0.980mg, 10mmol)을 질소 가스가 장착된 화염 건조된 250ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 1,2-에틸렌디아민(0.300mg, 5mmol)을 DMF(0.6ml)에 녹인 후 첨가 깔대기를 이용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합 시 아믹산이 형성되면서 백색의 가닥 모양의 물질이 생성되었으며, 계속 저으면서 재용해시켰다. 이후 아세트산무수물(1.23g, 12mmol)을 첨가하고, 탄산나트륨(0.2g, 무수물)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반한 후 상온으로 냉각시킨 후 침전시키고, 얼음물로 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여 생성물을 얻었다. Maleic anhydride (0.980 mg, 10 mmol) dissolved in DMF (3 ml) was added to a flame-dried 250 ml 3-necked round-bottom flask equipped with nitrogen gas. 1,2-Ethylenediamine (0.300 mg, 5 mmol) dissolved in DMF (0.6 ml) was slowly added using an addition funnel. The reaction mixture was stirred at 60 °C for 1 h. When mixed, amic acid was formed and a white strand-like substance was generated, which was redissolved with continuous stirring. Then, acetic anhydride (1.23 g, 12 mmol) was added, followed by sodium carbonate (0.2 g, anhydrous). The mixture was stirred at 60 °C overnight, cooled to room temperature, precipitated, washed with ice water, and dried in vacuo. The product was obtained by purification by silica column chromatography (hexane: EtOAc = 2:1).

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.66 (4H, s), 3.71 (4H, s); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.64, 134.31, 36.64.Obtained form: White solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.66 (4H, s), 3.71 (4H, s); 13 C NMR (101 MHz, CDCl 3 ) δ 170.64, 134.31, 36.64.

<1-2> 1,1'-(프로판-1,3-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온): 링커 2<1-2> 1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione): linker 2

DMF(3ml)에 용해된 말레산 무수물(0.980mg, 10mmol)을 질소 가스가 장착된 화염 건조된 250ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 1,3-디아미노프로판(0.371mg, 5mmol)을 DMF(0.6ml)에 용해시키고 첨가 깔때기를 사용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합 시 아믹산이 형성되면서 백색의 가닥 모양의 물질이 생성되었으며, 계속 저으면서 재용해시켰다. 이후 아세트산무수물(1.23g, 12mmol)을 첨가하고, 탄산나트륨(0.2g, 무수물)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반한 후 상온으로 냉각시킨 후 침전시키고, 얼음물로 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.Maleic anhydride (0.980 mg, 10 mmol) dissolved in DMF (3 ml) was added to a flame-dried 250 ml 3-necked round-bottom flask equipped with nitrogen gas. 1,3-Diaminopropane (0.371 mg, 5 mmol) was dissolved in DMF (0.6 ml) and slowly added using an addition funnel. The reaction mixture was stirred at 60 °C for 1 h. Upon mixing, amic acid was formed and white strands were generated, which were redissolved with continuous stirring. Acetic anhydride (1.23 g, 12 mmol) was then added, followed by sodium carbonate (0.2 g, anhydrous). The mixture was stirred at 60 °C overnight, cooled to room temperature, precipitated, washed with ice water, and dried in vacuo. The product was purified by silica column chromatography (hexane: EtOAc = 2:1).

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.70 (4H, s), 3.53 (4H, t, J = 7.2 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.74, 134.30, 35.46, 27.55. Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.70 (4H, s), 3.53 (4H, t, J = 7.2 Hz); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 170.74, 134.30, 35.46, 27.55.

<1-3> 1,1'-(부탄-1,4-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온): 링커 3<1-3> 1,1'-(butane-1,4-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione): linker 3

DMF(3ml)에 용해된 말레산 무수물(0.980mg, 10mmol)을 질소 가스가 장착된 화염 건조된 250ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 1,4-디아미노부탄(0.441mg, 5mmol)을 DMF(0.6ml)에 녹인 후 첨가 깔대기를 이용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합 시 아믹산이 형성되면서 백색의 가닥 모양의 물질이 생성되었으며, 계속 저으면서 재용해시켰다. 이후 아세트산무수물(1.23g, 12mmol)을 첨가하고, 탄산나트륨(0.2g, 무수물)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반한 후 상온으로 냉각시킨 후 침전시키고, 얼음물로 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.Maleic anhydride (0.980 mg, 10 mmol) dissolved in DMF (3 ml) was added to a flame-dried 250 ml 3-necked round-bottom flask equipped with nitrogen gas. 1,4-Diaminobutane (0.441 mg, 5 mmol) dissolved in DMF (0.6 ml) was slowly added using an addition funnel. The reaction mixture was stirred at 60 °C for 1 h. Upon mixing, amic acid was formed and a white strand-like substance was generated, which was redissolved with continuous stirring. Then, acetic anhydride (1.23 g, 12 mmol) was added, followed by sodium carbonate (0.2 g, anhydrous). The mixture was stirred at 60 °C overnight, cooled to room temperature, precipitated, washed with ice water, and dried in vacuo. The product was obtained by purification by silica column chromatography (hexane: EtOAc = 2:1).

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.8 (4H, s), 3.53 (4H, t, J = 6.0 Hz), 1.58 (4H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.90, 134.23, 37.28, 25.90.Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.8 (4H, s), 3.53 (4H, t, J = 6.0 Hz), 1.58 (4H, m); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 170.90, 134.23, 37.28, 25.90.

<1-4> 1,1'-(펜탄-1,5-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온): 링커 4<1-4> 1,1'-(pentane-1,5-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione): Linker 4

DMF(3ml)에 용해된 말레산 무수물(0.980mg, 10mmol)을 질소 가스가 장착된 화염 건조된 250ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 1,5-디아미노펜탄(0.511mg, 5mmol)을 DMF(0.6ml)에 녹인 후 첨가 깔때기를 이용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합 시 아믹산이 형성되면서 백색의 가닥 모양의 물질이 생성되었으며, 계속 저으면서 재용해시켰다. 이후 아세트산무수물(1.23g, 12mmol)을 첨가하고, 탄산나트륨(0.2g, 무수물)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반한 후 상온으로 냉각시킨 후 침전시키고, 얼음물로 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.Maleic anhydride (0.980 mg, 10 mmol) dissolved in DMF (3 ml) was added to a flame-dried 250 ml 3-necked round-bottom flask equipped with nitrogen gas. 1,5-Diaminopentane (0.511 mg, 5 mmol) dissolved in DMF (0.6 ml) was slowly added using an addition funnel. The reaction mixture was stirred at 60 °C for 1 h. Upon mixing, amic acid was formed and a white strand-like substance was generated, which was redissolved with continuous stirring. Then, acetic anhydride (1.23 g, 12 mmol) was added, followed by sodium carbonate (0.2 g, anhydrous). The mixture was stirred at 60 °C overnight, cooled to room temperature, precipitated, washed with ice water, and dried in vacuo. The product was obtained by purification by silica column chromatography (hexane: EtOAc = 2:1).

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.68 (4H, s), 3.49 (4H, t, J = 7.2 Hz), 1.60 (4H, m), 1.26 (2H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.95, 134.19, 37.66, 28.15, 23.99. Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.68 (4H, s), 3.49 (4H, t, J = 7.2 Hz), 1.60 (4H, m), 1.26 (2H, m); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 170.95, 134.19, 37.66, 28.15, 23.99.

<1-5> 1,1'-(헥산-1,6-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온): 링커 5<1-5> 1,1'-(hexane-1,6-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione): Linker 5

DMF(3ml)에 용해된 말레산 무수물(0.980mg, 10mmol)을 질소 가스가 장착된 화염 건조된 250ml 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 1,6-디아미노헥산(0.581mg, 5mmol)을 DMF(0.6ml)에 녹인 후 첨가 깔때기를 이용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합 시 아믹산이 형성되면서 백색의 가닥 모양의 물질이 생성되었으며, 계속 저으면서 재용해시켰다. 이후 아세트산무수물(1.23g, 12mmol)을 첨가하고, 탄산나트륨(0.2g, 무수물)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반한 후 상온으로 냉각시킨 후 침전시키고, 얼음물로 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 실리카 컬럼 크로마토그래피(헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.Maleic anhydride (0.980 mg, 10 mmol) dissolved in DMF (3 ml) was added to a flame-dried 250 ml 3-necked round-bottom flask equipped with nitrogen gas. 1,6-Diaminohexane (0.581 mg, 5 mmol) dissolved in DMF (0.6 ml) was slowly added using an addition funnel. The reaction mixture was stirred at 60 °C for 1 h. Upon mixing, amic acid was formed and a white strand-like substance was generated, which was redissolved with continuous stirring. Then, acetic anhydride (1.23 g, 12 mmol) was added, followed by sodium carbonate (0.2 g, anhydrous). The mixture was stirred at 60 °C overnight, cooled to room temperature, precipitated, washed with ice water, and dried in vacuo. The product was purified by silica column chromatography (hexane: EtOAc = 2:1).

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.68 (4H, s), 3.49 (4H, t, J = 7.2 Hz), 1.56 (4H, m), 1.29 (4H, m); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ170.99, 134.16, 37.79, 28.46, 26.28. Obtained form: White solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.68 (4H, s), 3.49 (4H, t, J = 7.2 Hz), 1.56 (4H, m), 1.29 (4H, m); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ) δ 170.99, 134.16, 37.79, 28.46, 26.28.

<실시예 2> 말레이미드 링커와 약물의 접합체의 제조<Example 2> Preparation of a conjugate of a maleimide linker and a drug

DM1과 말레이미드 링커를 1대1~1대2 사이 비율로 넣은 후 트리에틸아민을 1당량 넣고 디클로로메탄에 녹여 상온에서 교반하였다. 반응이 마무리되면 용매를 제거한 후 컬럼크로마토그래피로 정제하여 분석하였다. DM1 and maleimide linker were added in a ratio of 1:1 to 1:2, 1 equivalent of triethylamine was added, dissolved in dichloromethane, and stirred at room temperature. After the reaction was complete, the solvent was removed, and the product was purified by column chromatography and analyzed.

<2-1> 1,1'-(에탄-1,2-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온)-DM1: 링커-페이로드 1<2-1> 1,1'-(ethane-1,2-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione)-DM1: Linker-Payload 1

둥근 바닥 플라스크에 CH2Cl2에 용해된 DM1(100mg, 0.135mmol), 상기 실시예 1-1에서 제조된 링커 1(44.7mg, 0.203mmol) 및 트리에틸아민을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 증류수로 씻어주고 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 모아 회전증발기로 증발시킨 후, 실리카 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:CH3OH=30:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.In a round bottom flask, DM1 (100 mg, 0.135 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 , linker 1 (44.7 mg, 0.203 mmol) prepared in Example 1-1, and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed with distilled water and dried over sodium sulfate. The organic layer was collected, evaporated using a rotary evaporator, and then purified by silica column chromatography (CH 2 Cl 2 :CH 3 OH = 30: 1) to obtain the product.

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 6.79 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 6.64 (t, J = 4.6 Hz, 3H), 6.59 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 15.0, 11.4 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.62 (dd, J = 15.2, 9.1 Hz, 1H), 5.38 - 5.31 (m, 1H), 4.73 (dd, J = 11.9, 2.4 Hz, 1H), 4.24 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.70 - 3.58 (m, 5H), 3.46 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.00 (dddd, J = 34.7, 24.6, 17.7, 8.4 Hz, 6H), 2.80 (s, 4H), 2.58 (dt, J = 14.8, 8.6 Hz, 2H), 2.28 (ddd, J = 18.6, 7.4, 4.1 Hz, 1H), 2.14 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 2.01 (s, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.51 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 1.47 - 1.40 (m, 1H), 1.25 (q, J = 10.8, 9.3 Hz, 7H), 0.77 (s, 3H). 13C NMR (101MHz, Chloroform-d) 176.83, 176.66, 174.64, 170.72, 168.81, 155.94, 152.35, 142.10, 141.13, 139.36, 134.26, 133.26, 127.77, 125.36, 122.17, 118.64, 113.14, 88.53, 80.81, 78.18, 74.10, 67.24, 59.99, 56.72, 56.62, 52.49, 46.64, 39.81, 39.68, 38.83, 38.04, 37.92, 36.23, 35.63, 35.59, 34.26, 33.94, 32.42, 30.78, 27.29, 27.19, 15.57, 14.62, 13.40, 12.13.Obtained form: white solid; 1H NMR (400MHz, CDCl 3 ) δ 1H NMR (400MHz, chloroform-d) δ 6.79 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 6.64 (t, J = 4.6 Hz, 3H), 6.59 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 6.40 (dd, J = 15.0, 11.4 Hz, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.62 (dd, J = 15.2, 9.1 Hz, 1H), 5.38 - 5.31 (m, 1H), 4.73 (dd, J = 11.9, 2.4 Hz, 1H), 4.24 (t, J = 11.1 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.70 - 3.58 (m, 5H), 3.46 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.32 (s, 3H), 3.17 (s, 3H), 3.00 (dddd, J = 34.7, 24.6, 17.7, 8.4 Hz, 6H), 2.80 (s, 4H), 2.58 (dt, J = 14.8, 8.6 Hz, 2H), 2.28 (ddd, J = 18.6, 7.4, 4.1 Hz, 1H), 2.14 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 2.01 (s, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.51 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 1.47 - 1.40 (m, 1H), 1.25 (q, J = 10.8, 9.3 Hz, 7H), 0.77 (s, 3H). 13 C NMR (101MHz, Chloroform-d) 176.83, 176.66, 174.64, 170.72, 168.81, 155.94, 152.35, 142.10, 141.13, 139.36, 134.26, 133.26, 127.77, 125.36, 122.17, 118.64, 113.14, 88.53, 80.81, 78.18, 74.10, 67.24, 59.99, 56.72, 56.62, 52.49, 46.64, 39.81, 39.68, 38.83, 38.04, 37.92, 36.23, 35.63, 35.59, 34.26, 33.94, 32.42, 30.78, 27.29, 27.19, 15.57, 14.62, 13.40, 12.13.

<2-2> 1,1'-(프로판-1,3-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온)-DM1: 링커-페이로드 2<2-2> 1,1'-(propane-1,3-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione)-DM1: Linker-Payload 2

둥근 바닥 플라스크에 CH2Cl2에 용해된 DM1(100mg, 0.135mmol), 상기 실시예 1-2에서 제조된 링커 2(47.6mg, 0.203mmol) 및 트리에틸아민을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 증류수로 씻어주고 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 수집하고 회전 증발기로 증발시킨 다음, 실리카 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:CH3OH=30:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.In a round bottom flask, DM1 (100 mg, 0.135 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 , linker 2 (47.6 mg, 0.203 mmol) prepared in Example 1-2, and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed with distilled water and dried over sodium sulfate. The organic layer was collected and evaporated using a rotary evaporator, and then purified by silica column chromatography (CH 2 Cl 2 :CH 3 OH = 30: 1) to obtain the product.

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 6.62 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 15.2, 11.1 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 5.64 (dd, J = 15.4, 9.4 Hz, 1H), 5.38 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.79 - 4.73 (m, 1H), 4.27 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.75 - 3.63 (m, 2H), 3.52 - 3.45 (m, 4H), 3.44 - 3.39 (m, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.04 (tdd, J = 18.2, 13.5, 7.7 Hz, 5H), 2.84 (s, 4H), 2.67 - 2.55 (m, 2H), 2.37 (td, J = 18.5, 3.8 Hz, 1H), 2.17 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 1.88 (dq, J = 13.4, 7.1 Hz, 2H), 1.65 (d, J = 12.9 Hz, 4H), 1.55 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.46 (td, J = 10.0, 5.7 Hz, 1H), 1.32 - 1.18 (m, 7H), 0.79 (s, 3H). 13C NMR (151MHz, Chloroform-d) δ 176.66, 174.46, 170.79, 170.72, 168.87, 156.13, 152.30, 142.31, 141.20, 139.43, 134.32, 133.43, 127.78, 125.49, 122.33, 118.91, 113.29, 88.62, 81.00, 78.29, 74.22, 67.29, 60.05, 56.76, 56.71, 52.54, 46.73, 39.89, 39.74, 39.00, 36.60, 36.26, 35.72, 35.66, 35.29, 34.25, 34.05, 32.54, 30.83, 27.22, 26.57, 26.54, 15.63, 14.68, 13.50, 12.26.Obtained form: white solid; 1H NMR (600 MHz, CDCl 3 ) δ 6.81 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 3.5 Hz, 3H), 6.62 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 15.2, 11.1 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 5.64 (dd, J = 15.4, 9.4 Hz, 1H), 5.38 (q, J = 6.9 Hz, 1H), 4.79 - 4.73 (m, 1H), 4.27 (t, J = 11.5 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.75 - 3.63 (m, 2H), 3.52 - 3.45 (m, 4H), 3.44 - 3.39 (m, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.19 (s, 3H), 3.04 (tdd, J = 18.2, 13.5, 7.7 Hz, 5H), 2.84 (s, 4H), 2.67 - 2.55 (m, 2H), 2.37 (td, J = 18.5, 3.8 Hz, 1H), 2.17 (d, J = 14.7 Hz, 1H), 1.88 (dq, J = 13.4, 7.1 Hz, 2H), 1.65 (d, J = 12.9 Hz, 4H), 1.55 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.46 (td, J = 10.0, 5.7 Hz, 1H), 1.32 - 1.18 (m, 7H), 0.79 (s, 3H). 13 C NMR (151MHz, Chloroform-d) δ 176.66, 174.46, 170.79, 170.72, 168.87, 156.13, 152.30, 142.31, 141.20, 139.43, 134.32, 133.43, 127.78, 125.49, 122.33, 118.91, 113.29, 88.62, 81.00, 78.29, 74.22, 67.29, 60.05, 56.76, 56.71, 52.54, 46.73, 39.89, 39.74, 39.00, 36.60, 36.26, 35.72, 35.66, 35.29, 34.25, 34.05, 32.54, 30.83, 27.22, 26.57, 26.54, 15.63, 14.68, 13.50, 12.26.

<2-3> 1,1'-(부탄-1,4-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온)-DM1: 링커-페이로드 3<2-3> 1,1'-(butane-1,4-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione)-DM1: Linker-Payload 3

둥근 바닥 플라스크에 CH2Cl2에 용해된 DM1(100mg, 0.135mmol), 상기 실시예 1-3에서 제조된 링커 3(50.4mg, 0.203mmol) 및 트리에틸아민을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 증류수로 씻어주고 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 수집하고 회전 증발기로 증발시킨 다음, 실리카 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:CH3OH=30:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.In a round bottom flask, DM1 (100 mg, 0.135 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 , linker 3 (50.4 mg, 0.203 mmol) prepared in Example 1-3, and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed with distilled water and dried over sodium sulfate. The organic layer was collected and evaporated using a rotary evaporator, and then purified by silica column chromatography (CH 2 Cl 2 :CH 3 OH = 30: 1) to obtain the product.

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.82 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 3H), 6.62 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 15.3, 11.2 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.1, 9.1 Hz, 1H), 5.41 - 5.34 (m, 1H), 4.76 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 11.0 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.74 - 3.63 (m, 3H), 3.52 - 3.48 (m, 5H), 3.41 - 3.34 (m, 5H), 3.24 - 3.17 (m, 4H), 3.13 - 2.92 (m, 6H), 2.86 - 2.78 (m, 5H), 2.66 - 2.55 (m, 3H), 2.33 (ddd, J = 18.7, 9.9, 3.8 Hz, 1H), 2.17 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 1.67 (s, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.56 - 1.43 (m, 7H), 1.33 - 1.18 (m, 8H), 0.79 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.91, 176.74, 174.59, 174.56, 170.87, 170.83, 170.80, 170.76, 170.69, 168.86, 168.84, 156.02, 155.99, 152.37, 142.15, 142.12, 141.14, 141.06, 139.42, 139.38, 134.21, 133.32, 127.75, 125.35, 122.19, 118.72, 113.23, 113.17, 88.54, 80.87, 78.29, 78.23, 74.15, 67.28, 60.01, 56.75, 56.67, 56.66, 52.61, 52.52, 46.66, 39.79, 39.57, 38.88, 38.40, 38.34, 37.14, 36.22, 35.76, 35.65, 35.59, 34.27, 33.94, 33.42, 32.46, 30.82, 27.36, 27.20, 25.80, 25.78, 24.72, 15.61, 14.66, 13.46, 13.42, 12.18, 12.16.Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.82 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.72 - 6.68 (m, 3H), 6.62 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.42 (dd, J = 15.3, 11.2 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.1, 9.1 Hz, 1H), 5.41 - 5.34 (m, 1H), 4.76 (dd, J = 11.9, 2.7 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 11.0 Hz, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.74 - 3.63 (m, 3H), 3.52 - 3.48 (m, 5H), 3.41 - 3.34 (m, 5H), 3.24 - 3.17 (m, 4H), 3.13 - 2.92 (m, 6H), 2.86 - 2.78 (m, 5H), 2.66 - 2.55 (m, 3H), 2.33 (ddd, J = 18.7, 9.9, 3.8 Hz, 1H), 2.17 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 1.67 (s, 2H), 1.63 (s, 3H), 1.56 - 1.43 (m, 7H), 1.33 - 1.18 (m, 8H), 0.79 (s, 3H). 13 C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.91, 176.74, 174.59, 174.56, 170.87, 170.83, 170.80, 170.76, 170.69, 168.86, 168.84, 156.02, 155.99, 152.37, 142.15, 142.12, 141.14, 141.06, 139.42, 139.38, 134.21, 133.32, 127.75, 125.35, 122.19, 118.72, 113.23, 113.17, 88.54, 80.87, 78.29, 78.23, 74.15, 67.28, 60.01, 56.75, 56.67, 56.66, 52.61, 52.52, 46.66, 39.79, 39.57, 38.88, 38.40, 38.34, 37.14, 36.22, 35.76, 35.65, 35.59, 34.27, 33.94, 33.42, 32.46, 30.82, 27.36, 27.20, 25.80, 25.78, 24.72, 15.61, 14.66, 13.46, 13.42, 12.18, 12.16.

<2-4> 1,1'-(펜탄-1,5-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온)-DM1: 링커-페이로드 4<2-4> 1,1'-(pentane-1,5-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione)-DM1: Linker-Payload 4

둥근 바닥 플라스크에 CH2Cl2에 용해된 DM1(100mg, 0.135mmol), 상기 실시예 4에서 제조된 링커 4(53.3mg, 0.203mmol) 및 트리에틸아민을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 증류수로 씻어주고 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 수집하고 회전 증발기로 증발시킨 다음, 실리카 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:CH3OH=30:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.In a round bottom flask, DM1 (100 mg, 0.135 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 , linker 4 (53.3 mg, 0.203 mmol) prepared in Example 4, and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed with distilled water and dried over sodium sulfate. The organic layer was collected and evaporated using a rotary evaporator, and then purified by silica column chromatography (CH 2 Cl 2 :CH 3 OH = 30: 1) to obtain the product.

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.80 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.70 - 6.65 (m, 3H), 6.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 15.2, 11.4 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 5.37 (q, J = 6.3 Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 12.0, 2.6 Hz, 1H), 4.30 - 4.22 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.73 - 3.61 (m, 2H), 3.51 - 3.41 (m, 5H), 3.37 - 3.29 (m, 4H), 3.18 (s, 3H), 3.12 - 2.90 (m, 5H), 2.87 - 2.77 (m, 4H), 2.59 (tt, J = 14.6, 11.8, 5.1 Hz, 2H), 2.31 (ddd, J = 18.0, 14.0, 3.6 Hz, 1H), 2.16 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 1.84 (s, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.59 - 1.39 (m, 7H), 1.31 - 1.17 (m, 9H), 0.78 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.95, 176.78, 174.62, 170.96, 170.86, 170.81, 170.70, 168.86, 156.04, 152.37, 142.18, 141.14, 141.07, 139.45, 139.40, 134.19, 133.35, 127.75, 125.36, 122.23, 118.76, 113.23, 88.54, 80.90, 78.31, 74.17, 67.30, 60.02, 56.76, 56.68, 46.68, 39.82, 39.60, 38.91, 38.84, 38.74, 37.50, 36.22, 35.76, 35.66, 35.59, 33.96, 32.48, 30.85, 29.80, 28.10, 28.07, 27.40, 27.26, 27.06, 23.90, 15.62, 14.67, 13.47, 12.19.Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.80 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.70 - 6.65 (m, 3H), 6.61 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.41 (dd, J = 15.2, 11.4 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.3, 8.5 Hz, 1H), 5.37 (q, J = 6.3 Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 12.0, 2.6 Hz, 1H), 4.30 - 4.22 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.73 - 3.61 (m, 2H), 3.51 - 3.41 (m, 5H), 3.37 - 3.29 (m, 4H), 3.18 (s, 3H), 3.12 - 2.90 (m, 5H), 2.87 - 2.77 (m, 4H), 2.59 (tt, J = 14.6, 11.8, 5.1 Hz, 2H), 2.31 (ddd, J = 18.0, 14.0, 3.6 Hz, 1H), 2.16 (d, J = 14.2 Hz, 1H), 1.84 (s, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.59 - 1.39 (m, 7H), 1.31 - 1.17 (m, 9H), 0.78 (s, 3H). 13 C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.95, 176.78, 174.62, 170.96, 170.86, 170.81, 170.70, 168.86, 156.04, 152.37, 142.18, 141.14, 141.07, 139.45, 139.40, 134.19, 133.35, 127.75, 125.36, 122.23, 118.76, 113.23, 88.54, 80.90, 78.31, 74.17, 67.30, 60.02, 56.76, 56.68, 46.68, 39.82, 39.60, 38.91, 38.84, 38.74, 37.50, 36.22, 35.76, 35.66, 35.59, 33.96, 32.48, 30.85, 29.80, 28.10, 28.07, 27.40, 27.26, 27.06, 23.90, 15.62, 14.67, 13.47, 12.19.

<2-5> 1,1'-(헥산-1,6-다일)비스(1H-피롤-2,5-다이온)-DM1: 링커-페이로드 5<2-5> 1,1'-(hexane-1,6-diyl)bis(1H-pyrrole-2,5-dione)-DM1: Linker-Payload 5

둥근 바닥 플라스크에 CH2Cl2에 용해된 DM1(100mg, 0.135mmol), 상기 실시예 1-5에서 제조된 링커 5(56.1mg, 0.203mmol) 및 트리에틸아민을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응이 끝나면 증류수로 씻어주고 황산나트륨으로 건조시켰다. 유기층을 수집하고 회전 증발기로 증발시킨 다음, 실리카 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2:CH3OH=30:1)로 정제하여 생성물을 얻었다.In a round bottom flask, DM1 (100 mg, 0.135 mmol) dissolved in CH 2 Cl 2 , linker 5 (56.1 mg, 0.203 mmol) prepared in Example 1-5, and triethylamine were added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After the reaction was completed, the mixture was washed with distilled water and dried over sodium sulfate. The organic layer was collected and evaporated using a rotary evaporator, and then purified by silica column chromatography (CH 2 Cl 2 :CH 3 OH = 30: 1) to obtain the product.

수득 형태: 하얀색 고체; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.81 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.71 - 6.67 (m, 3H), 6.62 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.46 - 6.37 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.0, 9.1 Hz, 1H), 5.40 - 5.33 (m, 1H), 4.75 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.72 - 3.62 (m, 2H), 3.49 - 3.41 (m, 5H), 3.32 - 3.30 (m, 4H), 3.19 (s, 3H), 3.11 - 2.92 (m, 5H), 2.88 - 2.77 (m, 4H), 2.65 - 2.55 (m, 2H), 2.37 - 2.26 (m, 1H), 2.16 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 1.79 (s, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.58 - 1.39 (m, 7H), 1.33 - 1.17 (m, 11H), 0.78 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.78, 174.61, 174.58, 171.00, 170.76, 170.69, 168.86, 156.06, 152.35, 142.22, 141.15, 141.07, 139.43, 134.19, 134.17, 133.39, 127.74, 125.43, 118.79, 88.53, 80.94, 78.29, 74.19, 67.32, 60.02, 56.76, 56.70, 39.85, 39.62, 37.80, 37.71, 36.19, 35.68, 35.59, 34.34, 33.96, 32.50, 30.86, 28.46, 28.37, 27.45, 27.26, 26.28, 26.23, 26.20, 15.63, 14.69, 13.49, 12.21.Obtained form: white solid; 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 6.81 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 6.71 - 6.67 (m, 3H), 6.62 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 6.46 - 6.37 (m, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.63 (dd, J = 15.0, 9.1 Hz, 1H), 5.40 - 5.33 (m, 1H), 4.75 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 10.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.72 - 3.62 (m, 2H), 3.49 - 3.41 (m, 5H), 3.32 - 3.30 (m, 4H), 3.19 (s, 3H), 3.11 - 2.92 (m, 5H), 2.88 - 2.77 (m, 4H), 2.65 - 2.55 (m, 2H), 2.37 - 2.26 (m, 1H), 2.16 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 1.79 (s, 1H), 1.62 (s, 3H), 1.58 - 1.39 (m, 7H), 1.33 - 1.17 (m, 11H), 0.78 (s, 3H). 13 C NMR (101 MHz, Chloroform-d) δ 176.78, 174.61, 174.58, 171.00, 170.76, 170.69, 168.86, 156.06, 152.35, 142.22, 141.15, 141.07, 139.43, 134.19, 134.17, 133.39, 127.74, 125.43, 118.79, 88.53, 80.94, 78.29, 74.19, 67.32, 60.02, 56.76, 56.70, 39.85, 39.62, 37.80, 37.71, 36.19, 35.68, 35.59, 34.34, 33.96, 32.50, 30.86, 28.46, 28.37, 27.45, 27.26, 26.28, 26.23, 26.20, 15.63, 14.69, 13.49, 12.21.

<실시예 3> 항체(Trastuzumab)-약물(DM1) 중합체의 제조: ADC 1-5<Example 3> Preparation of antibody (Trastuzumab)-drug (DM1) polymer: ADC 1-5

상기 실시예 2에서 제조된 링커 페이로드를 활용하여 ADC를 제작하기 위해 TCEP를 사용하여 트라스트주맙을 완전히 환원시켜 8개의 사용 가능한 티올을 생성하였다. 이어서, DMSO에 용해되어 있던 링커-페이로드를 적절한 온도에서 융합 및 접합시켜 ADC를 제조하였다. To prepare ADCs utilizing the linker payloads manufactured in Example 2 above, trastuzumab was completely reduced using TCEP to generate eight available thiols. Subsequently, the linker-payloads dissolved in DMSO were fused and conjugated at an appropriate temperature to prepare ADCs.

구체적으로, PBS(pH 7.5)에 용해된 트라스트주맙(Trastuzumab, 2mg/ml) 용액에 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP, 증류수 내 50mM 스톡 용액, pH 7.0) 용액 5 당량을 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 DMSO 용액(DMSO 중 10mM)에 상기 실시예 2에서 제조된 링커-페이로드 1-5의 용액을 각각 첨가하고 추가 DMSO를 첨가하여 최종 농도가 10%가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. Amicon® Ultra-15 원심분리 필터 장치(10KDa MWCO, 15mL)를 사용하여 PBS로 반복 정제하여 과잉 시약을 제거하였다. 생성된 접합체를 대상으로 하기 HPLC, MS 및 SEC 분석을 수행하였다. Specifically, 5 equivalents of tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, 50 mM stock solution in distilled water, pH 7.0) solution was added to a solution of trastuzumab (2 mg/mL) dissolved in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.5. The mixture was incubated at 37°C for 1 h. Then, solutions of linker-payloads 1-5 prepared in Example 2 were each added to a DMSO solution (10 mM in DMSO), and additional DMSO was added to a final concentration of 10%. The reaction mixture was incubated at 37°C for 1 h. Excess reagents were removed by repeated purification with PBS using an Amicon ® Ultra-15 centrifugal filter device (10 KDa MWCO, 15 mL). The resulting conjugates were subjected to the following HPLC, MS, and SEC analyses.

실험 방법 일반Experimental Method General

모든 반응은 0.25mm 실리카 플레이트(F-254)에서 박층 크로마토그래피로 모니터링되었고, 반응 지점은 UV 광 램프(254nm, 365nm)에서 또는 과망간산칼륨으로 염색하고 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 시각화되었다. All reactions were monitored by thin layer chromatography on 0.25 mm silica plates (F-254), and reaction spots were visualized under a UV light lamp (254 nm, 365 nm) or by staining with potassium permanganate and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).

컬럼 크로마토그래피는 실리카겔(230-400 메쉬)에서 수행되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 400MHz(Agilent) 및 600MHz(Jeol) NMR 분광계에서 기록되었으며 다중도(s, 단일선; d, 이중선; t, 삼중선; q, 사중선; p, 펜텟; m, 다중선; 또는 이들의 조합(예: dd, dt 등)), 헤르츠(Hz) 단위의 결합 상수, 백만분율(ppm)로 보고된 화학적 이동으로 표시되었다. 사용된 NMR 용매는 Eurisotop®에서 구입하였다. 스펙트럼은 MestReNova에 의해 분석되었다. HRMS는 전기분무 이온화(ESI) 및 Q-TOF 질량 분석기(Agilent 6530)를 사용하여 측정되었다. 분석용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 단백질 MS는 WuXi App Tec을 사용하여 수행되었다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 Agilent Technologies 1260 Infinity ±를 사용하여 수행되었다. 모든 화학 시약 및 용매는 상업적인 공급원에서 얻은 분석 등급 또는 HPLC 등급이었다. Trastuzumab(Herceptin®)은 Roche Pharma에서 구입했고, DM1은 Angene에서 구입했다. 실온(RT)은 주변 온도(ambient temperature)를 나타낸다. 달리 명시하지 않는 한 수율은 분광학적 및 크로마토그래피적으로 순수한 화합물을 나타낸다.Column chromatography was performed on silica gel (230-400 mesh). 1H and 13C NMR spectra were recorded on 400 MHz (Agilent) and 600 MHz (Jeol) NMR spectrometers and expressed as multiplicities (s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet; p, pentet; m, multiplet; or a combination thereof (e.g., dd, dt, etc.)), coupling constants in hertz (Hz), and chemical shifts reported in parts per million (ppm). NMR solvents used were purchased from Eurisotop ® . Spectra were analyzed by MestReNova. HRMS was measured using electrospray ionization (ESI) and Q-TOF mass spectrometry (Agilent 6530). Analytical high-performance liquid chromatography (HPLC) and protein MS were performed using a WuXi App Tec. Size exclusion chromatography (SEC) was performed using an Agilent Technologies 1260 Infinity ±. All chemical reagents and solvents were of analytical or HPLC grade from commercial sources. Trastuzumab (Herceptin ® ) was purchased from Roche Pharma and DM1 was purchased from Angene. Room temperature (RT) indicates ambient temperature. Unless otherwise stated, yields refer to spectroscopically and chromatographically pure compounds.

<실험예 1> 반응조건의 최적화<Experimental Example 1> Optimization of reaction conditions

Trastuzumab (2mg/ml) 1 당량, 37℃ 1h, 완충액 pH 7.5; 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 통해 접합 비율을 확인하였다. 하기의 표 1은 그 결과를 나타낸다. Trastuzumab (2 mg/ml) 1 equivalent, 37°C 1 h, buffer pH 7.5; The conjugation ratio was confirmed by hydrophobic interaction chromatography (HIC). Table 1 below shows the results.

EntryEntry 링커-페이로드linker-payload Equivalent ratio
(mAb : TCEP : 링커-페이로드)Equivalent ratio
(mAb:TCEP:Linker-Payload) ADCADC Conjugation ratiob (%)Conjugation ratio b (%) 11 11 1 : 5 : 101 : 5 : 10 ADC 1 ADC 1 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%) 22 11 1 : 5 : 201:5:20 ADC 1 ADC 1 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%) 33 11 1 : 5 : 301:5:30 ADC 1 ADC 1 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%) 44 11 1 : 5 : 401:5:40 ADC 1 ADC 1 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%) 55 22 1 : 5 : 101 : 5 : 10 ADC 2 ADC 2 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%) 66 22 1 : 5 : 201:5:20 ADC 2ADC 2 > 90%> 90% 77 33 1 : 5 : 201:5:20 ADC 3ADC 3 > 90%> 90% 88 44 1 : 5 : 201:5:20 ADC 4ADC 4 > 90%> 90% 99 55 1 : 5 : 201:5:20 ADC 5 ADC 5 Heterogeneous (< 90%)Heterogeneous (<90%)

도 2는 (a) 트라스트주맙; (b)-(f) 각각 ADC 1-5의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 데이터를 나타내며, ADC 1에 대한 모든 최적화 테스트 결과가 오버레이되어 표시되었다. Figure 2 shows (a) trastuzumab; (b)-(f) hydrophobic interaction chromatography (HIC) data of ADC 1-5, respectively, with all optimization test results for ADC 1 overlaid.

그 결과, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 컬럼의 활용을 통해 대부분의 트라스트주맙 분자가 접합 과정에 참여하여 미반응 트라스트주맙이 존재하지 않는 것으로 나타났다. As a result, it was shown that most trastuzumab molecules participated in the conjugation process through the use of a hydrophobic interaction chromatography (HIC) column, and no unreacted trastuzumab existed.

<실험예 2> MS 분석<Experimental Example 2> MS Analysis

상기 실시예 3에서 제조된 ADC 2-4에 대해 LC-MS 분석을 수행하였다. 구체적으로, MS 분석은 Wuxibiologics 에서 진행되었으며 제조된 ADC를 pH8.0 Tris 및 0.1M DTT 처리하고 37℃에서 15분 동안 배양한 후 MS 분석하였다.LC-MS analysis was performed on ADC 2-4 manufactured in Example 3 above. Specifically, MS analysis was performed at Wuxibiologics, and the manufactured ADC was treated with pH8.0 Tris and 0.1 M DTT, incubated at 37°C for 15 minutes, and then subjected to MS analysis.

도 3은 경쇄에서 감지된 1개의 링커-페이로드(좌측) 및 중쇄에서 감지된 3개의 링커-페이로드(우측)를 나타내며, (a) 링커-페이로드 2(MW ~972); (b) 링커-페이로드 3(MW ~986); (c) 링커-페이로드 4(MW ~1,000)이다. Figure 3 shows one linker-payload detected in the light chain (left) and three linker-payloads detected in the heavy chain (right): (a) linker-payload 2 (MW ~972); (b) linker-payload 3 (MW ~986); and (c) linker-payload 4 (MW ~1,000).

도 4는 ADC 2-4의 질량분석 결과; TIC 스펙트럼 및 DAR 계산표를 나타낸다. (a) ADC 2; (b) ADC 3; (c) ADC 4이다. Figure 4 shows the mass spectrometry results of ADC 2-4; TIC spectra and DAR calculation table. (a) ADC 2; (b) ADC 3; and (c) ADC 4.

그 결과, ADC의 균질성은 동일한 접합 조건을 유지하면서 링커의 알킬 사슬 길이에 따라 다양하게 나타나는 것으로 나타났다. SDS-PAGE 및 LC-MS 데이터는 8에 가까운 DAR을 보유하는 링커 페이로드를 식별하였으며, 결과적으로, 알킬 사슬의 최적 길이가 3~5개의 탄소 원자로 구성된다는 것을 확인하였다. As a result, the homogeneity of ADCs was found to vary depending on the alkyl chain length of the linker while maintaining the same conjugation conditions. SDS-PAGE and LC-MS data identified linker payloads with a DAR close to 8, which in turn confirmed that the optimal alkyl chain length was 3–5 carbon atoms.

<실험예 3> SEC 분석<Experimental Example 3> SEC Analysis

크기 배제 크로마토그래피 SEC(Size Exclusion Chromatography) 컬럼을 활용하여 응집체를 분석하였다. 구체적으로, Agilent AdvanceBio SEC, 300Å 2.7μm, 4.6*300mm 컬럼으로 인산염 완충액(phosphate buffer)을 사용하여 제조된 ADC 및 응집체의 비율을 산정하였다.Aggregates were analyzed using a Size Exclusion Chromatography (SEC) column. Specifically, the ratios of ADC and aggregates prepared using a phosphate buffer were calculated using an Agilent AdvanceBio SEC, 300Å 2.7μm, 4.6*300mm column.

하기의 표 2는 상기 실시예 3에서 제조된 ADC 2-4의 응집체에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석 결과이다. Table 2 below shows the results of size exclusion chromatography (SEC) analysis for the aggregates of ADC 2-4 manufactured in Example 3.

ADCADC ADC 2 ADC 2 ADC 3 ADC 3 ADC 4 ADC 4 DARDAR 7.897.89 7.827.82 7.817.81 Aggregates (%)Aggregates (%) 3.033.03 5.195.19 12.4512.45

도 5는 ADC 2-4의 응집체에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 스펙트럼으로, (a) ADC 2; (b) ADC 3; (c) ADC 4이다. Figure 5 shows size exclusion chromatography (SEC) spectra for aggregates of ADC 2-4: (a) ADC 2; (b) ADC 3; and (c) ADC 4.

그 결과, 링커의 탄소 사슬 길이가 길어질수록 응집 속도가 증가하는 것으로 나타났다.As a result, it was found that the aggregation rate increased as the carbon chain length of the linker increased.

<실험예 4> <Experimental Example 4> in vitroin vitro 테스트 및 결합 분석Testing and Combination Analysis

HER2를 과발현하는 SK-BR-3 세포주를 활용하여 in vitro 실험을 실시하였다. 구체적으로, 5,000개 세포/well(10% FBS media 96-well plate)을 시딩(seeding)한 후 약물 처리 전 37℃ 5% CO2에서 24시간 동안 세포를 배양하였다. 배지의 증발을 방지하기 위해 세포 시드 웰 옆의 모든 웰에 PBS를 추가하였다. In vitro experiments were performed using SK-BR-3 cell lines that overexpress HER2. Specifically, 5,000 cells/well (10% FBS media 96-well plate) were seeded and the cells were cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO2 before drug treatment. To prevent evaporation of the medium, PBS was added to all wells next to the cell seed wells.

테스트할 약물(농도별 약물 + 1% FBS)이 포함된 배지 100μL를 추가하였다. 증발을 방지하기 위해 주변 웰에 PBS를 추가하였다. 설정된 시간(페이로드: 초기 관찰 후 48hr, 72hr, 96hr 배양조건을 관찰하여 적절한 배양조건 선택)에 따라 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 항체와 ADC는 96hr, 120hr, 144hr의 배양조건을 관찰하여 적절한 배양조건을 선택하였다. 120hr, 144hr 배양 조건의 경우 72hr 배양 후 추가 배지를 추가하였다. 약물 농도는 기준으로 사용된 IC50 값을 기준으로 3 이하, 3 이상으로 설정하였다. 양성 대조군은 일반적으로 etoposide 10μM 또는 24μM을 사용하였다. 100 μL of medium containing the drug to be tested (drug by concentration + 1% FBS) was added. PBS was added to the surrounding wells to prevent evaporation. It was cultured at 37°C and 5% CO 2 for the set time (payload: select appropriate culture conditions by observing 48 hr, 72 hr, and 96 hr culture conditions after initial observation). For antibodies and ADCs, appropriate culture conditions were selected by observing 96 hr, 120 hr, and 144 hr culture conditions. For 120 hr and 144 hr culture conditions, additional medium was added after 72 hr of culture. The drug concentration was set to 3 or less and 3 or more based on the IC 50 value used as a standard. The positive control generally used etoposide 10 μM or 24 μM.

각 웰에 CCK-8 용액(Cell counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Japan) 10μl를 첨가하고 37℃에서 2.5시간, 5% CO2에서 1~4시간 동안 배양한 후, 다음 CCK-8 용액 키트의 설명서에 따라 2.5시간 동안 배양하였다. 15초 동안 흔든 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다(Tecan microplate reader). 하기의 표 3은 그 결과를 나타낸다. Add 10 μl of CCK-8 solution (Cell counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Japan) to each well and incubate for 2.5 hours at 37°C and 1 to 4 hours in 5% CO2 , and then incubate for 2.5 hours according to the instructions of the CCK-8 solution kit. After shaking for 15 seconds, the absorbance was measured at 450 nm (Tecan microplate reader). Table 3 below shows the results.

SK-BR-3SK-BR-3 IC50 IC 50 CI95 CI 95 ConcentrationConcentration mAbmAb TrastuzumabTrastuzumab > 10> 10 -- μg/mlμg/ml ADCADC ADC 2 ADC 2 2.412.41 1.29 - 4.101.29 - 4.10 ng/mlng/ml ADC 3 ADC 3 2.542.54 1.20 - 4.751.20 - 4.75 ADC 4 ADC 4 4.664.66 2.35 - 8.742.35 - 8.74

그 결과, 온전한(Intact) 항체에 비해 IC50 값이 감소하는 것을 확인하였다. 대략 8에 가까운 DAR을 갖는 ADC 2-4는 모두 암세포를 억제하는 능력을 보여주었다.As a result, it was confirmed that the IC 50 value was reduced compared to the intact antibody. ADC 2-4, which had a DAR close to approximately 8, all showed the ability to inhibit cancer cells.

IC50과 응집률이 가장 낮은 것으로 나타난 ADC 2를 추가 분석을 위한 최적의 후보로 선택하였다. 링커가 절단할 수 없는 특성을 갖고 있으므로 링커-페이로드 효능과 페이로드 자체에 대한 평가도 실시하였다(도 6). 하기의 표 4는 종양 세포 SK-BR-3에 대한 ADC 2, 트라스트주맙, DM1 및 링커-페이로드 2의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸다. ADC 2, which showed the lowest IC 50 and aggregation rate, was selected as the optimal candidate for further analysis. Since the linker has the non-cleavable property, the linker-payload efficacy and the payload itself were also evaluated (Figure 6). Table 4 below shows the results of evaluating the cytotoxicity of ADC 2, trastuzumab, DM1, and linker-payload 2 against tumor cells SK-BR-3.

SK-BR-3SK-BR-3 IC50 IC 50 CI95 CI 95 ConcentrationConcentration mAbmAb 트라스트주맙Trastuzumab > 10,000> 10,000 -- ng/mlng/ml ADCADC ADC 2 ADC 2 2.412.41 1.29 - 4.101.29 - 4.10 페이로드Payload DM1DM1 1.001.00 0.87 - 1.150.87 - 1.15 nMnM 링커-페이로드linker-payload 링커-페이로드2linker-payload2 18.1418.14 11.43 - 28.7711.43 - 28.77

도 6은 종양 세포 SK-BR-3에 대한 세포 독성을 비교한 것으로, (a) DM1 및 링커-페이로드 2; (b) 트라스트주맙 및 ADC 2이다. Figure 6 compares the cytotoxicity against tumor cells SK-BR-3: (a) DM1 and linker-payload 2; (b) trastuzumab and ADC 2.

T-DM1의 IC50 값은 7~18ng/ml로 ADC 2~4보다 높은 것으로 알려져 있다. 이는 DAR의 차이(T DM1의 경우 ~3.5, ADC 2-4의 경우 ~8)로 인한 것일 수 있다. ADC 2-4의 효능을 비교하면 링커의 길이가 길어질수록 세포독성이 감소하는 것으로 나타났다. 이는 링커의 선형 탄소사슬이 길어질수록 소수성이 증가하고 응집체의 수가 증가하며 세포에 도달하는 ADC 농도가 감소하는 것과 관련이 있다고 추론할 수 있다. The IC 50 value of T-DM1 is known to be 7–18 ng/ml, which is higher than that of ADC 2–4. This may be due to the difference in DAR (~3.5 for T DM1 and ~8 for ADC 2–4). When comparing the efficacy of ADC 2–4, it was found that the cytotoxicity decreased as the length of the linker increased. This can be inferred to be related to the fact that as the linear carbon chain of the linker increases, the hydrophobicity increases, the number of aggregates increases, and the ADC concentration reaching the cell decreases.

<실험예 5> 결합 친화도에 대한 ELISA 분석<Experimental Example 5> ELISA analysis for binding affinity

ADC의 결합 친화력에 대한 테스트를 실시하였다. 먼저, 1주일 동안 보관한 ADC 2의 결합력을 확인하기 위해 ELISA 테스트를 수행하였다. Qin et al., 2022에 보고된 논문을 참고하여 실험을 진행하였다. 구체적으로, HER2 세포외 도메인에 면역반응하는 부분 접합 또는 비접합 트라스트주맙을 포함하여 모든 트라스트주맙 접합 ADC를 측정하였다. 미세역가 플레이트(96웰, Nunc, NY, USA)를 코팅 완충액(0.05M 탄산염/중탄산염 완충액, pH 9.6)에서 0.5μg/ml의 재조합 HER2 ECD, p105HER-2(Genetech, Inc., CA, USA)로 코팅하였다. 2~8℃에서 16~72시간 동안 배양한 후, 코팅 용액을 제거하고 주위 온도(ambient temperature)에서 1~2시간 동안 분석 희석제(인산염 완충 식염수[PBS], 0.5% 소 혈청 알부민[BSA], 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% Proclin 300)를 교반하면서 첨가하여 비특이적 결합 부위를 차단하였다. 세척 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(HRP; Jackson ImmunoResearch, PA, USA)에 접합된 F(ab')2 염소 항-인간 IgG Fc를 분석 희석액에 희석하고 검출을 위해 첨가했다. 플레이트를 주위 온도에서 1시간 동안 교반하면서 배양한 후 세척하였다. 결합된 HRP 접합체는 테트라메틸 벤지딘 퍼옥시다제 기질(Moss, Inc., MD, USA)을 사용하여 검출하였다. 교반 없이 주변 온도에서 10~20분 동안 색상이 발현되도록 하였다. 1M 인산을 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 620 또는 630nm의 기준 파장에 대해 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 트라스트주맙 농도는 표준 곡선의 4개 매개변수 맞춤으로부터 보간법으로 계산되었다. 하기의 표 5는 일주일 동안 트라스트주맙, T-Dxd 및 ADC 2의 Bmax 및 Kd 값을 비교한 결과를 나타낸다. A test was conducted on the binding affinity of ADC. First, an ELISA test was performed to confirm the binding affinity of ADC 2 stored for 1 week. The experiment was conducted with reference to the paper reported in Qin et al., 2022. Specifically, all trastuzumab-conjugated ADCs, including partially conjugated or unconjugated trastuzumab that immunoreacts with the HER2 extracellular domain, were measured. Microtiter plates (96 wells, Nunc, NY, USA) were coated with 0.5 μg/ml of recombinant HER2 ECD, p105HER-2 (Genetech, Inc., CA, USA) in coating buffer (0.05 M carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6). After incubation at 2–8°C for 16–72 h, the coating solution was removed, and assay diluent (phosphate-buffered saline [PBS], 0.5% bovine serum albumin [BSA], 0.05% polysorbate 20, 0.05% Proclin 300) was added with agitation at ambient temperature for 1–2 h to block nonspecific binding sites. After washing, F(ab')2 goat anti-human IgG Fc conjugated to horseradish peroxidase (HRP; Jackson ImmunoResearch, PA, USA) was diluted in assay diluent and added for detection. The plates were incubated at ambient temperature for 1 h with agitation and then washed. The bound HRP conjugate was detected using tetramethyl benzidine peroxidase substrate (Moss, Inc., MD, USA). Color development was allowed for 10–20 min at ambient temperature without agitation. The enzyme reaction was stopped by adding 1 M phosphoric acid. Absorbance was measured at 450 nm against a reference wavelength of 620 or 630 nm using a microplate reader. Total trastuzumab concentrations were calculated by interpolation from a four-parameter fit to the standard curve. Table 5 below shows the results comparing the Bmax and Kd values of trastuzumab, T-Dxd, and ADC 2 over a one-week period.

TrastuzumabTrastuzumab T-DxdT-Dxd ADC 2 ADC 2 DayDay Day 1Day 1 Day 1Day 1 Day 7Day 7 Day 1Day 1 Day 7Day 7 BmaxBmax 3.6023.602 2.6722.672 2.4622.462 3.9633.963 3.8633.863 KdKd 1.2841.284 0.7680.768 1.3271.327 1.2101.210 1.2161.216

도 7은 일주일 동안 트라스트주맙, T-Dxd 및 ADC 2의 결합력을 비교한 그래프를 나타낸다. Figure 7 shows a graph comparing the binding affinity of trastuzumab, T-Dxd, and ADC 2 over a period of one week.

그 결과, Bmax와 Kd를 비교하여 꾸준한 결합이 유지됨을 확인하였다. 또한, ADC 2의 결합 친화도는 유사한 DAR을 보유하는 T-Dxd(DAR ~7.7)의 결합 친화도와 병치되었다. 일주일 동안 T-Dxd의 Kd 값은 0.768에서 1.327로 증가한 반면, ADC 2는 1.210에서 1.216으로 거의 변화를 보이지 않았다. 또한 Bmax 값은 T-Dxd의 경우 2.672에서 2.462로, ADC2의 경우 3.963에서 3.863으로 감소했다. 두 개의 높은 DAR ADC의 데이터를 비교했을 때 ADC 2가 T-Dxd보다 더 안정적인 결합을 가지고 있음을 확인하였다. As a result, we confirmed that steady binding was maintained by comparing Bmax and Kd. In addition, the binding affinity of ADC 2 was juxtaposed to that of T-Dxd (DAR ~7.7) with similar DAR. Over the course of a week, the Kd value of T-Dxd increased from 0.768 to 1.327, whereas that of ADC 2 showed little change from 1.210 to 1.216. In addition, the Bmax value decreased from 2.672 to 2.462 for T-Dxd and from 3.963 to 3.863 for ADC2. When comparing the data of the two high DAR ADCs, we confirmed that ADC 2 had more stable binding than T-Dxd.

<실험예 6> SDS-PAGE를 이용한 단일 항체-약물 중합체의 순도 분석 <Experimental Example 6> Purity Analysis of Single Antibody-Drug Conjugate Using SDS-PAGE

신규한 항체-약물 중합체의 순도 및 분자량을 확인하기 위해 환원된 트라스트주맙(trastuzumab)과 상기 실시 예 3에서 제조된 ADC 2-4에 대한 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 구체적으로, BCA Assay 결과를 바탕으로 시료 농도를 계산하고, 0.2mg/ml의 일정한 농도로 조정하고, 4x 로딩 버퍼(Thermo, #NP0007)와 10x 환원제(Thermo, #B0009)를 비율(PBS 3.75ul, 4x 로딩 버퍼, 10x 환원 버퍼, 0.2mg/ml 단백질)로 혼합하고, 95℃에서 배양하였다. 10분간 가열한 후 얼음에 넣어 식히고, 그라데이션 젤을 사용하는 경우 BoltTM 4~12%, Bis-Tris, 1.0mm, 미니 단백질 젤 10-웰(Invitrogen, #NW04120BOX)을 사용하였다. 미니 젤 탱크(Thermo, #A25977)에 젤에 적합한 완충액을 채운 다음 젤을 삽입하고 Ladder(BIO-RAD, #1610375) 3ul와 샘플(1.0ug/well) 10ul를 로드하였다. PowerEaseTM Touch 350W 전원 공급 장치(Invitrogen, #PS0351)에 연결하고 실행하였다(Bis-Tris 젤 사용 시, 200V 30분). 이후 샘플이 제대로 내려오면 장비를 끄고 젤을 꺼냈다. 젤을 뚜껑이 있는 용기에 넣은 후 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 염색 용액(BIO RAD, #1610436)을 붓고 디지털 로커(DAIHAN, #RK-2D)에서 25rpm으로 밤새 흔들었다. 염색 용액을 제거한 후 탈염액(증류수 6:메탄올 3:아세트산 1)을 사용하여 1시간에 1회 총 3회 용액을 갈아주며 탈색하였다. 도 8은 그 결과를 나타낸다. To confirm the purity and molecular weight of the novel antibody-drug conjugate, SDS-PAGE analysis was performed on reduced trastuzumab and ADC 2-4 manufactured in Example 3. Specifically, the sample concentration was calculated based on the BCA Assay results, adjusted to a constant concentration of 0.2 mg/ml, 4x loading buffer (Thermo, #NP0007) and 10x reducing agent (Thermo, #B0009) were mixed in a ratio (PBS 3.75 ul, 4x loading buffer, 10x reducing buffer, 0.2 mg/ml protein), and incubated at 95°C. After heating for 10 minutes, it was cooled on ice. When using a gradient gel, Bolt TM 4-12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel 10-well (Invitrogen, #NW04120BOX) was used. Fill the mini gel tank (Thermo, #A25977) with the appropriate buffer for the gel, insert the gel, and load 3ul of Ladder (BIO-RAD, #1610375) and 10ul of sample (1.0ug/well). Connect to PowerEase TM Touch 350W power supply (Invitrogen, #PS0351) and run (200V for 30 min when using Bis-Tris gel). After the sample was properly unloaded, turn off the instrument and take out the gel. Place the gel in a lidded container, pour Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution (BIO RAD, #1610436), and shake at 25 rpm overnight on a digital rocker (DAIHAN, #RK-2D). After removing the dye solution, decolorization was performed using a decolorizing solution (distilled water 6: methanol 3: acetic acid 1), changing the solution three times in total once every hour. Figure 8 shows the results.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 유방암세포 증식 억제 활성평가에 적합한 순도를 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 8, the purity suitable for evaluating breast cancer cell proliferation inhibition activity was confirmed.

결론적으로, 본 발명의 링커-페이로드는 디말레이미드 작용기를 사용하는 간단한 합성에 의해 제조되었으며, 저렴하고 상업적으로 접근 가능한 시약을 사용하여 다양한 유형의 링커 페이로드가 유리한 수율로 합성되었다. 또한, 간단한 과정과 높은 수율로 다양한 길이의 링커 시스템을 사용하여 높은 DAR을 갖는 ADC를 합성하였다. 링커의 길이가 길어질수록 응집이 증가하는 것으로 나타났다. in vitro 테스트에서는 HER2를 과발현하는 세포주에서 예상되는 항암 효과가 나타났다. 링커-페이로드 자체가 항암 효과를 나타냈을 뿐만 아니라, ADC도 좋은 항암 활성을 보여 높은 DAR에도 불구하고 안정적인 결합 능력을 나타냈다. 또한 ADC와 T-Dxd 간의 결합 친화도를 비교할 때, 본 발명의 ADC 2가 T-Dxd에 비해 우수한 결합 친화도를 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명의 링커 페이로드가 향후 ADC 개발자들에게 유용할 것으로 기대된다.In conclusion, the linker-payload of the present invention was prepared by a simple synthesis using a dimaleimide functional group, and various types of linker payloads were synthesized in favorable yields using inexpensive and commercially available reagents. In addition, ADCs with high DAR were synthesized using linker systems of various lengths with a simple process and high yields. It was shown that aggregation increased as the linker length increased. In vitro tests showed the expected anticancer effect in cell lines overexpressing HER2. Not only the linker-payload itself showed anticancer effect, but the ADC also showed good anticancer activity, showing stable binding ability despite the high DAR. In addition, when comparing the binding affinity between the ADC and T-Dxd, it was confirmed that the ADC 2 of the present invention showed superior binding affinity than T-Dxd. The linker payload of the present invention is expected to be useful for ADC developers in the future.

Claims (10)

하기 화학식(Ⅰ)의 구조식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 리간드-약물 접합체:
(Ⅰ)
여기서, SU는 스페이서 유닛(spacer unit)이고,
SU1, SU2, 및 SU3는 각각 동일하거나 상이할 수 있으며,
a, b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 3의 정수이고,
L은 리간드(ligand) 유닛이고,
D는 약물 유닛(Drug Unit)이다.
A ligand-drug conjugate characterized by comprising a structural formula of the following chemical formula (Ⅰ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
(Ⅰ)
Here, SU is the spacer unit,
SU1, SU2, and SU3 may be the same or different,
a, b and c are each independently an integer from 0 to 3,
L is the ligand unit,
D is Drug Unit.
 제1항에 있어서,
상기 SU1, SU2 및 SU3는, 각각 독립적으로
-(CH2)n-, -C3-6사이클로알킬-, -C3-6사이클로아릴-, -C3-6헤테로아릴- 및 -(CH2CH2O)m-으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있고,
a, b 및 c는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2일 수 있으며,
여기에서 n은 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수이며,
여기에서 m은 1 내지 10의 정수인,
리간드-약물 접합체.
In the first paragraph,
The above SU1, SU2 and SU3 are each independently
-(CH 2 )n-, -C 3-6 cycloalkyl-, -C 3-6 cycloaryl-, -C 3-6 heteroaryl- and -(CH 2 CH 2 O)m- may be selected from the group consisting of
a, b and c can each independently be 0, 1 or 2,
Here, n is an integer from 1 to 10, independently.
Here, m is an integer from 1 to 10,
Ligand-drug conjugates.
 제1항에 있어서, 상기 리간드가 항체인, 리간드-약물 접합체.
A ligand-drug conjugate in claim 1, wherein the ligand is an antibody.
 제3항에 있어서, 상기 항체가 트라스트주맙(trastuzumab)인, 리간드-약물 접합체.
A ligand-drug conjugate in claim 3, wherein the antibody is trastuzumab.
 제1항에 있어서, 상기 페이로드가 DM1인, 리간드-약물 접합체.
A ligand-drug conjugate in claim 1, wherein the payload is DM1.
 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 리간드-약물 접합체는 5 내지 10의 DAR(Drug-to-Antibody Ratio)을 갖는 것을 특징으로 하는, 리간드-약물 접합체.
A ligand-drug conjugate according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the ligand-drug conjugate has a DAR (Drug-to-Antibody Ratio) of 5 to 10.
 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 리간드-약물 접합체는 7 내지 8의 DAR(Drug-to-Antibody Ratio)을 갖는 것을 특징으로 하는, 리간드-약물 접합체.
A ligand-drug conjugate according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the ligand-drug conjugate has a DAR (Drug-to-Antibody Ratio) of 7 to 8.
 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 리간드-약물 접합체 조성물을 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a ligand-drug conjugate composition of any one of claims 1 to 5.
 제8항에 있어서, 상기 암은 Her2 발현과 관련된 암인, 암 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for treating cancer, wherein the cancer in claim 8 is a cancer associated with Her2 expression.
 제9항에 있어서, 상기 암은 전이성 유방암인, 암 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for treating cancer, wherein the cancer in claim 9 is metastatic breast cancer.
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