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KR20240161175A - 폴리펩타이드 페이로드의 기능/풍부도의 조절 및 전달을 위한 소형 약물 반응성 도메인 - Google Patents

폴리펩타이드 페이로드의 기능/풍부도의 조절 및 전달을 위한 소형 약물 반응성 도메인 Download PDF

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KR20240161175A
KR20240161175A KR1020247034494A KR20247034494A KR20240161175A KR 20240161175 A KR20240161175 A KR 20240161175A KR 1020247034494 A KR1020247034494 A KR 1020247034494A KR 20247034494 A KR20247034494 A KR 20247034494A KR 20240161175 A KR20240161175 A KR 20240161175A
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KR
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fkbp13
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nucleic acid
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KR1020247034494A
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드루브 캄 세티
모일렌 얀 테르
더쉬에 선
케리-린 셰핸
안드레스 알바라도
Original Assignee
옵시디안 테라퓨틱스, 인크.
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Publication date
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Abstract

본원에서는 페이로드 및 약물 반응성 도메인[drug responsive domain, DRD]을 포함하는 조절 가능한 조작된 폴리펩타이드가 제공되며, 여기서 DRD는 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결되고 DRD는 리간드에 반응한다. DRD는 임의로 FKBR13이며, 야생형 또는 이의 변이체이다.

Description

폴리펩타이드 페이로드의 기능/풍부도의 조절 및 전달을 위한 소형 약물 반응성 도메인
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2022년 3월 18일에 출원된 미국 가출원 제63/269,582호에 대한 우선권을 주장한다.
서열 목록
WIPO 표준 ST.26의 규칙을 따르는 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다. 상기 서열 목록은 ASCII 포맷으로 XML로 부호화된 전자 문서로서 PatentCenter를 통해 제출되었다. 전자 문서는 '079445-000741US-1361439_ST26.xml'이라는 이름으로 2023년 3월 14일에 생성되었으며 크기는 114,195 바이트다.
대상에게 유전자 변형 세포를 제공하거나 CRISPR/Cas9 방법과 같은 유전자 편집 방법을 사용하여 생물학적 제제를 투여하는 것은 큰 가능성을 보여주지만 상당한 도전 과제를 야기한다. 치료 이익을 최적화하고 표적이탈효과[off-target effect]를 감소시키기 위해 유전자 변형 세포 또는 유전자 편집제를 조절하는 수단이 필요하다. 유전자 변형 세포에서 페이로드의 조절은 리간드에 결합하는 약물 반응성 도메인[drug responsive domain, DRD]에 페이로드를 커플링함으로써 달성될 수 있고, 그에 따라 리간드의 투여는 용량 의존적 방식으로 페이로드의 활성을 조절한다. 그러나, DRD에 작동가능한 상태로 연결된 조절 가능한 페이로드를 암호화하는 핵산 작제물 내의 페이로드 및 기타 구성요소의 크기는 선택된 바이러스 또는 비바이러스 벡터 내의 제한된 용량 때문에 공지된 DRD의 사용을 배제할 수 있다. 따라서, 유전자 편집제와 같은 더 큰 페이로드의 조절, 또는 아데노-연관 바이러스[adeno-associated virus, AAV] 벡터와 같은 더 작은 벡터를 사용하는 형질도입은 조절하는 데 있어 상당한 도전 과제를 야기한다.
본 개시는 DRD를 사용하여 조절 가능한 페이로드를 전달할 수 있는 조성물 및 시스템, 뿐만 아니라 조성물 및 시스템을 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 예로서, 유전자 편집 기능은, 다른 무엇보다도, 페이로드의 풍부도 및/또는 활성을 변형 및/또는 조정함으로써 조절될 수 있다. 유전자 편집 페이로드의 풍부도 및/또는 활성은 페이로드를 리간드에 반응하는 약물 반응성 도메인[drug-responsive domain, DRD]에 작동 가능한 상태로 연결하고 리간드를 유전자 편집 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결된 DRD에 제공함으로써 조절될 수 있다. 일부 경우에, DRD는 DRD를 암호화하는 핵산이 유전자 편집 시스템의 구성요소를 비롯한 추가적인 요소를 암호화하는 다른 핵산과 함께 발현 시스템, 예컨대 바이러스 벡터 내에 수용될 수 있도록 맞춤화되어야 한다. 따라서, 본원에는 소형 DRD 및 이를 암호화하는 핵산이 제공된다.
소형 DRD는 임의로 FK506(타크롤리무스) 및/또는 라파마이신(시롤리무스)과 같은 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체이다. 리간드가 존재하면, 페이로드 풍부도 또는 활성이 증가한다. 따라서, 페이로드가 유전자 편집 구성요소를 포함하는 경우, 리간드의 존재하의 FKBP13은 유전자 편집 구성요소의 풍부도를 증가시키고/시키거나, 유전자 편집 활성을 증가시킨다. 리간드의 부재하에, 페이로드는 하향 조절되거나 중지되고[turn off], 유전자 편집이 감소되거나 제거된다.
페이로드 및 리간드에 결합하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 발현 시, FKBP13 또는 이의 변이체는 페이로드에 작동가능한 상태로 연결된다. 임의로, FKBP13 변이체는 리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 비리간드 결합 영역에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, FKBP13은 FKBP13의 단편(예를 들어, 100개 미만의 아미노산의 C-말단 단편)일 수 있다. 단편은 임의로 리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하고, 임의로 리간드 결합 부위 외부에 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함한다. 임의로, 하나 이상의 돌연변이는 FK5065 및 라파마이신의 결합에 차등적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 암호화된 FKBP13 변이체는 라파마이신에 대한 반응보다 FK506에 대한 반응으로 페이로드의 생물학적 활성을 조절하도록 설계될 수 있다. 임의적으로, 라파마이신에 대한 반응과 FK506에 대한 반응 사이의 이러한 차등적 효과는 라파마이신에 대한 FKBP13 변이체의 결합 친화도를 감소시키는 돌연변이에 의해 달성된다.
FKBP13 또는 이의 변이체 및 페이로드를 암호화하는 핵산은 추가적인 구성요소, 예컨대 하나 이상의 프로모터 또는 링커를 추가로 포함하거나 암호화할 수 있다.
암호화된 페이로드는 원하는 생물학적 활성을 갖는 하나 이상의 생물학적 분자일 수 있다. 원하는 생물학적 활성은 예를 들어, 유전자 편집일 수 있다. 따라서, 페이로드는 임의로 RNA-안내된 핵산내부분해효소(예를 들어, Cas9 핵산내부분해효소)를 포함한다. 페이로드는 임의로 적어도 하나의 안내 RNA를 추가로 포함한다. 예로서, AAV 벡터 내에 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9 핵산내부분해효소 페이로드를 암호화하는 서열을 포함하는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 패키징되도록 구성된, 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열은 적어도 3000개의 염기 쌍을 포함한다.
또한, 본원에서는 유전자 변형 FKBP13, 예를 들어, 리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이 및/또는 비리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 FKBP13 단편(예를 들어, C-말단 단편)이 제공된다. 유전자 변형 FKBP13 단편은 임의로 돌연변이가 없는 대조군 FKBP13 단편보다 라파마이신에 대해 더 낮은 결합 친화도 및/또는 FK506에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다.
DRD 및 페이로드를 포함하는 재조합 폴리펩타이드가 본원에 제공되며, 여기서 페이로드는 FKBP13 또는 이의 변이체에 작동 가능한 상태로 연결되고, 생물학적 시스템(예를 들어, 포유류 혈액)에서 페이로드의 활성은 FKBP13과 접촉하는 리간드의 농도에 의해 조절 가능하다. 임의로, 생물학적 시스템에서 FKBP13 또는 이의 변이체에 대한 FK506의 EC50은 생물학적 시스템에서 FK506의 Cmax보다 약 2배 내지 약 20배 더 낮다.
또한, 발현 가능한 핵산을 포함하는 벡터 및 본원에 기재된 바와 같은 벡터 또는 발현 가능한 핵산을 포함하는 세포가 제공된다. 예로서, 벡터 또는 세포는 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 세포의 게놈 내의 표적 DNA에 혼성화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA 서열을 포함할 수 있다. 임의로, 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터)이다.
또한, 벡터를 표적 세포에 도입하여 재조합 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 벡터를 포함하는 표적 세포를 리간드와 접촉시킴으로써 세포 내의 페이로드를 조절하는 방법이 또한 제공된다. 페이로드가 유전자 편집을 위한 구성요소를 포함하는 경우, 본 방법 또는 조절은 벡터를 포함하는 표적 세포를 리간드와 접촉시켜 세포에서 발현된 DNA를 변형시킴으로써 유전자 편집의 조절을 제공한다.
예를 들어, 세포에서 표적 DNA를 변형시키는 방법은 (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및 (2) 세포의 게놈 내의 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA를 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 본 방법은 벡터-함유 세포를 유효량의 리간드와 접촉시켜 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하거나 증가시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소는 세포 내의 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단한다. 또한, 대상의 하나 이상의 세포 내로 벡터를 도입하고 벡터-함유 세포 하나 이상을 유효량의 리간드와 접촉시켜 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하거나 증가시킴으로써 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소는 대상의 하나 이상의 세포에서 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단한다. 또한, 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 대상에게 투여하고, 대상에게 유효량의 리간드를 투여하여 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도함으로써 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소는 하나 이상의 세포의 게놈을 특이적으로 변형시킨다.
대상에게 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 작제물, 벡터, 또는 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에 대한 페이로드의 투여의 용량 또는 지속기간을 제어하는 방법이 본원에 개시된다. 본 방법은 임의로 추가로 대상에게 선택된 양의 리간드을 투여하여 대상에게 페이로드의 선택된 활성을 전달하여 이에 의해 하나 이상의 핵산 작제물, 벡터 또는 세포를 통해 투여된 페이로드의 활성 수준을 제어하는 것을 포함한다.
유전자 편집 공정의 다운스트림 표적 단백질 또는 펩타이드의 발현을 조절하는 방법이 본원에 또한 개시된다. 이러한 방법은 유전자 편집기를 제어하는 데 관여하는 Cas9 단백질 또는 전사 인자 단백질과 같은 페이로드를 포함하는 조작되고 조절 가능한 올리고머 또는 폴리펩타이드를 발현하도록 세포를 조작하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 페이로드는 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된다. 이러한 방법에서, 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 벡터는 세포에 (생체내 또는 시험관내) 투여된다. 임의로, 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포는 세포에 의한 표적 단백질 또는 펩타이드의 발현을 조절하기 위해 대상에게 투여된다.
확인된 구현예는 단지 예시적이고 그러므로 비제한적이다. 본 발명의 하나 이상의 비제한 구현예의 상세는 아래 첨부 도면 및 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 구현예는 본 개시의 고려 후 당업자에게 명백할 수 있다.
도 1a는 (i) 잠재적인 FKBP DRD 서열을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 에쿠오레아 코에룰레센스[Aequorea coerulescens GFP, AcGFP]를 암호화하는 핵산 서열; (iii) 예시적인 자가 절단 펩타이드(돼지 테스코바이러스-1 2A[porcine teschovirus-1 2A, P2A])를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) mCherry를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 예시적인 핵산 작제물의 일반적인 조직을 도시하는 개략도이다.
도 1b는 일시적으로 형질주입된 HEK293 세포에서의 타크롤리무스 용량 반응 연구에 대한 형광 활성화 세포 분류[fluorescence activated cell sorting, FACS] 데이터를 제공한다. 몇몇 FKBP13 돌연변이(D90G, M54A 및 M96V)는 AcGFP를 불안정화하고 AcGFP 형광을 감소시키는 데 있어 효과적이었다.
도 2는 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입된 FKBP-039, FKBP-040, FKBP-041, FKBP-042, FKBP-043, FKBP-044, 및 FKBP-045로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 3은 스틱으로 표현된 라파마이신 및 타크롤리무스의 중첩 구조이다.
도 4는 FKBP-044, FKBP-052, FKBP-053, FKBP-054, FKBP-055, FKBP-056, FKBP-057, FKBP-058, FKBP-059, FKBP-060, FKBP-061, FKBP-062, FKBP-063, 또는 FKBP-064로 지정된 FKBP13 작제물로 안정적으로 형질도입된 Jurkat 세포에 대한 타크롤리무스 용량 반응의 형광 활성화 세포 분류[FACS] 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 5는 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-044, FKBP-066, FKBP-067, FKBP-068, FKBP-069, FKBP-070, FKBP-071, 및 FKBP-072로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 6은 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-044, FKBP-073, FKBP-074, FKBP-075, FKBP-076, 및 FKBP-077로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 7은 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-044, FKBP-083, FKBP-084, FKBP-085, 및 FKBP-086으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 8은 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-044, FKBP-087, FKBP-088, FKBP-089, FKBP-090, 및 FKBP-091로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 9는 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-044, FKBP-092, FKBP-093, FKBP-094, FKBP-095, FKBP-096 및 FKBP-097로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 10은 FKBP-044, FKBP-059, FKBP-068, FKBP-077, FKBP-084, FKBP-085, FKBP-091, FKBP-094, FKBP-095, 및 FKBP-097로 지정된 FKBP13 작제물로 안정적으로 형질도입된 Jurkat 세포에 대한 타크롤리무스 용량 반응의 FACS 데이터(GFP 평균 형광 세기[mean fluorescent intensity, MFI])를 도시하는 그래프이다.
도 11은 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-091, FKBP-098, FKBP-099, FKBP-100, 및 FKBP-101로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 12는 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-091, FKBP-102, FKBP-103, FKBP-104, FKBP-105 및 FKBP-106으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 13은 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-091, FKBP-107, FKBP-108, FKBP-109, FKBP-110, 및 FKBP-111로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 14는 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입된 FKBP-091, FKBP-112, FKBP-113, FKBP-114, FKBP-115 및 FKBP-116으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프, 및 각각의 작제물에 대한 EC50 값이다.
도 15a는 GFP에 대한 FACS 및 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, 안정적으로 형질도입된 Jurkat 세포에서 FKBP-091, FKBP-117, FKBP-118, FKBP-119, FKBP-120, FKBP-121, FKBP-122, 및 FKBP-123으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선 FACS 데이터를 도시하는 그래프이다.
도 15b는 FKBP-091, FKBP-117, FKBP-118, FKBP-119, FKBP-120, FKBP-121, FKBP-122, 및 FKBP-123으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 15c는 GFP에 대한 FACS 및 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-091, FKBP-124, FKBP-125, FKBP-126, FKBP-127, FKBP-128, FKBP-129, 및 FKBP-130으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 15d는 FKBP-091, FKBP-124, FKBP-125, FKBP-126, FKBP-127, FKBP-128, FKBP-129, 및 FKBP-130으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 15e는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-091, FKBP-131, FKBP-132, FKBP-133, FKBP-134, FKBP-135, FKBP-136, 및 FKBP-137로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 15f는 FKBP-091, FKBP-131, FKBP-132, FKBP-133, FKBP-134, FKBP-135, FKBP-136, 및 FKBP-137로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 15g는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-091, FKBP-138, FKBP-139, FKBP-140, FKBP-141, FKBP-142, FKBP-143, 및 FKBP-144로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 15h는 FKBP-091, FKBP-138, FKBP-139, FKBP-140, FKBP-141, FKBP-142, FKBP-143, 및 FKBP-144로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 15i는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-091, FKBP-145, FKBP-146, FKBP-147, FKBP-148, FKBP-149, 및 FKBP-150으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 15j는 FKBP-091, FKBP-145, FKBP-146, FKBP-147, FKBP-148, FKBP-149, 및 FKBP-150으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선의 또 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 16a는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-151, FKBP-152, 및 FKBP-153으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 16b는 FKBP-151, FKBP-152, 및 FKBP-153으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 17a는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-153, FKBP-155, 및 FKBP-157로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 17b는 FKBP-153, FKBP-155, 및 FKBP-157로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선의 또 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 18a는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-154, FKBP-155, 및 FKBP-156으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 18b는 FKBP-154, FKBP-155, 및 FKBP-156으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 19a는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-157, FKBP-158, 및 FKBP-159로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 19b는 FKBP-157, FKBP-158, 및 FKBP-159로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 20a는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-044, 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 20b는 FKBP-044 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스(T) 대 라파마이신(S) 반응 용량 곡선의 다른 표현이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 21은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-044, FKBP-059, FKBP-091 및 AcGFP-001로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 22는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-191, FKBP-199, FKBP-197, FKBP-200, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 23은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-201, FKBP-243, FKBP-244, FKBP-251, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 24는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-195, FKBP-198, FKBP-209, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 25는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-214, FKBP-215, FKBP-220, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 26은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-223, FKBP-226, FKBP-240, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 27은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-192, FKBP-203, FKBP-228, FKBP-229, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 28은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-230, FKBP-233, FKBP-255, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 29는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-256, FKBP-257, FKBP-258, FKBP-259, 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 30은 FKBP-230, FKBP-233, FKBP-255, FKBP-91 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 31은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-260, FKBP-262, FKBP-263, FKBP-265, FKBP-268 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 32는 FKBP-260, FKBP-262, FKBP-263, FKBP-265, FKBP-268 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 33은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-270, FKBP-271, FKBP-273, FKBP-274, FKBP-275 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 34는 FKBP-270, FKBP-271, FKBP-273, FKBP-274, FKBP-275 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이며, 데이터는 mCherry MFI에 대한 GFP MFI의 비로서 제시된다.
도 35는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-276, FKBP-277, FKBP-278, FKBP-279, FKBP-117, FKBP-195 및 FKBP-291로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 36은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-280, FKBP-281, FKBP-282, FKBP-283, FKBP-117, FKBP-195 및 FKBP-291로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 37은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-284, FKBP-285, FKBP-286, FKBP-287, FKBP-117, FKBP-195 및 FKBP-251로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 38은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-288, FKBP-289, FKBP-290, FKBP-291, FKBP-292, FKBP-195, FKBP-251 및 FKBP-117로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 39는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-272 및 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 약물 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 40은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-258, FKBP-251, 및 FKBP-259로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 약물 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 41은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-256, FKBP-257, 및 FKBP-228로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 약물 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 42는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-228로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 43은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-256 및 FKBP-257로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 44는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-167 및 FKBP-168로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 45는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-265 및 FKBP-264로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 46은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-197 및 FKBP-251로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 47은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-258 및 FKBP-259로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 48은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-215로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 49는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, FKBP-262 및 FKBP-263으로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다. BR1 및 BR2는 반복 실험 1 및 반복 실험 2를 지칭한다.
도 51은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, 상이한 혈청 농도하에서 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 52는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, 상이한 혈청 농도하에서 FKBP-251로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 53은 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, 상이한 혈청 농도하에서 FKBP-195로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 54는 GFP에 대한 FACS 기반 MFI를 사용하여 측정된 바와 같은, 상이한 혈청 농도하에서 FKBP-251로 지정된 FKBP13 작제물에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선을 도시하는 그래프이다.
본 개시는 페이로드의 조절성 제어를 위한 조성물 및 시스템을 제공한다. 페이로드의 풍부도 및/또는 활성은 페이로드를 리간드에 반응하는 약물 반응성 도메인[drug-responsive domain, DRD]에 작동 가능한 상태로 연결하고 페이로드에 작동가능한 상태로 연결된 DRD에 리간드를 제공하여 페이로드의 풍부도 및/또는 활성이 용량량 의존적 방식으로 리간드의 존재하에 증가되도록 조절될 수 있다. DRD는 임의로 FK506(타크롤리무스) 및/또는 라파마이신(시롤리무스)과 같은 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체이다. 예로서, 페이로드가 유전자 편집 구성요소를 포함하는 경우, 리간드의 존재하의 FKBP13은 유전자 편집 구성요소의 풍부도를 증가시키고/시키거나, 유전자 편집 활성을 증가시킨다. 리간드의 부재하에, 페이로드 풍부도가 하향 조절되고 결과적으로 유전자 편집이 감소되거나 제거된다. 따라서, 페이로드, DRD, 및 임의로 하나 이상의 추가적인 구성요소(예를 들어, 링커, 힌지 및 막관통 도메인, 꼬리, 태그)을 포함하는 조절 가능한 폴리펩타이드; 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터; 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포; 및 조절 가능한 폴리펩타이드의 제조 및 사용 방법(예를 들어, 유전자 편집의 방법 및 조절된 페이로드를 이용하여 대상을 치료하는 방법)이 본원에 제공된다.
조성물
조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드
적어도 하나의 페이로드 및 적어도 하나의 FKBP13 약물 반응성 도메인[DRD]을 갖는 조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드가 본원에 제공되며, 여기서 FKBP13 DRD는 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결되고, FKBP13 DRD는 리간드에 반응한다. 페이로드의 활성 수준은 리간드의 부재하의 기저 활성 수준에서 리간드의 포화량의 존재하의 최대 활성 수준까지의 범위이다. 리간드의 포화량은 페이로드의 최대 풍부도 및/또는 활성을 초래하는 양 이상의 리간드의 임의의 양을 지칭한다. 예로써, 적어도 하나의 페이로드의 활성 수준은 리간드의 부재하의 기저 활성 수준에서 리간드의 포화량의 존재하의 최대 활성 수준까지의 범위이다.
이론에 의해 제한됨의 의미 없이, DRD는 이들의 상응하는 안정화 리간드(쌍을 이룬 리간드 또는 리간드로서 또한 지칭된)의 부재하에 분해되지만, 이들의 안정성이 안정화 리간드에 결합함으로써 구제되는 불안정한 폴리펩타이드인 것으로 생각된다. DRD에 대한 리간드의 결합이 가역적이기 때문에, 리간드의 나중 제거는 DRD 펼침[unfolding]을 초래할 수 있어, 불안정해지고, 궁극적으로 유비퀴틴-프로테아솜 시스템[ubiquitin-proteasome system, UPS]에 의한 분해에 대해 태그가 부착된다. 따라서, DRD, 예를 들어, FKBP13 DRD가 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결될 때, 전체 작제물(즉, DRD + 페이로드)이 UPS에 의해 불안정해지고 분해되는 것으로 여겨진다. 하지만, 쌍을 이룬 리간드의 존재하에, 작제물은 안정화되고, 페이로드는 계속 사용할 수 있다. 추가로, DRD 안정성의 조건적 성질이 안정한 폴리펩타이드에서 불안정한 UPS 기질로의 신속하고 비교란적인 전환을 가능하게 하고, 이는 페이로드의 활성 수준의 조절 또는 조정을 용이하게 할 수 있는 것으로 여겨진다.
페이로드의 풍부도 및 가용성이 페이로드의 활성에 관한 것이기 때문에, 본 개시의 목적을 위해, 용어, 풍부도, 가용성, 활성, 및 어구, 풍부도 및/또는 활성(및 유사하게 풍부도의 수준, 가용성의 수준, 활성의 수준, 및 풍부도 및/또는 활성의 수준)은 본 개시 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되고 달리 명시적으로 언급되지 않거나 문맥상 무의미하지 않는 한, 활성으로 일반적으로 지칭된다. 추가로, 풍부도 또는 가용성의 측정은 활성 수준에 대하여 대용물로서 사용되고 활성 수준을 반영하기 위해 본원에 사용될 수 있다. 결과적으로, 리간드의 부재하와 비교된 경우에 유효량의 리간드의 존재하에 페이로드의 풍부도 또는 가용성에서의 변화는 활성 수준에서의 변화를 측정하기 위하여 대용물 역할을 임의로 한다.
본원에 기재된 조절 가능한 폴리펩타이드의 예시적인 구성요소(구성 블록)는 본 개시 전반에 걸쳐 참조되며 아래에 제공된다. 본원에 기재된 폴리펩타이드 중 임의의 것은 적어도 페이로드, 예를 들어, 유전자 편집 페이로드, 및 DRD를 포함할 수 있다. 임의로, 폴리펩타이드는 하나 이상의 추가적인 구성요소, 예컨대, 링커, 힌지(예를 들어, 분리 가능한[sheddable] 및 분리 불가능한 힌지), 꼬리(예를 들어, 세포질성 꼬리), 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 제조 방법에 관한 섹션에서 후술한 바와 같이, 당업자는 원하는 결과(예를 들어, 발현되는 세포에 대한 페이로드 또는 DRD의 위치, 및 페이로드의 원하는 활성)를 달성하기 위해 아래 제공된 지침을 사용하여 다양한 구성요소에서 선택할 수 있다.
DRD
DRD는, DRD가 페이로드에 작동 가능하게 연결될 때, 페이로드의 특징(예를 들어, 활성)에 대한 리간드 의존적 가역적 조절을 부여하도록 리간드와 상호 작용한다. 약물 반응성 도메인으로서 지칭되어도, DRD가 반응하는 리간드가 약물일 필요는 없다. 불안정화 도메인 또는 리간드 결합 도메인으로서 지칭될 수 있는 적합한 FKBP13 DRD(및 이들의 쌍을 이룬 리간드)가 본 명세서 전반에 걸쳐 제공된다.
예로서, FKBP13 DRD는 리간드에 반응하는 야생형 FKBP13 DRD 또는 변이체(예를 들어, 유전자 변형된) FKBP13 DRD를 포함하는 아미노산 서열일 수 있다. 임의로, FKBP13 DRD는 전장 야생형 FKBP13 폴리펩타이드(서열 번호 1) 또는 이의 단편(즉, 리간드에 결합하는 DRD 기능적 단편)이다. 예로서, FKBP13 DRD는 FKBP13의 단편, 예를 들어, 서열 번호 2와 같은 서열 번호 1의 C-말단 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, C-말단 단편은 100개 미만의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단편은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 2와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
유전자 변형 FKBP13은 야생형 FKBP13 DRD(서열 번호 1)에 비해 하나 이상의 돌연변이를 임의로 포함한다. 임의로, 유전자 변형 FKBP13은 서열 번호 3-109로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3-109로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 100개 미만의 아미노산의 서열 번호 1의 C-말단 단편이다. 하나 이상의 유전자 변형, 예를 들어, FKBP13의 아미노산 서열에서의 돌연변이(절두, 치환, 및 결실 포함)가 실시예에 개략된 바와 같이 이점이 될 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 동일성 또는 실질적 동일성은 참조 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열을 지칭한다. 또는, 동일성 퍼센트는 80% 내지 100%의 임의의 정수일 수 있다. 예시적인 구현예는 후술한 바와 같은 표준 파라미터를 사용하여 당업자에게 알려진 프로그램, 예를 들어, BLAST를 사용하여 참조 서열과 비교했을 때 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열을 비교하는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하다면 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수도 있고, 대안적인 파라미터를 지정할 수도 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기반하여, 참조 서열에 대한 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본원에 사용된 바와 같이, 비교 윈도우는 20 내지 600개, 약 20 내지 50개, 약 20 내지 100개, 약 50 내지 약 200개 또는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군에서 선택된 연속적인 위치의 개수 중 어느 하나의 세그먼트에 대한 참조를 포함하며, 여기서 두 서열이 최적으로 정렬된 후 서열은 연속적인 위치의 동일한 개수의 참조 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 하기에 의해 실시될 수 있다. 문헌[Smith and Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988)]의 유사성 탐색 방법, 이러한 알고리즘(예를 들어, BLAST)의 컴퓨터화된 구현, 또는 수동 정렬 및 시각적 검사.
서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘은 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터[National Center for Biotechnology Information, NCBI] 웹사이트를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 알고리즘이 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 단어로 정렬된 경우 알고리즘은 일부 양의 값의 임계치 점수 T와 매칭하거나 이를 충족시키는, 쿼리 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어링 서열 쌍[high scoring sequence pair, HSP]을 확인하는 것을 처음에 포함한다. T는 이웃 단어 점수 임계치로서 지칭된다(위의 문헌 Altschul et al,). 이들 초기 이웃 단어 히트[word hit]는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 발견하기 위한 검색을 개시하기 위한 시드(seed)로서 작용한다. 이후, 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오타이드 서열에 대해 파라미터 M(한 쌍의 매칭 잔기에 대한 보상 점수, 항상 > 0) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수, 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 각각의 방향으로의 단어 히트의 연장은, 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성 값에서 수량 X만큼 떨어질 때, 누적 점수가 하나 이상의 음의 스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하가 될 때, 또는 서열 중 어느 하나의 말단에 도달할 때, 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 28의 단어 크기[word size, W], 10의 기대치[expectation, E], M = 1, N = -2 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성에 대한 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)]을 참조한다). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 척도는, 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이 매칭이 우연히 발생할 확률의 표시를 제공하는, 최소 합계 확률[smallest sum probability, P(N)]이다. 예를 들어, 핵산은, 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 합계 확률이 약 0.01 미만, 더 바람직하게는 약 10-5 미만, 가장 바람직하게는 약 10-20 미만인 경우 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 유전자 변형 FKBP13은 FK506에 대한 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 FKBP13 단편은 대조군 FKBP13 단편, 예를 들어, 결합 부위의 3차원 구조가 변경되도록 하는 결합 부위 내 또는 결합 부위 외부에 특정 돌연변이가 결여되어 있는 대조군 FKBP13 단편보다 라파마이신에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 FKBP13 단편은 리간드 결합 부위에 돌연변이가 없는 대조군 FKBP13 단편보다 FK506에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 일부 구현예에서, 유전자 변형 FKBP13 단편은 대조군 FKBP13 단편보다 FK506에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖고, 임의로, 대조군 FKBP13 단편보다 라파마이신에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는다.
수많은 FKBP13 DRD가 본원에 기재되지만, 당업자는 본 개시에 따른 조절 가능한 조성물에 사용하기에 적합한 추가적인 FKBP13 DRD를 식별할 수 있다. 예로써, FKBP13 DRD를 라이브러리 스크리닝 및 구조 안내된 조작을 사용하여 식별하여 리간드의 부재하의 충분한 불안정성 및 리간드의 존재하의 충분한 안정성을 갖는 최적의 FKBP13 DRD 변이체를 선택할 수 있다. 세포(예를 들어, Jurkat 세포)를 돌연변이체 FKBP13 DRD 후보로 형질도입함으로써 무작위 돌연변이유발 스크리닝을 사용하여 변이체 라이브러리를 생성할 수 있다. 풍부한 라이브러리를 생산하기 위해, 리간드의 농도의 범위에 걸쳐 폴리펩타이드 풍부도를 시험함으로써 원하는 특징(낮은 기저 활성/발현 및 높은 동적 범위)을 갖는 세포를 선택한다. 이어서, 단일 세포 클론을 생산하고, 특징분석하여, 후보 FKBP13 DRD를 식별한다. 본원에 기재된 FKBP13 DRD는 (안정화 리간드 또는 간단히 리간드로서 또한 지칭된) 쌍을 이룬 리간드에 반응한다.
임의로, 생물학적 시스템에서 FKBP13 또는 이의 변이체에 대한 FK506의 EC50은 생물학적 시스템에서 FK506의 Cmax보다 약 2배 내지 약 20배 더 낮다. 생물학적 시스템은 조직, 세포 또는 혈액(예를 들어, 포유류 혈액)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페이로드
예로써, 페이로드는 원하는 생물학적 기능을 갖는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들일 수 있다. 이러한 페이로드는 변형된 폴리펩타이드, 예컨대, 글리코실화된 폴리펩타이드 또는 지질펩타이드, 또는 이의 임의의 활성 부분일 수 있다. 예를 들어, 페이로드는 RNA-안내된 핵산내부분해효소, 예를 들어, Cas9 폴리펩타이드 또는 이의 활성 부분일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 페이로드는 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소일 수 있다. 이러한 구현예에서, 조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드는 유전자 편집 시스템의 활성 및 결과적으로 다운스트림 표적 단백질의 발현을 조절한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적 단백질은 예를 들어, 대상에서 또는 세포에서 해로운 효과를 초래하는 유전자 돌연변이를 갖는 단백질을 포함하여, 유전자 편집을 위하여 선택된 단백질을 지칭한다. 유전자 편집 시스템의 하나 이상의 구성요소를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩타이드 중 임의의 것은 세포의 게놈을 시험관내에서 또는 시험관내에서 변형시켜 세포 내 표적 단백질의 발현 및/또는 활성을 변경시키는 데 사용될 수 있다.
페이로드가 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 포함하는 경우, 여러 핵산내부분해효소 중 어느 하나가 선택될 수 있다. 예를 들어, 선택된 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 Cas 단백질(CRISPR-연관 단백질), 예컨대, Cas9 및 Cas12일 수 있다. CRISPR/Cas 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 광범위한 부류의 박테리아 시스템을 지칭한다. CRISPR/Cas 시스템은 광범위한 진균 및 고세균 유기체에서 발견된다. CRISPR/Cas 시스템은 유형 I, II 및 III 하위 유형을 포함한다. 야생형 유형 II CRISPR/Cas 시스템은 안내 RNA 및 활성화 RNA와 복합체화된 RNA-매개 핵산분해효소, 예를 들어, Cas9를 사용하여 외래 핵산을 인식하고 이를 절단한다. 안내 RNA 및 활성화 RNA 둘 모두의 활성을 갖는 안내 RNA가 또한 당업계에 알려져 있다. 일부 경우에, 이러한 이중 활성 안내 RNA는 단일 안내 RNA[single guide RNA, sgRNA]로서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 Cas9는 RNA-매개 핵산내부분해효소(예를 들어, 박테리아 또는 고세균 기원의, 또는 이로부터 유래된/변형된 것)를 지칭한다. 페이로드 내 예시적인 RNA-매개 핵산분해효소는 Cas9 단백질 및 이의 상동체를 포함한다. 다른 RNA-매개 핵산분해효소는 Cpf1(Cas12a)(예를 들어, 문헌[Zetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015] 참조) 및 이의 상동체를 포함한다. 본원에 기재된 구현예 중 임의의 것에서, Cas9 핵산분해효소는 Cpf1 핵산분해효소 또는 임의의 기타 안내된 핵산분해효소로 대체될 수 있는 것으로 이해된다.
Cas9 상동체는 다음 분류학적 군의 박테리아를 포함하나 이에 제한되지 않는 매우 다양한 진균에서 발견된다. 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테로이데테스-클로로비(Bacteroidetes­Chlorobi), 클라미디아에-베르루코미크로비아(Chlamydiae-Verrucomicrobia), 클로르플렉시(Chlroflexi), 사이아노박테리아(Cyanobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes) 및 테르모토가에(Thermotogae). 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 단백질이다. 추가적인 Cas9 단백질 및 이의 상동체는 예를 들어, 문헌[Chylinksi et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5): 726-737; Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6): 467-477; Hou et al., Proc Natl Acad Sci USA 2013 Sep 24;110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9;497(7448):254-7; 및 Jinek et al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21]에 기재되어 있다. 본원에 제공된 Cas9 핵산분해효소 중 임의의 것의 변이체는 숙주 세포에서 효율적인 활성 또는 향상된 안정성을 위해 최적화될 수 있다. 따라서, 조작된 Cas9 핵산분해효소가 또한 고려된다. 예를 들어, 문헌[Slaymaker et al., Science 351 (6268): 84-88 (2016)]을 참조한다.
일부 경우에, Cas9 단백질은 틈내기효소이고, 그에 따라 안내 RNA와의 복합체의 일부로서 표적 핵산에 결합될 때, 단일 가닥 파단 또는 틈새가 표적 핵산에 도입된다. 구조적으로 상이한 안내 RNA에 각각 결합된 한 쌍의 Cas9 틈내기효소는 표적 게놈 영역의 두 개의 근위 부위로 표적화될 수 있고, 따라서 한 쌍의 근위 단일 가닥 파단을 표적 게놈 영역에 도입할 수 있다. 예시적인 Cas9 틈내기효소는 D10A 또는 H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 핵산분해효소를 포함한다(예를 들어, 문헌[Ran et al., Cell 154(6): 1380-1389 (2013)] 참조).
RNA-안내된 핵산내부분해효소, 예를 들어, Cas9 핵산내부분해효소는 또한 비활성 Cas9, 예를 들어, dCas9일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, dCas9 폴리펩타이드는 Cas9 핵산분해효소 활성을 비활성화하도록 변형된 불활성화된 또는 핵산분해효소 사멸된 Cas9이다. 변형은 핵산분해효소 활성 또는 핵산분해효소 도메인을 비활성화하기 위해 하나 이상의 아미노산을 변경하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 변형은 Cas9의 핵산분해효소 도메인의 전부 또는 일부를 제거하고, 그에 따라 핵산분해효소 활성을 나타내는 서열은 Cas9에서 부재하게 된 것을 포함한다. 따라서, dCas9는 핵산분해효소 활성을 비활성화하기 위해 변형된 폴리펩타이드 서열, 또는 핵산분해효소 활성을 비활성화하기 위한 폴리펩타이드 서열 또는 서열들의 제거를 포함할 수 있다. dCas9는 핵산분해효소 활성이 비활성화되었음에도 불구하고 DNA에 결합하는 능력을 유지한다. 따라서, dCas9는 DNA 결합에 필요한 폴리펩타이드 서열 또는 서열들을 포함하지만, 변형된 핵산분해효소 서열을 포함하거나 핵산분해효소 활성을 담당하는 핵산분해효소 서열이 결여되어 있다. 다른 부위 지정 핵산분해효소, 예를 들어, Cpf1에서 핵산분해효소 활성을 비활성화하기 위해 유사한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
임의로, RNA-안내된 핵산내부분해효소, 예를 들어, 본원에 기재된 FKBP13 DRD에 연결된 Cas9 핵산내부분해효소를 포함하는 폴리펩타이드는 시험관내에서 하나 이상의 안내 RNA와 복합체화되고, 생성된 복합체는 세포에 도입된다. 복합체는 임의로 세포의 게놈 서열 내 특이적 부위에서의 삽입을 위한 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, DNA 주형을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 핵산, 폴리펩타이드 또는 복합체를 도입하는 것의 맥락에서 어구 도입하는 것은 핵산 서열, 폴리펩타이드 또는 복합체의 세포 외부로부터 세포 내부로의 전좌를 지칭한다. 일부 경우에, 도입하는 것은 핵산, 폴리펩타이드 또는 복합체의 세포 외부로부터 세포의 핵 내부로의 전좌를 지칭한다. 전기천공, 나노와이어 또는 나노튜브와의 접촉, 수용체 매개 내재화, 세포 투과성 펩타이드를 통한 전좌, 및 리포솜 매개 전좌 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 이러한 전좌의 다양한 방법이 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포의 게놈을 변형시키는 것의 맥락에서 어구 변형시키는 것은 표적 게놈 영역에서 게놈 서열의 구조적 변화를 유도하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 변형시키는 것은 세포의 게놈에 뉴클레오타이드 서열을 삽입하는 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포의 특이적 유전자좌에서 게놈 서열에 삽입될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표적 게놈 영역 내에 이중 가닥 파단 또는 대향 가닥상에 한 쌍의 단일 가닥의 틈을 유도하고, 표적 게놈 영역을 측접시킴으로써 수행될 수 있다. 표적 게놈 영역에서 또는 내에서 단일 또는 이중 가닥 파단을 유도하기 위한 방법은 Cas9 핵산분해효소 도메인, 또는 이의 유도체, 및 표적 게놈 영역에 지시된 안내 RNA, 또는 안내 RNA의 쌍의 사용을 포함한다.
기타 유전자 편집 페이로드는 핵산분해효소(예를 들어, 징크 핑거 핵산분해효소[Zinc finger nuclease], 전사 활성화제 유사 효과기-기반 핵산분해효소[Transcription activator-like effector-based nucleases, TALEN], 또는 메가핵산분해효소) 및/또는 재조합효소, 예컨대, Cre 재조합효소를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 'TALEN'은 전사 활성화제 유사[Transcription Activator-like, TAL] 효과기 결합 도메인 및 핵산분해효소 도메인을 포함하는 단백질을 의미하며, 그 자체로 기능적인 단량체성 TALEN 뿐만 아니라 다른 단량체성 TALEN과의 이합체화를 필요로 하는 다른 것들을 포함한다. 이합체화는 단량체성 TALEN이 동일할 때 동종이합체성 TALEN을 초래할 수 있거나, 단량체성 TALEN이 상이할 때 이종이합체성 TALEN을 초래할 수 있다. TALEN은 종종 쌍으로 사용되지만 단량체성 TALEN이 알려져 있다. TALEN 또는 다른 도구에 의해 이루어진 유전자 변형은 예를 들어, 삽입, 결실, 외인성 핵산 단편의 삽입, 및 치환으로 이루어진 목록에서 선택될 수 있다. 일반적으로, 표적 DNA 부위가 확인되고, 그 부위에 특이적으로 결합할 TALEN-쌍이 생성된다. TALEN은 예를 들어, 단백질, mRNA로서 또는 TALEN을 암호화하는 벡터에 의해 세포 또는 배아에 전달된다. TALEN은 DNA를 절단하여 이중 가닥 파단을 만든 다음, 이를 복구하며, 종종 인델의 생성을 초래하거나, 염색체에 삽입되거나 변형된 서열을 이용한 파단의 복구를 위한 주형의 역할을 하는 동반된 외인성 핵산에 함유된 서열 또는 다형성을 혼입시킨다.
징크-핑거 핵산분해효소[ZFN]는 징크 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시켜 생성된 인공 제한 효소이다. 징크 핑거 도메인은 원하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있으며, 이는 징크 핑거 핵산분해효소가 복잡한 게놈 내에서 독특한 서열을 표적화할 수 있게 한다. 내인성 DNA 복구 기작을 이용함으로써, 이러한 시약은 고등 유기체의 게놈을 변경시키는 데 사용될 수 있다. ZFN은 유전자를 비활성화시키는 방법에 사용될 수 있다. 유전자 변형 동물을 생산하기 위해 징크 핑거 및 징크 핑거 핵산분해효소를 사용하는 재료 및 방법은 예를 들어, U.S. 8,106,255; U.S. 2012/0192298; U.S. 2011/0023159; 및 U.S. 2011/0281306에 개시되어 있다.
링커
수많은 링커 서열(링커)이 당업계에 알려져 있다. 링커는 예를 들어, GS 링커, GSG 링커, GGSG 링커를 포함한다. 이들 링커는 1회 이상의 소단위의 반복부이다. 그래서, GS 링커는 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상인 수치적 숫자인 GSn 링커이다. 유사하게, GSG 링커는 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상인 수치적 숫자인 GSGn 링커이다. GGSG 링커는 n이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 이상인 수치적 숫자인 GGSGn 링커이다.
힌지 및 막관통 도메인
힌지 서열은 연결된 구성요소 사이의 가요성을 용이하게 하는 아미노산의 짧은 서열이다. 힌지 서열은 임의의 적합한 분자에서 유래되거나 수득된 임의의 적합한 서열일 수 있다. 힌지 서열은 면역글로불린(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 힌지 영역, 즉 면역글로불린의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이 있는 서열(예를 들어, IgG4 Fc 힌지), 또는 CD8α CD4, CD28 및 CD7과 같은 유형 1 막 단백질의 세포외 영역의 전부 또는 부분에서 유래될 수 있으며, 이는 야생형 서열 또는 이의 유도체일 수 있다. 일부 힌지 영역은 면역글로불린 CH3 도메인, 또는 CH3 도메인 및 CH2 도메인 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지는 막관통 도메인에서 유래된다.
본 개시의 조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드 작제물에서 유용한 막관통 도메인은 예를 들어, MHC1 막관통 도메인, CD8α 막관통 도메인, B7-1 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, CTLA-4 막관통 도메인, PD-1 막관통 도메인, 또는 인간 IgG4 Fc 영역을 포함할 수 있다.
세포내/세포질성 또는 막관통 꼬리
임의로, 본원에 제공된 폴리펩타이드 작제물은 세포내/세포질성 또는 막관통 꼬리를 포함한다. 임의로, 세포내/세포질성 또는 막관통 꼬리는 CD8, CD40L, LIGHT, NKG2C, 또는 B7.1 세포내 꼬리이다. 작제물에서 막관통 영역의 부재는 예를 들어, 분비된 페이로드 또는 세포내 또는 핵내 활성이 있는 페이로드에 대하여 설계될 수 있다.
태그
임의로, 본원에 기재된 폴리펩타이드는 태그를 포함한다. 이러한 태그는 폴리펩타이드의 단리 또는 검출 혹은 페이로드의 단리 또는 검출을 가능하게 한다. 이러한 태그는 임의로 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질), His-태그, HA-태그, Myc 태그, FLAG 태그, mCherry, CD20, CD34, 신경 성장 인자 수용체[nerve growth factor receptor, NGFR], 절두된 NGFR[truncated NGFR, tNGRR], 표피 성장 인자[epidermal growth factor, EGFR], 또는 절두된 EGFR[truncated EGFR, tEGFR]을 포함한다.
리간드
리간드는 본원에 기재된 조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드의 FKBP13 DRD에 결합하는 임의의 제제일 수 있으며, 이의 유효량은 FKBP13 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된 페이로드의 특징(예를 들어, 풍부도, 가용성, 활성)에서의 측정 가능한 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 리간드는 합성 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 안정화 리간드는 저분자 화합물일 수 있다. 안정화 리간드는 규제 당국, 예컨대 미국 식품의약국[Food and Drug Administration, FDA]에 의해 이전에 승인된 임의의 저분자 치료 약물이다. 임의로, FKBP13 DRD는 FDA 승인된 저분자, 예를 들어, 타크롤리무스(FK506) 및/또는 시롤리무스(라파마이신)와 같은 저분자 약물인 쌍을 이룬 리간드에 반응한다. 본원에 기재된 바와 같이, DRD는 DRD에 대한 리간드의 결합 친화도에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 임의로, DRD는 제2 리간드(예를 들어, 시롤리무스)와 비교하여 제1 리간드(예를 들어, 타크롤리무스)의 결합에 차등적으로 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 변형된 DRD는 대조군인 미변형 DRD와 비교하여, 제1 리간드에 대한 증가된 결합 친화도 및 제2 리간드에 대한 감소된 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
핵산
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 조작되고 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 가능한 핵산 작제물이 본원에 제공된다. 예를 들어, 생물학적 활성을 갖는 리간드 및 페이로드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체(예를 들어, 유전자 변형 FKBP13)를 암호화하는 핵산이 본원에 제공되며, 여기서, 핵산의 발현 시, FKBP13은 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결된다. 핵산의 발현 시, FKBP13은 유효량의 리간드와 상호 작용하여, 페이로드의 생물학적 활성을 조정할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 페이로드(예를 들어, 유전자 편집 페이로드) 및 DRD를 암호화하고, 임의로 본원에 기재된 바와 같은 힌지, 링커, 막관통 도메인, 태그, 세포내/세포질 및 막관통 꼬리와 같은 추가적인 구성요소를 암호화한다. 핵산 작제물은 임의로 또한 추가적인 구성요소, 예컨대, 신호 서열 및 탈피 도메인을 포함하는 절단 부위를 암호화한다. 작제물은 임의로 추가로 프로모터 서열 및 다른 조절성 요소(인핸서, 번역적 제어 요소(예를 들어, IRES), 및 반감기를 제어하는 요소)를 포함한다.
전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 용어 핵산은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산[deoxyribonucleic acid, DNA] 또는 리보핵산[ribonucleic acid, RNA] 및 이들의 중합체를 지칭한다. DNA 서열이 기재될 때, 이의 상응하는 RNA가 또한 기재되며, 여기서 티미딘은 우리딘으로서 표현되는 것으로 이해된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 변형된 변이체, 대립유전자, 동원체[ortholog], SNP, 및 상보적 서열뿐만 아니라 명백하게 나타낸 서열을 암시적으로 포함한다.
임의로, 핵산은 리간드에 반응하는 FKBP13 단편을 암호화한다. 임의로, FKBP13 단편, 예를 들어, C-말단 단편은 100개 미만의 아미노산이다. 임의로, 암호화된 FKBP13 단편은 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 또는 90개 미만의 아미노산이다. 임의로, 암호화된 FKBP13 단편은 90-99개의 아미노산이다.
일부 구현예에서, 핵산은 서열 번호 1(즉, 야생형 FKBP13) 또는 이의 단편을 암호화한다. 임의로, 핵산은 서열 번호 1의 변이체 또는 이의 단편을 암호화한다. 암호화된 FKBP13 단편은 임의로 서열 번호 2이다. 일부 구현예에서, 암호화된 FKBP13은 서열 번호 2에 비해 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 서열 번호 2의 변이체, 예를 들어, 서열 번호 3-109 중 어느 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 FKPB13이다. 일부 구현예에서, 암호화된 FKBP13 변이체는 리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 타크롤리무스의 4옹스트롬 내에 있는 FKBP13의 잔기는 FKBP13에 대한 결합 부위의 일부인 것으로 간주되었다. FKBP13의 결합 부위는 잔기 Y56, F66, D67, F76, Q84, V85, I86, W89, Y112, R115, K120, I121 및 F129를 포함한다.
FKBP13 리간드는 임의로 FK506(타크롤리무스), 라파마이신(시롤리무스), 또는 FK506(타크롤리무스) 및 라파마이신(시롤리무스) 둘 모두이고, 그에 따라 암호화된 FKBP13은 리간드 중 하나 또는 둘 모두에 결합한다. 일부 구현예에서, 암호화된 FKBP13 변이체는 라파마이신에 대한 반응보다 FK506에 대한 반응으로 페이로드의 생물학적 활성을 5-10배, 예를 들어, 약 7배의 배율만큼 더 많이 조정한다.
본원에 기재된 일부 핵산 서열은 RNA-안내된 핵산내부분해효소, 예를 들어, CRISPR/Cas-연관 핵산내부분해효소를 포함하는 페이로드를 암호화한다. 임의로, CRISPR/Cas-연관 핵산내부분해효소는 Cas9 핵산내부분해효소 또는 Cas12 핵산내부분해효소이다. 임의로, Cas9 핵산내부분해효소는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9[Staphylococcus aureus Cas9, SaCas9] 또는 스타필로코커스 루그두넨시스[Staphylococcus lugdunensis, SluCas9]이다. 임의로, 핵산은 적어도 하나의 안내 RNA 서열을 추가로 암호화한다. 전반적으로 사용된 바와 같이, 안내 RNA[guide RNA, gRNA]는 부위 특이적 또는 표적화된 핵산분해효소, 예를 들어, RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하고, 세포의 게놈 내의 표적 핵산에 특이적으로 결합하거나 이에 혼성화하여, gRNA 및 표적화된 핵산분해효소가 세포의 게놈 내 표적 핵산에 공동 국소화되도록 하는 서열이다. 각각의 gRNA는 게놈 내 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하거나 또는 이에 혼성화하는 약 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이의 DNA 표적화 서열 또는 프로토스페이서 서열을 포함한다. 예를 들어, DNA 표적화 서열은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, gRNA는 crRNA 서열 및 트랜스활성화 crRNA[transactivating crRNA, tracrRNA] 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 tracrRNA 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA-안내된 핵산내부분해효소, 예를 들어, Cas9 단백질은 활성 핵산내부분해효소 형태일 수 있고, 그에 따라 안내 RNA와의 복합체의 일부로서 표적 핵산에 결합될 때, 이중 가닥 파단이 표적 핵산에 도입된다.
벡터 및 세포
핵산 중 하나 이상을 발현시키기 위한 벡터가 본원에 또한 제공된다. 이러한 벡터는 바이러스성 벡터 및 비바이러스성 벡터, 플라스미드, 코스미드, 및 인공 염색체에서 선택될 수 있다. 예로써, 벡터는 아데노-연관 바이러스[adeno-associated viral, AAV] 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 임의로 전위효소 및/또는 핵산분해효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 임의로, 벡터는 하나 이상의 역위 말단 반복부[inverted terminal repeat, ITR]를 포함한다.
일부 경우에, 벡터는 본원에 기재된 핵산 서열 중 임의의 것을 포함하며, 여기서 암호화된 페이로드는 RNA-안내된 핵산내부분해효소이고, 벡터는 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터에서 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9 핵산내부분해효소 페이로드를 암호화하는 서열을 갖는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 패키징되도록 구성된다. 임의로, 핵산은 AAV 벡터에서 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9 핵산내부분해효소 페이로드를 암호화하는 서열을 갖는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 패키징되도록 구성되고, 여기서 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9를 암호화하는 서열은 적어도 3000개의 염기쌍을 포함한다. 벡터의 제한된 용량 및 페이로드의 크기가 주어진 이러한 벡터 작제물은 소형 DRD를 필요로 한다. 100개 이하의 아미노산의 FKBP13의 단편과 같은 FKBP13 DRD 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산은 특히 이러한 벡터 작제물에 특히 적합하다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 작제물 또는 벡터를 함유하는 세포가 제공된다. 임의로, 세포는 면역 세포, 줄기 세포, 근육 세포 등이다. 임의로, 면역 세포는 일차 인간 T 세포, 예컨대, G-CSF, 골수 또는 제대혈로 자극 후 수집된 인간 말초 혈액 단핵 세포[peripheral blood mononuclear cell, PBMC]에서 유래된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 예를 들어, 종양에서 수집된 종양 침윤 림프구[tumor infiltrating lymphocyte, TIL]이다. 면역 효과기 세포는 또한 NK 세포, αβ T 세포, iNKT 세포, γδ T 세포, 대식세포, B 세포, 수지상 세포, 골수 유래된 전구 세포, 호산구, 호염기구, 호중구, 또는 Treg일 수 있다. 임의로, 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 인간 배아성 줄기 세포, 또는 유도 만능 줄기 세포[induced pluripotent stem cell, iPSC]이다. 본원에 제공된 세포는 임의로 포유류 세포, 또는 더 구체적으로, 인간 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 조혈 줄기 세포는 혈액 세포를 생성할 수 있는 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 조혈 줄기 세포는 골수성 또는 림프성 계통의 세포 또는 이들의 조합을 발생시킬 수 있다. 조혈 줄기 세포는 말초 혈액에서 분리될 수 있지만 골수에서 주로 발견된다. 다양한 세포 표면 마커를 사용하여, 조혈 줄기 세포를 확인, 분류 또는 정제할 수 있다. 일부 경우에, 조혈 줄기 세포는 c-kit+ 및 lin-로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD34-, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-로서 확인된다. 일부 경우에, 인간 조혈 줄기 세포는 CD133+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, lin-로서 확인된다. 일부 경우에, 조혈 줄기 세포는 CD150+CD48-CD244-이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 조혈 세포는 조혈 줄기 세포에서 유래된 세포를 지칭한다. 조혈 세포는 유기체, 시스템, 장기 또는 조직(예를 들어, 혈액 또는 이의 분획)에서부터의 단리에 의해 수득되거나 제공될 수 있다. 또는, 조혈 줄기 세포가 단리될 수 있고, 조혈 세포는 줄기 세포를 분화시킴으로써 수득되거나 제공될 수 있다. 조혈 세포는 추가의 세포 유형으로 분화할 수 있는 잠재력이 제한된 세포를 포함한다. 이러한 조혈 세포는 다능성 전구 세포, 계통 제한 전구 세포, 공통 골수성 전구 세포, 과립구 대식세포 전구 세포, 또는 거핵구 적혈구 전구 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조혈 세포는 림프구, 적혈구, 과립구, 단핵구, 및 혈소판과 같은 림프성 및 골수성 계통의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조혈 세포는 T 세포, B 세포, 대식세포, 자연 살해[natural killer, NK] 세포 또는 수지상 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 선천 면역 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 T 세포는 T 세포 수용체 분자를 발현하는 림프성 세포를 지칭한다. T 세포는 인간 알파 베타[alpha beta, αβ] T 세포 및 인간 감마 델타[gamma delta, γδ] T 세포를 포함한다. T 세포는 미감작 T 세포, 자극된 T 세포, 일차 T 세포(예를 들어, 미배양된), 배양된 T 세포, 불멸화된 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 이들의 조합, 또는 이들의 하위 집단을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. T 세포는 CD4+, CD8+, 또는 CD4+ 및 CD8+ 둘 모두일 수 있다. T 세포는 또한 CD4-, CD8-, 또는 CD4- 및 CD8- 둘 모두일 수 있다. T 세포는 헬퍼 세포, 예를 들어, 유형 TH1, TH2, TH3, TH9, TH17, 또는 TFH의 헬퍼 세포일 수 있다. T 세포는 세포독성 T 세포일 수 있다. 조절성 T 세포는 FOXP3+ 또는 FOXP3-일 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25hiCD127lo 조절성 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 유형 1 조절성(Tr1), TH3, CD8+CD28-, Treg17, 및 Qa-1 제한 T 세포, 또는 이들의 조합 또는 하위 집단으로 이루어진 군에서 선택된 조절성 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 FOXP3+T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25loCD127hi 효과기 T 세포이다. 일부 경우에, T 세포는 CD4+CD25loCD127hiCD45RAhiCD45RO- 미감작 T 세포이다. T 세포는 유전자 조작된 재조합 T 세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 일차 세포의 맥락에서 어구 일차는 형질전환되거나 불멸화되지 않은 세포이다. 이러한 일차 세포는 제한된 횟수로 배양, 이차 배양, 또는 계대배양될 수 있다(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 계대배양됨). 일부 경우에, 일차 세포는 시험관내에서 배양 조건에 적응된다. 일부 경우에, 일차 세포는 유기체, 시스템, 장기 또는 조직에서 단리되고, 임의로 분류되고, 배양 또는 계대 배양 없이 직접적으로 사용된다. 일부 경우에, 일차 세포는 자극되거나, 활성화 또는 분화된다. 예를 들어, 일차 T 세포는 CD3, CD28 효능제, IL-2, IFN-γ, 또는 이들의 조합과의 접촉(예를 들어, 이들의 존재하에 배양)에 의해 활성화될 수 있다.
본 개시는 또한 조작된 또는 유전자 변형 세포뿐만 아니라 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산된 조작된 세포 또는 유전자 변형 세포의 집단 중 임의의 것을 포함한다.
제조 방법
본 개시는 본 개시의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물 및 벡터의 제조 방법, 핵산 작제물의 발현을 통해 본 개시의 폴리펩타이드의 제조 방법, 그리고 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 벡터를 포함하는 세포의 제조 방법을 제공한다. 일반적으로, 원하는 페이로드를 조절하기 위해 DRD/리간드 쌍, 예를 들어, FKBP13/FK506이 선택된다. 임의로, 리간드는 FDA-승인된 저분자 약물이다. 일부 구현예에서, DRD/리간드 쌍은 임상적으로 다루기 쉬운 방식으로 선택된다. 예를 들어, 쌍은, 리간드가 리간드의 허용 가능한 범위 내에서 페이로드의 풍부도를 조절하거나 페이로드의 활성을 조절할 수 있도록 선택된다. 이러한 범위는 임의로 리간드의 승인된 FDA 용량 범위이다. 그 후, 핵산 또는 벡터는 본원에 기재된 조절 가능한 폴리펩타이드의 구성 블록/구성요소를 암호화하도록 설계되며, 이러한 구성요소는 폴리펩타이드의 경우에 적어도 페이로드 및 FKBP13 DRD를 포함한다. 핵산 또는 벡터는 추가적인 구성 블록/구성요소, 예컨대, 막관통 도메인, 링커, 힌지, 태그 또는 본원에 언급된 기타 구성요소를 암호화하도록 추가로 설계될 수 있다. 당업자는 본 개시를 이용하여, 적절한 구성요소를 선택하고 이를 작제물 내에서 정렬하여, 원하는 성과를 달성할 수 있다. 예를 들어, 구성 블록의 순서는 DRD가 N-말단 또는 C-말단에서 페이로드를 조절하는지 여부에 영향을 미친다.
또 다른 예로서, 링커 및 링커 길이는 구성적 활성 수준(즉, 리간드의 부재하의 기저 활성)에 영향을 미칠 수 있고, 특정 구현예에서, 특이적 링커 및 길이는 리간드의 부재하에 낮은 기저 활성 수준을 유지하면서 온 상태[on state](예를 들어, 리간드의 존재하에 최대 활성 수준)를 최대화하도록 선택된다. 또 다른 예로서, 특이적 힌지는 형태적 변화를 가능하게 할 수 있고, 이에 의해 리간드 반응성에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 힌지는 충분한 동적 범위를 초래하도록 선택되어, 페이로드 풍부도 및 생물제제 활성의 원하는 범위(즉, 0 또는 최소 활성에서 최대 포화 활성까지 리간드의 변동에 상응하는 허용 가능한 페이로드 활성 범위)를 수득한다.
일부 경우에, 핵산 작제물은 임의로 세포내 또는 막관통 도메인과 연관된 페이로드를 암호화하도록 구성되고, 그에 따라 페이로드는 임의로 세포막에 속박된다.
비히클/벡터는 핵산 작제물을 원하는 세포에 전달하도록 선택되고 설계된다. 예를 들어, 비히클은 바이러스성 벡터(예컨대, 아데노-연관 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및), 플라스미드, 코스미드, 및 인공 염색체를 포함하는 이전에 기재된 것에서 선택될 수 있다. 이러한 벡터는 전위효소, 핵산분해효소, 및 번역을 제어하는 요소(예를 들어, IRES)를 암호화하도록 설계될 수 있다. 벡터의 선택은 또한 다양한 구성 블록 구성요소의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 작은 작제물을 요구하는 벡터는 더 작은 DRD 사용을 필요로 할 수 있다. 적절한 구성요소, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 멀티시스트론성 발현, 번역 제어 및 반감기 제어 요소는 페이로드 풍부도 또는 활성의 원하는 제어를 달성하도록 선택된다.
추가적으로, 핵산 작제물은 다양한 조작된 구성요소의 원하는 발현에 필요한 경우에 시스트론성 또는 멀티시스트론성 발현을 위하여 설계된다. 일부 구현예에서, 멀티시스트론성 발현을 위해, 두 개 이상의 폴리펩타이드, 예를 들어, FKBP13 및 페이로드 융합체 및 제2 페이로드를 암호화하는 두 개 이상의 핵산은 자가 절단 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 의해 분리될 수 있다. 자가 절단 펩타이드의 예는 자가 절단 바이러스 2A 펩타이드, 예를 들어, 돼지 테스코바이러스-1[porcine teschovirus-1, P2A] 펩타이드, 토세아 아시그나 바이러스[Thosea asigna virus, T2A] 펩타이드, 말 비염 A 바이러스[equine rhinitis A virus, E2A] 펩타이드, 또는 구제역 바이러스[foot- and-mouth disease virus, F2A] 펩타이드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 자가 절단 2A 펩타이드는 단일 작제물에서 다수의 유전자 생성물의 발현을 가능하게 한다. (예를 들어, 문헌[Chng et al., MAbs 7(2): 403-412 (2015)] 참조). 일부 구현예에서, 핵산 작제물은 두 개 이상의 자가 절단 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 두 개 이상의 자가 절단 펩타이드는 모두 동일하다. 다른 구현예에서, 두 개 이상의 자가 절단 펩타이드 중 적어도 하나는 상이하다.
핵산이 전달되는 세포는, 적어도 부분적으로, 본원에 개시된 조절 가능한 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하고 충분한 동적 범위에서 페이로드 활성을 허용하는 세포의 능력에 기반하여 선택된다. 임의로, 세포는 제공된 핵산 또는 벡터의 부재하에 페이로드를 거의 또는 전혀 발현하지 않는다. 특정 구현예에서, 당업자는 페이로드를 자연적으로 발현하는 세포에서 페이로드 활성 또는 풍부도의 증가를 필요로 하는 세포를 선택할 것이다. 특정 구현예에서, 당업자는 유전자 편집을 필요로 하는 세포를 선택할 것이다. 특정 구현예에서 세포는 효과기 세포, 예를 들어, 면역 효과기 세포로서 선택된다.
본 개시에서 얻은 지식을 적용하는 당업자는 본 개시의 범주 내에서 본원에 명시적으로 예시된 것들 이상으로, 다양한 조절 가능한 폴리펩타이드뿐만 아니라 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 벡터, 및 조절 가능한 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된 세포를 구축할 수 있다.
사용 방법
페이로드를 조절하는 방법, 예를 들어, 유전자 편집 페이로드의 풍부도, 가용성 및/또는 활성을 조절하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 조절의 방법은 리간드에 반응하는 FKBP13 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된 페이로드를 발현하도록 세포를 조작하여 페이로드의 활동을 변형시키는 방법이다. 페이로드의 활성(예를 들어, 페이로드의 풍부도 및/또는 가용성에 상응함)은 대조군 세포, 예를 들어, DRD와 무관하게 페이로드를 발현하도록 조작된 세포에서의 페이로드의 활성과 비교하여 감소한다.
예를 들어, 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 세포 내 페이로드를 조절하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 핵산은 프로모터 서열 및 페이로드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본 방법은 세포를 유효량의 리간드와 접촉시켜, 원하는 수준의 페이로드 활성이 달성되도록 하는 단계를 추가로 포함한다.
임의로, 페이로드는 리간드의 부재하의 기저 활성 수준에서 리간드의 포화량의 존재하의 최대 활성까지의 범위의 생물학적 활성 수준을 가지며, 본 방법은 페이로드의 활성을 조정하는 방법으로서, FKBP13 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된 페이로드(예를 들어, 유전자 편집 페이로드)를 발현하도록 조작된 세포를 유효량의 리간드와 접촉시켜, 페이로드의 활성이 기저 활성 수준에 비해 증가되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 선택된 양의 리간드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 선택된 양의 리간드는 페이로드의 선택된 활성 수준을 초래한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 다양한 선택된 양의 리간드와 세포를 대안적으로 접촉시켜, 기저 수준에서 최대 수준까지의 범위의 다양한 선택된 활성 수준을 달성하는 단계를 포함한다.
접촉시키는 단계는 생체내 또는 시험관내에서 발생할 수 있다. 접촉시키는 단계는 페이로드의 연속적인 선택된 활성을 달성하기 위해(즉, 페이로드의 연속적인 온 상태를 달성하기 위해) 또는 페이로드의 간헐적 활성을 달성하기 위해(즉, 온 상태와 오프 상태[off state] 사이에 페이로드의 펄스화된 전달을 제공하기 위해) 임의로 수행된다. 오프 상태는 페이로드 활성이 기저 활성 수준임을 의미한다. 온 상태는 오프 상태보다 더 큰, 유효량의 리간드의 존재하에 선택된 활성 수준을 의미한다. 페이로드의 연속적인 활성은 유효량의 리간드와 FKBP13 DRD의 연속적인 접촉에 의해 또는 리간드와 FKBP DRD의 후속 접촉 단계 또는 단계들을 제공함으로써 달성될 수 있으며, 여기서 후속 접촉 단계 또는 단계들은 이전 접촉 단계에서부터 페이로드의 활성 수준이 기저 활성 수준에 도달하기 전에 수행된다. 각각의 접촉 단계는 리간드의 양에 따라 달라질 수 있는 데, 리간드를 더 많이 사용하면 페이로드 활성이 더 커지고, 리간드를 더 적게 사용하면 리간드/DRD 쌍의 동적 범위 내에서 페이로드 활성이 더 작아진다. 따라서, 리간드의 양은 시간이 지남에 따라 페이로드의 양 및/또는 활성을 상향조정 또는 하향조정하기 위한 후속 접촉 단계에 따라 달라질 수 있다. 각각의 접촉 단계는 또한 활성 수준의 원하는 패턴을 달성하기 위해 빈도에 관하여 달라질 수 있다.
또한, (a) (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및 (2) 세포의 게놈 내의 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA를 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계; (b) 벡터 함유 세포를 유효량의 리간드와 접촉시켜 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소가 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소가 세포 내의 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는, 단계에 의해 세포 내의 표적 DNA를 변형시키는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 세포를 변형시키기 위한 방법 중 임의의 것은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 본원에 기재된 세포 중 임의의 것은 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 유전자 변형될 수 있다.
치료 방법
본원에 기재된 바와 같은 핵산 또는 벡터, 또는 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 함유하는 세포를 대상에게 투여함으로써 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된 페이로드를 대상에게 전달하는 방법이 본원에 제공된다. 따라서, 페이로드를 이를 필요로 하는 대상에게 전달하는 방법이 제공된다. 페이로드는 본원에 기재된 바와 같은 핵산 작제물 또는 벡터를 대상에게 투여함으로써 전달될 수 있다. 페이로드는 예를 들어, 치료적으로 효과적인 유전자 편집 페이로드를 포함하는 임의의 생물학적 활성 페이로드일 수 있다. 본 방법은 대상의 표적 세포 내에서 발현 및 유전자 편집을 초래한다. 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 대상에게 전달하는 방법이 또한 제공된다. 벡터가 도입된 하나 이상의 세포는 동일한 대상 또는 상이한 대상에서 유래될 수 있다. 하나 이상의 세포는 동일하거나 상이한 대상에서 유래될 수 있고, 이어서 벡터의 도입 전 및/또는 후에 배양물에서 확장될 수 있다.
예로서, (a) (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및 (2) 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 안내 RNA를 포함하는 벡터를 대상의 하나 이상의 세포에 도입하는 단계; (b) 벡터 함유 세포 하나 이상을 유효량의 리간드와 접촉시켜 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소는 대상의 하나 이상의 세포의 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는, 단계에 의해 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, (a) 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 대상에게 투여하는 단계로서, 여기서 벡터는 (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열, 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및 (2) 하나 이상의 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안내 RNA를 포함하는, 단계; (b) 유효량의 리간드를 대상에게 투여하여 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 여기서 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 안내 RNA와 상호 작용하고, RNA-안내된 핵산내부분해효소는 하나 이상의 세포의 게놈을 특이적으로 변형시키는, 단계를 포함하는, 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 대상에게 전달하는 본원에 기재된 임의의 방법은 대상에서 세포를 단리하는 단계, 본 개시에 기재된 조절 가능한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 벡터로 단리된 세포를 형질도입하는 단계, 세포를 시험관내에서 확장하는 단계, 및 세포를 동일하거나 상이한 대상에게 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상은 유전자 돌연변이를 가질 수 있다. 세포는 형질도입된 세포를 수용하는 동일한 대상(자가유래 공급원)에서 단리될 수 있거나, 세포는 상이한 대상(예를 들어, 동종이계 공급원)에서 단리될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 약 1000개의 세포/주사에서 약 100억개 이하의 세포/주사, 예컨대, 1 × 1010, 1 × 109, 1 × 108, 1 × 107, 5 × 107, 1 × 106, 5 × 106, 1 × 105, 5 × 105, 1 × 104, 5 × 104, 1 × 103, 5 × 103개의 세포/주사, 또는 숫자 중 임의의 두 개 사이의 임의의 범위(종료 지점 포함)의 양으로 투여된다. 임의로, 1 × 108 내지 1 × 1010개의 세포가 대상에게 투여된다. 임의로, 세포는 필요에 따라 1, 2, 3, 또는 4회 투여된다. 일부 방법에서, 본원에 기재되거나 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 하나 이상의 유전자 변형 세포가 대상에게 투여된다.
본 방법은 대상에게 페이로드의 선택된 활성을 전달하기 위해 선택된 양의 쌍을 이룬 리간드를 대상에게 투여함으로써 대상에 대한 페이로드의 투여의 용량 또는 지속기간을 제어하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 리간드는 대상에서 연속적인 또는 간헐적인 페이로드 활성을 달성하도록 전달될 수 있다. 연속적인 페이로드 활성은 활성의 실질적으로 일관된 수준일 수 있거나, 활성의 수준은 조정될 수 있다. 오프 상태와 온 상태 사이 간헐적인 활성은 오프 상태와 실질적으로 일관된 온 상태 사이, 또는 오프 상태와 다양한 온 상태 활성 수준 사이 활성을 조정하는 것을 포함한다. 페이로드의 더 많은 활성을 원하는 경우 리간드의 투여의 더 높은 용량 또는 더 오랜 지속기간이 수행되고, 더 적은 활성을 원하는 경우 리간드 용량의 감소 또는 제거가 선택된다. 리간드 투여의 용량 및 지속기간 그리고 페이로드의 생성된 활성은 대상에서 허용 불가능하거나 원하지 않은 부작용 또는 독성을 피하도록 선택될 수 있다. 리간드의 투약량, 및 리간드의 투약량을 투여하기 위한 일정은 생성된 페이로드의 양, 페이로드의 활성, 또는 페이로드 활성의 효과의 하나 이상의 징후에 기초하여 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 리간드의 투여를 위한 범위는 0보다 큰 임의의 양에서 포화 용량까지의 범위이고, 생성된 페이로드 활성은 임의로 리간드에 대한 원하는 용량 반응을 가능하게 하는 충분한 동적 범위 및 페이로드에 대하여 동반 활성 범위(예를 들어, 주어진 리간드 및 페이로드에 대하여, 오프 상태 및 최대 페이로드 활성의 차이의 범위는 리간드의 적어도 10배 범위에서 발생할 것임)를 포함하여, 기저 수준에서 최대 수준 범위이다. 이 충분한 동적 범위는 미세 조정 그리고 허용 불가능하게 가파르지 않은 용량 반응 곡선을 허용한다. 구현예에서, 리간드의 투여의 투약량 또는 빈도 그리고 페이로드의 생성된 풍부도 및 활성은 허용 불가능하거나 원하지 않은 유해한 부작용을 피하거나, 완화하거나, 제한하도록 선정되고 대상의 연령, 병태, 및/또는 성별, 및 치료되고 있는 병태의 유형, 병태의 정도, 또는, 그리고 다른 치료적 제제가 치료 요법에서 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이다. 리간드의 주어진 부류에 대한 적절한 용량에 대한 지침은 문헌에서 발견될 수 있다. 예시적인 용량, 예를 들어, 다양한 조직/장기 이식에 대한 타크롤리무스의 임상적으로 승인된 용량은 0.1-0.3 mg/체중 kg이다. 이러한 용량은 20-68 ng/ml의 Cmax 값을 달성할 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법에서, 대상에 대한 투여를 위한 선택된 양의 리간드 및 선택된 양의 리간드의 투여의 빈도를 포함하는 리간드 용량 용법은 페이로드의 조절 및/또는 대상에 대하여 원하는 결과를 얻도록 선택된다. 대상은 결과에 대하여 임의로 모니터링된다. 따라서, 예를 들어, 대상에서 암의 치료를 위해, 샘플 내 악성 세포의 개수, 샘플 내 순환 종양 DNA, 또는 영상 촬영 시 고형 종양의 크기가 검출될 수 있다. 원하는 종점이 달성되는 경우(예를 들어, 유전자 돌연변이의 성공적인 치료를 보여주는 경우), 리간드를 감소시키거나 중단하여, 유전자 편집 페이로드를 감소시키거나 제거할 수 있으며, 예를 들어, 원치 않거나 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 완화하기 위해 사전 결정된 임계치보다 적은 페이로드의 풍부도, 가용성 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 대상에서 수용할 수 없는 비표적효과 또는 페이로드에서 다른 유해 효과가 발생하는 경우, 리간드를 감소시키거나 중단할 수 있다.
유전자 편집 공정의 다운스트림 표적 단백질의 발현을 조절하는 방법이 본원에 또한 개시된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 세포를 조작하여 DRD에 작동 가능한 상태로 연결된 CAS9 단백질 또는 전사 인자 단백질과 같은 페이로드를 포함하는 올리고머 또는 조작되고 조절 가능한 폴리펩티드를 발현시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 돌연변이를 갖는 대상의 경우, 본 개시에 따른 핵산 작제물 또는 벡터는 핵산 편집 폴리펩타이드를 제공하는 페이로드를 전달하도록 대상의 세포에 제공된다. 대상에서 표적 세포는 핵산 작제물 또는 벡터로 형질도입되어 유전자 편집 페이로드가 형질도입된 세포의 핵산(예를 들어, 게놈 DNA 또는 RNA)을 변형시키게 한다. 페이로드의 활성 수준 및 그에 따른 표적 단백질의 발현은 대상에 대한 리간드의 투여에 의해 조절될 수 있다.
또한, 세포의 게놈을 편집하기 위해, 본원에 기재된 유전자 편집 시스템 중 임의의 것, 예를 들어, CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 편집된 하나 이상의 세포를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 기재된 치료 방법 중 임의의 것은 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어, 비제한적으로 뒤시엔느 근이영양증, 근긴장 이영양증, 낭포성 섬유증, 겸상 적혈구, 베타 지중해 빈혈, 알파-1 항트립신 결핍증, APOL1-매개 신장 질환 또는 1형 당뇨병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, '전사물' 또는 '그 전사물'에 대한 언급은 복수의 전사물을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 그리고 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, '예컨대')의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 제한을 부과하지 않는다.
용어 '임의적' 또는 '임의로'는 후속적으로 기재된 사건, 상황 또는 재료가 발생하거나 존재할 수 있거나, 발생하지 않거나 존재하지 않을 수 있음을 의미하고, 설명이 그 사건, 상황 또는 재료가 발생하거나 존재하는 경우뿐만 아니라 발생하지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
본원에서 용어 '포함한', '포함하는', 또는 '갖는' 및 이들의 변화의 사용은 이후에 열거된 요소 및 그 균등물뿐만 아니라 추가적인 요소를 포함하는 것을 의미한다. 특정 요소를 '포함한', '포함하는' 또는 '갖는'으로서 인용된 구현예는 또한 이러한 특정 요소로 '본질적으로 이루어진' 및 '이루어진'으로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, '및/또는'은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 그리고 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안('또는')으로 해석되는 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 전환 어구 '이로 본질적으로 이루어진'(및 문법적 변형)은 언급된 재료 또는 단계 '및 청구된 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 질료적으로 영향을 미치지 않는 것들'을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)]을 참조하고(원문에 강조 표시됨), 또한 MPEP §2111.03을 참조한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 '이로 본질적으로 이루어진'은 '포함하는'과 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
양, 농도, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 중량, 위치 및 길이 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 사용되는 용어 '약' 및 '대략'은 실험 오차로 인한 변동을 설명하기 위한 것으로, 이는 지정된 양, 농도, 용량, 시간, 온도, 활성, 수준, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 중량, 위치 및 길이 등의 ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변동을 포함할 수 있다. 측정치 또는 숫자가 단어 약에 의해 명시적으로 수정되지 않더라도, 모든 측정치 또는 숫자는 단어 약에 의해 수정되는 것으로 암시적으로 이해된다. 용어 '약' 및 '대략'이 참조 폴리펩타이드 내에서 영역의 자리 또는 위치와 관련하여 사용되는 경우에, 이들 용어는 ± 20개 이하의 아미노산 잔기, ± 15개 이하의 아미노산 잔기, ± 10개 이하의 아미노산 잔기, ± 5개 이하의 아미노산 잔기, ± 4개 이하의 아미노산 잔기, ± 3개 이하의 아미노산 잔기, ± 2개 이하의 아미노산 잔기, 또는 심지어 ± 1개의 아미노산 잔기의 변동을 포함한다.
본원에서 '기저 활성 수준'이 언급된다. 본원에 사용된 바와 같은 기저 수준은 0, 거의 0, 또는 외인성 리간드의 부재하에 임의의 양일 수 있다. 기저 활성은 동일하거나 상이한 리간드의 내인성 수준 때문에 발생할 수 있거나 외인성 리간드의 부재하에 페이로드 생산의 휴지 수준 때문에 발생할 수 있다.
'생물학적 활성'에 대한 언급은 그렇게 명시되지 않았더라도, 적절한 조건하를 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, '접촉시키는 것'은 표적(예컨대, DRD)에 제제(예컨대, 리간드)를 제공하여, 제제 및 표적이 서로 접촉할 수 있도록 하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 접촉시키는 것은 (예를 들어, DRD가 세포외로 또는 세포 표면상에서 자리잡는 경우) 세포에 시험관내에서 리간드를 제공하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 접촉시키는 것은 리간드를 세포에 제공하는 것을 또한 포함하며, 여기서 DRD는 세포내로 자리잡고, 그에 따라 리간드는 세포질에 도달한다. 유사하게, 세포는 대상에 대한 리간드의 투여에 의해 생체내에서 접촉될 수 있고, 그에 따라 리간드는 세포 또는 DRD에 도달한다.
'DRD'는 그렇게 명시되지 않았더라도, 리간드에 반응하는 도메인을 의미하는 것으로 이해된다.
용어 '리간드', '쌍을 이룬 리간드', 및 '안정화 리간드'는 상호 교환 가능하게 사용되고 약물 반응성 도메인['DRD']과 관련하여 사용될 때 동일한 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, '작동 가능한 상태로 연결된'은, 쌍을 이룬 리간드의 존재하에, DRD가 페이로드의 측정 가능한 특징을 변경시키기 위해(예를 들어, 쌍을 이룬 리간드의 부재하의 활성의 수준과 비교하여 페이로드의 활성의 수준을 변경시키기 위해) 직접적으로 또는 간접적으로 페이로드에 연결되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 페이로드의 양 및/또는 활성의 측정된 수준은 리간드의 부재하의 발현 또는 활성의 측정된 수준과 비교하여 유효량의 리간드의 존재하에 증가된다. 유효량의 리간드는 페이로드의 양 또는 활성의 측정에서 증가를 확인하는 데 필요한 리간드의 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 유효량은 허용 불가능한 독성 또는 비표적효과를 생산할만큼 크지 않다. 임의로, 측정 가능한 특징은 치료 결과, 샘플 내 페이로드의 양, 또는 (페이로드의 양을 측정하는 것이 대용물의 역할을 할 수 있는) 페이로드의 생물학적 활성 수준이다.
용어 '페이로드'는 풍부도, 활성, 가용성, 발현, 기능 또는 다른 특징이 DRD에 의해 조절되기를 원하는 제제를 지칭한다.
어구 '연결된' 또는 '결합된' 또는 기타 등등이 사용되는 때마다, 어구 '직접적으로 또는 간접적으로'는 달리 명시적으로 언급되지 않거나 문맥상 무의미하지 않는 한 뒤따르는 것으로 이해된다.
본 개시의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 설명 및 첨부 도면에 기재되어 있다. 다른 구현예가 이용될 수 있고 구조적 또는 공정 변화가 본 개시의 범주에서 이탈 없이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다시 말해서, 실례적 구현예 및 양태는 후술된다. 그러나, 임의의 이러한 실제 구현예의 개발에서, 수많은 구현 특이적 결정이, 구현마다 달라질 수 있는, 개발자의 특정 목표, 예컨대, 시스템 관련 및 비즈니스 관련 제약조건의 준수를 달성하기 위해 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 더욱이, 이러한 개발 노력이 복잡하고 시간 소모적일 수 있지만 그럼에도 불구하고 본 개시의 이익을 갖는 기술 분야의 당업자에게는 일상적인 작업이 될 것임이 이해될 것이다.
본원에 인용된 공개물 및 이들이 인용된 자료는 이로써 그 전체가 참조로 본원에 구체적으로 포함된다.
아래 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 양태를 추가로 예시하기 위한 것이며, 청구범위의 범주를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
실시예 1
FDA 승인 약물에 반응하는 DRD를 확인하기 위해 FKBP13 및 이의 단편을 연구하였다. 이들 실험의 목적을 위해, 타크롤리무스를 예시적인 FDA 승인 약물로서 사용하였다. 타크롤리무스의 FKBP13에 대한 결합 친화도는 166 nM이며, 이는 FKBP12에 대한 결합 친화도 0.2 nM보다 실질적으로 낮다. 타크롤리무스에 대한 FKBP13 반응성을 증가시키기 위해, FBKP13 결합 부위를 FKBP12의 결합 부위와 더 유사하게 만드는 것을 목표로 하여 FKBP13의 결합 부위를 표적화였다. 이를 위해, FKBP12 및 FKBP13의 타크롤리무스 결합된 3차원 구조를 비교하였다. 전문가의 육안 검사를 기반으로 FKBP13의 약물 반응성을 증가시킬 수 있는 돌연변이를 설계하였다. 라이브러리 기반 스크리닝을 또한 실시하였다. 서열 번호 3-109에 상응하는 DRD를 라이브러리 선택에서 도출하였다. A117H 변이체(Q72R, Q84E 및 A117H 결합 부위 돌연변이)를 갖는 결합 부위를 사용하여 부위-포화 라이브러리로서 라이브러리를 생성하였으며, 여기서 117H는 FKBP12 결합 부위에서 발견되는 잔기이다. 라이브러리가 선택되는 동안 약 5개의 추가적인 결합 부위 돌연변이를 설계하였으며, A117W 돌연변이가 EC50을 개선하고 결합 친화도를 6배 증가시킬 가능성이 있는 것으로 나타났다. 라이브러리 출력을 시퀀싱을 통해 분석했을 때, DRD-유전자 돌연변이는 결합 부위의 A117W 버전으로 만들어졌다. 대조군으로서, 라이브러리에서 나온 A117H 서열을 이용하여 상위 FKBP13 돌연변이체 중 다섯 개를 또한 생산하였다. FKBP-117, 119, 121, 123, 125를 개선된 결합 부위(A117W; FKBP-091에서 확인됨)로 포맷화하였지만, FKBP-118, 120, 122, 124, 126은 라이브러리에서 시퀀싱된 것과 정확히 동일하며 결합 부위에 A117H 돌연변이를 갖는다. 나머지 라이브러리 출력(127-150)은 개선된 결합 부위 돌연변이(즉, Q72R, Q84E 및 A117W)만을 갖도록 포맷화하였다.
출발점 역할을 하는 전장 야생형 FKBP13 서열은 다음과 같다.
MRLSWFRVLTVLSICLSAVATATGAEGKRKLQIGVKKRVDHCPIKSRKGDVLHMHYTGKLEDGTEFDSSLPQNQPFVFSLGTGQVIKGWDQGLLGMCEGEKRKLVIPSELGYGERGAPPKIPGGATLVFEVELLKIERRTEL (서열 번호 1).
표 1은 실시예 전반에 걸쳐 기재된 작제물에 사용된 예시적인 FKBP13 DRD 서열을 제공한다. 야생형 FKBP13 단편은 서열 번호 2로 지정된다. 서열 번호 3-109는 서열 번호 2에 상응하는 단편에서 유래된 유전자 변형 FKBP13 폴리펩타이드의 예이다. 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 작제물 FKBP-039-FKBP-에 대한 참조
예시적인 DRD 서열
작제물 명칭(FKBP13 - AcGFP - mCherry 융합체) 작제물 내의 FKBP13 DRD FKBP13 DRD 서열 서열 번호
FKBP-039 FKBP13(WT) 2
FKBP-040 FKBP13(DRD - D90G) 3
FKBP-041 FKBP13(DRD - M54A) 4
FKBP-042 FKBP13(DRD - M96V) 5
FKBP-043 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - D90G) 6
FKBP-044 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54A) 7
FKBP-045 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M96V) 8
FKBP-053 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - D90G, F66H) 9
FKBP-054 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - D90G, L127K) 10
FKBP-055 FKBP13은 FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - (Q72R, Q84E, A117H)(DRD - F78V) 11
FKBP-056 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H) (DRD - F129K) 12
FKBP-057 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - I106A) 13
FKBP-058 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L52A) 14
FKBP-059 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93A) 15
FKBP-060 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L104A) 16
FKBP-061 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L133A) 10
FKBP-062 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54A, [-]이황화물) 18
FKBP-063 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54A, C42S) 19
FKBP-064 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - R102L) 20
FKBP-065 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H) 21
FKBP-066 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54K) 22
FKBP-067 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54H) 23
FKBP-068 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54H) 24
FKBP-069 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54G) 25
FKBP-070 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54D) 26
FKBP-071 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H) (DRD - M54V)-AcGFP-P2A-mCherry 27
FKBP-072 pELNS-FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93K) 28
FKBP-073 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93H) 29
FKBP-074 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93S) 30
FKBP-075 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93G) 31
FKBP-076 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L93D) 32
FKBP-083 FKBP13 trunc1(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54A) 33
FKBP-084 FKBP13 trunc2(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - M54A) 34
FKBP-085 FKBP13 trunc1WT(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - WT) 35
FKBP-086 FKBP13 trunc2WT(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - WT) 36
FKBP-087 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H; 및 I121H)(DRD - M54A) 37
FKBP-088 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H; 및 F129Y)(DRD - M54A) 38
FKBP-089 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, V85D, A117H)(DRD - M54A) 39
FKBP-090 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, I86D, A117H)(DRD - M54A) 40
FKBP-091 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A) 41
FKBP-092 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L127A) 42
FKBP-093 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - L80A) 43
FKBP-094 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - P107S) 44
FKBP-095 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - P122S) 45
FKBP-096 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - E100L) 46
FKBP-097 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD - E100S) 47
FKBP-098 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54S) 48
FKBP-099 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, del c-term R) 49
FKBP-100 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, M96V) 50
FKBP-101 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, Nterm- 2aa trunc) 51
FKBP-102 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, P118V) 52
FKBP-103 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, P119V) 53
FKBP-104 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W), K120I(DRD - M54A) 54
FKBP-105 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W), K120R(DRD - M54A) 55
FKBP-106 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117Y(DRD - M54A) 56
FKBP-107 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - I106V) 57
FKBP-108 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A I106V) 58
FKBP-109 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - L104V) 59
FKBP-110 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - L104V) 60
FKBP-111 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - D90A) 61
FKBP-112 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - L93V) 62
FKBP-113 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54S) 63
FKBP-114 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - M54A, Trunc1) 64
FKBP-115 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - 없음, Trunc2) 65
FKBP-116 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD - 없음, Trunc3) 66
FKBP-117 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD V85R) 67
FKBP-118 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD V85R) 68
FKBP-119 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD K101W) 69
FKBP-120 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD K101W) 70
FKBP-121 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD I136V) 71
FKBP-122 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD I136V) 72
FKBP-123 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD G49S) 73
FKBP-124 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD G49S) 74
FKBP-125 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD D62S) 75
FKBP-126 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD D62S) 76
FKBP-127 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD F76Q) 77
FKBP-128 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD H53L) 78
FKBP-129 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD E98L) 79
FKBP-130 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD P107K) 80
FKBP-131 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD T126C) 81
FKBP-132 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD G92Y) 82
FKBP-133 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD G83T) 83
FKBP-134 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD H41R) 84
FKBP-135 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD E61Y) 85
FKBP-136 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD S108M) 86
FKBP-137 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD P75L) 87
FKBP-138 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD G124R) 88
FKBP-139 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD E130R) 89
FKBP-140 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD K135Y) 90
FKBP-141 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117R(DRD L52R) 91
FKBP-142 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD T64G) 92
FKBP-143 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84G, A117H)(DRD P43R) 93
FKBP-144 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD D50R, E98M) 94
FKBP-145 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD H41S, E61D) 95
FKBP-146 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD L104S, I136L) 96
FKBP-147 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD T64R, S108G, E137F) 97
FKBP-148 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD D62N, D67N, D90N, M96G, E130K) 98
FKBP-149 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD T64Q, L94G) 99
FKBP-150 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117H)(DRD E61G, G124P) 100
FKBP-151 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84R, A117W)(DRD M54A) 101
FKBP-152 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84W, A117W)(DRD M54A) 102
FKBP-153 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, S79W, Q84E, A117W)(DRD M54A) 103
FKBP-154 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, S79W, Q84W, A117W)(DRD M54A) 104
FKBP-155 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, S79W, Q84R, A117W)(DRD M54A) 105
FKBP-156 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, T82W, Q84W, A117W)(DRD M54A) 106
FKBP-157 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, T82W, Q84E, A117W)(DRD M54A) 107
FKBP-158 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD M54A G111E) 108
FKBP-159 FKBP13(FKBP12 활성 부위와 매칭되도록 돌연변이됨 - Q72R, Q84E, A117W)(DRD M54A G111Y) 109
표 1에 기재된 DRD 서열을 포함하는 작제물을 제조하여, 예시적인 페이로드 폴리펩타이드[즉, 에쿠오레아 코에룰레센스(Aequorea coerulescens) GFP]에 대한 각각의 DRD의 효과를 결정하였다. 이들 작제물은 표 2에 기재되어 있다.
[표 2]
예시적인 DRD/AcGFP 작제물
결합 부위 돌연변이의 존재 및 부재하에 타크롤리무스에 대한 FKBP13 반응성을 증가시키는 돌연변이(즉, DRD-유전자 돌연변이)의 효과를 시험하기 위해, 작제물 FKBP13-039, FKBP13-040, FKBP13-041, FKBP13-042, FKBP13-043, FKBP13-044 및 FKBP13-045를 제조하였다. 이러한 작제물에 대한 서열은 아래에 기재되어 있다. 작제물 FKBP13-039, FKBP13-040, FKBP13-041, FKBP13-042, FKBP13-043, FKBP13-044 및 FKBP13-045에서, FKBP13 DRD 서열은 볼드체로 표시되고, AcGFP 아미노산 서열은 밑줄 그어져 있고, mCherry 서열은 이탤릭체로 표시된다. FBKP13 DRD 서열을 포함하는 본원에 기재된 작제물 중 임의의 것은 또한 작제물 FKBP13-039, FKBP13-040, FKBP13-041, FKBP13-042, FKBP13-043, FKBP13-044 및 FKBP13-045 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 AcGFP 아미노산 서열(서열 번호 117, 하기 서열 번호 110-116에서 밑줄 그어져 있음) 및/또는 mCherry 아미노산 서열(서열 번호 118, 하기 서열 번호 110-116의 이탤릭체)을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 110)
FKBP13-040
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 111)
FKBP-041
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 112)
FKBP-042
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 113)
FKBP-043
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 114)
FKBP-044
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 115)
FKBP-045
FKBP13 DRD-AcGFP-mCherry AA 서열(서열 번호 116)
도 1a는 (i) 잠재적인 FKBP DRD 서열을 암호화하는 핵산 서열; (ii) 에쿠오레아 코에룰레센스[Aequorea coerulescens GFP, AcGFP]를 암호화하는 핵산 서열; (iii) 예시적인 자가 절단 펩타이드(돼지 테스코바이러스-1 2A[P2A])를 암호화하는 핵산 서열; 및 (iv) mCherry를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 예시적인 핵산 작제물의 일반적인 조직을 도시하는 개략도이다.
HEK-293T 세포를 10% FBS(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 10-082-147) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 카탈로그 번호 15140122)으로 표준 배지(둘베코의 변형된 이글 배지[Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM](Fisher Scientific, Hampton, NH, 카탈로그 번호 11-960-044)에서 배양하고, 리포펙타민(Lipofectamine)® 2000(Fisher Scientific, 카탈로그 번호 11-668-027)을 사용하여 6개의 웰 플레이트에서 FKBP13-039, FKBP13-040, FKBP13-041, FKBP13-042, FKBP13-043, FKBP13-044 또는 FKBP13-045 작제물을 이용하여 일시적으로 형질주입시켰다. 24시간 후 형질주입된 HEK-293T 세포를 0, 1 또는 10 μM FK506(타크롤리무스)으로 처리하였다. FK506 처리의 24시간 후, 트립신 처리를 통해 세포를 수확하고, Attune NXT 유세포 측정기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 유동 분석을 수행하였다.
FKBP13-039 내 DRD는 야생형[WT] FKBP13(즉, 서열 번호 1의 98번의 아미노산 단편)이었다. FKBP13-040, FKBP13-041 및 FKBP13-042 내 DRD는 각각 DRD-유전자 돌연변이 D90G, M54A 및 M96V를 포함하도록 설계되었지만, 결합 부위 돌연변이는 포함하지 않았다. FKBP13-043, FKBP13-044, 및 FKBP13-045 작제물은 각각 DRD-유전자 돌연변이 D90G, M54A 및 M96V, 및 3개의 결합 부위 돌연변이(Q72R, Q84E 및 A117H)를 포함하였다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 모든 DRD-유전자 돌연변이는 AcGFP를 불안정화하고 AcGFP 형광을 감소시키는 데 있어 효과적이었다. 결합 부위 돌연변이의 존재 시(FKBP13-043, FKBP13-044 또는 FKBP13-045), AcGFP가 안정화되고 형광 신호가 더 효과적으로 증가하였다. 이는 1 μM FK506에 대해 더 적은 반응성을 갖는 결합 부위 돌연변이가 없는 작제물에 의해 입증된다. 흥미롭게도, WT FKBP13(FKBP13-043)도 DRD 활성을 보였다.
FKBP13 DRD 중 임의의 것이 인간에서 달성 가능한 혈장 약물 농도보다 낮은 EC50 값을 갖는지를 확인하기 위해, 타크롤리무스 용량 반응 실험을 수행하였다. 결과는 전반적으로 타크롤리무스에 대한 반응이 결합 부위 돌연변이의 존재하에 개선되었음을 보여주었다(표 3).
[표 3]
예시적인 FKBP13 DRD에 대한 타크롤리무스 반응
Jurkat 세포에서 FKBP13-AcGFP-mCherry 작제물에서부터의 AcGFP의 조절을 또한 연구하였다. Jurkat, 클론 E6-1 세포를 표준 배지(RPMI+ GlutaMAX Supplement(Life Technologies, Carlsbad, CA 카탈로그 번호 61870127), 태아 소 혈청[Fetal Bovine Serum, FBS](Life Technologies 카탈로그 번호 10-082-147)에서 배양하였다. Jurkat 세포에 FKBP-039, FKBP-040, FKBP-041, FKBP-042, FKBP-043, FKBP-044, 또는 FKBP-045 작제물 각각을 이용하여 생산된 렌티바이러스를 형질도입시켰다. Jurkat 세포가 형질도입 마커로서 mCherry를 사용하여 형질도입 후 5일차에 측정된 바와 같이 10-25% 양성이 될 때까지 이에 형질도입시켰다. 형질도입 후 5일차에, 세포를 최고 농도 10 μM로 시작하는 용량의 타크롤리무스 또는 DMSO로 처리하였다. 24시간의 항온처리 기간 후, 타크롤리무스 또는 DMSO로 처리된 세포에서 GFP 발현을 측정하였다. mCherry+ 세포에서 GFP 발현의 기하 평균 형광 세기[Geometric Mean Fluorescent Intensity, MFI]를 플롯팅하고, 용량 반응 곡선 맞춤을 프리즘 소프트웨어(Prism Software)(San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. 용량 반응 곡선은 도 2에 제공되어 있다. FKBP-044 작제물은 최고의 EC50 및 배수 변화 특징을 가졌으며, 추가 FKBP13 DRD 개발을 위한 지침을 제공하였다.
또 다른 실험에서, 몇몇 FKBP13 DRD 작제물을 전술한 바와 같이 HEK293 세포에 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기[Celigo Image Cytometer](Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 도 4는 FKBP-044, FKBP-052, FKBP-053, FKBP-054, FKBP-055, FKBP-056, FKBP-057, FKBP-058, FKBP-059, FKBP-060, FKBP-061, FKBP-062, FKBP-063, 및 FKBP-064 작제물로 안정적으로 형질도입된 Jurkat 세포에 대한 타크롤리무스 용량 반응 FACS 데이터를 제공한다.
FKBP13의 결정 구조에 대해 두 개의 상이한 단백질 데이터 뱅크[Protein Data Bank, PDB] 코드(2PBC 및 4NNR)가 존재한다. 절두된 WT(서열 번호 2)에 상응하는 4NNR에서의 98번의 아미노산 서열과 달리, PDB ID 2PBC의 서열은 두 개의 돌연변이, H41G 및 C42S를 갖는다. 이황화물은 단백질 안정화에 종종 연루되기 때문에, FKBP13의 안정화에서의 이 이황화물 결합의 역할을 조사하였다. 작제물 FKBP-052, FKBP-062 및 FKBP-063은 무력화된 이황화물을 갖는다. FKBP-052 작제물은 야생형 FKBP13 서열을 갖는 반면, FKBP-062 및 FKBP-063 작제물은 FKBP-044 작제물과 동일한 DRD-유전자 돌연변이를 갖는데, FKBP-062 작제물은 시스테인에서 세린으로의 돌연변이 두 개를 갖는 반면, FKBP-063 작제물은 한 개만을 갖는다. 예기치 않게, 이황화물 결합을 무력화해도 도 4에서 도시된 바와 같이 DRD 기능에 유의한 차이가 생성되지 않았다.
[표 4]
결합 부위 돌연변이와 연관된 변화
잔기 번호 54에서의 메싸이오닌 및 93번 위치에서의 류신 대신에 다른 치환의 효과를 시험하기 위해, FKBP13 DRD 작제물을 생성하고, 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. FKBP-044(M54A), FKBP-066(M54K), FKBP-067(M54H), FKBP-068(M54S), FKBP-069(M54G), FKBP-070(M54D) 및 FKBP-071(M54V)에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선. FKBP-072(L93K)는 도 5에 도시되어 있다. FKBP-068은 성능 면에서 원래 M54A 치환물에 가장 가까웠다. FKBP-044, FKBP-073(L93H), FKBP-074(L93S), FKBP-075(L93G), FKBP-076(L93D), FKBP-077(L93V)에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 6에 도시되어 있다. FKBP-077은 FKBP-044와 유사하게 수행되었다.
또 다른 실험에서, FKBP13의 추가 절두의 가능성을 탐색하기 위해, 작제물(FKBP-044, FKBP-083, FKBP-084, FKBP-085, 및 FKBP-086)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 7에 도시되어 있다. DRD-유전자 M54A와 N-말단 히스티딘의 절두의 조합은 기저(FKBP-083)를 낮춘다.
또 다른 실험에서, 타크롤리무스에 대한 민감도를 개선시키도록 설계된 대안적인 결합 부위를 갖는 몇몇 작제물(FKBP-044, FKBP-087, FKBP-088, FKBP-089, FKBP-090, 및 FKBP-091)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 8에 도시되어 있다. DRD-유전자 돌연변이 M54A와 조합된 FKBP-044의 A117H 대신 돌연변이 A117W를 갖는 FKBP-091은 약물 반응성이 우수하다.
또 다른 실험에서, 추가적인 DRD-유전자 돌연변이를 탐구하기 위해 설계된 몇몇 작제물(FKBP-044, FKBP-092, FKBP-093, FKBP-094, FKBP-095, FKBP-096 및 FKBP-097)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 9에 도시되어 있다.
도 10은 FKBP-044, FKBP-059, FKBP-068, FKBP-077, FKBP-084, FKBP-085, FKBP-091, FKBP-094, FKBP-095, 및 FKBP-097 작제물로 안정적으로 형질도입된 Jurkat 세포에 대한 타크롤리무스 용량 반응 FACS 데이터를 제공한다. 이들 실험은 결합 부위 설계의 제2 라운드 및 목적 대상인 것으로서 이전에 확인된 일부 돌연변이체 M54S(068), L93V(077), L93A(059) 및 M54A(044)를 포함하였다. FKBP-091의 EC50은 본 실험에서 30 nM인 것으로 밝혀졌다. 표 5를 참조한다.
[표 5]
돌연변이와 연관된 EC 50 변화
다른 작제물(FKBP-091, FKBP-098, FKBP-099, FKBP-100, 및 FKBP-101)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 11에 도시되어 있다.
또 다른 실험에서, FKBP-091에서 확인된 결합 부위 돌연변이와 신규한 DRD-유전자 돌연변이를 조합하도록 설계된 몇몇 작제물(FKBP-091, FKBP-102, FKBP-103, FKBP-104, FKBP-105 및 FKBP-106)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 12에 도시되어 있다. 모든 작제물은 상이한 결합 부위(Q72R, Q84E, A117Y)를 갖는 FKBP-106 작제물을 제외하고, 2세대 결합 부위[즉, FKBP-091 내 결합 부위(Q72R, Q84E, A117W)]를 갖는다.
또 다른 실험에서, FKBP-091에서 확인된 결합 부위 돌연변이와 신규한 DRD-유전자 돌연변이를 조합하도록 설계된 몇몇 다른 작제물(FKBP-091, FKBP-107, FKBP-108, FKBP-109, FKBP-110, 및 FKBP-111)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 13에 도시되어 있다. 모든 작제물은 2세대 결합 부위[즉, FKBP-091 내 결합 부위(Q72R, Q84E, A117W)]를 갖는다.
또 다른 실험에서, FKBP-091에서 확인된 결합 부위 돌연변이와 신규한 DRD-유전자 돌연변이를 조합하도록 설계된 몇몇 작제물(FKBP-091, FKBP-112, FKBP-113, FKBP-114, FKBP-115 및 FKBP-116)을 전술한 바와 같이 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질주입시키고, 셀리고 이미지 세포측정기(Nexcelom, Lawrence, MA)를 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 14에 도시되어 있다.
실시예 2
타크롤리무스에 대한 민감도를 측정하기 위해, 작제물 FKBP-117 내지 FKBP-150을 사용하여 추가적인 실험을 수행하였다. 작제물 FKBP-117 내지 FKBP-150을 전술한 바와 같이 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입하고, 타크롤리무스에 대한 이들의 반응을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. FKBP-091을 비교 작제물로서 사용하였다. AcGFP에 대한 EC50 값, AcGFP/mCherry에 대한 EC50 값, 및 각각의 작제물에 대한 배수 변화는 표 6에 기재되어 있다. 작제물 FKBP-117 내지 FKBP-150에 대한 타크롤리무스 용량 반응 곡선은 도 15a-15j에 기재되어 있다.
[표 6]
작제물 FKBP-117 내지 FKBP-150에 대한 EC 50 값
작제물 FKBP-151 - FKBP-159를 타크롤리무스 및 시롤리무스(라파마이신) 민감도의 차이에 대해 분석하였다. 이러한 작제물은 FKBP13에 대한 결합 부위의 주변부에 돌연변이를 가지며, 이는 타크롤리무스 및 시롤리무스에 대한 차등적 민감도를 가능하게 하도록 설계되었다. 라파마이신 및 타크롤리무스의 형상 및 크기의 차이(도 3)를 사용하여, 이들 돌연변이체를 설계하였다. 대조군 FKBP-044 및 FKBP-117과 함께 작제물 FKBP-151 내지 FKBP-159를 전술한 바와 같이 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입하고, 타크롤리무스 또는 시롤리무스에 대한 이들의 반응을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 타크롤리무스 및 라파마이신에 대한 각각의 작제물에 대한 EC50 값, Norm EC50 값 및 배수 변화는 각각 표 7 및 표 8에 기재되어 있다. 정규화된 EC50 값을 샘플 간의 mCherry 세기의 임의의 차이를 설명하는 mCherry 정규화된 GFP MFI 값에서 계산하였다. 작제물 FKBP-151, FKBP-152 및 FKBP-153에 대한 타크롤리무스 대 라파마이신 용량 반응 곡선은 도 16a 및 16b에 도시되어 있다. 작제물 FKBP-153, FKBP-155 및 FKBP-157에 대한 타크롤리무스 대 라파마이신 용량 반응 곡선은 도 17a 및 17b에 도시되어 있다. 작제물 FKBP-154, FKBP-155 및 FKBP-156에 대한 타크롤리무스 대 라파마이신 용량 반응 곡선은 도 18a 및 18b에 도시되어 있다. 작제물 FKBP-157, FKBP-158 및 FKBP-159에 대한 타크롤리무스 대 라파마이신 용량 반응 곡선은 도 19a 및 19b에 도시되어 있다. 비교 작제물 FKBP-044 및 FKBP-117에 대한 타크롤리무스 대 라파마이신 용량 반응 곡선은 도 20a 및 20b에 도시되어 있다. 작제물 153, 155 및 157은 표 9에 도시된 바와 같이 라파마이신 및 타크롤리무스 사이에서 가장 큰 차이를 나타낸다.
[표 7]
작제물 FKBP-151 - FKBP-159에 대한 타크롤리무스 반응 값
[표 8]
작제물 FKBP-151 - FKBP-159에 대한 라파마이신 반응 값
[표 9]
타크롤리무스 및 라파마이신에 대해 보고된 EC 50 및 배수 변화의 비
실시예 3
구성적으로 발현된 AcGFP 풍부도를 FKBP13/타크롤리무스 조절된 AcGFP 풍부도 수준과 비교하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. FKBP13을 목적 단백질(즉, AcGFP)에 융합시켜, AcGFP의 최대 풍부도에 대한 효과를 조사하였다. 작제물 FKBP-044, FKBP-059 및 FKBP-091 및 AcGFP-001을 이전에 기재된 바와 같이 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입하고, 용량 반응 실험을 수행하였다. MFI를 유세포 분석기에 의해 판독하였다(도 21). 조절된 FKBP13은 구성적 AcGFP MFI 값의 대략 70%에 도달하였다.
실시예 4
작제물 FKBP-160-292에 대해 추가적인 실험을 수행하였다. 작제물은 표 10에 도시되어 있고, Cas9 스크리닝을 위한 상위 30개의 약물 반응성 도메인은 표 11에 도시되어 있다.
[표 10]
FKBP-160-292 작제물 서열
[표 11]
Cas9 스크리닝에 대한 상위 30개의 약물 반응성 도메인[DRD]
[표 12]
FKBP 작제물 160-255에 대한 Ec50 및 Ec90 값
Norm은 mCherry로 정규화되고, Ec50 및 Ec90은 uM 단위이고, ND = 결정되지 않음이며, 초기 분석 동안 > 10의 배수 변화를 가졌던 작제물만을 Ec50에 대해 검정하였다.
[표 13]
FKBP 작제물 160-255에 대한 Ec50 및 Ec90 값
Ec50 및 Ec90은 μM 단위이다. ND: 검출되지 않음.
FKBP 작제물에 대한 라파마이신 및 타크롤리무스 반응 값
작제물 돌연변이 타크롤리무스 라파마이신
EC50 EC50
(Norm) 		EC 90 EC90
(Norm) 		FC EC50 EC50
(Norm) 		EC90 EC90
(Norm) 		FC
FKBP-91 Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
M54A 		0.0260 0.0268 0.111 0.1173 12.4 0.1009 0.0935 0.398 0.4141 3.2
FKBP-117
Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
V85R 		0.0075 0.0077 0.025 0.02716 21.2 0.0455 0.0440 0.17 0.1712 7.6
FKBP-153 Q72R,
S79W,
Q84E,
A117W
DRD
M54A		 0.0908 0.0951 0.341 0.3829 39.7 0.4874 0.4857 1.518 1.538 6.1
FKBP-155 Q72R,
S79W,
Q84R,
A117W
DRD
M54A		 0.2137 0.2264 0.808 0.947 61.3 0.3377 0.3289 1.145 1.181 7.5
FKBP-157 Q72R,
T82W,
Q84E,
A117W
DRD
M54A		 0.2948 0.3130 1.145 1.321 63.5 0.2823 0.2877 1.012 1.077 11.2
FKBP-166 Q72R,
S79W,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
V85R		 0.043 0.0439 0.22 0.2226 46 0.508 0.4997 1.635 1.582 15.7
FKBP-167 Q72R,
S79W,
Q84R,
A117W
DRD
M54A
V85R		 0.071 0.0694 0.348 0.3345 46.8 0.597 0.5891 1.72 1.711 11.3
FKBP-168 Q72R,
T82W,
Q84R,
A117W
DRD
M54A
V85R		 0.064 0.0646 0.342 0.3511 60.2 0.336 0.3221 1.385 1.333 18
FKBP-169 Q72R,
T82W,
Q84E,
A117W
DRD
M54A		 0.099 0.1031 0.448 0.4929 50.1 0.405 0.4007 1.391 1.416 10.8
FKBP-170 Q72R,
T82W,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
V85R		 0.03 0.0307 0.133 0.1384 47.6 0.224 0.2226 0.785 0.818 16.1
FKBP-171 Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
D50L		 1.734 1.916 8.161 10.14 60.3 6.116 6.508 15.98 18.01 14.1
FKBP-172 Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
M96W		 0.156 0.1633 1.046 1.306 63.1 0.572 0.5717 2.136 2.293 21.3
FKBP-177 Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
L80G		 4.377 5.07 18.68 23.86 22.3 4.138 4.223 5.281 6.331 2.3
FKBP-178 Q72R,
Q84E,
A117W
DRD
M54A
F78S		 4.287 4.983 22.34 28.45 36.4 7.477 46.4 16.82 151 2.9
FKBP-181 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
D50L		 0.502 0.7223 14.08 5.057 52 4.413 4.235 11.84 11.48 15.5
FKBP-182 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A M96W		 0.134 0.1386 0.819 0.9284 64.9 1.187 1.217 3.84 4.112 21.5
FKBP-185 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
D50L,
T57I,
I136L		 4.953 5.149 22.09 23.43 40.2 4.105 8.368 5.338 22.03 2
FKBP-186 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
G116E		 4.328 4.837 17.92 20.96 19 4.265 4.14 5.868 5.224 1.7
FKBP-187 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
L80G		 3.29 4.192 14.51 21.3 24 4.173 4.086 5.311 5.661 2.3
FKBP-188 Q72R,Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
F78S		 3.693 4.297 16.58 20.82 20.5 4.228 4.124 5.41 5.831 2.6
FKBP-189 Q72R,
Q84E,
A117W
V85R
DRD
M54A
H53G
R72L		 6.078 6.79 25.83 30.11 23 4.384 4.157 5.467 5.526 2.5
타크롤리무스에 대해 더 특이적이고 라파마이신에 덜 반응하도록 조작된 작제물. FKBP-91 및 FKBP-117은 이 실험에서 대조군이다. Ec50 및 Ec90은 μM 단위이다.
도 22-38은 FKBP-160-292의 특성분석의 결과를 도시한다. 작제물을 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입하였고, 타크롤리무스에 대한 이들의 반응을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. FKBP-091 및 FKBP-117을 FKBP-160-FKBP-255에 대한 비교 대조군으로서 사용하였다. FKBP-195를 FKBP-256-FKBP-275에 대한 비교 대조군으로서 사용하였다. FKBP-117, FPBP-195 및 FKBP-251을 FKBP-276-FKBP-292에 대한 비교 대조군으로서 사용하였다.
[표 15]
도 29 및 30의 그래프에 대한 Ec50 값
[표 16]
도 31 및 32의 그래프에 대한 Ec50 값
[표 17]
도 33 및 34의 그래프에 대한 Ec50 값
[표 18]
도 35의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 19]
도 36의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 20]
도 37의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 21]
도 38의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
도 39-50은 Cas9 스크리닝에서 상위 DRD의 추가의 조작, 특히, 다른 아미노산으로 돌연변이시키거나 M54A 돌연변이를 뺀 작제물의 직접적인 비교를 제공하는 것에서의, 결과를 도시한다.
[표 22]
도 39의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 23]
도 40의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 24]
도 41의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 25]
도 42의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 26]
도 43의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 27]
도 44의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 28]
도 45의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 29]
도 46의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 30]
도 47의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 31]
도 48의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 32]
도 49의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
[표 33]
도 50의 그래프에 대한 Ec50, FC 및 피크 값
도 51-54는 타크롤리무스 혈청 실험의 결과를 도시한다. 타크롤리무스 희석물을 도 51-54에 도시된 바와 같이 각각의 FBS% 내에서 제조하였다. FBS를 증가시키면서 항온처리하면 80% FBS에서 Ec50이 2배 증가한다.
[표 34]
도 51의 작제물 FKBP-195에 대한 Ec50 값
[표 35]
도 52의 작제물 FKBP-251에 대한 Ec50 값
[표 36]
도 53의 작제물 FKBP-195에 대한 Ec50 값
[표 37]
도 54의 작제물 FKBP-251에 대한 Ec50 값
실시예의 결과를 요약하기 위해, 풀링된 포화 돌연변이유발 라이브러리 스크리닝에서 발견된 FKBP 돌연변이체의 초기 특성분석에서는 원래의 결합 부위 돌연변이(Q72R, Q84E, A117W)와 조합될 때 FKBP/타크롤리무스 Ec50을 5 nM로 유의하게 감소시키는 V85R 돌연변이(FKBP-117)를 확인하였다. 작제물 FKBP-117에서 생성된 특성을 추가로 개선하기 위해, 일련의 조합 돌연변이체(FKBP-160 - FKBP-255)를 만들어, 단백질 조절에 대한 유리한 DRD 특성(< 50 nM Ec50 및 타크롤리무스의 부재하의 낮은 기저 오프[basal off] 상태)을 생성하는 FKBP 작제물을 확인하였다. AcGFP 발현을 판독값으로서 사용하여 FKBP 돌연변이 조절을 평가하기 위해, FKBP 돌연변이체를 AcGFP로 융합 단백질을 만드는 방식으로 클로닝하였다. 작제물을 Jurkat 세포 내로 안정적으로 형질도입하였고, 타크롤리무스에 대한 이들을 반응을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 이어서, 10 uM 타크롤리무스 투약에 반응하여 AcGFP 발현에서 > 10의 배수 변화를 가졌던 FKBP 돌연변이체를 타크롤리무스 용량 반응으로 추가로 스크리닝하여, 이들 작제물에 대한 Ec50을 측정하였다. FKBP-195, FKBP-228 및 FKBP-251은 Ec50 값이 각각 35 nm, 19 nM 및 30 nm인 가장 낮은 기저 발현을 생성하는 상위 FKBP 작제물로 나타났다. FKBP-215는 Ec50이 90 nM인 가장 낮은 기저 AcGFP 발현을 나타내었. 본 발명자들은 FKBP DRD 특성을 추가로 개선할 수 있는지 확인하기 위해 이러한 초기 조합 돌연변이체에서 추가 반복 FKBP 돌연변이체(FKBP-256 - FKBP-292)를 작제하였다. FKBP-272를 K135Y 돌연변이를 K135L로 변화시켜 FKBP-195에서 작제하였으며, 이는 유사한 Ec50이지만 더 낮은 기저 AcGFP 발현을 초래하였다. FKBP-263은, Ec50을 30 nM으로 개선하면서 낮은 기저 AcGFP 발현을 유지하는 M54A 돌연변이를 제거한 FKBP-215를 기반으로 하였다.
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Claims (51)

  1. (a) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체, 및
    (b) 생물학적 활성을 갖는 페이로드를 암호화하는 핵산으로서,
    상기 핵산의 발현 시, 상기 FKBP13은 상기 페이로드에 작동 가능한 상태로 연결되는, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산의 발현 시, 상기 FKBP13은 유효량의 상기 리간드와 상호 작용하여, 상기 페이로드의 상기 생물학적 활성을 조절하는, 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13은 서열 번호 1의 변이체인, 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 변이체는 리간드 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 FK506, 라파마이신, 또는 FK506과 라파마이신 둘 모두인, 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 변이체는 라파마이신에 대한 반응보다 FK506에 대한 반응으로 상기 페이로드의 상기 생물학적 활성을 조절하는, 핵산.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 변이체는 FKBP13의 단편인, 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 변이체는 FKBP13의 C-말단 단편인, 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 서열을 추가로 암호화하는 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 포함하는, 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 상기 핵산분해효소는 Cas9 핵산내부분해효소인, 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 Cas9 핵산내부분해효소는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9(Staphylococcus aureus Cas9, SaCas9) 또는 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis, SluCas9)인, 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 안내 RNA를 추가로 암호화하는 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 핵산은 AAV 벡터 내에 프로모터 서열, 안내 RNA, 및 Cas9 핵산내부분해효소 페이로드를 암호화하는 서열을 갖는 단일 뉴클레오타이드 서열로서 패키징되도록 구성되고, 상기 프로모터 서열, 상기 안내 RNA 및 상기 Cas9를 암호화하는 상기 서열은 적어도 3,000개의 염기 쌍을 포함하는, 핵산.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 단편은 100개 미만의 아미노산인, 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP 단편은 90-99개의 아미노산인, 핵산.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13 단편은 서열 번호 2와 적어도 85%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는, 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암호화된 FKBP13은 서열 번호 3-109에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산.
  19. FK506에 대한 결합 부위에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 유전자 변형 FKBP13.
  20. 제19항에 있어서, 상기 FKBP13은 서열 번호 1의 C-말단 단편인, 유전자 변형 FKBP13.
  21. 제20항에 있어서, 서열 번호 3-66에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유전자 변형 FKBP13.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FKBP13 단편은 상기 리간드 결합 부위에 돌연변이가 없는 대조군 FKBP13 단편보다 라파마이신에 대해 더 낮은 결합 친화도를 갖는, 유전자 변형 FKBP13.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FKBP13은 상기 리간드 결합 부위에 돌연변이가 없는 대조군 FKBP13 단편보다 FK506에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는, 유전자 변형 FKBP13.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 페이로드는 상기 FKBP13 또는 이의 변이체에 작동 가능한 상태로 연결되고, 생물학적 시스템에서 상기 페이로드의 활성은 상기 FKBP13과 접촉하는 상기 리간드의 농도에 의해 조절 가능한, 재조합 폴리펩타이드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물학적 시스템에서 상기 FKBP13 또는 이의 변이체에 대한 FK506의 EC50은 상기 생물학적 시스템에서 FK506의 Cmax보다 약 2배 내지 약 20배 더 낮은, 재조합 폴리펩타이드.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 생물학적 시스템은 조직 또는 세포인, 재조합 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 생물학적 시스템은 포유류의 혈액인, 재조합 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 벡터.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 암호화된 페이로드는 RNA-안내된 핵산내부분해효소이고, 상기 벡터는 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA 서열을 추가로 포함하는, 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 상기 벡터는 하나 이상의 역위 말단 반복 서열을 추가로 포함하는 벡터.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인 세포.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 근육 세포, 줄기 세포 또는 림프구인 세포.
  36. 재조합 세포를 생산하는 방법으로서, 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인, 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 근육 세포, 줄기 세포 또는 림프구인, 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포.
  41. 세포에서 페이로드를 조절하는 방법으로서,
    (a) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계로서, 상기 핵산은 프로모터 서열 및 상기 페이로드를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 단계; 및
    (b) 상기 세포를 유효량의 상기 리간드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  42. 세포 내 표적 DNA를 변형시키는 방법으로서,
    (a) (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소-암호화 핵산, 및
    (2) 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 안내 RNA를 포함하는 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 벡터-함유 세포를 유효량의 리간드와 접촉시켜 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 상기 안내 RNA와 상호 작용하고, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 상기 세포 내 상기 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는, 단계를 포함하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 벡터는 AAV 벡터인, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 포유류 세포는 인간 세포인, 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 근육 세포, 줄기 세포 또는 림프구인, 방법.
  47. 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 유전자 변형 세포.
  48. 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법으로서,
    (a) (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및
    (2) 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 안내 RNA를 포함하는 벡터를 상기 대상의 하나 이상의 세포 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 벡터-함유 세포 하나 이상을 유효량의 리간드와 접촉시켜 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 상기 안내 RNA와 상호 작용하고, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 상기 대상의 하나 이상의 세포의 표적 DNA에 특이적으로 결합하고 이를 절단하는, 단계를 포함하는 방법.
  49. 유전자 변형에 반응하는 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 방법으로서,
    (a) 벡터를 포함하는 하나 이상의 세포를 상기 대상에게 투여하는 단계로서, 상기 벡터는
    (1) 리간드에 반응하는 FKBP13 또는 이의 변이체를 암호화하는 서열, 프로모터 서열, 및 RNA-안내된 핵산내부분해효소를 암호화하는 서열을 포함하는 RNA-안내된 핵산내부분해효소 암호화 핵산, 및
    (2) 상기 하나 이상의 세포의 게놈 내 표적 DNA에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소와 상호 작용하도록 구성된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안내 RNA를 포함하는, 단계;
    (b) 유효량의 리간드를 상기 대상에게 투여하여 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소의 활성을 유도하는 단계로서, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 상기 안내 RNA와 상호 작용하고, 상기 RNA-안내된 핵산내부분해효소는 하나 이상의 세포의 게놈을 특이적으로 변형시키는, 단계를 포함하는 방법.
  50. 대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제47항의 하나 이상의 유전자 변형 세포를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 뒤시엔느 근이영양증, 근긴장 이영양증, 낭포성 섬유증, 겸상 적혈구, 베타 지중해 빈혈, 알파-1 항트립신 결핍증, APOL1-매개 신장 질환 또는 1형 당뇨병인, 방법.
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