KR20190027641A - 천연 항균제 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 천연 항균제 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, 유칼립투스 추출물의 분획물 및 티트리 추출물의 분획물을 이용한 천연 항균제 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 유칼립투스 및 티트리를 이용한 천연 항균제 및 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
유칼립투스(Eucalyptus)는 쌍떡잎식물 도금양목 도금양과의 상록교목으로 호주와 타스마니아가 원산지이며, 스페인, 포르투갈과 같은 지중해 지역과 중국에서 재배된다. 호주산 고무나무인 유칼립투스는 세계에서 가장 키가 큰 나무이며 호주의 원주민들은 심한 창상 주위에 유칼립투스의 나뭇잎은 싸매기도 했다. 유칼립투스는 호주의 원주민뿐만 아니라 유럽에서도 기름에 유칼립투스 잎을 담가서 여러 가지 감염증과 열병치료에 사용하고, 잎을 태워서 천식환자를 안정시키는 등 200년 이상 민간요법으로 사용해 왔다. 유칼립투스 오일은 감염, 화상, 상처, 염증이 있거나 칙칙하고 정체된 피부에 효과가 있고 머리를 맑게 해주며 감정을 진정시키는 효과가 있다. 유칼립투스의 일부 테르펜이 공기 중에 산화하여 발생한 오존은 강한 살균효과를 가지며, 이러한 살균 성질은 감염에 의한 열성질환에 효과적이다.
티트리(Melaleuca alternifolia)는 도금양목 도금양과의 상록교목으로 늪지대에서 자라며 생명력이 강해 줄기를 잘라내도 잘 자라는 것으로 알려져 있다. 공기를 상쾌하게 정화하는 역할을 하는 허브의 한 종류이다. 오스트레일리아 원주민들은 이미 오래 전부터 티트리 나무의 잎으로 베인 상처에 생긴 감염증을 치료해왔다. 제2차 세계대전 중에는 피부창상의 치료제로서 열대지방의 군인에게 지급되었다. 외과와 치과에서 사용되며 살균 소독제, 탈취제, 비누, 공기정화제에도 넣어 사용한다. 이밖에도 각종 감염증, 감기, 입 냄새, 무좀, 비듬 등에도 효과가 있다. 이러한 티트리를 헥산, CHCl3 또는 에틸아세테이트 등의 용매로 추출한 추출물을 화장료 조성물로 이용하여 보습효과를 증대시키는 기술이 있으나, 티트리의 항균 효과 확인을 통한 용도를 확장시키지 못하고 있는 실정이다.
본 발명은 해충 방제 효과 및 살균 효과가 있는 것으로 알려져 있는 유칼립투스(Eucalyptus) 및 티트리(Melaleuca alternifolia)를 가공하여 이들 가공물을 특정 비율로 혼합하여 사용하면 항균 효과를 극대화시킬 수 있음을 다양한 연구 끝에 알게 되어 완성한 발명으로서, 본 발명은 유칼립투스 및 티트리 가공물을 최적비로 포함하는 천연 항균제 및 이를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 천연 항균제에 관한 것으로서, 유칼립투스 에탄올 추출물을 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제1분획물; 유칼립투스 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제2분획물; 및 티트리 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 티트리 분획물;을 포함하는 혼합분획물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 항균제는 상기 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 제2분획물 및 티트리 분획물을 1 : 1.5 ~ 3 : 6 ~ 15 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 항균제에 있어서, 상기 유칼립투스 에탄올 추출물 및 티트리 에탄올 추출물은 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 항균제는 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 제2분획물 및 티트리 분획물 외에 디메틸설폭사이드(DMSO), 부틸렌글라이콜(Buthylene Glycol), 프로필렌글라이콜(Propylene Glycol), 글리세린(glycerin) 및 정제수 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 항균제는 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol), 에칠헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 디프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol) 및 펜틸렌글라이콜(Pentylene Glycol) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 첨가제를 더 포함할 수 도 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 본 발명의 천연 항균제는 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 균에 대해 항균성을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 앞서 설명한 다양한 형태의 본 발명의 천연 항균제를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 유칼립투스 에탄올 추출물을 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제2분획물, 및 티트리 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 티트리 분획물 각각을 준비하는 단계; 상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물을 용매에 투입한 후, 교반 및 용해시킨 용액을 제조하는 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물은 1 : 1.5 ~ 3 : 6 ~ 15 중량비로 용매에 투입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 유칼립투스 제1분획물은 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계; 상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 유칼립투스 제2분획물은 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계; 상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 유칼립투스 제1분획물 및 제2분획물 제조시, 사용되는 상기 유칼립투스 추출물은 유칼립투스 잎의 건조물을 분쇄시킨 유칼립투스 분말을 준비하는 1-1단계; 상기 유칼립투스 분말을 90 ~ 97 부피% 농도의 에탄올에 첨가한 후, 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로 교반하는 1-2단계; 2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계; 1차 여과액을 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛의 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및 상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 티트리 분획물은 분말 형태의 티트리 추출물을 준비하는 1단계; 상기 티트리 추출물, 레진(resin) 및 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 티트리 추출물은 티트리 잎의 건조물을 분쇄시킨 티트리 분말을 준비하는 1-1단계; 상기 티트리 분말을 80 부피% 농도 이상의 에탄올에 첨가한 후, 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로 교반하는 1-2단계; 2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계; 1차 여과액을 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛의 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및 상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 티트리 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예로서, 상기 레진은 폴리스티렌(polystyrene) 및 다이비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합체; 및 아크릭 에스테르(acrylic ester); 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 앞서 설명한 방법으로 제조한 다양한 형태의 상기 천연 항균제를 이용한 물품에 관한 것으로서, 상기 천연 항균제는 비누, 헤어샴푸, 바디샴푸 등의 세정제, 여성청결제, 화장품 등의 물품에 항균제 성분으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 천연 항균제는 식물 유래의 천연 성분으로 구성된 항균제로서, 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스 등에 대해 항균력이 우수하면서도, 인체에 무해하고, 피부 자극이 거의 없는 바, 피부에 직접 사용되는 화장품, 세정제, 여성청결제 등에 적용이 가능한 항균제이다.
도 1a ~ 1e 각각은 실험예 3의 (1)에서 실시한 실시예 1의 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균력 측정 결과이다.
도 2a ~ 2e 각각은 실험예 3의 (2)에서 실시한 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균력 측정 결과이다.
도 3은 실험예 3의 (3)에서 실시한 미생물 아데노신3인산 방출 측정 결과로서, 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 미생물 아데노신3인산 합성 저해를 통한 항균력 측정 결과이다.
도 4는 실험예 3의 (4)에서 실시한 미생물 세포막 탈분극(depolarization) 측정 결과로서, 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 미생물 세포막 기능 억제를 통한 항균력 측정 결과이다.
도 5의 (a) ~ (e)는 실험예 4에서 실시한 천연 항균제 처리 전의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스균 각각의 주사전자현미경 측정 사진이고, 도 5의 (f) ~ (j)는 천연 항균제 처리 후의 주사전자현미경 측정 사진이다.
도 2a ~ 2e 각각은 실험예 3의 (2)에서 실시한 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균력 측정 결과이다.
도 3은 실험예 3의 (3)에서 실시한 미생물 아데노신3인산 방출 측정 결과로서, 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 미생물 아데노신3인산 합성 저해를 통한 항균력 측정 결과이다.
도 4는 실험예 3의 (4)에서 실시한 미생물 세포막 탈분극(depolarization) 측정 결과로서, 실시예 1에서 제조한 항균제(제조예 1)의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스에 대한 미생물 세포막 기능 억제를 통한 항균력 측정 결과이다.
도 5의 (a) ~ (e)는 실험예 4에서 실시한 천연 항균제 처리 전의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스균 각각의 주사전자현미경 측정 사진이고, 도 5의 (f) ~ (j)는 천연 항균제 처리 후의 주사전자현미경 측정 사진이다.
이하에서는 본 발명의 천연 항균제를 이를 제조하는 방법을 통해서 더욱 구체적으로 설명을 한다.
본 발명의 천연 항균제는 유칼립투스 에탄올 추출물을 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제1분획물; 유칼립투스 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제2분획물; 및 티트리 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 티트리 분획물;을 혼합하여 제조한다.
우선, 상기 유칼립투스 제1분획물 및/또는 유칼립투스 제2분획물의 제조에 사용되는 상기 유칼립투스 에탄올 추출물은 유칼립투스 건조물을 분쇄시킨 유칼립투스 분말을 준비하는 1-1단계; 상기 유칼립투스 분말을 에탄올에 첨가한 후, 교반하는 1-2단계; 2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계; 1차 여과액을 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및 상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조할 수 있다.
1-1단계에서 상기 유칼립투스 분말은 유칼립투스의 잎 부위를 정제수를 이용하여 깨끗이 세척하고 완전히 건조시킨 후 건조물을 분쇄기를 이용하여 40 ~ 80 mesh로 잘게 분쇄시킨 분말일 수 있다.
그리고, 1-2단계는 유칼립투스 분말로부터 추출성분을 추출하는 공정으로서, 유칼립투스 분말을 90 ~ 97 부피% 농도의 에탄올에, 바람직하게는 93 ~ 96 부피% 농도의 에탄올에 첨가한다. 이때, 에탄올의 농도가 90 부피% 농도 미만이면 충분하게 추출 성분이 추출되지 않을 수 있으며, 에탄올 농도가 97 부피%를 초과하면 높은 순도로 인한 가격 상승으로 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 유칼립투스 분말을 에탄올에 첨가한 용액을 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로, 바람직하게는 18℃ ~ 27℃ 하에서 2시간 30분 ~ 3시간 30분 동안 250 ~ 400 rpm의 교반속도로 교반을 수행하여 유칼립투스 분말로부터 추출성분을 충분하게 추출시켜서 추출용액을 얻는다.
다음으로, 1-3단계는 1-2단계에서 제조한 추출용액을 당업계에서 일반적으로 사용하는 부직포 여과지에 여과시켜서 1차적으로 추출용액에 존재하는 상대적으로 크기가 큰 이물질인 유칼립투스 분말을 제거하는 공정이다.
다음으로, 1-4단계는 1-3단계에서 1차 여과 처리한 여과액을 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 필터로 2차 여과시켜서 여과액 얻는 공정인데, 2차 여과는 PVDF 필터를 사용하는 것이 수용성과 지용성 용매에 모두 사용 가능하며 반응성이 낮다는 측면에서 유리하다. 그리고, 상기 PVDF 필터는 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛인 것을, 바람직하게는 평균입경 0.5㎛ ~ 1.5㎛인 것을 더욱 바람직하게는 0.8㎛ ~ 1.2㎛인 것을 사용하는 것이 좋다. 이때, PVDF 필터는 평균입경 0.5㎛ 미만인 것을 사용하는 것은 필터 가격이 너무 비싸져서 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있으며, 평균입경 2㎛을 초과하는 것을 사용하는 것은 추출물 내 이물질이 존재하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내의 평균직경을 갖는 PVDF 필터를 사용하는 것이 좋다.
다음으로, 1-5단계는 2차 여과시켜서 얻은 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 제조하는 단계로서, 감압 농축공정은 당업계에서 일반적인 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 40℃ ~ 60℃ 온도의 물중탕 조건에서 60 mbar ~ 100 mbar의 압력으로 감압하여 수행하는 것이 좋다. 그리고, 추출물은 상기와 같은 감압 농축공정을 통해 용매를 모두 증발시키는 방법으로 건조시켜서 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 제조할 수 있다.
상기 유칼립투스 제1분획물을 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.
상기 유칼립투스 제1분획물은 앞서 설명한 방법으로 제조하여, 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계; 상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
2단계에서 상기 레진은 물질을 분리, 정제하는 역할을 하는 것으로서, 폴리스티렌(polystyrene) 및 다이비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합체; 및 아크릭 에스테르(acrylic ester); 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 또한, 2단계의 상기 에탄올은 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올을, 바람직하게는 47 ~ 53 부피% 농도의 에탄올을, 더욱 바람직하게는 48 ~ 52 부피% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.
그리고, 2단계에서 상기 혼합물은 상기 에탄올 50㎖ ~ 80㎖에, 유칼립투스 추출물 100 중량부에 대하여, 상기 레진 700 ~ 1,250 중량부를 혼합 및 용해시켜서 제조할 수 있으며, 바람직하게는 상기 에탄올 50㎖ ~ 70㎖에, 유칼립투스 추출물 100 중량부에 대하여, 상기 레진 850 ~ 1,150 중량부를 혼합 및 용해시켜서 제조할 수 있다. 이때, 레진 사용량이 700 중량부 미만이면 분리, 정제가 완전히 이루어지지 않는 문제가 있을 수 있고, 1,250 중량부를 초과하면 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있을 수 있다.
다음으로, 3단계에서 2단계의 혼합물을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 상온, 200mbar 이하 조건 하에서 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하여 유칼립투스 제1분획물을 제조할 수 있다.
상기 유칼립투스 제2분획물을 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.
상기 유칼립투스 제2분획물은 앞서 설명한 방법으로 제조하여, 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계; 상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
2단계에서 상기 레진의 종류는 유칼립투스 제1분획물 제조공정의 2단계의 레진과 동일하다.
그리고, 2단계의 상기 에탄올은 유칼립투스 제1분획물 제조공정과 달리 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을, 바람직하게는 92 ~ 97 부피% 농도의 에탄올을, 더욱 바람직하게는 93 ~ 97 부피% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.
또한, 2단계에서 상기 혼합물은 상기 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 사용하는 것을 제외하고는 유칼립투스 제1분획물 제조공정의 2단계의 에탄올, 유칼립투스 추출물 및 레진 사용량과 동일하다.
그리고, 유칼립투스 제2분획물 제조공정의 3단계 역시 유칼립투스 제1분획물 제조공정의 3단계와 동일하다.
다음으로, 티트리 분획물을 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.
티트리 분획물은 티트리 추출물을 이용하여 제조하는데, 상기 티트리 추출물은 티트리 건조물을 분쇄시킨 티트리 분말을 준비하는 1-1단계; 상기 티트리 분말을 에탄올에 첨가한 후, 교반하는 1-2단계; 2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계; 1차 여과액을 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및 상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 티트리 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조한 것일 수 있다.
1-1단계에서 상기 티트리 분말은 티트리의 잎 부위를 정제수를 이용하여 깨끗이 세척하고 완전히 건조시킨 후 건조물을 분쇄기를 이용하여 40 ~ 80 mesh로, 바람직하게는 40 ~ 60 mehs로 잘게 분쇄시킨 분말일 수 있다.
그리고, 1-2단계는 티트리 분말로부터 추출성분을 추출하는 공정으로서, 티트리 분말을 80 부피% 이상 농도의 에탄올에, 바람직하게는 90 ~ 97 부피% 농도의 에탄올에 첨가한다. 이때, 에탄올의 농도가 80 부피% 농도 미만이면 충분하게 추출 성분이 추출되지 않을 수 있으며, 에탄올 농도가 97 부피%를 초과하면 높은 순도로 인한 가격 상승으로 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 티트리 분말을 에탄올에 첨가한 용액을 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로, 바람직하게는 18℃ ~ 27℃ 하에서 2시간 30분 ~ 3시간 30분 동안 250 ~ 400 rpm의 교반속도로 교반을 수행하여 티트리 분말로부터 추출성분을 충분하게 추출시켜서 추출용액을 얻는다.
다음으로, 1-3단계는 1-2 단계에서 제조한 추출용액을 당업계에서 일반적으로 사용하는 부직포 여과지에 여과시켜서 1차적으로 추출용액에 존재하는 상대적으로 크기가 큰 이물질인 티트리 분말을 제거하는 공정이다.
다음으로, 1-4단계는 1-3단계에서 1차 여과 처리한 여과액을 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 필터로 2차 여과시켜서 여과액 얻는 공정인데, 2차 여과는 PVDF 필터를 사용하는 것이 수용성과 지용성 용매에 모두 사용 가능하며 반응성이 낮다는 측면에서 유리하다. 그리고, 상기 PVDF 필터는 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛인 것을, 바람직하게는 평균입경 0.5㎛ ~ 1.5㎛인 것을 더욱 바람직하게는 0.8㎛ ~ 1.2㎛인 것을 사용하는 것이 좋다. 이때, PVDF 필터는 평균입경 0.5㎛ 미만인 것을 사용하는 것은 필터 가격이 너무 비싸져서 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있으며, 평균입경 2㎛을 초과하는 것을 사용하는 것은 추출물 내 이물질이 존재하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내의 평균직경을 갖는 PVDF 필터를 사용하는 것이 좋다.
다음으로, 1-5단계는 2차 여과시켜서 얻은 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 티트리 추출물을 제조하는 단계로서, 감압 농축공정은 당업계에서 일반적인 방법으로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 40℃ ~ 60℃ 온도의 물중탕 조건에서 60 mbar ~ 100 mbar의 압력으로 감압하여 수행하는 것이 좋다. 그리고, 추출물은 상기와 같은 감압 농축공정을 통해 용매를 모두 증발시키는 방법으로 건조시켜서 분말 형태의 티트리 추출물을 제조할 수 있다.
티트리 분획물은 이러한 방법으로 제조한 티트리 추출물을 준비하는 1단계; 상기 티트리 추출물, 레진(resin) 및 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합물을 제조하는 2단계; 및 상기 혼합물을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것일 수 있다.
2단계에서 상기 레진은 물질을 분리, 정제하는 역할을 하는 것으로서, 폴리스티렌(polystyrene), 다이비닐벤젠(divinylbenzene) 및 아크릭 에스테르(acrylic ester) 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
또한, 2단계의 상기 에탄올은 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올을, 바람직하게는 47 ~ 53 부피% 농도의 에탄올을, 더욱 바람직하게는 48 ~ 52 부피% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 좋다.
그리고, 티트리 분획물 제조방법에 있어서, 2단계에서 상기 혼합물은 상기 에탄올 50㎖ ~ 80㎖에, 유칼립투스 추출물 100 중량부에 대하여, 상기 레진 650 ~ 1,400 중량부를 혼합 및 용해시켜서 제조할 수 있으며, 바람직하게는 상기 에탄올 50㎖ ~ 70㎖에, 유칼립투스 추출물 100 중량부에 대하여, 상기 레진 750 ~ 1,300 중량부를 혼합 및 용해시켜서 제조할 수 있다.
이때, 레진 사용량이 650 중량부 미만이면 분리, 정제가 완전히 이루어지지 않는 문제가 있을 수 있고, 1,400 중량부를 초과하면 경제성을 떨어뜨리는 문제가 있을 수 있다.
다음으로, 3단계에서 2단계의 혼합물을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 상온, 200 mbar 이하 조건 하에서 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하여 티트리 분획물을 제조할 수 있다.
본 발명의 천연 항균제는 앞서 설명한 방법을 각각 제조한 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 제2분획물 및 티트리 분획물 각각을 준비하는 단계; 상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물을 용매에 투입한 후, 교반 및 용해시킨 용액을 제조하는 단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
이때, 상기 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO), 부틸렌글라이콜(Buthylene Glycol), 프로필렌글라이콜(Propylene Glycol), 글리세린(glycerin) 및 정제수 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 DMSO, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 및 정제수 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물을 용매에 투입하는 비율에 따라 살균 효과에 차이가 나는데, 좀 더 구체적으로는 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물을 1 : 1.5 ~ 3 : 6 ~ 15 중량비로, 바람직하게는 1 : 1.5 ~ 2.8 : 7 ~ 12 중량비로, 더욱 바람직하게는 1 : 1.5 ~ 2.5 : 7.5 ~ 10.5 중량비로 사용하는 것이 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등 모두에 대해 가장 우수한 항균력을 가지기 때문이다.
또한, 본 발명의 천연 항균제의 구체적인 용도에 따라서 상기 용매에 상기 분획물들 외에 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol), 에칠헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 디프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol) 및 펜틸렌글라이콜(Pentylene Glycol) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 첨가제를 더 혼합할 수도 있다.
이러한, 본 발명의 천연 항균제는 다양한 균에 대한 항균력을 가지며, 구체적인 일례로 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스 중 1종 이상의 균에 대해 우수한 항균력을 가진다.
본 발명의 천연 항균제는 일반적인 항균 효능 평가 방법으로 사용되는 액체배지희석법에 의거하여 측정 시, 세균 증식을 90% 억제하는 최소억제농도(MIC90, mg/ml) 값이 대장균은 2.30 ㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 1.5 ~ 2.20 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 1.75 ~ 2.15 ㎎/㎖이다. 그리고, 녹농균의 경우, MIC90 값이 3.50 ㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 2.5 ~ 3.30 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 2.6 ~ 3.20 ㎎/㎖이다.
또한, 고초균의 경우, MIC90 값이 0.50 ㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 0.10 ~ 0.40 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.12 ~ 0.28 ㎎/㎖이다. 또한, 황색포도상구균의 경우, MIC90 값이 0.40 ㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 0.05 ~ 0.35 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 0.10 ~ 0.25 ㎎/㎖이다.
또한, 칸디다 알비칸스의 경우, MIC90 값이 5.0 ㎎/㎖ 이하, 바람직하게는 1.5 ~ 4.2 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 1.7 ~ 3.60 ㎎/㎖이다.
그리고, 이러한 본 발명의 천연 항균제는 비누, 헤어샴푸, 바디샴푸 등의 세정제, 여성청결제(feminine cleaner, 질 세정제), 화장품 등의 물품에 항균제 소재로서 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예들을 통해 설명한다. 이때, 하기 실시예들은 발명을 예시하기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
준비예 1: 유칼립투스 추출물
유칼립투스의 잎 부위를 정제수를 이용하여 깨끗이 세척하고 건조시킨 후, 건조물을 분쇄기를 이용하여 50 ~ 60 mesh로 잘게 분쇄시켜서 유칼립투스 분말을 제조하였다.
다음으로, 상기 유칼립투스 분말 500g과 추출 용매로서 95 부피% 농도 에탄올을 10L를 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300 rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 부직포 여과지를 이용하여 추출용액을 1차 여과한 뒤, 1차 여과액을 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 2차 여과하였다.
회수한 2차 여과액을 농축기를 이용하여 60℃에서 감압 농축하여 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 수득하였다.
준비예 2: 티트리 추출물
티트리의 잎 부위를 정제수를 이용하여 깨끗이 세척하고 건조시킨 후, 건조물을 분쇄기를 이용하여 50 ~ 60 mesh로 잘게 분쇄시켜서 티트리 분말을 제조하였다.
다음으로, 상기 티트리 분말 500g과 추출 용매로서 95 부피% 농도 에탄올을 10L를 혼합한 후, 교반기를 이용하여 22 ~ 23℃에서 교반속도 300 rpm으로 3시간 동안 교반하여 추출용액을 제조하였다.
다음으로 상기 추출용액을 부직포 여과지를 이용하여 추출용액을 1차 여과한 뒤, 1차 여과액을 평균입경 1㎛ PVDF 필터를 이용해 2차 여과하였다.
회수한 2차 여과액을 농축기를 이용하여 60℃에서 감압 농축하여 분말 형태의 티트리 추출물을 수득하였다.
실시예 1-1 : 유칼립투스 제1분획물 제조
준비예 1에서 제조한 유칼립투스 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 50 부피% 농도의 에탄올 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
실시예 1-2 : 유칼립투스 제2분획물 제조
준비예 1에서 제조한 유칼립투스 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 95 부피% 농도의 에탄올 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
비교예 1-1 : 유칼립투스 정제수 분획물 제조
준비예 1에서 제조한 유칼립투스 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 정제수 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
비교예 1-2 : 유칼립투스 분획물 제조
상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 유칼립투스 분획물을 제조하되, 50 부피% 농도의 에탄올 대신 42 부피% 농도의 에탄올을 사용하여 유칼립투스 분획물을 제조하여 비교예 1-2를 실시하였다.
비교예 1-3 : 유칼립투스 분획물 제조
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 유칼립투스 분획물을 제조하되, 유칼립투스 추출물 2g 및 상기 레진 12g을 사용하여 유칼립투스 분획물을 제조하여 비교예 1-3을 실시하였다.
비교예 1-4 : 유칼립투스 분획물 제조
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 유칼립투스 분획물을 제조하되, 유칼립투스 추출물 2g 및 상기 레진 26g을 사용하여 유칼립투스 분획물을 제조하여 비교예 1-4를 실시하였다.
실시예 2-1 : 티트리 분획물 제조
준비예 2에서 제조한 티트리 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 50 부피% 농도의 에탄올 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
실시예 2-2 : 티트리 분획물 제조
준비예 2에서 제조한 티트리 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 95 부피% 농도의 에탄올 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
실시예 2-3 : 티트리 분획물 제조
상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 티트리 분획물을 제조하되, 50 부피% 농도의 에탄올 대신 70 부피% 농도의 에탄올을 사용하여 티트리 분획물을 제조하여 비교예 1-2를 실시하였다.
비교예 2-1 : 티트리 정제수 분획물 제조
준비예 2에서 제조한 티트리 추출물 2g을 레진인 폴리스티렌 및 다이비닐벤젠의 중합체(Diaion 社의 HP-20) 20g과 각각 잘 섞어준 뒤, 이를 정제수 60㎖을 넣고 교반 및 용해시켜서 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 컬럼(column)에 충진시킨 후, 감압 여과하여 분획물과 레진을 분리시킨 뒤, 상등액인 분획물을 회수하였다.
실험예 1: 에탄올 추출물 및 분획물의 항균 효능 평가
상기 준비예의 추출물, 실시예 및 비교예에서 제조한 분획물에 대한 항균 효능을 확인하기 위해 항균성 검사 시험인 세균 증식 최소억제농도 측정(MIC test, broth dilution assay)를 수행하였다.
항균성 검사 시험은 각 시료를 정제수 및 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해한 뒤, 96 웰 플레이트(well plate)에 각 시료를 10 ㎎/㎖로 처리하고 단계적으로 희석(serial dilution)하였다.
그리고, 1×10 cfu/㎖의 농도로 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주를 접종하여 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃) 하에서 24시간 동안 배양한 뒤 595nm에서 흡광도를 측정하여, MIC50 및 MIC90을 측정하였다. 그리고, 측정결과를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
| 구분 | 구분 | 대장균 | 녹농균 | 고초균 | 황색포도 상구균 |
칸디다 알비칸스 |
| 준비예 1 | MIC50 | 0.49 | 0.49 | - | - | 0.96 |
| MIC90 | - | - | - | - | - | |
| 비교예 1-1 | MIC50 | 2.15 | 3.53 | - | 3.86 | - |
| MIC90 | - | - | - | 8.28 | - | |
| 비교예 1-2 | MIC50 | 1.75 | 2.12 | 1.56 | 1.84 | 5.01 |
| MIC90 | 4.86 | 5.28 | 2.37 | 2.55 | - | |
| 비교예 1-3 | MIC50 | 1.03 | 0.87 | 0.71 | 0.36 | 1.19 |
| MIC90 | 4.04 | 2.10 | 0.95 | 0.64 | 4.15 | |
| 비교예 1-4 | MIC50 | 0.35 | 0.28 | 0.44 | 0.20 | 0.54 |
| MIC90 | 3.79 | 1.72 | 0.77 | 0.32 | 3.41 | |
| 실시예 1-1 | MIC50 | 0.89 | 0.77 | 0.42 | 0.16 | 3.40 |
| MIC90 | 3.65 | 3.93 | 0.93 | 0.29 | - | |
| 실시예 1-2 | MIC50 | 0.40 | 0.25 | 0.46 | 0.17 | 0.86 |
| MIC90 | 3.98 | 1.69 | 0.83 | 0.30 | 3.79 |
| 구분 | 구분 | 대장균 | 녹농균 | 고초균 | 황색포도 상구균 |
칸디다 알비칸스 |
| 준비예 2 | MIC50 | 0.75 | 0.89 | 1.40 | 1.69 | 1.15 |
| MIC90 | 1.93 | 3.84 | 6.75 | 3.70 | - | |
| 비교예 2-1 | MIC50 | 9.55 | - | - | - | - |
| MIC90 | - | - | - | - | - | |
| 실시예 2-1 | MIC50 | 3.21 | 0.81 | 0.50 | 0.60 | - |
| MIC90 | - | - | 1.09 | 1.10 | - | |
| 실시예 2-2 | MIC50 | 0.85 | 0.58 | 0.25 | 0.15 | 1.24 |
| MIC90 | 3.58 | 2.05 | 0.45 | 0.28 | 3.69 | |
| 실시예 2-3 | MIC50 | 1.47 | 0.74 | 0.36 | 0.48 | 4.62 |
| MIC90 | 5.44 | 3.73 | 0.81 | 0.69 | 5.56 |
상기 표 1과 표 2에서 확인되는 바와 같이, 유칼립투스 에탄올 추출물(준비예 1), 티트리 에탄올 추출물(준비예 2), 유칼립투스 정제수 분획물(비교예 1) 및 티트리 정제수 분획물(비교예 2)의 경우, 항균성이 없거나 매우 떨어지는 문제가 있음을 확인할 수 있다.
이에 반해 실시예의 유칼립투스 제1분획물(실시예 1-1), 제2분획물(실시예 1-2) 및 티트리 분획물(실시예 2-2)은 전반적으로 모든 균에 대해 적절한 항균성을 보였다. 다만, 실시예 2-1의 티트리 분획물의 경우, MIC90 대장균, 녹농균 및 칸디다알비칸스에 대한 측정 결과가 좋지 않은 결과를 보였다.
제조예 1 : 천연 항균제의 제조
상기 실험예 1의 MIC 테스트 결과를 참조하여, 항균 스펙트럼이 가장 넓고 MIC90 값이 낮은 시료 3종(실시예 1-1, 실시예 1-2 및 실시예 2-2)을 선정하였다.
그리고, 이들을 하기 표 3과 같은 중량비로 혼합하여 천연 항균제를 제조하였다.
제조예 2 ~ 4 및 비교제조예 1 ~ 4
상기 제조예 1과 동일한 방법으로 천연 항균제를 제조하되, 하기 표 3의 중량비로 실시예 1-1(유칼립투스 제1분획물), 실시예 1-2(유칼립투스 제2분획물) 및 실시예 2-2 (티트리 분획물)을 혼합하여 천연 항균제를 각각 제조하여, 제조예 2 ~ 4 및 비교제조예 1 ~ 4를 실시하였다.
| 구분 | 실시예 1-1(유칼립투스 제1분획물) : 실시예 1-2(유칼립투스 제2분획물) : 실시예 2-2 (티트리 분획물) |
| 제조예 1 | 1 : 1.82 : 7.94 중량비 |
| 제조예 2 | 1 : 1.82 : 11.52 중량비 |
| 제조예 3 | 1 : 1.82 : 14.55 중량비 |
| 제조예 4 | 1 : 2.97 : 7.94 중량비 |
| 제조예 5 | 1 : 1.51 : 7.94 중량비 |
| 비교제조예 1 | 1 : 2 : 17 중량비 |
| 비교제조예 2 | 1 : 1.82 : 5.53 중량비 |
| 비교제조예 3 | 1 : 1.25 : 7.94 중량비 |
| 비교제조예 4 | 1 : 3.25 : 7.94 중량비 |
실험예 2 : 천연 항균제의 항균 효능 평가
상기 제조예 1 ~ 5 및 비교제조예 1 ~ 4에서 제조한 천연 항균제 각각을 시료로 준비하였다.
디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해한 뒤, 96 웰 플레이트(well plate)에 각 시료를 10 ㎎/㎖로 처리하고 단계적으로 희석(serial dilution)하였다. 그리고, 1× 10 cfu/㎖의 농도로 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 균주를 접종하여 25 ~ 37℃(칸디다알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃) 하에서 24시간 동안 배양한 뒤 595nm에서 흡광도를 측정하여, MIC90을 측정하였다. 그리고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
| 구분 | 대장균 | 녹농균 | 고초균 | 황색포도 상구균 |
칸디다 알비칸스 | |
| 제조예 1 | MIC90 | 2.15 | 3.16 | 0.27 | 0.24 | 3.32 |
| 제조예 2 | MIC90 | 2.19 | 3.43 | 0.24 | 0.21 | 4.15 |
| 제조예 3 | MIC90 | 2.19 | 3.28 | 0.30 | 0.18 | 4.69 |
| 제조예 4 | MIC90 | 2.16 | 3.30 | 0.35 | 0.33 | 4.04 |
| 제조예 5 | MIC90 | 2.25 | 3.24 | 0.30 | 0.25 | 3.47 |
| 비교제조예1 | MIC90 | 2.15 | 3.78 | 0.31 | 0.14 | 5.17 |
| 비교제조예2 | MIC90 | 3.11 | 3.31 | 0.66 | 0.37 | 6.43 |
| 비교제조예3 | MIC90 | 2.18 | 3.70 | 0.26 | 0.22 | 5.52 |
| 비교제조예4 | MIC90 | 3.26 | 3.75 | 0.42 | 0.30 | 6.55 |
상기 표 4의 측정결과를 살펴보면, 티트리 분획물을 15 중량비 초과하여 사용한 비교제조예 1과 티트리 분획물의 6 중량비 미만으로 사용한 비교제조예 2는 칸디다 알비칸스에 대한 MIC90 값이 높았으며, 이는 칸디다 알비칸스에 대한 항균력이 떨어짐을 의미한다. 유칼립투스 제2분획물 1.5 중량비 미만으로 사용한 비교제조예 3의 경우 녹농균에 대한 MIC90 값이 높았으며, 이는 녹농균에 대한 항균력이 떨어짐을 의미한다.
유칼립투스 제2분획물 3 중량비 초과하여 사용한 비교제조예 4의 경우 대장균과 녹농균 및 칸디다 알비칸스에 대한 MIC90 값이 높았으며, 이는 해당 균주 3종에 대한 항균력이 떨어짐을 의미한다.
실험예
3: 분획혼합물의 미생물
아데노신3인산
합성 저해, 세포막 기능 억제, 세포벽 기능 억제를 통한 항균 효능 평가
제조예 1에서 제조한 천연 항균제의 미생물 아데노신3인산 합성 저해, 세포막 기능 억제, 세포벽 기능 억제를 통한 항균 효능을 확인하였다.
(1) 생육저해 분석(Time killing assay)
균주 5종(대장균(E.coli), 녹농균(P.aeruginosa), 고초균(B. subtilis), 황색포도상구균(S. aureus) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 균주)을 배양한 뒤, 1×10 cfu/㎖의 농도로 마이크로튜브(microtube)에 상기 균주 각각을 튜브에 500㎕씩 분주하였다. 다음으로, 표 4의 제조예 1에서 얻은 균주별 MIC90 농도(표 4의 제조예 1 MIC90 값 참조)로 상기 균주가 분주된 튜브 각각에 처리한 뒤 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃) 하에서 배양하였다.
다음으로, 0시간, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간씩 배양한 후 샘플링하여 생균수를 측정하였고 그 결과는 도 1a ~ 도 1e에 균주별로 각각 나타내었다.
여기서, 대조군(control)은 분획혼합물의 용매인 DMSO를 분획혼합물과 같은 농도로 처리한 것이며, 도 1a ~ 도 1e의 분획혼합물은 제조예 1의 천연 항균제이다.
도 1a ~ 도 1e를 살펴보면, 분획혼합물을 처리하고 시간이 경과함에 따라 시험 균주의 생육이 저해됨을 확인할 수 있다.
(2) 뉴클레오타이드 방출 분석(Nucleotide leakage assay)
균주 5종(대장균 (E.coli), 녹농균 (P.aeruginosa), 고초균 (B. subtilis), 황색포도상구균(S. aureus) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 균주)을 적정 온도(칸디다 알비칸스 25℃, 고초균 30℃, 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃)에서 진탕 배양한 다음, 펠렛(pellet)을 회수한 뒤, 10mM PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 펠렛을 3회 세척하였다.
다음으로, 10mM PBS를 이용하여 균주 펠렛을 현탁하고, 5 × 10 cfu/㎖의 농도로 균주를 희석한 뒤, MIC90 농도(표 4의 제조예 1 MIC90 값 참조)로 제조예 1의 천연 항균제와 함께 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃) 하에서 8시간 동안 배양하였다.
천연 항균제와 함께 배양 중인 균주 배양액으로부터 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간대로 일정량의 배양액 샘플을 수집하여 0.22㎛ 필터로 여과한 후, TE 버퍼액(TE buffer)를 혼합하고 원심 분리하여 상층액을 제거하였다.
다음으로, 99.5 부피% 농도의 에탄올을 첨가하여 혼합한 뒤 원심 분리하여 상층액을 제거하고 남은 펠렛(pellet)을 완전히 건조시킨 후 정제수를 첨가하였다.
다음으로, 260nm에서 흡광값을 측정하였고, 그 결과를 도 2a ~ 도 2e에 나타내었다.
여기서, 대조군(control)은 분획혼합물의 용매인 DMSO를 분획혼합물과 같은 농도로 처리한 것이며, 도 2a ~ 도 2e의 분획혼합물은 제조예 1의 천연 항균제이다.
도 2a ~ 도 2e를 살펴보면, 분획혼합물을 처리하고 시간이 경과함에 따라 시험 균주의 뉴클레오타이드 방출이 증가함을 확인할 수 있다.
(3) 아데노신3인산 방출 분석(Measurement of ATP release)
균주 5종(대장균 (E.coli), 녹농균 (P.aeruginosa), 고초균 (B. subtilis), 황색포도상구균(S. aureus) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 균주)을 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃)에서 진탕 배양한 뒤, 펠렛(pellet)을 회수하였다.
균주 펠렛을 배양 배지에 현탁하여 1×106 cfu/㎖의 농도로 희석한 뒤, MIC90 농도(표 4의 제조예 1 MIC90 값 참조)로 제조예 1의 천연 항균제와 함께 상온에서 30분 동안 정치 배양하였다. 천연 항균제와 함께 배양 중인 균주 배양액으로부터 0분, 10분, 20분, 30분마다 50㎕의 샘플을 수집하여 96 웰 플레이트에 각각 분주하였다. 측정 시간대의 샘플을 수집하여 96 웰 플레이트에 분주한 직후, 50㎕의 BacTiter-Glo™ 시약으로 처리한 뒤 5분 동안 상온, 암조건에서 배양(incubation)하고 발광도(luminescence, %RLU)를 측정하였으며, 측정 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 살펴보면, 분획혼합물을 처리하고 시간이 경과함에 따라 시험 균주의 아데노신3인산 합성이 저해되는 것을 확인할 수 있다.
(4) 세포막 탈분극 분석(Membrane depolarization assay)
균주 5종(대장균 (E.coli), 녹농균 (P.aeruginosa), 고초균 (B. subtilis), 황색포도상구균(S. aureus) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 균주)을 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃)에서 진탕 배양한 뒤, 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 회수하였다.
다음으로, 1X DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 이용해 펠렛을 세척하고 1×106 cfu/㎖ 농도로 희석한 균주를 3,3-디에틸티아디카보시아닌 아이오딘(3,3-diethylthiadicarbocyanine iodide)으로 처리한 뒤, 상온(26~27℃), 암조건에서 1시간 동안 배양하였다.
다음으로, 여기에 MIC90 농도(표 4의 제조예 1 MIC90 값 참조)의 제조예 1의 천연 항균제를 각각 첨가한 뒤, 시간이 경과함에 따라 RCF(Relative corrected fluorescence)를 측정하였고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4를 살펴보면, 분획혼합물을 처리하고 시간이 경과함에 따라 시험 균주의 세포막 탈분극이 진행되는 경향을 확인할 수 있다.
실험예 4 : 천연 항균제의 미생물 세포벽 기능 억제를 통한 항균 효능 평가
제조예 1의 천연 항균제의 미생물 세포벽 기능 억제를 통한 항균 효능을 확인하였다.
(1) 주사전자현미경(Scanning electron microscopy) 관찰
균주 5종(대장균(E.coli), 녹농균(P.aeruginosa), 고초균(B. subtilis), 황색포도상구균(S. aureus) 및 칸디다 알비칸스(C. albicans) 균주)을 25 ~ 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃)에서 진탕 배양한 뒤, 원심 분리하여 펠렛(pellet) 각각을 회수하였다.
다음으로 펠렛을 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 세척한 뒤 MIC90 농도(표 4의 제조예 1 MIC90 값 참조)의 제조예 1의 천연 항균제와 함께 25 - 37℃(칸디다 알비칸스 25℃ / 고초균 30℃ / 대장균, 녹농균, 황색포도상구균 37℃) 하에서 24시간 동안 배양하였다.
배양이 완료된 배양약을 원심분리한 후 균체를 회수하여 4℃에서 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 포함하는 0.1M PB(phosphate buffer)로 24시간 동안 균체를 1차 고정시켰다.
다음으로, 고정시킨 균체를 0.05M 소디움 카코딜레이트 버퍼(sodium cacodylate buffer, pH 7.2)로 3회 세척하고 4℃에서 1% 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)를 이용하여 2시간 동안 균체를 2차 고정하였다.
다음으로, 증류수로 세척한 후 4℃에서 2시간 동안 0.5% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)가 포함된 엔 블록(en bloc)으로 염색하였다.
다음으로, 에탄올로 탈수시킨 뒤 초임계 건조기(critical point dryer)로 건조시켰다.
다음으로, 이온 스퍼터(Ion sputter)를 이용하여 건조된 균체를 금이온입자(gold ion particle)을 두께 20nm로 피막을 입힌 뒤 주사전자현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 (a), (b), (c), (d), (e) 각각은 차례대로 제조예 1의 천연 항균제 처리 전의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스 균주이다.
그리고, 도 5의 (f), (g), (h), (i), (j) 각각은 차례대로 제조예 1의 천연 항균제 처리된 후의 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스 균주이다.
도 5를 살펴보면 시험균주의 세포벽이 쪼글쪼글해지거나(Crinkle) 구멍이 나는(Puncturing) 등의 형태적으로 변화된 것을 확인할 수 있다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명의 3종의 분획물을 적정 조성비로 포함하는 천연 항생제가 대장균, 녹농균, 고초균, 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스균에 대해 매우 우수한 항균력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (16)
- 유칼립투스 에탄올 추출물을 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제1분획물;
유칼립투스 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제2분획물; 및
티트리 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 티트리 분획물;을 포함하는 혼합분획물을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항에 있어서, 상기 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 제2분획물 및 티트리 분획물을 1 : 1.5 ~ 3 : 6 ~ 15 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항에 있어서, 상기 유칼립투스 에탄올 추출물 및 티트리 에탄올 추출물은 분말 형태인 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항에 있어서, 디메틸설폭사이드(DMSO), 부틸렌글라이콜(Buthylene Glycol), 프로필렌글라이콜(Propylene Glycol), 글리세린(glycerin) 및 정제수 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항에 있어서, 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus subtilis), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 균에 대해 항균성이 있는 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항에 있어서, 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol), 에칠헥실글리세린(Ethylhexylglycerin), 디프로필렌글라이콜(Dipropylene Glycol) 및 펜틸렌글라이콜(Pentylene Glycol) 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제.
- 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 천연 항균제를 포함하는 것을 특징으로 하는 여성청결제.
- 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 천연 항균제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세정제.
- 유칼립투스 에탄올 추출물을 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제1분획물, 유칼립투스 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 유칼립투스 제2분획물, 및 티트리 에탄올 추출물을 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올로 분획시킨 티트리 분획물 각각을 준비하는 단계;
상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물을 용매에 투입한 후, 교반 및 용해시킨 용액을 제조하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유칼립투스 제1분획물, 상기 유칼립투스 제2분획물 및 상기 티트리 분획물은 1 : 1.5 ~ 3 : 6 ~ 15 중량비로 용매에 투입하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유칼립투스 제1분획물은
분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계;
상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 45 ~ 55 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계;
상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계
를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 유칼립투스 제2분획물은
분말 형태의 유칼립투스 추출물을 준비하는 1단계;
상기 유칼립투스 추출물, 레진(resin) 및 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계;
상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;
를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 티트리 분획물은
분말 형태의 티트리 추출물을 준비하는 1단계;
상기 티트리 추출물, 레진(resin) 및 90 ~ 99 부피% 농도의 에탄올을 혼합 및 교반하여 혼합액을 제조하는 2단계;
상기 혼합액을 컬럼(column)에 충전시킨 후, 감압 여과하여 분획물 및 레진을 분리시킨 후, 분획물을 회수하는 3단계;
를 포함하는 공정을 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 유칼립투스 추출물은
유칼립투스 잎의 건조물을 분쇄시킨 유칼립투스 분말을 준비하는 1-1단계;
상기 유칼립투스 분말을 90 ~ 97 부피% 농도의 에탄올에 첨가한 후, 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로 교반하는 1-2단계;
2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계;
1차 여과액을 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛의 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및
상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 유칼립투스 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제13항에 있어서, 상기 티트리 추출물은
티트리 잎의 건조물을 분쇄시킨 티트리 분말을 준비하는 1-1단계;
상기 티트리 분말을 80 부피% 농도 이상의 에탄올에 첨가한 후, 15℃ ~ 30℃ 하에서 2시간 ~ 5시간 동안 200 ~ 500 rpm의 교반속도로 교반하는 1-2단계;
2단계에서 교반시킨 용액을 부직포 여과지에 1차 여과하는 1-3단계;
1차 여과액을 평균입경 0.5㎛ ~ 2㎛의 PVDF 필터로 2차 여과시켜서 여과액을 얻는 1-4단계; 및
상기 여과액을 감압 농축 공정을 수행하여 분말 형태의 티트리 추출물을 제조하는 1-5단계;를 수행하여 제조한 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
- 제11항, 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 레진은 폴리스티렌(polystyrene) 및 다이비닐벤젠(divinylbenzene)의 중합체; 및 아크릭 에스테르(acrylic ester); 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 천연 항균제의 제조방법.
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