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KR20240168351A - 항체-약물 접합체 및 그의 용도 - Google Patents

항체-약물 접합체 및 그의 용도 Download PDF

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KR20240168351A
KR20240168351A KR1020247033958A KR20247033958A KR20240168351A KR 20240168351 A KR20240168351 A KR 20240168351A KR 1020247033958 A KR1020247033958 A KR 1020247033958A KR 20247033958 A KR20247033958 A KR 20247033958A KR 20240168351 A KR20240168351 A KR 20240168351A
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Abstract

본 발명은 항체-약물 접합체에 관한 것이며, 여기서 항체는 폴레이트 수용체 a에 특이적으로 결합하고, 여기서 약물은 바람직하게는 세포독성 약물 중에서 선택된다. 이러한 항체-약물 접합체는 특히 암, 예컨대 난소암, 유방암 및 비소세포 폐암을 비롯한 증식성 질환을 치료하는 데 유용하다.

Description

항체-약물 접합체 및 그의 용도
항체-약물 접합체가 이하에 개시되며, 여기서 항체는 폴레이트 수용체 알파 (FRα)에 특이적으로 결합하고, 여기서 약물은 바람직하게는 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 캄프토테신 유사체, 예컨대 엑사테칸 중에서 선택된다. 이러한 항체-약물 접합체는 특히 암, 예컨대 난소암, 유방암 또는 폐암을 비롯한 증식성 질환을 치료하는 데 유용하다.
항체-약물 접합체 (이하 "ADC"로 지칭됨)는 새로운 부류의 치료제, 특히 암 치료제이다. 이러한 ADC는 적어도 항체 및 페이로드 (예를 들어 세포독성 약물)를 포함하며, 둘 다는 링커에 의해 공유 결합된다. 따라서, ADC는 항체 표적 특이성을 페이로드의 효율 (예를 들어, 화학요법제의 세포독성 활성)과 조합하기 위해 설계된다. 효율적인 ADC는 높은 특이성 및 낮은 전신 독성을 나타내야 한다.
독성과 관련하여, ADC에 사용된 항체는 그의 항원에 정확하고 효율적으로 결합할 필요가 있으며, 이는 적합한 표적 항원이 표적화된 세포 상에서 우선적으로 또는 독점적으로 발현된다는 것을 의미한다.
ADC를 설계할 때, 세포 내재화 후에 또는 이환 조직 미세환경에서 선택적 효소 메카니즘에 의한 활성 약물 유닛의 최종 방출을 가능하게 하면서 최종 활성 약물을 리간드 표적화 유닛에 공유 부착시킬 필요가 있다. 이와 관련하여, 여러 펩티다제- 및 글리코시다제-감수성 절단가능한 링커 화학적 전략 (자기-희생 화학과 연관됨)이 개발되었다. 이들 절단가능한 링커 및 그의 상응하는 절단 메카니즘은 널리 공지되어 있고, 여러 간행물에 기재되어 있다 (예를 들어 문헌 [Bargh JG et al., Chem. Soc. Rev., 2019, 48, 4361, Toki et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 6, 1866-1872, Scott et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 3, 831-840]). 이러한 효소-감수성 절단가능한 물질의 선택은 접합체의 효능 및 내약성에 영향을 미치는 ADC의 중요한 설계 속성이다.
세포독소 또는 약물을 항체에 접합시키는 데 사용되는 링커 유형의 예는 히드라존, 티오에테르, 에스테르, 디술피드 및 펩티드-함유 링커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 링커는 예를 들어 리소솜 구획 내의 낮은 pH에 의한 절단에 감수성이거나 또는 프로테아제, 예컨대 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들어 카텝신 (예를 들어 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 감수성인 것 중에서 선택된다. 효율적인 링커는 페이로드의 정확하고 적시의 방출을 보장할 수 있다. 독성과 관련하여, 또한 링커의 안정성은, 링커 자체가 독성을 구동하는 것으로 보이지 않더라도, 페이로드에 의해 발휘되는 독성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보인다. 실제로, 안정한 링커는 페이로드를 표적-특이적 방식으로 방출할 수 있는 반면, 안정하지 않은 링커는 페이로드의 비-정확한 방출을 일으킬 가능성이 더 커서 (예를 들어 비-특이적 절단으로 인함), 비-특이적 전신 독성으로 이어질 수 있다.
ADC에 사용되는 페이로드는 피코몰 범위의 시험관내 억제 농도를 갖는 고도로 강력한, 종종 세포독성 약물이다. 통상적인 페이로드는 예를 들어 미세관 억제제 (예컨대 메이탄신 유도체 (DM1/DM4), 아우리스타틴 (MMAE/MMAF), 에리불린) 및 DNA 알킬화제 (예컨대 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀, 인돌리노벤조디아제핀 또는 두오카르마이신)이다.
ADC가 유망한 치료제인 것으로 보이지만, 일부 ADC는 너무 독성일 수 있고, 이는 이들 화합물의 치료 범위를 제한하거나 추가의 임상 개발을 막는다. 또한, 현재 승인되었거나 임상 연구 중인 대부분의 ADC는 상기 언급된 바와 같은 미세관- 및 DNA-표적화제를 기초로 한다. 따라서, 미세관- 및 DNA-표적화제에 대해 저항성이거나 또는 저항성이 된 종양을 효율적으로 치료하기 위해서는, 다른 작용 메카니즘을 갖는 페이로드를 기초로 하는 새로운 차별화된 ADC에 대한 필요가 존재한다.
따라서, 높은 특이성, 최대 효율 및 낮은 독성을 나타내는 효율적인 ADC는 그의 성분 각각의 적절한 조합을 필요로 한다. 가능한 전략의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Khongorzul et al., 2019 (Molecular cancer research, DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-19-0582)]을 참조한다. WO2019081455 및 문헌 [Conilh et al., (2021, Pharmaceuticals, 14(3), 247)]은, 특히 토포이소머라제 I 억제제 페이로드 엑사테칸을 기초로 하고 친수성 단분산 폴리사르코신 (PSAR) 약물-링커 플랫폼을 사용하는 HER2-표적화 항체-약물 접합체를 추가로 보고한다.
문헌 [Cheng et al., (2018, DOI: 10/1158/1535-7163.MCT-17-1215)] 및 WO2017151979는 전형적으로 3 내지 4개의 에리불린 분자에 접합된 파를레투주맙을 갖는 ADC (MORAb-202) 및 종양 치료에서의 그의 용도를 보고한다. 이러한 ADC의 에리불린 페이로드의 작용 메카니즘은 미세관 억제이다. 문헌 [Moore et al., (2018, Future Oncol. 14(17) 1669-1678)]은 난소암의 치료를 위한, 페이로드로서 평균 3 내지 4개의 메이탄시노이드 분자와 접합된 인간화 항-FRα 항체인 미르베툭시맙을 포함하는 ADC 미르베툭시맙 소라브탄신을 사용한 III상 연구의 결과를 보고한다. 이러한 ADC의 메이탄신 페이로드의 작용 메카니즘은 미세관 억제이다.
따라서, 효율적이고, 높은 특이성, 낮은 독성 (개선된 치료 지수) 및 차별화된 페이로드 작용 메카니즘을 갖는 항-FRα 항체를 포함하는 항체-약물 접합체에 대한 필요가 여전히 존재한다.
실시예에 제시된 바와 같이, 본 개시내용은, 특히 다른 페이로드 및 약물 링커를 갖는 FRα 발현 항체를 표적화하는 참조 선행 기술 ADC, 예컨대 미르베툭시맙 소라브탄신과 비교할 경우, 고형 종양 암 모델에서 탁월한 생체내 효능 및 낮은 독성을 갖는 토포이소머라제 I 억제제-기반 항-FRα 항체-약물 접합체를 제공한다.
따라서, 본 개시내용의 제1 목적은 화학식 (I)의 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이며:
,
여기서:
Ab는 서열식별번호(SEQ ID NO): 12에 특이적으로 결합하는 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체이고,
L은 바람직하게는 티올 잔기를 통해 상기 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체에 결합된 절단가능한 링커 모이어티이고,
D는 L에 결합된 세포독성 약물 모이어티이고,
p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이고, 보다 바람직하게는 p는 8이다.
구체적 실시양태에서, Ab는 인간 IgG1 이소형 불변 영역을 포함하는 항체이다.
바람직한 실시양태에서, Ab는 인간 IgG1 이소형의 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 상기 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 인간 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 상기 항체에 대해 어떠한 ADCC 활성도 부여하지 않거나 또는 감소된 ADCC 활성을 부여한다.
다른 구체적 실시양태에서, Ab는 인간 IgG4 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 IgG4 불변 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 상기 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 상기 항체에 대해 어떠한 ADCC 활성도 부여하지 않거나 또는 감소된 ADCC 활성을 부여한다.
바람직한 실시양태에서, Ab는
(a) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는
(b) 서열식별번호: 7의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 8의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 항-FRα 항체이다.
구체적 실시양태에서, 상기 Ab는 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
구체적 실시양태에서, 상기 Ab는 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
구체적 실시양태에서, D는 바람직하게는 캄프토테신 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 토포이소머라제 I의 억제제이고, 보다 바람직하게는 D는 하기 화학식 (II)의 엑사테칸의 약물 모이어티이다.
구체적 실시양태에서, L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커 모이어티이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이다. 보다 구체적 실시양태에서, L은 리소솜 프로테아제-감수성 링커이고, W는 예를 들어 발린-시트룰린 (Val-Cit), 알라닌-알라닌-아스파라긴 (Ala-Ala-Asn), 발린-알라닌 (Val-Ala) 및 페닐알라닌-리신 (Phe-Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택된 절단가능한 펩티드 모이어티를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, L은 프로테아제 감수성 절단가능한 링커이고, W는 바람직하게는 β-글루쿠로니드 또는 β-갈락토시드 모이어티로부터 선택된 당 절단가능한 유닛을 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, L은 글루타티온-감수성 링커이고, W는 디술피드 모이어티를 포함한다. 구체적 실시양태에서, W는 하기 화학식 (III)
및 그의 제약상 허용되는 염을 갖고, 여기서
각각의 R2는 전자 끄는 기 및 C1-C4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
n은 0, 1 또는 2이고;
T는 당 절단가능한 유닛 또는 폴리펩티드 절단가능한 유닛이고;
Y는 T가 당 절단가능한 유닛인 경우에 O이거나, 또는 T가 폴리펩티드 절단가능한 유닛인 경우에 NR3이고;
R3은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, L은 화학식 (IV)의 링커 -A-W-에 상응하고,
여기서
X1은 연결기 유닛이고;
Z는 임의적인 스페이서이고;
X2는 연결기 유닛이고;
K는, 바람직하게는 폴리사르코신 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 임의적인 소수성 차폐 물질이고;
R1은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R4는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R5는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재된다.
보다 구체적 실시양태에서, X1 및 X2는 독립적으로 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
보다 구체적 실시양태에서, Z는 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, K는 바람직하게는 하기 화학식 (V)의 폴리사르코신이며:
,
여기서 k는 2 내지 50, 바람직하게는 4 내지 30의 정수이고,
R6은 OH 또는 NH2에 상응한다.
구체적 실시양태에서, T는 글루쿠로니드 또는 갈락토시드인 당 절단가능한 유닛이다.
다른 구체적 실시양태에서, T는 바람직하게는 Val-Cit, Val-Ala 및 Phe-Lys로부터 선택된 디펩티드이다.
구체적 실시양태에서, L은 상기 항체의 1개 이상의 티올 잔기에 공유 결합되고, 바람직하게는 상기 L은 화학식 (VI)의 링커에 상응한다:
.
구체적 실시양태에서, Ab는 전장 항체 또는 항원 결합 부분을 함유하는 항체 단편을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 항체 약물 접합체는 하기 화학식 (VII)에 상응하며
여기서 Ab는 항-FRα 항체, 예컨대 파를레투주맙, 또는 전형적으로 IgG1 Fc 불변 영역의 류신 234 및 류신 235에서 알라닌 치환을 포함하는 그의 침묵 IgG1 변이체이고, p는 4 내지 8이다.
바람직한 실시양태에서, 항체 약물 접합체는 하기 화학식 (VII)에 상응하며
여기서 Ab는 항-FRα 항체, 예컨대 파를레투주맙, 또는 그의 침묵 IgG1 변이체, 통상적으로 LALA 돌연변이로도 불리는, 전형적으로 IgG1 Fc 불변 영역의 류신 234 및 류신 235에서 알라닌 치환을 포함하는 인간 IgG1의 돌연변이체 변이체이고, p는 8이다.
화학식 (I)의 ADC의 보다 바람직한 실시양태에서,
Ab는
(i) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및
(ii) 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 항-폴레이트 수용체 알파 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고
D는 엑사테칸이고;
p는 1 내지 8, 예를 들어 4 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이고, 예를 들어 p는 7 내지 8이다.
본 개시내용의 또 다른 목적은 의약으로서 사용하기 위한, 바람직하게는 종양, 예를 들어 고형 종양, 보다 구체적으로 난소암, 유방암, 폐암 또는 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양의 치료에 사용하기 위한 상기 ADC에 관한 것이다.
본 개시내용의 또 다른 목적은 종양, 예를 들어 고형 종양, 보다 구체적으로 난소암, 유방암, 폐암 또는 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양의 치료를 위한 의약 또는 제약 조성물의 제조에서의 상기 ADC의 용도에 관한 것이다.
구체적 실시양태에서, ADC는 바람직하게는 난소암, 삼중 음성 유방암 및 비소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 사용될 수 있다.
본 개시내용은 추가로 본원에 개시된 바와 같은 항체-약물 접합체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하고, 임의로 다른 활성 성분, 예를 들어 항암 약물 또는 면역요법 약물, 예컨대 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 ADC를 수득하는 방법에 관한 것이며, 여기서 방법은:
(a) 본원에 정의된 바와 같은 항-FRα 항체의 생산에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계,
(b) 상기 항-FRα 항체를 단리하는 단계,
(c) 화학식 (VIII)의 링커 L에 결합된 엑사테칸을 합성하는 단계:
(d) 상기 항-FRα 항체를 화학식 (VIII)의 화합물에 접합시켜;
이에 의해 본 개시내용의 ADC를 수득하는 단계를 포함한다.
도 1은 실시예 4에 따른 접합체의 전임상 설치류 효능, 약동학 및 내약성 데이터를 나타낸다.
도 2는 실시예 5에 따른 폴레이트 수용체 알파 세포외 발현의 유동 세포측정 평가를 나타낸다.
도 3은 실시예 6에 따른 여러 폴레이트 수용체 알파 양성 암성 세포주에 대한 화합물 엑사테칸 메실레이트의 시험관내 세포독성 데이터를 나타낸다.
도 4는 실시예 7에 따른 재조합 인간 폴레이트 수용체 알파 단백질에 대한 접합체의 시험관내 ELISA 결합 실험을 나타낸다.
도 5는 실시예 8에 따른 재조합 인간 폴레이트 수용체 알파 단백질에 대한 접합체의 시험관내 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 결합 실험을 나타낸다.
도 6은 실시예 9에 따른 접합체의 시험관내 폴레이트 수용체 알파 양성 암 세포 결합 친화도를 나타낸다.
도 7은 실시예 10에 따른 접합체의 생체외 인간 혈장 안정성을 나타낸다.
도 8은 실시예 11에 따른 폴레이트 수용체 알파 음성 유방암 세포주 BT-474에 대한 접합체의 시험관내 세포독성 검정을 나타낸다.
도 9는 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 양성 SW-620 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 10은 실시예 12에 따른 제2 폴레이트 수용체 알파 양성 SW-620 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 11은 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 양성 OV-90 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 12는 실시예 12에 따른 제2 폴레이트 수용체 알파 양성 OV-90 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 13은 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 양성 KB 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 14는 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 양성 PA-1 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 15는 실시예 12에 따른 제3 폴레이트 수용체 알파 양성 OV-90 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 16은 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 양성 IGROV-1 이종이식 암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가 및 종양 재이식 챌린지를 나타낸다.
도 17은 실시예 12에 따른 폴레이트 수용체 알파 음성 BT-474 이종이식 유방암 모델에서의 접합체의 생체내 효능 평가를 나타낸다.
도 18은 실시예 13에 따른 고용량의 접합체의 생체내 SCID 및 CD-1 마우스 내약성 평가를 나타낸다.
도 19는 실시예 14에 따른 총 mAb, 총 ADC 및 접합체의 유리 엑사테칸 하위-성분의 생체내 래트 약동학적 평가를 나타낸다.
도 20 및 21은 실시예 15에 따른 접합체의 생체내 마우스 폐 염증 평가를 나타낸다.
도 22는 실시예 16에 따른 생체내 시노몰구스 원숭이 용량-범위-발견 독성학 연구를 나타낸다.
정의
본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
용어 "FRα" 또는 "폴레이트 수용체 알파"는 달리 기재되지 않는 한 서열식별번호: 12에 규정된 바와 같은 인간 폴레이트 수용체 알파를 지칭한다. 이 서열은, 또한 유니프롯KB에서 엔트리 P15328 (FOLR1_인간) 하에 입수가능한, FOLR1 유전자 (호모 사피엔스)에 의해 코딩된 바와 같은 폴레이트 수용체 알파의 아미노산 서열에 상응한다.
본원에 언급된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 포함한다. 자연 발생 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" (또는 간단히 "항원 부분")은 항원 (예를 들어 FRα의 부분)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전장 또는 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; F(ab)2 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 힌지 영역에서 변형된 IgG 중쇄, 예를 들어 IgG4를 갖는 단일 아암으로 이루어진 유니바디(UniBody), 도메인 항체 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), 또는 VH 도메인으로 이루어진 나노바디 단편; 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 또는 이러한 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 융합 단백질을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이는 재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자를 형성한 단일 쇄 단백질 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체도 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, FRα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 FRα 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, FRα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 FRα 분자에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어 IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "KD"는 koff 대 kon의 비 (즉 koff/kon)로부터 수득되고 몰 농도 (M)로서 표현되는 평형 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. KD 값은 항체의 농도 (특정한 실험에 필요한 항체의 양)에 관한 것이고, 따라서 KD 값이 낮을수록 (농도가 낮을수록) 항체의 친화도가 높다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. mAb의 KD 값을 결정하기 위한 바람직한 방법은 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., 1992, 1993, 및 Muller, Meth Enzymol 1983]에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 표면 플라즈몬 공명을 사용하거나, 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(Biacore)®를 사용하는 것에 의한다 (친화도 평가에 관한 상세한 정보에 대해서는 또한 문헌 [Rich RL, Day YS, Morton TA, Myszka DG. High-resolution and high-throughput protocols for measuring drug/human serum albumin interactions using BIACORE ®. Anal Biochem. 2001] 참조).
본원에 사용된 용어 "kassoc" 또는 "ka", 또는 "kon"은 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "kdis" 또는 "kd", 또는 "koff는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 수많은 부위에서 항원과 약한 비-공유 결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 많을수록 친화도는 더 강하다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원에 특이적으로 결합하는", 예를 들어 "FRα에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 단백질은 항원, 예컨대 본 개시내용에서의 FRα 상에 제시된 에피토프에 검출가능하게 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 이는 전형적으로 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM, 40 nM 이하, 또는 약 30 nM의 KD로 인간 FRα에 결합하는 항체 또는 ADC를 지칭하는 것으로 의도된다. 전형적으로, KD는 10-3 pM 내지 200 nM, 특히 0.1 pM 내지 100 nM, 특히 0.1 pM 내지 50 nM, 또는 1 pM 내지 50 nM, 특히 1 pM 내지 30 nM, 10 pM 내지 50 nM, 0.1 nM 내지 200nM 또는 0.1 nM 내지 100 nM, 또는 1 nM 내지 50 nM, 특히 1 nM 내지 30 nM에 포함된다. 전형적으로, 본 개시내용의 ADC는 FRα에 특이적이고, 상기 정의된 바와 같은 KD를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균, 특히 포유동물 세포가 바람직하며, 이는 이들이 원핵 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 더 크기 때문이다.
본원에 사용된 용어 "ADCC" 또는 "항체 의존성 세포 세포독성" 활성은 세포 고갈 활성을 지칭한다. ADCC 활성은 상업적으로 입수가능한 ADCC 검정, 예를 들어 프로메가(Promega)에 의해 Ref# G7015 하에 상업화된 바와 같은 ADCC 리포터 생물검정에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 용어 "대상체"는 또한 용어 "환자"를 포괄한다.
본원에 사용된 ADC의 화학식 (I)에서의 용어 "약물" 또는 D는 또한 "페이로드", 즉 항체 (또는 단편)에 접합된 모이어티를 지칭한다. 약물 D는 전형적 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, D는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포괄할 수 있다. 바람직하게는, 이는 치료 모이어티, 예컨대 세포독소를 지칭한다. "세포독소" 또는 "세포독성제"는 세포에 유해한 (예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 약물 또는 세포독소, 및 그의 호변이성질체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 라세미체 또는 그의 혼합물, 및 그의 수화물, 에스테르, 용매화물 또는 제약상 허용되는 염을 포괄한다.
본원에 주어진 임의의 화학식은 또한 화합물의 비표지된 형태뿐만 아니라 동위원소 표지된 형태, 예컨대 중수소 표지된 화합물 또는 14C-표지된 화합물을 나타내는 것으로 의도된다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 본 개시내용의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 전형적으로 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 지칭한다. 많은 경우에, 본 개시내용의 화합물은 아미노 및/또는 카르복실 기 또는 그와 유사한 기의 존재에 의해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 산 부가염은 유기 산 및/또는 무기 산으로 형성될 수 있다. 제약상 허용되는 염기 부가염은 유기 염기 및/또는 무기 염기로 형성될 수 있다. 이러한 염은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
용어 연결기 유닛은 화합물의 상이한 부분을 함께 연결하는 구성요소를 지칭하며, 예를 들어, 연결기는 Ab를 스페이서에, 또는 스페이서를 아미드 관능기 -CO-NR1-에 연결할 수 있다. 연결기는 항체-약물-접합체의 성분, 즉 Ab, 스페이서, 소수성 차폐 물질, 및/또는 아미드 관능기 -CO-NR1-에 대한 부착 부위를 보유하는 스캐폴드이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 그의 지식으로부터 적절한 연결기를 선택할 수 있다. 연결기의 비포괄적 목록은 아미노산, 예를 들어 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 세린, 티로신, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 호모알라닌; 아미노 알콜; 아미노 알데히드; 폴리아민 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 유리하게는, 연결기 유닛 X1 및/또는 X2는 1개 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산이다. 하나의 실시양태에서, 연결기 유닛 X1 및/또는 X2는 글루탐산, 리신 및 글리신으로부터 선택된다. 연결기 유닛 X1 및 X2는 독립적으로 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고; R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
연결기 유닛의 예는 임의로 치환된 폴리에테르, 아미노산, 벤질 기, 아민, 케톤, 을 포함한다.
특히, 연결기 유닛은 2가 또는 3가일 수 있다. 예를 들어, X2는 소수성 차폐 물질 K가 존재하는 경우에 3가 연결기 유닛일 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 또는 비-천연 아미노산을 지칭한다. X2가 1개 이상의 아미노산으로 이루어진 경우에, -CONR1- 또는 -CONR1'- 기의 CO 모이어티는 X2 연결기 유닛의 일부로서 간주될 수 있다. 아미노산의 비포괄적 목록은 리신, 글루탐산, 아스파르트산, 세린, 티로신, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신 및 호모알라닌을 포함한다.
스페이서는 항체-약물-접합체의 2개의 성분, 예컨대 2개의 연결기 유닛에 공유 결합하는 2가 아암이다.
스페이서 유닛의 비포괄적 목록은 알킬렌, 헤테로알킬렌 (따라서 알킬렌에 Si, N, O 및 S로부터 선택된 적어도 1개의 헤테로원자가 개재됨); 알콕시; 폴리에테르, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 및 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜; 1종 이상의 천연 또는 비-천연 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, N-메틸글리신; C3-C8 헤테로시클로; C3-C8 카르보시클로; 아릴렌, 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 스페이서는 2가 선형 알킬렌 기, 바람직하게는 (CH2)4이다.
예를 들어, 스페이서는 -C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 헤테로알킬렌-, -C3-C8　카르보시클로-, -O-(C1 C8　알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8　카르보시클로)-, -(C3-C8　카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8　헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8　헤테로시클로)-, -(C3-C8　헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 헤테로알킬렌-C(=O)-, -C3-C8　카르보시클로-C(=O)-, -O-(C1-C8　알킬)-C(=O)-, -아릴렌-C(=O)-, -C1-C10　알킬렌-아릴렌-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-C(=O)-, -C1-C10　알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-C(=O)-, -(C3-C8　카르보시클로)-C1-C10　알킬렌-C(=O)-, -C3-C8　헤테로시클로-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)-C(=O)-, -(C3-C8　헤테로시클로)-C1-C10　알킬렌-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 헤테로알킬렌-NH-, -C3-C8　카르보시클로-NH-, -O-(C1-C8　알킬)-NH-, -아릴렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-NH-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8　카르보시클로)-NH-, -(C3-C8　카르보시클로)-C1-C10　알킬렌-NH-, -C3-C8헤테로시클로-NH-, -C1-C10　알킬렌-(C3-C8　헤테로시클로)-NH-, -(C3-C8　헤테로시클로)-C1-C10　알킬렌-NH-, -C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10　헤테로알킬렌-S -, -C3-C8카르보시클로-S -, -O-(C1-C8　알킬)-)-S -, -아릴렌-S-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-S-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8　카르보시클로)-S-, -(C3-C8　카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C3-C8　헤테로시클로-S-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8　헤테로시클로)-S-, -(C3-C8　헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-S-, -C1-C10 알킬렌-O-C(=O)-, -C3-C8　카르보시클로-O-C(=O)-, -O-(C1-C8　알킬)-O-C(=O)-, -아릴렌-O-C(=O)-, -C1-C10　알킬렌-아릴렌-O-C(=O)-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-O-C(=O)-, -C1-C10　알킬렌-(C3-C8카르보시클로)-O-C(=O)-,-(C3-C8　카르보시클로)-C1-C10　알킬렌-O-C(=O)-, -C3-C8　헤테로시클로-O-C(=O)-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8헤테로시클로)-O-C(=O)-, 및 -(C3-C8　헤테로시클로)-C1-C10　알킬렌-O-C(=O)-로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 언급된 기 중 임의의 것은 -X, -R', -O-, -OR', =O, -SR', -S-, -NR'2, -NR'3 +, =NR', -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NR'C(=O)R', -C(=O)R', -C(=O)NR'2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R', -OS(=O)2OR', -S(=O)2NR', -S(=O)R', -OP(=O)(OR')2, -P(=O)(OR')2, -PO3 -, -PO3H2, -C(=O)X, -C(=S)R', -CO2R', -CO2, -C(=S)OR', C(=O)SR', C(=S)SR', C(=O)NR'2, C(=S)NR'2, 및 C(=NR')NR'2로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: -F, -Cl, -Br, 또는 -I이고; 각각의 R'는 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C6-C10 아릴, 또는 -C3-C10 헤테로사이클이다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 1가 포화 탄화수소 쇄 (직쇄 또는 분지쇄를 가짐)를 지칭한다. 예를 들어, 알킬은 C1-C20 알킬을 지칭한다. 바람직하게는, 알킬은 "저급 알킬", 즉 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 갖는 알킬 기 (직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬 기)이다. 예를 들어, 이는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함한다.
단독으로 또는 예를 들어 알킬렌 글리콜의 일부로서 사용되는 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같은 2가 포화, 직쇄 또는 분지형 알킬 기를 지칭한다.
알케닐 및 알키닐은 2-20개의 탄소 원자, 바람직하게는 2-12개, 보다 바람직하게는 2-6개, 특히 2-4개를 갖는 적어도 부분적으로 불포화된 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기를 지칭한다. 알케닐 기는 적어도 1개의 C=C 이중 결합을 포함하고; 알키닐 기는 적어도 1개의 C≡C 삼중 결합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "C3-C8 시클로알킬" 또는 "카르보사이클"은 3 내지 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 6개를 갖는 포화 또는 불포화 시클릭 기를 지칭한다. 시클로알킬은 단일 고리 또는 함께 융합된 다중 고리를 가질 수 있다. 시클로알킬은 또한 스피로시클릭 고리를 포함할 수 있다. 적합한 시클로알킬 기는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "C3-C8 시클로알킬렌" 또는 "카르보시클로"는 본원에 정의된 바와 같은 2가 시클로알킬을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "할로겐"은 플루오로 (-F), 클로로 (-Cl), 브로모 (-Br) 또는 아이오도 (-I) 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6 할로알킬"은 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 할로겐 기에 의해 치환된 본원에 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬을 지칭한다. 적합한 C1-C6 할로알킬 기는 트리플루오로메틸 및 디클로로메틸을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자, 및 O, N, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자로 이루어진 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 (예를 들어: 술폭시드 또는 술폰), 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬 기가 분자의 나머지에 부착되는 위치에 위치할 수 있다.
헤테로알킬렌은 상기 정의된 바와 같은 2가 헤테로알킬을 지칭한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 헤테로원자는 또한 쇄 말단 중 하나 또는 둘 다를 점유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6 알콕시"는 -O-알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 기는 본원에 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬이다. 적합한 C1-C6 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6 할로알콕시"는 본원에 정의된 바와 같은 1개 이상의 할로겐 기에 의해 치환된, 본원에 정의된 바와 같은 C1-C6 알콕시 기를 지칭한다. 적합한 할로알콕시는 트리플루오로메톡시를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴"은 6 내지 10개의 고리 원자를 함유하는 단일 고리 또는 함께 융합된 다중 방향족 고리를 갖고, 여기서 적어도 1개의 고리가 방향족인, 다중불포화, 방향족 히드로카르빌 기를 지칭한다. 방향족 고리는 임의로 그에 융합된 1 내지 2개의 추가의 고리 (본원에 정의된 바와 같은 시클로알킬, 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴)를 포함할 수 있다. 적합한 아릴 기는 페닐, 나프틸, 및 헤테로시클릴에 융합된 페닐 고리, 예컨대 벤조피라닐, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥사닐 등을 포함한다.
아릴렌은 상기 정의된 바와 같은 2가 아릴 기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴"은 5 내지 10개의 원자를 함유하는 단일 고리 또는 함께 융합되거나 공유 연결된 다중 방향족 고리를 갖고, 여기서 적어도 1개의 고리가 방향족이고, 적어도 1개의 고리 원자가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자인, 다중불포화, 방향족 고리계를 지칭한다. 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 이러한 고리는 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클릴 고리에 융합될 수 있다. 이러한 헤테로아릴의 비제한적 예는 푸라닐, 티오페닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 옥사트리아졸릴, 티아트리아졸릴, 피리디닐, 피리미딜, 피라지닐, 피리다지닐, 옥사지닐, 디옥시닐, 티아지닐, 트리아지닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조푸라닐, 이소벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 이소벤조티오페닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 퓨리닐, 벤조티아디아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 신놀리닐, 퀴나졸리닐 및 퀴녹살리닐을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴", "3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬" 또는 "헤테로시클릴"은 3 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 3 내지 8개의 고리 원자를 갖고, 여기서 적어도 1개의 고리 원자가 N, O 및 S로부터 선택된 헤테로원자인, 포화 또는 불포화 시클릭 기를 지칭한다. 질소 및 황 헤테로원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로사이클은 융합된 또는 가교된 고리뿐만 아니라 스피로시클릭 고리를 포함할 수 있다. 헤테로사이클의 예는 테트라히드로피리딜, 피페리디닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 피페라지닐, 1-아제파닐, 이미다졸리닐, 1,4-디옥사닐 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "헤테로시클로" 또는 "헤테로시클로알킬렌"은 본원에 정의된 바와 같은 2가 헤테로사이클을 지칭한다.
또한, 용어 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, C3-C8 카르보사이클, C3-C8 카르보시클로, C3-C8 헤테로사이클, C3-C8 헤테로시클로, 폴리에테르는 -X, -R', -O-, -OR', =O, -SR', -S-, -NR'2, -NR'3, =NR', -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R', -C(=O)R', -C(=O)NR'2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R', -OS(=O)2OR', -S(=O)2NR', -S(=O)R', -OP(=O)(OR')2, -P(=O)(OR')2, -PO3 -, -PO3H2, -C(=O)R', -C(=O)X, -C(=S)R', -CO2R', -CO2, -C(=S)OR', C(=O)SR', C(=S)SR', C(=O)NR'2, C(=S)NR'2, 및 C(=NR')NR'2로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환된 기를 지칭하며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: -F, -CI, -Br, 또는 -I이고; 각각의 R'는 독립적으로 -H, -C1-C20 알킬, -C6-C10 아릴, 또는 -C3-C10 헤테로사이클이다.
본원에 사용된 용어 "폴리에테르"는 에테르 연결을 함유하는 중합체를 지칭한다. 폴리에테르에서의 에테르 모이어티의 수는 2 내지 100, 바람직하게는 2 내지 25, 특히 2 내지 10에 포함될 수 있다. 폴리에테르의 예는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
전자 끄는 기는, 통상적으로 공명 또는 유도 효과에 의해, 이웃 원자로부터 그 자체를 향해 전자 밀도를 끌어당기는 원자 또는 기를 지칭한다. 전자 끄는 기는 할로겐, 할로알킬 (예컨대 -CF3), -CN, -SO3H, -NO2, 및 -C(O)R 기를 포함하며, 여기서 R= H, OH, 또는 알콕시이다. 유리하게는, 전자 끄는 기는 -NO2이다. 한 실시양태에서, 전자-끄는 기는 페닐 고리의 Y-T 치환기에 대해 오르토 위치에 있다.
본원에 사용된 용어 "보호기"는 분자 내의 재생된 관능기 또는 다른 관능기를 공격하지 않는, 용이하게 입수가능한 시약에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 화학적 치환기를 지칭한다. 적합한 보호기는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 계속해서 개발되고 있다. 적합한 보호기는, 예를 들어 문헌 [Wutz et al., ("Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Edition," Wiley-Interscience, 2007)]에서 찾아볼 수 있다. 문헌 [Wutz et al., (pages 696-927)]에 기재된 바와 같은 아미노 기의 보호를 위한 보호기가 특정 실시양태에서 사용된다. 아미노 보호기의 대표적인 예는 t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 9-플루오레닐 메톡시카르보닐 (Fmoc), 아세틸 (Ac), 카르복시벤질 기 (Cbz), 벤질 기 (Bn), 알릴, 트리플루오로아세틸, 알릴옥시 카르보닐 (Alloc) 기 및 2,2,2- 트리클로로에톡시카르보닐 (Troc)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
소수성 차폐 물질은 화합물의 겉보기 소수성을 감소시킬 수 있는 기를 지칭한다. 소수성 차폐 물질은 폴리사르코신 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있다. 에틸렌 글리콜 또는 사르코신 모이어티의 수는 넓은 범위에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 소수성 차폐 물질에서의 에틸렌 글리콜 또는 사르코신 잔기의 수는 2 내지 500, 바람직하게는 5 내지 100, 특히 5 내지 25에 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 소수성 차폐 물질은 6 내지 24개의 사르코신 모이어티를 포함하는, 바람직하게는 10 내지 12개의 사르코신 모이어티를 포함하는 폴리사르코신이다.
본원에 사용된 용어 "결합된"은 연결을 지칭한다. 이러한 연결은 또한 화학식 (I)에서 대시 "-"로 나타내어진다. 연결은 공유 결합, 또는 예컨대 정전기력을 통한 비-공유 상호작용일 수 있다. 바람직하게는, 결합은 공유 결합이다. 본원에 사용된 화학식 상의 "파상선"은 본 개시내용의 ADC의 각각의 부분 (Ab, L, Z, X 및 D) 사이의 부착 부위를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환을 억제하는 것; 예를 들어, 질환, 상태 또는 장애의 병리상태 또는 증상학을 경험하거나 나타내고 있는 개체에서 질환, 상태 또는 장애를 억제하는 것 (즉, 병리상태 및/또는 증상학의 추가 발달을 정지시키는 것); 및 (2) 질환을 호전시키는 것; 예를 들어, 질환, 상태 또는 장애의 병리상태 또는 증상학을 경험하거나 나타내고 있는 개체에서 질환, 상태 또는 장애를 호전시키는 것 (즉, 병리상태 및/또는 증상학을 역전시키는 것), 예컨대 질환의 중증도를 감소시키는 것 또는 질환의 1종 이상의 증상을 감소 또는 완화시키는 것 중 1종 이상을 지칭한다. 특히, 종양의 치료와 관련하여, 용어 "치료"는 종양 성장의 억제 또는 종양 크기의 감소를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 ADC의 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에, 예를 들어 투여 후 치료 효과, 예컨대 종양 성장 속도 또는 종양 부피의 억제 또는 감소, 암의 증상의 감소 또는 치료 효능의 일부 징후를 생성하기에 충분한 양이다. 암의 경우에, ADC의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/거나, 종양 크기를 감소시키고/거나, 종양 전이를 억제 (예를 들어, 둔화 또는 정지)하고/거나, 종양 성장을 억제 (예를 들어, 둔화 또는 정지)하고/거나, 1종 이상의 증상을 완화시킬 수 있다.
본원에 사용된 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 x 100). 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 기재된 바와 같은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 니들만 및 분쉬 알고리즘 (NEEDLEMAN, 및 Wunsch)을 사용하여 결정될 수 있다.
2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 또한 예를 들어 알고리즘, 예컨대 EMBOSS 니들 (쌍별 정렬; www.ebi.ac.uk에서 이용가능함)을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, EMBOSS 니들은 BLOSUM62 매트릭스, "갭 개방 페널티" 10, "갭 연장 페널티" 0.5, "단부 갭 페널티" 거짓, "단부 갭 개방 페널티" 10 및 "단부 갭 연장 페널티" 0.5로 사용될 수 있다. 일반적으로, "퍼센트 동일성"은 매칭되는 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 정렬 후에 비교된 2개의 서열 사이에서 10개의 서열 위치 중 6개가 동일한 경우에, 동일성은 60%이다. % 동일성은 전형적으로 분석이 수행되는 질의 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다. 동일한 1차 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 2개의 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형과 무관하게 동일하다.
본 개시내용의 ADC를 제조하는 데 사용하기 위한 항체 Ab
본 개시내용의 ADC를 제조하는 데 사용하기 위한 항체 Ab는 서열식별번호: 12에 특이적으로 결합하는 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체이다.
바람직하게는, 이러한 항체는, 단리되고 하기 표 1에 기재된 바와 같은 그의 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열 및 인간 불변 이소형에 의해 구조적으로 특징화되는 하기 항체를 포함한다:
표 1: 가변 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
IgG1 LALA는 문헌 [J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 by Hezareh et al.]에 또한 개시되어 있는, 잔기 234 및 235에서 류신에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 IgG1 Fc 영역에 상응한다.
mAb1의 전장 경쇄 및 중쇄 및 상응하는 코딩 서열이 하기 표 2에 제시된다.
표 2: 전장 중쇄 및 경쇄 아미노산 및 DNA 코딩 서열
mAb1 항체의 VH CDR1 (또한 HCDR1로도 불림), VH CDR2 (또한 HCDR2로도 불림), VH CDR3 (또한 HCDR1로도 불림), VL CDR1 (또한 LCDR1로도 불림), VL CDR2 (또한 LCDR2로도 불림), VL CDR3 (또한 HCDR3으로도 불림)의 아미노산 서열의 예는 표 3에 제시된다.
표 3에서, 본 개시내용의 일부 항체의 CDR 영역은 카바트 시스템을 사용하여 서술된다. 판독의 용이성을 위해, CDR 영역은 하기에서 각각 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3으로 불린다.
표 3: 카바트에 따른 mAb1의 CDR 영역 (또한 WO2017151979에 개시됨)
하기 표 4 및 5는 ADC의 항체에 관한 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
표 4: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 간단한 설명
*aa는 아미노산 서열이고,
nt는 뉴클레오티드 서열임
표 5: 본 발명을 실시하기 위한 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열
한 실시양태에서, Ab는
(i) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(ii) 서열식별번호: 4의 LCDR1; 서열식별번호: 5 또는 8의 LCDR2; 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 갖는 단리된 재조합 항체이며;
여기서 상기 항체는 서열식별번호: 12의 폴레이트 수용체 알파에 특이적으로 결합한다.
구체적 실시양태에서, Ab는
(a) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는
(b) 서열식별번호: 7의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 8의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 재조합 항체이다.
구체적 실시양태에서, Ab는 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 재조합 항체이다.
구체적 실시양태에서, Ab는 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 재조합 항체이다.
구체적 실시양태에서, Ab는 서열식별번호: 16의 중쇄 및 서열식별번호: 17의 경쇄를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 재조합 항체이다.
구체적 실시양태에서, Ab는 하기 특성 중 1종 이상을 갖는 항-FRα 항체이다:
(i) 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어® 검정에 의해 측정 시 100nM 이하의 KD, 바람직하게는 50 nM 이하의 KD로 폴레이트 수용체 수용체 α (FRα)에 결합함;
(ii) 내재화 항체이고, 특히 FRα 발현 종양 세포에 내재화됨;
(iii) 특히 안정성 문제 또는 응집 없이 항체당 4 내지 8개의 페이로드의 접합을 가능하게 함.
이전 실시양태와 조합될 수 있는 특정 실시양태에서, Ab는 상기 정의된 재조합 항체의 내재화 항체 단편이다.
항체와 관련하여 본원에 사용된 "내재화"는 세포에 대한 특이적 결합 시 세포의 지질 이중층 외부 막을 통해 내부 구획으로 (즉, "내재화"), 바람직하게는 세포 내 분해 구획으로 항체가 받아들여질 수 있는 것을 지칭한다.
항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 유니바디, 및 scFv 단편, 디아바디, 단일 도메인 또는 나노바디 및 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL)로 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강제된다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 항체 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, Ab는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체와 적어도 동일한 친화도 (또는 뛰어난 친화도)를 가지면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간화 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체, 예를 들어 뮤린 항-FRα 내재화 항체로부터 유래되고 프레임워크 영역 (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 한 부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 프레임워크 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유래된 항-FRα 뮤린 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 일부 구체적 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 CDR 잔기가 또한 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 회복시키거나 개선시키기 위해 치환된다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
바람직하게는, Ab는 인간화 또는 인간 침묵 항체, 바람직하게는 인간화 침묵 IgG1 항체이다.
본원에 사용된 용어 "침묵" 항체는 ADCC 활성 검정에서 측정 시 ADCC 활성을 나타내지 않거나 또는 낮은 ADCC 활성을 나타내는 항체를 지칭한다.
한 실시양태에서, 용어 "ADCC 활성이 없거나 또는 낮은 ADCC 활성"은 침묵 항체가 야생형 상응하는 IgG 이소형을 갖는 상응하는 항체에서 관찰되는 ADCC 활성의 적어도 10% 미만, 예를 들어 50% 미만인 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 의미한다.
침묵 이펙터 기능은 항체의 Fc 불변 부분에서의 돌연변이에 의해 수득될 수 있고, 이는 문헌 [Art: Strohl 2009 (AA & N297A); Baudino 2008, D265A (Baudino et al., J.Immunol. 181 (2008): 6664-69, Strohl, CO Biotechnology 20 (2009): 685-91)]에 기재되어 있거나, 또는 문헌 [Saunders 2019 (Front. Immunol., 07 June 2019, doi:10.3389/fimmu.2019.01296)]에서 또한 검토되었다. 침묵 IgG1 항체의 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에서 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이, 또는 Leu235Glu와 쌍형성된 Ser228Pro를 포함한다. Pro331Ser은 또한 침묵 IgG1 항체를 생성하기 위해 임의로 Ledu234Glu 및 Leu235Phe와 조합되어 (LALA-PG) 사용될 수 있다. 침묵 IgG1 항체의 또 다른 예는 비-글리코실화 또는 비글리코실화 항체를 야기하는 N297A 돌연변이를 포함한다. 침묵 IgG4 항체의 예는 Ser228Pro를 포함한다.
구체적 실시양태에서, Ab는 파를레투주맙, 또는 WO2005080431 또는 WO2017151979에 개시된 바와 같은 다른 항-FRα 항체이다.
다른 구체적 실시양태에서, Ab는 미르베툭시맙 또는 미르베툭시맙의 침묵 LALA 돌연변이체 버전이다.
바람직한 실시양태에서, Ab는 파를레투주맙의 침묵 LALA 돌연변이체 버전, 또는 WO2005080431 또는 WO2017151979에 개시된 바와 같은 다른 항-FRα 항체이다.
돌연변이체 아미노산 서열을 갖는 항체는 코딩 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어, 코딩된 변경된 항체를 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능 (즉, 상기 제시된 기능)에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, Ab는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 또는 모두는 본원에 기재된 mAb1 (파를레투주맙의 침묵 LALA 돌연변이체 버전) 항체 또는 파를레투주맙의 CDR 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산 보존적 변형만큼 상이한 유사한 CDR 서열을 갖는 상기 항체의 기능적 변이체에 기초한 명시된 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항체 또는 단백질은 특히 ADC로서 사용되는 경우에 mAb1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
특정 실시양태에서, Ab는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 1개 이상은 본원에 기재된 미르베툭시맙 (미르베툭시맙의 침묵 LALA 돌연변이체 버전) 항체 또는 파를레투주맙의 CDR 서열과 1, 2 또는 3개의 아미노산 보존적 변형만큼 상이한 유사한 CDR 서열을 갖는 상기 항체의 기능적 변이체에 기초한 명시된 아미노산 서열을 갖고, 여기서 항체 또는 단백질은 특히 ADC로서 사용되는 경우에 mAb1 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
항-FRα 항체의 목적하는 기능적 특성은 비제한적으로 하기를 포함한다:
(i) Elisa 검정 (실시예에 기재된 바와 같음)에 의해 결정 시 폴레이트 수용체 수용체 α (FRα)에 5nM 미만, 예를 들어 약 0.5nM의 EC50으로 결합함.
(ii) 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어® 검정에 의해 측정 시, 예를 들어 실시예에 기재된 SPR 비아코어 친화도 검정을 사용하여 결정 시, 폴레이트 수용체 수용체 α (FRα)에 100nM 이하의 KD, 바람직하게는 50 nM 이하의 KD로 결합함,
(iii) 내재화 항체이고, 특히 FRα 발현 종양 세포에 내재화됨;
(iv) 특히 안정성 문제 또는 응집 없이 항체당 4 내지 8개의 페이로드의 접합을 가능하게 하며, 여기서 약물-항체-비는 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 RPLC-MS에 의해 결정됨;
(v) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 FRα 음성 세포주에서의 시험관내 효능 검정 사용 시, 항-FRα 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 낮은, FRα 음성 세포주 (예컨대 BT-474 유방암 세포주)에서의 시험관내 효능을 제공함; 및/또는
(vi) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 이종이식 모델 중 1가지의 사용 시, 항-FRa 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 높은, 종양-보유 마우스 이종이식 모델에서의 생체내 효능을 제공함.
본원에 사용된 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 아미노산 치환을 지칭하는 것으로 의도된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 시험될 수 있다.
변형은 관련 기술분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 개시내용의 항체 내로 도입될 수 있다.
구체적 실시양태에서, Ab는 서열식별번호: 1-6의 상응하는 CDR과 100% 동일한 6개의 CDR, 및 각각 서열식별번호: 7 및 8에 명시된 바와 같은 상응하는 프레임워크 아미노산 영역과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 프레임워크 아미노산 영역을 포함하는 항-FRα 항체이며, 여기서 상기 항-FRα 항체는 하기 특성을 갖는다:
(i) Elisa 검정 (실시예에 기재된 바와 같음)에 의해 결정 시 폴레이트 수용체 수용체 α (FRα)에 5nM 미만, 예를 들어 약 0.5nM의 EC50으로 결합함.
(ii) 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어® 검정에 의해 측정 시 100nM 이하의 KD, 바람직하게는 50 nM 이하의 KD로 폴레이트 수용체 수용체 α (FRa)에 결합함;
(iii) 내재화 항체이고, 특히 FRα 발현 종양 세포에 내재화됨;
(iv) 특히 안정성 문제 또는 응집 없이 항체당 4 내지 8개의 페이로드의 접합을 가능하게 하며, 여기서 약물-항체-비는 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 RPLC-MS에 의해 결정됨;
(v) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 FRα 음성 세포주에서의 시험관내 효능 검정 사용 시, 항-FRα 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 낮은, FRα 음성 세포주 (예컨대 BT-474 유방암 세포주)에서의 시험관내 효능을 제공함; 및/또는
(vi) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 이종이식 모델 중 1가지의 사용 시, 항-FRa 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 높은, 종양-보유 마우스 이종이식 모델에서의 생체내 효능을 제공함.
구체적 실시양태에서, Ab는 미르베툭시맙의 상응하는 CDR과 100% 동일한 6개의 CDR, 및 미르베툭시맙의 상응하는 프레임워크 아미노산 영역과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 프레임워크 아미노산 영역을 포함하는 항-FRα 항체이며, 여기서 상기 항-FRα 항체는 하기 특성을 갖는다:
(i) Elisa 검정 (실시예에 기재된 바와 같음)에 의해 결정 시 폴레이트 수용체 수용체 α (FRα)에 5nM 미만, 예를 들어 약 0.5nM의 EC50으로 결합함.
(ii) 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 비아코어® 검정에 의해 측정 시 100nM 이하의 KD, 바람직하게는 50 nM 이하의 KD로 폴레이트 수용체 수용체 α (FRa)에 결합함;
(iii) 내재화 항체이고, 특히 FRα 발현 종양 세포에 내재화됨;
(iv) 특히 안정성 문제 또는 응집 없이 항체당 4 내지 8개의 페이로드의 접합을 가능하게 하며, 여기서 약물-항체-비는 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같이 RPLC-MS에 의해 결정됨;
(v) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 FRα 음성 세포주에서의 시험관내 효능 검정 사용 시, 항-FRα 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 낮은, FRα 음성 세포주 (예컨대 BT-474 유방암 세포주)에서의 시험관내 효능을 제공함; 및/또는
(vi) 이러한 변이체 항-FRα 항체를 갖는 ADC는, 예를 들어 실시예에 사용된 바와 같은 이종이식 모델 중 1가지의 사용 시, 항-FRα 항체로서 mAb1을 갖는 상응하는 대조군 ADC와 유사하거나 더 높은, 종양-보유 마우스 이종이식 모델에서의 생체내 효능을 제공함.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 개시내용의 ADC에 사용하기 위해, Ab는 또한 이전 섹션에 개시된 항체의 조작된 버전을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 항체의 특성을 개선시키기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형이 이루어진 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이된" 항체는 또한 본 발명에 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 항체는 전형적으로 항체의 1종 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다.
또한, Ab는 항체의 1종 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있는 항체이다. 각각의 이들 실시양태는 하기에 추가로 상세히 기재된다.
본원에 사용된 용어 "이소형 불변 영역" 또는 "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한, 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 IgG 항체의 위치 C226 또는 P230으로부터 카르복실-말단까지의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 넘버링이다. Fc 영역의 C-말단 리신 (잔기 K447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안 제거될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 갖는 항체와 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다.
하나의 구체적 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.
다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체가 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력을 감소시키고/거나 항체의 Fcγ 수용체에 대한 친화도를 감소시키기 위해 1개 이상의 아미노산을 변형시키는 것에 의해 변형된다. 감소된 이펙터 기능, 특히 감소된 ADCC를 갖는 이러한 항체는 침묵 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적 실시양태에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이체 변이체, 예를 들어 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하고/거나 Fcγ 수용체에 결합하는 ADC의 능력을 감소시키거나 제거하는 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 바람직한 예는 문헌 [J. Virol 2001 Dec;75(24):12161-8 by Hezareh et al.]에 기재된 바와 같은, 아미노산 위치 234 및 235의 류신이 알라닌에 의해 대체된 (소위 LALA 돌연변이) IgG1이다. 또 다른 예는 LALA 돌연변이에 더하여, 위치 329의 프롤린이 글리신에 의해 대체된 LALA-PG 삼중 돌연변이를 갖는 IgG1 이소형 침묵 돌연변이체이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297에서의 글리코실화를 방지하는 침묵 Fc 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297에서 아스파라긴의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N297의 글리신 또는 알라닌에 의한 대체이다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 야기하여 그러한 부위에서 글리코실화를 제거하는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
본 개시내용에 의해 고려되는 본원의 항체의 또 다른 변형은 PEG화 또는 HES화 또는 관련 기술이다. 항체는 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와, 1개 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화 항체이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 개시내용의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
본 개시내용에 의해 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성되는 분자의 반감기를 증가시키기 위한 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 그의 단편에 대한 본 개시내용의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 접합 또는 단백질 융합이다. 이러한 접근법은 예를 들어 EP 0 322 094 (Ballance et al.)에 기재되어 있다.
본 개시내용의 ADC를 제조하는 데 사용하기 위한 항체의 생산
본 개시내용의 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산뿐만 아니라 이들 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성에 관한 보다 많은 정보를 위해, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 국제 출원 번호 WO2005080431을 참조할 수 있다.
예를 들어, 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 또는 생화학 기술 (예를 들어, DNA 화학적 합성, PCR 증폭, 또는 관심 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)에 의해 수득할 수 있고, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 DNA를 발현 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록 항체 유전자가 벡터 내로 라이게이션되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입될 수 있거나, 또는 보다 전형적으로 둘 다의 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 단부 라이게이션)에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 사용하여, VH 절편이 벡터 내의 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내의 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 이들을 이미 목적하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 코딩하고 있는 발현 벡터 내로 삽입함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자를 생성할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 인 프레임으로 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자에 더하여, 본원에 개시된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조절 서열의 선택을 포함한 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 시토메갈로바이러스 (CMV), 원숭이 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스 조절 서열, 예컨대 유비퀴틴 프로모터 또는 P-글로빈 프로모터가 사용될 수 있다. 추가로, 조절 요소는 상이한 공급원으로부터의 서열, 예컨대 SV40 초기 프로모터 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형 1의 긴 말단 반복부로부터의 서열을 함유하는 SRa 프로모터 시스템으로 구성된다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 개시내용의 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기점) 및 선택 마커 유전자를 보유할 수 있다. 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017 (모두 Axel et al.) 참조). 예를 들어, 전형적으로 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여한다. 선택 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선택을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 다양한 형태의 용어 "형질감염"은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입에 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하다. 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포, 효모 또는 사상 진균에서의 항체의 발현이 논의되며, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 어셈블리하고 분비할 가능성이 원핵 세포보다 더 크기 때문이다.
본 개시내용의 ADC를 제조하는 데 사용하기 위한 바람직한 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 표 3 및 4에 기재되어 있다 (특히 서열식별번호: 13-15 참조).
본 개시내용의 재조합 항체를 발현하기 위한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포), 예컨대 DHFR 선택 마커 (문헌 [Kaufman and Sharp, 1982]에 기재된 바와 같음)와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포 (문헌 [Urlaub and Chasin, 1980]에 기재됨), CHOK1 dhfr+ 세포주, NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 및 임의로 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 항체의 분비에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양하는 것에 의해 생산된다. 항체는 그의 분비 후에 예를 들어 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수 및 정제될 수 있다.
링커 L
본원에 사용된 "링커" 또는 "링커 모이어티"는 화합물, 예컨대 약물 모이어티를 또 다른 모이어티, 예컨대 항체 모이어티에 공유 연결시킬 수 있는 임의의 화학적 모이어티를 지칭한다.
본 개시내용의 ADC는 한 측에서 이전 섹션에 개시된 바와 같은 Ab, 상기 항-FRα 항체에 결합되고, 다른 측에서 약물 D에 결합된 절단가능한 링커 모이어티 L을 함유한다.
구체적 실시양태에서, 링커 L은, 예를 들어 항체 서열의 천연 또는 인공 시스테인 잔기로부터의, 항체 Ab의 1개 이상의 티올 잔기에 공유 결합된다.
본원에 사용된 용어 "절단가능한"은 특정 환경 조건 (예컨대 산화환원 전위 또는 pH) 또는, 예를 들어 세포 내 ADC의 내재화 후에 세포내 환경에 반응하여 특정 리소솜 효소 하에 절단될 수 있는 링커를 지칭한다.
구체적 실시양태에서, L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커 모이어티이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이다.
구체적 실시양태에서, 임의의 스트레쳐 유닛 A는 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
본 개시내용의 ADC에 사용될 수 있는 절단가능한 링커의 예는 산-감수성 또는 산-불안정성 링커, 예컨대 산-불안정성 히드라존 링커, 리소솜 프로테아제-감수성 링커, b-글루쿠로니드 링커 또는 글루타티온-감수성 디술피드 링커를 포함한다.
L이 리소솜 프로테아제-감수성 링커인 구체적 실시양태에서, W는 발린-시트룰린 (Val-Cit), 알라닌-알라닌-아스파라긴 (Ala-Ala-Asn), 발린-알라닌 (Val-Ala) 및 페닐알라닌-리신 (Phe-Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 절단가능한 펩티드 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, W는 발린-알라닌 펩티드 모이어티를 포함한다.
L이 프로테아제 감수성 링커인 다른 구체적 실시양태에서, W는 바람직하게는 β-글루쿠로니드 또는 β-갈락토시드 모이어티로부터 선택된 당 절단가능한 유닛을 포함한다.
L이 글루타티온 감수성 링커인 다른 구체적 실시양태에서, W는 디술피드 모이어티를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커 모이어티이며, 여기서 W는 하기 화학식 (III)
및 그의 제약상 허용되는 염을 갖고, 여기서
각각의 R2는 독립적으로 전자-끄는 기 및 C1-C4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n은 0, 1 또는 2이고;
T는 당 절단가능한 유닛 또는 폴리펩티드 절단가능한 유닛이고;
Y는 T가 당 절단가능한 유닛인 경우에 O이거나, 또는 T가 폴리펩티드 절단가능한 유닛인 경우에 NR3이고;
R3은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, T는 글루쿠로니드 또는 갈락토시드인 당 절단가능한 유닛이다.
다른 구체적 실시양태에서, T는 바람직하게는 Val-Cit, Val-Ala 및 Phe-Lys로부터 선택된 디펩티드이다.
보다 구체적 실시양태에서, L은 화학식 (IV)의 링커 -A-W-에 상응하고,
여기서
X1은 연결기 유닛이고;
Z는 임의적인 스페이서이고;
X2는 연결기 유닛이고;
K는, 바람직하게는 폴리사르코신 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 임의적인 소수성 차폐 물질이고;
R1은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R4는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R5는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재된다.
화학식 (IV)의 링커의 바람직한 실시양태에서, X1 및 X2는 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
화학식 (IV)의 링커의 다른 바람직한 실시양태에서, Z는 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 링커 L의 다른 실시양태에서, K는 바람직하게는 하기 화학식 (V)의 폴리사르코신이며
,
여기서 k는 2 내지 50, 바람직하게는 4 내지 30의 정수이고,
R6은 OH 또는 NH2에 상응한다.
화학식 (IV) 또는 (V)의 링커 L의 다른 실시양태에서, K는 바람직하게는 2 내지 50개의 에틸렌-글리콜 모이어티를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티 (PEG)이다.
바람직한 실시양태에서, L은 화학식 (VI)의 링커에 상응한다:
바람직하게는, 상기 링커 L은 항체 Ab의 1개 이상의 티올 잔기, 예를 들어 항체 Ab의 8개의 티올 잔기에 공유 결합된다.
페이로드
한 실시양태에서, 본 개시내용의 D는 X의 카르보닐 관능기 측 상의 X에 연결된 페이로드이다. 한 실시양태에서, X와 D 사이의 연결은 X의 카르보닐 관능기와 D의 아미노 기 사이에서 발생한다.
페이로드 D는 ADC 설계의 중요한 성분이다. 페이로드는 치료제 또는 약물일 수 있다. 용어 "약물"은 특히 생물학적 과정을 조정할 수 있고/거나 생물학적 활성을 갖는 작용제를 지칭한다.
구체적 실시양태에서, 페이로드 D는 종양 세포의 세포질 내부에서 내재화된 ADC로부터의 방출 후에 활성화되는 세포독성 약물이다. 이는 이상적으로는 (항체에 연결된 경우) 비-종양 세포에 영향을 미치지 않으면서 종양 세포를 파괴할 수 있어야 한다. 페이로드는 또한 이상적으로는 전신 순환 및 리소솜에서 높은 안정성을 가져야 한다. 이는 바람직하게는 암 세포주에 대한 시험관내 서브나노몰 IC50 값 및 수성 환경에서 충분한 용해도를 가져야 한다.
구체적 실시양태에서, 세포독성 약물은 미세관-파괴제 또는 항유사분열제, 예컨대 아우리스타틴 (모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 포함), 메이탄시노이드 (예를 들어 메이탄신), DNA-손상제, 예컨대 칼리케아미신, 두오카르마이신, 및 안트라시클린 (예를 들어 다우노루비신, 독소루비신, 디히드록시안트라신디온), 또는 토포이소머라제 I의 억제제, 예컨대 캄프토테신 또는 그의 유사체로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, D는 탁손, 시토칼라신 B, 아우리스타틴 (모노메틸 아우리스타틴 E 포함), 그라미시딘 D, 브로민화에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구체적 실시양태에서, D는 항대사물, (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 제거제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에 다우노마이신) 및 독소루비신)), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, D는 비제한적으로 캄프토테신 유사체, 인돌로카르바졸 유사체, 페난트리딘 유사체, 플루오로퀴놀론 유사체, 퀴녹살린, 에보디아민, 아크리딘, 나프티리딘, 데옥시니보마이신 유사체, 안구스틴 유사체, 스틸벤 티아졸 유사체, 피롤로퀴나졸리노퀴놀린 알칼로이드 또는 인데노이소퀴놀린 유사체를 포함하는 토포이소머라제 I의 억제제이고 (검토를 위해 문헌 [Selas et al., A patent review of topoisomerase I inhibitors (2016-present), 2021, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 31(6), 473-508] 참조); 바람직하게는 비제한적으로 이리노테칸, 토포테칸, 캄프토테신, SN-38, 엑사테칸, DXd, 실라테칸, 코시테칸, 루르토테칸, 기마테칸, 벨로테칸, 루비테칸을 포함하는 캄프토테신 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다 (검토를 위해 문헌 [Sriram et al., Camptothecin and its analogues: a review on their chemotherapeutic potential, 2005, Natural Product Research, 14(9), 393-412] 참조).
바람직한 실시양태에서, D는 하기 화학식 (II)의 엑사테칸의 약물 모이어티이다
.
본 개시내용의 ADC
한 실시양태에서, 본 개시내용은 항-FRα 항체가 약물 (특히 엑사테칸)에 연결된 ADC를 제공한다. 링커 L은 상기 정의된 바와 같다.
바람직하게는, 이러한 ADC는 유효 용량의 약물, 예를 들어 토포이소머라제 I의 억제제, 바람직하게는 엑사테칸을 FRα를 발현하는 종양 세포에 선택적으로 전달할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 화학식 (I)의 ADC를 제공하며,
,
여기서:
- Ab는 서열식별번호: 12에 특이적으로 결합하는 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체이고,
- L은 티올 잔기를 통해 상기 항체에 결합된 절단가능한 링커 모이어티이고,
- D는 L에 결합된 세포독성 약물 모이어티, 예를 들어 토포이소머라제 I의 억제제이고,
- p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이고, 보다 바람직하게는 p는 8이다.
Ab, L 및 D는 이전 섹션에서 정의되었다.
약물-대-항체 비 또는 "DAR"로도 지칭되는 용어 "p"는 화학식 (I)의 ADC에서 항체 모이어티당 약물 모이어티의 수, 또는 항체 Ab당 -L-D 모이어티의 수에 상응한다.
약물-대-항체 비가 원칙적으로 단일 ADC에 대해서는 정확한 값을 갖지만, 이 값은 많은 ADC를 함유하는 조성물을 기재하는 데 사용되는 경우에, 전형적으로 접합 단계와 연관된 어느 정도의 불균질성으로 인해 종종 평균 값일 것으로 이해된다. ADC의 샘플에 대한 평균 로딩도 또한 본원에서 약물 대 항체 비 또는 "DAR"로 지칭된다. 일부 실시양태에서, DAR (p)은 약 1 내지 약 8 (즉, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 및 8), 바람직하게는 약 4 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 8, 보다 더 바람직하게는 약 8이다.
따라서, 화학식 (I)의 ADC의 다중 카피를 포함하는 조성물에서, "p"는 항체 Ab당 -L-D 모이어티의 평균 수를 지칭한다. 평균 p 수가 8에 근접한 경우, ADC는 "DAR8"인 것으로 간주될 것이다.
약물-항체 비를 측정하는 방법은 실시예에 개시되어 있거나 또는 예를 들어 문헌 [Conilh et al., (Pharmaceuticals 2021, 14(3), 247)]에 기재되어 있다.
링커 L을 통한 항체에 대한 약물 로딩은 항체 모이어티 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 일부 실시양태에서, ADC의 링커 모이어티 (L)는 항체 모이어티 상의 1개 이상의 아미노산 잔기 상의 화학적 활성 기를 통해 항체 모이어티에 부착된다. 예를 들어, 링커는 유리 아미노산, 이미노, 히드록실, 티올 또는 카르복실 기를 통해 항체 모이어티에 (예를 들어 N- 또는 C-말단에, 1개 이상의 리신 잔기의 엡실론 아미노 기에, 1개 이상의 글루탐산 또는 아스파르트산 잔기의 유리 카르복실 기에, 또는 1개 이상의 시스테인 잔기의 술프히드릴 기에) 부착될 수 있다. 링커가 부착되는 부위는 항체 모이어티의 아미노산 서열 내의 천연 잔기일 수 있거나, 또는 예를 들어 DNA 재조합 기술에 의해 (예를 들어 시스테인 또는 비-천연 아미노산 잔기를 아미노산 서열 내로 도입하는 것에 의해) 또는 단백질 생화학에 의해 (예를 들어 환원, pH 조정, 또는 가수분해에 의해) 항체 모이어티 내로 도입될 수 있다.
부착 부위가 쇄간 시스테인 티올 기인 경우에, 항체는 링커가 부착될 수 있는 단지 1개 또는 소수의 시스테인 티올 기를 가질 수 있다. 실제로, 대부분의 반응성 시스테인 티올은 일반적으로 쇄간 디술피드 가교로서 존재한다. 항체에 대한 링커-독소의 과다-부착은 쇄간 디술피드 가교를 형성하는 데 이용가능한 시스테인 잔기를 감소시킴으로써 항체를 탈안정화시킬 수 있다. 따라서, 최적의 약물 항체 비는 항체 모이어티를 탈안정화시키지 않으면서, 약동학적 특성을 저하시키지 않으면서, (항체당 부착된 약물 모이어티의 수를 증가시킴으로써) ADC의 효력을 증가시켜야 한다.
구체적 실시양태에서, -L-D는 항체의 쇄간 반응성 티올 잔기에 결합된다. 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 전형적인 항체는 8개의 이용가능한 쇄간 반응성 티올 잔기를 포함한다. 따라서, 구체적 실시양태에서, ADC는 8개의 -L-D 모이어티가 항체 Ab의 8개의 쇄간 반응성 티올 잔기에 공유 결합된 DAR8 ADC이고, 가장 바람직하게는 여기서 -L-은 화학식 (VI)에 상응한다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 하기 화학식 (VII)에 상응하며:
여기서 Ab는 상기 섹션에서 정의된 바와 같은 항-FRα이고, p는 4 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이다.
보다 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 하기 화학식 (VII)에 상응하며:
여기서 Ab는 상기 섹션에서 정의된 바와 같은 항-FRα이다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 화학식 (I)에 상응하며, 여기서
(i) Ab는
서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및
서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 항-폴레이트 수용체 알파 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
(ii) L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고
(iii) D는 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 엑사테칸이고;
(iv) p는 1 내지 8, 바람직하게는 8이다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 화학식 (I)에 상응하며, 여기서
(i) Ab는 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체이고;
(ii) L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고
(iii) D는 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 엑사테칸이고;
(iv) p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8, 예를 들어 약 8이다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 화학식 (I)의 ADC이며, 여기서
(i) Ab는 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체이고;
(ii) L은 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고
(iii) D는 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 엑사테칸이고;
(iv) p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8, 예를 들어 약 8이다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 Ab가 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체인 화학식 (VII)의 ADC이다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC는 Ab가 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체인 화학식 (VII)의 ADC이다.
제약 조성물 - 제제
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된, 본원에 개시된 ADC (예를 들어, 화학식 (VI)의 링커 L에 결합되고, 그 자체가 엑사테칸과 같은 약물에 결합된 mAb1) 중 하나 또는 그의 조합을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 생리학상 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 본 개시내용의 제약 제제는 안정화제, 계면활성제, 완충제, 항미생물 보존제, 보호제, 항산화제, 킬레이트화제, 벌킹제로부터 선택된 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "용매"는 액체 제제, 예컨대 수성 제제의 제조를 위한 임의의 제약상 허용되고 (즉, 인간 또는 또 다른 포유동물에게 투여하기에 안전하고 비-독성이고) 유용한 성분이다. 예시적인 용매는 물, 예컨대 멸균 주사용수 (WFI) 또는 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액, 및 그의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 용매는 개시된 멸균수 또는 정박테리아 주사용수 (BWFI)이다.
본원에 사용된 안정화제는 특히 언폴딩 및 응집에 대한 단백질 안정성을 증가시키는 화합물이다. 바람직하게는, 안정화제는 제약 제제에서의 적합한 첨가제 또는 부형제로서 당국에 의해 허용된다.
안정화제는 사카라이드일 수 있다. 본원에서 "사카라이드"는 일반 조성 (CH2O)n 및 그의 유도체, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 폴리사카라이드, 당 알콜, 환원당, 비환원당 등을 포함한다. 본원에서 사카라이드의 예는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 실리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토스, 락툴로스, 말툴로스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로스 등을 포함한다.
본 개시내용의 제약 제제 중 안정화제의 농도는 1 내지 500 mM에 포함된다.
본원에 사용된 "계면활성제"는 표면-활성제를 지칭한다. 계면활성제는 일반적으로 소수성 영역의 노출을 줄여 단백질-단백질 상호작용을 감소시키고, 또한 흡착 부위에 대한 경쟁에 의해 방지되는 계면-유도된 응집을 감소시키기 위해 단백질 제제에 첨가된다.
본원에서 계면활성제의 예는 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 술페이트 (SDS); 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴- 술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸- 베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-,리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필- 베타인 (예를 들어 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필- 디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 폴리에틸글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어 플루로닉스, PF68 등)를 포함한다. 제약상 허용되는 계면활성제의 다른 예는 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르 (트윈(Tween)), 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌- 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 모노라우릴 에테르, 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르 (트리톤-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (폴록사머, 플루로닉), 및 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 가장 적합한 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르는 폴리소르베이트 20 (상표명 트윈 20™ 하에 판매됨) 및 폴리소르베이트 80 (상표명 트윈 80™ 하에 판매됨)이다.
가장 적합한 폴리에틸렌-폴리프로필렌 공중합체는 명칭 플루로닉(Pluronic)® F68 또는 폴록사머 188(Poloxamer 188)™ 하에 판매되는 것이다. 가장 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 상표명 브리즈(Brij)™ 하에 판매되는 것이다. 가장 적합한 알킬페놀-폴리옥시에틸렌 에테르는 상표명 트리톤-X 하에 판매된다.
본 개시내용의 제약 제제 중 계면활성제의 농도는 0.01 내지 0.1% (w/v)에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "완충제"는 그를 포함하는 용액이 그의 짝산/짝염기 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 것을 제공하는 작용제를 지칭한다. 이러한 범위의 pH를 제어할 완충제의 예는 아세테이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트, 글리실글리신 및 다른 유기 산 완충제를 포함한다.
"보존제"는 박테리아, 진균 또는 또 다른 감염원에 의한 오염 및/또는 그의 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 첨가될 수 있는 화합물이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 제조를 용이하게 할 수 있다. 잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 w-크레졸을 포함한다.
본원에 일반적으로 사용된 "보호제"는 단백질과 조합되는 경우에 동결건조 및/또는 후속 냉장 저장 시 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 감소시키는 물질이다. 예시적인 보호제는 당 및 그의 상응하는 당 알콜, 예컨대 수크로스, 락토스, 트레할로스, 덱스트란, 에리트리톨, 아라비톨, 크실리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 아미노산, 예컨대 아르기닌 또는 히스티딘; 액방성 염, 예컨대 황산마그네슘; 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 폴리(프로필렌 글리콜); 및 그의 조합을 포함한다. 보호제의 추가의 예는 젤라틴, 덱스트린, 변형된 전분 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함한다.
보호제는 사전-동결건조된 제제에 "동결건조보호량"으로 첨가될 수 있다. 이는 동결건조보호량의 보호제의 존재 하에서의 단백질의 동결건조 후, 단백질이 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 본질적으로 유지한다는 것을 의미한다.
본원에 일반적으로 사용된 "항산화제"는 산화 반응을 제한하고 단백질의 안정성 및 안전성을 유지시키는 데 일반적으로 사용되는 제약상 허용되는 부형제이다. 항산화제의 예는 아스코르브산, 메타중아황산나트륨, 히스타민, 메티오닌, 아스코르브산, 글루타티온, 비타민 E, 폴리에틸렌이민이다.
본 개시내용의 제약 제제 중 항산화제 농도는 5 내지 25 mM에 포함될 수 있다.
"킬레이트화제"는 단백질의 안정성을 유지시키는 데 일반적으로 사용되는 제약상 허용되는 부형제이다. 킬레이트화제의 예는 에데테이트 디소듐, 디에틸렌트리아민 펜타-아세트산, 시트르산, 헥사포스페이트, 티오글리콜산, 아연을 포함한다.
본원에 일반적으로 사용된 "벌킹제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 부가하는 데 일반적으로 사용되는 제약상 허용되는 부형제이고, 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여한다 (예를 들어, 개방 세공 구조를 유지시키는 본질적으로 균일한 동결건조된 케이크의 생산을 용이하게 함). 예시적인 벌킹제는 만니톨, 글리신, 락토스, 변형된 전분, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비톨을 포함한다.
제약 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 자연스럽게, 치료될 상태, 질병의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 성별에 좌우된다.
본 개시내용의 제약 조성물은 국소, 경구, 비경구, 복강내, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안내 투여 등, 바람직하게는 복강내 또는 정맥내 투여용으로 제제화될 수 있다.
바람직하게는, 제약 조성물은 주사될 수 있는 제제에 대해 제약상 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 등장성, 멸균, 염수 용액 (인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 염수의 첨가 시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결-건조된 조성물일 수 있다.
투여에 사용되는 용량은 다양한 파라미터의 함수로서, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리상태, 또는 대안적으로 목적하는 치료 지속기간의 함수로서 적합화될 수 있다.
제약 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 ADC를 제약상 허용되는 담체 또는 수성 매질 중에 용해 또는 분산시킬 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제제; 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 또는 동결건조물을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 시린지성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
유리 염기 또는 약리학상 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용액은 계면활성제, 예컨대 히드록시프로필셀룰로스와 적합하게 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 그의 혼합물 중에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
본 개시내용의 ADC는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제제화될 수 있다. 제약상 허용되는 염은 무기 산, 예컨대 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등으로 형성된 산 부가염 (단백질의 유리 아미노 기에 의해 형성됨)을 포함한다. 유리 카르복실기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철, 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결-건조 기술이다.
직접 주사를 위한 보다 더 또는 고도로 농축된 용액의 제조가 또한 고려되며, 여기서 용매로서 DMSO의 사용은 고농도의 활성제를 작은 종양 영역에 전달하는 극도로 빠른 침투를 발생시키는 것으로 고려된다.
제제화 시, 용액은 투여 제제와 상용성인 방식으로 및 치료상 유효한 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 투여 형태, 예컨대 상기 기재된 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여되지만, 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.
수용액으로의 비경구 투여를 위해, 예를 들어 용액은 필요한 경우에 적합하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 되어야 한다. 이들 특정한 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 피하주입액에 첨가하거나 또는 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580] 참조). 투여량의 일부 변화는 치료되는 대상체의 상태에 따라 반드시 발생할 것이다. 투여를 담당하는 사람은 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 개시내용의 ADC는 용량당 약 0.0001 내지 1.0 밀리그램, 또는 약 0.001 내지 0.1 밀리그램, 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 심지어 1.0 내지 약 10 밀리그램을 포함하도록 치료 혼합물 내에서 제제화될 수 있다. 다중 용량이 또한 투여될 수 있다.
본 개시내용의 ADC를 포함하는 제약 제제는 "즉시 사용가능한" 주사가능한 제제 또는 동결건조 제제일 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 개시내용의 ADC를 포함하는 제약 제제는 사전-충전 시린지에 공급될 수 있다.
본 개시내용의 ADC의 용도 및 방법
본 개시내용의 ADC는 치료 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해 대상체에게, 예를 들어 생체내 투여될 수 있다.
특히 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 특히 FRα를 발현하는 종양 세포를 갖는 암, 보다 구체적으로 고형 종양을 갖는, 보다 구체적으로 난소암, 유방암, 폐암, 또는 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에서 사용하기 위해, 의약으로서 본 개시내용의 ADC를 사용하는 것이 본원에서 고려된다.
용어 "암"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종 및 도세포암 포함), 중피종, 슈반세포종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암 (예를 들어 상피 편평 세포암), 폐암, 예컨대 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위 또는 위암, 예컨대 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도 종양, 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다.
본 개시내용의 ADC는 난소암, 삼중 음성 유방암 및 비소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 특히 유용하다.
따라서, 본 개시내용은 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 화학식 (I)의 ADC를 투여하는 것을 포함하는, 암, 특히 상기 열거된 암 중 1종, 보다 바람직하게는 난소암, 삼중 음성 유방암 및 비소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ADC는 예를 들어 상기 언급된 질환의 치료 또는 예방을 위해 단독 활성 성분으로서, 또는 다른 약물, 예를 들어 항바이러스제, 항염증제 또는 세포독성제, 항증식제, 화학요법제 또는 항종양제와 함께, 예를 들어 아주반트로서 또는 그와 조합되어 투여될 수 있다.
예를 들어, 상기 개시된 바와 같이 사용하기 위한 ADC는 AZT, IFN-알파, 항-CD20 mAb, 항-CD25 mAb, 항-PD1 mAb, 항-PDL-1 mAb, 항-CTLA4 mAb, 화학요법제와 조합되어 사용될 수 있다.
이러한 항-PD1 또는 항-PDL1 항체의 예는 비제한적으로 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙 또는 아테졸리주맙을 포함한다.
적합한 항종양제는 비제한적으로 알킬화제 (예컨대 시클로포스파미드, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 니트로스우레아, 테모졸로미드), 안트라시클린 (예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신), 탁산 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀), 에포틸론, 토포이소머라제 I의 억제제 (예컨대 이리노테칸 또는 토포테칸), 토포이소머라제 II의 억제제 (예컨대 에토포시드, 테니포시드, 또는 타플루포시드), 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체 (예컨대 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시우레아, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 또는 티오구아닌), 펩티드 항생제 (예컨대 블레오마이신, 콜리스틴, 그라미시딘), 백금-기반 항신생물제 (예컨대 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴), 레티노이드 (예컨대 트레티노인, 알리트레티노인, 벡사로텐), 빈카 알칼로이드 및 유도체 (예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 항-VEGF 작용제 (예컨대 베바시주맙, 라니비주맙, 수니티닙, 소라페닙, 파조파닙, 표적화 요법, 예컨대 키나제 억제제 (예컨대 이브루티닙, 이델랄리십, 에를로티닙, 게피티닙, 이마티닙, 베무라페닙, 비스모데깁), 프로테아솜 억제제 (예컨대 보르테조밉, 카르필조밉), 히스톤 데아세틸라제 억제제 (예컨대 보리노스타트 또는 로미뎁신)를 포함할 수 있다.
상기에 따라, 본 개시내용은 추가 측면에서 치료 유효량의 본 개시내용의 ADC 및 적어도 1종의 제2 약물 물질을, 예를 들어 병용으로 또는 순차적으로 공-투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 상기 제2 약물 물질은 항바이러스제, 항염증제 또는 세포독성제, 항증식제, 화학요법제 또는 예를 들어 상기 나타낸 바와 같은 다른 항종양제이다.
본원에 개시된 조성물 (예를 들어 ADC를 포함함) 및 사용에 대한 지침서로 이루어진 키트가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 키트는 적어도 1종의 추가의 시약, 또는 1종 이상의 추가의 항체 또는 단백질 (예를 들어, 제1 항체와 별개의 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 상보적 활성을 갖는 항체)을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 전형적으로 키트의 내용물의 의도된 용도를 나타내는 라벨을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 또는 달리 키트에 동반되는 임의의 서면 또는 기록물을 포함한다. 키트는 환자가 상기 정의된 바와 같은 ADC 치료에 반응할 군, 특히 FRα-발현 종양을 갖는 군에 속하는지 진단하기 위한 도구를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용의 ADC의 제조 방법
본 개시내용의 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술에 의해 링커 L에 의해 적어도 1종의 약물에 접합될 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌 [Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition, 2013, Academic Press (eBook ISBN: 9780123822406)]에 기재되어 있다. 치료제를 항체에 접합시키는 방법에 대한 보다 많은 정보에 대해서는, 문헌 [Lyon et al., "Chapter six - Conjugation of Anticancer Drugs Through Endogenous Monoclonal Antibody Cysteine Residues", 2012, Methods in Enzymology, 502, 123-138 (doi:10.1016/B978-0-12-416039-2.00006-9); Chapter 2-7 of "Antibody-Drug Conjugates: Fundamentals, Drug Development, and Clinical Outcomes to Target Cancer", 3 November 2016, eBook ISBN:9781119060727, doi:10.1002/9781119060727 및 Panowksi S et al., 2014 Jan 1; 6(1): 34-45]을 참조한다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 ADC를 수득하는 방법은 하기 단계:
- 숙주 세포를 이전 섹션에 정의된 바와 같은 항체 Ab를 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계,
- 항체를 단리하는 단계,
- 화학식 (VIII)의 링커 L에 결합된 엑사테칸을 합성하는 단계:
및
- 상기 항체를 화학식 (VIII)의 화합물에 접합시켜 화학식 (I)의 ADC를 수득하는 단계
를 포함한다.
항체는 상기 설명된 바와 같이 수득될 수 있다. 항체는 잠재적인 접합 부위로서 사용될 수 있는 4개의 접근가능한 쇄간 디술피드 결합을 함유한다. 4개의 쇄간 디술피드 결합은, 예를 들어 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP) 또는 디티오트레이톨 (DTT)에 의해 환원될 수 있으며, 이는 접합에 이용가능한 8개의 티올 기를 생성한다.
화학식 (VIII)의 모이어티 -L-D는 유기 합성 관련 기술분야에 공지된 절차 (화학 반응, 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리, 결정화 등), 및 분석 화학 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 분석 절차에 따라 제조될 수 있다. 이러한 반응 및 기술의 세부사항은 문헌 [Richard Larock, Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 2nd Ed (2010), 및 the multi-volume serie edited by Michael B. Smith and others, Compendium of Organic Synthetic Methods (1974 et seq.)]을 포함한 다수의 학술지에서 찾아볼 수 있다. 출발 물질 및 시약은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있거나 또는 문헌 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
엑사테칸 화합물은 공지된 절차에 따라 합성할 수 있다 (US5834476; WO2019044946 또는 문헌 [Sugimori et al., 1998, J. Med. Chem., 41(13), 2308-2318 doi:10.1021/jm970765q] 참조). 엑사테칸은 또한 표준 공급원 (예를 들어 메드켐익스프레스(MedChemExpress) cat#HY-13631A 또는 카르보신트(Carbosynth) cat#FE72401)으로부터 구입할 수 있다.
화학식 (I)의 최종 ADC는 공지된 절차에 따라 항체의 천연 또는 조작된 시스테인 티올 잔기에 -L-D 성분을 접합시킨 후에 수득된다. 예를 들어, 문헌 [Lyon et al., "Chapter six - Conjugation of Anticancer Drugs Through Endogenous Monoclonal Antibody Cysteine Residues", 2012, Methods in Enzymology, 502, 123-138 (doi:10.1016/B978-0-12-416039-2.00006-9) 또는 SJ Walsh et al., Site-selective modification strategies in antibody-drug conjugates, Chem. Soc. Rev., 2021,50, 1305-1353, doi:10.1039/D0CS00310G]을 참조한다. 전형적으로, 항체 성분을 환원제, 예컨대 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 또는 디티오트레이톨 (DTT)로 환원시키고; -L-D 성분을 첨가하고, 항체의 시스테인 티올 잔기와 공유 반응하도록 하고; 최종 ADC 화합물을 정제하고, 완충제-교환한다.
충분히 기재된 본 발명은 이제 하기 실시양태 및 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 단지 예시적이고, 추가로 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
구체적 실시양태
1. 화학식 (I)의 항체-약물 접합체로서:
,
여기서:
- Ab는 서열식별번호: 12에 특이적으로 결합하는 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체이고,
- L은 바람직하게는 티올 잔기를 통해 상기 항체에 결합된 절단가능한 링커 모이어티이고,
- D는 L에 결합된 세포독성 약물 모이어티이고,
- p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이고, 보다 바람직하게는 p는 8인 항체-약물 접합체.
2. 실시양태 1에 있어서, D가 바람직하게는 캄프토테신 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 토포이소머라제 I의 억제제이고, 보다 바람직하게는 D가 하기 화학식 (II)의 엑사테칸의 약물 모이어티인 항체-약물 접합체
.
3. 실시양태 1-2 중 어느 하나에 있어서, L이 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커 모이어티이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티인 항체-약물 접합체.
4. 실시양태 3에 있어서, L이 리소솜 프로테아제-감수성 링커이고, W가 예를 들어 발린-시트룰린 (Val-Cit), 알라닌-알라닌-아스파라긴 (Ala-Ala-Asn), 발린-알라닌 (Val-Ala) 및 페닐알라닌-리신 (Phe-Lys)으로 이루어진 군으로부터 선택된 절단가능한 펩티드 모이어티를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
5. 실시양태 3에 있어서, L이 프로테아제 감수성 절단가능한 링커이고, W가 바람직하게는 β-글루쿠로니드 또는 β-갈락토시드 모이어티로부터 선택된 당 절단가능한 유닛을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
6. 실시양태 3에 있어서, L이 글루타티온-감수성 링커이고, W가 디술피드 모이어티를 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
7. 실시양태 3에 있어서, W가 하기 화학식 (III)
및 그의 제약상 허용되는 염을 갖고, 여기서
각각의 R2는 전자 끄는 기 및 C1-C4 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
n은 0, 1 또는 2이고;
T는 당 절단가능한 유닛 또는 폴리펩티드 절단가능한 유닛이고;
Y는 T가 당 절단가능한 유닛인 경우에 O이거나, 또는 T가 폴리펩티드 절단가능한 유닛인 경우에 NR3이고;
R3은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된 것인
항체-약물 접합체.
8. 실시양태 7에 있어서, L이 화학식 (IV)의 링커 -A-W-에 상응하고
여기서
X1은 연결기 유닛이고;
Z는 임의적인 스페이서이고;
X2는 연결기 유닛이고;
K는, 바람직하게는 폴리사르코신 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 임의적인 소수성 차폐 물질이고;
R1은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R4는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
R5는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되는 것인
항체-약물 접합체.
9. 실시양태 8에 있어서, X1 및 X2가 독립적으로 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된 것인
항체-약물 접합체.
10. 실시양태 8-9 중 어느 하나에 있어서, Z가 1개 이상의 아미노산(들), 1개 이상의 N-치환된 아미노산, 임의로 치환된 폴리에테르, C1-C12 알킬렌, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴렌, C3-C8 시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬렌, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴렌, C2-C10 알케닐렌, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
상기 알킬렌 및 알케닐렌은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
상기 알킬렌, 아릴렌, 시클로알킬렌, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로아릴렌 및 알케닐렌은 할로겐, 옥소, -OH, -NO2, -CN, C1-C6 알킬, C3-C6 시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클릴, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, C1-C6 할로알콕시, -(CO)-R', -O-(CO)-R', -(CO)-O-R', -(CO)-NR"R"', -NR"-(CO)-R', 및 -NR"R"'로부터 선택된 치환기 중 1개 이상으로 임의로 치환되고;
R', R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된 것인
항체-약물 접합체.
11. 실시양태 8-10 중 어느 하나에 있어서, K가 바람직하게는 하기 화학식 (V)의 폴리사르코신이고
,
여기서 k는 2 내지 50, 바람직하게는 4 내지 30의 정수이고,
R6은 OH 또는 NH2에 상응하는 것인
항체-약물 접합체.
12. 실시양태 7-11 중 어느 하나에 있어서, T가 글루쿠로니드 또는 갈락토시드인 당 절단가능한 유닛인 항체-약물 접합체.
13. 실시양태 7-11 중 어느 한 실시양태에 있어서, T가 바람직하게는 Val-Cit, Val-Ala 및 Phe-Lys로부터 선택된 디펩티드인 항체-약물 접합체.
14. 실시양태 1-3 중 어느 하나에 있어서, L이 상기 항체의 1개 이상의 티올 잔기에 공유 결합되고,
바람직하게는, 상기 L은 하기 화학식 (VI)의 링커:
에 상응하는 것인 항체-약물 접합체.
15. 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 전장 항체 또는 항원 결합 부분을 함유하는 항체 단편을 포함하는 것인 항체-약물 접합체.
16. 실시양태 1-15 중 어느 하나에 있어서, 하기 화학식 (VII)에 상응하며,
여기서 Ab는 항-FRα 항체, 예컨대 파를레투주맙, 또는 전형적으로 IgG1 Fc 불변 영역의 류신 234 및 류신 235에서 알라닌 치환을 포함하는 그의 침묵 IgG1 변이체이고, p는 4 내지 8, 바람직하게는 8인 항체-약물 접합체.
17. 실시양태 1-16 중 어느 하나에 있어서,
- Ab가 인간 IgG1 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 상기 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 인간 IgG1 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 상기 항체에 대해 어떠한 ADCC 활성도 부여하지 않거나 또는 감소된 ADCC 활성을 부여하는 것이거나; 또는
- Ab가 인간 IgG4 이소형 불변 영역, 또는 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역을 포함하는 항체이며, 여기서 상기 돌연변이체 또는 화학적으로 변형된 불변 영역은 야생형 인간 IgG4 이소형 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여 상기 항체에 대해 어떠한 ADCC 활성도 부여하지 않거나 또는 감소된 ADCC 활성을 부여하는 것인
항체-약물 접합체.
18. 실시양태 1-17 중 어느 하나에 있어서, Ab가
(i) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는
(ii) 서열식별번호: 7의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 8의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 항-FRα 항체인 항체-약물 접합체.
19. 실시양태 1-18 중 어느 하나에 있어서, Ab가
(i) 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄; 또는
(ii) 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄
를 포함하거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 항체-약물 접합체.
20. 실시양태 1-19 중 어느 하나에 있어서,
(i) Ab가
서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및
서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
를 포함하는 항-폴레이트 수용체 알파 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
(ii) L이 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고;
(iii) D가 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 엑사테칸이고;
(iv) p가 1 내지 8, 바람직하게는 8인
항체-약물 접합체.
21. 실시양태 20에 있어서, Ab가
(i) 서열식별번호: 9의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편, 또는
(ii) 서열식별번호: 11의 중쇄 및 서열식별번호: 10의 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편인
항체-약물 접합체.
22. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 바람직하게는 종양, 예를 들어 고형 종양, 보다 구체적으로 난소암, 유방암, 폐암 또는 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
23. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 있어서, 난소암, 삼중 음성 유방암, 및 비소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
24. 실시양태 1-21 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하고, 임의로 다른 활성 성분을 포함하는 제약 조성물.
25.
- 숙주 세포를 실시양태 1-21 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항-FRα 항체의 생산에 적합한 조건 하에 배양하는 단계,
- 상기 항-FRα 항체를 단리하는 단계,
- 화학식 (VIII)의 링커 L에 결합된 엑사테칸을 합성하는 단계:
- 상기 항-FRα 항체를 화학식 (VIII)의 화합물에 접합시켜
이에 의해 실시양태 1-21 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 ADC를 수득하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체를 수득하는 방법.
실시예
기능적 검정
ELISA에 의한 인간 FRα-결합 친화도
샌드위치 ELISA 검정은 96-웰 높은-결합 ELISA 플레이트 (코닝 인크.(Corning Inc.), 미국 뉴욕주 뉴욕, Cat#3590)를 사용하여 수행하였다. 플레이트를 PBS (pH 7.4) 중 100 μL/웰의 재조합 인간 FRa 단백질 (시노 바이올로지칼(Sino Biological) cat#11241-H08H)을 사용하여 2 μg/mL로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T (PBS + 0.05% 트윈-20)로 2회 세척한 후, 플레이트를 200 μL/웰의 인큐베이션 완충제 (PBS-T + 0.1% BSA)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고, 시험 화합물 (항체 또는 항체-약물 접합체)의 3배 희석 시리즈 100 μL를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 암실에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 5회 세척한 후, 플레이트를 이전에 인큐베이션 완충제 중에 1:250,000으로 희석시킨 염소 항-인간 IgG (H+L) HRP 접합된 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch) cat#109-035-088) 100μL/웰과 함께 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. PBS-T로 5회 세척한 후, TMB 기질 용액 (써모-피셔(Thermo-Fisher) cat#N301)을 첨가하였다. 퍼옥시다제 활성을 0.18M H2SO4로 정지시키고, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 멀티스칸(MultiSkan) EX 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm (참조 파장 650 nm)에서 흡광도를 판독하였다. 그래프패드 프리즘 9 소프트웨어를 사용하여 S자형 피팅을 수행하였다.
SPR 비아코어 친화도
표면 플라즈몬 공명 (SPR) 실험은 비아코어 T200 장치 상에서 25℃에서 수행하였다. 시험 항체 또는 ADC를, 인간 항체 포획 키트 (시티바(Cytiva) cat# BR100839)에 의해 사전에 관능화시킨 CM5 시리즈 S 센서칩 상에 저밀도 (300-500 RU)로 포획시켰다. 유사하게 처리하였지만 리간드를 생략한 관능화된 표면/유동 셀을 참조로서 사용하였다. 동역학적 속도 및 친화도를 측정하기 위해, 재조합 인간 FRα (시노 바이올로지칼 cat#11241-H08H) 분석물 샘플을 단일 사이클 동역학적 전략을 사용하여 연속해서 5가지 농도 (0.5, 1, 2, 4, 8 nM)로, 일정한 70 μL/mL 유량의 구동 완충제 (HBS-EP+, 시티바 cat# BR100669)로 300초의 접촉 펄스 하에 이중으로 주입하였다. 구동 완충제를 900초 동안 주입하여 해리 상을 측정하였다. 이중 주입 사이에, 분석물 및 리간드 둘 다를 제거하기 위해 표면/유동 셀을 3M MgCl2로 재생시키고, 동일한 조건을 사용하여 새로운 리간드 포획을 수행하였다. 데이터 분석은 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 참조 표면 및 분석물 제로-농도 신호의 차감 후에 수행하였다. 데이터를 프로세싱하고, 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합 동역학 속도 상수, ka (온-레이트) 및 kd (오프-레이트), 및 KD (평형 해리 상수, 또한 "친화도"로도 지칭됨)를 결정하였다. 반복실험에 대한 평균 값 및 표준 편차를 보고하였다.
유동 세포측정법에 의한 세포-결합 친화도
암성 세포주 상에서 발현된 세포외 인간 FRα에 대한 항체 또는 ADC 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 시험된 항체 또는 ADC를 LYNX 신속 APC 항체 접합 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (바이오-라드(Bio-Rad), Cat#LNK032APC)에 따라 APC 형광단에 접합시켰다. 500,000개의 세포 (유동 세포측정 플라스틱 튜브에서 100μL의 PBS 중에 현탁됨)에 시험 APC-표지된 항체 또는 ADC의 10 μg/mL 용액 5 μL를 첨가하였다. 세포를 암실에서 20분 인큐베이션하고, 원심분리에 의해 PBS로 3회 세척하고, 분석을 위해 200 μL의 PBS 중에 재현탁시켰다. BD FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))에 의해 제어되는 BD 포르테사 유동 세포측정기를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하고, 플로우조 소프트웨어 (BD 바이오사이언스)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
인간 혈장에서의 안정성 검정
ADC 샘플 (PBS 중 >6 mg/mL 용액)을 스크류 마개를 갖는 원심분리 튜브에서 순수한 멸균 인간 혈장 (진텍스(GeneTex) Cat# GTX73265)으로 희석하여 200 μg/mL의 최종 ADC 농도를 수득하였다 (잔류 PBS 부피 5% v/v 미만). 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 분취액을 5분, 6시간, 1일, 2일, 3일, 및 7일의 시점에 취하였다 (분취액을 분석 시까지 -80℃에서 동결 유지시킴). 이전에 비오티닐화된 인간 폴레이트 수용체 알파 재조합 단백질 (시노 바이올로지칼스 cat#11241-H08H)로 코팅된 디나비즈(Dynabeads)™ M-280 스트렙타비딘 (써모 사이언티픽) 자기 비드를 사용하여 면역포획에 의해 혈장으로부터 ADC를 단리하였다. 간략하게, 600 μL의 상업용 비드 용액을 HBS-EP 완충제 (시티바, 카탈로그 #BR100188)로 2회 세척하고, 1.2 mL의 HBS-EP 완충제 중에 재현탁시켰다. 65 μL (48 μg 단백질 양)의 비오티닐화된 재조합 FRα 용액을 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 비드를 HBS-EP 완충제로 3회 세척하고, 1.2mL의 HBS-EP 완충제 중에 재현탁시켰다. 1회의 면역포획을 위해, 100 μL의 이전 비드 용액을 마이크로원심분리 튜브 내의 100 μL의 HBS-EP에 첨가하였다. 혈장 중 10 μL의 ADC 용액 (이론상 2 μg ADC 양)을 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 인큐베이션 후에, 비드-ADC 복합체를 HBS-EP 완충제로 2회 세척하고, 200 μL의 HBS-EP 완충제로 재현탁시키고, 2 μL/1000U의 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) cat# P0705L)를 완만한 교반 하에 37℃에서 밤새 첨가함으로써 탈글리코실화시켰다. 이어서, 비드를 HBS-EP 완충제로 2회, 증류수로 2회 및 물 중 10% 아세토니트릴 (v/v)로 1회 세척하였다. 비드를 0.1% (v/v)의 포름산을 함유하는 물 중 30% 아세토니트릴 (v/v) 50 μL와 함께 실온에서 완만한 교반 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 브루커 임팩트 II(Bruker Impact II)™ Q-ToF 질량 분광계가 장착된 써모 얼티메이트 3000 UHPLC 시스템을 사용한 변성 역상 크로마토그래피-질량 분광측정법에 의해, 탈글리코실화된 ADC를 함유하는 용리된 샘플을 분석하였다. 이동상 A는 물 + 0.1% 포름산이고, 이동상 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산이었다. 칼럼은 애질런트 PEEK PLRP-S 1000Å 2.1x100mm 5μm (80℃)였다. 선형 구배는 25분 내 20%B에서 50%B였다. 유량은 0.4 mL/분이었다. UV 검출을 280 nm에서 모니터링하였다. Q-ToF 질량 분광계는 m/z 범위 500-5000 (ESI+)에서 사용하였다. 데이터를 브루커 콤파스(Bruker Compass)® 소프트웨어에 포함된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션하였다. 안정성 데이터 분석을 위해, 선택된 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 용리 시간 범위 내의 미가공 스펙트럼의 디컨볼루션을 구현하였다. 약물-링커 상실 또는 변형은 출발 ADC 물질로부터의 상응하는 질량 이동에 따라 확인되었다. 상이한 DAR을 갖는 ADC의 상대비는 특정 ADC 하위-종의 강도를 총 ADC 종으로부터의 강도로 나눔으로써 계산하였다. 최종 DAR 값은 문헌 [Xu et al., Anal. Biochem., 2011, 412 (1), 56-66]에 기재된 바와 같이 계산하였다.
FRa 음성 세포주 (BT-474 세포주)에서의 시험관내 효능
ADC의 비특이적 (오프-타겟) 세포독성을 평가하기 위해, 시험관내 세포독성 검정을 BT-474 (FRa 음성) 암 세포주에서 실현하였다. 세포를 세포주에 따라 적절한 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (100μL의 적절한 배양 배지 중 1000 내지 10,000개 세포/웰), 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지에 이전에 용해시킨 시험 화합물의 연속 희석물 (50μL)을 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 144시간 동안 수행하였다. MTT (5mg/mL, 20μL, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 내지 2시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 이어서, 배양 배지를 조심스럽게 제거하고, 웰 내용물을 산성화된 이소프로판올로 균질하게 용해시켰다. 흡광도 값을 멀티스칸™ 스카이 마이크로플레이트 판독기 (써모 사이언티픽) 상에서 570 nm의 파장 (690 nm의 참조 파장)을 사용하여 측정하였다. 억제 용량 반응 곡선 피팅 (그래프패드 프리즘 9)을 사용하여 비처리 대조군 세포와 비교하여 IC50 농도 값을 결정하였다.
암 이종이식 모델에서의 생체내 효능
4 내지 5주령 암컷 CB-17 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스를 수득하고, 연구 개시 전에 7일 동안 격리하였다. 마우스를 PBS 중 재현탁된 세포 (마우스당 5-10 x 106개 세포) (OV-90, SW-620, KB, BT-474 세포주) 또는 PBS 중 50% BD 매트리겔 (코닝(Corning)®) (PA-1, IGROV-1, OVCAR-3, NCI-H2110 세포주)로 피하로 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 120-150 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위화하고 (전형적으로 군당 7마리 마우스), PBS (음성 대조군) 또는 임상시험 항체-약물 접합체의 단일 (달리 언급되지 않는 한) 정맥내 주사에 의해 처리하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치 (길이 x 폭)를 사용하여 3-5일마다 측정하고, 하기 식 V = 4/3 x π x R3을 사용하여 계산하였고, 여기서 R은 반경을 나타낸다. 종양 부피가 1500 mm3을 초과할 때 또는 종양의 궤양화의 경우에 마우스를 희생시켰다.
역상 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (RPLC-MS)에 의한 약물-항체-비 (DAR) 평가:
변성 RPLC-QToF 분석을 사용하여 접합체의 약물-항체-비 (DAR)를 평가하였다. 간략하게, ADC를 물/아세토니트릴 + 0.1% 포름산 (0.4 mL/분)의 이동상 구배를 사용하여 애질런트 PLRP-S 1000Å 2.1x150mm 8μm (80℃) 상에서 용리시키고, 500-3500 m/z 범위 (ESI+)를 스캐닝하는 브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계를 사용하여 검출하였다. 데이터를 브루커 콤파스® 소프트웨어에 포함된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션하였다.
실시예 1: 엑사테칸-기반 화학적 약물-링커의 합성
물질 및 일반적인 유기 합성 방법
모든 용매 및 시약은 표준 상업적 공급원 (시그마-알드리치, 플루오로켐(Fluorochem), TCI 케미칼스(TCI Chemicals), 아크로스 오가닉스(Acros Organics), 알파 에이사(Alfa Aesar), 엔아민(Enamine), 써모 피셔, 카르보신트, 욱시 앱텍(WuXi AppTec), 이리스 바이오테크(Iris Biotech))으로부터 입수하였고, 달리 언급되지 않는 한 추가 정제 없이 사용하였다. 무수 용매는 시그마-알드리치로부터 구입하였다. Fmoc-아미노산, 2-클로로트리틸, 왕(Wang) 및 링크(Rink) 아미드 폴리스티렌 1% DVB 100-200 메쉬 수지 (제1 Fmoc-사르코신 아미노산이 사전-로딩됨)는 크리스토프 센 래보러토리즈(Christof Senn Laboratories) 및 시그마-알드리치로부터 구입하였다. 엑사테칸 메실레이트는 메드켐익스프레스로부터 구입하였다.
수지-상 합성을 20μm 폴리에틸렌 프릿이 장착된 빈 SPE 플라스틱 튜브 (시그마-알드리치)에서 수행하였다. 교반을 위해 티트라맥스(Titramax) 101 플랫폼 진탕기 (하이돌프(Heidolph))를 사용하였다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 화학 반응은 불활성 아르곤 분위기 하에 실온에서 수행하였다.
액체 핵 자기 공명 스펙트럼은 브루커 푸리에 300HD 또는 브루커 아반스 III HD400 분광계 상에 기록되었고, 보정을 위해 잔류 용매 피크를 사용하였다. 질량 분광분석법 분석은 유니버시티 클라우드 베르나드 리온 1(University Claude Bernard Lyon 1)의 UMR5246 CNRS 연구소의 센터 커먼 드 스펙트로메트리 드 마세(Centre Commun de Spectrometrie de Masse) (CCSM)에 의해 수행되었다.
정상 플래쉬 크로마토그래피는 텔레다인 이스코 콤비플래쉬(Teledyne Isco CombiFlash)® Rf200 장치 상에서 마슈레-나겔 크로마본드(Macherey-Nagel Chromabond)® 플래쉬 카트리지 (40-63μm)를 사용하여 수행하였다. 역상 크로마토그래피는 텔레다인 이스코 콤비플래쉬® Rf200 장치 상에서 바이오타지(Biotage)® 스파르 C18 듀오 100Å 30μm 카트리지 또는 인터킴 퓨리플래쉬(Interchim PuriFlash) RP-AQ (30μm) 카트리지를 사용하거나; 또는 애질런트 1100 정제용 2원 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.
화학 반응 및 화합물 특징화를 각각 모니터링하고, 사전-코팅된 40-63μm 실리카 겔 (마슈레-나겔), HPLC-UV (애질런트 1100 시스템) 또는 UHPLC-UV/MS (브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계가 장착된 써모 얼티메이트 3000 UHPLC 시스템 또는 브루커 MicrOTOF-QII 질량 분광계가 장착된 애질런트 1260 HPLC 시스템)를 사용하여 박층 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
HPLC 방법 1: DAD 검출기가 장착된 애질런트 1100 HPLC 시스템. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 칼럼은 애질런트 조르박스 SB-Aq 4.6x150mm 5μm (실온)였다. 선형 구배는 30분 내 0%B에서 50%B, 이어서 50%B에서 5분 유지였다. 유량은 1.0 mL/분이었다.
HPLC 방법 2: DAD 검출기가 장착된 애질런트 1100 HPLC 시스템. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 칼럼은 애질런트 포로쉘 120 EC-C18 3.0x50mm 2.7μm (실온)였다. 선형 구배는 9분 내 5%B에서 80%B, 이어서 80%B에서 1분 유지였다. 유량은 0.8 mL/분이었다.
HPLC 방법 3: DAD 검출기가 장착된 애질런트 1100 HPLC 시스템. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 칼럼은 애질런트 포로쉘 120 EC-C18 3.0x50mm 2.7μm (실온)였다. 선형 구배는 20분 내 5%B에서 80%B, 이어서 80%B에서 2분 유지였다. 유량은 0.8 mL/분이었다.
HPLC 방법 4: 써모 얼티메이트 3000 UHPLC 시스템 + 브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계. 이동상 A는 물 + 0.1% 포름산이었고, 이동상 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산이었다. 칼럼은 애질런트 PLRP-S 1000Å 2.1x150mm 8μm (80℃)였다. 선형 구배는 25분 내 10%B에서 50%B였다. 유량은 0.4 mL/분이었다. UV 검출을 280 nm에서 모니터링하였다. Q-ToF 질량 분광계는 m/z 범위 500-3500 (ESI+)에서 사용하였다. 데이터를 브루커 콤파스® 소프트웨어에 포함된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션하였다.
HPLC 방법 5 (정제용 방법): DAD 검출기가 장착된 텔레다인 이스코 콤비플래쉬® Rf200 2원 MPLC 시스템. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 재사용가능한 카트리지는 바이오타지® 스파르 C18 듀오 100Å 30μm (30g)였다. 선형 구배는 35분 내 10%B에서 50%B, 이어서 50%B에서 5분 유지였다. 유량은 25 mL/분이었다.
HPLC 방법 6 (정제용 방법): 이중-루프 자동-주입기, DAD 검출기 및 분획 수집기가 장착된 애질런트 1100 정제용 2원 HPLC 시스템. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다. 칼럼은 워터스 선파이어 C18 OBD 정제용 칼럼, 100Å, 5 μm, 19mm x 250mm (실온)였다. 선형 구배는 40분 내 10%B에서 60%B, 이어서 60%B에서 5분 유지였다. 유량은 25 mL/분이었다.
1.1) 단분산 폴리사르코신 중간체
1.1.1) 일반적 방법
단분산 폴리사르코신의 수지-상 합성을, 링크 아미드 및 2-클로로트리틸 수지의 경우 하위-단량체 합성 반복 절차 (WO2019081455에 기재된 바와 같음) 또는 왕 수지의 경우 상업용 Fmoc-Sar-Sar-OH 디펩토이드 빌딩 블록 (CAS#2313534-20-0)을 사용한 하기 전형적 Fmoc/SPPS 방법론을 사용하여 실현하였다. 수지-상 이량체 단계 (n=2)는 디케토피페라진 형성으로 인해 회피되었다. 모든 합성 수율은 제조업체에 의해 표시된 초기 Fmoc-사르코신 로딩에 기초하여 보고된다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 반응은 실온에서 수행하였다. 제1 Fmoc-사르코신 잔기가 사전로딩된 링크 아미드, 2-클로로트리틸 또는 왕 폴리스티렌 1% DVB 100-200 메쉬 수지 (크리스토프 센 래보러토리즈)를 사용하였다 (전형적 초기 로딩 0.6-1 mmol/g).
1.1.2) 폴리사르코신의 신장
Fmoc-사르코신 사전로딩된 링크 아미드, 2-클로로트리틸 또는 왕 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (수지 100 mg당 1 mL)으로 실온에서 2회 15분 동안 처리하였다. 이어서, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다. 수지에 DMF 중 Fmoc-Sar-Sar-OH (3 당량), HATU (2.9 당량) 및 DIPEA (6 당량)의 용액 (수지 100 mg당 1 mL)을 첨가하였다. 반응 용기를 2시간 동안 교반하고, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (수지 100 mg당 1 mL)으로 실온에서 2회 15분 동안 처리하였다. 이어서, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다.
링크 아미드 또는 2-클로로트리틸 수지 상에서의 합성을 위해, WO2019081455에 기재된 바와 같은 전형적 하위-단량체 합성 절차를 이어서 사용하였다. 브로모아세틸화 및 아민 치환 단계를 교대로 행하여 목적하는 길이가 수득될 때까지 n=3 폴리사르코신 올리고머의 신장을 수행하였다. DMF 중 10 당량의 브로모아세트산 및 13 당량의 디이소프로필카르보디이미드 (수지 100 mg당 2 mL)를 첨가함으로써 브로모아세틸화 단계를 수행하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 배수하고, DMF (4회)로 세척하였다. 아민 치환 단계를 위해, 수용액 중 40% (wt) 메틸아민을 첨가하고 (수지 100 mg당 1.5 mL), 용기를 30분 동안 진탕시키고, 배수하고, DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다.
왕 수지 상에서의 합성을 위해, 전형적 Fmoc/SPPS 절차를 사용하였다. Fmoc-Sar-Sar-OH 디펩토이드 빌딩 블록 (CAS#2313534-20-0)의 반복 커플링에 의해 n=3 폴리사르코신 올리고머의 신장을 수행하였다. 수지에 DMF 중 Fmoc-Sar-Sar-OH (3 당량), HATU (2.9 당량) 및 DIPEA (6 당량)의 용액 (수지 100 mg당 1 mL)을 첨가하였다. 반응 용기를 90분 동안 교반하고, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 광범위하게 세척하였다. 이어서 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (수지 100 mg당 1 mL)으로 실온에서 2회 15분 동안 처리하였다. 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다. 이러한 커플링/Fmoc-탈보호 사이클을 목적하는 폴리사르코신 길이가 수득될 때까지 반복하였다. 필요한 경우에, 균등한 길이의 최종 폴리사르코신을 수득하기 위해 마지막 커플링은 Fmoc-Sar-Sar-OH 디펩토이드 유닛 대신 상업용 Fmoc-Sar-OH 아미노산으로 행한다.
1.1.3) 폴리사르코신의 최종 수지-상 측부-관능화, 임의적인 캡핑, 수지 절단 및 정제
목적하는 수지-상 폴리사르코신 단분산 올리고머 길이에 도달하면, 직교 화학적 관능화를 수행한다. 이어서 임의로 Fmoc-아미노산 (예를 들어 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-β-Ala-OH, Fmoc-아미노-3,6 디옥사옥탄산, Fmoc-9-아미노-4,7-디옥사노난산)으로 최종 캡핑한다. 최종 화합물의 N-말단을 캡핑하는 Fmoc 보호기는, 사용되는 직교 관능화 화학 (하기 참조)에 따라 수지 절단 전 또는 후에 제거될 수 있다.
1.1.3.1) 2-아지도에탄-1-아민 측부-관능화 폴리사르코신
링크 또는 2-클로로트리틸 수지에 DMF 중 10 당량의 브로모아세트산 및 13 당량의 디이소프로필카르보디이미드 (수지 100 mg당 2 mL)를 첨가한다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 배수하고, DMF (4회)로 세척하였다. DMF 중 2-아지도에탄-1-아민의 3 몰 용액을 첨가하고 (수지 100 mg당 1 mL), 용기를 45분 동안 진탕시키고, 배수하고, DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다. 이어서, 1-시간 Fmoc-Gly-OH 커플링 (DMF 중 5당량 Fmoc-Gly-OH, 4.9당량 HATU, 10당량 DIPEA (수지 100 mg당 1 mL)) 및 DMF 중 20% 피페리딘 (수지 100 mg당 1 mL)을 사용한 Fmoc-탈보호를 실온에서 2회 15분 동안 수행하였다. 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다.
최종 폴리사르코신 화합물을 수지로부터 절단하였다 (링크 및 왕 수지의 경우 100% TFA 2회 30분, 2-클로로트리틸 수지의 경우 DCM 중 20% TFA 2회 15분). 수지를 여과하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하여 조 물질을 수득하였으며, 이를 인터킴® RP-AQ (30μm) 카트리지 상에서 정제하였다. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다.
1.1.3.2) 글루탐산 측부-관능화 폴리사르코신
링크, 왕 또는 2-클로로트리틸 수지에 DMF 중 Fmoc-Glu(OAll)-OH (3 당량), HATU (2.9 당량) 및 DIPEA (6 당량)의 용액 (수지 100 mg당 1 mL)을 첨가하였다. 반응 용기를 90분 동안 교반하고, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 광범위하게 세척하였다. 이어서 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (수지 100 mg당 1 mL)으로 실온에서 2회 15분 동안 처리하였다. 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다. 이어서, DMF 중 Fmoc-아미노-3,6 디옥사옥탄산 (3 당량), HATU (2.9 당량), DIPEA (6 당량) (수지 100 mg당 1 mL)와 1-시간 커플링시켰다. 수지를 DMF (4회), DCM (4회)으로 세척하였다. Alloc-보호기를 0.25 당량의 Pd(PPh3)4 및 20 당량의 페닐실란을 함유하는 DCM 용액으로 2회 30분 처리에 의해 제거하였다 (아르곤 스트림 하에 완만하게 교반함). 이어서, 수지를 DMF (5회) 및 DCM (5회)으로 세척하였다. 임의로, 50 당량의 DIC 및 60 당량의 N-히드록시숙신이미드를 함유하는 DMF 용액 (수지 100 mg당 1.5 mL)으로 90분 처리하여 최종 폴리사르코신 화합물의 카르복실산 측쇄에 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르를 도입하였다. 이어서, 수지를 DMF (4회) 및 DCM (4회)으로 세척하였다.
최종 폴리사르코신 화합물을 수지로부터 절단하였다 (링크 및 왕 수지의 경우 100% TFA 2회 30분, 2-클로로트리틸 수지의 경우 DCM 중 20% TFA 2회 15분). 수지를 여과하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하여 조 물질을 수득하였으며, 이를 인터킴® RP-AQ (30μm) 카트리지 상에서 정제하였다. 이동상 A는 물 + 0.1% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴이었다.
1.1.4) 최종 폴리사르코신 중간체
하기 표 6은 생성된 화합물을 열거한다.
표 6
1.2) 중간체 화합물 합성
1.2.1) 화합물 INT1의 합성
화합물 INT1을 특허 출원 WO2019081455에 기재된 절차에 따라 합성하였다. 이 화합물은 등몰 부분입체이성질체 혼합물이다 (입체생성 중심은 별표로 표시됨).
1.2.2) 화합물 INT2, INT2-S 및 INT2-R의 합성
1.2.2.1) tert-부틸 (2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트의 합성
(±)-옥토파민 히드로클로라이드 (1690 mg /11 mmol)를 둥근 바닥 플라스크에서 칭량하고, 증류수 4 mL 중에 현탁시켰다. 플라스크를 0℃에서 냉각시키고, 사전-냉각된 65% 질산 용액 4 mL를 천천히 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 20분 동안 유지시켰고, 이는 HPLC에 의해 평가된 바와 같이 출발 물질의 완전한 모노-니트로화를 보여주었다. 플라스크의 내용물을 250 mL 사전-냉각된 에를렌마이어로 옮기고, pH 값이 8-9에 도달할 때까지 0℃에서 포화 NaHCO3 용액 (대략 50 mL)으로 천천히 중화시켰다. 이어서, 디옥산 30 mL를 첨가하고, 이어서 Boc2O (7202 mg /13.2 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 반응물이 실온에 도달하도록 하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 포화 시트르산 용액으로 3회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 증발시켜 조 물질을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (석유 에테르/EtOAc, 구배 70:30에서 20:80)에 의해 정제하여 표제 화합물 (1320 mg /40%)을 농후한 황색-내지-갈색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.79 (s, 1H), 7.79 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.47 (dd, J = 8.6, 2.1 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.74 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.56 (t, J = 6.3 Hz, 1H), 3.07 (td, J = 6.1, 1.6 Hz, 2H), 1.31 (s, 9H). MS m/z (ESI+): 계산치 [M+H]+ = 299.1 ; 예상치 [M+H]+ = 299.1. HPLC 방법 2 체류 시간 = 5.5분.
1.2.2.2) (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-히드록시에틸)-2-니트로페녹시)-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트의 합성
둥근-바닥 플래쉬에서, Ag2CO3 (1500 mg / 5.4 mmol) 및 1,1,4,7,10,10-헥사메틸트리에틸렌테트라민 (251 mg / 1.1 mmol)을 무수 아세토니트릴 4 mL에 녹이고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이전 화합물 tert-부틸 (2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트 (292 mg / 0.98 mmol) 및 1-브로모-2,3,4-트리-O-아세틸-α-D-글루쿠로니드 메틸 에스테르 (583 mg / 1.46 mmol)를 0℃에서 첨가하고, 용액 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 셀라이트 상에서 여과하고, EtOAc로 희석하고, 포화 시트르산 용액으로 3회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 증발시켜 조 물질을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (석유 에테르/EtOAc, 구배 70:30에서 30:70)에 의해 정제하여 표제 화합물 (244 mg / 48%)을 황색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.76 (dd, J = 3.3, 2.1 Hz, 1H), 7.60 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 8.7, 2.6 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 5.71 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.46 (td, J = 9.5, 1.1 Hz, 1H), 5.21 - 5.02 (m, 3H), 4.75 (dd, J = 9.9, 1.4 Hz, 1H), 4.62 (s, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.17 (s, 2H), 3.10 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.81 - 2.59 (m, 6H), 2.05 - 1.96 (m, 9H), 1.30 (d, J = 1.7 Hz, 9H). MS m/z (ESI+): 계산치 [M+Na]+ = 637.2 ; 예상치 [M+Na]+ = 637.2. HPLC 방법 2 체류 시간 = 6.75분.
1.2.2.3) (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에틸)-2-니트로페녹시)-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트의 합성
이전 화합물 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-히드록시에틸)-2-니트로페녹시)-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (334 mg / 0.54 mmol) 및 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (219 mg / 1.09 mmol)를 0℃에서 건조 DCM 6 mL 중에 용해시켰다. 무수 피리딘 (112 mg / 1.41 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 0.45μm PTFE 필터 상에서 여과하고, 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (석유 에테르/EtOAc, 구배 85:15에서 30:70)에 의해 정제하여 표제 화합물 (380 mg / 90%)을 황색 발포체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.39 - 8.26 (m, 2H), 7.93 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 1.2 Hz, 2H), 7.46 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.77 (dd, J = 7.7, 3.7 Hz, 1H), 5.47 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 5.11 (q, J = 9.6 Hz, 2H), 4.77 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 3.73 - 3.59 (m, 3H), 3.59 - 3.37 (m, 2H), 2.05 - 1.96 (m, 9H), 1.48 - 1.35 (m, 1H), 1.32 (s, 9H). MS m/z (ESI+): 계산치 [M+Na]+ = 802.15 ; 예상치 [M+Na]+ = 802.15. HPLC 방법 2 체류 시간 = 8.5분.
1.2.2.4) 화합물 INT2의 합성
이전 화합물 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에틸)-2-니트로페녹시)-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 381 mg (0.49 mmol), 엑사테칸 메실레이트 200 mg (0.38 mmol) 및 HOBt 51 mg (0.38 mmol)을 무수 DMF/피리딘의 85:15 (v/v) 혼합물 5 mL 중에 용해시켰다. DIPEA 53.5 mg (0.51 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 2시간 동안 교반하고, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 95:5)에 의해 정제하여 중간체 화합물 (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-((((1R,9R)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카르바모일)옥시)에틸)-2-니트로페녹시)-6-(메톡시카르보닐)테트라히드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 360 mg (87%)을 황색/녹색빛 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+Na]+ = 1098.3. HPLC 방법 3 체류 시간 = 14.7 및 14.9분 (부분입체이성질체 혼합물).
이 중간체 화합물 355 mg (0.33 mmol)을 0℃에서 MeOH/THF 75:25 8mL 중에 용해시켰다. LiOH 1수화물 (138 mg / 3.3 mmol)을 물 (1 mL) 중에 용해시키고, 반응 용기에 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후 (반응은 HPLC로 추적함), 혼합물을 아세트산 (258 mg / 4.3 mmol)으로 중화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 수득된 조 물질을 0℃에서 TFA/DCM (30:70 v/v) 용액으로 재용해시키고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 증발시키고, 조 잔류물을 물/ACN (1:1 v/v) 용액에 녹이고, HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 정제하여 화합물 INT2 172 mg (62%)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 836.2. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.3 및 7.8분 (부분입체이성질체 혼합물).
1.2.2.5) 입체순수 화합물 INT2-S 및 INT2-R의 합성
1.2.2.5.1) tert-부틸 (2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트의 라세미 혼합물의 키랄 분리
라세미 tert-부틸 (2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트 (이전에 기재된 바와 같이 합성함)의 키랄 분리를 텔레다인 이스코 콤비플래쉬® Rf200 시스템 상에서 키랄플래쉬(Chiralflash)® IC MPLC 칼럼 30x100mm, 20μm (다이셀 cat#83M73)를 사용하여 수행하였다. 이동상은 DCM + 0.2% (v/v) EtOH (등용매 구배)였다. 유량은 12 mL/분이었다. 샘플 용매는 DCM + 0.2% (v/v) EtOH였다. 분리 후 2종의 거울상이성질체의 질량 회수는 80% 초과였다.
tert-부틸 (S)-(2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트 체류 시간은 15분인 반면, tert-부틸 (R)-(2-히드록시-2-(4-히드록시-3-니트로페닐)에틸)카르바메이트 체류 시간은 25분이었다.
절대 배위를 결정하기 위해, 둘 다의 거울상이성질체의 페놀계 위치를 무수 THF 중 1.2 몰 당량의 4-니트로벤조일 클로라이드 및 2 몰 당량의 트리에틸아민으로 에스테르화하였다. 화합물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (석유 에테르/EtOAc, 구배 90:10에서 10:90)에 의해 정제하여 4-(2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)-1-히드록시에틸)-2-니트로페닐 4-니트로벤조에이트를 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.51 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.44 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 8.19 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.93 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 5.84 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.86 - 4.76 (m, 1H), 3.24 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H). ESI+ [M+Na]+ = 470.1.
거울상이성질체 (이전에 헵탄/디클로로메탄의 1:1 혼합물 중에 용해시키고, 3주 동안 천천히 증발되도록 하여 결정의 형성을 유도함)의 절대 배위를 X선 결정학에 의해 확인하였다. 블록-형상의 결정을 퍼플루오로에테르 오일 중 나일론 루프 상에 탑재하였다. T = 150.00 (5) K에서 작동하는 옥스포드 크리오시스템즈 저온 장치가 장착된 엑스칼리버, 아틀라스, 제미니 초-회절계를 사용하여 데이터를 수집하였다. 데이터는 Cu Kα 방사선을 사용하여 ω 스캔을 사용하여 측정하였다. ShelXT 솔루션 프로그램으로, 이중 방법을 사용하고 그래픽 인터페이스로서 Olex2 (O.V. Dolomanov et al., Olex2: A complete structure solution, refinement and analysis program, J. Appl. Cryst., 2009, 42, 339-341)를 사용하여 구조를 해석하였다. 모델을 ShelXL 2018/3 (Sheldrick, G.M., Crystal structure refinement with ShelXL, Acta Cryst., 2015, C71, 3-8)으로 F2에 대한 전체 행렬 최소 제곱 최소화를 사용하여 정밀화하였다.
1.2.2.5.2) 입체순수 INT2-S 및 INT2-R 화합물의 합성
입체순수 화합물 INT2-S 및 INT2-R을 이전 섹션 1.2.2에 기재된 바와 같이 합성하였고, 반응 조건, 반응성 또는 전체 수율에서 임의의 인지가능한 변화는 없었다.
HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 최종 정제하여 화합물 INT2-S 33 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 836.2. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.3분.
HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 최종 정제하여 화합물 INT2-R 21 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 836.2. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.8분.
1.2.3) 화합물 INT3의 합성
1.2.3.1) Ac-Val-Ala-OH (아세틸-L-발릴-L-알라닌)의 합성
DCM 30 mL 중 L-알라닌 벤질 에스테르 히드로클로라이드 (542 mg / 2.5 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (254 mg / 2.5 mmol), 증류수 (30 mL), N-α-아세틸-L-발린 (400 mg / 2.5 mmol) 및 HOBt (339 mg / 2.5 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, EDC-HCl (530 mg / 2.75 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 밤새 교반하였다. 반응물을 2M HCl 20 mL로 희석하였고, 층이 분리되었다. 유기 상을 2M HCl로 2회, 포화 NaHCO3 용액으로 2회 및 포화 NaCl 용액으로 1회 세척하였다. 유기 상을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 증발시켜 벤질 아세틸-L-발릴-L-알라니네이트 714 mg (89%)을 백색 고체 중간체로서 수득하였다.
이 중간체를 EtOAc/MeOH 1:1 (v/v) 10 mL 중에 가용화시키고, 스테인레스 스틸 수소화 반응기로 옮겼다. 제1 아르곤 퍼징 후, 촉매량의 5 중량% Pd/C를 첨가하였다. 이어서, 반응기를 H2로 2회 퍼징하고, 실온에서 밤새 10 bar의 H2 압력 하에 유지시켰다. 반응물을 0.45μm PTFE 필터로 여과하고, 진공 하에 용매를 제거한 후, 정량적 양의 순수한 아세틸-L-발릴-L-알라닌을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.45 (s, 1H), 8.23 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.25 - 4.11 (m, 2H), 1.94 (dt, J = 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.26 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.85 (dd, J = 12.1, 6.8 Hz, 6H).
1.2.3.2) (2S)-2-아세트아미도-N-((2S)-1-((4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드의 합성
둥근 바닥 플래쉬에서, 1-(4-아미노페닐)부트-3-인-1-올 (문헌 [Sharma A. et al., Chem 2018, 4 (10), 2370-2383]에 기재된 절차에 따라 합성됨) 420 mg (2.60 mmol) 및 이전 화합물 Ac-Val-Ala-OH 600 mg (2.60 mmol)을 무수 THF 20 mL 중에 현탁시켰다. 이어서, 무수 DMF 5 mL 중에 사전에 용해시킨 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ) 676 mg (2.74 mmol)을 플라스크에 넣고, 혼탁한 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시키고, 조 잔류물을 건조-로딩하고, 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 85:15)에 의해 정제하여 표제 화합물 809 mg (83%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.84 (s, 1H), 8.18 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.28 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.44 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.62 (q, J = 6.2 Hz, 1H), 4.39 (p, J = 7.6, 7.2 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.8 Hz, 1H), 2.70 (t, J = 2.6 Hz, 1H), 1.96 (dt, J = 13.2, 6.6 Hz, 1H), 1.88 (s, 3H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 10.9, 6.8 Hz, 6H). ESI+ [M+H]+ = 374.2. HPLC 방법 2 체류 시간 = 3.95분.
1.2.3.3) 1-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)부트-3-인-1-일 (4-니트로페닐) 카르보네이트의 합성
(2S)-2-아세트아미도-N-((2S)-1-((4-(1-히드록시부트-3-인-1-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)-3-메틸부탄아미드 94 mg (0.25 mmol) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 153 mg (0.50 mmol)을 무수 DMF 2 mL 중에 용해시켰다. DIPEA 98 mg (0.76 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 90:10)에 의해 정제하여 표제 화합물 118 mg (87%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.99 (s, 1H), 8.35 - 8.26 (m, 2H), 8.22 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.58 - 7.48 (m, 2H), 7.43 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 5.74 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.39 (p, J = 7.2 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 3.01 - 2.84 (m, 3H), 1.99 - 1.91 (m, 1H), 1.88 (s, 3H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 11.2, 6.8 Hz, 6H). ESI+ [M+H]+ = 539.1. HPLC 방법 2 체류 시간 = 6.48분.
1.2.3.4) 화합물 INT3의 합성
이전 화합물 1-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)부트-3-인-1-일 (4-니트로페닐) 카르보네이트 43 mg (0.081 mmol), 엑사테칸 메실레이트 55.5 mg (0.11) 및 HOBt 11.0 mg (0.08 mmol)을 무수 DMF/피리딘의 85:15 (v/v) 혼합물 2 mL 중에 용해시켰다. DIPEA 11.5 mg (0.09 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 감압 하에 휘발성 물질을 제거한 후, 반응 혼합물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 95:5)에 의해 정제하여 화합물 INT3 42 mg (62%)을 황색/녹색빛 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 835.3. HPLC 방법 2 체류 시간 = 6.50 및 6.60분 (부분입체이성질체 혼합물).
1.2.4) 화합물 INT4, INT4-S 및 INT4-R의 합성
1.2.4.1) tert-부틸 (2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트의 합성
상업적으로 입수가능한 tert-부틸 (2-히드록시-2-(4-니트로페닐)에틸)카르바메이트 (CAS# 939757-25-2) 911 mg (3.23 mmol)을 함유하는 MeOH 용액을 스테인레스 스틸 수소화 반응기로 옮겼다. 제1 아르곤 퍼징 후, 촉매량의 5 중량% Pd/C를 첨가하였다. 이어서, 반응기를 H2로 2회 퍼징하고, 반응물이 교반되도록 하면서 실온에서 5시간 동안 10 bar의 H2 압력 하에 유지하시켰다. 반응물을 0.45μm PTFE 필터로 여과하고, 진공 하에 MeOH를 제거한 후, 표제 화합물 749 mg (92%)을 백색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 253.2. HPLC 방법 2 체류 시간 = 2.73분.
1.2.4.2) tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트의 합성
이전 화합물 tert-부틸 (2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 150 mg (0.60 mmol), Fmoc-Ala-OH 222 mg (0.71 mmol) 및 DIPEA 81 mg (0.62 mmol)을 무수 DMF 5 mL 중에 용해시켰다. HATU 181 mg (0.71 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 100:0에서 90:10)에 의해 정제하여 제1 중간체 tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트를 정량적으로 수득하였고, 이는 Fmoc-탈보호에 직접 관여하였다. HPLC 방법 2 체류 시간 = 7.7분.
tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트를 DMF/피페리딘 9:1 (v/v) 5 mL 중에 용해시키고, 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 80:20)에 의해 정제하여 제2 중간체 tert-부틸 (2-(4-((S)-2-아미노프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 130 mg (2 단계에 걸쳐 68%)을 백색 발포성 고체로서 수득하였다. HPLC 방법 2 체류 시간 = 3.75분.
tert-부틸 (2-(4-((S)-2-아미노프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 130 mg (0.40 mmol) 및 상업적으로 입수가능한 Ac-Val-OSu (CAS# 56186-37-9) 124 mg (0.48 mmol)을 무수 DMF 3 mL 중에 용해시키고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 DCM 3 mL로 연화처리하여 표제 화합물 95 mg (51%)을 백색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.82 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.73 - 6.58 (m, 1H), 5.27 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.58 - 4.47 (m, 1H), 4.40 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.4, 6.8 Hz, 1H), 3.15 - 2.90 (m, 2H), 1.88 (s, 4H), 1.35 (s, 9H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.92 - 0.73 (m, 6H). ESI+ [M+H]+ = 487.3. HPLC 방법 2 체류 시간 = 4.50분.
1.2.4.3) tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에틸)카르바메이트의 합성
tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 286 mg (0.62 mmol) 및 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 375 mg (1.23 mmol)을 무수 DMF 3 mL 중에 용해시켰다. DIPEA 318 mg (2.46 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 90:10)에 의해 정제하여 표제 화합물 336 mg (87%)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.99 (s, 1H), 8.36 - 8.26 (m, 2H), 8.22 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.56 - 7.46 (m, 2H), 7.34 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 5.68 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.38 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 8.5, 6.9 Hz, 1H), 3.49 - 3.34 (m, 2H), 2.01 - 1.90 (m, 1H), 1.87 (s, 3H), 1.37 (s, 9H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (dd, J = 11.1, 6.8 Hz, 6H). ESI+ [M+Na]+ = 652.2. HPLC HPLC 방법 2 체류 시간 = 7.13분.
1.2.4.4) 화합물 INT4의 합성
이전 화합물 tert-부틸 (2-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-2-(((4-니트로페녹시)카르보닐)옥시)에틸)카르바메이트 231 mg (0.37 mmol), 엑사테칸 메실레이트 150 mg (0.28) 및 HOBt 38 mg (0.28 mmol)을 무수 DMF/피리딘의 85:15 (v/v) 혼합물 5 mL 중에 용해시켰다. DIPEA 40 mg (0.31 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 3시간 동안 교반하고, 휘발성 물질을 감압 하에 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피 (DCM/MeOH 구배 99:1에서 90:10)에 의해 정제하였다. 중간체 화합물 1-(4-((S)-2-((S)-2-아세트아미도-3-메틸부탄아미도)프로판아미도)페닐)-2-((tert-부톡시카르보닐)아미노)에틸 ((1R,9R)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카르바메이트 220 mg (85%)을 갈색 황색 고체로 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 926.4. HPLC 방법 2 체류 시간 = 6.7 및 6.8분 (부분입체이성질체 혼합물).
수득된 고체를 0℃에서 TFA/DCM (30:70 v/v) 용액으로 재용해시키고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 증발시키고, 조 잔류물을 물/ACN (1:1 v/v) 용액에 녹이고, HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 정제하여 화합물 INT4 171.4 mg (73%)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 826.4. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.3 및 8.75분 (부분입체이성질체 혼합물).
1.2.4.5) 입체순수 화합물 INT4-S 및 INT4-R의 합성
1.2.4.5.1) tert-부틸 (2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트의 라세미 혼합물의 키랄 분리
라세미 tert-부틸 (2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트의 키랄 분리를 텔레다인 이스코 콤비플래쉬® Rf200시스템 상에서 키랄플래쉬® IC MPLC 칼럼 30x100mm, 20μm (다이셀 cat#83M73)를 사용하여 수행하였다. 이동상은 DCM + 0.2% (v/v) EtOH (등용매 구배)였다. 유량은 12 mL/분이었다. 샘플 용매는 DCM + 0.2% (v/v) EtOH였다. 분리 후 2종의 거울상이성질체의 질량 회수는 75% 초과였다.
tert-부틸 (S)-(2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 체류 시간은 21분인 반면, tert-부틸 (R)-(2-(4-아미노페닐)-2-히드록시에틸)카르바메이트 체류 시간은 29분이었다. 거울상이성질체 (이전에 헵탄/에탄올의 1:1 혼합물 중에 용해시키고, 1주 동안 천천히 증발되도록 하여 결정의 형성을 유도함)의 절대 배위를 X선 결정학에 의해 확인하였다. 블록-형상의 결정을 퍼플루오로에테르 오일 중 나일론 루프 상에 탑재하였다. T = 150.00 (10) K에서 작동하는 옥스포드 크리오시스템즈 저온 장치가 장착된 엑스칼리버, 아틀라스, 제미니 초-회절계를 사용하여 데이터를 수집하였다. 데이터는 Cu Kα 방사선을 사용하여 ω 스캔을 사용하여 측정하였다. ShelXT 솔루션 프로그램으로, 이중 방법을 사용하고 그래픽 인터페이스로서 Olex2 (O.V. Dolomanov et al., Olex2: A complete structure solution, refinement and analysis program, J. Appl. Cryst., 2009, 42, 339-341)를 사용하여 구조를 해석하였다. 모델을 ShelXL 2018/3 (Sheldrick, G.M., Crystal structure refinement with ShelXL, Acta Cryst., 2015, C71, 3-8)으로 F2에 대한 전체 행렬 최소 제곱 최소화를 사용하여 정밀화하였다.
1.2.4.5.2) 입체순수 INT4-S 및 INT4-R 화합물의 합성
입체순수 화합물 INT4-S 및 INT4-R을 이전 섹션 1.2.4에 기재된 바와 같이 합성하였고, 반응 조건, 반응성 또는 전체 수율에서 임의의 인지가능한 변화는 없었다.
HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 최종 정제하여 화합물 INT4-S 54 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 826.4. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.45분.
HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 최종 정제하여 화합물 INT4-R 46 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 826.4. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.90분.
1.3) 약물-링커의 합성
1.3.1) 글루쿠로니드-기반 약물-링커의 합성
1.3.1.1) 화합물 LNK1의 합성
화합물 PSR1 (아지드-폴리사르코신 중간체) 44.5 mg (0.049 mmol) 및 화합물 INT1 (알킨-페이로드) 27.5 (0.033 mmol)를 100mM PBS (pH = 7.5) 및 DMSO의 1:1 (v/v) 용액 중에 용해시켜, 0.060M 농도의 화합물 INT1에 도달하도록 하였다. 이어서, 새로이 제조된 CuSO4 5수화물 및 아스코르브산나트륨 용액 (대략 250 mg/mL)을 순차적으로 반응 바이알에 첨가하여 0.08 몰 당량 Cu 및 1 몰 당량의 아스코르브산나트륨 (반응 혼합물 중 화합물 INT1 몰 당량 기준)에 도달하도록 하였다. 반응물을 아르곤으로 퍼징하고, 40℃에서 교반하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하였고, 이는 2시간 미만 내에 완결되었다. 이어서, 반응 혼합물을 물/ACN 1:1 (v/v) 중 0.1% TFA 용액으로 희석하고, HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 정제하여 중간체 화합물 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(2-(1-(35-아미노-3-글리실-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-데카메틸-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-운데카옥소-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-운데카아자펜타트리아콘틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)-1-((((1R,9R)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)카르바모일)옥시)에틸)-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리히드록시테트라히드로-2H-피란-2-카르복실산 44 mg (출발 화합물 INT1에 기초하여 77%)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 1755.7. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.51분 및 7.82분 (부분입체이성질체 혼합물).
이 화합물 26.0 mg (0.015 mmol) 및 말레이미도아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 4.11 mg (0.016 mmol)을 무수 DMF 중에 용해시켰다 (0.1M 농도의 말레이미드 화합물). 트리에틸아민 2.25 mg (0.022 mmol)을 첨가하고, HPLC에 의해 반응의 전체 전환이 관찰될 때까지 반응물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물/ACN 1:1 (v/v) 중 1% TFA 용액으로 희석하고, HPLC 정제용 방법 6을 사용하여 정제하여 화합물 LNK1 16.0 mg (57%)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 1892.7. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.95분 및 8.20분 (등몰 부분입체이성질체 혼합물).
1.3.1.2) 화합물 LNK2의 합성
화합물 PSR3 (NHS-활성화된 폴리사르코신 중간체) 409 mg (0.31 mmol) 및 화합물 INT2 (NH2-페이로드) 172 mg (0.21 mmol)을 소형 바이알 내의 무수 DMF 중에 용해시켰다 (0.080M 농도의 화합물 INT2). 트리에틸아민 83.5 mg (0.83 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. HPLC에 의해 관찰 시 반응의 전체 전환 후, 피페리딘을 반응 바이알에 직접 첨가하여 DMF 중 8% (v/v) 피페리딘 용액에 도달하도록 하였다. 이어서, HPLC에 의해 전체 Fmoc-탈보호가 관찰될 때까지 반응물을 실온에서 5-10분 동안 교반하였다. 반응물을 물/ACN 1:1 (v/v) 중 10% TFA 용액으로 천천히 중화시키고, HPLC 정제용 방법 5를 사용하여 정제하여 중간체 화합물 (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((9S)-40-아미노-9-(2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)아세트아미도)-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-데카메틸-1,6,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40-트리데카옥소-2-옥사-5,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-운데카아자테트라콘탄-3-일)-2-니트로페녹시)-3,4,5-트리히드록시테트라히드로-2H-피란-2-카르복실산 254 mg (출발 화합물 INT2에 기초하여 67% 수율)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 1819.7. HPLC 방법 2 체류 시간 = 4.60분 및 4.69분 (등몰 부분입체이성질체 혼합물).
이 화합물 254 mg (0.14 mmol) 및 말레이미도아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 39.1 mg (0.15 mmol)을 무수 DMF 중에 용해시켰다 (0.1M 농도의 말레이미드 화합물). 트리에틸아민 22.6 mg (0.22 mmol)을 첨가하고, HPLC에 의해 반응의 전체 전환이 관찰될 때까지 반응물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 물/ACN 1:1 (v/v) 중 1% TFA 용액으로 희석하고, HPLC 정제용 방법 6을 이용하여 정제하여 최종 화합물 LNK2 161 mg (58%)을 황색 고체로서 수득하였다. HRMS m/z (ESI+): 계산치 [M+2H]2+ = 985.8900; 예상치 [M+2H]2+ = 985.8896; 오차 = 0.4 ppm. HPLC 방법 2 체류 시간 = 7.9분 및 8.1분 (등몰 부분입체이성질체 혼합물).
1.3.1.3) 화합물 LNK2-S 및 LNK2-R의 합성
화합물 LNK-2-S 및 LNK2-R을 화합물 LNK2에 대해 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 출발 물질은 각각 화합물 INT2-S 및 INT2-R (NH2-페이로드) 및 화합물 PSR3 (NHS-활성화된 폴리사르코신 중간체)이었다.
화합물 LNK2-S 53.4 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+2H]2+ = 985.9. HPLC 방법 3 체류 시간 = 7.8분.
화합물 LNK2-R 44.0 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+2H]2+ = 985.9. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.1분.
1.3.2) 디펩티드-기반 약물-링커의 합성
1.3.2.1) 화합물 LNK3의 합성
최종 화합물 LNK3을 화합물 LNK1에 대해 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 출발 물질은 화합물 PSR2 (아지드-폴리사르코신 중간체) 및 화합물 INT3 (알킨-페이로드)이었다.
화합물 LNK3 14.0 mg (2 단계에 걸쳐 36%)을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+H]+ = 1883.8. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.82분 및 9.07분 (등몰 부분입체이성질체 혼합물).
1.3.2.2) 화합물 LNK4의 합성
화합물 LNK4를 화합물 LNK2에 대해 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 출발 물질은 화합물 PSR4 (NHS-활성화된 폴리사르코신 중간체) 및 화합물 INT4 (NH2-페이로드)였다.
화합물 LNK4 34.9 mg (2 단계에 걸쳐 46%)을 황색 고체로서 수득하였다. HRMS m/z (ESI+): 계산치 [M+2H]2+ = 981.4394; 예상치 [M+2H]2+ = 981.4398; 오차 = -0.4 ppm. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.81분 및 8.94분 (등몰 부분입체이성질체 혼합물).
1.3.2.3) 화합물 LNK4-S 및 LNK4-R의 합성
화합물 LNK4-S 및 LNK4-R을 화합물 LNK2에 대해 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 합성하였다. 출발 물질은 각각 화합물 INT4-S 및 INT4-R (NH2-페이로드) 및 화합물 PSR4 (NHS-활성화된 폴리사르코신 중간체)였다.
화합물 LNK4-S 18.1 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+2H]2+ = 981.4. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.78분.
화합물 LNK4-R 16.3 mg을 황색 고체로서 수득하였다. ESI+ [M+2H]2+ = 981.4. HPLC 방법 3 체류 시간 = 8.96분.
실시예 2: 항체-약물 접합체의 제조 및 특징화
2.1) 항체 생산
모노클로날 항체 아미노산 서열을 문헌으로부터 입수하였다. 파를레투주맙 경쇄 (서열식별번호: 10) 및 중쇄 (서열식별번호: 11) 서열은 문헌 [World Health Organization (WHO) Drug Information Vol 23, No. 3, 2009]에 공개된 제약 물질에 대한 국제 일반명 (INN) 리스트 62 및 WO2017151979로부터 입수하였다. 파를레투주맙의 중쇄 상에 Fc-침묵 돌연변이 L234A 및 L235A ("LALA")를 포함하는 파를레투주맙-LALA (Wines et al., The Journal of Immunology May 15, 2000, 164 (10) 5313-5318)를 또한 생산하였다 (중쇄 "LALA" 서열식별번호: 9 서열). 미르베툭시맙 경쇄 (서열식별번호: 17) 및 중쇄 (서열식별번호: 16) 서열은 특허 출원 WO2011106528로부터 입수하였다. 인간 IgG1k 비-결합 이소형 대조군은 시노 바이올로지칼스(Sino Biologicals)로부터의 cat#HG1K (독점 아미노산 서열)였다. 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)® 150mg)은 로슈(Roche)로부터 구입하였다. 엔헤르투(Enhertu)® (트라스투주맙 데룩스테칸)는 다이이치 산쿄(Daiichi Sankyo)/아스트라제네카(AstraZeneca)로부터 구입하였다.
모노클로날 항체는 관련 기술분야-인식 기술을 사용하여 CHO K1 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다 (스위스 소재 에비트리아 아게(Evitria AG)에 아웃소싱). cDNA를 통상적인 (비-PCR 기반) 클로닝 기술을 사용하여 에비트리아 벡터 시스템 내로 클로닝하였다. pDNA를 음이온 교환 크로마토그래피에 기초하여 저-내독소 조건 하에 제조하였다. 260 nm 파장에서 흡수를 측정함으로써 DNA 농도를 결정하였다. 서열의 정확성은 생어 서열분석 (플라스미드당 최대 2회의 서열분석 반응)에 의해 검증하였다. 현탁액-적응된 CHO K1 세포 (원래 ATCC로부터 제공받아, 에비트리아에서 현탁 배양액에서의 무혈청 성장에 적응시킴)를 항체 생산을 위해 사용하였다. 시드를 에비트리아의 독점 동물-성분 및 무혈청 배지에서 성장시켰다. 세포를 에비트리아의 독점 형질감염 시약으로 형질감염시켰다. 상청액을 원심분리 및 후속 여과 (0.2μm 필터)에 의해 수거하였다. 항체를 맙셀렉트 슈어 단백질 A 정제 수지 (시티바) 및 SEC 정제용 수지를 사용하여 정제하였다. 항체 물질의 순도를 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였고, 95% 초과였다. 내독소 함량을 찰스 리버 엔도세이프 PTS 시스템을 사용하여 측정하였다.
2.2) 시스테인-접합된 항체-약물 접합체의 제조
항체 용액 (PBS 7.4 + 1 mM EDTA 중 10 mg/mL)을 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)의 필요한 양 (최종 ~DAR4 ADC를 위해 2.2 몰 당량 또는 최종 DAR8 ADC를 위해 14 몰 당량)으로 37℃에서 1-2시간 동안 처리하였다. 환원된 항체를 아미콘 30K 원심분리 필터 장치 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 3 라운드의 희석/원심분리에 의해 인산칼륨 100 mM pH 7.4 + 1 mM EDTA로 완충제-교환하였다. 최종 ~DAR4 ADC를 위해, 6 몰 당량의 약물-링커 (12 mM DMSO 원액으로부터의 것)를 항체에 첨가하였다. 최종 DAR8 ADC를 위해, 10-12 몰 당량의 약물-링커를 첨가하였다. 용액을 실온에서 30분 인큐베이션하였다. 최종 접합체를 아미콘 30K 원심분리 필터 장치를 사용하여 4 라운드의 희석/원심분리에 의해 PBS pH 7.4 완충제 또는 히스티딘 수크로스 완충제 (20 mM 히스티딘 완충제 pH 6.0, 4% (w/v) 수크로스 + 75 mM NaCl)로 완충제-교환/정제하고, 멸균-여과하였다 (0.20μm PES 필터).
최종 단백질 농도를 나노드롭 원 장치 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 280 nm에서 분광광도계로 평가하였다.
2.3) 시스테인-접합된 항체-약물 접합체의 특징화
생성된 접합체를 하기와 같이 특징화하였다:
역상 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (RPLC-MS)에 의한 약물-항체-비 (DAR) 평가:
변성 RPLC-QToF 분석을 상기 실시예 1에 기재된 HPLC 방법 4를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 접합체를 물/아세토니트릴 + 0.1% 포름산 (0.4 mL/분)의 이동상 구배를 사용하여 애질런트 PLRP-S 1000Å 2.1x150mm 8μm (80℃) 상에서 용리시키고, 500-3500 m/z 범위 (ESI+)를 스캐닝하는 브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계를 사용하여 검출하였다. 데이터를 브루커 콤파스® 소프트웨어에 포함된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션하였다.
역상 액체 크로마토그래피 (RPLC-UV):
변성 RPLC-UV 분석을 또한 애질런트 1100 HPLC-DAD 시스템 상에서, 상기 기재된 HPLC 방법 4의 약간 변형된 버전을 사용하여 수행하였다. 이동상 개질제 0.1% 포름산을 0.1% TFA로 대체하고, 검출은 DAD UV 흡광도만을 사용하여 행하였다 (질량 분광측정법 검출기 없음).
크기 배제 크로마토그래피 (SEC):
15μL 미만의 칼럼외 부피를 갖는 애질런트 1100 HPLC 시스템 (짧은 섹션의 0.12mm 내부 직경 피크 튜빙 및 마이크로-부피 UV 유동 셀이 장착됨) 상에서 SEC를 수행하였다. 칼럼은 애질런트 어드밴스바이오SEC 300Å 4.6x150mm 2.7μm였다 (30℃에서 유지됨). 이동상은 100 mM 인산나트륨 및 200 mM 염화나트륨 (pH 6.8)이었다. 10% 아세토니트릴 (v/v)을 이동상에 첨가하여 고정상과의 2차 소수성 상호작용을 최소화하고 박테리아 성장을 방지하였다. 유량은 0.35 mL/분이었다. UV 검출을 280 nm 또는 임의의 다른 관련 파장에서 모니터링하였다.
2.4) 리신-접합된 항체-약물 접합체의 제조
항체 미르베툭시맙 또는 파를레투주맙의 용액 (100mM KH2PO4 pH 8.0 중 10 mg/mL)을 술포-SPDB-DM4 CAS#1626359-59-8 (메드켐익스프레스)의 12mM DMSO 용액으로 처리하여, 술포-SPDB-DM4의 7.5 몰 당량 최종 농도에 도달하였다. 용액을 실온에서 3시간 동안 인큐베이션하고, 0.20μm PES 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 접합체를 아미콘 30K 원심분리 필터 장치를 사용하여 5 라운드의 희석/원심분리에 의해 PBS pH 7.4 완충제 또는 히스티딘 수크로스 완충제 (20 mM 히스티딘 완충제 pH 6.0, 4% (w/v) 수크로스 + 75 mM NaCl)로 완충제-교환/정제하고, 멸균-여과하였다 (0.20μm PES 필터).
최종 단백질 농도를 나노드롭 원 장치 (써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 280 nm에서 분광광도계로 평가하였다.
2.5) 리신-접합된 항체-약물 접합체의 특징화
생성된 접합체를 하기와 같이 특징화하였다:
고유 SEC-MS에 의한 평균 약물-항체-비 (DAR) 평가:
분석 전에, ADC를 50μg의 ADC에 대해 50U의 IgG제로(IgGZERO)® (게노비스) 효소를 첨가함으로써 탈글리코실화하였다. ADC를 30℃로 유지시킨 애질런트 어드밴스바이오 SEC 200A 1.9μm 2.1x150mm PEEK 칼럼 (cat# PL1980-3201PK) 상에서 분리하였다. 칼럼을 50 mM 아세트산암모늄 + 10% (v/v) HPLC 등급 이소프로판올 중에서 평형화시켰다. 유량은 실행 동안 0.075 mL/분으로 유지시켰고, ADC는 전형적으로 3.5 내지 4.5분 사이에 용리되었다. 유동 및 완충제 조성은 mAb 또는 ADC의 용리 후에 유지시켰다. 칼럼 용리액을 300-8000 m/z 범위 (ESI+)를 스캐닝하는 브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계로 보냈다. 소스 모세관 전압을 4500 V로 설정하였다. 소스 건조 기체 및 연무화 기체를 각각 8.0 L/분 및 25 Psi로 설정하였다. 소스 건조 온도를 200℃로 설정하였다. 브루커 콤파스® 소프트웨어에 포함된 맥스엔트 알고리즘을 사용하여 ADC 질량 스펙트럼을 디컨볼루션하고, 각각의 ADC 하위-종의 이온 강도 피크 높이를 사용하여 DAR을 계산하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC):
15μL 미만의 칼럼외 부피를 갖는 애질런트 1100 HPLC 시스템 (짧은 섹션의 0.12mm 내부 직경 피크 튜빙 및 마이크로-부피 UV 유동 셀이 장착됨) 상에서 SEC를 수행하였다. 칼럼은 애질런트 어드밴스바이오SEC 300Å 4.6x150mm 2.7μm였다 (30℃에서 유지됨). 이동상은 100 mM 인산나트륨 및 200 mM 염화나트륨 (pH 6.8)이었다. 10% 이소프로판올 (v/v)을 이동상에 첨가하여 고정상과의 2차 소수성 상호작용을 최소화하고 박테리아 성장을 방지하였다. 유량은 0.35 mL/분이었다. UV 검출을 280 nm 또는 임의의 다른 관련 파장에서 모니터링하였다.
2.6) 합성된 항체-약물 접합체의 개관
표 7:
LC-0d: 경쇄; LC-1d: 1개의 약물-링커를 갖는 경쇄; HC-0d: 중쇄; HC-1d: 1개의 약물-링커를 갖는 중쇄; HC-2d: 2개의 약물-링커를 갖는 중쇄; HC-3d: 3개의 약물-링커를 갖는 중쇄. 주요 당형태가 HC에 대해 보고되어 있다.
실시예 3: 일반적 세포 배양 실시 및 동물 실험
본 프로젝트에 사용된 인간 암 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), 더 라이브니츠 인스티튜트 DSMZ 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤드 셀 컬쳐스 게엠베하 (DSMZ) 또는 유러피안 콜렉션 오브 어센티케이티드 셀 컬쳐스 (ECACC)로부터 구입하였다. 실험에 사용하기 위해, 세포 배양 배지 & 보충, 동결보존, 및 계대배양 절차에 대한 원래의 ATCC/DSMZ/ECACC 공급업체로부터의 지침에 따라, 세포를 우수한, 확립된 세포 배양 실시에 따라 배양하였다. 세포를 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 2개월 이하 동안 인큐베이션하였다.
모든 동물 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EEC에 따라 수행하였다. 실험은 프랑스 농무부에 의해 승인된 동물 관리 시설에서 및 개별 허가 하에 수행하였다. 연구는 지역 동물 윤리 위원회 (CECCAPP)에 의해 승인되었다.
실시예 4: 글루쿠로니드 또는 디펩티드 약물-링커 설계의 설치류 치료 지수 비교
약물-링커 구축물 LNK1 (글루쿠로니드-엑사테칸) 및 LNK3 (디펩티드 Val-Ala-엑사테칸)의 마우스 치료 지수를 평가하여, 2가지의 효소-절단가능한 양식 글루쿠로니드 및 디펩티드 Val-Ala의 마우스 치료 지수를 비교하였다. T-GLC-EXA ADC 및 T-VA-EXA ADC를, 표적화 모이어티로서 모델 인간 HER2 표적화 트라스투주맙 모노클로날 항체를 사용하여 제제화하였다. 이들 ADC를 HER2+ 위암 모델에서의 생체내 효능의 관점 및 내약성 (치료 지수)의 관점에서 비교하였다. 트라스투주맙은 마우스에서 교차-반응하지 않기 때문에, 이 검정은 ADC의 약물-링커 성분의 명백한 독성에 대한 유용한 정보를 제공한다 (가능한 표적-매개 독성이 제외됨).
생체내 효능의 평가: NCI-N87 위암 세포를 암컷 SCID 마우스 (4주령) 내에 피하로 이식하였다. 종양이 대략 150 mm3로 성장한 경우에 ADC를 1 mg/kg의 치유 용량 미만으로 정맥내로 1회 투여하였다 (군당 6마리의 동물, 군 사이의 초기 종양 부피의 차이를 최소화하기 위해 할당됨). 종양 부피를 캘리퍼 장치에 의해 3-5일마다 측정하고, 식 (L x W2)/2를 사용하여 계산하였다. 종양 부피가 1000 mm3를 초과한 경우 마우스를 희생시켰다.
약동학적 프로파일의 평가: 접합체의 단일 정맥내 3 mg/kg 용량 후 래트에서의 PK 프로파일 (시간 경과에 따른 mAb 성분에 기초한 총 항체-약물 접합체 농도). ADC를 암컷 스프라그-돌리 래트 (4-6주령, 찰스 리버)에 꼬리 정맥을 통해 3 mg/kg으로 주사하였다 (군당 3마리의 동물, 무작위로 할당됨). 혈액을 다양한 시점에 안와후 채혈을 통해 시트레이트 튜브 내로 채취하고, 혈장으로 프로세싱하고, 분석 시까지 -80℃에서 저장하였다. 항체 성분에 기초한 ADC 농도를 인간 IgG ELISA 키트 (스템셀(Stemcell)™ 테크놀로지스)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 평가하였다. 상응하는 모노클로날 항체의 표준 곡선을 정량화에 사용하였다. PK 함수 (미국 어바인 소재의 앨러간, 약동학 및 약물 대사 부서 유산스키(Usansky) 등에 의해 개발된 애드-인)를 포함하는 마이크로소프트(Microsoft)® 엑셀(Excel)® 소프트웨어를 사용하여 2-구획 분석에 의해 PK 파라미터 (클리어런스, 반감기 및 AUC)를 계산하였다.
생체내 내약성의 평가: 암컷 SCID 마우스 (n = 3)를 단일 복강내 고용량의 200 mg/kg의 ADC 화합물로 처리하였다. 마우스를 12일의 과정에 걸쳐 체중 감소 또는 독성의 명백한 징후에 대해 관찰하였다. 엔헤르투® (트라스투주맙 데룩스테칸)를 본 실험에서 양성 대조군으로서 사용하였다.
본 연구의 결과를 도 1에 제시한다. T-GLC-EXA 및 T-VA-EXA는 유사한 생체내 효능 (도 1A) 및 유사한 래트 PK 프로파일 (도 1B)을 보여주었지만, 마우스 내약성에 있어서 고용량에서 유의한 차이를 나타내었다 (도 1C). 적어도 엑사테칸 페이로드와 함께 사용하기 위해서는, 디펩티드 Val-Ala 절단가능한 양식이 보다 우수한 효능/내약성 프로파일을 제공한다고 결론내렸다. 따라서, 이러한 물질이 다른 ADC 구축물을 위해 선호되었다.
실시예 5: 폴레이트 수용체 알파 (FRa) 세포외 결합 부위의 유동 세포측정 평가
FRa 세포 표면 정량화를 위해, 세포를 PE 항-FOLR1 항체 (바이오레전드(BioLegend) cat#908304)와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율을 이바이오사이언스(eBioscience)™ 고정가능 생존율 염료 이플루오르(eFluor)™ 780 키트 (써모 피셔 사이언티픽 cat#65-0865-18)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 평가하였다. BD FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스)에 의해 제어되는 BD 포르테사 유동 세포측정기를 사용하여 분석을 수행하고, 플로우조 소프트웨어 (BD 바이오사이언스)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과를 도 2에 제시한다. 본 연구 프로그램의 세포주는 상이한 수준의 FRa의 세포외 발현을 나타내었다. BT-474 유방암 세포는 세포외 FRa를 발현하지 않았고, 따라서 본 연구 프로그램과 관련하여 음성 대조군 세포주인 것으로 간주되었다.
실시예 6: FRa+ 암성 세포주에 대한 엑사테칸 메실레이트의 시험관내 세포독성 검정
화합물 엑사테칸 메실레이트의 시험관내 세포독성을 여러 FRa 양성 암성 세포주에 대해 평가하였다. 세포를 세포주에 따라 적절한 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (100μL의 적절한 배양 배지 중 1000 내지 10,000개 세포/웰), 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지에 이전에 용해시킨 시험 화합물의 연속 희석물 (50μL)을 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 144시간 동안 수행하였다. MTT (5mg/mL, 20μL, 시그마-알드리치)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 내지 2시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 이어서, 배양 배지를 조심스럽게 제거하고, 웰 내용물을 산성화된 이소프로판올로 균질하게 용해시켰다. 흡광도 값을 멀티스칸™ 스카이 마이크로플레이트 판독기 (써모 사이언티픽) 상에서 570 nm의 파장 (690 nm의 참조 파장)을 사용하여 측정하였다. 억제 용량 반응 곡선 피팅 (그래프패드 프리즘 9)을 사용하여 비처리 대조군 세포와 비교하여 IC50 농도 값을 결정하였다.
결과를 도 3에 제시한다. 엑사테칸 메실레이트는 준-nM 내지 nM-미만의 IC50 시험관내 효력을 나타내었으며, 이는 본 발명자들이 이 화합물을 FRa-발현 악성종양에 대한 ADC 페이로드로서 사용하는 것을 조사하도록 촉발하였다.
실시예 7: ELISA에 의한 재조합 FRα-결합 친화도
샌드위치 ELISA 검정은 96-웰 높은-결합 ELISA 플레이트 (코닝 인크., 미국 뉴욕주 뉴욕, Cat#3590)를 사용하여 수행하였다. 플레이트를 PBS (pH 7.4) 중 100 μL/웰의 재조합 인간 FRa 단백질 (시노 바이올로지칼 cat#11241-H08H); 재조합 시노몰구스 FRa 단백질 (시노 바이올로지칼 cat#90950-C08H); 재조합 래트 FRa 단백질 (시노 바이올로지칼 cat#81073-R08H) 또는 재조합 마우스 FRa 단백질 (시노 바이올로지칼 cat# 50573-M08H)을 사용하여 2 μg/mL로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS-T (PBS + 0.05% 트윈-20)로 2회 세척한 후, 플레이트를 200 μL/웰의 인큐베이션 완충제 (PBS-T + 0.1% BSA)로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고, 시험 화합물 (항체 또는 항체-약물 접합체)의 3배 희석 시리즈 100 μL를 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 암실에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 5회 세척한 후, 플레이트를 이전에 인큐베이션 완충제 중에 1:250,000으로 희석시킨 염소 항-인간 IgG (H+L) HRP 접합된 항체 (잭슨 이뮤노리서치 cat#109-035-088) 100μL/웰과 함께 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. PBS-T로 5회 세척한 후, TMB 기질 용액 (써모-피셔 cat#N301)을 첨가하였다. 퍼옥시다제 활성을 0.18M H2SO4로 정지시키고, 써모 사이언티픽 멀티스칸 EX 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm (참조 파장 650 nm)에서 흡광도를 판독하였다. 그래프패드 프리즘 9 소프트웨어를 사용하여 S자형 피팅을 수행하였다.
결과를 도 4에 제시한다. 도 4A: 모든 항체 및 ADC는 대략 EC50 = 0.1nM의 유사한 재조합 인간 FRα 결합 친화도를 나타내었다. 천연 항체와 각각의 ADC 구축물 사이에 결합의 상실은 관찰되지 않았다. 파를레투주맙 및 파를레투주맙-LALA 및 그의 각각의 ADC 구축물 사이에 결합의 상실은 관찰되지 않았다. 미르베툭시맙과 M-SORAV ADC 구축물 사이에 결합의 유의한 상실은 관찰되지 않았다. 음성 대조군 ADC NEG-VA-EXA에 대한 인간 FRα 결합은 검출되지 않았다. 도 4B: F-LALA-VA-EXA는 인간 및 시노몰구스 재조합 FRa 단백질에 동등하게 결합하고, 래트 및 마우스 재조합 FRa 단백질에는 결합하지 않는다. 따라서, F-LALA-VA-EXA는 설치류 교차-반응성이 아니지만, 시노몰구스 교차-반응성이다.
실시예 8: SPR에 의한 인간 FRα-결합 친화도
표면 플라즈몬 공명 (SPR) 실험을 비아코어 T200 장치 상에서 25℃에서 수행하였다. 시험 항체 또는 ADC를, 인간 항체 포획 키트 (시티바(Cytiva) cat# BR100839)에 의해 사전에 관능화시킨 CM5 시리즈 S 센서칩 상에 저밀도 (300-500 RU)로 포획시켰다. 유사하게 처리하였지만 리간드를 생략한 관능화된 표면/유동 셀을 참조로서 사용하였다. 동역학적 속도 및 친화도를 측정하기 위해, 재조합 인간 FRa (시노 바이올로지칼 cat#11241-H08H) 분석물 샘플을 단일 사이클 동역학적 전략을 사용하여 연속해서 5가지 농도 (0.5, 1, 2, 4, 8 nM)로, 일정한 70 μL/mL 유량의 구동 완충제 (HBS-EP+, 시티바 cat# BR100669)로 300초의 접촉 펄스 하에 이중으로 주입하였다. 구동 완충제를 900초 동안 주입하여 해리 상을 측정하였다. 이중 주입 사이에, 분석물 및 리간드 둘 다를 제거하기 위해 표면/유동 셀을 3M MgCl2로 재생시키고, 동일한 조건을 사용하여 새로운 리간드 포획을 수행하였다. 데이터 분석은 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 참조 표면 및 분석물 제로-농도 신호의 차감 후에 수행하였다. 데이터를 프로세싱하고, 1:1 결합 모델에 피팅하여 결합 동역학 속도 상수, ka (온-레이트) 및 kd (오프-레이트), 및 KD (평형 해리 상수, 또한 "친화도"로도 지칭됨)를 결정하였다. 반복실험에 대한 평균 값 및 표준 편차를 보고하였다.
결과를 도 5에 제시한다. 천연 항체와 각각의 ADC 구축물 사이에서 재조합 인간 FRa 결합의 상실은 관찰되지 않았다. 파를레투주맙 및 파를레투주맙-LALA 및 각각의 ADC 구축물 사이에 결합의 상실은 관찰되지 않았다. 놀랍게도, 미르베툭시맙 및 미르베툭시맙-기반 구축물과 비교하여 파를레투주맙 및 파를레투주맙-LALA-기반 구축물에 대해 ~10배 감소된 KD 값 (친화도 상수)이 관찰되었다. 이는 미르베툭시맙 및 미르베툭시맙-기반 구축물과 비교하여 파를레투주맙 및 파를레투주맙-LALA-기반 구축물에 대한 증가된 kd 값 (해리율 상수)의 결과였다 (회합률 상수 ka가 유사하다는 것을 고려함). 음성 대조군 IgG1 (시노 바이올로지칼스 cat#HG1K)에 대해서는 어떠한 인간 FRα 결합 사건도 검출되지 않았다.
실시예 9: 유동 세포측정법에 의한 세포-결합 친화도
암성 세포주 상에서 발현된 세포외 인간 FRa에 대한 항체 또는 ADC 결합을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 시험된 항체 또는 ADC를 LYNX 신속 APC 항체 접합 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (바이오-라드, Cat#LNK032APC)에 따라 APC 형광단에 접합시켰다. 500,000개의 세포 (유동 세포측정 플라스틱 튜브에서 100μL의 PBS 중에 현탁됨)에 시험 APC-표지된 항체 또는 ADC의 10 μg/mL 용액 5 μL를 첨가하였다. 세포를 암실에서 20분 인큐베이션하고, 원심분리에 의해 PBS로 3회 세척하고, 분석을 위해 200 μL의 PBS 중에 재현탁시켰다. BD FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스)에 의해 제어되는 BD 포르테사 유동 세포측정기를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하고, 플로우조 소프트웨어 (BD 바이오사이언스)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과를 도 6에 제시한다. 파를레투주맙 및 파를레투주맙-LALA 및 각각의 ADC 구축물 사이에서 대등한 인간 FRα 세포 결합이 관찰되었다. 천연 미르베툭시맙 및 천연 파를레투주맙 결합 친화도는 동일한 것으로 보였다. 놀랍게도, 그의 모 항체 미르베툭시맙과 비교하여 미르베툭시맙의 ADC 유도체 (M-SORAV)에 대해 결합의 유의한 상실이 관찰되었다. 이는 (1) 항체 가변 영역의 일부인 리신 아미노산과 반응하여 결합 친화도를 감소시킬 수 있는 술포-SPDB-DM4 약물-링커의 이질적 확률적 접합; (2) LYNX 신속 APC 접합 키트가 술포-SPDB-DM4와 같은 리신 아미노산과 반응함으로 인한 M-SORAV의 보다 낮은 APC 표지화 효율 또는 (3) (1)과 (2)의 조합에 의해 설명될 수 있다. FRa-음성 대조군 세포주 BT-474에 대해서는 모든 시험된 화합물에 대해 결합이 관찰되지 않았다.
실시예 10: 생체외 ADC 인간 혈장 안정성
F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA ADC 샘플 (PBS 중 >6 mg/mL 용액)을 스크류 마개를 갖는 원심분리 튜브에서 순수한 멸균 인간 혈장 (진텍스 Cat# GTX73265)으로 희석하여 200 μg/mL의 최종 ADC 농도를 수득하였다 (잔류 PBS 부피 5% v/v 미만). 샘플을 37℃에서 인큐베이션하고, 분취액을 5분, 6시간, 1일, 2일, 3일, 및 7일의 시점에 취하였다 (분취액을 분석 시까지 -80℃에서 동결 유지시킴). 이전에 비오티닐화된 인간 폴레이트 수용체 알파 재조합 단백질 (시노 바이올로지칼스 cat#11241-H08H)로 코팅된 디나비즈™ M-280 스트렙타비딘 (써모 사이언티픽) 자기 비드를 사용하여 면역포획에 의해 혈장으로부터 ADC를 단리하였다. 간략하게, 600 μL의 상업용 비드 용액을 HBS-EP 완충제 (시티바, 카탈로그 #BR100188)로 2회 세척하고, 1.2 mL의 HBS-EP 완충제 중에 재현탁시켰다. 65 μL (48 μg 단백질 양)의 비오티닐화된 재조합 FRa 용액을 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 비드를 HBS-EP 완충제로 3회 세척하고, 1.2mL의 HBS-EP 완충제 중에 재현탁시켰다. 1회의 면역포획을 위해, 100 μL의 이전 비드 용액을 마이크로원심분리 튜브 내의 100 μL의 HBS-EP에 첨가하였다. 혈장 중 10 μL의 ADC 용액 (이론상 2 μg ADC 양)을 첨가하고, 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 인큐베이션 후에, 비드-ADC 복합체를 HBS-EP 완충제로 2회 세척하고, 200 μL의 HBS-EP 완충제로 재현탁시키고, 2 μL/1000U의 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스 cat# P0705L)를 완만한 교반 하에 37℃에서 밤새 첨가함으로써 탈글리코실화시켰다. 이어서, 비드를 HBS-EP 완충제로 2회, 증류수로 2회 및 물 중 10% 아세토니트릴 (v/v)로 1회 세척하였다. 비드를 0.1% (v/v)의 포름산을 함유하는 물 중 30% 아세토니트릴 (v/v) 50 μL와 함께 실온에서 완만한 교반 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 브루커 임팩트 II™ Q-ToF 질량 분광계가 장착된 써모 얼티메이트 3000 UHPLC 시스템을 사용한 변성 역상 크로마토그래피-질량 분광측정법에 의해, 탈글리코실화된 ADC를 함유하는 용리된 샘플을 분석하였다. 이동상 A는 물 + 0.1% 포름산이었고, 이동상 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산이었다. 칼럼은 애질런트 PEEK PLRP-S 1000Å 2.1x100mm 5μm (80℃)였다. 선형 구배는 25분 내 20%B에서 50%B였다. 유량은 0.4 mL/분이었다. UV 검출을 280 nm에서 모니터링하였다. Q-ToF 질량 분광계는 m/z 범위 500-5000 (ESI+)에서 사용하였다. 데이터를 브루커 콤파스® 소프트웨어에 포함된 MaxEnt 알고리즘을 사용하여 디컨볼루션하였다. 안정성 데이터 분석을 위해, 선택된 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC) 용리 시간 범위 내의 미가공 스펙트럼의 디컨볼루션을 구현하였다. 약물-링커 상실 또는 변형은 출발 ADC 물질로부터의 상응하는 질량 이동에 따라 확인되었다. 상이한 DAR을 갖는 ADC의 상대비는 특정 ADC 하위-종의 강도를 총 ADC 종으로부터의 강도로 나눔으로써 계산하였다. 최종 DAR 값은 문헌 [Xu et al., Anal. Biochem., 2011, 412 (1), 56-66]에 기재된 바와 같이 계산하였다.
결과를 도 7에 제시한다. >90% 약물-링커 인간 혈장 안정성이 F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA ADC 둘 다에 대해 관찰되었다. 말레이미드 기의 자기-안정화 가수분해로부터의 +18 Da (+H2O) 질량 이동 (이는 48-72시간 ADC 인큐베이션 시간 후에 완료되었음)을 제외하고는, 본 연구 동안 약물-링커 질량 이동은 관찰되지 않았다 (조기 엑사테칸 방출 또는 대사 없음). 유일하게 관찰된 불안정성은 ADC의 중쇄 상의 전체 약물-링커의 역-마이클 말레이미드 탈접합에 의해 유발되었다 (경쇄 상에서 탈접합은 관찰되지 않음).
실시예 11: FRa 음성 세포주에 대한 시험관내 세포독성 실험
ADC의 비특이적 (오프-타겟) 세포독성을 평가하기 위해, 시험관내 세포독성 검정을 BT-474 (FRa 음성) 암 세포주에서 실현하였다. 세포를 세포주에 따라 적절한 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 (100μL의 적절한 배양 배지 중 1000 내지 10,000개 세포/웰), 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지에 이전에 용해시킨 시험 화합물의 연속 희석물 (50μL)을 첨가하고, 인큐베이션을 37℃에서 144시간 동안 수행하였다. MTT (5mg/mL, 20μL, 시그마-알드리치)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 내지 2시간 동안 계속 인큐베이션하였다. 이어서, 배양 배지를 조심스럽게 제거하고, 웰 내용물을 산성화된 이소프로판올로 균질하게 용해시켰다. 흡광도 값을 멀티스칸™ 스카이 마이크로플레이트 판독기 (써모 사이언티픽) 상에서 570 nm의 파장 (690 nm의 참조 파장)을 사용하여 측정하였다. 억제 용량 반응 곡선 피팅 (그래프패드 프리즘 9)을 사용하여 비처리 대조군 세포와 비교하여 IC50 농도 값을 결정하였다.
결과를 도 8에 제시한다. 소라브탄신 (술포-SPDB-DM4)-기반 ADC는 VA-EXA (LNK4-S 약물-링커)-기반 ADC와 비교하여 더 높은 수준의 오프-타겟 (비-FRa-매개) 세포 사멸 효력을 나타내었다. 이는 미르베툭시맙- 및 파를레투주맙-기반 ADC 둘 다에 대해 관찰되었다. VA-EXA 약물-링커 성분은 소라브탄신 약물-링커와 비교하여 오프-타겟 독성을 덜 생성하며, 이는 임상 설정에서 ADC의 내약성을 증가시키기 위한 우수한 전제조건이다.
표 8:
실시예 12: 생체내 효능 이종이식 모델
4 내지 5주령 암컷 CB-17 중증 복합 면역결핍 (SCID) 마우스를 장비에 랩스(Janvier labs) (프랑스 르 제네스-생-아일)로부터 입수하고, 연구 개시 전에 7일 동안 격리하였다. 마우스를 PBS 중 재현탁된 세포 (마우스당 5-10 x 106개 세포) (OV-90, SW-620, KB, BT-474 세포주) 또는 PBS 중 50% BD 매트리겔 (코닝®) (PA-1, IGROV-1, OVCAR-3, NCI-H2110 세포주)로 피하로 접종하였다. 평균 종양 부피가 약 120-150 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 무작위화하고 (전형적으로 군당 7마리 마우스), PBS (음성 대조군) 또는 임상시험 항체-약물 접합체의 단일 (달리 언급되지 않는 한) 정맥내 주사에 의해 처리하였다. 종양 부피를 캘리퍼 장치 (길이 x 폭)를 사용하여 3-5일마다 측정하고, 하기 식 V = 4/3 x π x R3을 사용하여 계산하였고, 여기서 R은 반경을 나타낸다. 종양 부피가 1500 mm3을 초과할 때 또는 종양의 궤양화의 경우에 마우스를 희생시켰다.
IGROV-1 종양 모델에서, 종양 재이식 챌린지를 연구 제94일에 수행하였다. F-LALA-VA-EXA (12mg/kg IV 1회)로 처리한 마우스에, 연구 시작 시 사용한 것과 동일한 절차를 사용하여 IGROV-1 세포를 재이식하였다 (동물의 다른 옆구리). 5마리의 새로운 SCID 동물의 대조군에도 또한 정확하게 동일한 절차에 따라 재이식하였다.
도 9에는 SW-620 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 5, 10 또는 15 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. F-VA-EXA는 5 mg/kg 이상의 용량에서 고도로 활성인 반면, 비교물 M-SORAV는 15 mg/kg으로 투여한 경우에도 불활성이었다.
도 10에는 SW-620 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA를 1, 3 및 6 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 비-표적화 이소형-매칭 음성 대조군 ADC NEG-VA-EXA를 6 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA는 1 mg/kg 이상의 용량에서 동등하게 고도로 활성이었다. 비-표적화 접합체 NEG-VA-EXA는 6 mg/kg의 최고 시험 용량에서 불활성이었고, 이는 접합체의 항종양 활성이 표적-선택적임을 입증한다.
도 11에는 OV-90 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-VA-EXA, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 30 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 모든 접합체는 모든 군에서 100% 완화율로 고도로 활성이었다. 그러나, M-SORAV 접합체에서 유의한 독성이 관찰되었다: 6마리의 마우스 중 6마리가 흐트러진 외양 (칙칙하고 헝클어진 헤어코트)을 보였고, 6마리의 마우스 중 3마리가 탈진 징후를 나타내었고, 6마리의 마우스 중 2마리에서 설사가 있었다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA 접합체에 의해서는 독성이 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 M-SORAV와 비교하여 F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA 구축물에 대한 보다 우수한 전임상 치료 범위를 제안한다.
도 12에는 OV-90 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-VA-EXA, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 치유 용량 미만의 5 및 10 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 5 mg/kg에서, F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA는 M-SORAV와 비교하여 유사한 효능 및 개선된 효능을 나타내었다. 10 mg/kg에서, F-VA-EXA 및 M-SORAV는 유사한 효능을 나타내었다 (그러나 M-SORAV 군 내에서 보다 많은 불균질성이 관찰되었음). 10 mg/kg에서, F-LALA-VA-EXA는 F-VA-EXA 및 M-SORAV 둘 다를 능가하였다.
도 13에는 KB 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-VA-EXA, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 3, 6 및 12 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 비-표적화 이소형-매칭 음성 대조군 ADC NEG-VA-EXA를 12 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. F-VA-EXA, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV는 3 mg/kg 이상의 용량에서 동등하게 활성이었다. 비-표적화 접합체 NEG-VA-EXA는 12 mg/kg의 최고 시험 용량에서 불활성이었고, 이는 접합체의 항종양 활성이 표적-선택적임을 입증한다.
도 14에는 PA-1 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 치유 용량 미만의 3, 6 및 12 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 비-표적화 이소형-매칭 음성 대조군 ADC NEG-VA-EXA를 12 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 3 mg/kg에서, F-LALA-VA-EXA는 M-SORAV를 능가하였다. 6 mg에서 F-LALA-VA-EXA는 M-SORAV를 약간 능가하였다. 12 mg에서 M-SORAV는 F-LALA-VA-EXA를 능가하였다. 전반적으로, 둘 다의 접합체는 유사한 수준의 효능을 나타내었다. 시험된 최고 용량 12 mg/kg에서, 비-표적화 접합체 NEG-VA-EXA는 비처리 대조군과 비교하여 약간 감소된 종양 성장 속도를 나타내었다.
도 15에는 OV-90 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 3, 6 및 12 mg/kg 용량으로 1회 IV 주사하였다. 3, 6 및 12 mg/kg에서, F-LALA-VA-EXA는 M-SORAV를 능가하였다.
도 16에는 IGROV-1 암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 3, 6 및 12 mg/kg 용량으로 1회 IV 주사하였다. 비-표적화 이소형-매칭 음성 대조군 ADC NEG-VA-EXA를 12 mg/kg으로 1회 IV 주사하였다. 3, 6 및 12 mg/kg에서, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV는 강한 종양 퇴행이 존재하는, 유사한 수준의 효능을 보였다. 12 mg/kg의 최고 시험 용량에서, 비-표적화 접합체 NEG-VA-EXA는 어느 정도의 수준의 효능을 나타내었지만, 연구의 다른 FRa-표적화 ADC보다 덜 현저하였다. 연구 제94일 후에 수행된 종양 재성장 재챌린지는, 12mg/kg의 F-LALA-VA-EXA로 IV 1회 처리된 군의 재이식 후에 어떠한 종양 성장도 관찰되지 않았기 때문에, F-LALA-VA-EXA가 보호적 면역 기억 반응을 유도할 수 있다는 것을 확인시켜 주었다 (새로운 비처리 SCID 마우스를 갖는 양성 대조군은 이식 후에 종양 성장을 나타내었음).
도 17에는 폴레이트 수용체 알파 음성 (FRa neg) BT-474 유방암 모델에서의 종양 이종이식 실험이 제시된다. F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 5 및 10 mg/kg 용량으로 1회 IV 주사하였다. 엔헤르투® (HER2-표적화 트라스투주맙 데룩스테칸)를 양성 대조군으로서 사용하였고, 10 mg/kg 용량으로 1회 IV 주사하였다. 둘 다의 용량으로의 F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV에 대해서는 어떠한 효능도 관찰되지 않았고, 이는 이들 접합체의 효능이 FRa 선택적임을 확인시켜준다. 예상된 바와 같이, 그리고 이전에 관찰된 바와 같이 (Conilh et al., 2021, Pharmaceuticals, 14(3), 247, doi: 10.3390/ph14030247), 엔헤르투®는 이러한 HER2 양성 BT-474 암 모델에서 효과적이었다.
표 9:
실시예 13: 마우스 내약성 실험
마우스 전임상 치료 지수를 평가하기 위해, F-VA-EXA, F-LALA-VA-EXA 및 M-SORAV 접합체를 사용하여 마우스 내약성 실험을 수행하였다. 암컷 SCID 마우스 (n=5마리의 마우스/군)를 단일 복강내 용량의 F-VA-EXA (200 mg/kg), F-LALA-VA-EXA (200 mg/kg) 또는 M-SORAV (100 mg/kg)로 처리하였다. 마우스를 21일의 과정에 걸쳐 체중 감소 또는 독성의 명백한 징후에 대해 조심스럽게 모니터링하였다.
암컷 CD-1 마우스에서 F-LALA-VA-EXA 0, 50, 100, 150 또는 200 mg/kg으로 1회 IV 처리하여 동일한 실험을 또한 수행하였다.
결과를 하기 및 도 18에 제시한다 (SCID 마우스 실험에 대한 것). F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA는 200 mg/kg의 용량에서 독성의 명백한 징후 없이 잘 허용되었다. 반대로, 100 m/kg의 용량의 M-SORAV로 처리된 모든 마우스는 독성의 유의한 징후를 나타내었고 (많은 털과 함께 흐트러진 외양, 설사, 탈진, 감긴 눈, 지친 거동), 제2일-제3일에 사망하였거나 안락사시켜야 했다. 이들 결과는 상기 언급된 이종이식 효능 데이터와 함께, 비교자 M-SORAV와 비교하여 F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA 구축물의 뛰어난 전임상 치료 지수를 보여준다.
암컷 CD-1 마우스에서, MBK-103은 조사된 모든 용량 수준에서 어떠한 용량 의존성 유해 전신 또는 국부 효과를 유발하지 않았다 (최대 200mg/kg IV 1회). 체중 감소 또는 거동의 변화는 관찰되지 않았다. 유일하게 주목할 만한 관찰은 최종 부검 동안 대조군과 비교하여 모든 군에서의 흉선 및 비장 중량의 약간의 감소였다.
표 10:
실시예 14: 스프라그-돌리 래트 약동학 연구
F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA 접합체를 암컷 스프라그-돌리 래트 (4-6주령-찰스 리버)에 꼬리 정맥을 통해 5 mg/kg으로 주사하였다 (군당 6마리의 동물, 무작위로 할당됨). 혈액을 5분, 4시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일 및 21일에 안와후 채혈을 통해 시트레이트 튜브 내로 채취하고; 혈장으로 프로세싱하고; 분석 시까지 -80℃에서 저장하였다.
총 mAb 농도를 ELISA에 의해, 포획 시약으로서 염소 폴리클로날 항-인간 IgG (H+L) 1차 항체 (잭슨 이뮤노리서치) 및 2차 검출 항체로서 마우스 폴리클로날 항-인간 IgG (H+L) HRP 접합체 (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 평가하였다. 총 ADC 농도를 ELISA에 의해, 포획 시약으로서 토끼 폴리클로날 항-엑사테칸 항체 (ref#6294/00000920, 프랑스 아프리유 소재의 바이오템(Biotem)에서 주문-제작), 및 2차 검출 항체로서 마우스 폴리클로날 항-인간 IgG (H+L) HRP 접합체 (잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 평가하였다. ADC의 표준 곡선을 정량화에 사용하였다.
PK 함수 (미국 캘리포니아주 어바인 소재의 앨러간, 약동학 및 약물 대사 부서 유산스키 등에 의해 개발된 애드-인)를 포함하는 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 사용하여 2-구획 분석에 의해 약동학적 파라미터 (클리어런스, 반감기, Vss 및 AUC)를 계산하였다.
유리 엑사테칸 농도를 LC/MS-MS 방법을 사용하여, 애질런트 1100 HPLC 시스템 및 사이엑스 API 4000 MS/MS 시스템을 사용하여 평가하였다. 래트 혈장 샘플을 80:20 (v/v) 아세토니트릴/메탄올 + 1% 포름산 + 내부 표준물로서 d5-엑사테칸 (20 ng/mL)으로 구성된 유기 용액을 사용하여 단백질-침전시켰다. 45℃에서 유지시킨 페노메넥스 키네텍스(Phenomenex Kinetex)® C8 2.1x30mm 2.6μm 100A 칼럼 (페노메넥스 cat# 00D-4497-AN) 상에서 구배 용리 모드를 사용하여 샘플을 분석하였다. 이동상 A는 물 + 0.15% 포름산이었고, 이동상 B는 아세토니트릴/이소프로판올 80:20 (v/v) + 0.15% 포름산이었다. 유량은 0.8mL/분이었다. 검출을 위해, MRM 스캐닝을 양이온 모드로 사용하였다. 보정 곡선을 피크 면적 비 분석물/중수소화된 내부 표준물 대 공칭 분석물 농도를 사용하여, 1/x 가중치를 사용한 선형 최소 제곱 회귀를 사용하여 플롯팅하였다. 보정 곡선은 0.2 (LLOQ) 내지 500 ng/mL 범위였다.
결과를 도 19에 제시한다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA는 순환에서 2상 PK 프로파일 (빠른 분포상에 이어서 보다 느린 제거상)을 나타내었고, 유사한 분포 부피, 느린 클리어런스율 및 13-15일 범위의 반감기를 가졌다. 총 mAb 및 총 ADC 곡선은 강도, 기울기 및 형상이 유사하였으며, 이는 우수한 ADC 안정성 (시간 경과에 따른 주요 페이로드 탈접합 없음)을 시사한다. 유리 엑사테칸 페이로드는 실험의 0-48시간 기간 동안에만 검출되었고 (모 ADC 성분보다 106배 덜 농축됨), 이는 우수한 ADC 안정성 및 엑사테칸의 조기 탈접합이 없음을 시사한다.
실시예 15: 마우스에서의 폐 염증 및 독성 평가
블레오마이신은 섬유생성에 수반되는 메카니즘의 연구 및 잠재적 요법의 평가를 위해 폐 섬유증을 모델링하기 위해 설치류에서 널리 사용되어 왔다. ADC 폐 독성을 평가하기 위해, 블레오마이신-유도된 폐 섬유증을 문헌 [Walter and Kleeberger, Mouse Models of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis, 2008, Curr. Protoc. Pharmacol. 40:5.46.1-5.46.17]에 기재된 바와 같은 공지된 절차에 따라 마우스에서 유도하였다. 제0일, 제4일 및 제8일에, 암컷 C57/BL6 마우스 (장비에 랩스(Janvier Labs), 프랑스 르 제네스트-세인트-아일)를 이소플루란으로 가볍게 마취시키고, 20 μL의 1 mg/kg 블레오마이신 PBS 용액 (블레오마이신 벨론, 주사용 15 mg) 또는 PBS (음성 대조군 마우스)를 비강내로 투여하였다. 비-블레오마이신-조건화 마우스를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 제11일에, 마우스 (군당 n=6마리 동물)를 시험 접합체 (10 mg/kg i.p.)로 처리하고, 실험 지속기간 동안 독성 및 체중 감소의 겉보기 징후에 대해 모니터링하였다. 전임상에서 및 적은 백분율의 환자에서 간질성 폐 질환 및 폐장염을 유도하는 것으로 공지되어 있는, 임상 승인된 접합체 엔헤르투® (10 mg/kg i.p.)로 처리한 양성 대조군을 포함시켰다. 제25일에 모든 마우스를 희생시키고, 기관지-폐포 상청액을 수득하고 (기관지-폐포 세척에 의함), 폐 기관을 수거하고, 칭량하고, PBS 중 0.1% (w/v) 포름알데히드 중에 고정시켰다. 고정 후, 폐를 PBS 용액 중 0.02% (w/v) 아지드화나트륨으로 헹구고, 조직학적 염색을 위해 파라핀에 포매시켰다. 슬라이드를 항-CD45 항체 (압캠(Abcam) cat#ab10558, 1:500)로 염색하여 폐에서의 백혈구 침윤 수준을 정량화하였다. 2차 비오티닐화된 염소 항-토끼 항체 (벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories) cat#BA-1000, 1:300) 및 아비딘-HRP (벡터 래보러토리즈 cat# A-2004)를 검출에 사용하였다. 조직학적 실험 및 영상화는 센터 드'이미저리 퀀터테이티브 리온-에스트(Centre d'Imagerie Quantitative Lyon-Est, CiQLE) 플랫폼 (프랑스 리온)에 아웃소싱하였다. IHC 영상의 무작위 절편 (30% 확대)을 피지(Fiji) 소프트웨어 (미국 위스콘신-매디슨 대학교의 광학 및 컴퓨터 기기를 위한 실험실에 의해 개발되고 유지됨)의 고유 기능을 사용하여 프로세싱하여, 슬라이드 (폐당 1개의 슬라이드) 내의 CD45 양성 세포를 카운팅하고 백혈구 침윤 수준을 평가하였다. 비-블레오마이신-조건화 마우스로부터 수득한 기관지-폐포 상청액 내의 림프구 (CD3/CD4), 호산구 (CCR3/SiglecF), 호중구 (Ly6g/Ly6C) 및 대식세포 (F4/80)의 총 카운트의 모니터링을 유동 세포측정법에 의해 수행하였다. 비-블레오마이신-조건화 마우스로부터 수득한 기관지-폐포 상청액 내의 염증성 시토카인 수준은 ELISA에 의해 정량화하였다. IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13은 바이오-플렉스 프로(Bio-Plex Pro)™ 마우스 시토카인 Th2 패널 (바이오-라드 cat# L60000UKVT)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다. TGF-β 및 IL-17은 각각 마우스 TGF-베타 1 듀오세트 및 마우스 IL-17 듀오세트 ELISA 키트 (알앤디 시스템즈(R&D systems) cat# DY1679 및 DY421)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정량화하였다.
통계적 유의성은 그래프패드 프리즘 9 소프트웨어를 사용하여 일원 ANOVA (터키 방법)를 사용하여 평가하였다. p-값은 * (p < 0.033), ** (p < 0.002), *** (p < 0.0002) 및 **** (p < 0.0001)로 나타내어지고, "ns"는 유의하지 않음 (p > 0.123)을 의미한다.
IHC CD45 정량화 결과를 도 20에 제시한다. 양성 대조군 엔헤르투® ADC는 비처리 (***) 및 블레오마이신-조건화 (****) 음성 대조군 둘 다와 비교하여 백혈구 염증 침윤의 유의한 증가를 유발하였다. F-VA-EXA ADC는 비처리군과 비교하여 백혈구 염증 침윤의 유의한 증가를 유발하지 않았고, 블레오마이신-조건화 (***) 대조군과 비교한 경우 유의한 증가를 유발하였다. F-LALA-VA-EXA는 비처리 및 블레오마이신-조건화 음성 대조군 둘 다와 비교하여 백혈구 염증 침윤의 유의한 증가를 유발하지 않았다. 이러한 전임상 결과를 기초로, F-VA-EXA 및 특히 F-LALA-VA-EXA (Fc-침묵 변이체)가 임상 세팅에서 간질성 폐 질환 또는 폐장염을 덜 유도하거나 또는 유도하지 않을 것으로 가설화할 수 있다.
기관지-폐포 상청액 내의 염증성 시토카인 수준을 도 21A에 제시한다. 양성 대조군 엔헤르투® ADC는 비처리군과 비교하여 IL-13, IL-17 및 TGF-β 시토카인 수준의 유의한 증가를 유발하였다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA ADC는 비처리군과 비교하여 시토카인 수준의 유의한 증가를 유발하지 않았다.
기관지-폐포 상청액에서의 림프구, 호산구, 호중구 및 대식세포의 총 카운트를 도 21B에 제시한다. 양성 대조군 엔헤르투®는 비처리 대조군과 비교하여 림프구, 대식세포, 호중구 및 호산구 카운트의 유의한 증가를 유발하였다. F-VA-EXA 및 F-LALA-VA-EXA는 비처리 대조군과 비교하여 림프구 카운트의 유의한 증가를 나타내었지만, 비처리 대조군과 비교하여 대식세포, 호중구 및 호산구의 통계적으로 유의한 증가는 나타내지 않았다.
표 11:
실시예 16: 시노몰구스 원숭이에서의 용량-범위-발견 독성학 연구
베트남 기원의 목적-사육 천연 암컷 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 사용하여 비인간 영장류 용량-범위-발견 독성학 연구를 수행하였다. 연구는 신바이오세 SAS (프랑스 마르시-레뚜왈르)에서 수행하였다. 연구 프로토콜은 시험 시설 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. F-LALA-VA-EXA ADC를 30, 40, 50 또는 60 mg/kg의 용량 수준으로 3-주 간격 (총 3회 용량)으로 정맥내로 투여하였다 (5mL/kg/h, 30분 주사 기간에 걸침). 2마리의 암컷 원숭이/군을 연구에 사용하였다 (총 8마리의 동물). 마지막 투여 5일 후에 최종 희생시킨 후, 육안 부검, 기관 중량의 측정 및 조직병리학적 검사를 수행하였다. 연구 동안 평가된 파라미터는 사망률, 임상 징후 (식품 소비의 추정 포함), 체중, 안과 검사, 체온, 혈액학, 응고, 임상 화학, 요분석, 기관 중량, 및 광범위한 조직 목록의 육안 및 현미경 검사를 포함하였다. ADC 제제 완충제는 20mM 히스티딘 pH 6.0, 4% (w/v) 수크로스 및 75mM NaCl이었다. 비히클은 염수 0.9%였다.
결과를 도 22에 제시한다. F-LALA-VA-EXA ADC는 추정 최고 비-중증 독성 용량 (HNSTD)이 50 mg/kg 3회로 잘 허용되었다. 60 mg/kg의 투여는 2마리의 동물 중 1마리에서 급성 신부전으로 인해 허용되지 않았다 (폴레이트 수용체 알파가 신장에서 내인성으로 발현되기 때문에 아마도 표적-관련). 시노몰구스 HNSTD가 설치류 암 모델에서 효과적인 치료 용량을 훨씬 초과하기 때문에 (용량의 알로메트릭 척도화 후), F-LALA-VA-EXA의 전임상 치료 범위는 유리한 것으로 보인다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 화학식 (I)의 항체-약물 접합체로서:
    ,
    여기서:
    - Ab는 서열식별번호: 12에 특이적으로 결합하는 항-폴레이트 수용체 알파 (FRα) 항체이고,
    - L은 바람직하게는 티올 잔기를 통해 상기 항체에 결합된 절단가능한 링커 모이어티이고,
    - D는 L에 결합된 세포독성 약물 모이어티이고,
    - p는 1 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8이고, 보다 바람직하게는 p는 8인
    항체-약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, D가 바람직하게는 캄프토테신 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 토포이소머라제 I의 억제제이고, 보다 바람직하게는 D가 하기 화학식 (II)의 엑사테칸의 약물 모이어티인 항체-약물 접합체
    .
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L이 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커 모이어티이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티인 항체-약물 접합체.
  4. 제3항에 있어서, W가 하기 화학식 (III)

    및 그의 제약상 허용되는 염을 갖고, 여기서
    각각의 R2는 독립적으로 전자-끄는 기 및 C1-C4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    n은 0, 1 또는 2이고;
    T는 당 절단가능한 유닛 또는 폴리펩티드 절단가능한 유닛이고;
    Y는 T가 당 절단가능한 유닛인 경우에 O이거나, 또는 T가 폴리펩티드 절단가능한 유닛인 경우에 NR3이고;
    R3은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고,
    R" 및 R"'는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된 것인
    항체-약물 접합체.
  5. 제4항에 있어서, L이 화학식 (IV)의 링커 -A-W-에 상응하고

    여기서
    X1은 연결기 유닛이고;
    Z는 임의적인 스페이서이고;
    X2는 연결기 유닛이고;
    K는, 바람직하게는 폴리사르코신 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 임의적인 소수성 차폐 물질이고;
    R1은 H, C1-C24 알킬, C2-C6 알케닐; 임의로 치환된 폴리에테르, 6 내지 10개의 고리 원자를 갖는 아릴, C3-C8 시클로알킬, 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로시클로알킬, 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 헤테로아릴, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, -NR"-, -C(O)NR"-, -NR"-C(O)-, -NR"-C(O)-NR"'-, -NR"-C(O)-O-, -O-C(O)NR"- 및 트리아졸로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
    R4는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되고;
    R5는 H, C1-C6 알킬 및 C2-C6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 알킬 및 알케닐은 -O-, -S-, -C(O)-, 및 -NR"-로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 또는 화학적 기에 의해 임의로 개재되는 것인
    항체-약물 접합체.
  6. 제5항에 있어서, K가 바람직하게는 하기 화학식 (V)의 폴리사르코신이고
    ,
    여기서 k는 2 내지 50, 바람직하게는 4 내지 30의 정수이고,
    R6은 OH 또는 NH2에 상응하는 것인
    항체-약물 접합체.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, T가 글루쿠로니드 또는 갈락토시드인 당 절단가능한 유닛인 항체-약물 접합체.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, T가 바람직하게는 Val-Cit, Val-Ala 및 Phe-Lys로부터 선택된 디펩티드인 항체-약물 접합체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L이 화학식 (VI)의 링커에 상응하고:

    L이 상기 항체의 1개 이상의 티올 잔기에 공유 결합된 것인
    항체-약물 접합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 화학식 (VII)에 상응하며

    여기서 Ab는 항-FRα 항체, 예컨대 파를레투주맙, 또는 전형적으로 IgG1 Fc 불변 영역의 류신 234 및 류신 235에서 알라닌 치환을 포함하는 그의 침묵 IgG1 변이체이고, p는 4 내지 8인 항체-약물 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Ab가
    (i) 서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드; 또는
    (ii) 서열식별번호: 7의 VH를 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및 서열식별번호: 8의 VL을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
    를 포함하는 항-FRα 항체인 항체-약물 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Ab가
    서열식별번호: 1의 HCDR1, 서열식별번호: 2의 HCDR2, 서열식별번호: 3의 HCDR3을 포함하는 가변 중쇄 폴리펩티드 및
    서열식별번호: 4의 LCDR1, 서열식별번호: 5의 LCDR2 및 서열식별번호: 6의 LCDR3을 포함하는 가변 경쇄 폴리펩티드
    를 포함하는 항-폴레이트 수용체 알파 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고;
    (ii) L이 화학식 -A-W-의 절단가능한 링커이고, 여기서 A는 Ab에 연결되는 임의적인 스트레쳐 유닛이고, W는 D에 연결되는 절단가능한 모이어티이고;
    (iii) D가 토포이소머라제 I의 억제제, 예를 들어 엑사테칸이고;
    (iv) p가 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 보다 바람직하게는 약 8인
    항체-약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 바람직하게는 종양, 예를 들어 고형 종양, 보다 구체적으로 난소암, 유방암, 폐암 또는 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 난소암, 삼중 음성 유방암, 및 비소세포 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 데 사용하기 위한 항체-약물 접합체.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체를 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여 포함하고, 임의로 다른 활성 성분을 포함하는 제약 조성물.
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Patent event code: PA01051R01D

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