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KR20190101364A - 예정 사멸-1(pd-1)에 대한 항체 - Google Patents

예정 사멸-1(pd-1)에 대한 항체 Download PDF

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KR20190101364A KR1020197015225A KR20197015225A KR20190101364A KR 20190101364 A KR20190101364 A KR 20190101364A KR 1020197015225 A KR1020197015225 A KR 1020197015225A KR 20197015225 A KR20197015225 A KR 20197015225A KR 20190101364 A KR20190101364 A KR 20190101364A
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데이비드 제이. 킹
마릴린 케리
바오츠안 황
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테사로, 인코포레이티드
아납티스바이오, 아이엔씨.
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Abstract

본 개시는 예정 사멸-1(PD-1) 단백질에 결합하는 항체 제제를 제공한다. 특정 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 및 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열이 명백하게 제공된다. 또한, 암 또는 감염성 질환과 같이 PD-1 억제에 반응하는 장애나 질환을 치료하기 위해 항PD-1 항체 약제를 사용하는, 관련된 핵산, 벡터, 조성물, 및 방법이 제공된다.

Description

예정 사멸-1(PD-1)에 대한 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/416,128호 및 2016년 11월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/427,777호의 이익을 주장하며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
암은 심각한 공중 보건 문제로, 미국 암 협회(American Cancer Society)의 암 현황 및 수치 자료 2016(Caner Facts & Figures 2016; http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/acspc-047079.pdf)에 따르면 2016년 단 한 해 동안 미국에서는 약 595,690명이 암으로 사망할 것으로 예상된다.
예정 사멸 1(PD-1)(예정 세포 사멸 1로도 알려짐)은 세포 사멸이 진행 중인 마우스 T 세포주의 감산 혼성화(subtractive hybridization)에 의해 원래 식별된 268개 아미노산으로 이루어진 I형 막관통 단백질이다(Ishida 외, Embo J., 11: 3887-95 (1992) 참조). PD-1은 T 세포 조절자의 CD28/CTLA-4 계열의 구성원이고, 활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수 계통 세포 상에서 발현된다(Greenwald 외, Annu. Rev. Immunol., 23: 515-548 (2005); 및 Sharpe 외, Nat. Immunol. 8: 239-245 (2007) 참조).
PD-1에 대한 2개의 리간드인 PD 리간드 1(PD-L1) 및 PD 리간드 2(PD-L2)가 식별되었는데, 이들 모두는 B7 단백질 수퍼패밀리에 속한다(Greenwald 외, 상기 문헌 참조). PD-Ll은 폐, 심장, 흉선, 비장 및 신장 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에서 발현된다(예: Freeman 외, J. Exp. Med., 192(7): 1027-1034 (2000); 및 Yamazaki 외, J. Immunol., 169(10): 5538-5545 (2002) 참조). PD-L1의 발현은 지질다당류(LPS)와 GM-CSF 치료에 반응하여 대식세포 및 수지상 세포(DC)에서 상향조절되고, T 세포 및 B 세포 수용체를 통한 신호전달 시 T 세포 및 B 세포 상에서 상향조절된다. PD-L1은 다양한 쥣과 종양 세포주에서도 발현된다(예: Iwai 외, Proc. Nat.l Acad. Sci. USA, 99(9): 12293-12297 (2002); 및 Blank 외, Cancer Res., 64(3): 1140-1145 (2004) 참조). 대조적으로, PD-L2는 보다 제한된 발현 패턴을 나타내고, 주로 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포 및 대식세포), 및 일부 종양 세포주에 의해 발현된다(예: Latchman 외, Nat. Immunol., 2(3): 261-238 (2001) 참조). 종양에서 PD-L1의 고발현은 종양 미세환경 내의 종양 세포, 지질, 또는 다른 세포에서의 고발현인지와 상관없이 좋지 못한 임상적 예후와 상관되는데, 이는 고발현이 종양에서 효과기 T 세포를 억제하고 조절 T 세포(Treg)를 상향조절하기 때문일 수 있다.
PD-1은 T 세포 활성화를 음성적으로 조절하며, 이러한 억제 기능은 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프(ITSM)에 연결된다(예: Greenwald 외, 상기 문헌; 및 Parry 외, Mol. Cell. Biol., 25: 9543-9553 (2005) 참조). PD-1 결핍은 자가면역으로 이어질 수 있다. 예를 들어, C57BL/6 PD-1 넉아웃 마우스는 루푸스 유사 증후군을 발병시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Nishimura 등, Immunity, 11: 141-1151 (1999) 참조). 인간에서, PD-1 유전자의 단일 뉴클레오티드 다형성은 전신 홍반성 루푸스, 1형 당뇨, 류마티스 관절염, 및 다발성 경화증의 진행이 더 높게 발생하는 것과 연관되어 있다(예를 들어, Nielsen 외, Tissue Antigens, 62(6): 492-497 (2003); Bertsias 외, Arthritis Rheum., 60(1): 207-218 (2009); Ni 외, Hum. Genet., 121(2): 223-232 (2007); Tahoori 외, Clin. Exp. Rheumatol., 29(5): 763-767 (2011); 및 Kroner 외, Ann. Neurol., 58(1): 50-57 (2005) 참조). 비정상적인 PD-1 발현은 여러 병리학에서의 T 세포 기능장애, 예컨대 종양 면역 회피 및 만성 바이러스 감염 등에도 연루되었다(예를 들어, Barber 외, Nature, 439: 682-687(2006); 및 Sharpe 외, 상기 문헌 참조).
최근의 연구는 PD-1에 의해 유도된 T 세포 억제가 항종양 면역의 억제에 역할을 한다는 것을 입증한다. 예를 들어, PD-L1은 다양한 인간 및 마우스 종양에서 발현되고, 종양 상에서 PD-1이 PD-L1에 결합하면 T 세포 억제 및 종양 면역 회피와 보호가 나타난다(Dong 외, Nat. Med., 8: 793-800 (2002) 참조). 종양 세포에 의한 PD-L1의 발현은, 시험관 내에서 항종양 T 세포에 의한 용해에 대한 이들의 내성과 직접 연관되었다(Dong 외, 상기 문헌; 및 Blank 외, Cancer Res., 64: 1140-1145 (2004) 참조). PD-1 넉아웃 마우스는 종양 접종에 내성이 있으며(Iwai 외, Int. Immunol., 17: 133-144 (2005)), PD-1 넉아웃 마우스 유래의 T 세포는, 종양을 가진 마우스에 양자 전이된(adoptively transferred) 경우 종양 거부에 매우 효과적이다(Blank 외, 상기 문헌 참조). 단클론 항체를 사용하여 PD-1 억제 신호를 차단하면 마우스에서 숙주 항종양 면역성을 강화시킬 수 있으며(Iwai 외, 상기 문헌; 및 Hirano 외, Caner Res., 65: 1089-1096 (2005) 참조), 종양에서 PD-L1의 고수준 발현은 많은 인간 암 유형에 있어서의 불량한 예후와 연관된다(Hamanishi 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 3360-335 (2007), Brown 외, J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003); 및 Flies 외, Yale Journal of Biology and Medicine, 84(4): 409-421 (2011) 참조).
전술한 내용을 고려하여, 다양한 유형의 암의 치료 및 면역강화를 위해 (예를 들어, 감염성 질환의 치료를 위해) PD-1의 활성을 억제하기 위한 전략이 개발되었다(예를 들어, Ascierto 외, Clin. Cancer. Res., 19(5): 1009-1020 (2013) 참조). 이와 관련하여, 암의 치료를 위해 PD-1을 표적으로 하는 단클론 항체가 개발되었다(예를 들어, Weber, Semin. Oncol., 37(5): 430-4309 (2010); 및 Tang 외, Current Oncology Reports, 15(2): 98-104 (2013) 참조). 예를 들어, (BMS-936558로도 알려진) 니볼루맙(nivolumab)은 1상 임상 시험에서 비소세포 폐암, 흑색종 및 신장 세포암에서 완전 반응 또는 부분 반응을 생성하였으며(예를 들어, Topalian, New England J. Med., 366: 2443-2454 (2012) 참조), 현재 3상 임상 시험 중에 있다. MK-3575는 I상 임상 시험에서 항종양 활성의 증거를 나타낸 PD-1에 대한 인간화 단클론 항체이다(예를 들어, Patnaik 외, 2012 American Society of Clinical Oncology (ASCO) Annual Meeting, Abstract # 2512 참조). 또한, 최근의 증거는 PD-1을 표적으로 하는 치료가 HIV와 같은 병원균에 대한 면역 반응을 강화할 수 있음을 시사한다(예를 들어, Porichis 외, Curr. HIV/AIDS Rep., 9(1): 81-90 (2012) 참조). 그러나 이러한 진전에도 불구하고, 이러한 잠재적 치료요법의 효능은 인간에서는 제한적일 수 있다.
높은 친화도로 PD-1에 결합하고 PD-1의 활성을 효과적으로 중화시키는 PD-1의 추가 길항제(예를 들어, 항체)가 필요하다.
본 개시는 항체 제제 및 이와 관련된 다양한 조성물과 방법을 제공하며, 이에는, 예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 세포, 및 다양한 방법론 등이 포함된다.
본 발명은 PD-1에 결합하는 신규한 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 높은 친화도로 PD-1에 결합하고 PD-1 활성을 효과적으로 중화시킨다. 일부 구현예에서, 항체 중쇄 폴리펩티드(서열번호 1) 서열 및 경쇄 폴리펩티드(서열번호 2) 서열이 명시적으로 제공된다.
본 개시는 서열번호 1에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시는 서열번호 1에 기재된 것과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 전체 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1에 제시된 서열에 대한 서열 차이는 CDR 내에는 없다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1의 3개의 CDR을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 5에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 IgG4 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 인간 IGHG4*01 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 IgG 중쇄 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 중쇄 불변 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 힌지(hinge) 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG4 힌지 영역에서의 돌연변이가 다른 IgG4 분자와의 반 분자 교환을 방지할 수 있는 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, IgG4의 힌지 영역에서의 하나 이상의 돌연변이는 다른 IgG4 분자와의 반 분자 교환을 방지하는, 세린에서 프롤린으로의 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IgG4의 힌지 영역에서의 하나 이상의 돌연변이는 S228P 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, J. Biol. Chem. 2015; 290(9):5462-5469 참조.
본 개시는 서열번호 2에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 제공한다. 본 개시는 서열번호 2에 기재된 것과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 전체 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 서열번호 2에 제시된 서열에 대한 서열 차이는 CDR 내에는 없다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 2의 3개의 CDR을 모두 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 카파(kappa) 경쇄이다. 일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 인간 IGKC*01 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 서열번호 6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 본 개시는 서열번호 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 및 서열번호 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 항PD-1 항체 제제를 제공한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 각각 서열번호 1에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서는, 항PD-1 항체 제제는 각각 서열번호 2에 명시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 정준 항체 포맷(canonical antibody format)을 갖는다.
일부 구현예에서, 제공된 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제는 하나 이상의 부위에서 글리코실화된다. 일부 구현예에서, 글리칸은 Fc 영역에 N-연결된다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 (Kabat 넘버링) Asn297에서 글리코실화된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제의 하나 이상의 당형태(glycoform)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 명시된 절대량 및/또는 상대량으로 존재하는 복수의 당형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제의 하나 이상의 구체적인 당형태가 실질적으로 없을 수 있는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 제공된 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제는 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이황화 결합은 IgG4 면역글로불린에 대한 예상 위치에서의 이황화 결합이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 또 다른 항체 제제, 예컨대 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3)나 T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 단백질(TIM-3)에 대해 특이적인 것과 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 항체 제제는 PD-1 및 또 다른 항원에 결합하여 "이중 반응성" 항체 제제(예를 들어, 이중특이적 항체)를 생성한다. 예를 들어, 항체 제제는 PD-1에 결합할 수 있고, 예를 들어 림프구 활성화 유전자 3(LAG-3) 또는 T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 단백질(TIM-3)과 같은 면역계의 또 다른 음성 조절자에 결합할 수 있다.
또한, 본 개시는 전술한 면역글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 단리되었거나 정제된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 전술한 면역글로불린 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항PD-1 항체 제제, 이러한 항PD-1 항체 제제를 암호화하는 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하는 단리된 세포, 이러한 벡터를 포함하는 단리된 세포, 이러한 항PD-1 항체 제제 또는 이러한 벡터를 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물, 및 포유 동물에게 이러한 조성물의 유효량을 투여함으로써 포유 동물에서 암이나 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
다음의 도면들로 이루어진, 본원에 포함된 도면은 단지 예시를 위한 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.
도 1 은 인간 및 시노몰구스 원숭이 PBMC에서 예시적인 항PD-1 항체 제제의 수용체 점유율을 도시하는 그래프를 보여준다.
특정 구현예의 상세한 설명
본 개시는 항체 제제 및 이와 관련된 다양한 조성물과 방법을 적어도 부분적으로 기술하며, 이에는, 예를 들어, 폴리펩티드, 핵산, 세포, 및 다양한 방법론 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체 결합 단백질은 높은 친화도로 PD-1에 결합하고 PD-1 활성을 효과적으로 중화시킨다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드(서열번호 1 및 5) 서열 및 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드(서열번호 2 및 6) 서열이 명시적으로 제공된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드는 단리된다. 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)" 또는 "항체(antibody)"는, 척추동물의 혈액이나 기타 체액에서 발견되며 박테리아 및 바이러스와 같은 이물질을 식별하여 중화시키기 위해 면역 시스템에 의해 사용되는 단백질을 지칭한다. 전체 면역글로불린은 일반적으로 4개의 폴리펩티드, 즉 2개의 동일한 카피의 중쇄(H) 폴리펩티드 및 2개의 동일한 카피의 경쇄(L) 폴리펩티드로 이루어진다. 중쇄 각각은 하나의 N-말단 가변(VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2 및 CH3) 영역을 포함하고, 각각의 경쇄는 하나의 N-말단 가변(VL) 영역과 하나의 C-말단 불변(CL) 영역을 포함한다. 면역글로불린 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2개의 구별되는 유형, 즉 카파(k)또는 람다(l) 중 하나에 할당될 수 있다. 일반적인 면역글로불린에서, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬되고, 경쇄 불변 영역은 중쇄의 제1 불변 영역과 정렬된다. 중쇄의 나머지 불변 영역들은 서로 정렬된다.
경쇄와 중쇄로 이루어진 각 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 및 VL 영역은 동일한 일반 구조를 가지며, 각 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크(FW 또는 FR) 영역을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "프레임워크 영역(framework region)"은 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR) 사이에 위치하는, 가변 영역 내의 상대적으로 보존된 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적인 면역글로불린의 경우, 각각의 가변 도메인에는 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 지정된 4개의 프레임워크 영역이 있다. 프레임워크 영역은 가변 영역의 구조적 프레임워크를 제공하는 β 시트를 형성한다(예를 들어, C.A. Janeway 외(편집자), Immunobiology, 5판, Garland Publishing, New York, NY (2001) 참조).
일반적인 면역글로불린의 경우, 각각의 가변 도메인에는 CDR1, CDR2, 및 CDR3로 지정된 3개의 상보적 결정 영역(CDR)이 있다. CDR은 "초가변 영역"을 형성하는데, 이는 항체 결합을 담당한다. CDR은 루프의 연결을 형성하는데, 이는 일부 경우에, 프레임워크 영역에 의해 형성된 β-시트 구조의 일부를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 불변 영역은 가변 영역의 배향에 영향을 미칠 수 있다. 불변 영역은 또한, 작동자 분자 및 세포와의 상호작용을 통해 항체 의존성 상보체 매개 용해 또는 항체 의존성 세포 독성에 참여하는 것과 같은 다양한 작동자 기능을 나타낸다.
본 개시는 PD-1에 결합하는 항체 제제를 적어도 부분적으로 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체 제제(antibody agent)"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 제제는 단클론 항체 또는 다클론 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 당업계에 공지된 바와 같이, 항체 제제는 인간화, 영장류화, 키메라화 등인 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 구현예에서, 용어 "항체 제제"는 항체의 구조적 및 기능적 특징을 활용하기 위해 개발되었거나 당업계에 알려진 작제물이나 포맷 중 하나 이상을 대안적인 제시에서 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, 구현예에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체 제제는, 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 Igm 항체; 이중 또는 다중 특이적 항체(예: Zybodies®등); Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이들의 집합과 같은 항체 단편; 단쇄 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체(예: IgNAR과 같은 상어 단일 도메인 또는 이의 단편); 낙타 항체(cameloid antibodies); 마스킹된 항체 (예: Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPsTM"); 단쇄 또는 탠덤 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPIN®; Avimers®; DART; TCR 유사 항체; Adnectin®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProteins; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 포맷이지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 자연적으로 생성되었다면 가질 수 있었던 공유 변형(예: 글리칸 부착)이 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸, 페이로드[예: 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 부속기[예: 폴리에틸렌 글리콜 등]의 부착)을 포함할 수 있다. 많은 구현예에서, 항체 제제는 당업자에 의해 상보성 결정 영역(CDR)으로서 인식되는 하나 이상의 구조 요소를 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 항체 제제는 기준 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 비교해 서열이 동일하거나 1~5개의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 비교해 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나 추가되거나 치환되지만, 포함된 CDR이 기준 CDR의 아미노산 서열과 다른 방식으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 비교해 포함된 CDR 내의 1~5개의 아미노산이 결실되거나 추가되거나 치환되지만, 포함된 CDR이 기준 CDR의 아미노산 서열과 다른 방식으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 비교해 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 치환되지만, 포함된 CDR이 기준 CDR의 아미노산 서열과 다른 방식으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 포함된 CDR은, 기준 CDR과 비교해 포함된 CDR 내의 1~5개의 아미노산이 결실되거나 추가되거나 치환되지만, 포함된 CDR이 기준 CDR의 아미노산 서열과 다른 방식으로 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 기준 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 당업자에 의해 면역글로불린 가변 도메인으로서 인식되는 구조 요소를 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 면역글로불린 결합 도메인에 상동이거나 대체적으로 상동인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함한다. 위에서 논의된 바와 같이, (예정 세포 사멸 1로도 알려진) 예정 사멸 1(PD-1)은 268개의 아미노산으로 이루어진 I형 막관통 단백질(Ishida 외, 상기 문헌 참조)이다. PD-1은 T 세포 조절자의 CD28/CTLA-4 계열의 구성원이고, 활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수 계통 세포 상에서 발현된다(Greenwald 외, 상기 문헌; 및 Sharpe 외, 상기 문헌 참조). PD-1은 짧은 세포외 줄기, 막관통 영역 및 세포내 꼬리(intracellular tail)가 이어지는 세포외 IgV 도메인을 포함한다. 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 및 면역수용체 티로신-기반 전환 모티프에 위치한 2개의 인산화 부위를 함유하는데, 이들은 PD-1의 능력 중 T 세포 수용체 신호전달을 부정적으로 조절하는 역할을 한다(예를 들어, Ishida 외, 상기 문헌; 및 Blank 외, 상기 문헌 참조).
PD-1에 결합하는 특정 다른 항체 및 그의 성분이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제8,168,757호; Topalian 외, 상기 문헌; 및 Patnaik 외, 상기 문헌 참조). 특정 항PD-1 항체는, 예를 들어, Abcam(Cambridge, MA)와 같은 공급원에서 상업적으로 입수할 수도 있다.
일부 구현예에서, 제공된 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제는 하나 이상의 부위에서 글리코실화된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "글리칸(glycan)"은 당단백질의 당 중합체(모이어티) 성분이다. 용어 "글리칸"은 유리 글리칸을 포함하며, 이에는 당단백질로부터 절단되거나 달리 방출된 글리칸이 포함된다. 일부 구현예에서, 글리칸은 Fc 영역에 N-연결된다. 일부 구현예에서, 항체 제제는 (Kabat 넘버링) Asn297에서 글리코실화된다.
일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제의 하나 이상의 당형태(glycoform)를 포함하는 조성물을 제공한다. 용어 "당형태"는 당단백질의 특정 형태를 지칭하도록 본원에서 사용된다. 즉, 당단백질이 상이한 글리칸 또는 글리칸의 세트에 연결될 가능성이 있는 특정 폴리펩티드를 포함하는 경우, (폴리펩티드가 특정 글리칸 또는 글리칸 세트에 연결되는) 각각의 상이한 형태의 당단백질을 "당형태"로서 지칭한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제 중 하나 이상으로 이루어진 복수의 당형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 명시된 절대량 및/또는 상대량으로 존재하는 복수의 이러한 당형태를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제로 이루어진 하나 이상의 특정 당형태가 실질적으로 없을 수 있는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 당형태의 양은 "백분율"로서 표현된다. 임의의 주어진 파라미터에 대해, "백분율"은 조제물 중 글리칸의 총 몰에 대한 특정 글리칸(글리칸 X)의 몰 수를 지칭한다. 일부 구현예에서, "백분율"은 검출된 PNGase F-방출된 Fc 글리칸의 총 몰에 대한 PNGase F-방출된 Fc 글리칸 X의 몰 수를 지칭한다.
일부 구현예에서, 제공된 중쇄, 경쇄 및/또는 항체 제제는 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 이황화 결합은 IgG4 면역글로불린에 대한 예상 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 이황화 결합은 서열번호 1의 잔기 22, 96, 130, 143, 199, 222, 225, 257, 317, 363 및 421로부터 선택된 위치에 상응하는 하나 이상의 잔기에 존재한다. 　 일부 구현예에서, 이황화 결합은 서열번호 2의 잔기 23, 88, 134, 194 및 214로부터 선택된 위치에 상응하는 하나 이상의 잔기에 존재한다. 　
일부 구현예에서, 단리된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 5와 적어도 90% 동일한 (예: 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 　
일부 구현예에서, 단리된 면역글로불린 경쇄 폴리펩타이드는 서열번호 2 또는 6과 적어도 90% 동일한 (예, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열을 포함한다. 　
본원에 기술된 바와 같이, 핵산 또는 아미노산의 서열 "동일성"은 관심 핵산 또는 아미노산 서열을 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다. 백분율 동일성은 관심 서열과 기준 서열 간의 같은 (즉, 동일한) 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 수를 최장 서열의 길이(즉, 관심 서열 또는 기준 서열의 길이 중 더 긴 것)로 나눈 것이다. 2개 이상의 서열 간의 최적의 정렬을 얻고, 이들 간의 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 공지되어 있고, 다수의 이용 가능한 소프트웨어 프로그램에 통합되어 있다. 이러한 프로그램의 예는 CLUSTAL-W, T-Coffee, 및 ALIGN(핵산 및 아미노산 서열 정렬용), BLAST 프로그램(예를 들어, BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 이들의 최근 버전) 및 FASTA 프로그램(예를 들어, FASTA3x, FASTM, 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사성 검색용)을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은, 예를 들어 Altschul 외, J. Molecular Biol, 215(3): 403-410 (1990), Beigert 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin 외(편집), Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(1): 951-960 (2005), Altschul 외, Nucleic Acids Res., 25(11): 3389-3402 (1997), 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)에도 기술되어 있다.
전술한 면역 글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산으로 대체되거나 치환될 수 있다. 아미노산의 "대체(replacement)" 또는 "치환(substitution)"은 폴리펩티드 서열 내의 주어진 위치 또는 잔기에서의 하나의 아미노산을 동일한 위치 또는 잔기에서의 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다.
아미노산은 "방향족(aromatic)" 또는 "지방족(aliphatic)"으로 광범위하게 그룹화된다. 방향족 아미노산은 방향족 고리(aromatic ring)를 포함한다. "방향족" 아미노산의 예는 히스티딘(H 또는 His), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 및 트립토판(W 또는 Trp)을 포함한다. 비-방향족 아미노산은 "지방족"으로 광범위하게 그룹화된다. "지방족" 아미노산의 예는 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 이소류신(I 또는 He), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser), 트레오닌(T 또는 Thr), 시스테인(C 또는 Cys), 프롤린(P 또는 Pro), 글루타민산(E 또는 Glu), 아스파르트산(A 또는 Asp), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gin), 리신(K 또는 Lys), 및 아르기닌(R 또는 Arg)을 포함한다.
지방족 아미노산은 4개의 하위 기(sub-group)로 세분화될 수 있다. "대형 지방족 비극성 하위 기(large aliphatic non-polar sub-group)"는 발린, 류신 및 이소류신으로 이루어진다. "지방족 약극성 하위 기(aliphatic slightly-polar sub-group)"는 메티오닌, 세린, 트레오닌 및 시스테인으로 이루어진다. "지방족 극성/하전된 하위 기(aliphatic polar/charged sub-group)"는 글루타민산, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루타민, 리신 및 아르기닌으로 이루어진다. "소 잔기 하위 기(small-residue sub-group)"는 글리신 및 알라닌으로 이루어진다. 일단의 하전된/극성 아미노산은 3개의 하위 기, 즉 리신과 아르기닌으로 이루어진 "양전하로 하전된 하위 기"; 글루타민산과 아스파르트산으로 이루어진 "음으로 하전된 하위 기"; 및 아스파라긴과 글루타민으로 이루어진 "극성 하위 기"로 세분화될 수 있다.
방향족 아미노산은 2개의 하위 기, 즉 히스티딘과 트립토판으로 이루어진 "질소 고리 하위 기"; 및 페닐알라닌과 티로신으로 이루어진 "페닐 하위 기"로 세분화될 수 있다.
아미노산의 대체 또는 치환은 보존적, 반보존적 또는 비보존적일 수 있다. 문구 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 하나의 아미노산이 공통 속성을 갖는 또 다른 아미노산에 의해 대체되는 것을 지칭한다. 개별 아미노산들 간의 공통 속성을 정의하는 기능적 방법은 상동성 유기체의 상응하는 단백질 사이에서 아미노산 변화에 대한 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz와 Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer- Verlag, New York (1979) 참조). 이러한 분석에 따르면, 기(group) 내의 아미노산이 서로 우선적으로 교환됨으로써 전체 단백질 구조에 미치는 이들의 영향에 있어서 서로 가장 유사한 아미노산기가 정의될 수 있다(Schulz와 Schirmer, 상기 문헌 참조).
보존적 아미노산 치환의 예는, 전술한 하위 기 내에서의 아미노산의 치환, 예를 들어, 양전하가 유지될 수 있도록 리신이 아르기닌으로 또는 그 반대로 치환되는 것, 음전하가 유지될 수 있도록 글루타민산이 아스파르트산으로 또는 그 반대로 치환되는 것, 유리 -OH가 유지될 수 있도록 세린이 트레오닌으로 또는 그 반대로 치환되는 것, 및 유리 -NH2가 유지될 수 있도록 글루타민이 아스파라긴으로 또는 그 반대로 치환되는 것을 포함한다.
"반 보존적 돌연변이"는 위에 나열된 동일한 기 내에 있지만 동일한 하위 기 내에 있지 않는 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 아스파라긴산을 아스파라긴으로, 또는 아스파라긴을 리신으로 치환하는 것은 동일한 기 내에 있지만 상이한 하위 기 내에 있는 아미노산을 포함한다. "비 보존적 돌연변이"는 상이한 기 사이의 아미노산 치환, 예를 들어, 리신과 트립토판의 치환, 또는 페닐알라닌과 세린의 치환 등을 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 본 발명의 단리된 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지는 단리된 항PD-l 항체 제제를 적어도 부분적으로 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된(isolated)"(또는 "정제된(purified)")은 그의 자연 환경에서 존재하는 다른 성분으로부터 제거되거나 분리되는 핵산 서열(예: 폴리뉴클레오티드) 또는 아미노산 서열(예: 폴리펩티드)을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그것이 생성된 세포의 다른 성분(예: 소포체(endoplasmic reticulum)나 세포질 단백질(cytoplasmic proteins) 및 RNA)으로부터 분리된 것이다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 다른 핵 성분(예: 히스톤(histones)) 및/또는 상류 또는 하류 핵산 서열로부터 분리된 것이다. 단리된 핵산 서열 또는 아미노산 서열은, 표시된 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 자연 환경에서 존재하는 다른 성분의 적어도 60%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%가 없을 수 있다.
"예정 사멸 1(PD-l) 결합제"란 예정 사멸 1 단백질(PD-1)에 특이적으로 결합하는 분자, 바람직하게는 단백질성 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합제는 항PD-1 항체 제제이다. 일부 구현예에서, 단리된 항PD-1 항체 제제는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 1) 및/또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 2)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단리된 항PD-1 항체 제제는 서열번호 1을 포함하는 서열을 가진 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 서열번호 2를 포함하는 서열을 가진 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어지며, 예를 들어, PD-1에 대한 본 발명의 중쇄 폴리펩티드의 친화도에 영향을 미침으로써 폴리펩티드에 중대하게 영향을 미치지 않는 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 성분의 예는, 예를 들어, 정제 또는 단리를 용이하게 하는 비오틴과 같은 단백질 모이어티, 패신저 돌연변이, 유리 시스테인을 포함하여 문제 부위가 없는 서열, 추가 글리코실화 부위, 및 고우도(high-likelihood)의 탈아미드화 부위 이성질화 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 5의 아미노산으로 이루어지며, 임의의 추가 성분(본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드에 대해 내인성이 아닌 성분)을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는, 아미노산의 대체, 삽입 및/또는 결실로 인해 생물학적 활성이 중대하게 감소되지 않는(예를 들어, 향상되거나 개선되는) 한, 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 및/또는 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산이 임의의 조합으로 상이한 아미노산 잔기와 대체되거나, 결실 또는 삽입될 수 있는 변이체를 포함한다. 항PD-1 항체 제제의 "생물학적 활성(biological activity)"은, 예를 들어 PD-1 또는 특정 PD-1 에피토프에 대한 결합 친화도, PD-1의 리간드 PD-L1 및 PD-L2에 결합하는 PD-1 단백질의 중화 또는 억제, PD-1 단백질의 생체 내 활성의 중화 또는 억제(예: IC50), 약동학, 및 교차 반응성(예를 들어, PD-1 단백질의 비인간 동족체 또는 이종상동체(orthologs)와의 교차 반응성, 또는 다른 단백질이나 조직과의 교차 반응성)을 지칭한다. 당업계에서 인식되는 항원 결합제의 다른 생물학적 속성 또는 특성은, 예를 들어, 친화성(avidity), 선택도(selectivity), 용해도(solubility), 접힘(folding), 면역 독성(immunotoxicity), 발현(expression), 및 제형성(formulation)을 포함한다. 전술한 속성 또는 특성은 ELISA, 경쟁 ELISA, 표면 플라스몬 공명 분석(BIACORE™), 또는 동역학 배제 검정(Kinetic Exclusion Assay, KINEXA™), 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 중화 검정, 수용체-리간드 결합 검정, 사이토카인 또는 성장 인자 생산 및/또는 분비 검정, 신호 전달 및 면역조직화학 검정을 포함하되, 이들로 한정되는 않는 표준 기술을 사용해 관찰, 측정, 및/또는 평가할 수 있다.
항PD-1 항체 제제의 활성과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제(inhibit)" 또는 "중화(neutralize)"는, 예를 들어 PD-1 단백질의 생물학적 활성, 또는 PD-1 단백질과 연관된 질환 또는 병태의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항, 방지, 예방, 억제, 지체, 파괴, 변경, 제거, 중단, 또는 역전시키는 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 단리된 PD-1 결합제는 PD-1 단백질의 활성을 적어도 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 약 100%, 또는 전술한 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위(예: 20% 내지 100%, 40% 내지 100% 또는 60% 내지 95% 등)만큼 억제하거나 중화시킨다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 전체 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항체 단편)이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 야생형 IgGl, IgG2, 또는 IgG4 항체, 또는 이의 변이체에 기초하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 항체 클래스 또는 아이소타입은 한 번 인식된 항원을 처분하거나 중화시키기 위한 작동자 메커니즘의 별개 세트와 결합한다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제가 항체인 경우, 작동자 분자 및 세포와의 상호작용을 통해 항체 의존성 보체 매개 용해 또는 항체 의존성 세포 독성에 대한 참여와 것과 같은 하나 이상의 작동자 기능(예: 보체 시스템의 활성화)을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 IgG 중쇄 영역 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 중쇄 불변 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 힌지 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, IgG4 힌지 영역에서의 돌연변이가 다른 IgG4 분자와의 반 분자 교환을 방지할 수 있는 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, IgG4의 힌지 영역에서의 하나 이상의 돌연변이는 다른 IgG4 분자와의 반 분자 교환을 방지하는, S228P 돌연변이 또는 세린에서 프롤린으로의 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, J. Biol. Chem. 2015; 290(9):5462-5469 참조.
항PD-1 항체 제제는 항체 접합체일 수도 있다. 이와 관련하여, 항PD-1 항체 제제는 (1) 항PD-1 항체 및 (2) 단백질 또는 비-단백질 모이어티의 접합체일 수 있다. 예를 들어, 항PD-1 항체 제제는 펩티드, 형광 분자 또는 화학치료제에 접합된 항PD-1 항체일 수 있다.
항PD-1 항체 제제는 인간 항체, 비인간 항체, 또는 키메라 항체이거나 이로부터 수득될 수 있다. "키메라(chimeric)"란 인간 및 비인간 영역 모두를 포함하는 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 인간화 항체이다. "인간화(humanized)" 항체는, 인간 항체 골격(scaffold) 및 비인간 항체로부터 수득되거나 유래된 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단클론 항체이다. 비인간 항체는, 예를 들어, 설치류(예: 마우스 또는 랫트)와 같은 임의의 비인간 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 인간화 항체는 비인간 항체로부터 수득되거나 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제의 CDRH3은 마우스 단클론 항체로부터 얻어지거나 유도되는 반면, 항체 제제의 나머지 가변 영역과 불변 영역은 인간 단클론 항체로부터 수득되거나 유도된다.
인간 항체, 비인간 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체는 시험관 내 공급원(예: 재조합에 의해 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 세포주) 및 생체 내 공급원(예: 설치류)를 통하는 것을 포함하는 임의의 수단에 의해 수득될 수 있다. 항체를 생성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, Kohler 및 Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow 및 Lane (편집), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); 및 Janeway 외 (편집), Immunobiology, 5판, Garland Publishing, New York, NY (2001)에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 인간 항체 또는 키메라 항체는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 하나 이상의 인간 면역글로불린 유전자로 대체되는 유전자이식 동물(예: 마우스)을 사용하여 생성될 수 있다. 내인성 항체 유전자가 효과적으로 인간 항체 유전자와 치환되는 유전자이식 마우스의 예는, Medarex HUMAB-MOUSE™, Kirin TC MOUSE™, 및 Kyowa Kirin KM-MOUSE™를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다(예를 들어, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), 및 Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008) 참조). 인간화 항체는, 예를 들어, 비인간 CDR을 인간 항체 골격에 이식하는 것(예: Kashmiri 외, Methods, 36(1): 25-34 (2005); 및 Hou 외, J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008) 참조)을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예: An, Z. (편집), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey (2009) 참조). 일부 구현예에서, 인간화 항체는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2011/0287485 A1호에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 PD-1이 이의 추정 리간드 중 임의의 하나 이상에 결합하는 것을 차단하는 PD-1의 에피토프와 결합한다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 PD-1이 이의 추정 리간드 중 둘 이상에 결합하는 것을 차단하는 PD-1의 에피토프와 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 PD-1이 PD-Ll 및/또는 PD-L2에 결합하는 것을 차단하는 PD-1 단백질의 에피토프와 결합한다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 본 발명의 항PD-1 항체 제제를 암호화하는 하나 이상의 단리된 또는 정제된 핵산 서열을 제공한다.
용어 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은, 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있고 비 자연적 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체, 즉 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 의도된다. 본원에 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 중 하나인 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 이들 용어는 분자의 일차 구조를 지칭하며, 따라서 이중 및 단일 가닥 DNA, 및 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이들 용어는, 등가물로서, 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드와 같은(이에 한정되지 않음) 변형된 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함한다. (포스포로티오에이트(phosphorothioates), 보라노포스페이트(phosphorothioates) 등과 같은) 많은 다른 연결 방법이 당업계에 공지되어 있지만, 핵산은 일반적으로 인산 결합(phosphate bond)을 통해 연결되어 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드를 형성한다. 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어, 서열번호 3을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 서열번호 4를 포함한다.
본 개시는 PD-1 결합 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, PD-1 결합 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 항PD-1 항체 제제를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 에피솜, 코스미드, 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스), 또는 파지일 수 있다. 적절한 벡터 및 벡터의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrook 외, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), 및 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994) 참조).
본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 및/또는 본 발명의 항PD-1 항체 제제를 암호화하는 핵산 서열에 추가하여, 벡터는 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결자, 신호 펩티드(예: 오스테오넥틴(osteonectin) 신호 펩티드), 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 등을 포함할 수 있다. 예시적인 발현 조절 서열은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, 캘리포니아 샌디에고 (1990)에 기술되어 있다.
구성적, 유도성, 및 억제성 프로모터를 포함하여, 다양한 상이한 공급원 유래의 많은 수의 프로모터가 당업계에 공지되어 있다. 프로모터의 대표적인 공급원은, 예를 들어, 바이러스, 포유동물, 곤충, 식물, 효모, 및 박테리아를 포함하며, 적절한 프로모터는 이들 공급원으로부터 쉽게 이용할 수 있거나, 예를 들어 ATCC와 같은 보관소(depositories)뿐만 아니라 다른 상업적 또는 개별 공급원으로부터 공개적으로 이용할 수 있는 서열에 기초하여 합성을 통해 만들 수 있다. 프로모터는 (일 방향으로 전사를 개시하는) 단방향성이거나 (3' 또는 5' 방향으로 전사를 개시하는) 양방향성일 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예는, 예를 들어, T7 박테리아 발현 시스템, pBAD(araA) 박테리아 발현 시스템, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는, 예를 들어, Tet 시스템(미국 특허 제5,464,758호 및 제5,814,618호 참조), Ecdysone 유도성 시스템(No 외, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351(1996) 참조), T-REX™ 시스템(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드), LACSWITCH™ 시스템(Stratagene, 캘리포니아주 샌디에고), 및 Cre-ERT 타목시펜 유도성 재조합효소 시스템(Indra 외, Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); 미국 특허 제7,112,715호; 및 Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol, 308: 123-144 (2005) 참조)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "인핸서(enhancer)"는, 예를 들어, 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다.
인핸서는 핵산 서열의 코딩 영역으로부터 수 킬로베이스 떨어진 곳에 위치할 수 있고 조절 인자, DNA 메틸화 패턴, 또는 DNA 구조체의 변화를 매개할 수 있다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 많은 인핸서가 당업계에 잘 알려져 있고 (예를 들어, ATCC와 같은 보관소뿐만 아니라 다른 상업적 및 개별적 공급원 유래의) 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 이용 가능하거나, 그 안에 존재한다. 프로모터(예: 공통으로 사용되는 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드는 인핸서 서열을 또한 포함한다. 인핸서는 코딩 서열의 상류, 내부 또는 하류에 위치할 수 있다.
벡터는 "선별 마커 유전자(selectable marker gene)"도 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "선별 마커 유전자"는 핵산 서열을 발현하는 세포가 상응하는 선택제(selective agent)의 존재 하에 특이적으로 선택되거나 제외되도록 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적절한 선별 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 1992/008796 및 WO 1994/028143; Wigler 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin 외, J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre 외, Gene, 30: 147-156 (1984); Kent 외, Science, 237: 901-903 (1987); Wigler 외, Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy 외, Cell, 22: 817-823 (1980); 및 미국 특허 제5,122,464호 및 제5,770,359호에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있는 "에피솜 발현 벡터" 또는 "에피솜"이며, 적절한 선별 압력이 있을 때 숙주 세포 내에서 DNA의 염색체외 분절로서 지속된다(예를 들어, Conese 외, Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004) 참조). 대표적인 상업적으로 이용 가능한 에피솜 발현 벡터는 엡스타인 바 핵 항원 1(Epstein Barr Nuclear Antigen 1, EBNA1) 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV) 복제 개시점(origin of replication, oriP)을 이용하는 에피솜 플라스미드를 포함하되, 이에 한정되지 않는다. Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)의 벡터 pREP4, pCEP4, pREP7, 및 pcDNA3.1과 Stratagene(캘리포니아주 칼즈배드)의 벡터 pBK-CMV는, EBNA1 및 oriP 대신에 T 항원 및 SV40 복제 개시점을 사용하는 에피솜 벡터의 비제한적인 예를 대표한다.
다른 적절한 벡터는 숙주 세포의 DNA에 무작위로 통합될 수 있는 통합 발현 벡터를 포함하거나, 발현 벡터와 숙주 세포 염색체 간의 특이적 재조합을 가능하게 하는 재조합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 통합 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 달성하기 위해 숙주 세포 염색체의 내인성 발현 조절 서열을 이용할 수 있다. 부위 특이적 방식으로 통합되는 벡터의 예는, 예를 들어, Life Technologies(캘리포니아주 칼스배드)의 flp-in 시스템의 성분(예: pcDNA™5/FRT), 또는 예를 들어 Stratagene(캘리포니아주 라호이아)의 pExchange-6 Core Vectors에서 발견될 수 있는 cre-lox 시스템의 성분을 포함한다. 숙주 세포 염색체에 무작위로 통합되는 벡터의 예는, 예를 들어, Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)의 pcDNA3.1(T 항원 없이 도입된 경우), Millipore(메사추세츠주 빌레리카)의 UCOE, 및 Promega(위스콘신주 매디슨)의 pCI 또는 pFN10A (ACT) FLEXI™를 포함한다.
바이러스 벡터도 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 바이러스 발현 벡터는 Crucell, Inc.(네덜란드 레이덴)로부터 입수 가능한 아데노바이러스-기반 Per.C6 시스템, Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)의 렌티바이러스-기반 pLP1, 및 Stratagene(캘리포니아주 라호이아)의 레트로바이러스 벡터 pFB-ERV 및 pCFB-EGSH를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 동일한 벡터 상의 세포에 (즉, 시스로(in cis)) 제공될 수 있다. 단방향 프로모터는 각각의 핵산 서열의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양방향 및 단방향 프로모터의 조합이 사용되어 다수의 핵산 서열의 발현을 조절할 수 있다. 본 발명의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 별개 벡터 상의 세포 집단에 (즉, 트랜스로(in trans)) 제공될 수 있다. 각각의 개별 벡터 내의 핵산 서열 각각은 동일하거나 상이한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 개별 벡터는 동시에 또는 순차적으로 세포에 제공될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산(들)을 포함하는 벡터(들)는, 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는, 임의의 적절한 원핵 또는 진핵 세포를 포함하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이와 같이, 본 개시는 본 발명의 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 숙주 세포는 쉽고 신뢰성 있게 배양될 수 있고, 성장 속도가 상당히 빠르고, 잘 특성화된 발현 시스템을 가지며, 쉽고 효율적으로 형질변환되거나 형질감염될 수 있는 것들이다.
적절한 원핵 세포의 예는, (고초균 및 브레비스균과 같은) 바실루스속(Bacillus), (대장균과 같은) 대장균속(Escherichia), 슈도모나스속(Pseudomonas), 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 살모넬라속(Salmonella), 및 에르비니아속(Erwinia) 유래의 세포를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 유용한 원핵 세포는, 예를 들어, 대장균(Escherichia coli)의 다양한 균주(예를 들어, K12, HB101 (ATCC 번호 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC 번호 53338), 및 CC102)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터는 진핵 세포 내로 도입된다. 적절한 진핵 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함한다. 적절한 효모 세포의 예는 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces), 피치아속(Pichia), 리노-스포리듐속(Rhino-sporidium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 및 스키조사카로마이세스속(Schizosaccharomyces) 유래의 것들을 포함한다. 효모 세포는 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerivisae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.
적절한 곤충 세포는, 예를 들어 Kitts 외, Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); 및 Lucklow 외, J. Virol., 67: 4566-4579 (1993)에 기술되어 있다. 곤충 세포는, 예를 들어, Sf-9 및 HI5(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드)를 포함한다.
일부 구현예에서는 포유동물 세포가 사용된다. 다수의 적절한 포유동물 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있으며, 많은 수의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC, 버지니아주 매너서스)로부터 입수할 수 있다. 적절한 포유류 세포의 예는, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)(ATCC 번호 CCL61), CHO DHFR-세포(Urlaub 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220(1980) 참조), 인간 배아 신장(HEK) 293 또는 293T 세포(ATCC 번호 CRL1573), 및 3T3 세포(ATCC 번호 CCL92)를 포함하되, 이들로 한정되지 않는다. 다른 적절한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1(ATCC 번호 CRL1650) 및 COS-7 세포주(ATCC 번호 CRL1651)뿐만 아니라, CV-1 세포주(ATCC 번호 CCL70)이다.
추가의 예시적인 포유류 숙주 세포는, 형질전환된 세포주를 포함하는, 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 정상 이배체 세포, 1차 조직의 시험관 배양물로부터 유래된 세포 계통뿐만 아니라 일차 외식편(primary explants)도 적합하다. 다른 적절한 포유동물 세포주는, 마우스 신경아종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, 및 BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하되, 이들로 한정되지 않으며, 이들 모두는 ATCC로부터 입수할 수 있다. 적절한 포유동물 숙주 세포의 선별 방법 및 세포의 형질변환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 정제 방법이 당업계에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다. 예를 들어, 포유동물 세포는 B 림프구 기원 전(pre-B lymphocyte origin) 세포주와 같은, 인간 림프계 또는 림프계 유래 세포주일 수 있다. 인간 림프계 세포주의 예는 RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1581-1585 (1988) 참조), Raji 세포 (CCL-86), PER.C6 세포 (Crucell Holland B.V., 네덜란드 레이덴), 및 이들의 유도체를 포함하되 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열은 "형질감염(transfection)", "형질변환(transformation)" 또는 "형질도입(transduction)"에 의해 세포 내에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "형질감염", "형질변환", 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 사용하여 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 많은 형질감염 기술이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 인산칼슘 DNA 공침(예: Murray E.J.(편집), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991) 참조); DEAE-덱스트란(dextran); 전기천공(electroporation); 양이온 리포솜-매개 형질감염(cationic liposome-mediated transfection); 텅스텐 입자에 의해 촉진된 미세입자 충격(tungsten particle-facilitated microparticle bombardment)(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990) 참조); 및 인산스트론튬 DNA 공침(Brash 외, Mol. Cell Biol, 7: 2031-2034 (1987) 참조)을 포함한다. 파지 또는 바이러스 벡터는, 감염성 입자가 적절한 패키징 세포(packaging cells)에서 성장한 후에 숙주 세포 내로 도입될 수 있으며, 이들 중 많은 수는 상업적으로 이용 가능하다.
본 개시는 본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 항PD-1 항체 제제, 전술한 것 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열, 또는 핵산 서열의 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 (예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 조성물이며, 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 (예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 담체, 및 본 발명의 아미노산 서열, 항원 결합제, 또는 벡터를 포함한다. 임의의 적절한 담체가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당 업계에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 부분적으로는, 조성물이 투여될 수 있는 특정 부위 및 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 조성물은 선택적으로 살균될 수 있다. 조성물은 보관을 위해 동결 또는 동결건조될 수 있고 사용 전에 적절한 무균 담체에서 재구성될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21판, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)에 기술된 종래 기술에 따라 생성될 수 있다.
본 개시는, PD-1 단백질의 발현, 부적절한 발현(예: 과발현) 또는 활성 증가가 질환의 병리학적 결과를 야기하거나 이에 기여하거나, PD-1 단백질 수준 또는 활성의 감소가 인간과 같은 포유동물에서 치료적 이점을 가지는 임의의 질환이나 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 포유동물에서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 포유동물은, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다. 상기 방법은 암 또는 감염성 질환에 걸린 포유동물에게 전술한 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이에 의해 암 또는 감염성 질환이 포유동물에서 치료된다. 본원에서 논의된 바와 같이, PD-1은 다양한 암에서 비정상적으로 발현되며(예를 들어, Brown 외, J. Immunol., 170: 1257-1266 (2003) 참조); 및 Flies 외, Yale Journal of Biology and Medicine, 84: 409-421 (2011) 참조), 일부 신장 세포 암종 환자에서 PD-L1의 발현은 종양 공격성과 상관이 있다.
본 개시는 PD-1 억제에 반응하는 장애를 갖는 포유동물에서 면역 반응을 강화하거나 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 본원에 기술된 임의의 PD-1 결합제 또는 항체 제제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, PD-1 결합제의 투여는 포유동물 또는 그의 조직에서 면역 반응 또는 면역 세포 활성을 향상시키거나 증가시킨다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 체액 또는 세포 매개 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 CD4 또는 CD8 T 세포 반응이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 B 세포 반응이다.
본원에 기술된 본 발명의 방법 및 조성물은, 예를 들어, 흑색종, 신장 세포 암종, 폐암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 담낭암, 후두암, 간암, 갑상선암, 위암, 침샘암, 고환암, 췌장암, 선암종(예: 폐의 선암종), 또는 머켈 세포 암종(예를 들어, Bhatia 외, Curr. Oncol. Rep, 13(6): 488-497 (2011) 참조)과 같은 당업계에 알려진 임의 유형의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 자궁내막암(endometrial cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난관암(fallopian tube cancer), 고환암(testicular cancer), 원발성 복막암(primary peritoneal cancer), 대장암(colon cancer), 결장암(colorectal cancer), 위암(stomach cancer), 소장 암(small intestine cancer), 항문생식기 영역의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the anogenital region), 흑색종(melanoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 폐암(lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평상피암(squamous cell carcinoma of the lung), 위암(stomach cancer), 방광암(bladder cancer), 쓸개암(gall bladder cancer), 간암(liver cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 후두암(laryngeal cancer), 타액샘암(salivary gland cancer), 식도암(esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 두경부 편평상피암(squamous cell carcinoma of the head and neck), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 중피종(mesothelioma), 머켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 육종(sarcoma), 교아 세포종(glioblastoma), 또는 혈액암(hematological cancer)(예: 다발성 골수종(multiple myeloma), B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종/원발성 종격 B-세포 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 본 발명의 방법 및/또는 조성물로 치료할 암은 현미부수체 불안정성 또는 결핍을 특징으로 한다. 현미부수체 불안정성("MSI")은, 현미부수체의 반복(DNA의 짧은 반복 서열)의 수가 현미부수체가 유전된 DNA에 함유된 반복의 수와 상이한 특정 세포(예를 들어, 종양 세포)의 DNA에서의 변화이거나 이를 포함한다. 미소부수체 불안정성은 DNA 부정합 복구(MMR) 시스템 결함으로 인해 복제 관련 오류를 복구하지 못함으로 인해 발생한다. 이러한 실패는 게놈 전체에 걸쳐 부정합 돌연변이를 지속시키지만, 특히 현미부수체로서 알려진 반복적인 DNA의 영역에서 지속시켜, 돌연변이 하중(mutation load)을 증가시킨다. MSI-H를 특징으로 하는 적어도 일부 종양에서 특정 항PD-1 제제에 대한 반응이 개선되었음이 입증되었다(Le 외, (2015) N. Engl. J. Med. 372(26):2509-2520; Westdorp 외, (2016) Cancer Immunol. Immunother. 65(10):1249-1259 참조).
일부 구현예에서, 암은 현미부수체 불안정성이 높은 현미부수체 불안정성 상태(예를 들어, MSI-H 상태)를 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 현미부수체 불안정성이 낮은 현미부수체 불안정성 상태(예를 들어, MSI-L 상태)를 갖는다. 일부 구현예에서, 암은 현미부수체가 안정한 현미부수체 불안정성 상태(예를 들어, MSS 상태)를 갖는다. 일부 구현예에서, 현미부수체 불안정성 상태는 차세대 시퀀싱(NGS) 기반 검정, 면역조직화학(IHC) 기반 검정, 및/또는 PCR 기반 검정에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 현미부수체 불안정성은 NGS에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 현미부수체 불안정성은 IHC에 의해 검출된다. 일부 구현예에서, 현미부수체 불안정성은 PCR에 의해 검출된다.
구현예에서, 암은 높은 종양 변이 부담(TMB)과 연관된다. 　 일부 구현예에서, 암은 높은 TMB 및 MSI-H와 연관된다. 　 일부 구현예에서, 암은 높은 TMB 및 MSI-L 또는 MSS와 연관된다. 　 일부 구현예에서, 암은 높은 TMB와 연관된 자궁내막암이다. 　 일부 관련 구현예에서, 자궁내막암은 높은 TMB 및 MSI-H와 연관된다. 　 일부 관련 구현예에서, 자궁내막암은 높은 TMB 및 MSI-L 또는 MSS와 연관된다.
일부 구현예에서, 암은 부정합 복구 결핍성 암이다. 현미부수체 불안정성은 DNA 부정합 복구(MMR) 시스템 결함으로 인해 복제 관련 오류를 복구하지 못함으로 인해 발생할 수 있다. 이러한 실패는 게놈 전체에 걸쳐 부정합 돌연변이를 지속시키지만, 특히 현미부수체로서 알려진 반복적인 DNA의 영역에서 지속시켜, 돌연변이 하중(mutation load)을 증가시키며, 이는 특정 항PD-1 제제에 대한 반응을 개선할 수 있다. (상기 문헌 참조). 일부 구현예에서, 암은 과돌연변이된 암이다. 일부 구현예에서, 암은 중합효소 엡실론(POLE)에서 돌연변이를 보유한다.
본 발명의 방법은 임의 유형의 감염성 질환(즉, 박테리아, 바이러스, 진균류 또는 기생충으로 인한 질환 또는 장애)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 감염성 질환의 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인플루엔자 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스(HBV, 또는 C형 간염 바이러스(HCV))에 의해 유발되는 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법은, 예를 들어, MacKay I.R. 및 Rose N.R., (편집), The Autoimmune Diseases, 5판, Academic Press, Waltham, MA (2014)에 기술된 것들과 같은 임의 유형의 자가면역 질환(신체가 자기 조직을 공격하고 손상시키는, 면역 체계 과활동(immune system over-activity)에 의해 발생하는 질환 또는 장애)를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 자가면역 질환의 예로는 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 경피증, 크론병, 건선, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 및 궤양성 대장염을 포함하되 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩타드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 발명예 PD-1 결합제, 전술된 것 중 어느 하나를 암호화하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터를 투여하면 포유동물에서 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응이 유도된다. 포유동물은, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다. "면역 반응(immune response)"은 예를 들어 항체 생성 및/또는 면역 작용기 세포(예를 들어, T 세포)의 활성화를 수반할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료(treatment, treating)" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 결과를 얻는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 결과(effect)는 치료적인 것이며, 결과는 질환 및/또는 질환으로 인한 유해 증상(adverse symptoms)을 부분적으로 또는 완전히 치유하는 것이다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 PD-1 결합제의 "치료적 유효량"을 투여하는 단계를 포함한다. "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량으로서 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자, 및 개체에게 원하는 반응을 유도하는 PD-1 결합제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, PD-1 결합제의 치료적 유효량은 인간에서 PD-1 단백질 활성을 감소시키고/시키거나 암 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 향상시키는 양이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 약리학적 및/또는 생리학적 효과는 예방적인 것일 수 있다. 즉, 효과는 질환이나 질환의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 것이다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 항PD-1 항체 제제의 "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"을 투여하는 단계를 포함한다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과(예를 들어, 질환 발병의 예방)를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 투여량으로서 효과적인 양을 지칭한다.
일반적인 투여량은 예를 들어, 동물이나 인간의 체중 1 kg당 1 pg 내지 20 mg의 범위일 수 있지만; 이러한 예시적인 범위 미만이거나 이를 초과하는 투여량도 본 발명의 범위 내에 속한다. 일일 비경구 투여량은 총 체중 1 kg당 약 0.00001 μg 내지 약 20 mg일 수 있다(예: 약 0.001 μg/kg, 약 0.1 μg/kg, 약 1 μg/kg, 약 5 μg/kg, 약 10 μg/kg, 약 100 μg/kg, 약 500 μg/kg, 약 1 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위). 일부 구현예에서는, 총 체중 1 kg당 약 0.1 μg 내지 약 10 mg일 수 있다(예: 약 0.5 μg/kg, 약 1 μg/kg, 약 50 μg/kg, 약 150 μg/kg, 약 300 μg/kg, 약 750 μg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위). 일부 구현예에서는, 총 체중 1 kg당 약 1 μg 내지 약 5 mg일 수 있다(예: 약 3 μg/kg, 약 15 μg/kg, 약 75 μg/kg, 약 300 μg/kg, 약 900 μg/kg, 약 2 mg/kg, 약 4 mg/kg, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위). 일부 구현예에서는, 총 체중 1 kg당 약 0.5 내지 약 15 mg일 수 있다(예: 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 13 mg/kg, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위). 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 환자의 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 병태에 따라 수 일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우, 질환 증상이 원하는 정도로 억제될 때까지 치료가 반복될 수 있다. 그러나, 다른 투여 방식들이 유용할 수 있고, 이들은 본 발명의 범위에 포함된다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여, 또는 조성물의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드, 본 발명의 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드, 본 발명의 PD-1 결합제, 전술한 것 중 어느 하나를 암호화하는 본 발명의 핵산 서열, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터의 유효량을 포함하는 조성물(들)은, 경구 투여, 안구 투여, 비경구 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여, 폐 투여, 기관지 투여, 구내 투여, 피내 투여, 피부간 투여, 경피 투여, 국부 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 구내 투여, 설하 투여, 장내 투여, 동맥내 투여, 위내 투여, 특정 기관 내(예: 간내) 투여, 직장 투여, 피하 투여, 설하 투여, 기관 투여, 질 투여, 유리체 투여, 척수내 투여, 경막내 투여, 뇌실내 투여, 점막 투여 또는 좌약 투여를를 포함하는 표준 투여 기술을 사용해 포유동물에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 비경구 투여에 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "비경구(parentral)"은 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 이용하여 포유류에게 투여된다. 포유동물은, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다.
일단 포유동물(예: 인간)에게 투여되면, 항PD-1 항체 제제의 생물학적 활성은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성은 특정 PD-1 결합제의 안정성을 결정함으로써 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 약 30분 내지 45일(예를 들어, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 1일, 약 5일, 약 10일, 약 15일, 약 25일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 약 2시간 내지 20일(예를 들어, 약 5시간, 약 10시간, 약 15시간, 약 20시간, 약 2일, 약 3일, 약 7일, 약 12일, 약 14일, 약 17일, 약 19일, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, PD-1 결합제는 약 10일 내지 40일(예를 들어, 약 10일, 약 13일, 약 16일, 약 18일, 약 20일, 약 23일, 약 26일, 약 29일, 약 30일, 약 33일, 약 37일, 약 38일, 약 39일, 약 40일, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 생체 내 반감기를 갖는다.
항PD-1 항체 제제의 안정성은, 예를 들어, 혈청 반감기, 시차주사 열량측정법(DSC), 열 이동 분석, 및 펄스-추적 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 다른 적절한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는, 생체 내 및 시험관 내 단백질 안정성을 측정하는 다른 방법은, 예를 들어, Protein Stability and Folding, B.A. Shirley (편집), Human Press, Totowa, New Jersey (1995); Protein Structure, Stability, and Interactions (Methods in Molecular Biology), Shiver J.W. (편집), Humana Press, New York, NY (2010); 및 Ignatova, Microb. Cell Fact., 4: 23 (2005)에 기술되어 있다.
항PD-1 항체 제제의 안정성은, 아미노산 서열의 50%가 고유 입체형태로 있고 나머지 50%는 변성되는 온도인 전이 중간 값(Tm)과 관련하여 측정될 수 있다. 일반적으로, T는m이 높을 수록 단백질은 더 안정적이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 PD-1 결합제는 약 60 내지 100℃의 시험관 내 전이 중간 값(Tm)을 갖는다. 예를 들어, 항PD-1 항체 제제는 약 65 내지 80℃(예를 들어, 66℃, 68℃, 70℃, 71℃, 75℃ 또는 79℃), 약 80 내지 90℃(예를 들어, 81℃, 85℃ 또는 89℃), 또는 약 90 내지 100℃(예를 들어, 약 91℃, 약 95℃, 또는 약 99℃)의 시험관 내 Tm을 포함할 수 있다.
특정 항PD-1 항체 제제의 생물학적 활성 또한 PD-1 단백질 또는 이의 에피토프에 대한 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 용어 "친화도(affinity)"는 2개 제제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며 해리상수(KD)로서 표현된다. 에피토프에 대한 항체의 친화도와 같은, 리간드에 대한 결합제의 친화도는, 예를 들어, 약 1 피코몰(pM) 내지 약 100 마이크로몰(μM)(예: 약 1 피코몰(pM) 내지 약 1 나노몰(nM), 약 1 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 1 μM 내지 약 100 μM)일 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 결합제는 1 나노몰 이하(예를 들어, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 0.1 nM, 0.05 nM, 0.025 nM, 0.01 nM, 0.001 nM, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 KD로 PD-1 단백질에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1 결합제는 200 pM 이하(예를 들어, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)의 KD로 PD-1에 결합할 수 있다. 관심 항원 또는 관심 에피토프에 대한 면역글로불린 친화도는 당업계에서 인식되는 임의의 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 분리식 비드(예를 들어, 자성 비드), 표면 플라스몬 공명(SPR), 용액 상 경쟁(KINEXA™), 항원 패닝, 및/또는 ELISA를 포함한다(예를 들어, Janeway 외(편집), Immunobiology, 5판, Garland Publishing, New York, NY, 2001 참조).
항PD-1 항체 제제는 단독으로 투여되거나, (예를 들어, 보강제로서) 다른 약물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, PD-l 결합제는 본원에 개시된 질환의 치료 또는 예방을 위해 다른 제제, 예컨대 암세포에 대해 세포독성이 있거나, 암세포의 면역원성을 조절하거나, 암세포에 대한 면역 반응을 촉진하는 제제 등과 조합하여 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 항PD-1 항체 제제는, 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 화학치료제, 이온화 방사선, 소분자 항암제, 암 백신, 생물학적 치료제(예를 들어, 다른 단클론 항체, 암-사멸 바이러스, 유전자 치료제, 및 양자 T 세포 전달), 및/또는 수술을 포함하는 적어도 하나의 다른 항암제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제로 치료하기 위한 대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유동물)는 화학요법(예: 백금계 화학요법)으로 치료를 받았거나, 향후 치료받게 된다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 액티노마이신(actinomycin), 올트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid), 아자시티딘(azacitidine), 아자티오프린(azathioprine), 블레오마이신(bleomycin), 보르테조밉(bortezomib), 카보플라틴(carboplatin), 카페시타빈(capecitabine), 시스플라틴(cisplatin), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다우노루비신(daunorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 독시플루리딘(doxifluridine), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에포틸론(epothilone), 에토포시드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이마티닙(imatinib), 이리노테칸(irinotecan), 메클로레타민(mechlorethamine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉사트(methotrexate), 미톡산트론(mitoxantrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 페메트렉시드(pemetrexed), 테니포시드(teniposide), 티오구아닌(tioguanine), 토포테칸(topotecan), 발루비신(valrubicin), 베무라페닙(vemurafenib), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 또는 비노렐빈(vinorelbine)이다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 백금계 화학요법제, 예컨대, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 트리플라틴 테트라니트레이트(triplatin tetranitrate), 페난트리플라틴(phenanthriplatin), 피코플라틴(picoplatin), 또는 사트라플라틴(satraplatin) 등이다. 일부 이러한 구현예에서, 화학요법제는 페메트렉시드와 같은 엽산 대사 길항물질(folate antimetabolite)이다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제로 치료하기 위한 대상체(예: 인간과 같은 포유동물)는, 베바시주맙(bevacizumab), 이트라코나졸(itraconazole), 카복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole), TNP-470, 푸마질린(fumagillin), CM101, IL-12, 혈소판 인자-4(platelet factor-4), 수라민(suramin), SU5416, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 혈관신생억제 스테로이드(angiostatic steroids), 헤파린(heparin), 연골 유래 혈관신생 억제 인자(예: 펩티드 프로포닌(peptide troponin) I 및 콘도르모듈린(chondromodulin) I), 세포간질 메탈로프로티나아제 억제제(matrix metalloproteinase inhibitor), 앤지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 2-메토시에스트라디올, 테코갈란(tecogalan), 테트라티오몰리브덴산염(tetrathiomolybdate), 트롬보스폰딘(thrombospondin), 탈리도마이드(thalidomide), 프롤락틴(prolactin), αVβ3 억제제, 레날리도마이드(lenalidomide), 리노미드(linomide), 라무시루맙(ramucirumab), 타스퀴니모드(tasquinimod), 라니비주맙(ranibizumab), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 파조파닙(pazopanib), 에버롤리무스(everolimus), 메탈로프로티나아제의 조직 억제제(TIMP1 및 TIMP2), bFGF 가용성 수용체, 형질변환 생장 인자 베타(transforming growth factor beta), 인터페론 알파(interferon alpha), 인터페론 베타(interferon beta), 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반 프롤리페린 관련 단백질(placental proliferin-related protein), 파조파닙(pazopanib), 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 엑시티닙(axitinib), 포나티닙(ponatinib), 카보잔티닙(cabozantinib), 레고라페닙(regorafenib), 반데타닙(vandetanib), 렌바티닙(lenvatinib), 세막사닙(semaxanib), SU6668, 바탈라닙(vatalanib), 티보자닙(tivozanib), 세디라닙(cediranib), 프로타민(protamine), 헤파린(heparin), 스테로이드(steroids), 아스코르브산 에테르(ascorbic acid ethers), 황산다당류(sulfated polysaccharide) DS 4152, 푸마질린(fumagillin), AGM 12470, 네오바스탓(neovastat), RO4929097, MRK-003, MK-0752, PF03084014, MEDI0639, 커큐민(curcumin), 3,3′'-다이인돌릴메탄(DIM), 레스베라트롤(resveratrol), 3,5-비스(2,4-다이플루오로벤질리덴)-4-피페리돈(DiFiD) 및 에피갈로카테킨-3-갈레트(EGCG), 호노키올(honokiol), Flt2-11, CBO-P11, Je-11, V1, 및 이들의 임의의 조합과 같은 항혈관신생제(anti-angiogenic agent)로 치료를 받았거나 향후 치료를 받게 된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는, 예를 들어, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손 및 플루티카손) 및 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 및 나프록센)을 포함하는 항염증제와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 감염성 질환을 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 방법으로 감염성 질환을 치료하는 경우, 항PD-1 항체 제제는 적어도 하나의 항세균제 또는 적어도 하나의 항바이러스제와 조합하여 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 항세균제는 당업계에 공지된 임의의 적절한 항생제일 수 있다. 항바이러스제는 특정 바이러스를 특이적으로 표적화하는 임의의 적합한 유형의 임의의 백신(예를 들어, 생약독화 백신, 서브유닛 백신, 재조합 벡터 백신, 및 소분자 항바이러스 치료제(예를 들어, 바이러스 복제 억제제 및 뉴클레오시드 유사체))일 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 경피증, 크론병, 건선, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 또는 궤양성 대장염이다. 본 발명의 방법으로 자가면역 질환을 치료하는 경우, 항PD-1 항체 제제는, 예를 들어, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손 및 플루티카손) 및 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 및 나프록센)을 포함하는 항염증제와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 면역 관문 경로를 억제하는 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 PD-1 결합제는 CTLA-4, TIM-3 또는 LAG-3 경로를 억제하거나 길항하는 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들 면역 관문 경로 중 2개 이상을 동시에 표적화하는 병용 요법은 항종양 활성을 개선하고 잠재적으로 보강한다는 것이 입증되었다(예를 들어, Sakuishi 외, J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow 외, Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); 및 Woo 외, Cancer Res., 72: 917-927 (2012) 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 PD-1 결합제는 TIM-3 및/또는 LAG-3에 결합하는 항체와 조합하여 투여된다. 이와 관련하여, 포유류에서 암 또는 감염성 질환을 치료하는 본 발명의 방법은 (i) TIM-3 단백질에 결합하는 항체 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물, 또는 (i) LAG-3 단백질에 결합하는 항체 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. LAG-3 및 TIM-3에 특이적인 예시적인 항체 제제는 WO2016/126858 및 WO2016/161270에 각각 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 항TIM-3 항체 제제는, 예를 들어, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니손 및 플루티카손) 및 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 및 나프록센)을 포함하는 항염증제와 조합하여 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는, LAG-3 신호 전달을 억제하는 제제 및/또는 TIM-3 신호 전달을 억제하는 제제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 LAG-3 신호 전달을 저해하는 제제가 투여되었거나 향후에 이를 투여받게 되는 대상체에게 투여되어, 대상체는 둘 모두로 치료를 받게 된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 TIM-3 신호 전달을 저해하는 제제가 투여되었거나 향후에 이를 투여받게 되는 대상체에게 투여되어, 상기 대상체는 둘 모두로 치료를 받게 된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제로 치료받는 포유동물은 TIM-3을 억제하는 제제 및 LAG-3을 억제하는 제제로 치료를 받았거나 향후 치료를 받게 되어, 상기 포유동물은 3가지 모두로 치료를 받게 된다. 일부 구현예에서, 항PD-1 항체 제제는 LAG-3에 결합하는 항체 및/또는 TIM-3에 결합하는 항체와 조합하여 투여된다.
일부 구현예에서, 대상체는 항PD-1 항체 제제와 조합하여 하나 이상의 추가 치료제로 치료를 받고 있거나 향후 받게 된다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 PARP 억제제이다. 일부 구현예에서, PARP 억제제는 ABT-767, AZD 2461, BGB-290, BGP 15, CEP 8983, CEP 9722, DR 2313, E7016, E7449, 플루조파립(fluzoparib, SHR 3162), IMP 4297, INO1001, JPI 289, JPI 547, 단클론 항체 B3-LysPE40 접합체, MP 124, 니라파립(niraparib) (ZEJULA) (MK-4827), NU 1025, NU 1064, NU 1076, NU1085, 올라파립(olaparib) (AZD2281), ONO2231, PD 128763, R 503, R554, 루카파립(rucaparib) (RUBRACA) (AG-014699, PF-01367338), SBP 101, SC 101914, 심미파립(Simmiparib), 텔라조파립(talazoparib) (BMN-673), 벨리파립(veliparib) (ABT-888), WW 46, 2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-7,8-다이하이드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-올, 및 이들의 염 또는 유도체이다. 일부 구현예에서, PARP 억제제는 니라파립, 올라파립, 루카파립, 탈라조파립 및 벨리파립이다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료법은, TIM-3 또는 LAG-3을 억제하는 제제를 전달하는 조성물과 PARP 억제제를 사용하는 치료를 포함하여, 대상체는 3가지 모두로 치료를 받게 된다. 일부 구현예에서, 추가적인 치료법은, TIM-3을 억제하는 제제를 전달하는 조성물, LAG-3을 억제하는 제제를 전달하는 조성물, 및 PARP 억제제를 사용하는 치료를 포함하여, 대상체는 4가지 모두로 치료를 받게 된다.
치료 용도에 추가하여, 본원에 기술된 바와 같은 항PD-1 항체 제제는 진단 또는 연구 용도로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 항PD-1 항체 제제는 암 또는 감염성 질환을 진단하는 방법에 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 항PD-1 항체 제제는 비정상적인 PD-1 발현과 연관된 질환 또는 장애에 대한 시험이 진행 중인 대상체에서 PD-1 단백질 수준을 모니터링하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 연구 용도에는, 예를 들어, 인간의 체액, 세포 또는 조직의 추출물과 같은 샘플에서 PD-1 단백질을 검출하기 위해 항PD-1 항체 제제 및 표지를 사용하는 방법이 포함된다. 항PD-1 항체 제제는, 검출 가능한 모이어티와의 공유 또는 비공유 결합표식(labeling)과 같은 변형 유무와 상관없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 방사성 동위원소(예를 들어, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I), 형광 또는 화학발광 화합물(예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린), 효소(예를 들어, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 겨자무 과산화효소), 또는 보결기(prosthetic groups)일 수 있다. 항원 결합제(예를 들어, 항체)를 검출 가능한 모이어티에 별도록 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다(예를 들어, Hunter 외, Nature, 194: 495-496 (1962); David 외, Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain 외, J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. 및 Cytochem., 30: 407-412 (1982) 참조).
PD-1 단백질 수준은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 항PD-1 항체 제제를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 방사성 면역분석(RIA), 및 FACS를 포함한다. PD-1 단백질의 정상 또는 표준 발현 값은 항원-항체 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 임의의 적절한 기술을 사용하여, 예를 들어, PD-1 폴리펩티드를 포함하거나 이를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플을 PD-1 특이적 항체와 결합시키는 것에 의해 설정할 수 있다. 항체는 결합된 항체 또는 미결합 항체의 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 적절한 검출 가능한 물질은 다양한 효소, 보결기(prosthetic groups), 형광 물질, 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다(예를 들어, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) 참조). 그런 다음, 샘플에서 발현된 PD-1 폴리펩티드의 양을 표준 값과 비교한다.
항PD-1 항체 제제는 키트, 즉, 소정 양의 시약이 진단 분석을 수행하기 위한 지침과 함께 조합된 패키지로 제공될 수 있다. PD-l 결합제가 효소로 표지되는 경우, 바람직하게는 효소에 필요한 기질 및 공동 인자(예를 들어, 검출 가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)가 키트에 포함된다. 또한, 안정화제, 완충액(예컨대, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 키트에 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 분석의 민감도를 실질적으로 최적화시키는 시약 용액 중에서의 농도를 맞출 수 있도록 달라질 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는 (일반적으로는 동결 건조된) 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 특징들은 예시적인 구현예에 대한 이하의 설명에서 명백해질 것이지만, 이는 본 발명의 예시를 위해 주어지는 것이며 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 특정 예시적인 항PD-1 항체의 설명
본 실시예는 특정 항PD-1 항체 중쇄 폴리펩티드 서열과 경쇄 폴리펩티드 서열, 및 이를 암호화하는 핵산을 기술한다.
항PD-1 항체 중쇄 폴리펩티드(CDR 서열) (서열 번호 1)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGSYTYYQDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
항PD-1 항체 경쇄 폴리펩티드(CDR 서열) (서열 번호 2)
DIQLTQSPSFLSAYVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHYSSYPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
신호 서열을 갖는 항PD-1 항체 중쇄 폴리펩티드 (서열 번호 5)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSTISGGGSYTYYQDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASPYYAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
신호 서열을 갖는 항PD-1 항체 경쇄 폴리펩티드 (서열 번호 6)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCDIQLTQSPSFLSAYVGDRVTITCKASQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTLHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHYSSYPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
항PD-1 항체 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 3)
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC AGT AGC TAT GAC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC TCA ACC ATT AGT GGT GGT GGT AGT TAC ACC TAC TAT CAA GAC AGT GTG AAG GGG CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG TCC CCT TAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCA TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCG CTA GCA CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCC GAG AGC ACA GCC GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCA GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACG AAG ACC TAC ACC TGC AAC GTA GAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCA TGC CCA GCA CCT GAG TTC CTG GGG GGA CCA TCA GTC TTC CTG TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACT CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAG GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAC TGG TAC GTG GAT GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GGC CTC CCG TCC TCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAG CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CAG GAG GAG ATG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AGG CTA ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG GAG GGG AAT GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CTG GGT AAA
항PD-1 항체 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 (서열번호 4)
GAC ATC CAG TTG ACC CAG TCT CCA TCC TTC CTG TCT GCA TAT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC AAG GCC AGT CAG GAT GTG GGT ACT GCT GTA GCC TGG TAT CAG CAA AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TGG GCA TCC ACC CTG CAC ACT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAA TTC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CAG CAT TAT AGC AGC TAT CCG TGG ACG TTT GGC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGG ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAA TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTC AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT
위의 서열들은 골격으로서 인간 IGHG4*01 중쇄 유전자 및 인간 IGKC*01 카파 경쇄 유전자를 사용하는 예시적인 인간화 단클론 항PD-1 항체를 기술한다. IgG4 중쇄의 힌지 영역에는 Ser에서 Pro로의 점 돌연변이가 하나 있다. 이러한 돌연변이는 신호 서열을 포함하는 서열번호 5에서의 잔기 243에 상응하는 정규(canonical) S228 정준 위치에 있다. 　 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이러한 점 돌연변이는 항체 중쇄의 힌지를 안정화시키는 역할을 하는 것으로 예상된다.
이러한 예시적인 인간화 단클론 항PD-1 항체의 생체 물리학적 및 생화학적 특성화는 IgG4 분자에 대한 예상 이황화 결합 패턴과 일치한다. 예상 쇄간 이황화 결합(interchain disulfide linkage) 및 쇄내 이황화 결합(intrachain disulfide linkage)에 포함된 잔기는 아래에 표로 표시되어 있다(표 1 및 표 2).
Figure pct00001
Figure pct00002
이러한 예시적인 항PD-1 항체는 성숙한 단백질 서열(서열번호 1)에서 각 중쇄의 CH2 도메인의 아스파라긴 잔기 293에서 점유된 N-글리코실화 부위를 나타낸다. 이러한 부위에서의 발현된 N-글리코실화는 포유동물 세포 배양물에서 발현된 IgG 상에서 일반적으로 관찰되는 올리고당 종의 혼합물이며, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 배양된 이러한 예시적인 항PD-1 항체의 제제로부터 유래된 글리칸 종의 상대 존재율이 아래에 도시되어 있다(표 3).
Figure pct00003
실시예 2 - 재조합 PD-1에 대한 예시적인 항PD-1 항체의 결합
본 실시예는 재조합 PD-1 폴리펩티드에 대한 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1 및 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)의 결합을 기술한다. 구체적으로, 본 실시예는 표면 플라스몬 공명(SPR) 및 유동 세포 계측을 사용하여 각각 결정된 바와 같이, 예시적인 항체가 가용성 PD-1 융합체 및 세포-발현된 재조합 PD-1에 고친화도로 결합함을 입증한다.
Biacore T200 시스템을 사용하여 SPR 분석을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 동역학 상수를 결정하였다. 가장 높은 항원 농도에서 포화에 도달하고 Rmax 값이 100 반응 단위(RU) 미만으로 유지되도록 실험 파라미터를 선택하였다. GE 항인간 IgG(Fc-특이적임)를 Biacore CM5 칩 상에 고정시켰다. 그런 다음, EDC-활성화 아민 결합 화학을 사용해 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1 및 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)를 이 표면 상으로 포획하였다. 이어서, 일련의 2배 연속 희석물 중의 이량체 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 융합 단백질(마우스 IgG2a Fc와 융합됨)을 포획된 예시적인 항체 위로 흘리고, 해리를 모니터링하였다. 포획 및 분석물 결합은 HBS-EP+ 완충액에서 수행하였다. 3M MgCl2를 사용하여 각 실행 사이에 칩을 재생하였다. 생성된 센서그램을 1:1 결합 모델을 사용해 전체적으로 피팅하여, 전반적인 친화도(KD)의 척도로서 온 오프 속도(각각, kassoc 및 kdissoc) 및 해리 상수(dissociation constants)를 계산하였다. SPR 측정치는, 예시적인 항PD-1 항체가 빠른 결합 속도, 느린 해리 속도, 및 높은 전체 친화도로 인간 및 시노몰구스 PD-1에 결합한다는 것을 입증하였다(표 4). 또한, 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 대한 결합 동역학은 유사하였으며, KD값에 있어서 차이는 2배 미만이었다.
전장 원시 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1이 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포주 클론을 사용해 유동 세포 계측 연구를 수행하였다. 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1과 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)를 3배 희석물로 희석하였다. 예시적인 항체의 희석물을 인간 또는 시노몰구스 원숭이 PD-1 발현 CHO-K1 세포(1E5 세포)에 첨가하고 얼음 상에서 배양하였다. 세포를 2회 세척하고 PE-접합된 마우스 항인간 IgG4로 얼음 상에서 배양하여 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, 프로피디움 요오드화물이 존재하는 가운데 재현탁하여 죽은 세포를 제거하고, BD FACSArray 기기(BD Biosciences) 상에 고정하여 형광에 대해 분석하였다. 데이터를 중앙 형광 강도에 대해 분석하고 그래프화 하였으며, EC50 값을 계산하기 위해 비선형(S자형) 회귀 분석을 사용해 곡선을 GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc.)에 피팅하였다. 이러한 예시적인 항PD-1 항체는 각각 2.0 및 3.4 nM의 EC50으로 세포-표면 인간 및 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하는 것으로 밝혀졌다(표 4).
Figure pct00004
본 실시예는 본 발명의 범위 내의 항PD-1 항체가 높은 친화도로 PD-1 폴리펩티드에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3 - 예시적인 항PD-1 항체의 수용체 점유율
본 실시예는 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1 및 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)가 인간 및 시노몰구스 원숭이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 발현된 미처리 PD-1을 점유하는 능력을 기술한다.
이들 연구를 위해, 건강한 인간 공여자 또는 시노몰구스 원숭이로부터의 PBMC를 사용하였다. Indiana Blood Center에서 구한 연막(buffy coat)으로부터 인간 PBMC를 단리하였고, 나트륨 헤파린 내에 무균적으로 채취한 말초 혈액을 Worldwide Primates, Inc로부터 구해 이로부터 시노몰구스 원숭이 PBMC를 단리하였다. 두 경우 모두, 분리는 Ficoll-Paque 1.077을 사용해 Ficoll에 의해 수행하였고, 다음 사용을 위해 냉동 보관하였다.
실험 당일에, 동결 보존된 세포를 해동하고, 가습된 CO2 인큐베이터에서 37℃로 밤새 레스팅하기 전에 세포 농도를 2E6 세포/ml로 조정하였다. 그런 다음, 세포를 펠릿화하여 1 ml의 배지 중에 재현탁하고 다수 계수하였다. 세포 농도를 4E5 세포/150 μl의 배지로 조정하였다. 인간 A/B 혈청(40 μl/ml)을 첨가하여 Fc 수용체를 차단하였다. 원심분리 후, 세포를 예시적인 항PD-1 항체와 함께 4℃에서 배양하였다. 그런 다음, PBMC가 2개의 조건으로 분할되기 전에 3회 세척하였다. 한 세트의 세포는 예시적인 항PD-1 항체와 함께, 나머지 한 세트는 IgG4와 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, FITC-표지된 항CD3 항체 및 PE-표지된 항IgG4 항체로 염색하기 전에 PBMC를 4회 세척하였다. 유동 세포 계측법으로 분석하기 전에 세포를 세척하고 고정시켰다. CD3+/Igg4+ 세포의 수를 각 파라미터별로 결정하였고, 예시적인 항PD-1 항체에 대한 점유 백분율은 다음과 같이 결정하였다:
[항PD-1 항체의 주어진 사전배양 농도에서 IgG4로 처리한 세포에 대한 CD3+/Igg4+ 세포의 수]
나누기
[항PD-1 항체의 주어진 사전배양 농도에서 예시적인 항PD-1 항체로 처리한 세포에 대한 CD3+/Igg4+ 세포의 수]
예시적인 항PD-1 항체와 함께 사전배양된 PBMC의 경우, IgG4로 처리한 세포뿐만 아니라 항PD-1 항체로 처리한 세포 모두가 많은 수의 CD3+/IgG4+ 세포를 생성하였다. 사전배양 단계 동안 예시적인 항PD-1 항체의 수준이 감소함에 따라 IgG4로 처리한 세포에 의해 검출된 CD3+/Igg4+ 세포의 수가 꾸준히 감소하였는데, 이는 예시적인 항PD-1 항체에 의해 PD-1의 점유율이 농도 의존적이 됨을 나타낸다(도 1).
본 실시예는 본 발명의 범위 내의 항PD-1 항체가 자연 발현된 PD-1에 결합할 수 있고, 추가로 예시적인 항PD-1 항체에 의해 PBMC에 대한 PD-1의 점유율이 농도 의존적이라는 것을 입증한다.
실시예 4 - 예시적인 항PD-1 항체는 PD-1 및 PD-L1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 차단함
본 실시예는 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1 및 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)가 PD-1과 이의 동원 리간드인 PD-L1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 방지하는 능력을 기술한다.
이들 연구에서, 인간 PD-L1 및 PD-L2, 마우스 IgG1 Fc 융합 단백질을 발현시키고, 정제하고, DyL650으로 표지하였다. PD-1 CHO-K1 세포에 대한 PD-L1 및 PD-L2 모두의 결합의 용량-반응을 결정하였다. PD-1 CHO-K1 세포에 대한 리간드 결합의 차단을 정량화하기 위해, 일련의 3배 희석물 중의 예시적인 항PD-1 항체 또는 IgG4 대조군 항체를 PD-L1-mFc-DyL650 또는 PD-L2-mFc-DyL650과 사전 혼합하였다. 혼합물을 인간 PD-1 CHO-K1 세포(3E5 세포)에 첨가하고 4℃에서 배양하였다. 세포를 1회 세척하고 프로피디움 요오드화물 및 DyL650-PD-L1 또는 DyL650-PD-L2이 존재하는 가운데 재현탁하였다. BD FACSArray(BD Bioscience) 상에서 결합을 분석하되, 죽은 세포는 제외시켰다. 중앙 형광 강도에 대해 데이터를 분석하였고, IC50을 계산하기 위해 비선형 회귀 분석을 사용해 곡선을 GraphPad Prism(Graphpad Software, Inc.)에 피팅시켰다. IgG4 대조군 항체와 달리, 예시적인 항PD-1 항체(서열번호 1 및 2에 기재된 중쇄 및 경쇄를 각각 가짐)는 PD-1과 PD-L1 및 PD-L2 사이의 상호작용을 강력하게 억제할 수 있다는 것을 발견했다(표 5).
Figure pct00005
본 실시예는 본 발명의 범위 내의 항PD-1 항체가 PD-L1 및 PD-L2와 같은 PD-1 리간드의 결합을 차단할 수 있음을 입증한다.
이렇듯, 본 발명의 적어도 여러 양태와 구현예를 기술하였지만, 다양한 변경, 수정, 및 개선이 당업자에게 쉽게 명백해질 것임을 이해해야 한다. 이러한 변경, 수정, 및 개선은 본 개시의 일부가 되도록 의도되고, 본 발명의 사상 및 범주 내에 있도록 의도된다. 따라서, 전술한 설명은 단지 예시에 불과하며, 본 발명은 이어지는 청구범위에 의해 상세하게 기술된다.
간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하여 본원에 인용된 모든 참조 문헌은, 마치 각각의 참조 문헌이 개별적으로 및 구체적으로 참조에 의해 통합된 것으로 표시되고, 그 전체가 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 참조에 의해 본원에 통합된다.
본 발명을 설명하는 문맥에서 (특히, 다음의 청구범위의 문맥에서) 용어 "하나(a, an, the)" 및 "적어도 하나(at lease one)" 및 유사한 지시 대상의 사용은, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확히 부정되지 않는 한, 단수와 복수형 모두를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 하나 이상의 항목의 목록이 이어지는 용어 "적어도 하나(at least one)"을 사용하는 것(예를 들어, "A와 B 중 적어도 하나")은, 본원에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확히 부정되지 않는 한, 열거된 항목들 중에서 선택된 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목 중 2개 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하여 이루어지는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)", 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급하지 않는 한, 개방 단부형 용어로서 (즉, "포함하지만 이에 제한되지 않는(including, but not limited to)"의 의미로서) 간주되어야 한다. 본원에서의 값의 범위에 대한 설명은, 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내에 속하는 각각의 별도 값을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로서 역할을 하도록 의도되는 것 뿐이며, 각각의 별도 값은 마치 이들이 본원에 개별적으로 인용된 것 처럼 본 명세서에 통합된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되지 않거나 달리 문맥에 의해 명확히 부정되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 임의의 그리고 모든 예시, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "이와 같은(such as)")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 대한 제한을 제기하지 않는다. 본 명세서에서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> ANAPTYSBIO, INC. TESARO, INC. <120> ANTIBODIES DIRECTED AGAINST PROGRAMMED DEATH- 1 (PD-1) <130> 2009530-0774 <140> PCT/US2017/059618 <141> 2017-11-01 <150> 62/427,777 <151> 2016-11-29 <150> 62/416,128 <151> 2016-11-01 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Gln Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 2 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Tyr Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 3 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgaca tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaacc attagtggtg gtggtagtta cacctactat 180 caagacagtg tgaaggggcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gtccccttac 300 tatgctatgg actactgggg gcaagggacc acggtcaccg tctcctcagc atccaccaag 360 ggcccatcgg tcttcccgct agcaccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccagtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cgaagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagtccaa atatggtccc 660 ccatgcccac catgcccagc acctgagttc ctggggggac catcagtctt cctgttcccc 720 ccaaaaccca aggacactct catgatctcc cggacccctg aggtcacgtg cgtggtggtg 780 gacgtgagcc aggaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg 840 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960 aacaaaggcc tcccgtcctc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020 gagccacagg tgtacaccct gcccccatcc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1080 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200 ttcctctaca gcaggctaac cgtggacaag agcaggtggc aggaggggaa tgtcttctca 1260 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320 ctgggtaaa 1329 <210> 4 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat atgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgca aggccagtca ggatgtgggt actgctgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattgg gcatccaccc tgcacactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcagcat tatagcagct atccgtggac gtttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acggactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc aattgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctcagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 5 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Gln 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 460 <210> 6 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe 20 25 30 Leu Ser Ala Tyr Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Leu His Thr Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His 100 105 110 Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

Claims (61)

  1. 예정 사멸 1(PD-1)에 결합할 수 있는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96% 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  2. 서열번호 1과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드.
  3. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 예정 사멸 1(PD-1)에 결합하는, 중쇄 폴리펩티드.
  4. 예정 사멸 1(PD-1)에 결합할 수 있는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 서열번호 2와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 PD-1에 결합하는, 중쇄 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및/또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 제1 시스테인과 제2 시스테인에 의해 형성된 적어도 하나의 이황화 결합을 포함하고,
    i) 상기 제1 시스테인은 서열번호 1의 잔기 22, 96, 130, 143, 199, 222, 225, 257, 317, 363 및 421로부터 선택되고, 상기 제2 시스테인은 서열번호 2의 잔기 23, 88, 134, 194, 및 214로부터 선택되며;
    ii) 상기 제1 시스테인은 서열번호 1의 잔기 22, 96, 130, 143, 199, 222, 225, 257, 317, 363 및 421로부터 선택되고, 상기 제2 시스테인은 서열번호 1의 잔기 22, 96, 130, 143, 199, 222, 225, 257, 317, 363 및 421로부터 선택되며;
    iii) 상기 제1 시스테인은 서열번호 2의 잔기 23, 88, 134, 194, 및 214로부터 선택되고, 상기 제2 시스테인은 서열번호 2의 잔기 23, 88, 134, 194, 및 214로부터 선택되는, 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 글리코실화되는 적어도 하나의 아스파라긴을 함유하는, 폴리펩티드.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 서열.
  10. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 핵산 서열.
  11. 서열번호 3을 포함하는 서열을 가진 단리된 핵산.
  12. 서열번호 4를 포함하는 서열을 가진 단리된 핵산.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 항체 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 제제는 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 및 서열번호 2를 포함하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함하는, 항체 제제.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 항체 제제는 TIM-3에 결합하는, 항체 제제.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 제제는 약 1 피코몰(pM) 내지 약 100 마이크로몰(μM)의 KD로 TIM-3에 결합하는, 항체 제제.
  19. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, (b) 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, (c) 제13항의 벡터, (d) 제14항의 단리된 세포, 또는 (e) 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 제제를 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  21. 포유동물에서 PD-1 억제에 반응하는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항의 벡터, 제14항의 단리된 세포, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 제제, 또는 제19항 또는 제20항의 조성물의 유효량을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 상기 포유동물에서 상기 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 포유동물에서 PD-1 억제에 반응하는 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항의 벡터, 제14항의 단리된 세포, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 제제, 또는 제19항 또는 제20항의 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 PD-1의 유효량을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 상기 포유동물에서 상기 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. PD-1 억제에 반응하는 질환을 가진 포유동물에서 면역 반응을 강화하거나 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항의 벡터, 제14항의 단리된 세포, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체 제제, 또는 제19항 또는 제20항의 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 PD-1의 유효량을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 상기 포유동물에서 상기 면역 반응 또는 상기 면역 세포의 활성을 강화하거나 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 면역 반응은 체액 또는 세포 매개 면역 반응인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 면역 반응은 CD4 또는 CD8 T 세포 반응인, 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 면역 반응은 B 세포 반응인, 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암은:
    i) 높은 종양 변이 부담(TMB)과 연관된 암(TMB);
    ii) 현미부수체 안정적(MSS)인 암,
    iii) 현미부수체 불안정성을 특징으로 하는 암,
    iv) 높은 현미부수체 불안정성 상태(MSI-H)를 갖는 암,
    iv) 낮은 현미부수체 불안정성 상태(MSI-L)를 갖는 암,
    vi) 높은 TMB 및 MSI-H와 연관된 암,
    vi) 높은 TMB 및 MSI-L 또는 MSS와 연관된 암,
    viii) 결함이 있는 DNA 불일치 복구 시스템을 갖는 암,
    ix) DNA 불일치 복구 유전자에 결함을 갖는 암,
    x) 과돌연변이된 암,
    xi) 중합효소 엡실론(POLE)에 돌연변이를 포함하는 암,
    xii) 선암종(adenocarcinoma), 자궁내막암(endometrial cancer), 유방암(breast cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난관암(fallopian tube cancer), 고환암(testicular cancer), 원발성 복막암(primary peritoneal cancer), 대장암(colon cancer), 결장암(colorectal cancer), 위암(stomach cancer), 소장 암(small intestine cancer), 항문생식기 영역의 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma of the anogenital region), 흑색종(melanoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 폐암(lung cancer), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평상피암(squamous cell carcinoma of the lung), 위암(stomach cancer), 방광암(bladder cancer), 쓸개암(gall bladder cancer), 간암(liver cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 후두암(laryngeal cancer), 타액샘암(salivary gland cancer), 식도암(esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 두경부 편평상피암(squamous cell carcinoma of the head and neck), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 중피종(mesothelioma), 머켈 세포 암종(Merkel cell carcinoma), 육종(sarcoma), 교아 세포종(glioblaseoma), 및 다발성 골수종(multiple myeloma), B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종/원발성 종격 B-세포 림프종, 또는 만성 골수성 백혈병과 같은 혈액암(hematological cancer), 또는
    xiii) xii)의 암으로서, 상기 암은 MSS 또는 MSI-L이거나, 현미부수체 불안정성을 특징으로 하거나, MSI-H이거나, 높은 TMB를 가지거나, 높은 TMB를 가지면서 MSS 또는 MSI-L이거나, 높은 TMB를 가지면서 MSI-H이거나, 결함이 있는 DNA 불일치 복구 시스템을 가지거나, DNA 불일치 복구 유전자에 결함을 가지거나, 중합효소 엡실론(POLE)에 돌연변이를 포함하는 것인, 방법.
  29. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 감염성 질환인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스 또는 박테리아에 의해 야기되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 인플루엔자 바이러스, 뎅기바이러스, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)인, 방법.
  32. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 류머티스성 관절염, 경피증, 크론병, 건선, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 또는 궤양성 대장염인, 방법.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3을 억제하는 제제가 상기 포유동물에게 투여되었거나 향후 투여되어, 상기 포유동물이 둘 다로 치료를 받게 되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, TIM-3을 억제하는 상기 제제는 TIM-3 결합제인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 TIM-3 결합제는 항체, 항체 접합체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, TIM-3을 억제하는 제제가 상기 포유동물에게 투여되었거나 투여되게 되어, 상기 포유동물이 둘 다로 치료를 받게 되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, LAG-3을 억제하는 상기 제제는 LAG-3 결합제인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 LAG-3 결합제는 항체, 항체 접합체, 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 포유동물은 PD-1 제제, TIM-3을 억제하는 제제, 및 LAG-3을 억제하는 제제 각각으로 치료를 받아, 상기 포유동물이 3가지 모두로 치료를 받게 되는, 방법.
  41. 제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, PARP를 억제하는 제제가 상기 포유동물에게 투여되었거나 투여되게 되어, 상기 포유동물이 둘 다로 치료를 받게 되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, PARP를 억제하는 상기 제제는 소분자, 핵산, 폴리펩티드(예: 항체), 탄수화물, 지질, 금속, 또는 독소(toxin)인, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, PARP를 억제하는 상기 제제는, ABT-767, AZD 2461, BGB-290, BGP 15, CEP 8983, CEP 9722, DR 2313, E7016, E7449, 플루조파립(fluzoparib, SHR 3162), IMP 4297, INO1001, JPI 289, JPI 547, 단클론 항체 B3-LysPE40 접합체, MP 124, 니라파립(niraparib) (ZEJULA) (MK-4827), NU 1025, NU 1064, NU 1076, NU1085, 올라파립(olaparib) (AZD2281), ONO2231, PD 128763, R 503, R554, 루카파립(rucaparib) (RUBRACA) (AG-014699, PF-01367338), SBP 101, SC 101914, 심미파립(Simmiparib), 텔라조파립(talazoparib) (BMN-673), 벨리파립(veliparib) (ABT-888), WW 46, 2-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-7,8-다이하이드로-5H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-올, 및 이들의 염 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 PD-1 제제, TIM-3을 억제하는 제제 또는 LAG-3을 억제하는 제제, 및 PARP를 억제하는 제제 각각으로 치료를 받아, 상기 포유동물이 3가지 모두로 치료를 받게 되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 상기 포유동물이 LAG-3 또는 TIM-3을 억제하는 제제로 치료를 받는 단계를 추가로 포함하여, 상기 포유동물이 4가지 모두로 치료를 받게 되는, 방법.
  46. 제21항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 PD-1을 억제하는 제제로 치료하는 것에 대해 내성을 가지는, 방법.
  47. 제21항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 PD-1을 억제하는 제제로 치료하는 것에 대해 불응성인, 방법.
  48. 제21항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 PD-1을 억제하는 제제로 치료하는 것에 대해 상기 포유동물을 민감화시키는, 방법.
  49. 제21항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 기능소실 면역 세포(exhausted immune cell)를 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 기능소실 면역 세포는 기능소실 T 세포인, 방법.
  51. 제21항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 방법.
  52. 제21항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 이전에 하나 이상의 상이한 암 치료 방법으로 치료받은 적인 있는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 포유동물은 수술, 방사선 치료, 화학요법 또는 면역요법 중 하나 이상으로 이전에 치료받은 적이 있는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 포유동물은 세포독성 요법으로 이전에 치료받은 적인 있는, 방법.
  55. 제21항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 또 다른 치료제 또는 치료약을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법, 면역요법, 항혈관형성 제제, 또는 항염제 중 하나 이상을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 숙주 세포 배양물에서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계에 의해 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  58. 숙주 세포 배양물에서 상기 항체를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계에 의해 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법.
  59. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항의 벡터, 제14항의 단리된 세포, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 결합시키는 단계, 및 대상체에 대한 투여를 위해 제형하는 단계에 의해 제19항 또는 제20항의 조성물을 제조하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 투여를 위해 제형화하는 상기 단계는 비경구 전달용으로 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제21항 내지 제56항 중 어느 하나의 방법들 중 하나에 사용하기 위해, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제13항의 벡터, 제14항의 단리된 세포, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제19항 또는 제20항의 조성물을 제조하는 방법.
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