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KR20210064269A - 동결보존된 종양 샘플로부터의 til의 확장 - Google Patents

동결보존된 종양 샘플로부터의 til의 확장 Download PDF

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KR20210064269A
KR20210064269A KR1020217011191A KR20217011191A KR20210064269A KR 20210064269 A KR20210064269 A KR 20210064269A KR 1020217011191 A KR1020217011191 A KR 1020217011191A KR 20217011191 A KR20217011191 A KR 20217011191A KR 20210064269 A KR20210064269 A KR 20210064269A
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tumor tissue
tumor
tils
til
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KR1020217011191A
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Inventor
아난드 비라파쓰란
케네스 온니무스
Original Assignee
이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
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Publication date
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Abstract

동결보존된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 및 암을 포함한 인간 질환의 치료에서 확장된 TIL을 사용하는 방법이 개시된다. 동결을 위한 종양 조직을 제조하는 것은 종양 조직을 단편화하는 단계 및 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 동결보존 배지에서 2℃ 내지 8℃에서 약 30 내지 약 80분 동안 인큐베이션될 수 있다. 단편을 동결시키는 단계는, 예를 들어 건조 크리오쉬퍼를 사용하여 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존된 종양 조직의 조성물이 개시된다.

Description

동결보존된 종양 샘플로부터의 TIL의 확장
관련 출원에 대한 상호 참조
본 국제 PCT 출원은 2018년 9월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 62/733,937 및 2019년 7월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/879,881을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본원에 기재된 본 발명은 일반적으로 림프구의 확장, 보다 구체적으로, 배타적이지는 않지만, 동결보존된 종양 조직으로부터의 림프구의 확장에 관한 것이다.
종양 침윤 림프구 (TIL)의 입양 전달을 사용한 불응성 암의 치료는 불량한 예후를 갖는 환자를 치료하기 위한 잠재적으로 강력한 접근법을 나타낸다. 문헌 [Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 성공적인 면역요법은 다수의 TIL을 필요로 하고; 따라서, 제조 및 상업화를 위해 강건하고 신뢰할 수 있는 공정이 필요하다. 상업화를 위한 이러한 규모조정은 세포 확장에 있어서의 많은 기술적, 물류적 및 규제적 문제로 인해 엄청난 도전과제였다. IL-2-기반 TIL 확장에 이은 "급속 확장 공정" (REP)은 그의 효율로 인해 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되어 왔다. 문헌 [Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP는 14-일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 가져올 수 있지만, 이는 종종 피더 세포로서 다수의 공여자로부터의 방사선조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC, 또한 단핵 세포 (MNC)로도 공지됨)를 과량 (예를 들어, 200배)으로 필요로 할 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT3) 및 고용량의 IL-2를 필요로 한다. 문헌 [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP 절차를 겪은 TIL로 일부 흑색종 환자에서 숙주 면역억제 후에 성공적인 입양 세포 요법이 가능해졌다.
현행 TIL 제조 공정은 본원에 기재된 지속기간, 비용, 멸균 우려 및 다른 인자에 의해 제한되어 이러한 공정을 상업화할 가능성이 심하게 제한된다. 현행 공정의 많은 제한 중에는 제조를 개시하기 위해 신선한 종양 조직에 의존한다는 것이 있으며, 이는 종종 신선한 종양을 보다 먼 거리로 운송하는데 있어서의 어려움 때문에 고가 및 고비용의 현지 제조 시설을 필요로 한다. 신선한 종양 조직에 의존하지 않으며 지리적으로 널리 분포된 인간 환자에서 사용하기 위한 상업적 규모 제조 및 규제 승인에 적절한 TIL 제조 공정 및 요법을 제공하는 것이 시급히 필요하다.
한 실시양태에서, 본 발명은 동결된 종양 조직을 출발 TIL 공급원 물질로서 사용하여 치료적 TIL 집단을 생산하는 TIL 확장 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위해 종양 조직을 동결보존하는 방법을 제공한다:
(i) 종양 조직을 단편화하는 단계;
(ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편을 제공한다:
(i) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편을 제공한다:
(i) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(ii) 약 10% v/v 디메틸술폭시드를 포함하는 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 단편을 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 조직을 동결시키는 단계;
(d) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 2 내지 12% v/v (부피:부피) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5 내지 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 1% v/v, 2% v/v, 3% v/v, 4% v/v, 5% v/v, 6% v/v, 7% v/v, 8% v/v, 9% v/v, 10% v/v, 11% v/v, 12% v/v, 13% v/v, 14% v/v 및 15% v/v로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 저장 배지의 나머지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 2 내지 12% w/w (중량:중량) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5 내지 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 1% w/w, 2% w/w, 3% w/w, 4% w/w, 5% w/w, 6% w/w, 7% w/w, 8% w/w, 9% w/w, 10% w/w, 11% w/w, 12% w/w, 13% w/w, 14% w/w 및 15% w/w로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 저장 배지의 나머지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 45분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 5% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 10% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 용기를 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(b) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(c) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(d) 용기를 동결시키는 단계;
(e) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계;
(d) 용기를 해동시키는 단계;
(f) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(g) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(h) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 1.5 mm 내지 6 mm 직경 및 1.5 mm 내지 6 mm 두께로 트리밍된다. 또 다른 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 약 6 mm x 6 mm x 6 mm로 트리밍된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항박테리아제는 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 겐타미신을 적어도 50 μg/mL의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제, 항진균제 및 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 암포테리신 B이고, 약 0.25 μg/mL 내지 약 2.5 μg/mL로 존재한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 펀진이고, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL로 존재한다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 상기 방법의 동결 단계를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 또는 또 다른 적합한 배지 또는 용액 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃의 온도에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 방법은 인간 대상체로부터의 신선한 종양 샘플을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 단계 (c)와 제2 확장 단계 (e) 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 종양 단편을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(d) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (c)에서 단계 (d)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(e) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 (g)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(i) 대상체에게 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계;
(f) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계;
(g) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(h) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(i) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (h)에서 단계 (i)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(j) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (i)에서 단계 (j)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(k) 단계 (j)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (j)에서 단계 (k)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(l) 단계 (k)에서 수거된 치료적 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (k)에서 (l)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(m) 단계 (l)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(n) 대상체에게 단계 (m)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 흑색종, 불응성 흑색종, 전이성 흑색종 및 비소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 조직을 동결시키는 단계;
(d) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(e) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(f) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(g) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(h) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 용기를 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 상기 방법의 동결 단계를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃의 온도에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (i) 내지 (k)는, 적용가능한 경우, 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (i) 내지 (k)는, 적용가능한 경우, 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (i) 내지 (k)는, 적용가능한 경우, 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (i) 내지 (k)는, 적용가능한 경우, 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(e) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 단계 (g)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 치료적 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (g)에서 (h)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(i) 단계 (h)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(j) 대상체에게 단계 (i)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 상기 방법의 동결 단계를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃의 온도에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 단계와 제2 확장 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 확장 방법은 약 16일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 확장 방법은 제1 확장 단계 (사전REP 단계) 및 제2 확장 단계 (REP 단계)를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 3 내지 약 5일이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 3일이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 5일이다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 11 내지 약 13일이다. 또 다른 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 11일이다. 또 다른 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 13일이다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 5일이고, 제2 확장 단계는 약 11일이다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 단계는 약 3일이고, 제2 확장 단계는 약 13일이다.
일부 실시양태에서, TIL은 제2 확장 단계 동안 추가의 용기 내로 분할된다. 일부 실시양태에서, TIL은 제2 확장 단계의 제5일에 분할된다. 일부 실시양태에서, TIL은 제2 확장 단계의 제6일에 분할된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 11일이고, TIL은 제2 확장 단계의 제5일에 분할된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 13일이고, TIL은 제2 확장 단계의 제6일에 분할된다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 단계는 3일이고, 제2 확장 단계는 13일이고, TIL은 제2 확장 단계의 제6일 (총 공정의 제9일)에 분할된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 단계는 5일이고, 제2 확장 단계는 11일이고, TIL은 제2 확장 단계의 제5일 (총 공정의 제10일)에 분할된다.
일부 실시양태에서, 피더 세포는 제2 확장 단계 동안 사용된다. 한 실시양태에서, 1/100 규모 공정에서, 약 2-50 x 106개 피더 세포가 제2 확장 단계 동안 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 약 25 x 106개 피더 세포가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 약 50 x 106개 피더 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, 전체 규모 공정에서, 약 2-50 x 109개 피더 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, 전체 규모 공정에서, 약 2.5x109 또는 약 5x109개 피더 세포가 사용된다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 PBMC이다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 약 5 x 106 내지 약 200 x 106개 TIL로 시딩된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 제1 확장 단계로부터의 TIL의 약 5% 내지 약 25%로 시딩된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 제1 확장 단계로부터의 TIL의 약 10% 내지 약 20%로 시딩된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 단계는 제1 확장 단계로부터의 TIL의 약 10%로 시딩된다.
다른 실시양태는 이들 조성물 및 방법의 조합 및 변형을 포함한다.
상기 개요뿐만 아니라 하기 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 보다 잘 이해될 것이다.
도 1: 단계 B에서의 단편화 후 신선한 종양 조직의 임의적인 동결보존을 포함하는, 2A 공정의 한 실시양태의 주요 단계를 도시한다. 제1 확장 배양의 개시로부터 단계 E의 종료까지의 총 시간은 약 22일이다.
도 2: 패널 a 내지 c는 나중에 사전REP 배양의 개시가 가능하도록 신선한 종양 단편의 동결보존을 포함하는, TIL 제조 공정의 한 실시양태의 다양한 단계를 도시한다.
도 3: 나중에 사전REP 배양을 개시하는데 사용되는 신선한 종양 단편의 동결보존을 포함하는, TIL 제조의 한 실시양태를 도시한다.
도 4: 나중에 사전-REP 배양을 개시하는데 사용되는 신선한 종양 단편의 동결보존을 포함하는, TIL 제조의 한 실시양태를 도시한다.
도 5: 일반적으로 공정 1C의 한 실시양태를 공정 2A의 예시적인 실시양태와 비교한다. 공정 2A는 신선한 종양 조직 단편 또는 해동된 동결보존된 종양 조직 단편으로부터의 사전-REP 배양의 개시를 고려한다.
도 6: 공정 1C의 실시양태를 공정 2A의 실시양태와 추가로 비교한다.
도 7: REP가 "초기" 개시되는 2A 공정의 한 실시양태를 도시한다.
도 8: Gen 2A 공정 및 "Gen 2.2"로 표시된 변형된 Gen 2A 공정으로부터 유래된 총 생존 세포를 비교하며, 여기서 사전-REP 배양은 신선한 것, 급속 동결된 것, 또는 저장 배지에서 2℃ 내지 8℃에서 30분 또는 60분 인큐베이션 후에 동결된 것으로 개시된다. 세포 수는 사전-REP 배양의 종료시의 것이다.
도 9: Gen 2A 공정 및 "Gen 2.2"로 표시된 변형된 Gen 2A 공정으로부터 유래된 총 생존 세포를 비교하며, 여기서 사전-REP 배양은 신선한 것, 급속 동결된 것, 또는 저장 배지에서 2℃ 내지 8℃에서 30분 또는 60분 인큐베이션 후에 동결된 것으로 개시된다. 세포 수는 REP 배양의 종료시의 것이다.
도 10: Gen 2A 공정 및 "Gen 2.2"로 표시된 변형된 Gen 2A 공정으로부터 유래된 세포에 의해 생산된 IFN-γ를 비교하며, 여기서 사전-REP 배양은 신선한 것, 급속 동결된 것, 또는 저장 배지에서 2℃ 내지 8℃에서 30분 또는 60분 인큐베이션 후에 동결된 것으로 개시된다.
도 11: Gen 2 실시양태의 주요 단계를 Gen 2.2 실시양태의 주요 단계와 비교하여 도시한다.
도 12: 1/100 규모 TIL 생산 공정의 주요 단계를 도시한다.
도 13: 도 13a-13e는 5명의 상이한 환자로부터 가공되고 사전-REP 동안 수집된 종양 샘플에 대한 총 생존 세포 (TVC)를 도시한다. 신선한 (Gen2 대조군) 및 동결된 종양 샘플을 사용하여 TVC를 측정하였다. 신선한 종양 샘플에 대해 제11일에 또는 동결된 종양 샘플에 대해 제7일에 TVC를 기록하였다. 도 13a (환자 M1125)는 종양 샘플이 다음 상이한 동결 방법들에 적용된 환자만을 보여준다: 액체 질소의 증기 상 중 급속 동결, 및 액체 질소의 증기 상 중 급속 동결 전 2-8℃에서 30 또는 60분 동안 인큐베이션. 나머지 환자 S13018, OV8022, T6042 및 O8026 (각각 도 13b-13e)에 대해, 종양 샘플을 급속 동결 전 2-8℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 환자에 대해, 종양 샘플을 3mm 직경의 단편으로 절편화하고, 4-6개의 단편을 배양에 사용하였다. 그래프 상의 각각의 막대는 전체 규모로 외삽된 TVC (10을 곱함)를 나타낸다. 도 13a에서, 동결된 초기 사전-REP 배양물은 신선한 경우와 비교하여 약 1% TVC를 생성하였고, 도 13b에서는 신선한 경우와 비교하여 약 25% TVC를, 도 13c에서는 신선한 경우와 비교하여 약 200%를, 도 13d에서는 신선한 경우와 비교하여 약 96%를, 도 13e에서는 신선한 경우와 비교하여 약 3%를 생성하였다. 데이터는 제7일에 동결된 종양 샘플로부터의 TVC가 제11일에 신선한 종양 샘플로부터의 TVC와 대등하다는 것을 나타낸다.
도 14: 도 14a-14e는 초기 REP 동안 수집된, 도 13과 동일한 5명의 환자로부터의 종양 샘플에 대한 TVC를 도시한다. 세포를 도 13에 기재된 바와 같이 제11일 (신선) 및 제7일 (동결)에 수거하였다. 도 14a에서, 동결된 초기 REP 배양물은 신선한 경우와 비교하여 약 86% TVC를 생성하였고, 도 14b에서는 신선한 경우와 비교하여 약 98% TVC를, 도 14c에서는 신선한 경우와 비교하여 약 124%를, 도 14d에서는 신선한 경우와 비교하여 약 286%를, 도 14e에서는 신선한 경우와 비교하여 약 167%를 생성하였다. 데이터는 초기 REP 동안 제7일에 동결된 종양 샘플로부터의 전체 수율 (TVC로서 측정됨)이 제11일에 신선한 종양 샘플로부터의 TVC와 대등하다는 것을 나타낸다.
도 15: 도 15는 4명의 환자로부터의 신선한 및 동결된 종양 샘플 내의 CD8/CD4 비를 도시한다. 신선한 또는 동결된 REP TIL 샘플을 유동 세포측정 항체 (CD3-BUV395, CD62LBV421, CD57-PB, CD11c-BV711, CD28-BB515, CD19-BUV563, CCR7-PE, CD123-BV605, CD27PE-CF594, CD14-BV-650, TCRg/d-APC, CD45-PerCP-Cy5.5, CD45RA-A700, CD56-BUV737, CD8-BV786, CD4-PE-Cy7AND CD16-APC-Vio770)로 염색하였다. TIL의 정체는 TCR a/b+ 또는 g/d+, 단핵구 (CD14+), NK (CD56+, CD16+, CD56+/CD16+) 및 B 세포 (CD19+)에 기초하여 결정하였고, 순도는 CD3+CD45+ 세포에 기초하여 결정하였다. 환자 M1125 및 T6042는 높은 CD8 발현을 나타냈지만, 전체 CD8/CD4 비는 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이에 대등하다.
도 16: 도 16a-16h는 도 15와 동일한 4명의 환자에서의 CD3+CD45+ 발현 및 다른 마커 발현을 도시한다. 도 16a 및 16b는 환자 M1125에 대한 데이터를; 도 16c 및 16d는 환자 S13018에 대한 데이터를; 도 16e 및 16f는 환자 OV8022에 대한 데이터를; 도 16g 및 16h는 환자 T6042에 대한 데이터를 도시한다. 데이터는 TIL 순도가 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이에 대등하다는 것을 보여준다.
도 17: 도 17a-17c는 신선한 및 동결된 종양 샘플로부터의 CD4 또는 CD8 발현 세포에서의 CD28, CD27 및 CD57의 발현을 예시한다. 도 17a는 환자 M1125에 대한 것이고; 도 17b는 환자 S13018에 대한 것이고, 도 17c는 환자 T6042에 대한 것이다. 데이터는 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이의 분화 상태가 대등하다는 것을 보여준다.
도 18: 도 18a-18c는 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 CD4 또는 CD8 발현 세포의 기억 상태를 도시한다. 도 18a는 환자 M1125에 대한 것이고; 도 18b는 환자 S13018에 대한 것이고, 도 18c는 환자 T6042에 대한 것이다. 데이터는 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이의 기억 상태가 대등하다는 것을 보여준다. TN: 나이브 (CD45RA+CCR7+), TCM: 중앙 기억 (CD45RA-CCR7+), TEM: 이펙터 기억 (CD45RA-CCR7-), TEMRA/TEFF: RA+ 이펙터 기억/이펙터 (CD45RA+CCR7), 중앙 기억/활성화된 세포 (CD45RA+CD62L+). 제시된 막대 그래프는 CD4+ 또는 CD8+에 대해 게이팅된 경우 양성 CD45+/- 또는 CCR7+/- 또는 CD62L+/- 백분율이다.
도 19: 도 19a-19c는 3명의 환자: M1125 (도 19a); S13018 (도 19b); 및 T6042 (도 19c)에서 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 CD4 (상부 패널) 또는 CD8 (하부 패널) 발현 세포의 활성화/소진 마커를 예시한다. REP TIL의 활성화 및 소진을 다색 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 종양 조직을 항체 (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-다즐 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-비오그린, TIGIT-PerCP-이플루오르 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-이플루오르 780)로 염색하고, 유동 세포측정법을 사용하여 발현을 측정하였다. 종합하면, TIL 활성화/소진 상태는 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이에 대등하다.
도 20: 도 20a-20c는 3명의 환자: M1125 (도 20a); S13018 (도 20b); 및 T6042 (도 20c)에 대한 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 IFNγ 기능을 예시한다. 1x105개 REP TIL을 항-CD3 플레이트에 24시간 동안 플레이팅하였다. 배양물 상청액을 수집하고, IFNγ 퀀티킨 ELISA 키트를 사용하여 IFNγ 시토카인에 대해 측정하였다. 막대 그래프는 여기서 삼중 측정의 평균 + SD를 나타낸다. 스튜던트 't' 검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <0.001. 종합하면, 데이터는 IFN-γ 기능이 동결된 종양 샘플에서 더 높다는 것을 입증한다.
도 21: 도 21a-21c는 3명의 환자: M1125 (도 21a); S13018 (도 21b); 및 T6042 (도 21c)에 대한 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 그랜자임 B (GzmB) 기능을 예시한다. 1x105개 REP TIL을 항-CD3 플레이트에 24시간 동안 플레이팅하였다. 배양물 상청액을 수집하고, 듀오 세트 ELISA 키트를 사용하여 그랜자임 B에 대해 측정하였다. 막대 그래프는 여기서 삼중 측정의 평균 + SD를 나타낸다. 스튜던트 't' 검정을 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P <0.001. 종합하면, 데이터는 그랜자임 B (GzmB) 기능이 동결된 종양 샘플에서 대등/더 높다는 것을 입증한다.
도 22: 도 22a-22c는 3명의 환자: M1125 (도 22a); S13018 (도 22b); 및 T6042 (도 22c)에 대한 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 CD107A 발현을 예시한다. 2x105개 REP TIL을 2시간 동안 PMA/IO의 자극 없이 또는 그로 자극한 다음, CD107A-APC700에 대해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 막대 그래프는 CD8 또는 CD4에 대해 게이팅된 CD107A 양성 세포를 나타낸다. 종합하면, 데이터는 CD107A 발현이 신선한 종양 샘플과 동결된 종양 샘플 사이에 대등하다는 것을 입증한다.
도 23: 도 23a-23c는 3명의 환자: M1125 (도 23a); S13018 (도 23b); 및 T6042 (도 23c)에 대한 신선한 및 동결된 종양 샘플에서의 1301 세포 대비 텔로미어 길이를 예시한다. 유동-FISH를 다코(Dako)/애질런트(Agilent) 병리학 용액 (유동 세포측정법을 위한 텔로미어 PNA 키트/FITC) 키트를 사용하여 수행하고, 제조업체의 지침에 따라 텔로미어 반복부의 평균 길이를 측정하였다. 1301 T-세포 백혈병 세포주 (시그마알드리치(SigmaAldrich), 미주리주 세인트 루이스)를 각각의 검정에서 내부 참조 표준물로서 사용하였다. 개별 TIL을 계수하고, 1301 세포와 1:1 세포 비로 혼합하였다. 2 x 106개 TIL을 2 x 106개 1301 세포와 혼합하고, FITC-접합된 텔로미어 PNA 프로브 (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA)를 사용하여 계내 혼성화를 수행하고, 유동 세포측정법 (비디 칸토(BD canto) II)을 사용하여 분석하였다. 시험 샘플의 텔로미어 형광을 하기 식에 따라 1301 세포의 기하 평균 형광 (fl)의 백분율로서 표현하였다: 상대 텔로미어 길이 = [(프로브를 갖는 시험 세포의 평균 FITC fl - 프로브를 갖지 않는 시험 세포의 평균 FITC fl) x 1301 세포의 DNA 인덱스 x 100] / [(프로브를 갖는 1301 세포의 평균 FITC fl - 프로브를 갖지 않는 1301 세포의 평균 FITC fl) x 시험 세포의 DNA 인덱스. 데이터는 텔로미어 길이가 신선한 종양 샘플보다 동결된 종양 샘플에서 대등하거나 더 양호하다는 것을 나타낸다.
도 24: 도 24는 신선한 및 동결된 종양 단편으로부터의 TIL에 대한 확장 공정: 신선한 방법 ("GEN2"), 초기-REP 방법 1 ("ER-1") 및 초기-REP 방법 2 ("ER-2")의 특정 실시양태를 예시하는 흐름도이다.
도 25: 도 25는 구조 I-A 및 I-B가, 예를 들어 4-1BBL 또는 4-1BB에 결합하는 항체로부터 유래된 3개의 선형으로-연결된 TNFRSF 결합 도메인을 포함하며, 이들은 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이는 이어서 IgG1-Fc (CH3 및 CH2 도메인 포함)를 통해 제2의 3가 단백질에 연결되며, 또한 디술피드 결합 (소형의 신장된 타원형)을 통해 3가 단백질 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 함께 합쳐 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공하는 것으로 예시한다.
[서열 목록의 간단한 설명]
서열식별번호(SEQ ID NO): 1은 무로모납의 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 2는 무로모납의 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 3은 재조합 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 4는 알데스류킨의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 5는 재조합 인간 IL-4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 6은 재조합 인간 IL-7 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 7은 재조합 인간 IL-15 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 8은 재조합 인간 IL-21 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 9는 인간 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 10은 뮤린 4-1BB의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 11은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄이다.
서열식별번호: 12는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄이다.
서열식별번호: 13은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 14는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 15는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 16은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 17은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 18은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 19는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 20은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우토밀루맙 (PF-05082566)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 21은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄이다.
서열식별번호: 22는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄이다.
서열식별번호: 23은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 24는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 25는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 26은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 27은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 28은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 29는 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 30은 4-1BB 효능제 모노클로날 항체 우렐루맙 (BMS-663513)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 31은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열식별번호: 32는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 33은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 34는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 35는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 36은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 37은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 38은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 39는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 40은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 41은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 42는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 Fc 도메인이다.
서열식별번호: 43은 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 44는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 45는 TNFRSF 효능제 융합 단백질에 대한 링커이다.
서열식별번호: 46은 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 47은 4-1BBL 폴리펩티드의 가용성 부분이다.
서열식별번호: 48은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 49는 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 1에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 50은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 51은 4-1BB 효능제 항체 4B4-1-1 버전 2에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 52는 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 53은 4-1BB 효능제 항체 H39E3-2에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 54는 인간 OX40의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 55는 뮤린 OX40의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 56은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄이다.
서열식별번호: 57은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄이다.
서열식별번호: 58은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 59는 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 60은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 61은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 62는 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 63은 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 64는 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 65는 OX40 효능제 모노클로날 항체 타볼릭시주맙 (MEDI-0562)에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 66은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 중쇄이다.
서열식별번호: 67은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 경쇄이다.
서열식별번호: 68은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 69는 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 70은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 71은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 72는 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 73은 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 74는 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 75는 OX40 효능제 모노클로날 항체 11D4에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 76은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 중쇄이다.
서열식별번호: 77은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 경쇄이다.
서열식별번호: 78은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 79는 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 80은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 81은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 82는 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 83은 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 84는 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 85는 OX40 효능제 모노클로날 항체 18D8에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 86은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 87은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 88은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 89는 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 90은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 91은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 92는 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 93은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu119-122에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 94는 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 95는 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 96은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 97은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 98은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 중쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 99는 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR1이다.
서열식별번호: 100은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR2이다.
서열식별번호: 101은 OX40 효능제 모노클로날 항체 Hu106-222에 대한 경쇄 CDR3이다.
서열식별번호: 102는 OX40 리간드 (OX40L) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 103은 OX40L 폴리펩티드의 가용성 부분이다.
서열식별번호: 104는 OX40L 폴리펩티드의 대안적 가용성 부분이다.
서열식별번호: 105는 OX40 효능제 모노클로날 항체 008에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 106은 OX40 효능제 모노클로날 항체 008에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 107은 OX40 효능제 모노클로날 항체 011에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 108은 OX40 효능제 모노클로날 항체 011에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 109는 OX40 효능제 모노클로날 항체 021에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 110은 OX40 효능제 모노클로날 항체 021에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 111은 OX40 효능제 모노클로날 항체 023에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 112는 OX40 효능제 모노클로날 항체 023에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 113은 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 114는 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 115는 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 116은 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 117은 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 118은 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 119는 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 120은 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 121은 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 122는 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 123은 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 124는 인간화 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 125는 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 중쇄 가변 영역 (VH)이다.
서열식별번호: 126은 OX40 효능제 모노클로날 항체에 대한 경쇄 가변 영역 (VL)이다.
서열식별번호: 127은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 128은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 129는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 130은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 131은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 132는 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 133은 PD-1 억제제 니볼루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 134는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 135는 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 136은 PD-1 억제제 니볼루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 137은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 138은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 139는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 140은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 141은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 142는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 143은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 144는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 145는 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 146은 PD-1 억제제 펨브롤리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 147은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 148은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 149는 PD-L1 억제제 두르발루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 150은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 151은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 152는 PD-L1 억제제 두르발루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 153은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 154는 PD-L1 억제제 두르발루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 155는 PD-L1 억제제 두르발루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 156은 PD-L1 억제제 두르발루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 157은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 158은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 159는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 160은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 161은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 162는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 163은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 164는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 165는 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 166은 PD-L1 억제제 아벨루맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 167은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 168은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 169는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 170은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 171은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 172는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 173은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 중쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 174는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR1 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 175는 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR2 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 176은 PD-L1 억제제 아테졸리주맙의 경쇄 CDR3 아미노산 서열이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허 및 공개는 그 전문이 참조로 포함된다.
정의
용어 "동결된"은 조직, 세포 조성물 또는 다른 조성물이 저온에 대한 노출의 결과로서 경질 또는 강성이 된 것을 의미한다. 본원에 사용된 이 용어는 세포, 조직 등을 매우 낮은 온도에서 저장하며 저장된 세포, 조직 등은 그의 생존율을 유지하는 공정인 동결보존의 개념을 포괄한다.
용어 "동결저장"은 이미 동결된 조성물을 매우 낮은 온도에서 보관하며 저장된 세포, 조직 등은 그의 생존율을 유지하는 것을 의미한다.
용어 "급속 동결", "순간 동결", "급속 동결된" 및 "순간 동결된"은, 비제한적 예를 들어 약 2분 미만 내에 극도로 급속하게 동결되게 하는 것을 의미한다.
용어 "LOVO 세포 가공 시스템" 및 "LOVO"는 프레세니우스 카비 유에스에이, 엘엘씨(Fresenius Kabi USA, LLC)에 의해 제조된 세포 가공 시스템을 지칭한다. 이들 두 용어는 또한, 멸균 및/또는 폐쇄 시스템 환경에서 세포를 포함하는 용액을 막 또는 필터, 예컨대 스피닝 막 또는 스피닝 필터를 통해 펌핑하여, 연속적 유동 및 세포 가공으로 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 분리해내도록 할 수 있는, 임의의 판매업체에 의해 제조된 임의의 기기 또는 장치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포 수거기 및/또는 세포 가공 시스템은 폐쇄 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체-교환, 농축 및/또는 다른 세포 가공 단계를 수행할 수 있다.
용어 "펀진"은 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 인비트로젠(InvitroGen)에 의해 판매되는 항진균 시약 펀진(Fungin)™ (카탈로그 번호 ant-fn-1 및 ant-fn-2)을 지칭한다. 펀진은 피마리신 CAS 7681-93-8의 가용성 제제이다. 본원에 사용된 "펀진"은 피마리신 또는 나타마이신의 임의의 상업용 제제를 포괄한다.
용어 "펀지존"은 이. 알. 스큅 앤 손즈, 엘엘씨(E. R. Squibb and Sons, LLC)의 상표이고, 항진균 암포테리신 B CAS 1397-89-3을 지칭한다. 암포테리신 B는, 예를 들어 미국 미주리주 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치로부터 상업적으로 입수가능하다 (카탈로그 번호 A2942, 탈이온수 중 250 μg/mL 용액으로서). 본원에 사용된 "펀지존"은 암포테리신 B의 임의의 상업용 제제를 포괄한다.
용어 "생리학상 완충 등장성 염수 용액"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 많은 이러한 염 용액 중 어느 하나이며 생리학적 pH 및 등장성 염 농도로 만들어진 용액을 의미한다. 관련 기술분야에서, 이들은 통상적으로 평형 염 용액으로 지칭된다. 비제한적으로, 이러한 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 행크 평형 염 용액 ("HBSS"), 트리스-완충 염수 ("TBS"), 포스페이트 완충 염수 ("PBS") 또는 둘베코 포스페이트 완충 염수 ("DPBS" 또는 "dPBS")를 포함할 수 있다.
용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.
용어 "시험관내"는 대상체의 신체의 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있는 또는 사멸한 세포가 사용되는 세포-기반 검정을 포괄하고, 또한 어떠한 무손상 세포도 사용되지 않는 무세포 검정을 포괄할 수 있다.
용어 "생체외"는 대상체의 신체로부터 제거된 세포, 조직 및/또는 기관에 대해 처리하거나 절차를 수행하는 것을 수반하는 사건을 지칭한다. 적절하게는, 세포, 조직 및/또는 기관은 수술 또는 처리의 방법에서 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9배), 보다 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80- 또는 90배), 또는 가장 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100배의 항원-특이적 TIL 수의 증가를 의미한다. 다수의 급속 확장 프로토콜은 하기에 약술된다.
본원에서의 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득된 세포 집단을 의미한다. TIL은 CD8+ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4+ T 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것 (때때로 "새로 수거된" 것으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL ("REP TIL" 또는 "REP-후 TIL")을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에서 논의된 바와 같이 확장 또는 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. TIL 세포 집단은 유전자 변형된 TIL을 포함할 수 있다.
본원에서의 "세포 집단" (TIL 포함)은 공통 특성을 공유하는 다수의 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 수가 1 x 106 내지 1 x 1010개의 범위이고, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2의 존재 하의 1차 TIL의 초기 성장은 대략 1 x 108개 세포의 벌크 TIL 집단을 생성한다. REP 확장은 일반적으로 주입을 위해 1.5 x 109 내지 1.5 x 1010개 세포 집단을 제공하도록 수행된다.
본원에서 "동결보존된 TIL"은 1차, 벌크 또는 확장된 TIL (REP TIL)이 약 -150℃ 내지 -60℃ 범위의 온도에서 처리 및 저장되는 것을 의미한다. 동결보존을 위한 일반적 방법은 또한 실시예를 포함한 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 명확하게 하고 의심을 피하기 위해, "동결보존된 TIL"은 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과 구별가능하다.
본원에서 "해동된 동결보존된 TIL"은 이전에 동결보존된 다음, 세포 배양 온도 또는 TIL이 환자에게 투여될 수 있는 온도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 실온 이상으로 복귀되도록 처리된 TIL 집단을 의미한다.
TIL은 일반적으로, 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로, 또는 종양에 침윤하여 치료 작용을 하는 그의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다. TIL은 하기 바이오마커 중 1종 이상을 발현하는 것에 의해 일반적으로 카테고리화될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 및 CD25. 추가적으로 및 대안적으로, TIL은 환자 내로의 재도입시 고형 종양에 침윤하는 그의 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
용어 "동결보존 배지들" 또는 "동결보존 배지"는 세포의 동결보존에 사용될 수 있는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 5% v/v DMSO 내지 10% v/v DMSO를 포함하는 배지를 포함할 수 있으며; 이러한 배지는 또한 7% v/v DMSO 내지 10% v/v DMSO를 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 배지는 크리오스토르(CryoStor) CS10, 하이퍼써마솔(Hyperthermasol), 뿐만 아니라 그의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "CS10"은 스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies) 또는 바이오라이프 솔루션즈(Biolife Solutions)로부터 입수한 동결보존 배지를 지칭한다. CS10 배지는 상표명 "크리오스토르® CS10"으로 지칭될 수 있다. CS10 배지는 DMSO를 포함하는 무혈청, 동물 성분-무함유 배지이다.
용어 "중심 기억 T 세포"는 인간에서 CD45R0+이고 CCR7 (CCR7hi) 및 CD62L (CD62hi)을 구성적으로 발현하는 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R) 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BCL-6, BCL-6B, MBD2 및 BMI1을 포함한다. 중심 기억 T 세포는 TCR 촉발 후 이펙터 분자로서 주로 IL-2 및 CD40L을 분비한다. 중심 기억 T 세포는 혈액 중 CD4 구획에서 우세하고, 인간에서는 림프절 및 편도에서 비례적으로 풍부화되어 있다.
용어 "이펙터 기억 T 세포"는, 중심 기억 T 세포와 같이 CD45R0+이지만, CCR7의 구성적 발현을 상실하였고 (CCR7lo) CD62L 발현에 대해 불균질하거나 낮은 (CD62Llo) 인간 또는 포유동물 T 세포의 하위세트를 지칭한다. 중심 기억 T 세포의 표면 표현형은 또한 TCR, CD3, CD127 (IL-7R) 및 IL-15R을 포함한다. 중심 기억 T 세포에 대한 전사 인자는 BLIMP1을 포함한다. 이펙터 기억 T 세포는 항원 자극 후 인터페론-γ, IL-4 및 IL-5를 포함한 높은 수준의 염증성 시토카인을 신속하게 분비한다. 이펙터 기억 T 세포는 혈액 중 CD8 구획에서 우세하고, 인간에서는 폐, 간 및 장에서 비례적으로 풍부화되어 있다. CD8+ 이펙터 기억 T 세포는 다량의 퍼포린을 보유한다.
용어 "폐쇄 시스템"은 외부 환경에 대해 폐쇄된 시스템을 지칭한다. 세포 배양 방법에 적절한 임의의 폐쇄 시스템이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 폐쇄 시스템은, 예를 들어 폐쇄 G-용기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 종양 단편이 폐쇄 시스템에 첨가되면, 시스템은 TIL이 환자에게 투여될 준비가 될 때까지 외부 환경에 대해 개방되지 않는다.
종양을 파괴하는 공정을 기재하기 위해 본원에 사용된 용어 "단편화", "단편" 및 "단편화된"은 기계적 단편화 방법, 예컨대 종양 조직의 분쇄, 슬라이싱, 분할 및 세절, 뿐만 아니라 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하기 위한 임의의 다른 방법을 포함한다.
용어 "말초 혈액 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구 (T 세포, B 세포, NK 세포) 및 단핵구를 포함한, 둥근 핵을 갖는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 말초 혈액 단핵 세포는 방사선조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포이다. PBMC는 항원-제시 세포의 한 유형이다.
용어 "항-CD3 항체"는 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어 모노클로날 항체를 지칭한다. 항-CD3 항체는 무로모납으로도 또한 공지된 OKT-3을 포함한다. 항-CD3 항체는 T3 및 CD3ε로도 또한 공지된 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는, 예를 들어 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙을 포함한다.
용어 "OKT-3" (또한 본원에서 "OKT3"으로도 지칭됨)은 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한 모노클로날 항체 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 지칭하고, 상업적으로 입수가능한 형태, 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 퓨어, 밀테니 바이오텍, 인크.(Miltenyi Biotech, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 무로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 당형태 또는 바이오시밀러를 포함한다. 무로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)에 제공된다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있고, ATCC 수탁 번호 CRL 8001이 배정되어 있다. 또한, OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 유러피안 콜렉션 오브 어센티케이티드 셀 컬쳐스(European Collection of Authenticated Cell Cultures, ECACC)에 기탁되어 있고, 카탈로그 번호 86022706이 배정되어 있다.
표 1. 무로모납의 아미노산 서열.
Figure pct00001
표 2. 인터류킨의 아미노산 서열
Figure pct00002
용어 "IL-2" (또한 본원에서 "IL2"로도 지칭됨)는 인터류킨-2로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-2는, 예를 들어 문헌 [Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79] (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 3). 예를 들어, 용어 IL-2는 IL-2의 인간, 재조합 형태, 예컨대 알데스류킨 (프로류킨(PROLEUKIN), 단일 사용 바이알당 2천2백만 IU로 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능함), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포츠머스 소재 셀게닉스, 인크.(CellGenix, Inc.) (셀그로(CELLGRO) GMP) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.) (카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매업체로부터의 다른 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비글리코실화 인간 재조합 형태이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 4). 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아 사우스 샌프란시스코 소재 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)로부터 입수가능한 PEG화 IL2 전구약물 NKTR-214를 포함한 본원에 기재된 바와 같은 IL-2의 PEG화 형태를 포괄한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 PEG화 IL-2는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0328791 A1 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/065086 Al (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 접합된 IL-2의 대안적 형태는 미국 특허 번호 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 및 4902,502 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 IL-2의 제제는 미국 특허 번호 6,706,289 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
용어 "IL-4" (또한 본원에서 "IL4"로도 지칭됨)는 Th2 T 세포에 의해 및 호산구, 호염기구 및 비만 세포에 의해 생산되는, 인터류킨 4로 공지된 시토카인을 지칭한다. IL-4는 나이브 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. 문헌 [Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70]. IL-4에 의한 활성화시, Th2 T 세포는 후속적으로 양성 피드백 루프에서 추가의 IL-4를 생산한다. IL-4는 또한 B 세포 증식 및 부류 II MHC 발현을 자극시키고, IgE로의 부류 전환 및 B 세포로부터의 IgG1 발현을 유도한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-211) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크.(ThermoFisher Scientific, Inc.) (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 깁코(Gibco) CTP0043)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 5).
용어 "IL-7" (또한 본원에서 "IL7"로도 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터류킨 7로 공지된 글리코실화 조직-유래 시토카인을 지칭한다. 문헌 [Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발생을 자극시킬 수 있다. IL-7은 IL-7 수용체 알파 및 공통 감마 쇄 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합하며, 이는 일련의 신호에서 흉선 내의 T 세포 발생 및 말초 내의 생존에 중요하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7은 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재의 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재의 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 깁코 PHC0071)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 6).
용어 "IL-15" (또한 본원에서 "IL15"로도 지칭됨)는 인터류킨-15로 공지된 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-15는, 예를 들어 문헌 [Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. IL-15는 IL-2와 β 및 γ 신호전달 수용체 서브유닛을 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 12.8 kDa의 분자 질량을 갖는, 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-15는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 34-8159-82)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 7).
용어 "IL-21" (또한 본원에서 "IL21"로도 지칭됨)은 인터류킨-21로 공지된 다면발현성 시토카인 단백질을 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-21의 모든 형태를 포함한다. IL-21은, 예를 들어 문헌 [Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc., 13:379-95 (2014)] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. IL-21은 주로 자연 킬러 T 세포 및 활성화된 인간 CD4+ T 세포에 의해 생산된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자 질량을 갖는, 132개의 아미노산을 함유하는 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-21 재조합 단백질, 카탈로그 번호 14-8219-80)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 8).
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 질환 치료를 포함하나 이제 제한되지는 않는 의도된 적용을 실시하기에 충분한 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합물의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 의도된 적용 (시험관내, 생체내 및 생체외), 또는 치료될 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서의 특정한 반응 (예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 구체적 용량은 선택된 특정한 화합물, 이어질 투여 요법, 화합물이 다른 화합물과 조합되어 투여되는지의 여부, 투여 시기, 투여될 조직, 및 화합물을 운반하는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
본원에 사용된 용어 "치료 효과"는 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포괄한다. 예방적 효과는 질환 또는 상태 출현을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태의 증상 발병을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 상태 진행을 늦추거나 중지시키거나 역전시키는 것, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
"제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 제약 성분을 위한 이러한 제약상 허용되는 담체 또는 제약상 허용되는 부형제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 제약상 허용되는 부형제가 활성 제약 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 추가의 활성 제약 성분, 예컨대 다른 약물이 또한 기재된 조성물 및 방법 내로 혼입될 수 있다.
예를 들어, 분자량 또는 화학식과 같은 물리적 또는 화학적 특성을 기재하기 위해 범위가 본원에 사용되는 경우에, 범위의 모든 조합 및 하위조합 및 그 안의 구체적 실시양태가 포함되는 것으로 의도된다. 수치 또는 수치 범위를 언급하는 경우에 용어 "약"의 사용은 언급된 수치 또는 수치 범위가 실험적 가변성 내에서 (또는 통계적 실험 오차 내에서) 근사치이므로, 수치 또는 수치 범위가 달라질 수 있다는 것을 의미한다. 편차는 전형적으로 언급된 수치 또는 수치 범위의 0% 내지 15%, 바람직하게는 0% 내지 10%, 보다 바람직하게는 0% 내지 5%이다. 용어 "포함하는" (및 관련 용어, 예컨대 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "갖는" 또는 "포함한")은 실시양태, 예컨대, 예를 들어 기재된 특색으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 임의의 물질의 조성물, 방법 또는 공정의 한 실시양태를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 항체를 포함한다. 용어 "항체" 및 그의 복수 형태 "항체들"은 전체 이뮤노글로불린 및 임의의 항원-결합 단편 ("항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 지칭한다. "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질 또는 그의 항원-결합 부분을 추가로 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 VH 및 VL 영역은, 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)으로 지칭되고 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역 사이에 배치될 수 있는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원 에피토프 또는 에피토프들과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, IL-33, ST2, CD20, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 제시된 바 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 또는 VL 도메인으로 이루어질 수 있는 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., Nature, 1989, 341, 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 이들을 단일 단백질 쇄로 만들 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 단일 쇄 Fv (scFv)로 공지된 1가 분자를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 1988, 242, 423-426; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883] 참조). 이러한 scFv 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편" 내에 포괄되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체는 포함하지 않는 것으로 의도된다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 디스플레이하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체 (하기 추가로 기재됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 부류 (예를 들어, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다. 포유동물에서, 5종의 항체 이소형이 존재한다: IgA, IgD, IgG, IgM 및 IgE. 인간에서, IgG 이소형의 4종의 하위부류: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 IgA 이소형의 2종의 하위부류: IgA1 및 IgA2가 존재한다.
어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "인간 항체 유도체"는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어 항체와 또 다른 활성 제약 성분 또는 항체의 접합체를 지칭한다. 용어 "접합체", "항체-약물 접합체", "ADC" 또는 "면역접합체"는 치료 모이어티, 예컨대 박테리아 독소, 세포독성 약물 또는 방사성핵종-함유 독소에 접합된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. 독성 모이어티는 관련 기술분야에서 이용가능한 방법을 사용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다.
용어 "인간화 항체", "인간화 항체들" 및 "인간화"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 인간 프레임워크 서열 내에서 추가의 프레임워크 영역 변형이 이루어질 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기는 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann et al., Nature 1988, 332, 323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596]을 참조한다.
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 것인 항체, 예컨대 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 것인 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편이다. 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 404,097, 국제 특허 공개 번호 WO 93/11161; 및 문헌 [Bolliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
용어 "글리코실화"는 항체의 변형된 유도체를 지칭한다. 비-글리코실화 항체는 글리코실화가 결여되어 있다. 글리코실화를 변경하여, 예를 들어 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 1개 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 유발하는 1개 이상의 아미노산 치환이 이루어짐으로써 그 부위에서 글리코실화가 제거될 수 있다. 비-글리코실화는 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 기재된 바와 같이, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705 및 Ms709는 푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8 (알파 (1,6) 푸코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705 및 Ms709 세포주에서 발현된 항체의 탄수화물에 푸코스가 존재하지 않는다. Ms704, Ms705 및 Ms709 FUT8-/- 세포주는 2가지 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 파괴에 의해 생성되었다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0110704 또는 문헌 [Yamane-Ohnuki, et al. Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622] 참조). 또 다른 예로서, 유럽 특허 번호 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴된 세포주를 기재하고 있으며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련 효소의 감소 또는 제거에 의해 저푸코실화를 나타낸다는 것을 기재하고, 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 푸코스를 부가하는 효소 활성이 낮거나 또는 이러한 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들어 래트 골수종 세포주 YB2/0 (ATCC CRL 1662)를 기재하고 있다. 국제 특허 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주인 Lec 13 세포를 기재하고 있으며, 또한 이러한 숙주 세포에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다는 것을 기재한다 (또한 문헌 [Shields, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740] 참조). 국제 특허 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있으며, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 증가된 ADCC 활성을 생성한다는 것을 기재한다 (또한 문헌 [Umana, et al., Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180] 참조). 대안적으로, 항체의 푸코스 잔기는 푸코시다제 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 예를 들어, 푸코시다제 알파-L-푸코시다제는 문헌 [Tarentino, et al., Biochem. 1975, 14, 5516-5523]에 기재된 바와 같이 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다.
"PEG화"는 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 전형적으로 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. PEG화는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는데 사용된 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. PEG화될 항체는 비-글리코실화 항체일 수 있다. PEG화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 0154316 및 EP 0401384에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체에 적용될 수 있다.
용어 "바이오시밀러"는 미국에서 허가된 참조 생물학적 제품과 임상 불활성 성분에서의 부차적 차이에도 불구하고 고도로 유사한 생물학적 제품을 의미하며, 제품의 안전성, 순도 및 효력의 관점에서 생물학적 제품과 참조 제품 사이에 임상적으로 의미있는 차이가 존재하지 않는 것이다. 추가로, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 이미 유럽 의약품청에 의해 사용 인가된 또 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 제품 또는 생물학적 의약은 박테리아 또는 효모와 같은 생물학적 공급원에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 이들은 비교적 작은 분자, 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복잡한 분자, 예컨대 모노클로날 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 항-CD20 모노클로날 항체가 리툭시맙인 경우에, 리툭시맙과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-CD20 바이오시밀러 모노클로날 항체는 리툭시맙에 대한 "바이오시밀러"이거나 또는 리툭시맙의 "바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 이미 유럽 의약품청 (EMA)에 의해 사용 인가된 또 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서의 유사한 생물학적 용도에 대한 관련 법적 기준은 개정된 규정 (EC) No 726/2004의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4)이고, 따라서 유럽에서, 바이오시밀러는 규정 (EC) No 726/2004의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4) 하에 인가되거나, 인가를 위해 승인되거나 또는 인가를 위한 용도의 대상일 수 있다. 이미 인가된 원래의 생물학적 의약품은 유럽에서 "참조 의약품"으로 지칭될 수 있다. 바이오시밀러로 간주되기 위한 제품에 대한 일부 요건은 유사 생물학적 의약품에 대한 CHMP 가이드라인에 약술되어 있다. 추가로, 모노클로날 항체 바이오시밀러와 관련된 가이드라인을 포함한 제품 특이적 가이드라인은 EMA에 의해 제품별로 제공되고 그의 웹사이트에 공개되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특징, 생물학적 활성, 작용 메카니즘, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 있어서 참조 의약품과 유사할 수 있다. 추가로, 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있거나 사용을 위해 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 품질 특징을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽에서의 바이오시밀러는 EMA에 의해 인가된 참조 의약품과 비교된다. 그러나, 일부 경우에, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 지역 밖에서 인가된 생물학적 의약품 (비-EEA 인가된 "비교자")과 비교될 수 있다. 이러한 연구는, 예를 들어 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 인가된 비교자와 비교되었거나 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의하게 영향을 미치지 않는 아미노산 구조에서의 부차적 변형 (예를 들어 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그의 참조 의약품의 아미노산 서열에 대해 97% 이상, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약품의 번역후 변형과 상이한 1종 이상의 번역후 변형, 예를 들어 이에 제한되지는 않을지라도, 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및/또는 말단절단을 포함할 수 있으며, 단 이러한 상이함이 의약품의 안전성 및/또는 효능에 변화를 일으키지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 또는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 배타적인 것은 아닐지라도, 바이오시밀러는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있으며, 단 이러한 상이함이 참조 의약품과 연관된 안전성 우려를 해결하거나 해결하도록 의도된 경우에 그러한 패턴을 가질 수 있다. 추가적으로, 바이오시밀러는, 예를 들어 그의 강도, 제약 형태, 제제, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약품을 벗어날 수 있으며, 단 의약품의 안전성 및 효능은 손상되지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여, 예를 들어 약동학 (PK) 및/또는 약역학 (PD) 프로파일에 있어서의 차이를 포함할 수 있으나, 인가되거나 인가에 적합한 것으로 간주되도록 여전히 참조 의약품과 충분히 유사한 것으로 생각된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 상이한 결합 특징을 나타내며, 여기서 상이한 결합 특징은 유사한 생물학적 제품으로서의 인가를 위한 장벽이 되지 않는 것으로 EMA와 같은 규제 기관에 의해 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다.
용어 "혈액 악성종양"은 혈액, 골수, 림프절 및 림프계의 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 포유동물의 조혈 및 림프 조직의 암 및 종양을 지칭한다. 혈액 악성종양은 또한 "액상 종양"으로도 지칭된다. 혈액 악성종양은 ALL, CLL, SLL, 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 급성 단핵구성 백혈병 (AMoL), 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "B 세포 혈액 악성종양"은 B 세포에 영향을 미치는 혈액 악성종양을 지칭한다.
용어 "고형 종양"은 통상적으로 낭 또는 액상 영역을 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 용어 "고형 종양 암"은 악성, 신생물성 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 고형 종양 암은 육종, 암종 및 림프종, 예컨대 폐암, 유방암, 전립선암, 결장암, 직장암 및 방광암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.
용어 "액상 종양"은 사실상 유체인 비정상적 세포 물질을 지칭한다. 액상 종양 암은 백혈병, 골수종 및 림프종, 뿐만 아니라 다른 혈액 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 액상 종양으로부터 수득된 TIL은 또한 골수 침윤 림프구 (MIL)로 본원에서 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미세환경"은 전체로서의 고형 또는 혈액 종양 미세환경 또는 미세환경 내의 세포의 개별 하위세트를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 종양 미세환경은 문헌 [Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473]에 기재된 바와 같이, "신생물 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침습을 지지하고, 종양을 숙주 면역으로부터 보호하고, 치료 저항성을 조성하고, 우세한 전이가 번성하도록 틈을 제공하는 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 매트릭스 및 기계적 신호"의 복합 혼합물을 지칭한다. 종양이 T 세포에 의해 인식될 항원을 발현하지만, 미세환경에 의한 면역 억제 때문에 면역계에 의한 종양 클리어런스는 드물다.
한 실시양태에서, 본 발명은 환자가 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료되는, TIL 집단으로 암을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자가 본 발명에 따른 TIL의 주입 전에 비골수절제 화학요법으로 사전-치료되는, TIL 집단이 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-골수절제 화학요법 및 TIL 주입 (제0일) 후에, 환자는 생리학적 내성까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
실험적 소견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전 림프구고갈이 조절 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ("시토카인 싱크")의 제거에 의해 치료 효능을 증진시키는데 주요 역할을 하는 것으로 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 rTIL의 도입 전에 환자에 대해 림프구고갈 단계 (때때로 또한 "면역억제 조건화"로 지칭됨)를 이용한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성" 및 "서열 퍼센트 동일성"은 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 (필요하다면 갭이 도입됨) 동일하거나, 또는 명시된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 것을 지칭하고, 이때 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 적합한 프로그램은, 예를 들어 미국 정부의 국립 생물 정보 센터 BLAST 웹 사이트로부터 이용가능한 BLAST 프로그램 모음을 포함한다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되고, 반면에 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코), 또는 DNASTAR로부터 이용가능한 메그얼라인(MegAlign)은 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 추가의 공중 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다.
본 발명의 특정 실시양태는 항체, 예를 들어 항-IL-33 또는 항-ST2 항체 및/또는 항-CD20 항체 및/또는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 및/또는 항-PD-L2 항체의 변이체를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "변이체"는 참조 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 인접한 특정 위치에서의 1개 이상의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포괄하나 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교하여 그의 아미노산 서열에 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환을 수반할 수 있다. 변이체는 참조 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
의심을 피하기 위해, 본 발명의 특정한 측면, 실시양태 또는 실시예와 관련하여 기재된 특정한 특색 (예를 들어 정수, 특징, 값, 용도, 질환, 화학식, 화합물 또는 군)은 본원에 기재된 임의의 다른 측면, 실시양태 또는 실시예와 비상용성이지 않은 한 그에 적용가능한 것으로 이해될 것으로 의도된다. 따라서 이러한 특색은 적절한 경우에 본원에 정의된 임의의 정의, 청구범위 또는 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 모든 특색 (임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면 포함) 및/또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 공정의 모든 단계는, 이러한 특색 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 경우의 조합을 제외하고는, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 발명은 임의의 개시된 실시양태의 임의의 세부사항에 한정되지 않는다. 본 발명은 본 명세서 (임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면 포함)에 개시된 특색의 임의의 신규한 것 또는 신규한 조합, 또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 공정의 단계의 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확대된다.
종양 동결보존 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위해 종양 조직을 동결보존하는 방법을 제공한다:
(i) 종양 조직을 단편화하는 단계;
(ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
한 실시양태에서, 종양 조직은 약 1.5 mm 내지 약 6 mm의 직경을 갖는 대략 구형 단편으로 단편화된다. 바람직한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 6 mm의 직경을 갖는다. 한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 3 mm의 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 적어도 1.5 mm의 최단 가장자리 길이 및 약 6 mm의 최장 가장자리 길이를 갖는 일반적으로 직사각형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 조직은 약 1.5 mm 내지 6 mm의 가장자리 길이를 갖는 일반적으로 입방형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 일반적으로 입방형인 단편은 약 6 mm의 가장자리 길이를 갖는다. 한 실시양태에서, 일반적으로 입방형인 단편은 약 3 mm의 가장자리 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 조직 샘플은 종양 조직으로부터 비-종양 조직을 분리하도록 트리밍된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 절제된 종양으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 조직은 종양 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 절개 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 절제 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 1개 이상의 중심부 바늘 생검으로부터의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 약 1.5 mm x 1.5 mm, 약 2 mm x 2 mm, 약 2.5 mm x 2.5 mm, 약 3 mm x 3 mm, 약 3.5 mm x 3.5 mm, 약 4 mm x 4 mm, 약 4.5 mm x 4.5 mm, 약 5 mm x 5 mm, 약 5.5 mm x 약 5.5 mm, 또는 약 6 mm x 약 6 mm의 단면을 갖는 단편으로 트리밍된다.
한 실시양태에서, 종양 조직은 12시간 미만의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 조직은 8시간 미만의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 조직은 3시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만의 것이다.
일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 2 내지 12% v/v (부피:부피) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5 내지 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 1% v/v, 2% v/v, 3% v/v, 4% v/v, 5% v/v, 6% v/v, 7% v/v, 8% v/v, 9% v/v, 10% v/v, 11% v/v, 12% v/v, 13% v/v, 14% v/v 및 15% v/v로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 나머지 동결보존 배지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 2 내지 12% w/w (중량:중량) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5 내지 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 1% w/w, 2% w/w, 3% w/w, 4% w/w, 5% w/w, 6% w/w, 7% w/w, 8% w/w, 9% w/w, 10% w/w, 11% w/w, 12% w/w, 13% w/w, 14% w/w 및 15% w/w로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 나머지 동결보존 배지는 수성 배지이다.
한 실시양태에서, 동결보존 배지는 적어도 1종의 항미생물제를 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 적어도 50 μg/mL의 농도의 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 페니실린이고; 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 스트렙토마이신이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 항진균제이다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 암포테리신 B이고; 일부 실시양태에서, 항진균제는 펀진™이다. 일부 실시양태에서, 항미생물제의 조합이 사용된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항진균제는 1종 이상의 항박테리아제와 조합되어 사용된다.
일부 실시양태에서, 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 10분; 적어도 20분; 적어도 25분; 적어도 30분; 적어도 35분; 적어도 40분; 적어도 45분; 적어도 50분; 적어도 55분; 적어도 60분; 또는 적어도 70분이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 약 10분; 약 20분; 약 25분; 약 30분; 약 35분; 약 40분; 약 45분; 약 50분; 약 55분; 약 60분; 또는 약 70분이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 10분 미만; 20분 미만; 25분 미만; 30분 미만; 35분 미만; 40분 미만; 45분 미만; 50분 미만; 55분 미만; 60분 미만; 또는 70분 미만이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 밀도에 비례한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 표면 대 부피 비에 비례한다.
일부 실시양태에서, 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 생리학상 완충 등장성 염수 용액 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 각각의 연속 세척 후에 교체된다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 트리스-완충 염수 (TBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1회 연속 세척에서의 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 다른 연속 세척 중 1회 이상에서 사용된 것과 상이한 생리학상 완충 등장성 염수 용액일 수 있다.
한 실시양태에서, 동결은 약 -125℃ 내지 약 -196℃ 범위의 온도에서 일어난다. 한 실시양태에서, 동결은 약 -140℃ 내지 약 -185℃ 범위의 온도에서 일어난다. 한 실시양태에서, 동결은 약 -140℃ 내지 약 -175℃ 범위의 온도에서 일어난다. 한 실시양태에서, 동결은 약 -145℃의 온도에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 동결은 액체 질소의 증기 상에서 일어난다.
관련 기술분야에 널리 공지된 문제는 동결 공정 동안 세포 또는 조직을 손상시키지 않으면서 이들을 동결보존하는 것이다. 이론에 얽매이지는 않지만, 동결 동안의 손상의 한 원인은 세포 파열을 일으키는 세포내 빙핵형성이다. 문헌 [Muldrew and McGann, "The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury", Biophysical Journal, 66:532-41 (1994)]에는 세포 및 특히 전체 조직 동결보존에 있어서 이러한 널리 공지되고 광범위하게 인식되는 어려움에 대한 정량적 이론이 약술되어 있다. 이후의 논문인 문헌 [Acker and McGann, "Membrane damage occurs during the formation of intracellular ice," Cryo Letter, 22:241-54 (2001)]에는 세포내 빙결 및 세포 손상의 근본적인 메카니즘이 추가로 개발되어 있다.
동결 동안의 손상은 해동시 조직이 그의 생리학적 구조를 실질적으로 상실하거나 또는 조직을 구성하는 세포가 그의 생존율을 실질적으로 상실하는 경우에 검출된다. 생존율은 성장하거나 정상 세포 기능의 마커를 나타내는 세포의 수와 비교하여 배양 배지 내로 도입된 세포의 분율에 의해 결정될 수 있다. 생존 세포의 분율을 확인하기 위한 수많은 방법, 예를 들어 및 비제한적으로 염료 배제 시험, 예컨대 트리판 블루 배제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Strober, Curr. Protoc. Immunol., 2001, Appendix 3B, https://dx.doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs21에서 이용가능함]을 참조한다. 비제한적으로, 생존율은 또한 대사 활성 검정, 예컨대 MTT 검정에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 MTT인 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드는 세포 효소에 의해 포르마잔으로 대사된다. 이러한 효소적 반응은 황색 MTT를 자주색 포르마잔으로 전환시킨다. 예를 들어, 문헌 [Berridge et al., Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005); Mosmann, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays," J. Immunol. Methods 65 (1-2): 55-63 (1983)]을 참조한다.
이론에 얽매이지는 않지만, 느린 냉각은 무해한 세포내 얼음을 생성하는 것으로 가정되며, 문헌 [Acker and McGann, "Protective effect of intracellular ice during freezing?" Cryobiology, 46(2): 197-202 (2003)]을 참조한다. 과도한 세포 손상 없이 동결을 달성하거나 또는 세포 생존율을 유의하게 감소시키지 않으면서 동결을 달성하는 통상적인 접근법은 느린 동결 속도를 사용하는 것이었다. 미국 특허 5,891,617 (Watson et al.)은 이러한 접근법을 강조하며, 예를 들어 청구항 1 단계 (c)는 매우 느린 냉각 속도: "약 -0.3℃/분 이하"를 교시한다. 유사하게, 미국 특허 9,938,495 (Comhaire et al.)는 줄기 세포에 대해 "해동 후의 높은 세포 생존율은 DMSO-무함유 동결보존 배지를 사용하여 느린 동결에 의해 수득되었다"고 교시한다.
이들 예시적인 교시에 기초하여, 본 개시내용의 방법 및 생성물은 놀랍고 예상치 못한 것이다. 추가로, 실시예 및 그 안의 데이터를 포함한 본 개시내용은 치료 용도를 위한 종양 침윤 림프구의 제조에 사용하기 위해, 종양 조직, 종양 단편 또는 종양 시편을 신속하고 효율적으로 동결보호하는 문제에 대한 기술적 해결책을 입증한다.
일부 실시양태에서, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위해 종양 조직을 동결보존하는 방법은 (iv) 동결된 단편을 적어도 -130℃ 미만의 온도에서 저장하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결된 단편은 액체 질소의 증기 상에 저장된다. 일부 실시양태에서, 동결된 단편은 액체 질소 중에 침지되어 저장된다. 일부 실시양태에서, 동결보존된 단편은 자가 치료 용도를 위한 TIL의 나중 제조를 위해 저장된다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분의 기간 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(b) 종양 단편을 저장 배지에서 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 단편을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(d) 종양 단편을 해동시키는 단계;
(e) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 단편을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(f) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(g) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 2 내지 12% v/v (부피:부피 또는 부피-대-부피) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5 내지 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 1% v/v, 2% v/v, 3% v/v, 4% v/v, 5% v/v, 6% v/v, 7% v/v, 8% v/v, 9% v/v, 10% v/v, 11% v/v, 12% v/v, 13% v/v, 14% v/v 및 15% v/v로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 저장 배지의 나머지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 2 내지 12% w/w (중량:중량 또는 중량-대-중량) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5 내지 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 1% w/w, 2% w/w, 3% w/w, 4% w/w, 5% w/w, 6% w/w, 7% w/w, 8% w/w, 9% w/w, 10% w/w, 11% w/w, 12% w/w, 13% w/w, 14% w/w 및 15% w/w로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 저장 배지의 나머지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 15분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 45분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 75분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 5% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 10% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 밀도에 비례한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 표면 대 부피 비에 비례한다.
동결보존된 종양 단편
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편을 제공한다:
(i) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편을 제공한다:
(i) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(ii) 10% v/v DMSO를 포함하는 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 단편을 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계.
한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 1.5 mm 내지 6 mm의 직경을 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 6 mm의 직경을 갖는다. 한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 3 mm의 직경을 갖는다. 한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 20 mm, 약 19 mm, 약 18 mm, 약 17 mm, 약 16 mm, 약 15 mm, 약 14 mm, 약 13 mm, 약 12 mm, 약 11 mm, 약 10 mm, 약 9 mm, 약 8 mm, 약 7 mm, 약 6 mm, 약 5 mm, 약 4 mm, 약 3 mm, 약 2 mm 및 약 1 mm로 이루어진 군으로부터 선택된 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 종양 샘플은 적어도 1.5 mm의 최단 가장자리 길이 및 약 6 mm의 최장 가장자리를 갖는 일반적으로 직사각형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 길이가 약 1.5 mm 내지 6 mm인 가장자리를 갖는 일반적으로 입방형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 일반적으로 입방형인 단편은 길이가 약 6 mm인 가장자리를 갖는다. 한 실시양태에서, 일반적으로 입방형인 단편은 길이가 약 3 mm인 가장자리를 갖는다. 한 실시양태에서, 일반적으로 입방형인 단편은 약 20 mm, 약 19 mm, 약 18 mm, 약 17 mm, 약 16 mm, 약 15 mm, 약 14 mm, 약 13 mm, 약 12 mm, 약 11 mm, 약 10 mm, 약 9 mm, 약 8 mm, 약 7 mm, 약 6 mm, 약 5 mm, 약 4 mm, 약 3 mm, 약 2 mm 및 약 1 mm로 이루어진 군으로부터 선택된 가장자리 길이를 갖는다.
한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 2 mm3 내지 약 200 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 5 mm3 내지 약 150 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 25 mm3 내지 약 150 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 50 mm3 내지 약 150 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 100 mm3 내지 약 125 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 50 mm3 내지 약 75 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 75 mm3 내지 약 100 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 200 mm3 내지 약 1000 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 약 500 mm3 내지 약 800 mm3의 부피를 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화된다. 한 실시양태에서, 대략 구형인 단편은 약 20 mm, 약 19 mm, 약 18 mm, 약 17 mm, 약 16 mm, 약 15 mm, 약 14 mm, 약 13 mm, 약 12 mm, 약 11 mm, 약 10 mm, 약 9 mm, 약 8 mm, 약 7 mm, 약 6 mm, 약 5 mm, 약 4 mm, 약 3 mm, 약 2 mm 및 약 1 mm로 이루어진 군으로부터 선택된 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 단편으로 트리밍되며, 여기서 단편은 약 1.5 mm x 1.5 mm, 약 2 mm x 2 mm, 약 2.5 mm x 2.5 mm, 약 3 mm x 3 mm, 약 3.5 mm x 3.5 mm, 약 4 mm x 4mm, 약 4.5 mm x 4.5 mm, 약 5 mm x 5 mm, 약 5.5 mm x 약 5.5 mm, 약 6 mm x 6 mm, 약 6.5 mm x 6.5 mm, 약 7 mm x 7 mm, 약 7.5 mm x 7.5 mm, 약 8 mm x 8 mm, 약 8.5 mm x 8.5 mm, 약 9 mm x 9 mm, 약 9.5 mm x 9.5 mm, 약 10 mm x 10 mm, 약 10.5 mm x 10.5 mm, 약 11 mm x 11 mm, 약 11.5 mm x 11.5 mm, 약 12 mm x 12 mm의 단면을 갖는다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 단편으로 트리밍되며, 여기서 단편은 약 2 mm2 내지 약 3 mm2, 약 3 mm2 내지 약 4 mm2, 약 4 mm2 내지 약 5 mm2, 약 5 mm2 내지 약 6 mm2, 약 6 mm2 내지 약 7 mm2, 약 7 mm2 내지 약 8 mm2, 약 8 mm2 내지 약 9 mm2, 약 9 mm2 내지 약 10 mm2, 약 10 mm2 내지 약 11 mm2, 약 11 mm2 내지 약 12 mm2, 약 12 mm2 내지 약 20 mm2, 약 20 mm2 내지 약 50 mm2, 약 50 mm2 내지 약 100 mm2, 또는 약 100 mm2 내지 약 500 mm2의 단면적을 갖는다. 일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 단편으로 트리밍되며, 여기서 단편은 약 1.5 mm2, 약 2 mm2, 약 2.5 mm2, 약 3 mm2, 약 3.5 mm2, 약 4 mm2, 약 4.5 mm2, 약 5 mm2, 약 5.5 mm2, 약 6 mm2, 약 6.5 mm2, 약 7 mm2, 약 7.5 mm2, 약 8 mm2, 약 8.5 mm2, 약 9 mm2, 약 9.5 mm2, 약 10 mm2, 약 10.5 mm2, 약 11 mm2, 약 11.5 mm2, 약 12 mm2, 약 20 mm2, 약 25 mm2, 약 30 mm2, 약 40 mm2, 약 50 mm2, 약 100 mm2, 약 200 mm2, 약 300 mm2, 약 400 mm2, 약 500 mm2, 약 750 mm2, 또는 약 1000 mm2의 단면적을 갖는다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 단편으로 트리밍되며, 여기서 단편은 약 2 mm3 내지 약 3 mm3, 약 3 mm3 내지 약 4 mm3, 약 4 mm3 내지 약 5 mm3, 약 5 mm3 내지 약 6 mm3, 약 6 mm3 내지 약 7 mm3, 약 7 mm3 내지 약 8 mm3, 약 8 mm3 내지 약 9 mm3, 약 9 mm3 내지 약 10 mm3, 약 10 mm3 내지 약 11 mm3, 약 11 mm3 내지 약 12 mm3, 및 약 12 mm3 내지 약 20 mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 단편으로 트리밍되며, 여기서 단편은 약 1.5 mm3, 약 2 mm3, 약 2.5 mm3, 약 3 mm3, 약 3.5 mm3, 약 4 mm3, 약 4.5 mm3, 약 5 mm3, 약 5.5 mm3, 약 6 mm3, 약 6.5 mm3, 약 7 mm3, 약 7.5 mm3, 약 8 mm3, 약 8.5 mm3, 약 9 mm3, 약 9.5 mm3, 약 10 mm3, 약 10.5 mm3, 약 11 mm3, 약 11.5 mm3, 약 12 mm3, 약 20 mm3, 약 25 mm3, 약 30 mm3, 약 40 mm3, 약 50 mm3, 약 100 mm3, 약 200 mm3, 약 300 mm3, 약 400 mm3, 약 500 mm3, 약 750 mm3, 또는 약 1000 mm3의 부피를 갖는다.
일부 실시양태에서, 종양 샘플은 절제된 종양으로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 종양 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 절개 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 절제 생검으로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 샘플은 1개 이상의 중심부 바늘 생검으로부터의 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 종양 샘플은 동결 전 12시간 미만의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 동결 전 8시간 미만의 것이다. 한 실시양태에서, 종양 샘플은 동결 전 3시간 미만, 2시간 미만 또는 1시간 미만의 것이다.
일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 2 내지 12% v/v (부피:부피 또는 부피-대- 부피) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5 내지 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 1% v/v, 2% v/v, 3% v/v, 4% v/v, 5% v/v, 6% v/v, 7% v/v, 8% v/v, 9% v/v, 10% v/v, 11% v/v, 12% v/v, 13% v/v, 14% v/v 및 15% v/v로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 나머지 동결보존 배지는 수성 배지이다.
일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 2 내지 12% w/w (중량:중량 또는 중량-대-중량) 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 5 내지 10% w/w DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 1% w/w, 2% w/w, 3% w/w, 4% w/w, 5% w/w, 6% w/w, 7% w/w, 8% w/w, 9% w/w, 10% w/w, 11% w/w, 12% w/w, 13% w/w, 14% w/w 및 15% w/w로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율의 DMSO를 포함한다. 상기 중 일부 실시양태에서, 나머지 동결보존 배지는 수성 배지이다.
한 실시양태에서, 동결보존 배지는 적어도 1종의 항미생물제를 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 적어도 20 μg/mL의 농도의 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 적어도 50 μg/mL 농도의 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 페니실린이고; 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 스트렙토마이신이다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항미생물제는 항진균제이다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 암포테리신 B이고; 일부 실시양태에서, 항진균제는 펀진™이다. 일부 실시양태에서, 항미생물제의 조합이 사용된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종의 항진균제는 1종 이상의 항박테리아제와 조합되어 사용된다.
일부 실시양태에서, 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 10분; 적어도 20분; 적어도 25분; 적어도 30분; 약 35분; 약 40분; 약 45분; 약 50분; 약 55분; 또는 약 60분이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 밀도에 비례한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 표면 대 부피 비에 비례한다.
일부 실시양태에서, 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 종양 샘플은 생리학상 완충 등장성 염수 용액 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 각각의 연속 세척 후에 교체된다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 트리스-완충 염수 (TBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1회 연속 세척에서의 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 다른 연속 세척 중 1회 이상에서 사용된 것과 상이한 생리학상 완충 등장성 염수 용액일 수 있다.
한 실시양태에서, 동결은 약 -125℃ 내지 약 -180℃ 범위의 온도에서 일어난다. 한 실시양태에서, 동결은 약 -140℃ 내지 약 -175℃ 범위의 온도에서 일어난다. 한 실시양태에서, 동결은 약 -145℃의 온도에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 동결은 액체 질소의 증기 상에서 일어난다.
한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 1개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 2개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 3개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 4개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 5개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 6개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 7개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 8개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 9개이다. 한 실시양태에서, 상기 또는 본원의 임의의 실시양태에 따라 사용된 종양 단편의 수는 10개이다.
동결보존된 종양 단편으로부터의 TIL의 제조
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결보존된 종양 단편으로부터 치료적 TIL 집단으로 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(i) 동결보존된 종양 단편으로부터 제1 TIL 집단을 수득하는 단계;
(ii) IL-2 및 임의로 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계; 및
(iii) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하며, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 또는 100배 더 많고, 여기서 제2 확장은 적어도 14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 TIL의 치료적 집단인 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 동결보존된 종양 단편을 배양하여 TIL을 제공하는 단계;
(b) 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계; 및
(c) 임의로 확장된 수의 TIL을 동결보존하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 종양 샘플을 단편화하는 단계;
(b) 종양 단편을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 단편을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(d) 종양 단편을 해동시키는 단계;
(e) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 단편을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(f) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(g) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 2% v/v DMSO 내지 12% v/v 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 5% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 10% v/v DMSO를 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 5% v/v DMSO 내지 10% v/v DMSO를 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 45분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결보존 배지에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 동결보존 배지에서 약 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션은 적어도 10분; 적어도 20분; 적어도 25분; 적어도 30분; 약 35분; 약 40분; 약 45분; 약 50분; 약 55분; 또는 약 60분이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 밀도에 비례한다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 시간은 종양 단편 표면 대 부피 비에 비례한다.
일부 실시양태에서, 약 1.5 mm x 1.5 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 20분 동안, 약 30분 동안, 약 35분 동안, 약 40분 동안 또는 약 60분 미만 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 약 2 mm x 2 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 20분 동안, 약 30분 동안, 약 35분 동안, 약 40분 동안, 약 45분 동안, 약 50분 동안 또는 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 약 3 mm x 3 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 적어도 20분 동안, 약 30분 동안, 약 35분 동안, 약 40분 동안, 약 45분 동안, 약 50분 동안 또는 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 약 4 mm x 4 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 30분 동안, 약 35분 동안, 약 40분 동안, 약 45분 동안, 약 50분 동안, 약 60분 동안 또는 약 70분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 약 5 mm x 5 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 약 30분 동안, 약 35분 동안, 약 40분 동안, 약 45분 동안, 약 50분 동안, 약 60분 동안 또는 약 70분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 약 6 mm x 6 mm의 단면을 갖는 종양 단편은 동결보존 배지에서 적어도 20분 동안, 약 30분 동안, 약 40분 동안, 약 45분 동안, 약 50분 동안, 약 60분 동안 또는 약 70분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 5% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 60분 동안 인큐베이션된다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 약 10% v/v DMSO를 포함하고, 종양 조직은 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 약 30분 내지 약 60분 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 IL-2를 포함하는 배양 배지에서 동결보존된 종양 단편을 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기서 TIL의 수는 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 100배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 150배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 200배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 250배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 300배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 350배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 400배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 450배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 500배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 550배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 600배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 700배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 750배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 800배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 850배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 900배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 1000배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 1200배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 1500배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 1600배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 2000배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 2100배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 2200배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 약 2500배 확장된다. 일부 실시양태에서, TIL의 수는 2500배 초과 확장된다.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 용기를 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 제조하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 동결시키는 단계;
(f) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계;
(g) 용기를 해동시키는 단계;
(h) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(i) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(j) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결보존된 종양 단편으로부터 TIL을 제조하는 방법은 제1 배양 배지에 OKT-3을 첨가하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 1.5 mm 내지 6 mm 직경 및 1.5 mm 내지 6 mm 두께로 트리밍된다. 또 다른 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 약 6 mm x 6 mm x 6 mm로 트리밍된다. 일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 약 1.5 mm x 1.5 mm, 약 2 mm x 2 mm, 약 2.5 mm x 2.5 mm, 약 3 mm x 3 mm, 약 3.5 mm x 3.5 mm, 약 4 mm x 4 mm, 약 4.5 mm x 4.5 mm, 약 5 mm x 5 mm, 약 5.5 mm x 약 5.5 mm, 또는 약 6 mm x 6 mm의 단면을 갖는 단편으로 트리밍된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항박테리아제는 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 겐타미신을 적어도 20 μg/mL의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 겐타미신을 적어도 50 μg/mL의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제, 항진균제 및 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 암포테리신 B이고, 약 0.25 μg/mL 내지 약 2.5 μg/mL로 존재한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 펀진™이고, 약 5μg/mL 내지 약 50μg/mL로 존재한다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 생리학상 완충 등장성 염수 용액 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 각각의 연속 세척 후에 교체된다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 트리스-완충 염수 (TBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1회 연속 세척에서의 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 다른 연속 세척 중 1회 이상에서 사용된 것과 상이한 생리학상 완충 등장성 염수 용액일 수 있다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 방법은 인간 대상체로부터의 신선한 종양 샘플을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 조직 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 약 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e)는 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 제1 배양 배지는 OKT-3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(d) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (c)에서 단계 (d)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(e) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 (g)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(i) 대상체에게 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계;
(f) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계;
(g) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(h) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(i) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 폐쇄 시스템에서 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (h)에서 단계 (i)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(j) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (i)에서 단계 (j)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(k) 단계 (j)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (j)에서 단계 (k)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(l) 단계 (k)에서 수거된 치료적 TIL을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (k)에서 (l)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(m) 단계 (l)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계;
(n) 단계 (m)으로부터의 주입 백 내의 치료적 TIL 집단을 해동시키는 단계; 및
(o) 대상체에게 단계 (n)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 흑색종, 불응성 흑색종, 전이성 흑색종 및 비소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 2℃ - 8℃에서 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 저장 배지에서 2℃-8℃에서 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(d) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(e) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(f) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(g) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 용기를 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 동결시키는 단계;
(f) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계;
(g) 용기를 해동시키는 단계;
(h) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(i) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(j) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 생리학상 완충 등장성 염수 용액 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 각각의 연속 세척 후에 교체된다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 트리스-완충 염수 (TBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1회 연속 세척에서의 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 다른 연속 세척 중 1회 이상에서 사용된 것과 상이한 생리학상 완충 등장성 염수 용액일 수 있다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 조직 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 약 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(e) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 단계 (g)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (g)에서 (h)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(i) 단계 (h)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(j) 대상체에게 단계 (i)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계;
(f) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계;
(g) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(h) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(i) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 폐쇄 시스템에서 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (h)에서 단계 (i)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(j) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (i)에서 단계 (j)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(k) 단계 (j)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (j)에서 단계 (k)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(l) 단계 (k)에서 수거된 치료적 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (k)에서 (l)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(m) 단계 (l)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계;
(o) 단계 (m)으로부터의 주입 백 내의 치료적 TIL 집단을 해동시키는 단계; 및
(p) 대상체에게 단계 (o)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 용기를 해동시키는 단계;
(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 동결시키는 단계;
(f) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계;
(g) 용기를 해동시키는 단계;
(h) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(i) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(j) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 1.5 mm 내지 6 mm 직경 및 약 1.5 mm 내지 약 6 mm 두께로 트리밍된다. 또 다른 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 약 6 mm x 6 mm x 6 mm로 트리밍된다.
일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항박테리아제는 겐타미신이다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 겐타미신을 적어도 20 μg/mL의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 겐타미신을 적어도 50 μg/mL의 농도로 포함한다. 일부 실시양태에서, 저장 배지는 항박테리아제, 항진균제 및 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 암포테리신 B이고, 약 0.25 μg/mL 내지 약 2.5 μg/mL로 존재한다. 일부 실시양태에서, 항진균제는 펀진이고, 약 5 μg/mL 내지 약 50 μg/mL로 존재한다.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 상기 방법의 트리밍 단계를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 방법은 인간 대상체로부터의 신선한 종양 샘플을 사용하여 수행된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (c) 내지 (e) 또는 단계 (h) 내지 (j)는, 적용가능한 경우, 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(c) 종양 단편을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(d) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (c)에서 단계 (d)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(e) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 단계 (e)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 (g)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(i) 대상체에게 단계 (g)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
(b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(e) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계;
(f) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계;
(g) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(h) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(i) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (h)에서 단계 (i)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(j) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (i)에서 단계 (j)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(k) 단계 (j)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (j)에서 단계 (k)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(l) 단계 (k)에서 수거된 치료적 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (k)에서 (l)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(m) 단계 (l)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계;
(n) 단계 (m)으로부터의 주입 백 내의 치료적 TIL 집단을 해동시키는 단계; 및
(o) 대상체에게 단계 (n)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 흑색종, 불응성 흑색종, 전이성 흑색종 및 비소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 동결 전에 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법을 제공한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) 종양 조직을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(c) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(d) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(e) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(f) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(g) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 동결시키는 단계; 및
(v) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 용기를 해동시키는 단계;
(d) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
(e) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 조직 트리밍 단계를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 해동 단계는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 동결 단계는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃의 온도에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (e) 내지 (g)는, 적용가능한 경우, 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (e) 내지 (g)는, 적용가능한 경우, 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (e) 내지 (g)는, 적용가능한 경우, 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (d) 내지 (f) 또는 단계 (e) 내지 (g)는, 적용가능한 경우, 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함하는 것인 단계;
(b) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
(ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
(iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
(iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
(v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
(c) 종양 조직을 해동시키는 단계;
(d) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
(e) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(f) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(g) 단계 (f)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 단계 (g)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (g)에서 (h)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
(i) 단계 (h)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
(j) 대상체에게 단계 (i)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, 신선한 종양 조직은 종양 조직 저장 방법의 단계 (i)를 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척은 각각 적어도 3분의 적어도 3회 연속 세척을 포함하며, 여기서 HBSS는 각각의 세척 후에 교체된다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)는 용기를 37℃ 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 종양 조직 저장 방법 단계 (iv)는 용기를 약 -125℃ 내지 약 -195℃의 온도에서 동결시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -150℃의 온도에서 동결되고; 일부 실시양태에서, 용기는 약 -125℃ 내지 약 -145℃의 온도에서 동결되고; 추가 실시양태에서, 용기는 약 -135℃의 온도에서 동결된다.
일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 자궁내막 종양 조직, 갑상선 종양 조직, 난소 종양 조직, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 방법은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계와 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계 사이에 분할을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 분할은 제16일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 배양 단계는 약 11일 내에 완료된다. 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 7일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 14일 내에 완료된다. 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 22일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 21일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 20일 내에 완료되고; 일부 실시양태에서, 단계 (e) 내지 (g)는 약 16일 내에 완료된다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 5일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 3일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 11일 내에 완료된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계는 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양) 단계는 약 13일 내에 완료된다. 임의로, 제2 확장 (또는 제2 배양)은 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제5일 또는 제6일에 2개 이상의 배양물로 분할될 수 있다.
TIL을 제조 또는 확장시키는 상기 방법의 일부 실시양태에서, OKT-3은 제0일에 시작하여 배양 배지에 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제5일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제6일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제5일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제6일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하기 위한 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제6일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 5일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 11일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제5일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 단계에서 제1 확장 (또는 제1 배양)이 약 3일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 약 13일 내에 완료되고, 제2 확장 (또는 제2 배양)이 제2 확장 (또는 제2 배양)의 정확히 또는 약 제6일에 2개 이상의 배양물로 분할되도록 적절하게 변형된, 상기 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양)이 한정 배지에서 수행되도록 적절하게 변형된, 상기 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제2 확장 (또는 제2 배양)이 한정 배지에서 수행되도록 적절하게 변형된, 상기 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제1 확장 (또는 제1 배양) 및 제2 확장 (또는 제2 배양)이 동일한 또는 상이한 한정 배지에서 수행되도록 적절하게 변형된, 상기 방법 중 임의의 방법을 제공한다.
TIL 제조 공정
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 TIL을 확장시키는 다양한 방법이 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Jin et al., J. Immunother. 35(3): 283-292 (2012), "Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes in Gas-permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment"] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)은 임상 용도를 위한 단순화된 TIL 생산 방법을 교시한다. 문헌 [Jin et al.]은 제1 TIL 배양에 이은 급속 확장 (REP) 프로토콜을 교시하며, 이는 조합되어 관련 기술분야의 통상의 기술자가 임상적으로 유용한 양의 TIL을 생산할 수 있게 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 종양을 동결보존하는 단계, 종양을 해동시키는 단계 및 문헌 [Jin et al.]에 기재된 공정을 수행하는 단계를 포함하는, TIL을 제조하는 방법을 제공한다. 간략하게, 이 공정은 하기 공정을 수반한다. TIL은 초기에 효소적 종양 소화물 및 예리한 절제에 의해 생산된 종양 단편 (약 1 내지 8 mm3)으로부터 배양될 수 있다. 종양 소화물을 효소 배지 (RPMI 1640, 2 mM 글루타맥스(GlutaMAX), 10 mg/mL 겐타미신, 30U/mL DNase 및 1.0 mg/mL 콜라게나제)에서의 인큐베이션, 이어서 기계적 해리 (젠틀맥스(GentleMACS), 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 캘리포니아주 오번)에 의해 생산한다. 종양을 효소적 배지에 넣은 직후, 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킨다. 이어서, 물질을 5% CO2 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴하고, 5% CO2 하에 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한다. 이어서, 종양을 대략 1분 동안 3번째로 기계적으로 파괴한다. 3번째 기계적 파괴 후, 큰 조직 조각이 존재하는 경우에, 5% CO2 하에 37℃에서 추가 30분의 인큐베이션을 수행하거나 수행하지 않으면서, 추가 1 또는 2회의 기계적 해리를 샘플에 적용할 수 있다. 최종 인큐베이션의 종료시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 사멸 세포를 함유한 경우에, 피콜을 사용하는 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 24-웰 플레이트 (코스타(Costar) 24-웰 세포 배양 클러스터, 편평 바닥; 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 뉴욕주 코닝)에서 TIL 배양을 개시하며, 각각의 웰에 IL-2 (6000 IU/mL; 키론 코포레이션(Chiron Corp.), 캘리포니아주 에머리빌)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM) 중 1x106개의 종양 소화 세포 또는 대략 약 1 내지 8 mm3 크기의 1개의 종양 단편을 시딩한다. CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes 및 약 10 μg/mL 겐타미신으로 보충된 글루타맥스를 갖는 RPMI 1640으로 구성된다. 40 mL 용량 및 10 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (예를 들어, 지-렉스(G-Rex)10; 윌슨 울프 매뉴팩처링(Wilson Wolf Manufacturing), 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 배양을 개시하는 경우에, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10 내지 40 mL의 CM 중 10 내지 40x106개의 생존 종양 소화 세포 또는 5 내지 30개의 종양 단편을 로딩한다. 지-렉스10 및 24-웰 플레이트 둘 다를 가습 인큐베이터 내 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 배양 개시 5일 후에, 배지의 절반을 제거하여 신선한 CM 및 IL-2로 교체하고, 제5일 후에, 배지의 절반을 2-3일마다 교체한다. T-175 플라스크 및 기체-투과성 백 또는 기체-투과성 지-렉스 플라스크를 사용하여 TIL의 REP를 수행한다. T-175 플라스크에서의 TIL REP를 위해, 150 mL의 배지 중에 현탁된 1x106개 TIL을 각각의 T-175 플라스크에 첨가한다. TIL을 "피더" 세포로서 방사선조사된 (50 Gy) 동종 PBMC와 함께 1 대 100의 비로 배양하고, 세포를 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 (50/50 배지)에서 배양한다. T-175 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션한다. 배지의 절반을 제5일에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교체한다. 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3L 백에서 합하고, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V를 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가한다. 각각의 백 내의 세포의 수를 매일 또는 2일마다 계수하고, 신선한 배지를 첨가하여 세포 수가 0.5 내지 2.0x106개 세포/mL를 유지하도록 한다. 100 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500mL 용량 플라스크 (지-렉스100, 윌슨 울프)에서의 TIL REP를 위해, 5x106 내지 10x106개 TIL을 방사선조사된 동종 PBMC와 함께 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 1 대 100의 비로 배양한다. 지-렉스100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션한다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 분리해내고, 원심분리 병에 넣고, 10분 동안 1500 rpm (491 g)으로 원심분리한다. TIL 펠릿을 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 50/50 배지 중에 재현탁시키고, 다시 원래 지-렉스100 플라스크에 첨가한다. TIL이 지-렉스100 플라스크에서 연속으로 확장되는 경우에, 제7일에 각각의 지-렉스100에서의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지 중에 현탁시키고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취물로 나누고, 이를 사용하여 3개의 지-렉스100 플라스크에 시딩한다. 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가한다. 지-렉스100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 4일 후에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 지-렉스100 플라스크에 첨가한다. 배양 제14일에 세포를 수거한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 확장 방법은 동결된 종양으로부터 세포의 확장을 준비하는 것을 포함한다. 종양 샘플을 환자로부터 수집하고, 본원에 개시된 방법에 따라 동결보존한다. 1/100 규모로 수행되는 공정을 위해 세포를 확장시킬 준비를 하는 경우에, 약 6개의 2-3 mm 직경의 동결된 종양 단편을 37℃ 수조를 사용하여 5 + 1분 동안 해동시키고, 겐타미신으로 보충된 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 세척한다. 이어서, 단편을 CM1 배지 또는 약 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 무혈청 또는 한정 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 또는 다른 기체 투과성 용기 내에 넣는다. 이들 사전-REP (또는 제1 확장) 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 5일 동안 인큐베이션한다. 제5일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 사전-REP TIL의 10%를 지-렉스 5M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 또는 다른 기체 투과성 용기 내 CM2 배지 또는 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 무혈청 또는 한정 배지에서 25x106 또는 50x106개 PBMC 피더 세포와 함께 공동-배양함으로써 REP (또는 제2 확장)를 개시한다. 제10일에, 배양물을 10x106개 이하의 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 또는 다른 기체 투과성 용기 내로 분할한다. 분할 배양물을 CM4 배지 또는 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 다른 무혈청 또는 한정 배지에서 추가 6일 동안 인큐베이션한다. 제16일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시킨다. 이러한 공정은 본원에서 "초기 REP 방법 1" 공정 또는 "ER-1"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 확장 방법은 동결된 종양으로부터 세포의 확장을 준비하는 것을 포함한다. 종양 샘플을 환자로부터 수집하고, 본원에 개시된 방법에 따라 동결보존한다. 1/100 규모로 수행되는 공정을 위해 세포를 확장시킬 준비를 하는 경우에, 약 6개의 2-3 mm 직경의 동결된 종양 단편을 37℃ 수조를 사용하여 5 + 1분 동안 해동시키고, 겐타미신으로 보충된 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS)으로 세척한다. 이어서, 단편을 CM1 배지 또는 약 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 무혈청 또는 한정 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 또는 다른 기체 투과성 용기 내에 넣는다. 이들 사전-REP (또는 제1 확장) 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션한다. 제3일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 사전-REP TIL의 10%를 지-렉스 5M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 또는 다른 기체 투과성 용기 내 CM2 배지 또는 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 무혈청 또는 한정 배지에서 25x106 또는 50x106개 PBMC 피더 세포와 함께 공동-배양함으로써 REP (또는 제2 확장)를 개시한다. 제9일에, 배양물을 10x106개 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 또는 다른 기체 투과성 용기 내로 분할한다. 분할 배양물을 CM4 배지 또는 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 다른 무혈청 또는 한정 배지에서 추가 7일 동안 인큐베이션한다. 제16일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시킨다. 이러한 공정은 본원에서 "초기 REP 방법 2" 공정 또는 "ER-2"로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 종양을 동결보존하는 단계, 종양을 해동시키는 단계 및 하기 공정을 수행하는 단계를 포함하는, TIL을 제조하는 방법을 제공한다. TIL은 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15 (IL-2가 바람직함)의 존재 하에 벡터로부터 임의로 발현될 수 있는 암의 항원 (그의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들), 또는 세포를 포함한 1종 이상), 예컨대 HLA-A2 결합 펩티드, 예를 들어 0.3 μM MART-1:26-35 (27L) 또는 gp100:209-217 (210M)에 의한 시험관내 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 자극을 사용한 급속 확장에 의해 생산될 수 있다. 시험관내-유도된 TIL은 HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄스된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 급속하게 확장된다. 대안적으로, TIL은, 예를 들어 방사선조사된 자가 림프구 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2에 의해 재자극될 수 있다. TIL은 각각의 종양 세포 게놈에 의해 코딩된 추정상 10,000개의 유전자 돌연변이의 결과로서 생산된 임의의 독특한 항원의 고도로 강력한 인식을 위해 선택될 수 있다. 그러나, 항원은 독특할 필요가 없다. T-세포는 암의 1종 이상의 항원, 예컨대 1종 이상의 항원의 항원성 부분, 예컨대 에피토프, 또는 암의 세포의 고도로 강력한 인식을 위해 선택될 수 있다. "암의 항원" 및 "그 암의 항원"은 모든 상기 언급된 항원을 포괄하는 것으로 의도된다. 암이 흑색종, 예컨대 전이성 흑색종인 경우에, 바람직하게는 TIL은 MART-1 (예컨대 MART-1:26-35 (27L)), gp100 (예컨대 gp100:209-217 (210M)), 또는 종양 코딩된 돌연변이로부터 유래된 "독특한" 또는 환자-특이적 항원의 고도로 강력한 인식을 위해 선택된다. TIL에 의한 고도로 강력한 인식을 위해 선택될 수 있는 다른 적합한 흑색종 항원은 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 (TRP)1, TRP2 및 MAGE를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항원, 예컨대 NY-ESO-1, 텔로머라제, p53, HER2/neu, 암배아성 항원 또는 전립선-특이적 항원은 폐 암종, 유방암, 결장암, 전립선암 등의 치료를 위해 TIL에 의한 고도로 강력한 인식을 위해 선택되는데 사용될 수 있고, TIL을 위해 선택될 수 있는 다른 항원은 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
IL-2-기반 TIL 확장에 이은 "급속 확장 공정" (REP)은 그의 속도 및 효율로 인해 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되어 왔다. 문헌 [Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. REP는 14-일 기간에 걸쳐 TIL의 1,000배 확장을 가져올 수 있지만, 이는 종종 피더 세포로서 다수의 공여자로부터의 방사선조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 과량 (예를 들어, 200배)으로 필요로 할 뿐만 아니라 항-CD3 항체 (OKT3) 및 고용량의 IL-2를 필요로 한다. 문헌 [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 동결보존된 종양 단편은 치료 또는 다른 목적을 위한 TIL을 제조하기 위해 초기 또는 최초 배양에 적합한 출발점이다.
이들 특색 중 일부를 함유하는 공정 2A로 공지된 예시적인 TIL 공정이 도 1에 도시되어 있다. 공정 1C로 공지된 또 다른 예시적인 TIL 공정이 도 5 및 6에 기재되어 있으며 공정 2A와 비교된다. 공정 2A의 한 실시양태는 도 1에 제시된다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 동결보존된 TIL을 환자 내로 이식하기 전에 그의 대사 활성을 증가시키고 이에 따라 상대 건강을 증가시키도록 재자극시키는 것과 관련된 단계 및 상기 대사 건강을 시험하는 방법을 포함할 수 있다. 본원에 일반적으로 약술된 바와 같이, TIL은 일반적으로 환자 샘플로부터 채취되고, 환자 내로 이식하기 전에 그의 수를 확장시키도록 조작된다. 일부 실시양태에서, TIL은 하기에서 논의된 바와 같이 임의로 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL은 동결보존되고, 환자에게 투여하기 위해 해동될 수 있다. 해동되면, 이들은 또한 환자 내로 주입하기 전에 그의 대사를 증가시키도록 재자극될 수 있다.
일부 실시양태에서, 하기에서 뿐만 아니라 실시예 및 도면에서 상세하게 논의된 바와 같이, 제1 확장 (사전REP로 지칭되는 공정 뿐만 아니라 도 1에서 단계 A로 제시된 공정 포함)은 3 내지 14일로 단축되고, 제2 확장 (REP로 지칭되는 공정 뿐만 아니라 도 1에서 단계 B로 제시된 공정 포함)은 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 (예를 들어, 도 1에서 단계 B로 기재된 확장)은 11일로 단축되고, 제2 확장 (예를 들어, 도 1에서 단계 D로 기재된 확장)은 11일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 하기에서 및 실시예 및 도면에서 상세하게 논의된 바와 같이, 제1 확장 및 제2 확장 (예를 들어, 도 1에서 단계 B 및 단계 D로 기재된 확장)의 조합은 22일로 단축된다.
하기 "단계" 지정 A, B, C 등은 도 1에 관한 것이고, 본원에 기재된 특정 실시양태에 관한 것이다. 하기 및 도 1에서의 단계의 순서는 예시적이고, 단계의 임의의 조합 또는 순서, 뿐만 아니라 추가의 단계, 단계의 반복 및/또는 단계의 생략이 본 출원 및 본원에 개시된 방법에 의해 고려된다.
단계 A. 환자 종양 샘플 수득
일반적으로, TIL은 환자 종양 샘플로부터 초기에 수득되고 ("1차 TIL"), 이어서 본원에 기재된 바와 같이 추가의 조작을 위해 더 큰 집단으로 확장되고, 임의로 동결보존되고, 본원에 약술된 바와 같이 재자극되고, 임의로 TIL 건강의 지표로서 표현형 및 대사 파라미터에 대해 평가된다.
환자 종양 샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 일반적으로 외과적 절제, 바늘 생검 또는 종양과 TIL 세포의 혼합물을 함유하는 샘플을 수득하기 위한 다른 수단을 통해 수득될 수 있다. 일반적으로, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함한 임의의 고형 종양으로부터의 것일 수 있다. 종양 샘플은 또한 액상 종양, 예컨대 혈액 악성종양으로부터 수득된 종양일 수 있다. 고형 종양은 유방암, 췌장암, 전립선암, 결장직장암, 폐암, 뇌암, 신암, 위암 및 피부암 (편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 암 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 TIL은 악성 흑색종 종양으로부터 수득되는데, 이들이 특히 높은 수준의 TIL을 갖는 것으로 보고되었기 때문이다.
용어 "고형 종양"은 통상적으로 낭 또는 액상 영역을 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 용어 "고형 종양 암"은 악성, 신생물성 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 고형 종양 암은 육종, 암종 및 림프종, 예컨대 폐암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 결장암, 직장암 및 방광암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 자궁경부암, 두경부암 (예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 교모세포종, 난소암, 육종, 췌장암, 방광암, 유방암, 삼중 음성 유방암 및 비소세포 폐 암종으로부터 선택된다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.
용어 "혈액 악성종양"은 혈액, 골수, 림프절 및 림프계의 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 포유동물의 조혈 및 림프 조직의 암 및 종양을 지칭한다. 혈액 악성종양은 또한 "액상 종양"으로도 지칭된다. 혈액 악성종양은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 림프종 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 급성 단핵구성 백혈병 (AMoL), 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "B 세포 혈액 악성종양"은 B 세포에 영향을 미치는 혈액 악성종양을 지칭한다.
수득되면, 일반적으로 예리한 절제를 사용하여 종양 샘플을 1 내지 약 8 mm3의 작은 조각으로 단편화하며, 약 2-3 mm3가 특히 유용하다. 이들 단편으로부터 효소적 종양 소화물을 사용하여 TIL을 배양한다. 이러한 종양 소화물은 효소적 배지 (예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 1640 완충제, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 겐타미신, 30 유닛/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제)에서의 인큐베이션에 이어서 기계적 해리 (예를 들어, 조직 해리기를 사용함)에 의해 생산될 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소적 배지에 넣고, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시키고, 이어서 5% CO2 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 단지 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 상기 조건 하에 기계적 해리 및 인큐베이션의 반복 사이클을 수행함으로써 생산될 수 있다. 이러한 공정의 종료시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 사멸 세포를 함유하는 경우에, 피콜 분지형 친수성 폴리사카라이드를 사용하는 밀도 구배 분리가 수행되어 이들 세포를 제거할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0244133 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것이 사용될 수 있다. 임의의 상기 방법이 TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대해 본원에 기재된 임의의 실시양태에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 수거된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수거된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, 단편화는, 예를 들어 소화뿐만 아니라 절제를 포함한 물리적 단편화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단편화는 물리적 단편화이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 절제이다. 일부 실시양태에서, 단편화는 소화에 의한 것이다. 일부 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 소화물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다. 한 실시양태에서, TIL은 환자로부터 수득된 효소적 종양 소화물 및 종양 단편으로부터 초기에 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 종양이 고형 종양인 경우, 종양은, 예를 들어 단계 A (도 1에 제공된 바와 같음)에서 종양 샘플이 수득된 후에 물리적 단편화를 겪는다. 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 전에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 동결보존 후에 일어난다. 일부 실시양태에서, 단편화는 종양을 수득한 후 및 임의의 동결보존의 부재 하에 일어난다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고, 10, 20, 30, 40개 또는 그 초과의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고, 30 또는 40개의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 종양은 단편화되고, 40개의 단편 또는 조각이 제1 확장을 위해 각각의 용기 내에 배치된다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4 내지 약 50개의 단편을 포함하며, 여기서 각각의 단편은 약 27 mm3의 부피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1300 mm3 내지 약 1500 mm3의 총 부피를 갖는 약 30 내지 약 60개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1350 mm3의 총 부피를 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 1 그램 내지 약 1.5 그램의 총 질량을 갖는 약 50개의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 단편은 약 4개의 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, TIL은 종양 단편으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 예리한 절제에 의해 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 8 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 2 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 3 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 4 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 5 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 6 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 7 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 8 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 9 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 10 mm3이다. 일부 실시양태에서, 종양은 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 1 mm x 1 mm x 1 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 2 mm x 2 mm x 2 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 3 mm x 3 mm x 3 mm이다. 일부 실시양태에서, 종양은 4 mm x 4 mm x 4 mm이다. 배양을 개시하기 전에 먼저 종양 조직을 동결시킨 실시양태에서, 종양은 약 6 mm x 6 mm x 6 mm이다.
일부 실시양태에서, 각각의 조각에서 출혈성, 괴사성 및/또는 지방 조직의 양을 최소화하도록 종양이 절제된다. 일부 실시양태에서, 각각의 조각에서 출혈성 조직의 양을 최소화하도록 종양이 절제된다. 일부 실시양태에서, 각각의 조각에서 괴사성 조직의 양을 최소화하도록 종양이 절제된다. 일부 실시양태에서, 각각의 조각에서 지방 조직의 양을 최소화하도록 종양이 절제된다.
일부 실시양태에서, 종양 내부 구조를 유지하도록 종양 단편화가 수행된다. 일부 실시양태에서, 스칼펠에 의한 자르기 동작을 수행하지 않고 종양 단편화가 수행된다. 일부 실시양태에서, TIL은 종양 소화물로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 종양 소화물을 효소적 배지, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 RPMI 1640, 2 mM 글루타맥스, 10 μg/mL 겐타미신, 30 U/mL DNase 및 1.0 mg/mL 콜라게나제에서의 인큐베이션, 이어서 기계적 해리 (젠틀맥스, 밀테니 바이오텍, 캘리포니아주 오번)에 의해 생성한다. 종양을 효소적 배지에 넣은 후, 종양을 대략 1분 동안 기계적으로 해리시킬 수 있다. 이어서 용액을 5% CO2 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 대략 1분 동안 다시 기계적으로 파괴시킬 수 있다. 5% CO2 하에 37℃에서 30분 동안 다시 인큐베이션한 후, 종양을 대략 1분 동안 3번째로 기계적으로 파괴시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 3번째 기계적 파괴 후, 큰 조직 조각이 존재하는 경우에, 5% CO2 하에 37℃에서 추가 30분의 인큐베이션을 수행하거나 수행하지 않으면서, 추가 1 또는 2회의 기계적 해리를 샘플에 적용한다. 일부 실시양태에서, 최종 인큐베이션의 종료시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 사멸 세포를 함유한 경우에, 피콜을 사용하는 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 단계 전에 수거된 세포 현탁액은 "1차 세포 집단" 또는 "새로 수거된" 세포 집단으로 불린다.
일부 실시양태에서, 세포를 샘플 수거 후에 임의로 동결시키고, 단계 B에 기재된 확장 내로의 도입 전에 동결 저장할 수 있으며, 이는 하기에 추가로 상세하게 기재될 뿐만 아니라 도 1에 예시된다.
단계 B: 제1 확장
일부 실시양태에서, 본 방법은 대상체/환자에 대한 투여시 복제 사이클이 증가될 수 있는 어린 TIL을 수득하는 것을 제공하고, 이에 따라 보다 노령의 TIL (예를 들어, 대상체/환자에 대한 투여 전에 보다 많은 라운드의 생체외 복제를 추가로 겪은 "노령의 TIL")에 비해 추가의 치료 이익을 제공할 수 있다. 어린 TIL의 특색은 문헌, 예를 들어 문헌 [Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); 및 Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)] (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한된, 그러나 다수의 유전자 절편의 체세포 재조합에 의해 생산된다. 이들 유전자 절편: V (가변), D (다양성), J (연결) 및 C (불변)은 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 이를 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 새로 수거된 TIL 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 새로 수거된 TIL 및/또는 도 5 및/또는 도 6에 예시된 바와 같은 공정 1C로 지칭되는 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성의 증가는 이뮤노글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 다양성은 이뮤노글로불린에 존재하고, 이뮤노글로불린 중쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 이뮤노글로불린에 존재하고, 이뮤노글로불린 경쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 1종에 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 존재한다.
예를 들어 도 1의 단계 A에 기재된 바와 같이 종양 단편의 절제 또는 소화 후에, 생성된 세포를 IL-2 함유 혈청에서 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하는 조건 하에 배양한다. 일부 실시양태에서, 종양 소화물을 2 mL 웰 내 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 불활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 인큐베이션한다. 이러한 1차 세포 집단을 소정 기간의 일수 동안, 일반적으로 3 내지 14일 동안 배양하여, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 x 108개의 벌크 TIL 세포를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 1차 세포 집단을 7 내지 14일의 기간 동안 배양하여, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 x 108개의 벌크 TIL 세포를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 1차 세포 집단을 10 내지 14일의 기간 동안 배양하여, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 x 108개의 벌크 TIL 세포를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 이러한 1차 세포 집단을 약 11일의 기간 동안 배양하여, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 x 108개의 벌크 TIL 세포를 생성시킨다.
바람직한 실시양태에서, TIL의 확장은 하기 및 본원에 기재된 바와 같은 초기 벌크 TIL 확장 단계 (예를 들어 예컨대 사전-REP로 지칭되는 공정을 포함할 수 있는, 도 1의 단계 B에 기재된 것), 이어서 하기에 단계 D 하에 및 본원에 기재된 바와 같은 제2 확장 (급속 확장 프로토콜 (REP) 단계로 지칭되는 공정을 포함한, 단계 D), 이어서 임의적인 동결보존, 및 이어서 하기 및 본원에 기재된 바와 같은 제2 단계 D (재자극 REP 단계로 지칭되는 공정을 포함함)를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 공정으로부터 수득된 TIL은 본원에 기재된 바와 같은 표현형 특징 및 대사 파라미터에 대해 임의로 특징화될 수 있다.
TIL 배양이 24-웰 플레이트에서, 예를 들어 편평 바닥의 코스타 24-웰 세포 배양 클러스터 (코닝 인코포레이티드, 뉴욕주 코닝)를 사용하여 개시되는 실시양태에서, 각각의 웰에 IL-2 (6000 IU/mL; 키론 코포레이션, 캘리포니아주 에머리빌)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM) 중 1 x 106개의 종양 소화 세포 또는 1개의 종양 단편을 시딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 단편은 약 1 mm3 내지 10 mm3이다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지에 대한 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 단계 B를 위한 CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes 및 10 μg/mL 겐타미신으로 보충된 글루타맥스를 갖는 RPMI 1640으로 이루어진다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (예를 들어, 지-렉스10; 윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 개시되는 실시양태 (도 1)에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10 내지 40 mL의 CM 중 10 x 106 내지 40 x 106개의 생존 종양 소화 세포 또는 5 내지 30개의 종양 단편을 로딩한다. 지-렉스10 및 24-웰 플레이트 둘 다를 5% CO2 하에 37℃에서 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 배양 개시 5일 후에, 배지의 절반을 제거하여 신선한 CM 및 IL-2로 교체하고, 제5일 후에, 배지의 절반을 2 내지 3일마다 교체한다.
종양 단편의 제조 후에, 생성된 세포 (즉, 단편)를 IL-2 함유 혈청에서 종양 및 다른 세포에 비해 TIL의 성장을 유리하게 하는 조건 하에 배양한다. 일부 실시양태에서, 종양 소화물을 2 mL 웰 내 6000 IU/mL의 IL-2를 갖는 불활성화된 인간 AB 혈청을 포함하는 배지에서 (또는 일부 경우, 본원에 약술된 바와 같이, aAPC 세포 집단의 존재 하에) 인큐베이션한다. 이러한 1차 세포 집단을 소정 기간의 일수 동안, 일반적으로 10 내지 14일 동안 배양하여, 벌크 TIL 집단, 일반적으로 약 1 x108개의 벌크 TIL 세포를 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 동안의 성장 배지는 IL-2 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IL은 재조합 인간 IL-2 (rhIL-2)이다. 일부 실시양태에서 IL-2 원액은 1 mg 바이알에 대해 20-30x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 1 mg 바이알에 대해 20x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 1 mg 바이알에 대해 25x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 1 mg 바이알에 대해 30x106 IU/mg의 비활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 4-8x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 5-7x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 6x106 IU/mg의 IL-2의 최종 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, IL-2 원액은 실시예 E에 기재된 바와 같이 제조된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10,000 IU/mL의 IL-2, 약 9,000 IU/mL의 IL-2, 약 8,000 IU/mL의 IL-2, 약 7,000 IU/mL의 IL-2, 약 6000 IU/mL의 IL-2 또는 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 9,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 5,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 8,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 7,000 IU/mL의 IL-2 내지 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 6,000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 1종 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제이다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제이고, 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 우토밀루맙, EU-101, 융합 단백질 및 그의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지 중 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지 중 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 TNFRSF 효능제에 추가로, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하며, 여기서 1종 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 배양 배지는 배양 배지에 대한 약어인 "CM"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 이는 CM1 (배양 배지 1)로 지칭된다. 일부 실시양태에서, CM은 10% 인간 AB 혈청, 25 mM Hepes 및 10 mg/mL 겐타미신으로 보충된 글루타맥스를 갖는 RPMI 1640으로 이루어진다. 배양이 40 mL 용량 및 10 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (예를 들어, 지-렉스10; 윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 개시되는 실시양태 (도 1)에서, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10 내지 40 mL의 CM 중 10 x 106 내지 40 x 106개의 생존 종양 소화 세포 또는 5-30개의 종양 단편을 로딩한다. 지-렉스10 및 24-웰 플레이트 둘 다를 5% CO2 하에 37℃에서 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 배양 개시 5일 후에, 배지의 절반을 제거하여 신선한 CM 및 IL-2로 교체하고, 제5일 후에, 배지의 절반을 2 내지 3일마다 교체한다. 일부 실시양태에서, CM은 실시예에 기재된 CM1이고, 실시예 1을 참조한다. 일부 실시양태에서, 제1 확장은 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 초기 세포 배양 배지 또는 제1 세포 배양 배지는 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 (때때로 사전-REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는, 예를 들어 도 1의 단계 B에 기재된 것과 같은 공정을 포함함)은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 (때때로 사전-REP로 지칭되는 것을 포함할 수 있는, 예를 들어 도 1의 단계 B에 기재된 것과 같은 공정을 포함함), 뿐만 아니라 예를 들어 도 1의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장은 실시예에서 논의되고 도 4 및 5에 제시된 바와 같이 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 단계 B의 제1 확장은 10-14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장은, 예를 들어 도 1의 단계 B에 기재된 바와 같은 확장에서 논의된 바와 같이 11일로 단축된다.
일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 1일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 3일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 4일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 5일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 6일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 7일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 8일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 9일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 10일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 11일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 12일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 13일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 1일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 2일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 3일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 4일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 5일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 6일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 7일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 8일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 9일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 10일 내지 11일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 11일 동안 진행될 수 있다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합이 제1 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 그의 임의의 조합이, 예를 들어 도 1에 따를 뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 단계 B 공정 동안을 비롯하여, 제1 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합이 제1 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21 뿐만 아니라 그의 임의의 조합이 도 1에 따른 및 본원에 기재된 바와 같은 단계 B 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 확장 (사전-REP로 지칭되는 공정을 포함함; 예를 들어 도 1에 따른 단계 B) 공정은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 3 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 단계 B의 제1 확장은 7 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 단계 B의 제1 확장은 10 내지 14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장은 11일로 단축된다.
일부 실시양태에서, 제1 확장, 예를 들어 도 1에 따른 단계 B는 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템이 본원에 기재된 바와 같은 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 단일 생물반응기는, 예를 들어 지-렉스-10 또는 지-렉스-100이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
단계 C: 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행
일부 경우에, 예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터 수득된, 예를 들어 TIL 집단을 포함한 제1 확장으로부터 수득된 벌크 TIL 집단은 본원 하기에서 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 제2 TIL 집단으로 지칭되는, 제1 확장으로부터 수득된 TIL 집단은 제2 확장 (이는 때때로 REP로 지칭되는 확장을 포함할 수 있음)에 적용된 다음, 하기에서 논의된 바와 같이 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 제1 TIL 집단 (때때로 벌크 TIL 집단으로 지칭됨) 또는 제2 TIL 집단 (이는 일부 실시양태에서 REP TIL 집단으로 지칭되는 집단을 포함할 수 있음)은 확장 전에 또는 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 적합한 처리를 위해 유전자 변형에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 선택을 위해 표현형결정될 때까지 저장된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장으로부터 (예를 들어, 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 B로부터) 수득된 TIL은 저장되지 않고, 제2 확장으로 직접적으로 진행된다. 일부 실시양태에서, 제1 확장으로부터 수득된 TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 동결보존되지 않는다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 4일 내지 10일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 약 14일에 일어난다
일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 1일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 TIL 확장은 2일 내지 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 3일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 4일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 5일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 6일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 7일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 8일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 9일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 10일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 11일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 12일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 13일 내지 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 14일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 1일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 2일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 3일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 4일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 5일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 6일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 7일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 8일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 9일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 10일 내지 11일에 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행은 단편화가 일어난 때로부터 11일에 일어난다.
일부 실시양태에서, TIL은 제1 확장 후 및 제2 확장 전에 저장되지 않고, TIL은 제2 확장으로 직접적으로 진행된다 (예를 들어, 일부 실시양태에서, 도 1에 제시된 바와 같은 단계 B에서 단계 D로의 이행 동안 저장이 없음). 일부 실시양태에서, 이행은 본원에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 제1 확장으로부터의 TIL인 제2 TIL 집단은 이행 기간 없이 제2 확장으로 직접적으로 진행된다.
일부 실시양태에서, 제1 확장에서 제2 확장으로의 이행, 예를 들어 도 1에 따른 단계 C는 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템이 본원에 기재된 바와 같은 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 단일 생물반응기는, 예를 들어 지-렉스-10 또는 지-렉스-100이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
시토카인
본원에 기재된 확장 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 고용량의 시토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해, 일반적으로 국제 공개 번호 WO 2015/189356 및 국제 공개 번호 WO 2015/189357 (그 전문이 본원에 명백하게 참조로 포함됨)에 약술된 바와 같이, IL-2, IL-15 및 IL-21 중 2종 이상의 조합으로 시토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2와 IL-15, IL-2와 IL-21, IL-15와 IL-21, 및 IL-2, IL-15와 IL-21을 포함하며, 마지막 경우 많은 실시양태에서 특정한 용도가 발견된다. 시토카인의 조합의 사용은 구체적으로 림프구 및 특히 본원에 기재된 바와 같은 T-세포의 생성을 유리하게 한다.
단계 D: 제2 확장
일부 실시양태에서, TIL 세포 집단은 수거 및 초기 벌크 가공 후에, 예를 들어 도 1에 나타낸 바와 같은 단계 A 및 단계 B, 및 단계 C로 지칭되는 이행 후에 수에 있어서 확장된다. 이 추가의 확장은 본원에서 제2 확장으로 지칭되며, 이는 일반적으로 관련 기술분야에서 급속 확장 공정 (REP; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 바와 같은 공정)으로 지칭되는 확장 공정을 포함할 수 있다. 제2 확장은 일반적으로 기체-투과성 용기에 피더 세포, 시토카인 공급원 및 항-CD3 항체를 포함한 다수의 성분을 포함하는 배양 배지를 사용하여 달성된다.
일부 실시양태에서, TIL의 제2 확장 또는 제2 TIL 확장 (이는 때때로 REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 바와 같은 공정을 포함할 수 있음)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 임의의 TIL 플라스크 또는 용기를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 7일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 8일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 9일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 10일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 11일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 12일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 13일 내지 약 14일 동안 진행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 TIL 확장은 약 14일 동안 진행될 수 있다.
한 실시양태에서, 제2 확장은 본 개시내용의 방법 (예를 들어, REP로 지칭되는 확장; 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에 나타낸 바와 같은 공정을 포함함)을 사용하여 기체 투과성 용기에서 수행될 수 있다. 예를 들어, TIL은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터류킨-15 (IL-15)의 존재 하에 비-특이적 T-세포 수용체 자극을 사용하여 급속하게 확장될 수 있다. 비-특이적 T-세포 수용체 자극은, 예를 들어 항-CD3 항체, 예컨대 약 30 ng/ml의 OKT3, 마우스 모노클로날 항-CD3 항체 (뉴저지주 라리탄 소재 오르토-맥네일(Ortho-McNeil) 또는 캘리포니아주 오번 소재 밀테니 바이오텍으로부터 상업적으로 입수가능함) 또는 UHCT-1 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 바이오레전드(BioLegend)로부터 상업적으로 입수가능함)을 포함할 수 있다. TIL은 임의로 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에, 임의로 벡터로부터 발현될 수 있는 암의 1종 이상의 항원 또는 그의 항원성 부분, 예컨대 에피토프(들), 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)을 제2 확장 동안 포함시킴으로써 시험관내에서 TIL의 추가의 자극을 유도하도록 확장될 수 있다. 다른 적합한 항원은, 예를 들어 NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2 및 VEGFR2 또는 그의 항원 부분을 포함할 수 있다. 또한, HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄스된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 TIL을 급속히 확장시킬 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 방사선조사된 자가 림프구 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2에 의해 TIL을 추가로 재자극시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 재자극은 제2 확장의 일부로서 일어난다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 방사선조사된 자가 림프구의 존재 하에 또는 방사선조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2로 일어난다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, OKT-3 항체는 무로모납이다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 1종 이상의 TNFRSF 효능제를 포함한다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제이다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제이고, 4-1BB 효능제는 우렐루맙, 우토밀루맙, EU-101, 융합 단백질 및 그의 단편, 유도체, 변이체, 바이오시밀러 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지 중 0.1 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다. 일부 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 세포 배양 배지 중 20 μg/mL 내지 40 μg/mL의 농도를 달성하기에 충분한 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 TNFRSF 효능제에 추가로, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 초기 농도의 IL-2 및 약 30 ng/mL의 초기 농도의 OKT-3 항체를 추가로 포함하며, 여기서 1종 이상의 TNFRSF 효능제는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21 뿐만 아니라 그의 임의의 조합은, 예를 들어 도 1에 따를 뿐만 아니라 본원에 기재된 단계 D 공정 동안을 비롯하여, 제2 확장 동안 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합은 제2 확장 동안 조합으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, IL-2, IL-15 및 IL-21 뿐만 아니라 그의 임의의 조합은 도 1에 따른 및 본원에 기재된 바와 같은 단계 D 공정 동안 포함될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3, 항원-제시 피더 세포 및 임의로 TNFRSF 효능제를 포함하는 보충된 세포 배양 배지에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 보충된 세포 배양 배지에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 보충된 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원-제시 피더 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포 배양 배지는 IL-2, OKT-3 및 항원-제시 세포 (APC; 또한 항원-제시 피더 세포로도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 IL-2, OKT-3 및 항원-제시 피더 세포 (즉, 항원 제시 세포)를 포함하는 세포 배양 배지에서 일어난다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15, 약 400 IU/mL의 IL-15, 약 300 IU/mL의 IL-15, 약 200 IU/mL의 IL-15, 약 180 IU/mL의 IL-15, 약 160 IU/mL의 IL-15, 약 140 IU/mL의 IL-15, 약 120 IU/mL의 IL-15, 또는 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 500 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 400 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 300 IU/mL의 IL-15 내지 약 100 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 200 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-15를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 180 IU/mL의 IL-15를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21, 약 15 IU/mL의 IL-21, 약 12 IU/mL의 IL-21, 약 10 IU/mL의 IL-21, 약 5 IU/mL의 IL-21, 약 4 IU/mL의 IL-21, 약 3 IU/mL의 IL-21, 약 2 IU/mL의 IL-21, 약 1 IU/mL의 IL-21, 또는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 20 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 15 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 12 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 10 IU/mL의 IL-21 내지 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 5 IU/mL의 IL-21 내지 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지는 약 2 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.5 IU/mL의 IL-21을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1 IU/mL의 IL-21을 포함한다.
일부 실시양태에서 항원-제시 피더 세포 (APC)는 PBMC이다. 한 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC 및/또는 항원-제시 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 한 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 한 실시양태에서, 급속 확장 및/또는 제2 확장에서의 TIL 대 PBMC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
한 실시양태에서, REP 및/또는 제2 확장은 150 ml 배지 중 벌크 TIL이 100- 또는 200배 과량의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합되어 있는 플라스크에서 수행된다. 배지 교체는 세포가 대안적 성장 챔버로 전달될 때까지 수행된다 (일반적으로 신선한 배지로 호흡을 통해 2/3 배지 교체). 대안적 성장 챔버는 하기에서 보다 충분히 논의된 바와 같이 지-렉스 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 (이는 REP 공정으로 지칭되는 공정을 포함할 수 있음)은 실시예 및 도면에서 논의된 바와 같이 7-14일로 단축된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 11일로 단축된다.
한 실시양태에서, REP 및/또는 제2 확장은 이전에 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (Tran, et al., J. Immunother, 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother, 2003, 26, 332-42) 또는 기체 투과성 배양용기 (지-렉스 플라스크)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 (급속 확장으로 지칭되는 확장을 포함함)은 T-175 플라스크에서 수행되며, 150 mL의 배지 중에 현탁된 약 1 x 106개의 TIL을 각각의 T-175 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL을 mL당 3000 IU의 IL-2 및 ml당 30 ng의 항-CD3 항체로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물에서 배양할 수 있다. T-175 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 배지의 절반을 제5일에 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제7일에 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 L 백에서 합할 수 있고, 5% 인간 AB 혈청을 갖는 300 mL의 AIM V 및 mL당 3000 IU의 IL-2를 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가하였다. 각각의 백 내 세포의 수를 매일 또는 2일마다 계수하였고, 세포 수가 0.5 내지 2.0 x 106개 세포/mL를 유지하도록 신선한 배지를 첨가하였다.
한 실시양태에서, 제2 확장 (이는 REP로 지칭되는 확장, 뿐만 아니라 도 1의 단계 D에서 지칭된 것들을 포함할 수 있음)은 100 cm 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 기체 투과성 플라스크 (지-렉스 100, 미국 미네소타주 뉴 브링톤 소재 윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션으로부터 상업적으로 입수가능함)에서 수행될 수 있으며, 5 x 106 또는 10 x 106개의 TIL을 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2 및 ml당 30 ng의 항-CD3 (OKT3)으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 PBMC와 함께 배양할 수 있다. 지-렉스 100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 분리해내고, 원심분리 병 내에 넣고, 10분 동안 1500 rpm (491 x g)으로 원심분리할 수 있다. TIL 펠릿을 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 배지 중에 재현탁시키고, 다시 원래 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL이 지-렉스 100 플라스크에서 연속적으로 확장될 때, 제7일에 각각의 지-렉스 100에서의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지 중에 현탁시킬 수 있고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취물로 분할할 수 있고, 이를 사용하여 3개의 지-렉스 100 플라스크에 시딩할 수 있다. 이어서, 5% 인간 AB 혈청 및 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. 지-렉스 100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후에 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 배양 제14일에 세포를 수거할 수 있다.
한 실시양태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 확장을 포함함)은 150 ml 배지 중 벌크 TIL이 100- 또는 200배 과량의 불활성화된 피더 세포, 30 mg/mL OKT3 항-CD3 항체 및 3000 IU/mL IL-2와 혼합되어 있는 플라스크에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 배지 교체는 세포가 대안적 성장 챔버로 전달될 때까지 수행된다. 일부 실시양태에서, 일반적으로 신선한 배지로 호흡에 의해 배지의 2/3가 교체된다. 일부 실시양태에서, 대안적 성장 챔버는 하기에서 보다 충분히 논의된 바와 같이 지-렉스 플라스크 및 기체 투과성 용기를 포함한다.
한 실시양태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 확장을 포함함)이 수행되고, TIL이 우수한 종양 반응성을 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0010058 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법이 우수한 종양 반응성을 위한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.
임의로, 세포 생존율 검정은 제2 확장 (REP 확장으로 지칭되는 확장을 포함함) 후에 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 사멸 세포를 선택적으로 표지하고 생존율 평가를 가능하게 하는 트리판 블루 배제 검정이 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL 샘플을 계수하고, 셀로미터 K2 자동화 세포 계수기 (넥스셀롬 바이오사이언스(Nexcelom Bioscience), 매사추세츠주 로렌스)를 사용하여 생존율을 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 표준 셀로미터 K2 이미지 세포측정기 자동 세포 계수기 프로토콜에 따라 생존율을 결정한다.
일부 실시양태에서, TIL의 제2 확장 (REP로 지칭되는 확장을 포함함)은 이전에 기재된 바와 같이 T-175 플라스크 및 기체-투과성 백 (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, 및 Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) 또는 기체-투과성 지-렉스 플라스크를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 기체-투과성 지-렉스 플라스크를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 제2 확장은 T-175 플라스크에서 수행되고, 약 1 x 106개의 TIL을 약 150 mL의 배지 중에 현탁시키고, 이를 각각의 T-175 플라스크에 첨가한다. TIL을 "피더" 세포로서 방사선조사된 (50 Gy) 동종 PBMC와 함께 1 대 100의 비로 배양하고, 세포를 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 (50/50 배지)에서 배양하였다. T-175 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 배지의 절반을 제5일에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교체한다. 일부 실시양태에서, 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 L 백에서 합하고, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V를 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가한다. 각각의 백 내 세포의 수를 매일 또는 2일마다 계수할 수 있고, 세포 수가 약 0.5 내지 약 2.0 x 106개 세포/mL를 유지하도록 신선한 배지를 첨가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 (REP로 지칭되는 확장을 포함함)을 100 cm2 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 플라스크 (지-렉스 100, 윌슨 울프)에서 수행하고 (도 1), 약 5 x 106 또는 10 x 106개의 TIL을 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3으로 보충된 400 mL의 50/50 배지에서 방사선조사된 동종 PBMC와 함께 1 대 100의 비로 배양한다. 지-렉스 100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션한다. 일부 실시양태에서, 제5일에, 250mL의 상청액을 분리해내고, 원심분리 병 내에 넣고, 10분 동안 1500 rpm (491g)으로 원심분리한다. 이어서 TIL 펠릿을 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 50/50 배지 중에 재현탁시키고, 다시 원래 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL이 지-렉스 100 플라스크에서 연속적으로 확장되는 실시양태에서, 제7일에 각각의 지-렉스 100에서의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지 중에 현탁시키고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취물로 분할하고, 이를 사용하여 3개의 지-렉스 100 플라스크에 시딩한다. 이어서, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가한다. 지-렉스 100 플라스크를 5% CO2 하에 37℃에서 인큐베이션하고, 4일 후에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 지-렉스 100 플라스크에 첨가한다. 배양 제14일에 세포를 수거한다.
T 및 B 림프구의 다양한 항원 수용체는 제한된, 그러나 다수의 유전자 절편의 체세포 재조합에 의해 생산된다. 이들 유전자 절편: V (가변), D (다양성), J (연결) 및 C (불변)은 이뮤노글로불린 및 T-세포 수용체 (TCR)의 결합 특이성 및 하류 적용을 결정한다. 본 발명은 T-세포 레퍼토리 다양성을 나타내고 이를 증가시키는 TIL을 생성하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제2 확장에서 수득된 TIL은 T-세포 레퍼토리 다양성의 증가를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 다양성의 증가는 이뮤노글로불린 다양성 및/또는 T-세포 수용체 다양성의 증가이다. 일부 실시양태에서, 다양성은 이뮤노글로불린에 존재하고, 이뮤노글로불린 중쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 이뮤노글로불린에 존재하고, 이뮤노글로불린 경쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 T-세포 수용체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 다양성은 알파, 베타, 감마 및 델타 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된 T-세포 수용체 중 1종에 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파 및/또는 베타의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 알파의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, T-세포 수용체 (TCR) 베타의 발현의 증가가 존재한다. 일부 실시양태에서, TCRab (즉, TCRα/β)의 발현의 증가가 존재한다.
일부 실시양태에서, 제2 확장 배양 배지 (예를 들어, 때때로 CM2 또는 제2 세포 배양 배지로 지칭됨)는 하기에서 보다 상세히 논의된 바와 같이 IL-2, OKT-3, 뿐만 아니라 항원-제시 피더 세포 (APC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 확장, 예를 들어 도 1에 따른 단계 D는 폐쇄 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템이 본원에 기재된 바와 같은 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 단일 생물반응기는, 예를 들어 지-렉스-10 또는 지-렉스-100이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
피더 세포 및 항원 제시 세포
한 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차 (예를 들어 도 1로부터의 단계 D에 기재된 것, 뿐만 아니라 REP로 지칭되는 것과 같은 확장을 포함함)는 REP TIL 확장 동안 및/또는 제2 확장 동안 과량의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전혈 유닛으로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법, 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득되며, 예를 들어 문헌 ["Isolation of mononuclear cells: Methodology and Application", GE Life Sciences technical publication 18-1152-69-AE, https://us.vwr.com/assetsvc/asset/en_US/id/16286835/contents에서 이용가능함]을 참조한다.
일반적으로, 동종 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 방사선조사된 동종 PBMC의 복제 부적격을 평가하기 위한 예시적인 프로토콜을 제공하는 실시예에 기재된 바와 같이, REP 절차에 사용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 제14일에서의 총 생존 세포 수가 REP의 제0일 및/또는 제2 확장의 제0일 (즉, 제2 확장의 시작 일)에서 배양에 투입된 초기 생존 세포 수보다 더 적은 경우에 복제 부적격으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위한 것으로 허용된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 제7일 및 제14일에서 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 총 생존 세포 수가 REP의 제0일 및/또는 제2 확장의 제0일 (즉, 제2 확장의 시작 일)에서 배양에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않은 경우에 복제 부적격으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위한 것으로 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 30 ng/ml OKT3 항체 및 3000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, PBMC는 제7일 및 제14일에서 OKT3 및 IL-2의 존재 하에 배양된 총 생존 세포 수가 REP의 제0일 및/또는 제2 확장의 제0일 (즉, 제2 확장의 시작 일)에서 배양에 투입된 초기 생존 세포 수로부터 증가되지 않은 경우에 복제 부적격으로 간주되고 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용하기 위한 것으로 허용된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 5 내지 60 ng/ml OKT3 항체 및 1000-6000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 10 내지 50 ng/ml OKT3 항체 및 2000-5000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 20 내지 40 ng/ml OKT3 항체 및 2000-4000 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 25 내지 35 ng/ml OKT3 항체 및 2500-3500 IU/ml IL-2의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, 항원-제시 피더 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 항원-제시 피더 세포는 인공 항원-제시 피더 세포이다. 한 실시양태에서, 제2 확장에서 TIL 대 항원-제시 피더 세포의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 한 실시양태에서, 제2 확장에서 TIL 대 항원-제시 피더 세포의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 한 실시양태에서, 제2 확장에서 TIL 대 항원-제시 피더 세포의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5 x 109개 피더 세포 대 약 100 x 106개 TIL의 비를 필요로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5 x 109개 피더 세포 대 약 50 x 106개 TIL의 비를 필요로 한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 약 2.5 x 109개 피더 세포 대 약 25 x 106개 TIL의 비를 필요로 한다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 제2 확장 절차는 제2 확장 동안 과량의 피더 세포를 필요로 한다. 많은 실시양태에서, 피더 세포는 건강한 혈액 공여자로부터의 표준 전혈 유닛으로부터 수득된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. PBMC는 표준 방법, 예컨대 피콜-파크 구배 분리를 사용하여 수득된다. 한 실시양태에서, 인공 항원-제시 (aAPC) 세포가 PBMC 대신 사용된다.
일반적으로, 동종 PBMC는 방사선조사 또는 열 처리를 통해 불활성화되고, 예를 들어 도면 및 실시예에 기재된 예시적인 절차를 포함한 본원에 기재된 TIL 확장 절차에 사용된다.
한 실시양태에서, 인공 항원 제시 세포는 제2 확장에서 PBMC에 대한 대체물로서 또는 그와 조합되어 사용된다.
시토카인
본원에 기재된 TIL 확장 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 고용량의 시토카인, 특히 IL-2를 갖는 배양 배지를 사용한다.
대안적으로, TIL의 급속 확장 및/또는 제2 확장을 위해, 일반적으로 국제 공개 번호 WO 2015/189356 및 국제 공개 번호 WO 2015/189357 (그 전문이 본원에 명백하게 참조로 포함됨)에 약술된 바와 같이, IL-2, IL-15 및 IL-21 중 2종 이상의 조합으로 시토카인의 조합을 사용하는 것이 추가적으로 가능하다. 따라서, 가능한 조합은 IL-2와 IL-15, IL-2와 IL-21, IL-15와 IL-21, 및 IL-2, IL-15와 IL-21을 포함하며, 마지막 경우 많은 실시양태에서 특정한 용도가 발견된다. 시토카인의 조합의 사용은 구체적으로 림프구 및 특히 본원에 기재된 바와 같은 T-세포의 생성을 유리하게 한다.
단계 E: TIL 수거
제2 확장 단계 후에, 세포가 수거될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은, 예를 들어 도 1에 제공된 바와 같이, 1, 2, 3, 4회 또는 그 초과의 확장 단계 후에 수거된다. 일부 실시양태에서 TIL은, 예를 들어 도 1에 제공된 바와 같이, 2회의 확장 단계 후에 수거된다.
TIL은, 예를 들어 원심분리에 의한 것을 포함한, 임의의 적절한 멸균 방식으로 수거될 수 있다. TIL 수거 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 임의의 이러한 공지된 방법이 본 발명의 공정에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 자동화 시스템을 사용하여 수거된다.
세포 수거기 및/또는 세포 가공 시스템은, 예를 들어 프레제니우스 카비, 톰텍 라이프 사이언스(Tomtec Life Science), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 및 이노테크 바이오시스템즈 인터내셔널, 인크.(Inotech Biosystems International, Inc.)를 포함한 다양한 공급처로부터 상업적으로 입수가능하다. 임의의 세포 기반 수거기가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 수거기 및/또는 세포 가공 시스템은 막-기반 세포 수거기이다. 일부 실시양태에서, 세포 수거는 세포 가공 시스템, 예컨대 LOVO 시스템 (프레제니우스 카비에 의해 제조됨)을 통해 이루어진다. 용어 "LOVO 세포 가공 시스템"은 또한, 멸균 및/또는 폐쇄 시스템 환경에서 세포를 포함하는 용액을 막 또는 필터, 예컨대 스피닝 막 또는 스피닝 필터를 통해 펌핑하여, 연속적 유동 및 세포 가공으로 펠릿화 없이 상청액 또는 세포 배양 배지를 분리해내도록 할 수 있는, 임의의 판매업체에 의해 제조된 임의의 기기 또는 장치를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 수거기 및/또는 세포 가공 시스템은 폐쇄 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체-교환, 농축 및/또는 다른 세포 가공 단계를 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수거, 예를 들어 도 1에 따른 단계 E는 폐쇄 시스템 생물반응기로부터 수행된다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템이 본원에 기재된 바와 같은 TIL 확장을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 실시양태에서, 사용된 단일 생물반응기는, 예를 들어 지-렉스-10 또는 지-렉스-100이다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다.
일부 실시양태에서, 도 1에 따른 단계 E가 실시예 7에서 기재된 공정에 따라 수행된다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 성질을 유지하기 위해 멸균 조건 하에 시린지를 통해 접근된다. 일부 실시양태에서, 실시예 7에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다.
일부 실시양태에서, TIL은 실시예 7에 기재된 방법에 따라 수거된다. 일부 실시양태에서, 제1일 내지 제11일 사이의 TIL이 본원에 기재된 바와 같은 방법 (실시예 7에서 제11일 TIL 수거로 지칭됨)을 사용하여 수거된다. 일부 실시양태에서, 제12일 내지 제22일 사이의 TIL이 본원에 기재된 바와 같은 방법 (실시예 7에서 제22일 TIL 수거로 지칭됨)을 사용하여 수거된다.
단계 F: 최종 제제화/주입 백으로의 전달
도 1에 예시적인 순서로 제공된 바와 같이 및 상기 및 본원에 상세히 약술된 바와 같이 단계 A 내지 E가 완료된 후, 세포는 환자에 대한 투여에 사용하기 위해 용기로 전달된다. 일부 실시양태에서, 치료상 충분한 수의 TIL이 상기 기재된 확장 방법을 사용하여 수득되면, 이들은 환자에 대한 투여에 사용하기 위해 용기로 전달된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 APC를 사용하여 확장된 TIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 이는 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내를 포함한다.
임의적인 배지 성분으로서의 항-CD3 항체
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 확장 방법 (REP로 지칭되는 것을 포함함, 예를 들어 도 1 참조)에 사용된 배양 배지는 또한 항-CD3 항체를 포함한다. IL-2와 조합된 항-CD3 항체는 TIL 집단에서 T 세포 활성화 및 세포 분열을 유도한다. 이러한 효과는 전장 항체 뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2 단편에서도 관찰될 수 있으며, 전자가 일반적으로 바람직하다; 예를 들어 문헌 [Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719] (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인지되는 바와 같이, 뮤린, 인간, 영장류, 래트 및 개 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 포유동물로부터의 항-인간 CD3 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한, 본 발명에서 용도가 발견되는 다수의 적합한 항-인간 CD3 항체가 존재한다. 특정한 실시양태에서, OKT3 항-CD3 항체 무로모납 (표 1에 제시된 실시양태 포함)이 사용된다 (뉴저지주 라리탄 소재 오르토-맥네일 또는 캘리포니아주 오번 소재 밀테니 바이오텍으로부터 상업적으로 입수가능함). 항-CD3 항체는 또한 또한 T3 및 CD3ε으로도 공지되어 있는 UHCT1 클론을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는, 예를 들어 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 비실리주맙을 포함한다.
임의적인 배지 성분으로서의 4-1BB (CD137) 효능제
한 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 4-1BB (CD137) 효능제이다. 4-1BB 효능제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 4-1BB 결합 분자일 수 있다. 4-1BB 결합 분자는 인간 또는 포유동물 4-1BB에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 이뮤노글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 결합 분자는 또한 4-1BB에 결합하는 항체 (전장 항체 포함), 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 항체의 조작된 형태, 예를 들어 scFv 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 완전 인간 항체인 항원 결합 단백질이다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 인간화 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 4-1BB 효능제는 항-4-1BB 항체, 인간 항-4-1BB 항체, 마우스 항-4-1BB 항체, 포유동물 항-4-1BB 항체, 모노클로날 항-4-1BB 항체, 폴리클로날 항-4-1BB 항체, 키메라 항-4-1BB 항체, 항-4-1BB 애드넥틴, 항-4-1BB 도메인 항체, 단일 쇄 항-4-1BB 단편, 중쇄 항-4-1BB 단편, 경쇄 항-4-1BB 단편, 항-4-1BB 융합 단백질 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 효능작용 항-4-1BB 항체는 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [Lee, et al., PLOS One, 2013, 8:e69677]. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 효능작용 항-4-1BB 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체 (즉, 단일 세포주로부터 유래된 항체)이다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 EU-101 (유틸렉스 캄파니 리미티드(Eutilex Co. Ltd.)), 우토밀루맙 또는 우렐루맙 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 우토밀루맙 또는 우렐루맙 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다.
바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제 또는 4-1BB 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 다량체 4-1BB 효능제, 예컨대 삼량체 또는 육량체 4-1BB 효능제 (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 가짐)는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 효능작용 모노클로날 항체와 비교하여 우수한 수용체 (4-1BBL) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 복합체 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 임의로 이들 융합 단백질 중 2개 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그보다 더 큰 융합 단백질이, 예를 들어 문헌 [Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics, 2013, 12:2735-47]에 기재되어 있다.
효능작용 4-1BB 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 4-1BB 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 제거하는 효능작용 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 항체-의존성 세포 식세포작용 (ADCP)을 제거하는 효능작용 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 제거하는 효능작용 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 Fc 영역 기능성을 제거하는 효능작용 4-1BB 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 인간 4-1BB (서열식별번호: 9)에 높은 친화도 및 효능작용 활성으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 인간 4-1BB (서열식별번호: 9)에 결합하는 결합 분자이다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 뮤린 4-1BB (서열식별번호: 10)에 결합하는 결합 분자이다. 4-1BB 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 4-1BB 항원의 아미노산 서열은 표 3에 요약되어 있다.
표 3. 4-1BB 항원의 아미노산 서열.
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일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 8 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 8.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 9 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 9.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 1 x 106 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.1 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.4 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.5 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.6 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.7 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.8 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2.9 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 9 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 8 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 7 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 6 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 5 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 4 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 3 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 약 2 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 4-1BB에 결합하는 4-1BB 효능제를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 PF-05082566 또는 MOR-7480으로도 또한 공지된 우토밀루맙 또는 그의 단편, 유도체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 우토밀루맙은 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)로부터 입수가능하다. 우토밀루맙은 이뮤노글로불린 G2-람다, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 구성원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모 사피엔스 (완전 인간) 모노클로날 항체이다. 우토밀루맙의 아미노산 서열은 표 4에 제시되어 있다. 우토밀루맙은 Asn59 및 Asn292에서의 글리코실화 부위; 위치 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) 및 362-420 (CH3)에서의 중쇄 쇄내 디술피드 가교; 위치 22'-87' (VH-VL) 및 136'-195' (CH1-CL)에서의 경쇄 쇄내 디술피드 가교; IgG2A 이소형 위치 218-218, 219-219, 222-222 및 225-225, IgG2A/B 이소형 위치 218-130, 219-219, 222-222 및 225-225, 및 IgG2B 이소형 위치 219-130 (2), 222-222 및 225-225에서의 쇄간 중쇄-중쇄 디술피드 가교; 및 IgG2A 이소형 위치 130-213' (2), IgG2A/B 이소형 위치 218-213' 및 130-213', 및 IgG2B 이소형 위치 218-213' (2)에서의 쇄간 중쇄-경쇄 디술피드 가교를 포함한다. 우토밀루맙 및 그의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,821,867; 8,337,850; 및 9,468,678, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/032433 A1 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 우토밀루맙의 전임상 특징은 문헌 [Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother., 2012, 61:1721-33]에 기재되어 있다. 다양한 혈액 및 고형 종양 적응증에서의 우토밀루맙의 현행 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 및 NCT02554812를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 서열식별번호: 11에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 12에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 11 및 서열식별번호: 12에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 우토밀루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 13에 제시된 서열을 포함하고, 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 14에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 17에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 20에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 우토밀루맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우토밀루맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이며, 여기서 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우토밀루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우토밀루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우토밀루맙이다.
표 4. 우토밀루맙에 관한 4-1BB 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
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바람직한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 BMS-663513 및 20H4.9.h4a로도 또한 공지된 모노클로날 항체 우렐루맙 또는 그의 단편, 유도체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 우렐루맙은 브리스톨-마이어스 스큅, 인크.(Bristol-Myers Squibb, Inc.) 및 크리에이티브 바이오랩스, 인크.(Creative Biolabs, Inc.)로부터 입수가능하다. 우렐루맙은 이뮤노글로불린 G4-카파, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF9 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 9, 4-1BB, T 세포 항원 ILA, CD137)], 호모 사피엔스 (완전 인간) 모노클로날 항체이다. 우렐루맙의 아미노산 서열은 표 5에 제시되어 있다. 우렐루맙은 위치 298 (및 298")에서의 N-글리코실화 부위; 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) 및 368-426 (CH3) (및 위치 22"-95", 148"-204", 262"-322" 및 368"-426")에서의 중쇄 쇄내 디술피드 가교; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 136'-196' (CH1-CL) (및 위치 23"'-88"' 및 136"'-196"')에서의 경쇄 쇄내 디술피드 가교; 위치 227-227" 및 230-230"에서의 쇄간 중쇄-중쇄 디술피드 가교; 및 135-216' 및 135"-216"'에서의 쇄간 중쇄-경쇄 디술피드 가교를 포함한다. 우렐루맙 및 그의 변이체 및 단편의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,288,638 및 8,962,804 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 우렐루맙의 전임상 및 임상 특징은 문헌 [Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016] (http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272에서 이용가능함)에 기재되어 있다. 다양한 혈액 및 고형 종양 적응증에서의 우렐루맙의 현행 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 및 NCT01471210을 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 서열식별번호: 21에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 22에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 23에 제시된 서열을 포함하고, 4-1BB 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 24에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 각각 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26 및 서열식별번호: 27에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29 및 서열식별번호: 30에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 우렐루맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 4-1BB 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 4-1BB 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 4-1BB 효능제 항체이며, 여기서 4-1BB 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 4-1BB 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 우렐루맙이다.
표 5. 우렐루맙에 관한 4-1BB 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00005
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 1D8, 3Elor, 4B4 (바이오레전드 309809), H4-1BB-M127 (비디 파밍겐(BD Pharmingen) 552532), BBK2 (써모 피셔(Thermo Fisher) MS621PABX), 145501 (레인코 테크놀로지스(Leinco Technologies) B591), ATCC 번호 HB-11248로서 기탁되고 미국 특허 번호 6,974,863에 개시된 세포주에 의해 생산된 항체, 5F4 (바이오레전드 31 1503), C65-485 (비디 파밍겐 559446), 미국 특허 출원 공개 번호 US 2005/0095244에 개시된 항체, 미국 특허 번호 7,288,638에 개시된 항체 (예컨대 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), 미국 특허 번호 6,887,673에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 번호 7,214,493에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,569,997에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,905,685에 개시된 항체 (예컨대 4E9 또는 BMS-554271), 미국 특허 번호 6,362,325에 개시된 항체 (예컨대 1D8 또는 BMS-469492; 3H3 또는 BMS-469497; 또는 3El), 미국 특허 번호 6,974,863에 개시된 항체 (예컨대 53A2); 미국 특허 번호 6,210,669에 개시된 항체 (예컨대 1D8, 3B8, 또는 3El), 미국 특허 번호 5,928,893에 기재된 항체, 미국 특허 번호 6,303,121에 개시된 항체, 미국 특허 번호 6,569,997에 개시된 항체, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/177788, WO 2015/119923 및 WO 2010/042433에 개시된 항체, 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 각각의 상기 특허 또는 특허 출원 공개의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, 및 WO 2010/078966 A1; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1, 및 US 2015/0126710 A1; 및 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519, 및 8,450,460 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 4-1BB 효능작용 융합 단백질이다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 도 25에서 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)로서 도시된 바와 같은 4-1BB 효능작용 융합 단백질 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다.
도 25에서 구조 I-A 및 I-B에 제시된 바와 같이, 원통형은 개별 폴리펩티드 결합 도메인을 지칭한다. 구조 I-A 및 I-B는, 예를 들어 4-1BBL 또는 4-1BB에 결합하는 항체로부터 유래된 3개의 선형으로-연결된 TNFRSF 결합 도메인을 포함하며, 이들은 폴딩되어 3가 단백질을 형성하고, 이는 이어서 IgG1-Fc (CH3 및 CH2 도메인 포함)를 통해 제2의 3가 단백질에 연결되며, 또한 디술피드 결합 (소형의 신장된 타원형)을 통해 3가 단백질 2개를 함께 연결하는데 사용되어, 구조를 안정화시키고 6개의 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 신호전달 단백질을 함께 합쳐 신호전달 복합체를 형성할 수 있는 효능제를 제공한다. 원통형으로서 표시된 TNFRSF 결합 도메인은, 예를 들어 친수성 잔기 및 가요성을 위한 Gly 및 Ser 서열, 뿐만 아니라 용해도를 위한 Glu 및 Lys를 포함할 수 있는 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 쇄를 포함하는 scFv 도메인일 수 있다. 임의의 scFv 도메인 설계, 예컨대 문헌 [de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208] 또는 본원의 다른 곳에 포함된 참고문헌에 기재된 것이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 융합 단백질 구조는 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 및 8,450,460 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
구조 I-A의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열이 표 6에 제공되어 있다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열식별번호: 31의 아미노산 17-230) 및 완전 힌지 도메인 (서열식별번호: 31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 한 부분 (예를 들어, 서열식별번호: 31의 아미노산 4-16)을 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결시키기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함한, 서열식별번호: 32 내지 서열식별번호: 41에 제공된 실시양태로부터 선택될 수 있다.
표 6. C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질 설계 (구조 I-A)를 갖는, 4-1BB 융합 단백질을 포함한 TNFRSF 융합 단백질에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00006
구조 I-B의 다른 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 7에 제공되어 있다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우에, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 43 내지 서열식별번호: 45에 제시된 실시양태로부터 선택된다.
표 7. N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질 설계 (구조 I-B)를 갖는, 4-1BB 융합 단백질을 포함한 TNFRSF 융합 단백질에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00007
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 우토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우렐루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 우토밀루맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 4 또는 표 5에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 상기의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 및 바이오시밀러를 포함한다.
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 4-1BBL 서열을 포함하는 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열식별번호: 46에 따른 서열을 포함하는 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 가용성 4-1BBL 서열을 포함하는 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 서열식별번호: 47에 따른 서열을 포함하는 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커로 연결되는 것인 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 23 및 서열식별번호: 24에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커로 연결되는 것인 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 4-1BB 효능제 융합 단백질은 표 8에 제공된 VH 및 VL 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커로 연결되는 것인 1개 이상의 4-1BB 결합 도메인을 포함한다.
표 8. 융합 단백질 내의 4-1BB 결합 도메인으로서 또는 scFv 4-1BB 효능제 항체로서 유용한 추가의 폴리펩티드 도메인.
Figure pct00008
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 가용성 제3 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단 단부에 추가의 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인인, 4-1BB 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 4-1BB 결합 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 4-1BB 결합 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 제3 가용성 4-1BB 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단 단부에 추가의 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 여기서 각각의 가용성 4-1BB 도메인에는 줄기 영역 (이는 삼량체화에 기여하고, 세포 막까지의 특정 거리를 제공하지만, 4-1BB 결합 도메인의 부분은 아님)이 결여되어 있고, 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 갖는 것인 4-1BB 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 시토카인 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인에는 줄기 영역이 결여되어 있고, 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 갖고, 여기서 각각의 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인은 4-1BB 결합 도메인인 4-1BB 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 임의의 상기 VL 도메인에 연결된 임의의 상기 VH 도메인을 포함하는 4-1BB 효능작용 scFv 항체이다.
한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 BPS 바이오사이언스(BPS Bioscience)로부터 상업적으로 입수가능한 BPS 바이오사이언스 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 79097-2이다. 한 실시양태에서, 4-1BB 효능제는 미국 뉴욕주 셜리 소재 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs)로부터 상업적으로 입수가능한 크리에이티브 바이오랩스 4-1BB 효능제 항체 카탈로그 번호 MOM-18179이다.
임의적인 배지 성분으로서의 OX40 (CD134) 효능제
한 실시양태에서, TNFRSF 효능제는 OX40 (CD134) 효능제이다. OX40 효능제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 OX40 결합 분자일 수 있다. OX40 결합 분자는 인간 또는 포유동물 OX40에 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 융합 단백질일 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 이뮤노글로불린 중쇄를 포함할 수 있다. OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 중쇄 및 경쇄를 둘 다 가질 수 있다. 본원에 사용된 용어 결합 분자는 또한 OX40에 결합하는 항체 (전장 항체 포함), 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 및 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편, 및 항체의 조작된 형태, 예를 들어 scFv 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 완전 인간 항체인 항원 결합 단백질이다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 인간화 항체인 항원 결합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 OX40 효능제는 항-OX40 항체, 인간 항-OX40 항체, 마우스 항-OX40 항체, 포유동물 항-OX40 항체, 모노클로날 항-OX40 항체, 폴리클로날 항-OX40 항체, 키메라 항-OX40 항체, 항-OX40 애드넥틴, 항-OX40 도메인 항체, 단일 쇄 항-OX40 단편, 중쇄 항-OX40 단편, 경쇄 항-OX40 단편, 항-OX40 융합 단백질 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, OX40 효능제는 효능작용 항-OX40 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체 (즉, 단일 세포주로부터 유래된 항체)이다.
바람직한 실시양태에서, OX40 효능제 또는 OX40 결합 분자는 또한 융합 단백질일 수 있다. OX40L에 융합된 Fc 도메인을 포함하는 OX40 융합 단백질은, 예를 들어 문헌 [Sadun, et al., J. Immunother. 2009, 182, 1481-89]에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 다량체 OX40 효능제, 예컨대 삼량체 또는 육량체 OX40 효능제 (3개 또는 6개의 리간드 결합 도메인을 가짐)는, 전형적으로 2개의 리간드 결합 도메인을 보유하는 효능작용 모노클로날 항체와 비교하여 우수한 수용체 (OX40L) 클러스터링 및 내부 세포 신호전달 복합체 형성을 유도할 수 있다. 3개의 TNFRSF 결합 도메인 및 IgG1-Fc를 포함하고 임의로 이들 융합 단백질 중 2개 이상을 추가로 연결하는 삼량체 (3가) 또는 육량체 (또는 6가) 또는 그보다 더 큰 융합 단백질이, 예를 들어 문헌 [Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47]에 기재되어 있다.
효능작용 OX40 항체 및 융합 단백질은 강한 면역 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 문헌 [Curti, et al., Cancer Res. 2013, 73, 7189-98]. 바람직한 실시양태에서, OX40 효능제는 독성을 감소시키기에 충분한 방식으로 OX40 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 예를 들어 NK 세포 세포독성을 제거하는 효능작용 OX40 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체-의존성 세포 식세포작용 (ADCP)을 제거하는 효능작용 OX40 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 제거하는 효능작용 OX40 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 Fc 영역 기능성을 제거하는 효능작용 OX40 모노클로날 항체 또는 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 높은 친화도 및 효능작용 활성으로 인간 OX40 (서열식별번호: 54)에 결합하는 것을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 인간 OX40 (서열식별번호: 54)에 결합하는 결합 분자이다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 뮤린 OX40 (서열식별번호: 55)에 결합하는 결합 분자이다. OX40 효능제 또는 결합 분자가 결합하는 OX40 항원의 아미노산 서열은 표 9에 요약되어 있다.
표 9. OX40 항원의 아미노산 서열.
Figure pct00009
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 8 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 8.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 9 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 9.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 또는 약 1 x 106 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.1 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.4 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.5 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.6 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.7 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.8 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2.9 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 또는 약 3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물, 공정 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 9 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 8 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 7 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 6 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 5 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 4 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 3 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 약 2 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50으로 인간 또는 뮤린 OX40에 결합하는 OX40 효능제를 포함한다.
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 MEDI0562 또는 MEDI-0562로도 또한 공지된 타볼릭시주맙이다. 타볼릭시주맙은 아스트라제네카, 인크.(AstraZeneca, Inc.)의 메드이뮨(MedImmune) 자회사로부터 입수가능하다. 타볼릭시주맙은 이뮤노글로불린 G1-카파, 항-[호모 사피엔스 TNFRSF4 (종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리 구성원 4, OX40, CD134)], 인간화 및 키메라 모노클로날 항체이다. 타볼릭시주맙의 아미노산 서열은 표 10에 제시되어 있다. 타볼릭시주맙은 푸코실화 복합체 이중-안테나 CHO-유형 글리칸을 갖는, 위치 301 및 301"에서의 N-글리코실화 부위; 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 265-325 (CH2) 및 371-429 (CH3) (및 위치 22"-95", 148"-204", 265"-325" 및 371"-429")에서의 중쇄 쇄내 디술피드 가교; 위치 23'-88' (VH-VL) 및 134'-194' (CH1-CL) (및 위치 23"'-88"' 및 134"'-194"')에서의 경쇄 쇄내 디술피드 가교; 위치 230-230" 및 233-233"에서의 쇄간 중쇄-중쇄 디술피드 가교; 및 224-214' 및 224"-214"'에서의 쇄간 중쇄-경쇄 디술피드 가교를 포함한다. 다양한 고형 종양 적응증에서의 타볼릭시주맙의 현행 임상 시험은 미국 국립 보건원 clinicaltrials.gov 식별자 NCT02318394 및 NCT02705482를 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 서열식별번호: 56에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 57에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 56 및 서열식별번호: 57에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 58에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 59에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 항체를 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 61 및 서열식별번호: 62에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 64 및 서열식별번호: 65에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 타볼릭시주맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 OX40 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이며, 여기서 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 타볼릭시주맙이다.
표 10. 타볼릭시주맙에 관한 OX40 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00010
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 화이자, 인크.로부터 입수가능한 완전 인간 항체인 11D4이다. 11D4의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,960,515; 8,236,930; 및 9,028,824 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 11D4의 아미노산 서열은 표 11에 제시되어 있다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 서열식별번호: 66에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 67에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 11D4의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 68에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 69에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 70, 서열식별번호: 71 및 서열식별번호: 72에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74 및 서열식별번호: 75에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 11D4에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 OX40 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이며, 여기서 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 11D4이다.
표 11. 11D4에 관한 OX40 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00011
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 화이자, 인크.로부터 입수가능한 완전 인간 항체인 18D8이다. 18D8의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 7,960,515; 8,236,930; 및 9,028,824 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 18D8의 아미노산 서열은 표 12에 제시되어 있다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 서열식별번호: 76에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 77에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 76 및 서열식별번호: 77에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 18D8의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 78에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 79에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 82에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84 및 서열식별번호: 85에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 18D8에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 OX40 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이며, 여기서 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 18D8이다.
표 12. 18D8에 관한 OX40 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00012
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 글락소스미스클라인 피엘씨(GlaxoSmithKline plc)로부터 입수가능한 인간화 항체인 Hu119-122이다. Hu119-122의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 9,006,399 및 9,163,085 및 국제 특허 공개 번호 WO 2012/027328 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. Hu119-122의 아미노산 서열은 표 13에 제시된다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 Hu119-122의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 86에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 87에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 88, 서열식별번호: 89 및 서열식별번호: 90에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 91, 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 93에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 Hu119-122에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 OX40 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이며, 여기서 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu119-122이다.
표 13. Hu119-122에 관한 OX40 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00013
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 글락소스미스클라인 피엘씨로부터 입수가능한 인간화 항체인 Hu106-222이다. Hu106-222의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 9,006,399 및 9,163,085, 및 국제 특허 공개 번호 WO 2012/027328 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. Hu106-222의 아미노산 서열은 표 14에 제시되어 있다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 Hu106-222의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 94에 제시된 서열을 포함하고, OX40 효능제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 95에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 각각 서열식별번호: 96, 서열식별번호: 97 및 서열식별번호: 98에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 99, 서열식별번호: 100 및 서열식별번호: 101에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 Hu106-222에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 OX40 효능제 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러 모노클로날 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 OX40 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 OX40 효능제 항체이며, 여기서 OX40 효능제 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. OX40 효능제 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 Hu106-222이다.
표 14. Hu106-222에 관한 OX40 효능제 항체에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00014
일부 실시양태에서, OX40 효능제 항체는 MEDI6469 (또한 9B12로도 지칭됨)이다. MEDI6469는 뮤린 모노클로날 항체이다. 문헌 [Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585]. 일부 실시양태에서 OX40 효능제는 문헌 [Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585] (이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 바이오베스트 인크.(Biovest Inc.) (미국 매사추세츠주 말번)에 의해 기탁된 9B12 하이브리도마에 의해 생산된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 MEDI6469의 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 MEDI6469의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 L106 (비디 파밍겐 제품 #340420)이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (비디 파밍겐 제품 #340420)의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체 L106 (비디 파밍겐 제품 #340420)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 ACT35 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 카탈로그 #20073)이다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35 (산타 크루즈 바이오테크놀로지, 카탈로그 #20073)의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, OX40 효능제는 항체 ACT35 (산타 크루즈 바이오테크놀로지, 카탈로그 #20073)의 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 뉴햄프셔주 웨스트 레바논 소재 바이오엑스셀 인크(BioXcell Inc)의 인비보맙(InVivoMAb)으로부터 상업적으로 입수가능한 뮤린 모노클로날 항체 항-mCD134/mOX40 (클론 OX86)이다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191 및 WO 2014/148895; 유럽 특허 출원 EP 0672141; 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506 및 US 2015/132288 (클론 20E5 및 12H3 포함); 및 미국 특허 번호 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399 및 9,163,085 (이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 OX40 효능제로부터 선택된다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 구조 I-A (C-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질) 또는 구조 I-B (N-말단 Fc-항체 단편 융합 단백질)에 도시된 바와 같은 OX40 효능작용 융합 단백질 또는 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 또는 바이오시밀러이다. 구조 I-A 및 I-B의 특성은 상기 및 미국 특허 번호 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 및 8,450,460 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 구조 I-A의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 6에 제공된다. Fc 도메인은 바람직하게는 완전 불변 도메인 (서열식별번호: 31의 아미노산 17-230) 및 완전 힌지 도메인 (서열식별번호: 31의 아미노산 1-16) 또는 힌지 도메인의 한 부분 (예를 들어, 서열식별번호: 31의 아미노산 4-16)을 포함한다. C-말단 Fc-항체를 연결시키기 위한 바람직한 링커는 추가의 폴리펩티드의 융합에 적합한 링커를 포함한, 서열식별번호: 32 내지 서열식별번호: 41에 제공된 실시양태로부터 선택될 수 있다. 마찬가지로, 구조 I-B의 폴리펩티드 도메인에 대한 아미노산 서열은 표 7에 제공된다. Fc 항체 단편이 구조 I-B에서와 같이 TNRFSF 융합 단백질의 N-말단에 융합되는 경우에, Fc 모듈의 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 42에 제시된 것이고, 링커 서열은 바람직하게는 서열식별번호: 43 내지 서열식별번호: 45에 제시된 실시양태로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 타볼릭시주맙의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 11D4의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 18D8의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu119-122의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, Hu106-222의 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 표 19에 기재된 가변 중쇄 및 가변 경쇄로부터 선택된 가변 중쇄 및 가변 경쇄, 상기의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 OX40 결합 도메인 및 그의 단편, 유도체, 접합체, 변이체 및 바이오시밀러를 포함한다.
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 OX40L 서열을 포함하는 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열식별번호: 102에 따른 서열을 포함하는 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 가용성 OX40L 서열을 포함하는 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열식별번호: 103에 따른 서열을 포함하는 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 서열식별번호: 104에 따른 서열을 포함하는 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 58 및 서열식별번호: 59에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 68 및 서열식별번호: 69에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 86 및 서열식별번호: 87에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 각각 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 95에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 구조 I-A 또는 I-B에 따른 OX40 효능제 융합 단백질은 표 15에 제공된 VH 및 VL 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함하는 scFv 도메인이며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 링커에 의해 연결되는 것인 1개 이상의 OX40 결합 도메인을 포함한다.
표 15. 융합 단백질 (예를 들어, 구조 I-A 및 I-B) 내의 OX40 결합 도메인으로서 또는 scFv OX40 효능제 항체로서 유용한 추가의 폴리펩티드 도메인.
Figure pct00015
Figure pct00016
한 실시양태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단 단부에 추가의 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인인, OX40 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 OX40 결합 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 OX40 결합 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 제3 가용성 OX40 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및/또는 C-말단 단부에 추가의 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 도메인은 Fab 또는 Fc 단편 도메인이고, 여기서 각각의 가용성 OX40 결합 도메인에는 줄기 영역 (이는 삼량체화에 기여하고, 세포 막까지의 특정 거리를 제공하지만, OX40 결합 도메인의 부분은 아님)이 결여되어 있고, 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 갖는 것인 OX40 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 (i) 제1 가용성 종양 괴사 인자 (TNF) 슈퍼패밀리 시토카인 도메인; (ii) 제1 펩티드 링커; (iii) 제2 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인; (iv) 제2 펩티드 링커 및 (v) 제3 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 가용성 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인에는 줄기 영역이 결여되어 있고, 제1 및 제2 펩티드 링커는 독립적으로 3-8개 아미노산의 길이를 갖고, 여기서 TNF 슈퍼패밀리 시토카인 도메인은 OX40 결합 도메인인 OX40 효능작용 단일-쇄 융합 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, OX40 효능제는 MEDI6383이다. MEDI6383은 OX40 효능작용 융합 단백질이고, 미국 특허 번호 6,312,700 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 임의의 상기 VL 도메인에 연결된 임의의 상기 VH 도메인을 포함하는 OX40 효능작용 scFv 항체이다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 미국 뉴욕주 셜리 소재 크리에이티브 바이오랩스, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한 크리에이티브 바이오랩스 OX40 효능제 모노클로날 항체 MOM-18455이다.
한 실시양태에서, OX40 효능제는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 바이오레전드, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한 OX40 효능작용 항체 클론 Ber-ACT35이다.
임의적인 세포 생존율 분석
임의로, 세포 생존율 검정은 관련 기술분야에 공지된 표준 검정을 사용하여, 제1 확장 (때때로 초기 벌크 확장으로 지칭됨) 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 사멸 세포를 선택적으로 표지하고 생존율 평가를 가능하게 하는 트리판 블루 배제 검정이 벌크 TIL의 샘플에 대해 수행될 수 있다. 생존율을 시험하는데 사용하기 위한 다른 검정은 알라마르 블루 검정; 및 MTT 검정을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
세포 수, 생존율, 유동 세포측정법
일부 실시양태에서, 세포 수 및/또는 생존율이 측정된다. 마커, 예컨대 비제한적으로 CD3, CD4, CD8 및 CD56, 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 기재된 임의의 다른 것의 발현은 항체, 예를 들어 비제한적으로 비디 바이오-사이언시스 (비디 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)로부터 상업적으로 입수가능한 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 FACS칸토(FACSCanto)™ 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)를 사용하여 측정될 수 있다. 세포는 일회용 c-칩 혈구계 (VWR, 일리노이주 바타비아)를 사용하여 수동으로 계수될 수 있으며, 생존율은 트리판 블루 염색을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 세포 생존율은 또한 미국 출원 15/863,634 ("Processes for Production of Tumor Infiltrating Lymphocytes and Uses of Same in Immunotherapy") (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기초하여 검정될 수 있다.
일부 경우에, 벌크 TIL 집단은 하기에서 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 REP에 적용된 다음, 하기에서 논의된 바와 같이 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우, 벌크 또는 REP TIL 집단은 적합한 처리를 위해 유전자 변형에 적용될 수 있다.
본 개시내용에 따르면, TIL을 생존율에 대해 검정하는 방법 및/또는 대상체에 대한 투여에서 추가로 사용하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 종양 침윤 림프구 (TIL)를 검정하는 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 제1 TIL 집단을 수득하는 단계;
(ii) IL-2 및 임의로 OKT-3을 포함하는 세포 배양 배지에서 제1 TIL 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계;
(iii) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많은 것인 단계;
(iv) 제3 TIL 집단을 수거, 세척 및 동결보존하는 단계;
(v) 동결보존된 TIL을 극저온 온도에서 저장하는 단계;
(vi) 제3 TIL 집단을 해동시켜 해동된 제3 TIL 집단을 제공하는 단계;
(vii) 해동된 제3 집단의 세포 배양 배지를 적어도 3일의 추가의 확장 기간 (때때로 재REP 기간으로 지칭됨) 동안 IL-2, OKT-3 및 APC로 보충함으로써 해동된 제3 TIL 집단의 한 부분의 추가의 제2 확장을 수행하는 단계이며, 여기서 제3 확장을 수행하여 제4 TIL 집단을 수득하고, 여기서 제4 TIL 집단 내의 TIL의 수를 제3 TIL 집단 내의 TIL의 수와 비교하여 소정 비를 얻는 것인 단계;
(viii) 단계 (vii)에서의 비에 기초하여 해동된 TIL 집단이 환자에 대한 투여에 적합한지 여부를 결정하는 단계; 및
(ix) 단계 (viii)에서 제4 TIL 집단 내의 TIL 수 대 제3 TIL 집단 내의 TIL의 수의 비가 5:1을 초과하는 것으로 결정되는 경우에 환자에게 치료 유효 투여량의 해동된 제3 TIL 집단을 투여하는 단계.
일부 실시양태에서, TIL은 단계 (vii) 후에 생존율에 대해 검정된다.
본 개시내용은 또한 TIL을 검정하는 추가의 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, TIL을 검정하는 방법을 제공한다:
(i) 동결보존된 제1 TIL 집단의 한 부분을 수득하는 단계;
(ii) 동결보존된 제1 TIL 집단의 부분을 해동시키는 단계;
(iii) IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)를 포함하는 세포 배양 배지에서 적어도 3일의 추가의 확장 기간 (때때로 재REP 기간으로 지칭됨) 동안 제1 TIL 집단의 부분을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 TIL 집단으로부터의 부분을 제2 TIL 집단과 비교하여 TIL의 수의 비를 얻고, 여기서 제2 TIL 집단 내의 TIL의 수 대 제1 TIL 집단의 부분 내의 TIL의 수의 비는 5:1 초과인 단계;
(iv) 단계 (iii)에서의 비에 기초하여 제1 TIL 집단이 환자에 대한 치료적 투여에 적합한지 여부를 결정하는 단계; 및
(v) 단계 (iv)에서 제2 TIL 집단 내의 TIL 수 대 제1 TIL 집단 내의 TIL의 수의 비가 5:1 초과인 것으로 결정되는 경우에 제1 TIL 집단이 치료적 투여에 사용하기에 적합한 것으로 결정하는 단계.
일부 실시양태에서, 제2 TIL 집단 내의 TIL 수 대 제1 TIL 집단의 부분 내의 TIL의 수의 비는 50:1 초과이다.
일부 실시양태에서, 방법은 본원에 제공된 임의의 실시양태에 기재된 바와 같은 방법에 따라 단계 (i)로부터의 전체 동결보존된 제1 TIL 집단의 확장을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 단계 (i)로부터의 전체 동결보존된 제1 TIL 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
세포 배양 배지
한 실시양태에서, 상기에서 논의된 것뿐만 아니라 도 1에 예시된 것을 포함한, TIL을 확장시키는 방법은 약 5,000 mL 내지 약 25,000 mL의 세포 배지, 약 5,000 mL 내지 약 10,000 mL의 세포 배지, 또는 약 5,800 mL 내지 약 8,700 mL의 세포 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, 제1 확장에서의 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, 제2 확장에서의 배지는 무혈청 배지이다. 일부 실시양태에서, 제1 확장 및 제2 확장에서의 배지는 둘 다 무혈청 배지이다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 1종 이하의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어 AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 술페이트 및 10 μM 겐타미신 술페이트) 세포 배양 배지 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 유리하게는 TIL의 수를 확장시키는데 필요한 배지의 양 및 배지의 유형의 수를 감소시킨다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 3일 또는 4일마다보다 더 빈번하지 않게 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기에서 세포의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장시키는데 필요한 절차를 단순화시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 확장 공정에 사용되는 배양 배지는 무혈청 배지 또는 한정 배지이다. 일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기초 세포 배지 및 혈청 보충제 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 부분적으로 혈청-함유 배지의 로트-대-로트 변동으로 인한 실험적 변동을 예방 및/또는 감소시키는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 기초 세포 배지 및 혈청 보충제 및/또는 혈청 대체물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기초 세포 배지는 CTS™ 옵트마이저(OpTmizer)™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CTS™ AIM-V SFM, 림포원(LymphoONE)™ T-세포 확장 제노-프리 배지, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 혈청 보충제 또는 혈청 대체물은 CTS™ 옵트마이저 T-세포 확장 혈청 보충제, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 1종 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 1종 이상의 아미노산, 1종 이상의 비타민, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 항산화제, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 1종 이상의 콜라겐 전구체, 1종 이상의 항생제 및 1종 이상의 미량 원소 중 1종 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민, 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 2-메르캅토에탄올을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 면역 세포 혈청 대체물은 CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 기초 배지, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM, CTS™ AIM-V 배지, CST™ AIM-V SFM, 림포원™ T-세포 확장 제노-프리 배지, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적인 성장 배지와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지 중 총 혈청 대체물 농도 (부피%)는 총 무혈청 또는 한정 배지의 부피 기준 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 3%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 5%이다. 일부 실시양태에서, 총 혈청 대체물 농도는 무혈청 또는 한정 배지의 총 부피의 약 10%이다.
일부 실시양태에서, 무혈청 또는 한정 배지는 CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM (써모피셔 사이언티픽)이다. CTS™ 옵트마이저™의 임의의 제제가 본 발명에 유용하다. CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 1L CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 기초 배지 및 26 mL CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 55mM의 2-메르캅토에탄올과 함께, 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽)로 보충된다.
일부 실시양태에서, 한정 배지는 CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM (써모피셔 사이언티픽)이다. CTS™ 옵트마이저™의 임의의 제제가 본 발명에 유용하다. CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 1L CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 기초 배지 및 26 mL CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 보충제의 조합이며, 이들은 사용 전에 함께 혼합된다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 55mM의 2-메르캅토에탄올과 함께, 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽)로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽), 55mM의 2-메르캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충된다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽), 55mM의 2-메르캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되고, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽), 55mM의 2-메르캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되고, 추가로 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽), 55mM의 2-메르캅토에탄올 및 2mM의 L-글루타민으로 보충되고, 추가로 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 55mM의 2-메르캅토에탄올로 보충되고, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 55mM의 2-메르캅토에탄올로 보충되고, 추가로 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 55mM의 2-메르캅토에탄올로 보충되고, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되고, 추가로 약 1000 IU/mL 내지 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되고, 추가로 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 실시양태에서, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM은 약 3%의 CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (SR) (써모피셔 사이언티픽) 및 약 2mM 글루타민으로 보충되고, 추가로 약 6000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 0.1mM 내지 약 10mM, 0.5mM 내지 약 9mM, 1mM 내지 약 8mM, 2mM 내지 약 7mM, 3mM 내지 약 6mM 또는 4mM 내지 약 5 mM 농도의 글루타민 (즉, 글루타맥스®)으로 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 2mM 농도의 글루타민 (즉, 글루타맥스 ®)으로 보충된다.
일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 5mM 내지 약 150mM, 10mM 내지 약 140mM, 15mM 내지 약 130mM, 20mM 내지 약 120mM, 25mM 내지 약 110mM, 30mM 내지 약 100mM, 35mM 내지 약 95mM, 40mM 내지 약 90mM, 45mM 내지 약 85mM, 50mM 내지 약 80mM, 55mM 내지 약 75mM, 60mM 내지 약 70mM, 또는 약 65mM 농도의 2-메르캅토에탄올로 보충된다. 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 한정 배지는 약 55mM 농도의 2-메르캅토에탄올로 보충된다.
일부 실시양태에서, 국제 PCT 공개 번호 WO/1998/030679 (이는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 한정 배지가 본 발명에 유용하다. 상기 공개에, 무혈청 진핵 세포 배양 배지가 기재되어 있다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지는 무혈청 배양물 내의 세포의 성장을 지지할 수 있는 무혈청 보충제로 보충된 기초 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 진핵 세포 배양 배지 보충제는 1종 이상의 알부민 또는 알부민 대체물, 1종 이상의 아미노산, 1종 이상의 비타민, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 항산화제, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 1종 이상의 콜라겐 전구체, 1종 이상의 미량 원소 및 1종 이상의 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함하거나 또는 이들을 조합함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 L-글루타민, 중탄산나트륨 및/또는 베타-메르캅토에탄올을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민 또는 알부민 대체물, 및 1종 이상의 아미노산, 1종 이상의 비타민, 1종 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 1종 이상의 항산화제, 1종 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체물, 1종 이상의 콜라겐 전구체 및 1종 이상의 미량 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 알부민, 및 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-히드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 티아민, 환원 글루타티온, L-아스코르브산-2-포스페이트, 철 포화 트랜스페린, 인슐린, 및 미량 원소 모이어티 Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3", Ge4+, Se4+, Br, T, Mn2+, P, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2+, Rb+, Sn2+ 및 Zr4+를 함유하는 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 기초 세포 배지는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 최소 필수 배지 (MEM), 기초 배지 이글 (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, 최소 필수 배지 (αMEM), 글래스고 최소 필수 배지 (G-MEM), RPMI 성장 배지 및 이스코브 변형 둘베코 배지로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 중 글리신의 농도는 약 5-200 mg/L의 범위이고, L-히스티딘의 농도는 약 5-250 mg/L이고, L-이소류신의 농도는 약 5-300 mg/L이고, L-메티오닌의 농도는 약 5-200 mg/L이고, L-페닐알라닌의 농도는 약 5-400 mg/L이고, L-프롤린의 농도는 약 1-1000 mg/L이고, L-히드록시프롤린의 농도는 약 1-45 mg/L이고, L-세린의 농도는 약 1-250 mg/L이고, L-트레오닌의 농도는 약 10-500 mg/L이고, L-트립토판의 농도는 약 2-110 mg/L이고, L-티로신의 농도는 약 3-175 mg/L이고, L-발린의 농도는 약 5-500 mg/L이고, 티아민의 농도는 약 1-20 mg/L이고, 환원 글루타티온의 농도는 약 1-20 mg/L이고, L-아스코르브산-2-포스페이트의 농도는 약 1-200 mg/L이고, 철 포화 트랜스페린의 농도는 약 1-50 mg/L이고, 인슐린의 농도는 약 1-100 mg/L이고, 아셀렌산나트륨의 농도는 약 0.000001-0.0001 mg/L이고, 알부민 (예를 들어, 알부맥스(AlbuMAX)® I)의 농도는 약 5000-50,000 mg/L이다.
일부 실시양태에서, 한정 배지 중 비-미량 원소 모이어티 성분은 하기 표 A에서 표제 "1X 배지 중 농도 범위" 하의 열에 열거된 농도 범위로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지 중 비-미량 원소 모이어티 성분은 하기 표 A에서 표제 "1X 배지 중 바람직한 실시양태" 하의 열에 열거된 최종 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 한정 배지는 무혈청 보충제를 포함하는 기초 세포 배지이다. 이들 중 일부 실시양태, 무혈청 보충제는 하기 표 A에서 표제 "보충제 중 바람직한 실시양태" 하의 열에 열거된 농도 및 유형의 비-미량 모이어티 성분을 포함한다.
표 A. 비-미량 원소 모이어티 성분의 농도
Figure pct00017
일부 실시양태에서, 한정 배지의 오스몰농도는 약 260 내지 350 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 오스몰농도는 약 280 내지 310 mOsmol이다. 일부 실시양태에서, 한정 배지는 최대 약 3.7g/L 또는 약 2.2g/L 중탄산나트륨으로 보충된다. 한정 배지는 L-글루타민 (약 2 mM의 최종 농도), 1종 이상의 항생제, 비-필수 아미노산 (NEAA; 약 100 μM의 최종 농도), 2-메르캅토에탄올 (약 100 μM의 최종 농도)로 추가로 보충될 수 있다.
일부 실시양태에서, 문헌 [Smith, et al., "Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement," Clin Transl Immunology, 4(1) 2015 (doi: 10.1038/cti.2014.31)]에 기재된 한정 배지가 본 발명에 유용하다. 간략하게, RPMI 또는 CTS™ 옵트마이저™를 기초 세포 배지로서 사용하고, 0, 2%, 5% 또는 10% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물로 보충하였다.
한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내의 세포 배지는 비여과된다. 비여과 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장시키는데 필요한 절차를 단순화시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내의 세포 배지는 베타-메르캅토에탄올 (BME 또는 βME; 또한 2-메르캅토에탄올, CAS 60-24-2로도 공지됨)이 결여되어 있다.
한 실시양태에서, 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 안에 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 종양 조직 샘플을 배양하는 단계; 종양 조직 샘플로부터 TIL을 수득하는 단계; 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 TIL의 수를 확장시키는 단계를 포함하는 방법의 지속기간은 약 7일 내지 14일, 예를 들어 약 11일이다. 일부 실시양태에서, 사전-REP는 약 7 내지 14일, 예를 들어 약 11일이다. 일부 실시양태에서, REP는 약 7 내지 14일, 예를 들어 약 11일이다.
한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 용기에서 확장된다. 기체-투과성 용기는 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0106717 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장시키는데 사용되었다. 한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 백에서 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 수리(Xuri) 세포 확장 시스템 W25 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 수리 세포 확장 시스템 W5 (지이 헬스케어)로도 또한 공지되어 있는 웨이브(WAVE) 바이오리액터 시스템을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백, 예컨대 OMNI C3® 세포 배양 백 (램파이어 바이올로지칼 래보러토리즈(Lampire Biological Laboratories))에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백, 예컨대 EXP-PAK™ 세포 확장 바이오-컨테이너 (차터 메디칼(Charter Medical))에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL을 확장시키기 위한 세포 확장 시스템은 각각의 확장 단계에 대해 동일한 기체 투과성 용기를 사용한다. 한 실시양태에서, TIL을 확장시키기 위한 세포 확장 시스템은 각각의 확장 단계에 대해 상이한 기체 투과성 용기를 사용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1L, 약 2L, 약 3L, 약 4L, 약 5L, 약 6L, 약 7L, 약 8L, 약 9L 및 약 10L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다.
한 실시양태에서, TIL은 지-렉스 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링으로부터 상업적으로 입수가능함)에서 확장될 수 있다. 이러한 실시양태는 세포 집단이 약 5 x 105개 세포/cm2에서 10 x 106 내지 30 x 106개 세포/cm2로 확장되게 한다. 한 실시양태에서, 이것은 공급이 없다. 한 실시양태에서, 이것은 배지가 지-렉스 플라스크에서 약 10 cm의 높이로 있는 한 공급이 없다. 한 실시양태에서 이것은 공급은 없으나 1종 이상의 시토카인의 첨가가 있다. 한 실시양태에서, 시토카인은 시토카인과 배지를 혼합할 어떠한 필요성도 없이 볼루스로 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, TIL을 확장시키는데 사용되었으며, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0377739A1, 국제 공개 번호 WO 2014/210036 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 us 2013/0115617 A1, 국제 공개 번호 WO 2013/188427 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0136228 A1, 미국 특허 번호 US 8,809,050 B2, 국제 공개 번호 WO 2011/072088 A2, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2016/0208216 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0244133 A1, 국제 공개 번호 WO 2012/129201 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0102075 A1, 미국 특허 번호 US 8,956,860 B2, 국제 공개 번호 WO 2013/173835 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0175966 A1 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 이러한 공정은 또한 문헌 [Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292]에 기재되어 있다.
TIL의 임의적인 유전자 조작
일부 실시양태에서, TIL은 고친화도 T 세포 수용체 (TCR), 예를 들어 종양-연관 항원, 예컨대 MAGE-1, HER2 또는 NY-ESO-1에 표적화된 TCR, 또는 종양-연관 세포 표면 분자 (예를 들어, 메소텔린) 또는 계통-제한 세포 표면 분자 (예를 들어, CD19)에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 추가의 기능을 포함하도록 임의로 유전자 조작된다.
TIL 제조를 위한 폐쇄 시스템
본 발명은 TIL 배양 공정 동안 폐쇄 시스템의 사용을 제공한다. 이러한 폐쇄 시스템은 미생물 오염을 방지하고/거나 감소시키도록 하고, 보다 적은 플라스크가 사용되도록 하고, 비용 감소를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 2개의 용기를 사용한다.
폐쇄 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm 및 https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm에서 찾아볼 수 있다.
멸균 연결 장치 (STCD)는 호환성 튜빙의 2개의 조각 사이에 멸균 용접을 생성한다. 이 절차는 다양한 용기 및 튜브 직경의 멸균 연결을 허용한다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템은, 예를 들어 실시예 4에 기재된 바와 같은 루어 락 및 열 밀봉 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 시스템의 멸균 및 폐쇄 성질을 유지하기 위해 멸균 조건 하에 시린지를 통해 접근된다. 일부 실시양태에서, 실시예 6에 기재된 바와 같은 폐쇄 시스템이 사용된다. 일부 실시양태에서, TIL은 실시예 4, 섹션 "최종 제제화 및 충전"에 기재된 방법에 따라 최종 생성물 제제 용기 내로 제제화된다.
일부 실시양태에서, 폐쇄 시스템은 종양 단편이 수득되는 때로부터 TIL이 환자에 대한 투여 또는 동결보존을 위해 제조될 때까지 1개의 용기를 사용한다. 일부 실시양태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우, 제1 용기는 폐쇄 G-용기이고, TIL 집단은 원심분리되어 제1 폐쇄 G-용기를 개방하지 않으면서 주입 백으로 전달된다. 일부 실시양태에서, 2개의 용기가 사용되는 경우, 주입 백은 하이포써모솔-함유 주입 백이다. 폐쇄 시스템 또는 폐쇄 TIL 세포 배양 시스템은, 종양 샘플 및/또는 종양 단편이 첨가되었을 때, 시스템을 외부로부터 치밀하게 밀봉하여 박테리아, 진균 및/또는 임의의 다른 미생물 오염의 침습이 없는 폐쇄 환경을 형성한다는 것을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 95%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5% 내지 약 90%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 10% 내지 약 90%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 15% 내지 약 85%이다. 일부 실시양태에서, 미생물 오염의 감소는 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%이다.
폐쇄 시스템은 미생물 오염의 부재 하에 및/또는 그의 유의한 감소 하에 TIL 성장을 가능하게 한다.
더욱이, TIL 세포 배양 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압은 각각 세포가 배양됨에 따라 달라진다. 결과적으로, 세포 배양에 적절한 배지는 순환되더라도, 폐쇄 환경은 여전히 TIL 증식을 위한 최적 환경으로서 일정하게 유지될 필요가 있다. 이 목적으로, 폐쇄 환경의 배양 액체 내의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압의 물리적 인자는 센서에 의해 모니터링되고, 그의 신호는 배양 환경의 유입구에 설치되는 기체 교환기를 제어하는데 사용되며, 폐쇄 환경의 기체 분압은 세포 배양 환경을 최적화하도록 배양 액체의 변화에 따라 실시간으로 조정되는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 폐쇄 환경의 pH, 이산화탄소 분압 및 산소 분압을 측정하는 모니터링 장치가 장착된 기체 교환기를 폐쇄 환경에 대한 유입구에 포함시키고, 모니터링 장치로부터의 신호에 기초하여 기체 농도를 자동적으로 조정함으로써 세포 배양 환경을 최적화하는 폐쇄 세포 배양 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 폐쇄 환경 내의 압력은 연속적으로 또는 간헐적으로 제어된다. 즉, 폐쇄 환경 내의 압력은, 예를 들어 압력 유지 장치에 의해 달라질 수 있으며, 따라서 공간이 양압 상태에서 TIL의 성장에 적합함을 보장하거나 또는 음압 상태에서 유체의 삼출을 촉진시켜 세포 증식을 촉진시킨다. 더욱이, 음압을 간헐적으로 적용함으로써, 폐쇄 환경에서의 순환 액체를 폐쇄 환경의 부피의 일시적 수축에 의해 균일하게 및 효율적으로 대체하는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, TIL의 증식을 위한 최적 배양 성분은 대체되거나 첨가될 수 있으며, IL-2 및/또는 OKT3과 같은 인자 뿐만 아니라 이들의 조합이 첨가될 수 있다.
TIL의 임의적인 동결보존
상기 논의되고, 도 1에 제공된 바와 같은 단계 A 내지 E에 예시된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정 전반에 걸쳐 수많은 지점에서, 예컨대 치료 생성물의 보존을 위해 TIL 수거 후 공정의 최종 단계에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같음) 후 확장된 TIL 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존은 일반적으로 TIL 집단을 동결 용액, 예를 들어 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 넣어 이루어질 수 있다. 용액 중의 세포를 극저온 바이알 내에 넣고, -80℃에서 24시간 동안 저장하며, 임의로 동결보존을 위한 기체상 질소 동결기로 전달한다. 문헌 [Sadeghi, et al., Acta Oncologica, 2013, 52, 978-986]을 참조한다. 일부 실시양태에서, TIL은 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 세포 배양 배지 플러스 5% DMSO에서 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 실시예 6 및 7에서 제공된 방법에 따라 동결보존된다.
적절할 경우, 세포를 동결기로부터 제거하고, 37℃ 수조에서 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 해동시킨다. 세포를 일반적으로 완전 배지 중에 재현탁시키고, 임의로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 생존율에 대해 계수 및 평가할 수 있다.
벌크 TIL 집단 또는 확장된 TIL 집단 중 어느 하나는 임의로 동결보존될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 치료적 TIL 집단에 대해 일어난다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 제2 확장 후에 수거된 TIL에 대해 일어난다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 도 1의 예시적인 단계 F에서의 TIL에 대해 일어난다. 일부 실시양태에서, TIL은 주입 백에서 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 주입 백에의 배치 전에 동결보존된다. 일부 실시양태에서, TIL은 동결보존되고, 주입 백에 배치되지 않는다. 일부 실시양태에서, 동결보존은 동결보존 배지를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 동결보존 배지는 디메틸술폭시드 (DMSO)를 함유한다. 이것은 일반적으로 TIL 집단을 동결 용액, 예를 들어 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 넣어 이루어진다. 용액 중의 세포를 극저온 바이알 내에 넣고, -80℃에서 24시간 동안 저장하며, 임의로 동결보존을 위한 기체상 질소 동결기에 전달한다. 문헌 [Sadeghi, et al., Acta Oncologica, 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 경우, 세포를 동결기로부터 제거하고, 37℃ 수조에서 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 해동시킨다. 세포를 일반적으로 완전 배지 중에 재현탁시키고, 임의로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 생존율에 대해 계수 및 평가할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, TIL 집단은 CS10 동결보존 배지 (크리오스토르 10, 바이오라이프 솔루션즈)를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL 집단은 디메틸술폭시드 (DMSO)를 함유하는 동결보존 배지를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL 집단은 CS10 및 세포 배양 배지의 1:1 (부피:부피) 비를 사용하여 동결보존된다. 바람직한 실시양태에서, TIL 집단은 CS10 및 추가의 IL-2를 추가로 포함하는 세포 배양 배지의 약 1:1 (부피:부피) 비를 사용하여 동결보존된다.
상기 단계 A 내지 E에서 논의된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 공정 전반에 걸쳐 다수의 지점에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 B에 따른 제1 확장 후의 벌크 TIL 집단 또는 단계 D에 따른 1회 이상의 제2 확장 후의 확장된 TIL 집단은 동결보존될 수 있다. 동결보존은 일반적으로 TIL 집단을 동결 용액, 예를 들어 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 넣어 이루어질 수 있다. 용액 중의 세포를 극저온 바이알 내에 넣고, -80℃에서 24시간 동안 저장하며, 임의로 동결보존을 위한 기체상 질소 동결기에 전달한다. 문헌 [Sadeghi, et al., Acta Oncologica, 2013, 52, 978-986]을 참조한다.
적절할 경우, 세포를 동결기로부터 제거하고, 37℃ 수조에서 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 해동시킨다. 세포를 일반적으로 완전 배지 중에 재현탁시키고, 임의로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 생존율에 대해 계수 및 평가할 수 있다.
일부 경우에, 단계 B TIL 집단은 하기 논의된 프로토콜을 사용하여 즉시 동결보존될 수 있다. 대안적으로, 벌크 TIL 집단은 단계 C 및 단계 D에 적용된 다음, 단계 D 후에 동결보존될 수 있다. 유사하게, 유전자 변형된 TIL이 요법에 사용될 경우에, 단계 B 또는 단계 D TIL 집단은 적합한 처리를 위해 유전자 변형에 적용될 수 있다.
제약 조성물, 투여량 및 투여 요법
한 실시양태에서, 본 개시내용의 방법을 사용하여 확장된 TIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 TIL의 현탁액이다. 본 개시내용의 PBMC를 사용하여 확장된 TIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, T-세포는 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 이는 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.
TIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 2.3 x 1010 내지 약 13.7 x 1010개의 TIL이 투여되며, 특히 암이 흑색종인 경우, 평균은 대략 7.8 x 1010개의 TIL이다. 한 실시양태에서, 약 1.2 x 1010 내지 약 4.3 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 3 x 1010 내지 약 12 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 4 x 1010 내지 약 10 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 5 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 6 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 약 7 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 2.3 x 1010 내지 약 13.7 x 1010개이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 특히 암이 흑색종인 경우 약 7.8 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 1.2 x 1010 내지 약 4.3 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 3 x 1010 내지 약 12 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 4 x 1010 내지 약 10 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 5 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 6 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이다. 일부 실시양태에서, 치료 유효 투여량은 약 7 x 1010 내지 약 8 x 1010개의 TIL이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 수는 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 및 9x1013개이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 수는 1x106 내지 5x106, 5x106 내지 1x107, 1x107 내지 5x107, 5x107 내지 1x108, 1x108 내지 5x108, 5x108 내지 1x109, 1x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 5x1012, 및 5x1012 내지 1x1013개의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 농도는, 예를 들어 제약 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 농도는 제약 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 초과이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.
본 발명의 제약 조성물에 제공된 TIL은 폭넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 담당 의사의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. 또한 적절한 경우 TIL의 임상적으로-확립된 투여량이 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여된 제약 조성물의 양, 예컨대 TIL의 투여량은 치료될 인간 또는 포유동물, 장애 또는 상태의 중증도, 투여율, 활성 제약 성분의 배치 및 처방 의사의 판단에 의존할 것이다.
일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 1개월 1회, 2주마다 1회, 1주 1회, 또는 격일 1회일 수 있다. TIL의 투여는 필요한 만큼 길게 계속될 수 있다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 및 9x1013개이다. 일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 1x106 내지 5x106, 5x106 내지 1x107, 1x107 내지 5x107, 5x107 내지 1x108, 1x108 내지 5x108, 5x108 내지 1x109, 1x109 내지 5x109, 5x109 내지 1x1010, 1x1010 내지 5x1010, 5x1010 내지 1x1011, 5x1011 내지 1x1012, 1x1012 내지 5x1012, 및 5x1012 내지 1x1013개의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.
일부 실시양태에서, TIL의 유효 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.
TIL의 유효량은 단일 또는 다중 용량 중 어느 하나로 비내 및 경피 경로, 동맥내 주사, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소로, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해를 비롯하여, 유사한 유용성을 갖는 작용제의 허용된 투여 방식 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다.
환자를 치료하는 방법
치료 방법은 초기 TIL 수집 및 TIL의 배양과 함께 시작한다. 이러한 방법은 둘 다 관련 기술분야에, 예를 들어 문헌 [Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292]에 기재되었다. 치료 방법의 실시양태는 실시예를 포함한 하기 섹션 전반에 걸쳐 기재된다.
예를 들어 상기 단계 A 내지 F에 기재된 바와 같은 또는 상기 단계 A 내지 F에 따른 (또한, 예를 들어 도 1에 제시된 바와 같은) 것을 포함한 본원에 기재된 방법에 따라 생산된 확장된 TIL은 암을 갖는 환자의 치료에서 특정한 용도가 발견된다 (예를 들어, 문헌 [Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239], 뿐만 아니라 보충적 내용에 기재된 바와 같음; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, TIL을 이전에 기재된 바와 같이 전이성 흑색종의 절제된 침착물로부터 성장시켰다 (문헌 [Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342] 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 신선한 종양을 멸균 조건 하에서 절제할 수 있다. 대표적 샘플을 형식적 병원체 분석을 위해 수집할 수 있다. 2 mm3 내지 3 mm3의 단일 단편을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자당 5, 10, 15, 20, 25 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 20, 25 또는 30개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 20, 22, 24, 26 또는 28개의 샘플이 수득된다. 일부 실시양태에서, 환자당 24개의 샘플이 수득된다. 샘플을 24-웰 플레이트의 개별 웰에 넣고, 고용량 IL-2 (6,000 IU/mL)를 갖는 성장 배지에서 유지하고, 종양의 파괴 및/또는 TIL의 증식에 대해 모니터링할 수 있다. 가공 후에 남아있는 생존 세포를 갖는 임의의 종양을 단일 세포 현탁액 내로 효소적으로 소화시키고, 본원에 기재된 바와 같이 동결보존할 수 있다.
일부 실시양태에서, 성공적으로 성장된 TIL을 표현형 분석 (CD3, CD4, CD8 및 CD56)을 위해 샘플링하고, 이용가능한 경우 자가 종양에 대해 시험할 수 있다. TIL은 밤샘 공동배양이 인터페론-감마 (IFN-γ) 수준 > 200 pg/mL 및 2배 배경을 생성한 경우 반응성인 것으로 간주될 수 있다 (문헌 [Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847]; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 자가 반응성 또는 충분한 성장 패턴의 증거를 갖는 배양물은 때때로 급속 확장 (REP)으로 지칭되는 제2 확장을 포함한 제2 확장 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 따라 제공된 바와 같은 제2 확장)을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 제2 확장 동안 높은 증식)을 갖는 확장된 TIL은 추가의 제2 확장을 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 높은 자가 반응성 (예를 들어, 도 1의 단계 D에 제공된 바와 같은 제2 확장 동안 높은 증식)을 갖는 TIL은 도 1의 단계 D에 따른 추가의 제2 확장을 위해 선택된다.
일부 실시양태에서, 환자는 ACT (입양 세포 전달)로 직접 이동되지 않으며, 예를 들어 일부 실시양태에서, 종양 수거 및/또는 제1 확장 후에, 세포는 즉시 이용되지 않는다. 이러한 실시양태에서, TIL은 동결보존되고, 환자에 대한 투여 2일 전에 해동될 수 있다. 이러한 실시양태에서, TIL은 동결보존되고, 환자에 대한 투여 1일 전에 해동될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 동결보존되고, 환자에 대한 투여 직전에 해동될 수 있다.
주입 백 TIL의 동결보존된 샘플의 세포 표현형은 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CCR7 및 CD45RA (비디 바이오사이언시스)에 대한 유동 세포측정법 (예를 들어, 플로우조(FlowJo))에 의해서뿐만 아니라 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 분석될 수 있다. 표준 효소-연결 면역흡착 검정 기술을 사용하여 혈청 시토카인을 측정하였다. 혈청 IFN-γ의 상승을 >100 pg/mL 및 4 3 기준선 수준 초과로서 정의하였다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1에 예시된 것에 의해 생산된 TIL은 TIL의 임상 효능의 놀라운 개선을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1에 예시된 것에 의해 생산된 TIL은, 예를 들어 도 1에 예시된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 기재된 것과는 다른 방법에 의해 생산된 TIL과 비교하여 증가된 임상 효능을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과는 다른 방법은 공정 1C 및/또는 1세대 (Gen 1)로 지칭되는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증가된 효능은 DCR, ORR 및/또는 다른 임상 방법에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어 도 1에 예시된 것에 의해 생산된 TIL은, 예를 들어 도 1에 예시된 것과는 다른 방법, 예를 들어 Gen 1 공정을 포함한, 본원에 기재된 것과는 다른 방법에 의해 생산된 TIL과 비교하여 유사한 반응까지의 시간 및 안전성 프로파일을 나타낸다.
일부 실시양태에서, IFN-감마 (IFN-γ)는 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, TIL로 치료되는 대상체의 혈액 중 IFN-γ는 활성 TIL의 지표이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효력 검정이 사용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 잠재력의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료되는 대상체의 혈액, 혈청 또는 생체외 TIL 중 시토카인 IFN-γ의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, IFN-γ의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료되는 환자에서의 치료 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 또는 그 초과로 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 2배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 3배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 4배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 5배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 퀀티킨 ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료되는 대상체의 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료되는 대상체의 혈액에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료되는 대상체의 혈청 TIL에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은 도 1에 예시되지 않은 것을 포함한 다른 방법, 예컨대 예를 들어 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법에 의해 생산된 TIL과 비교하여 증가된 폴리클로날성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유의하게 개선된 폴리클로날성 및/또는 증가된 폴리클로날성은 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL의 투여에 관한 치료 효능의 지표일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은, 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1배, 2배, 10배, 100배, 500배 또는 1000배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 2배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 10배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 100배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 500배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1000배 증가된다.
효능의 척도는 관련 기술분야에 공지되었을 뿐만 아니라 본원에 기재된 질환 제어율 (DCR) 뿐만 아니라 전체 반응률 (ORR)을 포함할 수 있다.
암 및 다른 질환을 치료하는 방법
본원에 기재된 조성물 및 방법은 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 과다증식성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 이들은 또한 본원에 및 하기 단락에 기재된 바와 같은 다른 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 신암 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 암을 TIL 집단으로 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료된다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리적 내성까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.
나타낸 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는데 있어서 본원에 기재된 화합물 및 화합물의 조합물의 효능은, 인간 질환의 치료에 대한 안내를 제공하는 관련 기술분야에 공지된 다양한 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 난소암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; 및 Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12]에 기재되어 있다. 췌장암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은 문헌 [Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294]에 기재되어 있다. 유방암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212]에 기재되어 있다. 흑색종에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; 및 Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, IFN-감마 (IFN-γ)는 과다증식성 장애 치료에 대한 치료 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, TIL로 치료되는 대상체의 혈액 중 IFN-γ는 활성 TIL의 지표이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 생산에 대한 효력 검정이 사용된다. IFN-γ 생산은 세포독성 잠재력의 또 다른 척도이다. IFN-γ 생산은, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL로 치료되는 대상체의 혈액 중 시토카인 IFN-γ의 수준을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법에 의해 수득된 TIL은 도 5 및/또는 도 6에 예시된 바와 같은 공정 1C로 지칭되는 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 대상체와 비교하여 본 방법의 TIL로 치료되는 대상체의 혈액 중 증가된 IFN-γ를 제공한다. 일부 실시양태에서, IFN-γ의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료되는 환자에서의 치료 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배, 2배, 3배, 4배 또는 5배 또는 그 초과로 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 2배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 3배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 4배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ 분비는 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 5배 증가된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 퀀티킨 ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 퀀티킨 ELISA 키트를 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료되는 환자로부터의 생체외 TIL에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료되는 환자의 혈액에서 측정된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL로 치료되는 환자에서의 혈청에서 측정된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 것을 포함한 본 발명의 방법에 의해 제조된 TIL은 도 1에 예시되지 않은 것을 포함한 다른 방법, 예컨대 예를 들어 공정 1C 방법으로 지칭되는 방법에 의해 생산된 TIL과 비교하여 증가된 폴리클로날성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유의하게 개선된 폴리클로날성 및/또는 증가된 폴리클로날성은 암 치료에 대한 치료 효능 및/또는 증가된 임상 효능의 지표이다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 T-세포 레퍼토리 다양성을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성의 증가는 본 발명의 방법에 의해 생산된 TIL의 투여에 관한 치료 효능의 지표일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은, 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL과 비교하여 1배, 2배, 10배, 100배, 500배 또는 1000배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 2배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 10배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 100배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 500배 증가된다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날성은 비치료된 환자와 비교하여 및/또는 예를 들어 도 1에 구현된 것과는 다른 방법을 포함한, 본원에 제공된 것과는 다른 방법을 사용하여 제조된 TIL로 치료되는 환자와 비교하여 1000배 증가된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 상기 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 사용하여 제조된 TIL의 치료 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 신암 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종, 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 사용하여 제조된 TIL 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 상기 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 사용하여 제조된 TIL 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 상기 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 신암 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 상기 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법 중 임의의 방법을 사용하여 제조된 TIL 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물의 치료 유효 투여량을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 있어서 상기 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 난소암, 자궁내막암, 갑상선암, 결장직장암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 유발된 암, 두경부암 (두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 포함), 신암 및 신세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
공-투여의 방법
일부 실시양태에서, 예를 들어 도 1의 단계 A 내지 F에 기재된 방법으로부터 유래된 TIL을 포함한, 본원에 기재된 바와 같이 생산된 TIL은 1종 이상의 면역 체크포인트 조절제, 예컨대 하기 기재된 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, PD-1을 표적화하고 본 발명의 TIL과 공-투여될 수 있는 항체는, 예를 들어 니볼루맙 (BMS-936558, 브리스톨-마이어스 스큅; 옵디보(Opdivo)®), 펨브롤리주맙 (람브롤리주맙, MK03475 또는 MK-3475, 머크(Merck); 키트루다(Keytruda)®), 인간화 항-PD-1 항체 JS001 (상하이 준시(ShangHai JunShi)), 모노클로날 항-PD-1 항체 TSR-042 (테사로, 인크.(Tesaro, Inc.)), 피딜리주맙 (항-PD-1 mAb CT-011, 메디베이션(Medivation)), 항-PD-1 모노클로날 항체 BGB-A317 (베이진(BeiGene)), 및/또는 항-PD-1 항체 SHR-1210 (상하이 헹루이(ShangHai HengRui)), 인간 모노클로날 항체 REGN2810 (레게네론(Regeneron)), 인간 모노클로날 항체 MDX-1106 (브리스톨-마이어스 스큅), 및/또는 인간화 항-PD-1 IgG4 항체 PDR001 (노파르티스(Novartis))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, PD-1 항체는 다음 클론으로부터의 것이다: RMP1-14 (래트 IgG) - 바이오엑스셀 카탈로그 번호 BP0146. 본원에 기재된 바와 같은 단계 A 내지 F에 따라 생산된 TIL과의 공-투여 방법에서 사용하기에 적합한 다른 적합한 항체는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 8,008,449에 개시된 항-PD-1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-1과의 그의 상호작용을 억제함으로써 면역 활성을 증가시킨다. PD-L1에 결합하고 PD-1 및 PD-L1 사이의 상호작용을 방해하며 항종양 면역 반응을 자극하는 관련 기술분야에 공지된 임의의 항체는 본원에 기재된 바와 같은 단계 A 내지 F에 따라 생산된 TIL과의 공-투여 방법에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, PD-L1을 표적화하고 임상 시험 중인 항체는 BMS-936559 (브리스톨-마이어스 스큅) 및 MPDL3280A (제넨테크)를 포함한다. PD-L1을 표적화하는 다른 적합한 항체는 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,943,743에 개시되어 있다. PD-1 또는 PD-L1에 결합하고 PD-1/PD-L1 상호작용을 방해하며 항종양 면역 반응을 자극하는 임의의 항체가 본원에 기재된 바와 같은 단계 A 내지 F에 따라 생산된 TIL과의 공-투여 방법에서 사용하기에 적합하다는 것은 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, 단계 A 내지 F에 따라 생산된 TIL의 조합이 투여되는 대상체는, 환자가 항-PD-1 항체 단독의 투여에 불응성인 암 유형을 갖는 경우에, 항-PD-1 항체와 공 투여된다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 불응성 흑색종을 갖는 경우에 TIL이 항-PD-1과 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 환자는 환자가 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 갖는 경우에 TIL이 항-PD-1과 조합되어 투여된다.
환자의 임의적인 림프구고갈 사전조건화
한 실시양태에서, 본 발명은 암을 TIL 집단으로 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 개시내용에 따른 TIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료된 환자에서의 암의 치료에 사용하기 위한 TIL 집단을 포함한다. 한 실시양태에서, TIL 집단은 주입에 의해 투여하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 동안 (TIL 주입 전 제27일 및 제26일) 시클로포스파미드 60 mg/kg/일 및 5일 동안 (TIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 플루다라빈 25 mg/m2/일이다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법 및 본 개시내용에 따른 TIL 주입 (제0일에) 후에, 환자는 생리학적 내성까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2 (알데스류킨, 프로류킨으로서 상업적으로 입수가능함)의 정맥내 주입을 받는다. 특정 실시양태에서, TIL 집단은 IL-2와 조합으로 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이며, 여기서 IL-2는 TIL 집단 후에 투여된다.
실험적 소견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전 림프구고갈이 조절 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소 ('시토카인 싱크')의 제거에 의해 치료 효능을 증진시키는데 주요 역할을 하는 것으로 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 TIL의 도입 전에 환자에 대해 림프구고갈 단계 (때때로 또한 "면역억제 조건화"로 지칭됨)를 이용한다.
일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈 또는 시클로포스파미드 (활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 그의 조합의 투여를 사용하여 달성된다. 이러한 방법은 문헌 [Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, 및 Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357] (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL - 10 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 25 mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/mL - 10 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 100 mg/m2/일, 150 mg/m2/일, 175 mg/m2/일, 200 mg/m2/일, 225 mg/m2/일, 250 mg/m2/일, 275 mg/m2/일, 또는 300 mg/m2/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 정맥내로 (i.v.) 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 35 mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250 mg/m2/일 i.v.로 4일 동안 투여된다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈은 환자에게 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 함께 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 4일에 걸쳐 플루다라빈은 25 mg/m2/일 i.v.로 투여되고 시클로포스파미드는 250 mg/m2/일 i.v.로 투여된다.
한 실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m2/일의 용량으로의 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25 mg/m2/일의 용량으로의 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.
IL-2 요법
한 실시양태에서, IL-2 요법은 고용량 IL-2 요법을 포함하며, 여기서 고용량 IL-2 요법은 치료적 TIL 집단의 치료 유효 부분을 투여한 다음 날에 시작하여 정맥내로 투여되는 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하며, 여기서 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회의 용량 동안, 내성까지 8시간마다 15-분 볼루스 정맥내 주입을 사용하여 0.037 mg/kg 또는 0.044 mg/kg IU/kg (환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 9일의 휴약 후, 이러한 스케줄은 총 최대 28회의 용량을 위해, 또 다른 14회 용량에 대해 반복될 수 있다.
한 실시양태에서, IL-2 요법은 점감 IL-2 요법을 포함한다. 점감 IL-2 요법은 문헌 [O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 및 Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9] (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다. 한 실시양태에서, 점감 IL-2 요법은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 106 IU/m2, 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 106 IU/m2, 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 106 IU/m2, 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 4.5 x 106 IU/m2를 포함한다. 이러한 치료 사이클은 최대 4회 사이클 동안 28일마다 반복될 수 있다. 한 실시양태에서, 점감 IL-2 요법은 제1일에 18,000,000 IU/m2, 제2일에 9,000,000 IU/m2, 및 제3일 및 제4일에 4,500,000 IU/m2를 포함한다.
한 실시양태에서, IL-2 요법은 1, 2, 4, 6, 7, 14 또는 21일마다 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로의 PEG화 IL-2의 투여를 포함한다.
입양 세포 전달
입양 세포 전달 (ACT)은 면역요법의 매우 효과적인 형태이고, 항종양 활성을 갖는 면역 세포의 암 환자 내로의 전달을 수반한다. ACT는 항종양 활성을 갖는 림프구의 시험관내 확인, 이들 세포의 큰 수로의 시험관내 확장 및 그의 암-보유 숙주 내로의 주입을 수반하는 치료 접근법이다. 입양 전달에 사용되는 림프구는 절제된 종양의 기질로부터 유래될 수 있다 (종양 침윤 림프구 또는 TIL). ACT를 위한 TIL은 종양 동결보존 및 해동 단계를 사용하는 것을 포함한, 본원의 TIL 제조 공정에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은, 예를 들어 도 1에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조된다. 이들은 또한 항종양 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 조작되거나, 혼합 림프구 종양 세포 배양물 (MLTC)로 풍부화되거나, 또는 자가 항원 제시 세포 및 종양 유래 펩티드를 사용하여 클로닝되는 경우에 혈액으로부터 유도 또는 유래될 수 있다. 림프구가 주입될 암-보유 숙주로부터 기원하는 ACT는 자가 ACT로 칭한다. 미국 공개 번호 2011/0052530은 주로 전이성 흑색종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 암 퇴행을 촉진하는 입양 세포 요법을 수행하는 방법에 관한 것이며, 이들 방법에 대해 그 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, TIL은 본원에 기재된 바와 같이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, TIL 및/또는 세포독성 림프구는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 1개월 1회, 2주마다 1회, 1주 1회, 또는 격일 1회일 수 있다. TIL 및/또는 세포독성 림프구의 투여는 필요한 만큼 길게 계속될 수 있다.
PD-1 및 PD-L1 억제제와의 조합
프로그램화된 사멸 1 (PD-1)은 T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) T 세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포에 의해 발현된 288개-아미노산 막횡단 면역체크포인트 수용체 단백질이다. CD279로도 또한 공지된 PD-1은 CD28 패밀리에 속하고, 인간에서 염색체 2 상의 Pdcd1 유전자에 의해 코딩된다. PD-1은 하나의 이뮤노글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 도메인, 막횡단 영역, 및 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM) 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프 (ITSM)를 함유하는 세포내 도메인으로 이루어진다. PD-1 및 그의 리간드 (PD-L1 및 PD-L2)는 문헌 [Keir, et al., Annu. Rev. Immunol. 2008, 26:677-704]에 기재된 바와 같이 면역 관용에서 주요 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. PD-1은 T 세포 면역 반응을 음성 조절하는 억제 신호를 제공한다. PD-L1 (B7-H1 또는 CD274로도 또한 공지됨) 및 PD-L2 (B7-DC 또는 CD273으로도 또한 공지됨)는 종양 세포 및 기질 세포 상에서 발현되며, 이는 PD-1을 발현하는 활성화된 T 세포에 의해 마주칠 수 있어서, T 세포의 면역억제를 유도한다. PD-L1은 인간 염색체 9 상의 Cd274 유전자에 의해 코딩되는 290개 아미노산 막횡단 단백질이다. PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및/또는 PD-L2 억제제를 사용하여 PD-1과 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 차단하는 것은 최근 임상 연구, 예컨대 문헌 [Topalian, et al., N. Eng. J. Med. 2012, 366:2443-54]에 기재된 것에 의해 입증된 바와 같이, 면역 저항성을 극복할 수 있다. PD-L1은 많은 종양 세포주 상에서 발현되고, 반면 PD-L2는 대부분 수지상 세포 및 몇몇 종양 세포주 상에서 발현된다. T 세포 (활성화 후 PD-1을 유도적으로 발현함) 이외에, PD-1은 또한 B 세포, 자연 킬러 세포, 대식세포, 활성화된 단핵구 및 수지상 세포 상에서도 발현된다.
본원에 기재된 TIL 및 TNFRSF 효능제의 방법, 조성물 및 조합물은 또한 프로그램화된 사멸-1 (PD-1), 프로그램화된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 및/또는 프로그램화된 사멸 리간드 2 (PD-L2) 결합 항체, 길항제 또는 억제제 (즉, 차단제)와 추가로 조합될 수 있다. PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 TIL 확장의 사전-REP 또는 REP 단계 동안 본원에 기재된 TNFRSF 효능제와 함께 세포 배양물 중에서 사용될 수 있다. PD-1, PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제는 또한 종양의 외과적 절제 전에 또는 TIL의 주입 동안 또는 후에 TNFRSF 효능제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, PD-1/PD-L1 억제제를 효능작용 GITR 항체와 함께 사용하는 적합한 방법 및 PD-1/PD-L1 길항제 및 GITR 효능제를 포함하는 조성물은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/026684 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 PD-1 억제제 또는 PD-1 차단제일 수 있다. 특히, 이는 하기 단락에 보다 상세히 기재된 PD-1 억제제 또는 차단제 중 하나이다. 용어 "억제제", "길항제" 및 "차단제"는 PD-1 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 항체인 PD-1 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 PD-1 억제제에 대한 언급은 또한 소분자 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 PD-1 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 소분자이다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 억제제는 항체 (즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함한 그의 단편, 또는 그의 단일-쇄 가변 단편 (scFv)이다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 폴리클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, PD-1 억제제는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-1 억제제는 PD-1과의 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 PD-1과의 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-1 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 60 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 20 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 10 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 pM 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하는 PD-1 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 8 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 8.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 9 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 9.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 1 x 106 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-1에 결합하는 PD-1 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.1 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.4 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.5 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.6 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.7 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.8 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.9 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 또는 약 3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하는 PD-1 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 9 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 8 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 7 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 6 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 5 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 4 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 3 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 2 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하는 PD-1 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니로부터 옵디보로서 상업적으로 입수가능함) 또는 그의 바이오시밀러, 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 니볼루맙은 PD-1 수용체를 차단하는 완전 인간 IgG4 항체이다. 한 실시양태에서, 항-PD-1 항체는 이뮤노글로불린 G4 카파, 항-(인간 CD274) 항체이다. 니볼루맙은 화학 초록 서비스 (CAS) 등록 번호 946414-94-4로 배정되어 있고, 또한 5C4, BMS-936558, MDX-1106 및 ONO-4538로도 공지되어 있다. 니볼루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,008,449 및 국제 특허 공개 번호 WO 2006/121168 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 다양한 형태의 암에서의 니볼루맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌 [Wang, et al., Cancer Immunol Res. 2014, 2:846-56; Page, et al., Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; 및 Weber, et al., J. Clin. Oncology, 2013, 31:4311-4318] (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다. 니볼루맙의 아미노산 서열은 표 16에 제시된다. 니볼루맙은 22-96,140-196, 254-314, 360-418, 22"-96", 140"-196", 254"-314" 및 360"-418"에서의 중쇄내 디술피드 연결; 23'-88', 134'-194', 23"'-88"' 및 134"'-194"'에서의 경쇄내 디술피드 연결; 127-214', 127"-214"'에서의 중쇄-경쇄간 디술피드 연결, 219-219" 및 222-222"에서의 중쇄-중쇄간 디술피드 연결; 및 290, 290"에서의 N-글리코실화 부위 (H CH2 84.4)를 갖는다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 서열식별번호: 127에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 128에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 127 및 서열식별번호: 128에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 129에 제시된 서열을 포함하고, PD-1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 130에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 130에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 130에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 130에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 130에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 129 및 서열식별번호: 130에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132 및 서열식별번호: 133에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135 및 서열식별번호: 136에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-1 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 니볼루맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-PD-1 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 항-PD-1 항체이며, 여기서 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 니볼루맙이다.
표 16. 니볼루맙에 관한 PD-1 억제제에 대한 아미노산 서열.
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또 다른 실시양태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙 (미국 뉴저지주 케닐워스 소재 머크 앤 캄파니, 인크.(Merck & Co., Inc.)로부터 키트루다(KEYTRUDA)로서 상업적으로 입수가능함) 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체를 포함한다. 펨브롤리주맙은 CAS 등록 번호 1374853-91-4로 배정되어 있고, 또한 람브롤리주맙, MK-3475 및 SCH-900475로도 공지되어 있다. 펨브롤리주맙은 이뮤노글로불린 G4, 항-(인간 단백질 PDCD1 (프로그램화된 세포 사멸 1)) (인간-무스 무스쿨루스 모노클로날 중쇄), 디술피드와 인간-무스 무스쿨루스 모노클로날 경쇄, 이량체 구조를 갖는다. 펨브롤리주맙의 구조는 또한 이뮤노글로불린 G4, 항-(인간 프로그램화된 세포 사멸 1); 인간화 마우스 모노클로날 [228-L-프롤린(H10-S>P)]γ4 중쇄 (134-218')-디술피드와 인간화 마우스 모노클로날 κ 경쇄 이량체 (226-226":229-229")-비스디술피드로 기재될 수 있다. 펨브롤리주맙의 특성, 용도 및 제조는 국제 특허 공개 번호 WO 2008/156712 A1, 미국 특허 번호 8,354,509 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010/0266617 A1, US 2013/0108651 A1 및 US 2013/0109843 A2 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 다양한 형태의 암에서 펨브롤리주맙의 임상 안전성 및 효능은 문헌 [Fuerst, Oncology Times, 2014, 36:35-36; Robert, et al., Lancet, 2014, 384:1109-17; 및 Thomas, et al., Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14:1061-1064]에 기재되어 있다. 펨브롤리주맙의 아미노산 서열은 표 21에 제시된다. 펨브롤리주맙은 하기 디술피드 가교: 22-96, 22"-96", 23'-92', 23"'-92"', 134-218', 134"-218"', 138'-198', 138"'-198"', 147-203, 147"-203", 226-226", 229-229", 261-321, 261"-321", 367-425 및 367"-425" 및 하기 글리코실화 부위 (N): Asn-297 및 Asn-297"를 포함한다. 펨브롤리주맙은 Fc 영역에 안정화 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4/카파 이소형이며; IgG4 힌지 영역에의 이러한 돌연변이의 삽입은 IgG4 항체에 대해 전형적으로 관찰되는 분자의 절반의 형성을 방지한다. 펨브롤리주맙은 각각의 중쇄의 Fc 도메인 내 Asn297에서 불균일하게 글리코실화되어, 무손상 항체에 대해 대략 149 kDa의 분자량을 생성한다. 펨브롤리주맙의 우세한 당형태는 푸코실화 비-갈락토 이중안테나 글리칸 형태 (G0F)이다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 서열식별번호: 137에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 138에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 137 및 서열식별번호: 138에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 대표적인 서열이 표 17에 열거된다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 139에 제시된 서열을 포함하고, PD-1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 140에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 140에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 140에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 140에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 140에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 139 및 서열식별번호: 140에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 각각 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142 및 서열식별번호: 143에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145 및 서열식별번호: 146에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 임의의 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-1 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 펨브롤리주맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-PD-1 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 항-PD-1 항체이며, 여기서 항-PD-1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 항-PD-1 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 펨브롤리주맙이다.
표 17. 펨브롤리주맙에 관한 PD-1 억제제에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00019
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 상업적으로-입수가능한 항-PD-1 모노클로날 항체, 예컨대 항-m-PD-1 클론 J43 (카탈로그 번호 BE0033-2) 및 RMP1-14 (카탈로그 번호 BE0146) (미국 뉴햄프셔주 웨스트 레바논 소재 바이오 엑스 셀, 인크.(Bio X Cell, Inc.))이다. 다수의 상업적으로-입수가능한 항-PD-1 항체가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 번호 8,354,509 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0266617 A1, 2013/0108651 A1, 2013/0109843 A2 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 항체이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 번호 8,287,856, 8,580,247 및 8,168,757 및 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0028857 A1, 2010/0285013 A1, 2013/0022600 A1 및 2011/0008369 A1 (이들의 교시는 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 항-PD-1 항체이다. 또 다른 실시양태에서, PD-1 억제제는 미국 특허 번호 8,735,553 B1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 항-PD-1 항체이다. 한 실시양태에서, PD-1 억제제는 CT-011로도 공지된 피딜리주맙이며, 이는 미국 특허 번호 8,686,119 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, PD-1 억제제는 소분자 또는 펩티드 또는 펩티드 유도체, 예컨대 미국 특허 번호 8,907,053; 9,096,642; 및 9,044,442 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0087581에 기재된 것; 1,2,4-옥사디아졸 화합물 및 유도체, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0073024에 기재된 것; 시클릭 펩티드모방체 화합물 및 유도체, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0073042에 기재된 것; 시클릭 화합물 및 유도체, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0125491에 기재된 것; 1,3,4-옥사디아졸 및 1,3,4-티아디아졸 화합물 및 유도체, 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/033301에 기재된 것; 펩티드-기재 화합물 및 유도체, 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/036927 및 WO 2015/04490에 기재된 것, 또는 마크로시클릭 펩티드-기재 화합물 및 유도체, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0294898에 기재된 것일 수 있고; 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 관련 기술분야에 공지된 임의의 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제 또는 차단제일 수 있다. 특히, 이는 하기 단락에 보다 상세히 기재된 PD-L1 또는 PD-L2 억제제, 길항제 또는 차단제 중 하나이다. 용어 "억제제", "길항제" 및 "차단제"는 PD-L1 및 PD-L2 억제제와 관련하여 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 항체인 PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 접합체 또는 바이오시밀러를 지칭할 수 있다. 의심을 피하기 위해, 본원에서 PD-L1 또는 PD-L2 억제제에 대한 언급은 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 에스테르, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물, 공정 및 방법은 PD-L1 또는 PD-L2 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 소분자이다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 항체 (즉, 항-PD-1 항체), Fab 단편을 포함한 그의 단편, 또는 그의 단일-쇄 가변 단편 (scFv)이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 폴리클로날 항체이다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합에 대해 경쟁하고/거나, PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체는 PD-L1 또는 PD-L2와의 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-L1 또는 PD-L2 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 PD-L1 억제제는, 화합물이 PD-L2 수용체를 포함한 다른 수용체와 결합하거나 상호작용하는 경우보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 이들이 PD-L1과 결합하거나 상호작용한다는 점에서 PD-L1에 대해 선택적이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 PD-L2 수용체에 대해서보다 적어도 약 2배 더 높은 농도, 약 3배 더 높은 농도, 약 5배 더 높은 농도, 약 10배 더 높은 농도, 약 20배 더 높은 농도, 약 30배 더 높은 농도, 약 50배 더 높은 농도, 약 100배 더 높은 농도, 약 200배 더 높은 농도, 약 300배 더 높은 농도, 또는 약 500배 더 높은 농도인 결합 상수로 PD-L1 수용체에 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 PD-L2 억제제는, 화합물이 PD-L1 수용체를 포함한 다른 수용체와 결합하거나 상호작용하는 경우보다 실질적으로 더 낮은 농도에서 이들이 PD-L2와 결합하거나 상호작용한다는 점에서 PD-L2에 대해 선택적이다. 특정 실시양태에서, 화합물은 PD-L1 수용체에 대해서보다 적어도 약 2배 더 높은 농도, 약 3배 더 높은 농도, 약 5배 더 높은 농도, 약 10배 더 높은 농도, 약 20배 더 높은 농도, 약 30배 더 높은 농도, 약 50배 더 높은 농도, 약 100배 더 높은 농도, 약 200배 더 높은 농도, 약 300배 더 높은 농도, 또는 약 500배 더 높은 농도인 결합 상수로 PD-L2 수용체에 결합한다.
임의의 이론에 얽매이지 않으면서, 종양 세포는 PD-L1을 발현하고 T 세포는 PD-1을 발현하는 것으로 여겨진다. 그러나, 종양 세포에 의한 PD-L1 발현은 PD-1 또는 PD-L1 억제제 또는 차단제의 효능에 요구되지 않는다. 한 실시양태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현한다. 또 다른 실시양태에서, 종양 세포는 PD-L1을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 PD-1 및 PD-L1 항체의 조합을 TIL과 조합하여 포함한다. PD-1 및 PD-L1 항체의 조합 및 TIL의 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 100 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 90 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 80 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 70 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 60 pM 이하의 KD, 약 50 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 40 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 30 pM 이하의 KD로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 7.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 8 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 8.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 9 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 약 9.5 x 105 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 1 x 106 l/M·s 또는 더 빠른 kassoc로 인간 PD-L1 및/또는 PD-L2에 결합하는 PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하거나, 약 2.1 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.2 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.4 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.5 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.6 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-1에 결합하거나, 약 2.7 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하거나, 또는 약 3 x 10-5 l/s 또는 더 느린 kdissoc로 인간 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기재된 조성물 및 방법은 약 10 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 9 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 8 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 7 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 6 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 5 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 4 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 3 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 약 2 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하거나, 또는 약 1 nM 이하의 IC50으로 인간 PD-1을 차단하거나 또는 인간 PD-1에 대한 인간 PD-L1 또는 인간 PD-L2의 결합을 차단 또는 억제하는 PD-L1 및/또는 PD-L2 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 MEDI4736 (아스트라제네카 피엘씨의 자회사인, 메릴랜드주 게이더스버그 소재 메드이뮨, 엘엘씨로부터 상업적으로 입수가능함)으로도 또한 공지된 두르발루맙 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 번호 8,779,108 또는 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0034559 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 항체이다. 두르발루맙의 임상 효능은 문헌 [Page, et al., Ann. Rev. Med., 2014, 65:185-202; Brahmer, et al., J. Clin. Oncol. 2014, 32:5s (supplement, abstract 8021); 및 McDermott, et al., Cancer Treatment Rev., 2014, 40:1056-64]에 기재되어 있다. 두르발루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,779,108 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 두르발루맙의 아미노산 서열은 표 18에 제시된다. 두르발루맙 모노클로날 항체는 22-96, 22"-96", 23'-89', 23"'-89"', 135'-195', 135"'-195"', 148-204, 148"-204", 215'-224, 215"'-224", 230-230", 233-233", 265-325, 265"-325", 371-429 및 371"-429'에서의 디술피드 연결; 및 Asn-301 및 Asn-301"에서의 N-글리코실화 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 서열식별번호: 147에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 148에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 147 및 서열식별번호: 148에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 두르발루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 149에 제시된 서열을 포함하고, PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 150에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 150에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 150에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 150에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 150에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 149 및 서열식별번호: 150에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152 및 서열식별번호: 153에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155 및 서열식별번호: 156에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 임의의 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-L1 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 두르발루맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 두르발루맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이며, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 두르발루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 두르발루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 두르발루맙이다.
표 18. 두르발루맙에 관한 PD-L1 억제제에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00020
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 MSB0010718C (머크 카게아아(Merck KGaA)/EMD 세로노(EMD Serono)로부터 상업적으로 입수가능함)로도 또한 공지된 아벨루맙, 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 아벨루맙의 제조 및 특성은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0341917 A1 (이의 개시내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 아벨루맙의 아미노산 서열은 표 19에 제시된다. 아벨루맙은 22-96, 147-203, 264-324, 370-428, 22"-96", 147"-203", 264"-324" 및 370"-428"에서의 중쇄내 디술피드 연결 (C23-C104); 22'-90', 138'-197', 22"'-90"' 및 138"'-197"'에서의 경쇄내 디술피드 연결 (C23-C104); 223-215' 및 223"-215"'에서의 중쇄내-경쇄 디술피드 연결 (h 5-CL 126); 229-229" 및 232-232"에서의 중쇄내-중쇄 디술피드 연결 (h 11, h 14); 300, 300"에서의 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4); 푸코실화 복합체 이중-안테나 CHO-유형 글리칸; 및 450 및 450'에서의 H CHS K2 C-말단 리신 클리핑을 갖는다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 서열식별번호: 157에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 158에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 157 및 서열식별번호: 158에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 159에 제시된 서열을 포함하고, PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 160에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 160에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 160 및 서열식별번호: 160에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 160에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 160에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 159 및 서열식별번호: 160에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162 및 서열식별번호: 163에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165 및 서열식별번호: 166에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 임의의 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-L1 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 아벨루맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이며, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아벨루맙이다.
표 19. 아벨루맙에 관한 PD-L1 억제제에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00021
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 MPDL3280A 또는 RG7446 (스위스 바젤 소재 로슈 홀딩 아게(Roche Holding AG)의 자회사인 제넨테크, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한 테센트릭(TECENTRIQ))으로도 또한 공지된 아테졸리주맙 또는 그의 항원-결합 단편, 접합체 또는 변이체이다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 번호 8,217,149 (이의 개시내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 항체이다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0203056 A1, 2013/0045200 A1, 2013/0045201 A1, 2013/0045202 A1, 또는 2014/0065135 A1 (이들의 개시내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 항체이다. 아테졸리주맙의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 8,217,149 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 아테졸리주맙의 아미노산 서열은 표 20에 제시된다. 아테졸리주맙은 22-96, 145-201, 262-322, 368-426, 22"-96", 145"-201", 262"-322" 및 368"-426"에서의 중쇄내 디술피드 연결 (C23-C104); 23'-88', 134'-194', 23"'-88"' 및 134"'-194"'에서의 경쇄내 디술피드 연결 (C23-C104); 221-214' 및 221"-214"'에서의 중쇄내-경쇄 디술피드 연결 (h 5-CL 126); 227-227" 및 230-230"에서의 중쇄내-중쇄 디술피드 연결 (h 11, h 14); 및 298 및 298'에서의 N-글리코실화 부위 (H CH2 N84.4>A)를 갖는다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 서열식별번호: 167에 의해 제공된 중쇄 및 서열식별번호: 168에 의해 제공된 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄, 또는 그의 항원 결합 단편, Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 변이체 또는 접합체를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 167 및 서열식별번호: 168에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 아테졸리주맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 가변 영역 (VR)을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제 중쇄 가변 영역 (VH)은 서열식별번호: 169에 제시된 서열을 포함하고, PD-L1 억제제 경쇄 가변 영역 (VL)은 서열식별번호: 170에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 169 및 서열식별번호: 170에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 99% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 169 및 서열식별번호: 170에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 98% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 169 및 서열식별번호: 170에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 97% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 169 및 서열식별번호: 170에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 96% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 169 및 서열식별번호: 170에 제시된 서열에 대해 각각 적어도 95% 동일한 VH 및 VL 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PD-L1 억제제는 각각 서열식별번호: 171, 서열식별번호: 172 및 서열식별번호: 173에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 각각 서열식별번호: 174, 서열식별번호: 175 및 서열식별번호: 176에 제시된 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환을 갖는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 상기 언급된 임의의 항체와 결합에 대해 경쟁하고/거나 PD-L1 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙에 관하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 항-PD-L1 바이오시밀러 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 바이오시밀러는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 아미노산 서열에 대해 적어도 97% 서열 동일성, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖고 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품과 비교하여 1종 이상의 번역후 변형을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 번역후 변형은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및 말단절단. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 인가된 또는 인가를 위해 제출된 항-PD-L1 항체이며, 여기서 항-PD-L1 항체는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품의 제제와 상이한 제제로 제공되며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 항-PD-L1 항체는 약물 규제 기관, 예컨대 미국 FDA 및/또는 유럽 연합 EMA에 의해 인가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다. 일부 실시양태에서, 바이오시밀러는 1종 이상의 부형제를 추가로 포함하는 조성물로서 제공되며, 여기서 1종 이상의 부형제는 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품에 포함된 부형제와 동일하거나 상이하며, 여기서 참조 의약품 또는 참조 생물학적 제품은 아테졸리주맙이다.
표 20. 아테졸리주맙에 관한 PD-L1 억제제에 대한 아미노산 서열.
Figure pct00022
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공되고, 달리 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 기재된 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 따라서, 첨부된 청구범위의 취지 및 범주가 본원에 포함되는 바람직한 버전들의 설명으로 제한되어서는 안 된다.
독자는 본 명세서와 동시에 제출되고 본 명세서와 함께 공람되는 모든 서류와 문서에 관심을 가지며, 그러한 모든 서류와 문서의 내용은 본원에 참조로 인용된다. 본 명세서 (임의의 첨부 청구범위, 요약서 및 도면 포함)에 개시된 모든 특색은 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적 특색에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 동등하거나 유사한 포괄적인 계열의 특색들 중 단지 한 예이다.
실시예
본원에 포괄된 실시양태는 하기 실시예를 참조하여 이제 기재된다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 본원에 포괄된 개시내용은 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1. 사전-REP 및 REP 공정을 위한 배지의 제조.
본 실시예는 전이성 흑색종, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC), 난소 암종, 삼중-음성 유방 암종 및 폐 선암종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 종양 유형으로부터 유래된 종양 침윤 림프구 (TIL)의 배양을 포함하는 프로토콜에 사용하기 위한 조직 배양 배지의 제조를 위한 절차를 기재한다. 이러한 배지는 본 출원 및 실시예에 기재된 임의의 TIL의 제조에 사용될 수 있다.
CM1의 제조
하기 시약을 차가운 저장고로부터 꺼내고, 이들을 37℃ 수조에서 가온하였다: (RPMI1640, 인간 AB 혈청, 200 mM L-글루타민). 하기 표 21에 따라 각각의 성분을 여과될 부피에 적절한 0.2 μm 필터 유닛의 상부 섹션 내로 첨가함으로써 CM1 배지를 제조하였다. 4℃에서 저장하였다.
표 21. CM1의 제조
Figure pct00023
사용 당일에, 필요한 양의 CM1을 37℃ 수조에서 사전가온하고, 6000 IU/mL IL-2를 첨가하였다.
표 22에 따라 필요시 추가의 보충을 수행하였다.
표 22. 필요에 따라, CM1의 추가의 보충.
Figure pct00024
CM2의 제조
제조된 CM1을 냉장고로부터 꺼내거나 또는 신선한 CM1을 상기와 같이 제조하였다. AIM-V®를 냉장고로부터 꺼내고, 제조된 CM1을 멸균 배지 병에서 동일 부피의 AIM-V®와 혼합하여 필요한 양의 CM2를 제조하였다. 사용 당일에 3000 IU/mL IL-2를 CM2 배지에 첨가하였다. 사용 당일에 3000 IU/mL IL-2를 갖는 충분한 양의 CM2를 제조하였다. CM2 배지 병을 그의 명칭, 제조자의 이니셜, 배지를 여과/제조한 일자, 2-주 유효 기간으로 라벨링하고, 조직 배양에 필요할 때까지 4℃에서 저장하였다.
CM3의 제조
CM3을 사용이 필요한 당일에 제조하였다. CM3은 사용 당일에 3000 IU/mL IL-2로 보충된 AIM-V® 배지와 동일하였다. IL-2 원액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여 실험에 필요한 충분한 양의 CM3을 제조하였다. 서서히 진탕시켜 잘 혼합하였다. AIM-V에의 첨가 직후 병을 "3000 IU/mL IL-2"로 라벨링하였다. 과량의 CM3이 존재한 경우, 이를 배지 명칭, 제조자의 이니셜, 배지를 제조한 일자 및 그의 유효 기간 (제조 7일 후)으로 라벨링된 병에 넣어 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일의 저장 후 IL-2로 보충된 배지를 폐기하였다.
CM4의 제조
CM4는 2 mM 글루타맥스™ (최종 농도)를 추가로 보충한 CM3과 동일하였다. CM3 1L마다, 10ml의 200 mM 글루타맥스™를 첨가하였다. IL-2 원액 및 글루타맥스™ 원액을 AIM-V의 병 또는 백에 직접 첨가하여 실험에 필요한 충분한 양의 CM4를 제조하였다. 서서히 진탕시켜 잘 혼합하였다. AIM-V에의 첨가 직후 병을 "3000 IU/mL IL-2 및 글루타맥스"로 라벨링하였다. 과량의 CM4가 존재한 경우, 이를 배지 명칭, "글루타맥스" 및 그의 유효 기간 (제조 7일 후)으로 라벨링된 병에 넣어 4℃에서 저장하였다. 4℃에서 7일의 저장 후 IL-2로 보충된 배지를 폐기하였다.
실시예 2. IL-2, IL-15 및 IL-21 시토카인 칵테일의 사용.
본 실시예는 종양 조직 또는 종양 단편의 동결보존을 포괄하는 실시예 및 실시양태를 포함한 본원의 임의의 실시예 또는 실시양태의 TIL 공정과 조합하여, 추가의 T 세포 성장 인자로서의 역할을 하는 IL-2, IL-15 및 IL-21 시토카인의 사용을 기재한다.
본원에 기재된 공정을 사용하여, 배양 개시시 실험의 한 부문에서는 IL-2의 존재 하에 및 또 다른 부문에서는 IL-2 대신 IL-2, IL-15 및 IL-21의 조합의 존재 하에 결장직장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 삼중 음성 유방 종양, 폐 종양 및 신장 종양으로부터 TIL을 성장시켰다. 사전-REP의 완료시, 배양물을 확장, 표현형, 기능 (CD107a+ 및 IFN-γ) 및 TCR Vβ 레퍼토리에 대해 평가하였다. IL-15 및 IL-21은 본원의 다른 곳에 및 문헌 [Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells, Santegoets, S. J., J. Transl Med., 11:37 (2013), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/에서 이용가능함]에 기재되어 있다.
결과는 다수의 조직학에서 IL-2 단독 조건에 비해 IL-2, IL-15 및 IL-21 처리된 조건 하에 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 다에서 증진된 TIL 확장 (>20%)이 관찰되었다는 것을 제시하였다. IL-2 단독 배양물에 비해 IL-2, IL-15 및 IL-21 처리된 배양물로부터 수득된 TIL에서 편향된 TCR Vβ 레퍼토리를 갖는 우세하게 CD8+ 집단을 향한 편향이 있었다. IL-2 단독으로 처리된 TIL과 비교하여 IL-2, IL-15 및 IL-21 처리된 TIL에서 IFN-γ 및 CD107A가 상승되었다.
실시예 3. IL-2 원액의 제조.
본 실시예는 정제된 동결건조된 재조합 인간 인터류킨-2를, rhIL-2 사용을 수반하는 것을 포함한 본 출원 및 실시예에 기재된 것 모두를 포함한 추가의 조직 배양 프로토콜에서 사용하기에 적합한 스톡 샘플 내로 용해시키는 공정을 기재한다.
절차
0.2% 아세트산 용액 (HAc)을 제조하였다. 29 mL 멸균수를 50 mL 원추형 튜브에 전달하였다. 1 mL 1N (1 노르말) 아세트산을 50 mL 원추형 튜브에 첨가하였다. 튜브를 2-3회 뒤집어 잘 혼합하였다. 스테리플립 필터를 사용하는 여과에 의해 HAc 용액을 멸균하였다.
PBS 중 1% HSA를 제조하였다. 150 mL 멸균 필터 유닛 내 96 mL PBS에 4 mL의 25% HSA 원액을 첨가하였다. 용액을 여과하였다. 4℃에서 저장하였다. 제조된 rhIL-2의 각각의 바이알에 대해, 양식을 채워넣었다.
rhIL-2 원액 (6 x 106 IU/mL 최종 농도)을 제조하였다. rhIL-2의 각각의 로트는 상이하였으며, 필요한 정보, 예컨대: 1) 바이알당 rhIL-2의 질량 (mg), 2) rhIL-2의 비활성 (IU/mg) 및 3) 권장된 0.2% HAc 재구성 부피 (mL)는 제조업체의 분석 증명서 (COA)에서 확인하였다.
하기 방정식을 사용하여 rhIL-2 로트에 필요한 1% HSA의 부피를 계산하였다:
Figure pct00025
예를 들어, 셀게닉스의 rhIL-2 로트 10200121 COA에 따르면, 1 mg 바이알에 대한 비활성은 25 x 106 IU/mg이다. 이는 rhIL-2를 2 mL 0.2% HAc에서 재구성할 것을 권장한다.
Figure pct00026
IL-2 바이알의 고무 스토퍼를 알콜 와이프로 닦았다. 3 mL 시린지에 부착된 16G 바늘을 사용하여, 권장된 부피의 0.2% HAc를 바이알 내로 주사하였다. 바늘을 빼낼 때 스토퍼가 이탈하지 않도록 주의하였다. 바이알을 3회 뒤집고, 모든 분말이 용해될 때까지 스월링하였다. 스토퍼를 조심스럽게 제거하고, 알콜 와이프 상에 챙겨두었다. 계산된 부피의 1% HSA를 바이알에 첨가하였다.
rhIL-2 용액의 저장. 단기간 저장 (<72시간)의 경우, 바이알을 4℃에서 저장하였다. 장기간 저장 (>72시간)의 경우, 바이알을 보다 적은 부피로 분취하고, 사용 준비될 때까지 -20℃에서 크리오바이알 내에 저장하였다. 동결/해동 사이클을 피하였다. 유효 기간은 제조 일자로부터 6개월 후였다. Rh-IL-2 라벨은 판매업체 및 카탈로그 번호, 로트 번호, 유효 기간, 조작자 이니셜, 분취물의 농도 및 부피를 포함하였다.
실시예 4. TIL 동결보존 공정.
본 실시예는 크리오메드 속도 제어 동결기, 모델 7454 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하는, 실시예 5에 기재된 간략화 폐쇄 절차로 제조된 TIL에 대한 동결보존 공정 방법을 기재한다.
사용된 장비는 하기와 같았다: 알루미늄 카세트 홀더 랙 (CS750 동결기 백과 호환성임), 750 mL 백을 위한 동결저장 카세트, 저압 (22 psi) 액체 질소 탱크, 냉장고, 열전쌍 센서 (백을 위한 리본 유형), 및 크리오스토어(CryoStore) CS750 동결 백 (오리젠 사이언티픽(OriGen Scientific)).
동결 공정은 핵형성부터 -20℃까지 0.5℃ 속도 및 -80℃ 종료 온도까지 분당 1℃ 냉각 속도를 제공한다. 프로그램 파라미터는 하기와 같았다: 단계 1 - 4℃에서 대기; 단계 2: -4℃까지 1.0℃/분 (샘플 온도); 단계 3: -45℃까지 20.0℃/분 (챔버 온도); 단계 4: -10.0℃까지 10.0℃/분 (챔버 온도); 단계 5: -20℃까지 0.5℃/분 (챔버 온도); 및 단계 6: -80℃까지 1.0℃/분 (샘플 온도).
실시예 5. 폐쇄 시스템을 사용하는 동결보존된 TIL 세포 요법제의 생산.
본 실시예는 현행 우수 조직 관리기준 및 현행 우수 제조 관리기준에 따른 기체 투과성 용기, 예컨대 지-렉스 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)에서의 TIL 세포 요법제의 cGMP 제조 공정에 대한 절차를 기재한다. 이러한 물질은 미국 FDA 우수 제조 관리기준 규정 (21 CFR 파트 210, 211, 1270 및 1271), 및 상업적 물질을 통한 I상에 적용가능한 ICH Q7 표준 하에 제조될 것이다. 이러한 방법은 본원에 기재된 종양 동결보존 및 해동 공정과 조합될 수 있다.
공정 개요는 하기 표 23에 제공된다.
표 23. 공정 요약.
Figure pct00027
본 실시예 전반에 걸쳐, 달리 명시되지 않는 한 1.0 mL/L = 1.0 g/kg으로 가정한다. 개시되면, 2℃ - 8℃에서 하기 유효기간이 적용된다: 인간 혈청, 유형 AB (HI) 제미니, 1개월; 2-메르캅토에탄올, 1개월. 겐타미신술페이트, 50 mg/mL 스톡은 실온에서 1개월 동안 보관할 수 있다. 10L의 AIM-V 배지를 함유하는 백은 사용 전 최대 24시간 동안 단지 1회 실온에서 가온할 수 있다. 제22일 수거 동안, 2개의 개더렉스(Gatherex)™ 펌프를 사용하여 지-렉스500MCS 플라스크로부터 TIL을 수거할 수 있다.
제0일 - CM1 배지 제조
RPMI 1640 배지를 제조하였다. BSC에서, 적절한 크기의 피펫을 사용하여, 1000 mL RPMI 1640 배지로부터 100.0 mL를 분리해내고, "폐기물"로 라벨링된 적절한 크기의 용기 내에 넣었다.
BSC에서, RPMI 1640 배지 병에 시약을 첨가하였다. 표 21에 나타낸 바와 같이 RPMI 1640 배지 병에 하기 시약을 첨가하였다. 첨가된 부피를 기록하였다. 병당 첨가된 양: 열 불활성화 인간 AB 혈청 (100.0 mL); 글루타맥스 (10.0 mL); 겐타미신 술페이트, 50 mg/mL (1.0 mL); 2-메르캅토에탄올 (1.0 mL)
RPMI 1640 배지 병을 캡핑하고, 병을 스월링하여 시약이 철저히 혼합되도록 보장하였다. RPMI 1640 배지를 1L 0.22-마이크로미터 필터 유닛을 통해 여과하였다. 여과된 배지를 라벨링하였다. 여과된 배지를 무균 캡핑하고, 라벨링하였다.
1개의 1.1 mL IL-2 분취물 (6 x 106 IU/mL) (BR71424)을 모든 얼음이 용융될 때까지 해동시켰다. IL-2 원액을 배지로 전달하였다. BSC에서, 1.0 mL의 IL-2 원액을 상기 제조된 CM1 제0일 배지 병으로 전달하였다. CM1 제0일 배지 1 병에 IL-2 (6 x 106 IU/mL) 1.0 mL를 첨가하였다. 병을 캡핑하고 스월링하여 IL-2를 함유하는 배지를 혼합하였다. "완전 CM1 제0일 배지"로 라벨링하였다.
적절한 크기의 피펫을 사용하여 20.0 mL의 배지를 분리해내고, 50mL 원추형 튜브 내로 분배하였다. BSC에서, 25.0 mL의 "완전 CM1 제0일 배지"를 50 mL 원추형 튜브로 전달하였다. 튜브를 "조직 조각"으로 라벨링하였다. 지-렉스100MCS (W3013130)를 BSC 내로 무균 전달하였다. BSC에서, 지-렉스100MCS 상의 모든 클램프를 폐쇄하면서, 배기 필터 클램프는 개방되도록 남겼다. 지-렉스100MCS 플라스크의 적색 라인을 리피터 펌프 유체 전달 세트 (W3009497)의 보다 큰 직경의 단부에 루어 연결부를 통해 연결하였다. BSC 옆에 박사 펌프를 설치하였다. BSC로부터 리피터 펌프 유체 전달 세트의 펌프 튜빙 섹션을 제거하고, 리피터 펌프에 설치하였다. BSC 내에서, 펌프마틱(Pumpmatic) 액체-분배 시스템 (PLDS) (W3012720)으로부터 시린지를 제거하고, 폐기하였다.
PLDS 피펫을 리피터 펌프 유체 전달 세트의 보다 작은 직경의 단부에 루어 연결부를 통해 연결하고, 흡인을 위해 "완전 CM1 제0일 배지"에 피펫 팁을 넣었다. 배지와 지-렉스100MCS 사이의 모든 클램프를 개방하였다. 완전 CM1 배지를 지-렉스100MCS 플라스크 내로 펌핑하였다. 펌프 속도를 "고" 및 "9"로 설정하고, 모든 완전 CM1 제0일 배지를 지-렉스100MCS 플라스크 내로 펌핑하였다. 모든 배지가 전달되면, 라인을 청소하고, 펌프를 정지시켰다.
플라스크로부터 펌프를 연결해제하였다. 플라스크 상에서 배기 필터를 제외하고 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다. 적색 배지 라인으로부터 리피터 펌프 유체 전달 세트를 제거하고, 적색 배지 라인 상에 적색 캡 (W3012845)을 두었다. BSC로부터 지-렉스100MCS 플라스크를 꺼내고, 말단 루어 근처 적색 라인으로부터 적색 캡을 열 밀봉하였다. 인큐베이터 파라미터: 37.0 ± 2.0℃; CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2.
50mL 원추형 튜브를 ≥ 30분의 가온 동안 인큐베이터에 두었다.
제0일 - 종양 세척 배지 제조
겐타미신을 HBSS에 첨가하였다. BSC에서, 5.0 mL 겐타미신 (W3009832 또는 W3012735)을 1 x 500 mL HBSS 배지 (W3013128) 병에 첨가하였다. 부피를 기록하였다. 병당 다음을 첨가하였다: HBSS (500.0 mL); 겐타미신 술페이트, 50 mg/ml (5.0 mL). 시약을 철저히 혼합하였다. 1L 0.22-마이크로미터 (0.22 μm) 필터 유닛 (W1218810)을 통해 겐타미신을 함유하는 HBSS를 여과하였다. 여과된 배지를 무균 캡핑하고, 하기 정보로 라벨링하였다.
제0일 - 종양 가공
(동결보존된 종양으로부터) 종양 시편을 수득하고, 즉시 가공을 위해 2℃ - 8℃에서 스위트로 전달하고, 종양 정보를 기록하였다.
종양 시편을 2℃ - 8℃에서 3회 세척하며, 각각의 세척에 대해 적어도 3분 동안 서서히 교반하였다. 각각의 세척 후에 세척 용액을 제거하고 신선한 용액으로 교체하였다.
전달 피펫을 사용하여, 원추형 튜브로부터의 4개의 개별 액적의 종양 세척 배지를 6-웰 플레이트의 뒤집힌 뚜껑 (2개 뚜껑) 상의 각각의 6개 원형 내에 두었다. 총 50개의 액적을 위해 2개의 원형 상에 추가의 액적을 두었다.
종양 세척 3: 겸자를 사용하여, "세척 2" 접시로부터 종양을 제거하고, "세척 3" 접시로 전달하였다. 겸자를 사용하여, 종양 시편을 ≥ 3분 동안 서서히 교반함으로써 세척하고 가라앉도록 하였다. 시간을 기록하였다.
룰러를 150 mm 접시 뚜껑 아래에 두었다. 겸자를 사용하여, 종양 시편을 150 mm 해부 접시 뚜껑으로 무균 전달하였다. 종양 시편의 모든 조각을 말단 대 말단으로 배열하고, 대략적인 전체 길이 및 단편 수를 기록하였다. 괴사성/지방 조직에 대해 종양을 평가하였다. 전체 종양 면적의 > 30%가 괴사성 및/또는 지방 조직인 것으로 관찰되었는지 여부를 평가하였으며; 예라면, 종양이 그렇게 진행된 경우 적절한 크기였는지를 확인하였다. 전체 종양 면적의 < 30%가 괴사성 또는 지방 조직인 것으로 관찰되었는지 여부를 평가하였으며; 예라면, 진행하였다.
클린업 절제. 종양이 크고 조직 외부의 > 30%가 괴사성/지방인 것으로 관찰된 경우에, 스칼펠 및/또는 겸자의 조합을 사용하여 종양 내부 구조를 보존하면서 괴사성/지방 조직을 제거함으로써 "클린업 절제"를 수행하였다. 종양 내부 구조를 유지하기 위해, 수직 절단 압력만을 사용하였다. 스칼펠을 사용한 톱질 동작으로는 절단하지 않았다.
스칼펠 및/또는 겸자의 조합을 사용하여, 종양 시편을 고른 적절한 크기의 단편으로 절단하였다 (최대 6개의 중간 단편). 종양 내부 구조를 유지하기 위해, 수직 절단 압력만을 사용하였다. 마찬가지로, 스칼펠을 사용한 톱질 동작으로는 절단하지 않았다. 비-절제 중간 단편은 "종양 세척 배지"에 완전히 잠긴 채 유지시켰다. 각각의 중간 단편을 "유지" 접시로 전달하였다.
한 번에 1개의 중간 단편을 조작하고, 해부 접시 내의 종양 중간 단편을 대략 3 x 3 x 3 mm 크기의 조각으로 절제하되, 각각의 조각 상의 출혈성, 괴사성 및/또는 지방 조직의 양은 최소화하였다. 종양 내부 구조를 유지하기 위해, 수직 절단 압력만을 사용하였다. 마찬가지로, 스칼펠을 사용한 톱질 동작으로는 절단하지 않았다.
출혈성, 괴사성 및/또는 지방 조직이 없는 8개 이하의 종양 조각을 선택하였다. 참조를 위해 룰러를 사용하였다. 8개의 바람직한 조각이 수득되거나 또는 전체 중간 단편이 절제될 때까지 절제를 계속하였다. 각각의 선택된 조각을 "종양 세척 배지"의 액적 중 1개로 전달하였다.
중간 단편으로부터 8개 이하의 조각을 선택한 후에, 중간 단편의 잔유물을 "바람직한 중간 단편" 6-웰 플레이트의 새로운 단일 웰 내에 넣었다.
바람직한 조직이 남아있는 경우에, "바람직한 중간 단편" 6-웰 플레이트로부터 추가의 바람직한 종양 조각을 선택하여 최대 50개의 조각이 되도록 액적을 채웠다. 생성된 절제된 조각의 총수를 기록하였다.
인큐베이터로부터 "조직 조각" 50 mL 원추형 튜브를 꺼냈다. 원추형 튜브가 ≥30분 동안 가온되도록 보장하였다. 개방된 가공 표면의 멸균을 손상시키지 않도록 보장하면서, "조직 조각" 50 mL 원추형 튜브를 BSC 내로 전달하였다.
전달 피펫, 스칼펠, 겸자 또는 조합을 사용하여, 바람직한 접시 뚜껑으로부터 선택된 50개의 최상의 종양 단편을 "조직 조각" 50 mL 원추형 튜브로 전달하였다. 전달 동안 종양 조각이 떨어지고 바람직한 조직이 남아있는 경우에, 바람직한 종양 중간 단편 웰로부터의 추가의 조각을 첨가하였다. 조각 수를 기록하였다.
인큐베이터로부터 배지를 함유하는 지-렉스100MCS를 꺼냈다. 지-렉스100MCS 플라스크를 BSC 내로 무균 전달하였다. 플라스크를 전달할 때, 용기를 뚜껑 또는 바닥으로 들지 않았다. 용기를 측면을 잡아 전달하였다. BSC에서, 내부 튜빙의 멸균이 유지되도록 보장하면서, 지-렉스100MCS 플라스크 캡을 들어올렸다. 종양 조각을 갖는 원추형 튜브를 스월링하여 현탁시키고, 내용물을 지-렉스100MCS 플라스크 내로 신속하게 부었다. 종양 조각이 플라스크의 막에 걸쳐 고르게 분포되도록 보장하였다. 플라스크를 필요한 경우 앞뒤로 서서히 기울여 종양 조각을 고르게 분포시켰다. 용기의 바닥 막 상의 종양 단편의 수 및 용기 내에 부유하는 것으로 관찰된 수를 기록하였다. 주: 시딩된 단편의 수가 수집된 수와 동일하지 않은 경우에, 영역 관리(Area Management)에 접촉하고, 섹션 10.0에 기록하였다.
지-렉스100MCS를 하기 파라미터에서 인큐베이션하였다: 지-렉스 플라스크를 다음에서 인큐베이션하였다: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃; CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2. 제11일에 인큐베이터로부터 지-렉스100MCS를 꺼내기에 적절한 시간을 결정하기 위한 계산을 수행하였다. 계산: 인큐베이션 시간; 하한치 = 인큐베이션 시간 + 252시간; 상한치 = 인큐베이션 시간 + 276시간.
제11일 - 배지 제조
인큐베이터를 모니터링하였다. 인큐베이터 파라미터: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃; CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2. 3x1000 mL RPMI 1640 배지 (W3013112) 병 및 3x1000 mL AIM-V (W3009501) 병을 인큐베이터에서 ≥ 30분 동안 가온하였다. 시간을 기록하였다. 배지: RPMI 1640 및 AIM-V. 추가의 사용을 위해 추가의 1x1000 mL 병의 AIM-V 배지 (W3009501)를 실온에 두었다.
시간에 도달하였을 때 RPMI 1640 배지를 제거하였다. 이전 단계에서 최종 인큐베이션 시간을 기록하였다. 배지가 ≥30분 동안 가온되도록 보장하였다. BSC에서, 각각의 3개의 사전-가온된 1000 mL RPMI 1640 배지 병으로부터 100.0 mL를 제거하고, "폐기물"로 라벨링된 적절한 크기의 용기 내에 넣었다. BSC에서, 각각의 3개의 RPMI 1640 배지 병에 하기 시약을 첨가하고, 각각의 병에 첨가된 부피를 기록하였다. 젬셀(GemCell) 인간 혈청, 열 불활성화 유형 AB (100.0 mL), 글루타맥스 (10.0 mL), 겐타미신 술페이트, 50 μg/mL (1.0 mL), 2-메르캅토에탄올 (1.0 mL).
병을 캡핑하고 스월링하여 시약이 철저히 혼합되도록 보장하였다. 개별 1L 0.22-마이크로미터 필터 유닛을 통해 각각의 병의 배지를 여과하였다. 여과된 배지를 무균 캡핑하고, 각각의 병을 CM1 제11일 배지로 라벨링하였다. IL-2 (6 x 106 IU/mL) (BR71424)의 3 x 1.1 mL 분취물을 모든 얼음이 용융될 때까지 해동시키고, IL 2 로트 # 및 유효 기간/시간을 기록하였다.
인큐베이터로부터 3개의 AIM-V 배지 병을 꺼냈다. 최종 인큐베이션 시간을 기록하였다. 배지가 ≥ 30분 동안 가온되도록 보장하였다. 마이크로피펫을 사용하여, 사전-가온된 AIM-V 배지의 1개의 1L 병 내로 3.0mL의 해동된 IL-2를 첨가하였다. IL-2를 분배한 후에 마이크로피펫 팁을 배지로 헹구었다. 각각의 분취물에 대해 새로운 멸균 마이크로피펫 팁을 사용하였다. 첨가된 총 부피를 기록하였다. 병을 "IL-2 함유 AIM-V"로 라벨링하였다. 10L 랩테이너 백 및 리피터 펌프 전달 세트를 BSC 내로 무균 전달하였다. 10L 랩테이너 백 상의 모든 라인을 폐쇄하였다. 리피터 펌프 전달 세트의 보다 큰 직경의 튜빙 단부를 10L 랩테이너 백의 중간 암형 포트에 루어 락 연결부를 통해 부착하였다.
BSC 옆에 박사 펌프를 설치하였다. 전달 세트 튜빙을 박사 펌프를 통해 공급하였다. 박사 펌프를 "고" 및 "9"로 설정하였다. 펌프마틱 액체-분배 시스템 (PLDS)으로부터 시린지를 제거하고, 폐기하였다. PLDS 피펫의 멸균은 손상시키지 않았다.
PLDS 피펫을 리피터 펌프 유체 전달 세트의 보다 작은 직경의 단부에 루어 연결부를 통해 연결하고, 흡인을 위해 IL-2 함유 AIM-V 배지 병에 피펫 팁을 넣었다. 배지 병과 10L 랩테이너 사이의 모든 클램프를 개방하였다.
PLDS를 사용하여, 제조된 사전-가온된 IL-2 함유 AIM-V 배지뿐만 아니라 2개의 추가의 AIM-V 병을 10L 랩테이너 백 내로 전달하였다. 여과된 CM1 제11일 배지의 3개 병을 첨가하였다. 최종 병을 첨가한 후에, 백으로 가는 라인을 청소하였다. 각각의 배지 병의 첨가 사이에 펌프를 정지시켰다. 전달 세트로부터 PLDS를 제거하고, BSC에서 라인의 루어 상에 적색 캡을 놓았다. 백을 서서히 마사지하여 혼합하였다. 배지 백을 하기 정보로 라벨링하였다. 유효 기간은 제조 일자로부터 24시간이었다.
"완전 CM2 제11일 배지" 백의 이용가능한 암형 포트에 60 mL 시린지를 부착하였다. 20.0 mL의 배지를 분리해내고, 50 mL 원추형 튜브에 넣었다. "완전 CM2 제11일 배지" 백의 암형 포트 상에 적색 캡을 놓았다. 라벨링하고, 배지 보유 샘플을 시험에 제출할 때까지 2℃-8℃에서 저장하였다. 적색 캡에 가까운, 전달 세트 라인 상의 적색 캡을 열 밀봉하였다. 백 상의 전달 세트를 유지하였다.
BSC에서, "세포 계수용 희석물" 및 로트 번호로 라벨링된 4.5 mL의 AIM-V 배지를 4개의 15mL 원추형 튜브에 첨가하였다. 튜브를 로트 번호 및 튜브 번호 (1-4)로 라벨링하였다. 4개의 크리오바이알을 "피더" 및 바이알 번호 (1-4)로 라벨링하였다. 임의의 나머지 2-메르캅토에탄올, 글루타맥스 및 인간 혈청을 BSC로부터 2℃ 내지 8℃로 전달하였다.
BSC 외부에서, 제조된 "완전 CM2 제11일 배지" 백에 부착된 전달 세트에 1L 전달 팩을 용접하였다. 전달 팩을 "피더 세포 CM2 배지" 및 로트 번호로 라벨링하였다. 백으로부터 몇 인치 떨어진 1L 전달 팩 튜빙의 튜빙 상에 표시를 하였다. 튜빙이 표시 지점까지 저울 상에 있도록 비어있는 전달 팩을 저울 상에 놓았다. 저울에서 용기 무게를 공제하고, 비어있는 전달 팩을 저울 상에 남겨두었다.
박사 펌프를 "중" 및 "4"로 설정하였다. 500.0 ± 5.0 mL의 "완전 CM2 제11일" 배지를 "세포 CM2 배지" 전달 팩 내로 펌핑하였다. 중량 기준으로 측정하고, 전달 팩에 첨가된 완전 CM2 배지의 부피를 기록하였다.
충전하였으면, 라인을 열 밀봉하였다. 1L 전달 팩에 대한 용접을 유지하면서, 피더 세포 배지 전달 팩으로부터 전달 세트를 갖는 CM2 제11일 배지 백을 분리하였다. 제조된 "완전 CM2 제11일 배지"를 사용시까지 인큐베이터에 두었다.
제11일 - TIL 수거
인큐베이터 파라미터: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃; CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2. 인큐베이터로부터 지-렉스100MCS를 꺼내기 전에 인큐베이션 파라미터가 충족되도록 보장하기 위해 점검을 수행하였다. 하한치는 상기 기재된 바와 동일하다.
인큐베이터로부터 꺼낸 시간을 기록하였다. 인큐베이터로부터 지-렉스100MCS를 조심스럽게 꺼내고, 큰 필터 라인을 제외한 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다. 가공 시작 시간을 기록하였다.
300 mL 전달 팩을 "TIL 현탁액"으로 라벨링하였다. 중력 혈액 필터의 TIL 현탁액 전달 (단일 라인)을 멸균 용접하였다. 300 mL 전달 팩을 저울 상에 놓고, 건조 중량을 기록하였다. 1L 전달 팩을 "상청액"으로 라벨링하였다.
지-렉스100MCS로부터의 적색 배지 제거 라인을 "상청액" 전달 팩에 멸균 용접하였다. 지-렉스100MCS로부터의 투명 세포 제거 라인을 "TIL 현탁액" 전달 팩에 연결된 혈액 필터의 상단 상의 2개의 스파이크 라인 중 1개에 멸균 용접하였다. 지-렉스100MCS를 개더렉스의 좌측에 놓고, "상청액" 및 "TIL 현탁액" 전달 팩을 우측에 놓았다.
지 렉스100MCS로부터의 적색 배지 제거 라인을 개더렉스 상의 상단 클램프 (적색 라인으로 표시됨) 및 튜빙 가이드에 설치하였다. 지-렉스100MCS로부터의 투명 수거 라인을 개더렉스 상의 하단 클램프 (청색 라인으로 표시됨) 및 튜빙 가이드에 설치하였다. 개더렉스로부터의 기체 라인을 지-렉스100MCS 플라스크의 멸균 필터에 부착하였다. 지-렉스100MCS 플라스크로부터 상청액을 분리해내기 전에, 세포 제거 라인 상의 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다. 지-렉스100MCS로부터의 ~900 mL의 배양물 상청액을 1L 전달 팩으로 전달하였다. 지-렉스100MCS 플라스크가 평평하고 배지가 흡인 딥 튜브의 단부까지 감소되었는지 확인하기 위해 플라스크를 육안으로 검사하였다.
상청액을 분리해낸 후, 적색 라인에 대한 모든 클램프를 폐쇄하였다.
플라스크를 격렬하게 두드리고, 배지를 스월링하여 세포를 방출시켰다. 모든 세포가 탈착되었는지 확인하기 위해 플라스크의 검사를 수행하였다. 수집 튜빙으로부터 떨어져 플라스크를 기울이고, 종양 조각이 모서리를 따라 침강하도록 하였다. 조각이 플라스크의 반대 측에 남아있도록 플라스크를 수집 튜빙을 향해 천천히 기울였다. 세포 수집 스트로가 벽과 바닥 막의 접합부에 있지 않은 경우에, 플라스크를 45° 각도로 기울이면서 랩핑하는 것은 통상적으로 스트로를 적절히 위치시키기에 충분하다.
TIL 현탁액 전달 팩으로 이어지는 모든 클램프를 해제하였다. 개더렉스를 사용하여, 세포 현탁액을 혈액 필터를 통해 300 mL 전달 팩 내로 전달하였다. 모든 세포 및 배지가 수집될 때까지 기울여진 모서리를 유지하였다. 막을 부착 세포에 대해 검사하였다. 지-렉스100MCS의 바닥을 헹구었다. 기체 교환 막의 ~1/4를 헹굼 배지로 덮었다. 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다. TIL 현탁액 전달 팩을 전체 튜빙 길이가 대략 동일하게 유지되도록 가능한 한 용접부에 근접하게 열 밀봉하였다. "상청액" 전달 팩을 열 밀봉하였다. 용접하기에 충분한 라인을 유지하였다. TIL 현탁액 전달 팩의 중량을 기록하고, 세포 현탁액의 부피를 계산하였다.
4-인치 혈장 전달 세트 상에 루어 연결부를 보유하면서, 4-인치 (4") 혈장 전달 세트를 "상청액" 전달 팩에 용접하고, BSC 내로 전달하였다. 4-인치 혈장 전달 세트 상에 루어 연결부를 보유하면서, 4-인치 혈장 전달 세트를 300 mL "TIL 현탁액" 전달 팩에 용접하고, BSC 내로 전달하였다.
1L "상청액" 전달 팩으로부터 대략 20.0 mL의 상청액을 뽑아내고, "Bac-T"로 라벨링된 멸균 50mL 원추형 튜브 내로 분배하였다. 적절한 크기의 시린지를 사용하여 BacT 라벨링된 50 mL 원추형 튜브로부터 1.0 mL 샘플을 분리해내고, 혐기성 병에 접종하였다.
4개의 크리오바이알을 바이알 번호 (1-4)로 라벨링하였다. 개별 3mL 시린지를 사용하여, TIL 현탁액 전달 팩으로부터 루어 연결부를 사용하여 4x1.0mL 세포 계수 샘플을 뽑아내고, 각각의 크리오바이알에 넣었다. 적색 캡 (W3012845)을 라인 상에 놓았다. TIL 전달 팩을 필요할 때까지 인큐베이터에 두었다. 세포 계수 및 계산을 수행하였다. 희석하지 않은 채로 초기 세포 계수를 수행하였다. 희석이 필요하지 않은 경우에, "샘플 [μL]" = 200, "희석물 [μL]" = 0이었다.
세포 수 및 TIL 수를 기록하였다. 총 생존 TIL 세포가 < 5 x 106개 세포인 경우에, "제11일 지-렉스 충전 및 시딩"으로 진행하였다. 총 생존 TIL 세포가 > 5 x 106개인 경우에, "유동 세포측정법을 위한 계산"으로 진행하였다.
총 생존 TIL 세포 수가 ≥ 4.0 x 107개인 경우에, 유동 세포측정법 샘플을 위해 1.0 x 107개 세포를 수득하기 위한 부피를 계산하였다. 유동 세포측정법에 필요한 총 생존 세포: 1.0 x 107개 세포. 유동 세포측정법에 필요한 세포의 부피: 생존 세포 농도를 1.0 x 107개 세포로 나눔.
적용가능한 경우: 총 생존 세포 및 유동 부피를 재계산하였다. 하기 세포측정법 샘플의 제거 후 남아있는 총 생존 세포 및 남아있는 부피를 계산하였다.
적용가능한 경우: 동결보존을 위한 부피를 계산하였다. 동결보존을 위해 1 x 107개 세포를 수득하는데 필요한 세포의 부피를 계산하였다.
표 24. TIL 동결보존 계산.
Figure pct00028
적용가능한 경우: 동결보존을 위한 샘플을 분리해냈다. TIL 현탁액 전달 팩으로부터 계산된 부피를 분리해냈다. 적절한 크기의 원추형 튜브에 넣고, "동결보존 샘플 1 x 107개 세포", 일자 및 로트 번호로 라벨링하였다. TIL 현탁액 전달 팩 상에 적색 캡 (W3012845)을 놓았다.
"동결보존 샘플 1 x 107개 세포"를 하기 파라미터에 따라 원심분리하였다: 속도: 350 x g, 시간: 10:00분, 온도: 주위, 브레이크; 최대 (9); 가속: 최대 (9).
CS-10을 첨가하였다. BSC에서, 상청액을 무균 흡인하였다. 튜브의 바닥을 서서히 두드려 세포를 나머지 유체 중에 재현탁시켰다. CS-10을 첨가하였다. 0.5 mL의 CS10을 천천히 첨가하였다. 첨가된 부피를 기록하였다. 동결보존 샘플 바이알을 ~0.5 mL로 채웠다.
제11일 - 피더 세포
LN2 동결기로부터 적어도 2개의 상이한 로트 번호를 갖는 3개의 피더 세포 백을 입수하였다. 세포를 해동할 준비가 될 때까지 드라이 아이스 상에서 보관하였다. 피더 세포 정보를 기록하였다. 적어도 2개의 상이한 로트의 피더 세포가 입수되었는지 확인하였다. 피더 세포 백을 로트 번호 기준으로 개별 집 탑 백 내에 넣고, 37.0 ± 2.0℃ 수조 또는 시토썸에서 ~3-5분 동안 또는 얼음이 막 사라질 때까지 해동시켰다.
피더 세포 하니스 제조. 4S-4M60을 CC2 세포 연결장치 (W3012820)에 용접하고, 세포 연결 장치의 단일 스파이크를 4S-4M60 매니폴드의 4-스파이크 단부로 대체하였다. 필요에 따라 용접하였다.
배지 전달 팩 부착: "피더 세포 CM2 배지" 전달 팩을 CC2 루어에 용접하였다. 백은 무바늘 주사 포트를 갖는 하니스의 측면에 부착될 것이다. 완전 CM2 제11일 배지를 함유하는 조립물을 BSC 내로 전달하였다.
해동된 피더 세포를 풀링하였다. BSC 내에서, 10 mL의 공기를 100 mL 시린지 내로 뽑아냈다. 이를 사용하여 CC2 상에 60 mL 시린지를 교체하였다. 커버를 제거하기 전에 피더 세포 백 상의 각각의 포트를 알콜 패드로 닦았다. 3개의 피더 백을 CC2의 스파이크 중 3개를 사용하여 스파이킹하였다. 스파이크를 한 방향으로 돌리면서 일정한 압력을 유지하였다. 포트의 측면을 천공하지 않았다. 피더 세포 백으로부터 나오는 라인은 개방되고 무바늘 주사 포트로 가는 라인은 폐쇄되도록 스톱콕을 개방하였다. 피더 세포 백의 내용물을 시린지 내로 뽑아냈다. 모든 3개의 백을 한 번에 배수시켰다. 피더 세포 백이 배수되었으면, 시린지 상의 압력을 유지하면서, 피더 세포 백으로 가는 라인을 클램핑 해제하였다. 하니스로부터의 시린지인 아래 시린지는 탈착시키지 않았다. 시린지 내의 피더 세포의 총 부피를 기록하였다.
피더 세포를 전달 팩에 첨가하였다. 피더 세포 백으로 가는 라인은 폐쇄되고 배지 전달 팩으로 가는 라인은 개방되도록 스톱콕을 돌렸다. 배지 전달 팩으로 가는 라인이 클램핑해제되지 않도록 보장하였다. 시린지로부터의 피더 세포를 "피더 세포 CM2 배지" 전달 팩 내로 분배하였다. 피더 세포를 함유하는 전달 팩으로 가는 라인을 클램핑 해제하고, 시린지를 하니스에 부착된 채로 남겨두었다. 백을 마사지하여 전달 팩 내의 풀링된 피더 세포를 혼합하였다. 백을 "피더 세포 현탁액"으로 라벨링하였다.
피더 세포 현탁액의 총 부피를 계산하였다. 세포 계수 샘플을 분리해냈다. 각각의 샘플에 대해 개별 3 mL 시린지를 사용하여, 피더 세포 현탁액 전달 팩으로부터 무바늘 주사 포트를 사용하여 4 x 1.0 mL 세포 계수 샘플을 뽑아냈다. 각각의 샘플을 라벨링된 크리오바이알 내로 분취하였다.
NC-200 및 공정 노트 5.14를 이용하여 세포 계수 및 계산을 수행하였다. 로트 번호 및 "세포 계수용 희석물"로 라벨링된 4.5 mL의 AIM-V 배지 내로 0.5 mL의 세포 현탁액을 첨가함으로써 세포 계수 샘플을 희석하였다. 이로써 1:10 희석물이 수득될 것이다.
세포 수 및 샘플 부피를 기록하였다. 총 생존 세포가 < 5 x 109개인 경우에, 진행하였다. 총 생존 세포가 ≥ 5 x 109개인 경우에, 보다 높은 세포 수에 대해 상기와 같이 진행하였다. 필요에 따라 추가의 피더 세포를 입수하고, 상기 논의된 바와 같이 전달 팩에 첨가하였다. 5 x 109개 생존 피더 세포를 수득하는데 필요한 피더 세포 현탁액의 부피를 계산하였다. 제거할 과량의 피더 세포의 부피를 계산하였다. 가장 가까운 정수로 버림하였다.
과량의 피더 세포를 제거하였다. 새로운 100 mL 시린지에, 10mL의 공기를 뽑아내고, 시린지를 하니스에 부착하였다. "피더 세포 현탁액" 전달 팩으로 가는 라인을 개방하였다. 시린지를 사용하여, 계산된 피더 세포의 부피 플러스 전달 팩으로부터의 추가의 10.0 mL를 100 mL 시린지 내로 뽑아냈다. 피더 세포의 부피가 제거되면 피더 세포 현탁액 전달 팩으로 가는 라인을 폐쇄하였다. 최종 시린지는 제거하지 않았다. 시린지가 충전되었으면, 이를 새로운 시린지로 교체하였다. 다수의 시린지를 사용하여 총 부피를 제거할 수 있었다. 각각의 새로운 시린지로, 10mL의 공기를 뽑아냈다. 제거된 피더 세포의 총 부피 (추가의 10 mL 포함)를 기록하였다.
OKT3을 첨가하였다. BSC에서, 1.0 mL 시린지 및 16 게이지 (16G 또는 16Ga) 바늘을 사용하여, 0.15 mL의 OKT3을 뽑아냈다. 시린지로부터 바늘을 무균 제거하고, 시린지를 무바늘 주사 포트에 부착하였다. OKT3을 주사하였다. "피더 세포 현탁액" 전달 팩에 대한 스톱콕을 개방하고, 이전에 제거된 10 mL의 피더 세포를 첨가하여 라인을 통해 OKT3을 플러싱하였다. 시린지를 거꾸로 돌리고 공기를 밀어내어 피더 세포 현탁액 전달 팩으로 가는 라인을 청소하였다. 남아있는 피더 세포 현탁액을 시린지에 남겨두었다. 모든 클램프를 폐쇄하고, BSC로부터 하니스를 꺼냈다. 용접하기에 충분한 튜빙을 남겨둔 채로, 피더 세포 현탁액 전달 팩을 열 밀봉하였다.
제11일 - 지-렉스 충전 및 시딩
지-렉스500MCS를 설정하였다. 지-렉스500MCS를 포장으로부터 꺼내고, 플라스크를 튜빙 내 임의의 균열 또는 꼬임에 대해 검사하였다. 모든 루어 연결부 및 마개가 단단히 조여있도록 보장하였다. 배기 필터 라인을 제외한 지-렉스500MCS 라인 상의 모든 클램프를 폐쇄하였다. 마커를 사용하여 4.5L 눈금에 라인을 그었다. "완전 CM2 제11일 배지"를 인큐베이터로부터 꺼냈다.
배지를 펌핑하기 위해 준비하였다. 지-렉스500MCS의 적색 라인을 완전 CM2 제11일 배지에 부착된 리피터 펌프 전달 세트에 용접하였다. "완전 CM2 제11일 배지" 백을 IV 폴에 걸었다. 박사 펌프를 통해 펌프 튜빙을 공급하였다. 배지를 지-렉스500MCS 내로 펌핑하였다. 박사 펌프를 "고" 및 "9"로 설정하였다. 4.5L의 배지를 지-렉스500MCS 내로 펌핑하여, 플라스크 상에 4.5L 눈금으로 표시된 라인까지 충전하였다. 용접부 근처의 지-렉스500MCS의 적색 라인을 열 밀봉하였다. 플라스크를 "제11일" 라벨로 라벨링하였다. 피더 세포: 현탁액 전달 팩을 플라스크에 용접하였다. 지-렉스500MCS의 적색 라인을 "피더 세포 현탁액" 전달 팩에 멸균 용접하였다.
피더 세포를 지-렉스500MCS에 첨가하였다. 피더 세포 현탁액과 지-렉스500MCS 사이의 모든 클램프를 개방하고, 피더 세포 현탁액을 중력 공급에 의해 플라스크에 첨가하였다. 용접부 근처의 적색 라인을 열 밀봉하였다. TIL 현탁액 전달 팩을 플라스크에 용접하였다. 지-렉스500MCS의 적색 라인을 "TIL 현탁액" 전달 팩에 멸균 용접하였다.
TIL을 지-렉스500MCS에 첨가하였다. TIL 현탁액과 지-렉스500MCS 사이의 모든 클램프를 개방하고, TIL 현탁액을 중력 공급에 의해 플라스크에 첨가하였다. 용접부 근처의 적색 라인을 열 밀봉하여 TIL 현탁액 백을 제거하였다.
지-렉스500MCS를 인큐베이션하였다. 지-렉스500MCS 상의 모든 클램프가 큰 필터 라인을 제외하고 폐쇄되었는지 점검하고, 인큐베이터에 두었다. 인큐베이터 파라미터: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃, CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2.
인큐베이션 윈도우를 계산하였다. 제16일에 인큐베이터로부터 지-렉스500MCS를 꺼내기에 적절한 시간을 결정하기 위한 계산을 수행하였다. 하한치: 인큐베이션 시간 + 108시간. 상한치: 인큐베이션 시간 + 132시간.
제11일 - 과량의 TIL 동결보존
과량의 TIL 바이알을 동결시켰다. 속도 제어 동결기 (CRF) 내에 배치된 바이알의 총수를 기록하고 확인하였다. 동결의 완료시, CRF로부터의 바이알을 적절한 저장 용기로 전달하였다.
제16일 - 배지 제조
AIM-V 배지를 사전-가온하였다. 사용하기 적어도 12시간 전 2-8℃로부터 3개의 CTS AIM V 10L 배지 백을 꺼내고, 빛으로부터 보호하면서 실온에 두었다. 각각의 백을 라벨링하였다. 가온 시작 시간 및 일자를 기록하였다. 모든 백을 12 내지 24시간의 지속기간 동안 가온되도록 보장하였다.
유체 펌프 전달 세트의 보다 큰 직경의 단부를 10L 랩테이너 백의 암형 포트 중 1개에 루어 커넥터를 통해 부착하였다. 상청액용 10L 랩테이너를 설정하였다. "상청액"으로 라벨링하였다. 상청액용 10L 랩테이너를 설정하였다. BSC로부터 꺼내기 전에 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다.
CTS AIM V 배지의 백당 IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424)의 5 x 1.1 mL 분취물을 모든 얼음이 용융될 때까지 해동시켰다. 100.0mL의 글루타맥스를 적절한 크기의 수용기 내로 분취하였다. 각각의 수용기에 첨가된 부피를 기록하고, 각각의 수용기를 "글루타맥스"로 라벨링하였다.
IL-2를 글루타맥스에 첨가하였다. 마이크로피펫을 사용하여, 5.0 mL의 IL-2를 각각의 글루타맥스 수용기에 첨가하였다. 공정마다 팁을 헹구고, 첨가된 각각의 mL에 대해 새로운 피펫 팁을 사용하였다. 각각의 글루타맥스 수용기에 첨가된 부피를 기록하고, 각각의 수용기를 "글루타맥스 + IL-2" 및 수용기 번호로 라벨링하였다.
제제화를 위한 CTS AIM V 배지 백을 준비하였다. CTS AIM V 10L 배지 백 (W3012717)이 실온에서 가온되도록 보장하고, 사용 전 12-24시간 동안 빛으로부터 보호하였다. 최종 인큐베이션 시간을 기록하였다. BSC에서, 4" 혈장 전달 세트 상의 클램프를 폐쇄한 다음, 스파이크 포트를 사용하여 백에 연결하였다. 스파이크를 한 방향으로 돌리면서 일정한 압력을 유지하였다. 포트의 측면을 천공하지 않도록 보장하였다. 리피터 펌프 유체 전달 세트의 보다 큰 직경의 단부를 4" 혈장 전달 세트에 루어를 통해 연결하였다.
BSC 옆에 박사 펌프를 설치하였다. BSC로부터 리피터 펌프 유체 전달 세트의 펌프 튜빙 섹션을 제거하고, 리피터 펌프에 설치하였다.
배지를 제제화하기 위해 준비하였다. BSC에서, 펌프마틱 액체-분배 시스템 (PLDS)으로부터 시린지를 제거하고, 폐기하였다. PLDS 피펫의 멸균을 손상시키지 않도록 보장하였다. PLDS 피펫을 리피터 펌프 유체 전달 세트의 보다 작은 직경의 단부에 루어 연결부를 통해 연결하고, 흡인을 위해 상기 제조된 "글루타맥스 + IL-2"에 피펫 팁을 넣었다. 수용기와 10L 백 사이의 모든 클램프를 개방하였다.
글루타맥스 + IL-2를 백 내로 펌핑하였다. 펌프 속도를 "중" 및 "3"으로 설정하고, 모든 "글루타맥스 + IL-2"를 10L CTS AIM V 배지 백 내로 펌핑하였다. 용액이 남아있지 않으면, 라인을 청소하고, 펌프를 정지시켰다. 하기 각각의 Aim V 백에 첨가된 IL-2 함유 글루타맥스의 부피를 기록하였다.
PLDS를 제거하였다. 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하고, PLDS 피펫을 리피터 펌프 유체 전달 세트로부터 제거하였다. 리피터 펌프 유체 전달 세트를 제거하고, 4" 혈장 전달 세트를 적색 캡핑하였다.
제조된 "완전 CM4 제16일 배지"의 각각의 백을 라벨링하였다.
샘플 계획에 따라 배지 보유물을 제거하였다. 30 mL 시린지를 사용하여, 시린지를 4" 혈장 전달 세트에 부착하고 샘플을 50 mL 원추형 튜브 내로 분배함으로써 20.0 mL의 "완전 CM4 제16일 배지"를 제거하였다. 시린지 제거 후 4" 혈장 전달 세트를 클램핑하거나 또는 적색 캡핑하도록 보장하였다.
새로운 리피터 펌프 유체 전달 세트를 부착하였다. 새로운 유체 펌프 전달 세트의 보다 큰 직경의 단부를 "완전 CM4 제16일 배지" 백에 연결된 4" 혈장 전달 세트 상에 부착하였다. 샘플 계획 목차 라벨로 라벨링하고, 배지 보유 샘플을 시험에 제출할 때까지 2-8℃에서 저장하였다.
인큐베이터를 모니터링하였다. 적용가능한 경우, 제조된 추가의 백에 대해 모니터링하였다. 인큐베이터 파라미터: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃, CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2.
완전 CM4 제16일 배지를 가온하였다. 완전 CM4 제16일 배지의 제1 백을 사용 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 ≥ 30분 동안 가온하였다. 적용가능한 경우, 추가의 백을 가온하였다.
희석물을 제조하였다. BSC에서, "세포 계수용 희석물"로 라벨링된 4.5 mL의 AIM-V 배지를 각각의 4개 15 mL 원추형 튜브에 각각 첨가하였다. 원추형 튜브를 라벨링하였다. 4개의 크리오바이알을 라벨링하였다.
제16일 - REP 분할
인큐베이터를 모니터링하였다. 인큐베이터 파라미터: 온도 LED 디스플레이: 37.0 ± 2.0℃, CO2 백분율: 5.0 ± 1.5% CO2.
인큐베이터로부터 지-렉스500MCS를 꺼냈다. 인큐베이터로부터 지-렉스500MCS를 꺼내기 전에 인큐베이션 파라미터가 충족되도록 보장하기 위해 하기 점검을 수행하였다: 상한치, 하한치, 꺼낸 시간. 인큐베이터로부터 지-렉스500MCS를 꺼냈다.
라인의 ~12 인치를 남기면서, 1L 전달 팩 (W3006645)을 열 밀봉하였다. 1L 전달 팩을 TIL 현탁액으로 라벨링하였다. 1L 전달 팩 (전체 라인을 포함함)을 저울 상에 놓고, 건조 중량을 기록하였다.
개더렉스 설정. 지-렉스500MCS로부터의 적색 배지 제거 라인을 상기 제조된 10L 랩테이너 백 "상청액" 상의 리피터 펌프 전달 세트에 멸균 용접하였다. 지-렉스500MCS로부터의 투명 세포 제거 라인을 상기 제조된 TIL 현탁액 전달 팩에 멸균 용접하였다. 지-렉스500MCS 플라스크를 개더렉스의 좌측에 놓았다. 상청액 랩테이너 백 및 TIL 현탁액 전달 팩을 우측에 놓았다. 지-렉스500MCS로부터의 적색 배지 제거 라인을 개더렉스 상의 상단 클램프 (적색 라인으로 표시됨) 및 튜빙 가이드에 설치하였다. 지-렉스500MCS로부터의 투명 수거 라인을 개더렉스 상의 하단 클램프 (청색 라인으로 표시됨) 및 튜빙 가이드에 설치하였다. 개더렉스로부터의 기체 라인을 지-렉스500MCS의 멸균 필터에 부착하였다. 지-렉스500MCS로부터 상청액을 분리해내기 전에, 세포 제거 라인 상의 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다.
지-렉스500MCS의 부피 감소. SOP-01777에 따라 지-렉스500MCS로부터의 ~4.5L의 배양물 상청액을 10L 랩테이너에 전달하였다. 지-렉스500MCS 플라스크가 평평하고 배지가 흡인 딥 튜브의 단부까지 감소되었는지 확인하기 위해 플라스크를 육안으로 검사하였다.
TIL 수거를 위한 플라스크를 준비하였다. 상청액을 분리해낸 후, 적색 라인에 대한 모든 클램프를 폐쇄하였다.
TIL 수거의 개시. TIL 수거의 시작 시간을 기록하였다. 플라스크를 격렬하게 두드리고, 배지를 스월링하여 세포를 방출시켰다. 모든 세포가 탈착되었는지 확인하기 위해 플라스크의 검사를 수행하였다. 호스가 플라스크의 모서리에 있도록 보장하기 위해 플라스크를 기울였다. 세포 수집 스트로가 벽과 바닥 막의 접합부에 있지 않은 경우에, 플라스크를 45° 각도로 기울이면서 랩핑하는 것은 통상적으로 스트로를 적절히 위치시키기에 충분하다.
TIL 수거. TIL 현탁액 전달 팩으로 이어지는 모든 클램프를 해제하였다. 개더렉스를 사용하여, 세포 현탁액을 TIL 현탁액 전달 팩 내로 전달하였다. 모든 세포 및 배지가 수집될 때까지 기울여진 모서리를 유지하도록 하였다. 막을 부착 세포에 대해 검사하였다.
플라스크 막을 헹구었다. 지-렉스500MCS의 바닥을 헹구었다. 기체 교환 막의 ~1/4를 헹굼 배지로 덮었다. 지-렉스500MCS 상의 클램프를 폐쇄하였다. 지-렉스500MCS 상의 모든 클램프가 폐쇄되도록 보장하였다.
전체 튜빙 길이가 대략 동일하게 남아있도록 가능한 한 용접부에 근접하게 TIL 함유 전달 팩을 열 밀봉하였다. 상청액을 함유하는 10L 랩테이너를 열 밀봉하고, 샘플 수집을 위해 BSC 내로 전달하였다.
세포 현탁액을 갖는 전달 팩의 중량을 기록하고, 현탁액 부피를 계산하였다. 샘플 제거를 위한 전달 팩을 준비하였다. 4" 혈장 전달 세트를 상기로부터의 TIL 현탁액 전달 팩에, 가능한 한 백에 근접하게 부착된 암형 루어 단부를 남기면서 용접하였다.
세포 상청액으로부터 시험 샘플을 분리해냈다. BSC에서, 10L 랩테이너로부터 암형 루어 포트 및 적절한 크기의 시린지를 사용하여 10.0 mL의 상청액을 분리해냈다. 15 mL 원추형 튜브 내에 넣고, "BacT"로 라벨링하고, BacT 샘플용 튜브를 보유하였다. 개별 시린지를 사용하여, 10.0 mL의 상청액을 분리해내고, 15 mL 원추형 튜브 내에 넣었다. 시험을 위해 미코플라스마 샘플용 튜브를 보유하였다. 튜브를 "미코플라스마 희석제"로 라벨링하였다. 상청액 백을 폐쇄하였다. 루어 포트 상에 적색 캡을 놓아 백을 폐쇄하고, BSC 밖으로 꺼냈다.
세포 계수 샘플을 분리해냈다. BSC에서, 각각의 샘플에 대해 개별 3 mL 시린지를 사용하여, 4x1.0 mL 세포 계수 샘플을 "TIL 현탁액" 전달 팩으로부터 루어 연결부를 사용하여 분리해냈다. 상기 제조된 크리오바이알에 샘플을 넣었다.
미코플라스마 샘플을 분리해냈다. 3 mL 시린지를 사용하여, TIL 현탁액 전달 팩으로부터 1.0 mL를 분리해내고, 상기 제조된 "미코플라스마 희석제"로 라벨링된 15 mL 원추형 튜브 내에 넣었다. 라벨링하고, 미코플라스마 샘플을 시험에 제출할 때까지 2-8℃에서 저장하였다.
시딩을 위한 전달 팩을 준비하였다. BSC에서, 리피터 펌프 유체 전달 세트의 큰 직경의 튜빙 단부를 TIL 함유 전달 팩 상의 루어 어댑터에 부착하였다. 지혈기를 사용하여 전달 팩에 근접한 라인을 클램핑하였다. 전달 세트의 단부 상에 적색 캡을 놓았다.
TIL을 인큐베이터에 두었다. BSC로부터 세포 현탁액을 꺼내고, 필요할 때까지 인큐베이터에 두었다. 시간을 기록하였다.
NC-200을 이용하여 세포 계수 및 계산을 수행하였다. 초기에 상기 제조된 4.5 mL의 AIM-V 배지 내로 0.5 mL의 세포 현탁액을 첨가함으로써 세포 계수 샘플을 희석하였다. 이로써 1:10 희석물을 수득하였다.
계대배양을 위한 플라스크를 계산하였다. 시딩할 플라스크의 총수를 계산하였다. 시딩할 지-렉스500MCS 플라스크의 수를 가장 가까운 정수로 반올림하였다.
실시예 6. 동결보존된 종양 조직으로부터의 TIL의 소규모 생산.
동결을 위한 종양 조직의 제조: 종양을 무균 수집하고, 멸균 트위저 및 스칼펠 및/또는 가위를 사용하여 트리밍하여 이질 비-종양 또는 괴사성 조직을 제거하였다. 최소 크기가 1.5 cm 직경인 종양을 6 mm 크기의 단편으로 추가로 단편화하였다. 종양을 동결시키기 위해, 최대 10개 조각의 6 mm 직경 단편을 10 mL의 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국) 저장 배지를 함유하는 단일 15 mL 크리오바이알 (써모, 미국)에 넣었다. 6 mm 직경 단편이 10개의 단편을 초과한 경우에 추가의 크리오바이알을 사용하였다. 크리오바이알 뚜껑을 단단히 조인 다음; 크리오바이알을 적어도 3회 내지 최대 약 5회 반복적으로 뒤집음으로써 종양 단편을 저장 배지와 서서히 혼합하였다. 이어서, 크리오바이알을 냉장고 내 2℃-8℃에서 15 내지 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 크리오바이알을 크리오쉬퍼 슬리브 내로 끼워넣었다.
종양 조직의 동결: 크리오바이알을 함유하는 크리오쉬퍼 슬리브를 액체 질소 건조 크리오쉬퍼 내에 넣고, 이에 의해 LN2 충전되고 온도 평형화된 건조 LN2 크리오쉬퍼 내부의 증기 상 액체 질소 온도를 사용하여 바이알의 내용물을 급속 동결시켰다. 단기간 저장 또는 수송을 위해, 바이알을 크리오쉬퍼에 남아있도록 하였다. 장기간 저장을 위해, 바이알을 액체 질소 동결기에 전달하고 액체 질소 온도에서 저장하였다.
저장된 종양 조직의 해동: 크리오바이알을 37℃ 수조에서 5 ± 1분 동안 침지시킴으로써 동결된 종양 샘플을 해동시켰다. 겸자를 사용하여, 6 mm 직경 단편을 분리해내고, 겐타미신 (깁코, 미국)을 함유한 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS) (깁코, 미국)으로 3회 세척하였다. 겐타미신을 HBSS에 50 μg/mL로 첨가하였다. 각각의 6 mm 직경 단편을 대략 8개의 개별 1 내지 3 mm 직경 단편으로 추가로 절제하였다. 전형적인 종양 단편은 약 1 내지 3 mm 직경 및 약 1 내지 3 mm 두께였다.
1/100 규모 절차를 사용하는 TIL 확장: 이 절차는 전체-규모 공정 2A TIL 제조 방법을 1/100 규모로 복제한 것이다. 연구의 범주는 지-렉스 10M 및 지-렉스 5M 플라스크를 사용하는 소형 2A 공정에 대한 지침을 제공하는 것이다. 전체-규모 사전-REP 공정의 1:10으로 지-렉스 10M 플라스크를 사용하여 사전REP 배양을 개시하였다. 지-렉스 5M에서 사전-REP 생성물의 10%를 사용하여 REP를 개시하였으며, 이는 전체-규모 REP 공정의 1:10에 해당한다. 이는 나머지 실험 동안 1:100 규모를 유지하였다.
사전-REP를 종양 가공으로 개시하고, 4개의 단편을 개별 지-렉스 10M 플라스크에 넣고, 제11일까지 CM1+IL-2와 함께 배양하였다. 제11일에 지-렉스 5M에서 사전-REP TIL (사전-REP 생성물의 10%), PBMC 피더, OKT3 및 IL-2를 사용하여 REP를 개시하였다. 제16일은 적절한 양의 TIL을 보유할 것이고, 증배 계수를 사용하여 전체-규모 공정을 외삽할 것이다. 도 7은 이러한 실험 규모 TIL 생산에 사용된 절차를 요약한다.
표 25는 이러한 실험 규모 TIL 생산에 사용된 장비를 열거한다.
표 25. 장비.
Figure pct00029
표 26은 이러한 실험 규모 TIL 생산에 사용된 소프트웨어를 열거한다.
표 26. 소프트웨어.
Figure pct00030
표 27은 이러한 실험 규모 TIL 생산에 사용된 물질을 열거한다.
표 27. 물질.
Figure pct00031
표 28은 사용된 추가의 물질 및 시약을 열거한다.
표 28. 추가의 물질 및 시약.
Figure pct00032
표 29는 다양한 마커 발현을 특징화하기 위한 세포의 유동 세포측정법 (FACS) 분석에 사용되는 시약을 열거한다.
표 29. FACS 시약.
Figure pct00033
표 30은 세포 배양 배지에 사용된 시약을 열거한다.
표 30. 배지 시약.
Figure pct00034
소규모 TIL 확장을 위한 절차 (규모 2A 공정의 1/100)
제0일
배지 제조, 필요한 경우, IL-2를 제조하였다. 3개의 지-렉스 10M 플라스크마다 350 mL CM1을 제조하였다. 6000 IU/mL IL-2를 CM1에 첨가하였다. 종양을 가공하면서 37℃ 수조에서 가온하였다.
종양 가공: 100mL의 배지 및 IL-2를 각각의 지-렉스 10M 플라스크에 첨가하고, 4개의 단편을 각각의 플라스크에 무작위로 첨가하였다. 결과의 이질성을 증가시키기 위해 단편을 무작위화하도록 하였다. 인큐베이터에 37℃/5% CO2에서 11일 동안 두었다.
제11일
배지 제조, 필요한 경우, IL-2를 제조하였다. 3개의 지-렉스 5M 플라스크마다 300 mL CM2를 제조하였다. 3000 IU/mL IL-2를 CM2에 첨가한 다음, 37℃ 수조에서 가온하였다.
제1 배양물로부터 TIL을 제조하였다: 세포를 건드리지 않으면서 인큐베이터로부터 각각의 지-렉스 10M 플라스크를 조심스럽게 꺼냈다. 배지를 흡인하고, 10 mL 피펫을 사용하여, 위아래로 서서히 혼합하여 막으로부터 세포를 유리시켰다. 배양물을 천천히 뽑아내고, 각각의 플라스크로부터 부피를 기록하고, 50 mL 원추형 바이알로 전달하였다.
세포 계수를 위해 200 μL 분취물을 수득한 다음, 3개의 바이알을 느슨하게 캡핑하고, 플라스크에 시딩할 준비가 될 때까지 37℃/5% CO2 인큐베이터에 두었다. TIL을 계수하고, 세포 계수 워크시트에 기록하였다.
피더 세포를 제조하였다: 적절한 수의 피더 (50 x 106개 세포/플라스크)를 수득하고; 피더 세포를 37℃ 수조에서 2분 동안 해동시킨 다음, 피더 세포를 CM2+IL-2 중에 1:10으로 희석하였다. 세포 계수를 위해 200 μL 분취물을 분리해냈다. 바이알을 느슨하게 캡핑하고, 플라스크에 시딩할 준비가 될 때까지 37℃/5% CO2 인큐베이터에 두었다. 20uL PBMC 피더 세포를 1:10으로 희석하고, PBMC 피더를 계수하였다. 세포 계수 워크시트에 기록하였다. 계수에 기초하여, 피더를 CM2+IL-2 중 10 x 106개 세포/mL로 희석한 다음, 5 mL의 용액을 각각의 플라스크에 대해 50 mL 원추형 튜브 내로 넣었다. 각각의 플라스크에 대해, 1.5 mL의 1:1000 희석된 스톡 OKT-3을 5mL의 피더에 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다.
각각의 플라스크에 TIL, PBMC 피더 세포, OKT-3 및 배지를 첨가함으로써 플라스크에 시딩하였다. TIL의 경우, 일반적으로 플라스크당 최대 약 2 x 106개 세포까지, 사전REP 생성물의 약 10%를 첨가하였다. PBMC 피더의 경우, 총 50 x 106개 세포를 함유하는, 상기와 같이 제조된 5 mL를 첨가하였다. 1.5 mL의 1:1000 희석된 OKT-3 스톡을 첨가한 다음, CM2 배지로 상단을 덮어 최종 부피 50 mL가 되게 하였다.
제16일
분할을 위한 배지 제조: 필요한 경우, IL-2를 제조한 다음; 3개의 플라스크마다 150 mL CM4를 제조하였다. 다음에, 3000 IU/mL IL-2를 배지에 첨가하였다. 필요할 때까지 37℃ 수조에 두었다.
분할: 세포를 건드리지 않으면서 인큐베이터로부터 지-렉스 5M 플라스크를 조심스럽게 꺼낸 다음, 세포를 흡인하지 않도록 주의하면서 대략 40 mL 배지를 흡인하였다. 10 mL 피펫을 사용하여, 위아래로 서서히 혼합하여 막으로부터 세포를 유리시킨 다음; 배양물을 천천히 뽑아내고, 각각의 플라스크로부터 부피를 기록하고, 50 mL 원추형 바이알로 전달하였다. 세포 계수를 위해 200 μL 분취물을 취한 다음, 3개의 바이알을 느슨하게 캡핑하고, 이들을 플라스크에 시딩할 준비가 될 때까지 37℃/5% CO2 인큐베이터에 두었다. TIL을 계수하고, 세포 계수 워크시트에 기록하였다. 지-렉스 5M 플라스크의 바닥으로부터 남아있는 액체를 흡인시켜 플라스크에 추가의 TIL이 남아있지 않도록 보장하였다.
각각의 플라스크에 대한 딸 플라스크의 수를 계산하고 (TVC/106), 반올림하였다 (최대 5). TVC를 딸 플라스크의 수로 나누고, 플라스크를 계산된 양으로 조정하였다. 일부 실험은 단지 1개의 플라스크만이 계속되도록 할 수 있다. 이는 또한 수거의 종료시에 외삽되고 설명될 것이다. 플라스크를 CM4+IL2로 50 mL까지 충전한 다음, 플라스크를 37℃/5% CO2에서 두었다.
제22일
수거: 세포를 건드리지 않도록 인큐베이터로부터 지-렉스 5M 플라스크를 조심스럽게 꺼낸 다음, 대사물 분석에 필요한 경우 상청액을 분리해냈다. 배지를 흡인하고, 10 mL 피펫을 사용하여, 위아래로 서서히 혼합하여 막으로부터 세포를 유리시켰다. 배양물을 천천히 뽑아내고, 각각의 플라스크로부터 부피를 기록한 다음, 50 mL 원추형 바이알로 전달하였다. 세포 계수를 위해 200 μL 분취물을 분리해낸 다음, 3개의 바이알을 느슨하게 캡핑하고, 플라스크에 시딩할 준비가 될 때까지 37℃/5% CO2 인큐베이터에 두었다.
세포 계수 워크시트 상의 TIL 기록을 계수하고; 이론적 전체-규모 수율을 외삽하고 기록하였다 (TVC*100). 단지 1개의 플라스크만이 분할되어 계속되는 경우에, 또한 상기 계산된 플라스크의 수만큼 곱하였다. 이어서, 표 31에 열거된 검정을 위해 세포를 할당하였다.
표 31. 기능적 검정.
Figure pct00035
나머지 세포를 1% HSA/PL-A의 1:10 희석물로 2회 세척하였다. 다른 연구를 위해 CS10을 함유한 1:1 제제 (30 x 106개 세포/mL/바이알) 중 나머지 세포를 단열 용기 (예컨대 미스터 프로스티(Mr. Frosty) 용기) 또는 CRF에서 동결시켰다.
표 32는 TIL 생산 공정에 대한 중요한 공정 파라미터를 요약한다.
표 32. 공정 파라미터.
Figure pct00036
실시예 7. 동결된 종양 조직 TIL을 사용한 초기 REP.
이 데이터는 실시예 5에 상술된 TIL 제조 프로토콜의 변형된 버전을 사용하여 생성되었다. 실시예 5와 상이한 실험 방법의 측면이 강조되어 있다.
종양 조직 제조: 종양을 수화된 상태로 유지하면서, 필요에 따라 적가를 통해 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 조직에 첨가함으로써, 종양을 수화된 상태로 유지하도록 주의를 기울였다. 멸균 트위저, 스칼펠 및 가위를 사용하여 종양을 트리밍하여 이질 비-종양 조직을 제거하였다. 최소 크기가 1.5 cm 직경인 종양 단편을 6 mm 직경의 조각으로 추가로 단편화하였다. 각각의 단편에 대한 이상적인 두께는 대략 6 mm였다.
종양 조직 동결: 10개 이하의 종양 단편 (공칭 크기 6 mm x 6 mm x 6 mm)을 각각의 크리오바이알에 넣었다. 15 mL 크리오바이알 (써모, 미국)을 사용하였다. 10 mL의 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 각각의 튜브에 첨가하였다. 크리오바이알 뚜껑을 단단히 조이고, 튜브를 5회 뒤집음으로써 크리오바이알의 내용물을 서서히 혼합하였다. 이어서, 크리오바이알을 냉장고 내 2℃-8℃에서 15분, 30분 또는 60분 동안 인큐베이션하였다. 저장 배지에서의 냉장 인큐베이션 후에, 크리오바이알을 슬리브에 패킹한 다음, 적절하게 충전되고 평형화된 건조 액체 질소 운송기 (크리오포트(Cryoport))에서 액체 질소의 증기 상 (LN2)을 사용하여 급속 동결시켰다. 저장을 위해, 완전 동결된 크리오바이알을 액체 질소 세포 저장 동결기로 전달하여, 동결된 종양 조직을 액체 질소 온도에서 유지하였다.
종양 해동: TIL 제조 공정의 제0일에, 종양 조직 단편을 함유하는 크리오바이알을 슬리브로부터 제거하고, 밀봉가능한 플라스틱 백에 넣은 다음, 밀봉된 백을 37℃ 수조에 5 ± 1분 동안 침지시킴으로써 해동시켰다.
겸자를 사용하여, 종양 단편을 멸균 HBSS (깁코, 미국) + 겐타미신 (깁코, 미국) 내로 조심스럽게 분리해내고, 겐타미신 (50 μg/mL)을 함유하는 HBSS에서 각각의 세척에 대해 ≥ 3분 동안 3회 연속 세척하였다. 모든 치수가 대략 5-6 mm인 개별 단편을 원래의 종양 샘플로부터 절단하고, 새로운 멸균 플라스틱 표면 상의 HBSS의 개별 액적에 두었다.
최대 60개의 이들 단편을 6000 IU/mL 재조합 인간 IL-2로 보충된 1 L의 세포 배양 배지 1 (CM1)을 함유하는 지-렉스 100MCS 플라스크 내에 넣고, 플라스크를 가습 인큐베이터 (공기 중 표적 37℃, 5% CO2) 내에 두어 사전-급속 확장 단계 (사전-REP) 유닛 작동을 개시하였다.
TIL 제조의 요약: 사전REP 및 REP. 소규모 Gen 2 공정 (1/100 규모)을 사용하여 "신선한" 대조군 및 여러 동결된 종양 조건을 시험하였다. 전체-규모 사전-REP 공정의 1:10 규모로 지-렉스 10M 플라스크를 사용하여 사전-REP 배양을 개시하였다. 지-렉스 5M에서 사전-REP 생성물의 10%를 사용하여 REP를 개시하였으며, 이는 전체-규모 REP 공정의 1:100에 해당한다.
"신선한" 대조군 공정을 위해, 신선한 종양을 멸균 HBSS + 겐타미신 중에서 세척하고, 공칭 6 mm x 6 mm x 6 mm 단편으로 절편화하였다. 약 4개의 단편을 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 CM1 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 내에 넣었다. 지-렉스 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 11일 동안 인큐베이션하였다. 배양 제11일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 지-렉스 5M 플라스크에서 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 CM2 배지 중 50 x 106개 PBMC 피더 세포와 함께 사전-REP TIL의 10%를 공동배양함으로써 REP를 개시하였다. 공동-배양 제16일에, 배양물을 10x106개 이하의 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 내로 분할하였다. 분할 "딸" 플라스크의 수의 계산을 하기와 같이 수행하였다: TVC/106 = 딸 플라스크의 수, 반올림함.
분할 배양물을 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 CM4 배지에서 추가로 6일 동안 인큐베이션하였다. 제22일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시켰다.
동결된 종양 확장 공정을 위해, 공칭 6 mm x 6 mm x 6 mm 단편을 상기 설명된 바와 같이 더 작은 2 mm - 3 mm 단편으로 가공하였다. 동결된 종양 확장을 위해 사용되는 사전-REP 설정, REP 개시, 분할 공정 및 시약을 "신선한" 대조군 공정과 정확히 유사하게 수행하되, 하기는 예외였다:
사전-REP 배양물의 지속기간은 7일이었다 (vs "신선한" 대조군의 경우 11일).
REP 배양의 지속기간은 제7일에 분할하면서 14일이었다 (vs "신선한" 대조군의 경우 제5일에 분할하면서 11일). 따라서, 동결된 종양의 총 지속기간은 21일이었다 (vs "신선한" 대조군의 경우 22일).
특징화 또는 REP TIL: TIL을 각각의 종양 가공 조건으로부터 생산하였다 (신선한 것, 저장 배지에서 0, 30분 또는 60분 냉장 인큐베이션으로 동결된 것). TIL 순도, 정체, 기억 하위세트, 활성화 및 소진 마커를 특징화하기 위해, 하기 항체를 사용하여 유동 세포측정법을 수행하였다: CD3-BUV395, CD62LBV421, CD57-PB, CD11c-BV711, CD28-BB515, CD19-BUV563, CCR7-PE, CD123-BV605, CD27PE-CF594, CD14-BV-650, TCRγ/δ-APC, CD45-PerCP-Cy5.5, CD45RA-A700, CD56-BUV737, CD8-BV786, CD4-PE-Cy7AND CD16-APC-Vio770) 및 TIL-2 패널 (CD3-BUV395, PD-1-BV421, 2B4/CD244-PB, CD8-BB515, CD25-BUV563, BTLA-PE, KLRG1-PE-다즐 594, TIM-3-BV650, CD194/CCR4-APC, CD4-비오그린, TIGIT-PerCP-이플루오르 710, CD183-BV711, CD69-APC-R700, CD95-BUV737, CD127-PE-Cy7, CD103-BV786, LAG-3-APC-이플루오르 780. IFN-γ, 그랜자임-B 및 CD107A의 분비에 기초하여 TIL 기능을 추가로 결정하였다. 간략하게, 약 105개 세포를 항-CD3 코팅된 플레이트로 24시간 동안 자극하였다. 배양물 상청액을 수집하고, ELISA를 사용하여 IFN-γ 및 그랜자임-B에 대해 시험하였다. CD107A 수준에 대해, TIL을 2시간 동안 PMA/IO의 자극 없이 또는 그로 자극한 다음, CD107A-APC700에 대해 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 추가로 분석하였다.
다코/애질런트 병리학 용액 (유동 세포측정법을 위한 텔로미어 PNA 키트/FITC) 키트를 사용하여 유동-FISH를 수행하여 제조업체의 지침에 따라 텔로미어 길이를 결정하였다. 1301 T-세포 백혈병 세포주 (시그마-알드리치)를 내부 참조 표준물로서 사용하였다.
결과
도 8은 종양 조직 동결 절차에 기초한 사전-REP 총 생존 세포 (TVC)를 보여준다. 저장 배지에서 냉장 조건 (2℃ - 8℃) 하에 약 30분 동안 인큐베이션하는 것은 즉각적 급속 동결 및 동결 전 더 긴 인큐베이션 둘 다의 경우와 비교하여 가장 생존력 있는 세포를 생성하였다. 도 9는 제21일에서의 REP TVC 결과를 보여준다. 동결 프로토콜은 사전-REP 배양에서 초기 생존율에 영향을 미친다. IFN-γ 분비를 측정함으로써 추가 기능을 평가하였으며, 이는 도 10에 요약되어 있다. 동결된 종양 조직으로부터 확장된 TIL을 먼저 저장 배지에서 30분 동안 인큐베이션한 것은 최고 수준의 IFN-γ를 발현하였다. 세포 표현형 패널에서 평가된 모든 마커 (표 29 참조)는 동결된 종양 조직으로부터 생산된 TIL이 신선한 종양 조직으로부터 생산된 TIL과 유사한 표현형을 갖는다는 것을 입증한다.
도 11 및 12는 주요 단계를 개괄하고, 본 예시적인 실험에서 비교된 세포 집단들 사이의 차이를 강조한다.
도 13-23은 3 내지 5명의 환자에서의 신선한 및 동결된 종양 샘플의 TIL 표현형 특징화의 결과를 예시한다. 환자 M1125를 급속 동결 및 액체 질소의 증기 상에서의 동결 전 2℃ 내지 8℃에서 30분 및 60분 인큐베이션으로 시험하고, 모든 다른 환자를 액체 질소의 증기 상에서의 동결 전 2℃ 내지 8℃에서 60분 인큐베이션으로 시험하였다. 종합하면, 동결된 종양 샘플은 신선한 종양 샘플과 같이 또는 그보다 더 우수하게 기능하였다.
실시예 8. 종양 동결보존 공정.
종양은 하기 공정에 따라 본 발명의 예시적인 실시양태에서 동결보존될 수 있다. 종양 조직은 무균으로 취급되어야 하고, 가공 전반에 걸쳐 오염이 없는 상태로 유지되어야 한다.
환자로부터 조직을 제거한 후에, 필요에 따라 전달 피펫을 사용한 적가를 통해 행크 평형 염 용액 (HBSS)을 조직에 첨가함으로써 조직을 수화된 상태로 유지하여야 한다. 종양을 뚜껑이 있는 멸균 시편 용기에 무균으로 넣고, 해부를 위해 병리센터로 보내지는 경우 수술실 또는 층류 후드에서 멸균 표면으로 전달한다. 각각의 부위에 지정된 절제 의사 또는 경험있는 병리학자가 멸균 트위저 및 멸균 스칼펠 또는 가위를 사용하여 종양을 트리밍하여 이질 비-종양 또는 괴사성 조직을 제거하여야 한다. 출혈성, 액상 및 괴사성 조직은 가능할 때마다 배제하여야 한다. 의사 또는 병리학자는 해부된 시편을 평가하여 조직이 생존하고, 비-출혈성이고, 괴사가 없고, 최소 크기 규격이 충족되는 것을 보장하여야 한다. 조직은 가능한 경우 색소 이질성을 가져야 한다.
종양이 적어도 1.5 cm의 직경을 갖는 경우에, 이를 절반으로 절단하여 비교를 위한 동결된 시편 및 신선한 시편 둘 다를 제공할 수 있다. 트리밍된 종양의 한쪽 절반을 겐타미신 및 암포테리신 첨가 하에 4-8℃에서 유지한 하이포써모솔의 멸균 병에 넣어야 한다. 뚜껑을 단단히 조여야 한다. 이는 신선한 시편을 제공한다.
종양의 다른 절반을 10 x 6 mm 단편으로 단편화하고, 10 mL의 멸균 크리오스토르® 10을 함유하는 제조된 멸균 15 mL 크리오바이알 내에 넣어야 한다. 10개 초과의 6 mm 단편을 수득하는 경우에, 10 mL의 멸균 크리오스토르 10을 함유하는 추가의 15 mL 크리오바이알을 사용한다. 뚜껑을 단단히 조여야 하고, 동결된 시편 용기를 4℃에서 1시간 동안 둔 다음, 액체 질소 상에서 급속 동결시켜야 한다. 이는 동결된 시편을 제공한다.
동결된 종양 시편을 크리오쉬퍼 지침에 따라 크리오쉬퍼 내로 패키징하여야 한다.
실시예 9. 난소암 종양으로부터의 16일의 동결된 종양 확장 공정.
소규모 TIL 확장 공정 (1/100 규모)을 사용하여 "신선한" 대조군 종양 샘플 및 동결된 종양 샘플을 시험하였다. 동결된 종양 샘플을 상기 실시예 7 및 8에서 논의된 동결보존 공정에 따라 동결시켰다. 전체-규모 사전-REP 공정의 1:10으로 지-렉스 10M 플라스크를 사용하여 사전-REP를 개시하였다. 지-렉스 5M 플라스크에서 사전-REP 생성물의 10%를 사용하여 REP를 개시하였으며, 이는 전체-규모 REP 공정의 약 1:100에 해당한다. 본 실시예에서는 난소 종양 샘플을 사용하였다.
신선한 종양 제조. 6개의 3 mm 직경의 신선한 종양 단편을 겐타미신으로 보충된 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척하였다. 약 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 CM1 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 내에 단편을 넣었다. 이들 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 11일 동안 인큐베이션하였다. 제11일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 지-렉스 5M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 CM2 배지 중 50x106개 PBMC 피더 세포와 사전-REP TIL의 10%를 공동-배양함으로써 REP를 개시하였다. 제16일에, 배양물을 10x106개 이하의 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 내로 분할하였다. 분할 배양물을 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 CM4 배지에서 추가로 6일 동안 인큐베이션하였다. 제22일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시켰다.
동결된 종양 제조 - 초기 REP 방법 1 ("ER-1"). 6개의 2-3 mm 직경의 동결된 종양 단편을 해동시키고, 겐타미신으로 보충된 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척하였다. 약 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 CM1 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 내에 단편을 넣었다. 이들 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 제5일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 지-렉스 5M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 CM2 배지 중 25x106 또는 50x106개 PBMC 피더 세포와 사전-REP TIL의 10%를 공동-배양함으로써 REP를 개시하였다. 제10일에, 배양물을 10x106개 이하의 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 내로 분할하였다. 분할 배양물을 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 CM4 배지에서 추가로 6일 동안 인큐베이션하였다. 제16일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시켰다.
동결된 종양 제조 - 초기 REP 방법 2 ("ER-2"). 6개의 2-3 mm 직경의 동결된 종양 단편을 해동시키고, 겐타미신으로 보충된 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척하였다. 약 6,000 IU/mL의 rhIL-2를 함유하는 CM1 배지를 갖는 지-렉스 10M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤) 내에 단편을 넣었다. 이들 배양물을 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 제3일에, 사전-REP 세포를 수거하고, 지-렉스 5M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링, 미네소타주 뉴 브라이톤)에서 3,000 IU/mL rhIL-2 및 30 ng/mL의 OKT-3을 함유하는 CM2 배지 중 25x106 또는 50x106개 PBMC 피더 세포와 사전-REP TIL의 10%를 공동-배양함으로써 REP를 개시하였다. 제9일에, 배양물을 10x106개 이하의 세포를 함유하는 지-렉스 5M 플라스크 내로 분할하였다. 분할 배양물을 3,000 IU/mL rhIL-2를 함유하는 CM4 배지에서 추가로 7일 동안 인큐베이션하였다. 제16일에, 세포를 수거하고, 크리오스토르10 (바이오라이프, 미국)을 사용하여 동결시켰다.
도 24는 이들 3가지 확장 방법을 비교하는 흐름도를 예시한다. 결과를 하기 표 33에 예시한다. ER-1 및 ER-2 방법 둘 다를 사용한 TIL의 확장은 신선한 종양 샘플 방법 GEN2를 사용한 경우와 비교하여 훨씬 더 큰 REP 배수 확장을 가져왔다.
표 33: 전체 규모로 외삽된 실시예 9로부터의 확장 결과.
Figure pct00037
실시예 10: 다른 종양 유형을 사용한 16일의 동결된 종양 확장 공정.
하기 암 유형: 흑색종, 폐암, 자궁경부암 및 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)의 적어도 2명의 환자로부터 수집된 종양 샘플을 사용하여 실시예 9에 개시된 공정을 수행한다. ER-1 및 ER-2 방법에 대해 상기 기재된 것과 실질적으로 동일한 방식으로 각각의 암 유형에 대해 확장 공정을 수행한다. 상기 기재된 바와 같이 데이터를 수집한다.
실시예 11: 한정 배지를 사용한 16일의 동결된 종양 확장 공정.
하기 암 유형: 흑색종, 폐암, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 난소암의 적어도 2명의 환자로부터 수집된 종양 샘플을 사용하되, CM1 및 CM2 배지를 본 발명에 따른 한정 배지 (예를 들어, 3% CTS™ 면역 세포 혈청 대체물 (써모피셔 사이언티픽) 및 55mM의 2-메르캅토에탄올을 갖는 CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM)로 대체하여 실시예 9에 개시된 공정을 수행한다.
실시예 12: OMNI C3™ 배양 백 및 EXP-PAK® 바이오-컨테이너를 사용한 16일의 동결된 종양 확장 공정
하기 암 유형: 흑색종, 폐암, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 난소암의 적어도 2명의 환자로부터 수집된 종양 샘플을 사용하되, 지렉스 기체 투과성 용기를 OMNI C3™ 배양 백 (램파이어 바이올로지칼 래보러토리즈) 또는 EXP-PAK® 세포 확장 바이오-컨테이너 (차터 메디칼)로 대체하여 실시예 9에 개시된 공정을 수행한다. OMNI C3™ 배양 백은 사전-REP/제1 확장 단계에서 대체하고, EXP-PAK® 바이오-컨테이너는 REP/제2 확장 단계에서 대체한다.
실시예 13: 한정 배지, OMNI C3™ 배양 백 및 EXP-PAK® 바이오-컨테이너를 사용한 16일의 동결된 종양 확장 공정
하기 암 유형: 흑색종, 폐암, 자궁경부암, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 및 난소암의 적어도 2명의 환자로부터 수집된 종양 샘플을 사용하되, CM1 및 CM2 배지를 본 발명에 따른 한정 배지 (예를 들어, CTS™ 옵트마이저™ T-세포 확장 SFM, 써모피셔)로 대체하고, 지렉스 기체 투과성 용기를 OMNI C3™ 배양 백 (램파이어 바이올로지칼 래보러토리즈) 또는 EXP-PAK® 세포 확장 바이오-컨테이너 (차터 메디칼)로 대체하여 실시예 9에 개시된 공정을 수행한다. OMNI C3™ 배양 백은 사전-REP/제1 확장 단계에서 대체하고, EXP-PAK® 바이오-컨테이너는 REP/제2 확장 단계에서 대체한다.
SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. Veerapathran, Anand Onimus, Kenneth <120> EXPANSION OF TILS FROM CRYOPRESERVED TUMOR SAMPLES <130> 116983-5041 <150> US 62/733,937 <151> 2018-09-20 <150> US 62/879,881 <151> 2019-07-29 <160> 176 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu 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Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 150 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab variable light chain <400> 150 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab heavy chain CDR1 <400> 151 Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 152 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab heavy chain CDR2 <400> 152 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 153 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab heavy chain CDR3 <400> 153 Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab light chain CDR1 <400> 154 Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab light chain CDR2 <400> 155 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> durvalumab light chain CDR3 <400> 156 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 157 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab heavy chain <400> 157 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 158 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab light chain <400> 158 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 159 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab variable heavy chain <400> 159 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 160 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab variable light chain <400> 160 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 161 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab heavy chain CDR1 <400> 161 Ser Tyr Ile Met Met 1 5 <210> 162 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab heavy chain CDR2 <400> 162 Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab heavy chain CDR3 <400> 163 Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr 1 5 10 <210> 164 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab light chain CDR1 <400> 164 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab light chain CDR2 <400> 165 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 166 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> avelumab light chain CDR3 <400> 166 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val 1 5 10 <210> 167 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain <400> 167 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 168 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain <400> 168 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 169 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab variable heavy chain <400> 169 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 170 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab variable light chain <400> 170 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 171 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR1 <400> 171 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His 1 5 10 <210> 172 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR2 <400> 172 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 173 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab heavy chain CDR3 <400> 173 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 174 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR1 <400> 174 Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR2 <400> 175 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> atezolizumab light chain CDR3 <400> 176 Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr 1 5

Claims (75)

  1. (i) 종양 조직을 단편화하는 단계;
    (ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
    (iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계
    를 포함하는, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위해 종양 조직을 동결보존하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 종양 조직이 약 1.5 mm 내지 6 mm의 직경을 갖는 대략 구형인 단편으로 단편화되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 대략 구형인 단편이 약 6 mm의 직경을 갖는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 대략 구형인 단편이 약 3 mm의 직경을 갖는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 종양 조직이 적어도 1.5 mm의 최단 가장자리 길이 및 약 6 mm의 최장 가장자리 길이를 갖는 일반적으로 직사각형인 단편으로 단편화되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 종양 조직이 약 1.5 mm 내지 약 6 mm의 가장자리 길이를 갖는 일반적으로 입방형인 단편으로 단편화되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 일반적으로 입방형인 단편이 약 6 mm의 가장자리 길이를 갖는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 일반적으로 입방형인 단편이 약 3 mm의 가장자리 길이를 갖는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 종양 조직이 절제된 종양으로부터의 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 절제된 종양이 8시간 미만의 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 동결보존 배지가 2% v/v 내지 15% v/v 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 동결보존 배지가 약 10% v/v DMSO를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 동결보존 배지가 적어도 1종의 항미생물제를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 1종의 항미생물제가 적어도 50 μg/mL의 농도의 겐타미신인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 종양 단편이 동결보존 배지에서 약 30분 내지 약 80분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 종양 단편이 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 인큐베이션되는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 종양 조직이 인큐베이션 전에 생리학상 완충 등장성 염수 용액 중에서 세척되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 세척이 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, 생리학상 완충 등장성 염수 용액은 각각의 연속 세척 후에 교체되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 동결이 -125℃ 내지 약 -196℃ 범위의 온도에서 일어나는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 동결이 약 -140℃ 내지 약 -175℃의 온도에서 일어나는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 동결이 약 -145℃의 온도에서 일어나는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, (iv) 동결된 단편을 적어도 -130℃ 미만에서 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 동결된 단편이 액체 질소의 증기 상 중에 저장되는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 동결된 단편이 액체 질소 중에 침지되어 저장되는 것인 방법.
  25. (i) 절제된 종양 또는 종양 생검 샘플을 단편화하는 단계;
    (ii) 단편을 동결보존 배지에서 인큐베이션하는 단계; 및
    (iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계
    를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (ii)가 10% v/v DMSO를 포함하는 동결보존 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃에서 약 30분 내지 약 60분 동안 단편을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 상기 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편.
  27. (i) 절제된 종양을 단편화하는 단계이며, 여기서 단편은 일반적으로 입방형 형상이고 각각의 가장자리에서 약 6 mm인 단계;
    (ii) 10% DMSO v/v를 포함하는 동결보존 배지에서 단편을 인큐베이션하는 단계이며, 여기서 인큐베이션은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 30분 내지 약 60분 동안 수행되는 것인 단계; 및
    (iii) 단편을 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계
    를 포함하는 공정에 의해 제조된, 종양 침윤 림프구 (TIL)의 제조를 위한 동결보존된 종양 단편.
  28. IL-2를 포함하는 배양 배지에서 동결보존된 종양 단편을 배양하는 단계를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법.
  29. (a) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 동결보존된 종양 단편을 처리하여 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공하는 단계;
    (b) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계; 및
    (c) 임의로 확장된 수의 TIL을 동결보존하는 단계
    를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법.
  30. (a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
    (ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
    (iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2 내지 약 8℃의 온도에서 약 30분 내지 약 60분의 기간 동안 인큐베이션하는 단계;
    (iv) 용기를 동결시키는 단계이며, 여기서 동결은 액체 질소의 증기 상을 사용하는 급속 동결인 단계; 및
    (v) 용기를 -130℃ 이하에서 저장하는 단계
    를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
    (b) 용기를 해동시키는 단계;
    (c) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3을 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공하는 단계; 및
    (d) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지를 사용하여 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계
    를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 단계 (i)에서의 종양 조직이 1.5 mm 내지 6 mm 직경으로 트리밍되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단계 (i)에서의 종양 조직이 약 6 mm x 6 mm x 6 mm로 트리밍되는 것인 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 배지가 항박테리아제 및 항진균제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 배지가 2% v/v 내지 12% v/v 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 저장 배지가 10% DMSO를 포함하는 것인 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 저장 배지가 겐타미신을 적어도 50 μg/mL의 농도로 포함하는 것인 방법.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 조직이 단계 (i)을 수행하기 전에 먼저 행크 평형 염 용액 (HBSS) 중에서 세척되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 세척이 각각 적어도 3분의 3회 연속 세척을 포함하며, HBSS는 각각의 연속 세척 후에 교체되는 것인 방법.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 용기를 약 37℃의 온도의 수조에 약 5분 동안 침지시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 또는 제30항에 있어서, 종양 조직이 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 난소 종양 조직 또는 HPV-양성 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제30항에 있어서, 제1 확장 단계 (c)와 제2 확장 단계 (e) 사이에 분할을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 분할이 단계 (c)가 개시된 지 약 16일 후에 일어나는 것인 방법.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 배양 단계가 약 11일인 방법.
  44. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 내지 (e)가 약 22일의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법.
  45. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 내지 (e)가 20일 미만의 기간에 걸쳐 수행되는 것인 방법.
  46. 제30항에 있어서, 단계 (iv)가 용기를 약 -125℃ 내지 약 -150℃에서 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  47. 제30항에 있어서, 단계 (iv)가 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  48. 제30항에 있어서, 단계 (v)가 용기를 적어도 약 -130℃ 미만에서 저장하는 것을 포함하는 것인 방법.
  49. 제30항에 있어서, 단계 (v)가 용기를 액체 질소 중에 침지시켜 저장하는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. (a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
    (ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
    (iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2 내지 약 8℃에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
    (v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
    를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
    (b) 용기를 해동시키는 단계;
    (c) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3을 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공하는 단계;
    (d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
    (e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계
    를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법.
  51. (a) (i) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
    (ii) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
    (iii) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 2 - 8℃에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (iv) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계; 및
    (v) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계
    를 포함하는 종양 조직의 저장 방법에 의해 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
    (b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
    (c) 종양 단편을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
    (d) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 제1 종양 침윤 림프구 (TIL) 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (c)에서 단계 (d)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (e) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (d)에서 단계 (e)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (f) 단계 (e)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (e)에서 단계 (f)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (g) 단계 (f)로부터 수거된 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (f)에서 (g)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (h) 단계 (g)로부터 수거된 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
    (i) 암을 갖는 대상체에게 단계 (h)에서의 주입 백으로부터의 제3 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계
    를 포함하는, 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, (j) 대상체에게 치료 유효 투여량의 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러를 병용으로 투여하는 단계 및 (k) 대상체에게 치료 유효 투여량의 PD-1/PD-L1 억제제를 병용으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, PD-1/PD-L1 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 아테졸리주맙 및 그의 바이오시밀러로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 암이 흑색종, 자궁경부암, 두경부 편평 세포암, 비소세포 폐암, 방광암, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  55. (e) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
    (f) 종양 조직을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (g) 종양 조직을 동결시키는 단계;
    (h) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
    (b) 종양 조직을 해동시키는 단계;
    (c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공하는 단계;
    (d) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
    (e) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계
    를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법.
  56. (a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
    (b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
    (b) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
    (c) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (d) 용기를 동결시키는 단계;
    (e) 용기가 동결된 상태로 유지되도록 용기를 저장하는 단계;
    (d) 용기를 해동시키는 단계;
    (f) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
    (g) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
    (h) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계
    를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 TIL을 확장시키는 방법.
  57. (a) 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체로부터 종양 조직을 수득하는 단계;
    (b) 종양 조직을 트리밍하여 과량의 비-종양 조직을 제거하는 단계;
    (c) 저장 배지를 함유하는 폐쇄가능한 용기에 종양 조직을 넣는 단계;
    (d) 종양 조직 및 저장 배지를 함유하는 용기를 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 20분 내지 약 70분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (e) 용기를 액체 질소의 증기 상을 사용하여 동결시키는 단계;
    (f) 용기를 액체 질소의 증기 상 온도에서 저장하는 단계;
    (g) 종양 조직을 해동시키는 단계;
    (h) 종양 조직을 폐쇄 시스템 내로 첨가하는 단계;
    (i) IL-2를 포함하는 세포 배양 배지에서 종양 조직으로부터의 제1 종양 침윤 림프구 (TIL) 집단을 배양함으로써 제1 확장을 수행하여 제2 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제1 확장은 제1 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 제1 확장은 약 3-14일 동안 수행되어 제2 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제2 TIL 집단은 제1 TIL 집단보다 수가 적어도 50배 더 많고, 여기서 단계 (h)에서 단계 (i)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (j) 제2 TIL 집단의 세포 배양 배지를 추가의 IL-2, OKT-3 및 항원 제시 세포 (APC)로 보충함으로써 제2 확장을 수행하여 제3 TIL 집단을 생산하는 단계이며, 여기서 제2 확장은 약 7-14일 동안 수행되어 제3 TIL 집단이 수득되고, 여기서 제3 TIL 집단은 제2 TIL 집단에 비해 증가된 이펙터 T 세포 및/또는 중심 기억 T 세포의 하위집단을 포함하는 치료적 TIL 집단이고, 여기서 제2 확장은 제2 기체-투과성 표면 영역을 제공하는 폐쇄 용기에서 수행되고, 여기서 단계 (i)에서 단계 (j)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (k) 단계 (j)로부터 수득된 치료적 TIL 집단을 수거하는 단계이며, 여기서 단계 (j)에서 단계 (k)로의 이행은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (l) 단계 (k)에서 수거된 치료적 TIL 집단을 주입 백으로 전달하는 단계이며, 여기서 단계 (k)에서 (l)로의 전달은 시스템 개방 없이 일어나는 것인 단계;
    (m) 단계 (l)로부터의 치료적 TIL 집단을 포함하는 주입 백을 동결보존 공정을 사용하여 동결보존하는 단계; 및
    (n) 대상체에게 단계 (m)에서의 주입 백으로부터의 치료적 TIL 집단의 치료 유효 투여량을 투여하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 생산된 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 인간 대상체를 위해 암을 치료하는 방법.
  58. (a) 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계이며, 여기서 종양 조직은 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 것인 단계;
    (b) 종양 조직을 저장 배지에서 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위의 온도에서 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계;
    (c) 종양 조직을 동결시키는 단계;
    (d) 종양 조직을 동결된 상태로 저장하는 단계;
    (e) 종양 조직을 해동시키는 단계;
    (f) 기체 투과성 용기에서 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지로 종양 조직을 처리하여 TIL을 제공하는 단계;
    (g) 적어도 복수의 TIL을 분리해내는 단계; 및
    (h) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계
    를 포함하는, 동결된 종양 조직으로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 확장시키는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 단계 (f)에서의 TIL이 약 3일 내지 약 5일의 기간에 걸쳐 배양되고, 단계 (h)에서의 TIL이 약 11일 내지 약 13일의 기간에 걸쳐 배양되는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 단계 (f)에서의 TIL이 약 3일의 기간에 걸쳐 배양되고, 단계 (h)에서의 TIL이 약 13일의 기간에 걸쳐 배양되는 것인 방법.
  61. 제58항에 있어서, 단계 (f)에서의 TIL이 약 5일의 기간에 걸쳐 배양되고, 단계 (h)에서의 TIL이 약 11일의 기간에 걸쳐 배양되는 것인 방법.
  62. 제58항에 있어서, (i) TIL을 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 수거된 TIL의 수가 적어도 10000배의 증가를 나타내는 것인 방법.
  64. (a) 인터류킨 2 (IL-2) 및 임의로 OKT-3 항체를 포함하는 제1 세포 배양 배지에서 동결보존된 종양 단편을 배양하여 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제공하는 단계;
    (b) 방사선조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지에서 TIL을 확장시켜 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계; 및
    (c) 임의로 확장된 수의 TIL을 동결보존하는 단계
    를 포함하는, 입양 T-세포 요법을 위한 종양 침윤 림프구 (TIL)를 제조하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 제1 배양 배지가 한정 배지인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 제2 배양 배지가 한정 배지인 방법.
  67. 제64항에 있어서, 제1 배양 배지 및 제2 배양 배지가 동일한 또는 상이한 한정 배지인 방법.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 약 11일 내에 수행되는 것인 방법.
  69. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 약 11일 내에 수행되는 것인 방법.
  70. 제64항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 총 약 22일 내에 수행되는 것인 방법.
  71. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 약 5일 내에 수행되는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 단계 (b)가 약 11일 내에 수행되는 것인 방법.
  73. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 약 3일 내에 수행되는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 단계 (b)가 약 13일 내에 수행되는 것인 방법.
  75. 제64항 내지 제67항 및 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)가 총 약 16일 내에 수행되는 것인 방법.
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