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KR20160114723A - 면역치료요법적 조성물, 치료 방법 및 진단 방법 - Google Patents

면역치료요법적 조성물, 치료 방법 및 진단 방법 Download PDF

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KR20160114723A KR1020167024664A KR20167024664A KR20160114723A KR 20160114723 A KR20160114723 A KR 20160114723A KR 1020167024664 A KR1020167024664 A KR 1020167024664A KR 20167024664 A KR20167024664 A KR 20167024664A KR 20160114723 A KR20160114723 A KR 20160114723A
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Abstract

IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물이 본 명세서에서 공개된다. 면역 반응을 증가시킬 필요가 있는 대상에서 이를 증가시키는 방법이 또한 공개된다. 상기 방법은 상기 면역치료요법적 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스로부터 보호할 수 있다. 인플루엔자 바이러스성 감염을 진단하는 방법이 본 명세서에서 더 공개된다.

Description

면역치료요법적 조성물, 치료 방법 및 진단 방법{IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITION, THERAPEUTIC METHOD AND DIAGNOSTIC METHOD}
본 발명은 면역치료요법적 조성물, 인플루엔자를 치료 및/또는 방지하는 방법, 그리고 인플루엔자 바이러스성 감염을 진단하는 방법에 관계한다.
특정 질환 (가령, 플루)으로부터 보호하고 및/또는 치료하기 위하여 개인에게서 면역 반응을 촉진하는데 백신이 이용된다. 매년, 수많은 개인들은 인플루엔자 바이러스에 접촉되고, 및/또는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로 사망한다. 특히, 어린이, 노인, 제기능을 못하는 면역계를 갖는 개인, 그리고 건강관리 종사자들은 인플루엔자 바이러스성 감염에 취약하며, 대개 입원을 요하고, 따라서 경제적 그리고 사회적 부담을 초래한다. 특히 지난 30년간 3가지 인플루엔자 균주들이 관심을 받아왔다. H1N1 인플루엔자 A 바이러스 아형은 흔한 인간 인플루엔자 바이러스로써 1919년 세계적으로 유행하였으며(전세계적으로 5천만 내지 1억명이 사망한 스페인 조류 인플루엔자) 및 2010에 시작하여 17,000명 이상이 사망한 유행병 신종인플루엔자 H1N1이 있다. H7N9 조류 인플루엔자 A 바이러스 아형은 2013년 중국에서 발생된 신종 인플루엔자 A 아형으로, 20명이 사망하였고, 100명이 감염되었고, 이는 신종 감염에 대해 비정상적으로 높은 비율이다. H5N1 조류 인플루엔자 A 바이러스 아형은 2006년 아시아에 처음 출현한 이후 전세계적으로 확산되었다. 가축유행성 (인간이 아닌 경우에 유행) 및 범유행성 (전세계적으로 많은 종들의 동물에게 영향을 주는)이며, 수천만 조류를 죽게 하고, 이의 확산을 위하여 수억만 다른 종의 도태를 자극한다. 2006년 6월 65회 발생과 2007년 6월 55회 발생된 것과 비교하였을 때 2008년 6월에 5개(중국, 이집트, 인도네시아, 파키스탄 및 베트남) 나라에서 H5N1이 11번 발생하였다고 보고되었다. 2013년 7월 WHO는 2003년 이후 375명이 사망에 이르게 된 총 630건의 인간 사례를 확인하였다고 발표하였다.
따라서, 인플루엔자 바이러스는 상당히 가변적이며, 따라서 이러한 가변성을 물리치고, 새로이 출몰하는 인플루엔자 바이러스 균주를 처리하기 위하여 제조업자는 인플루엔자 바이러스를 지향하는 새로운 백신 (예컨데, 인플루엔자 백신)을 개발해야 한다. 환언하면, 인플루엔자 백신 생산은 임의의 주어진 해에 집단들중에서 가장 만연될 것 같은 인플루엔자 균주(들)의 예측에 근거한다. 현재, 이들 인플루엔자 백신은 인플루엔자 바이러스를 대개 계란에서 키워서 만들고, 따라서 생식력있는 닭과 계란의 공급 그리고 인플루엔자 바이러스가 계란에서 얼마나 잘 자라느냐에 따라 생산이 제한된다. 이러한 경우, 유행에 반응하여 인플루엔자 백신 생산을 가속화시키고, 특정 인플루엔자 균주(들)을 표적으로 하도록 인플루엔자 백신을 특정 백신으로 신속하게 전환시키는 것이 어렵다.
따라서, 많은 상이한 인플루엔자 타입 A 아형들에게 적용가능하고, 이로 인하여 세계적 보호를 제공하고, 생존을 연단위로 연장시키기 위한 안전하고, 효과적인 면역치료요법적 조성물의 개발이 당분야에서 여전히 요구된다.
발명의 내용
요약
본 발명은 IL-17이 포함된 면역치료요법적 조성물에 관계한다. IL-17은 서열 번호:10 또는 서열 번호:11에 의해 인코드될 수 있다. IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다. IL-17은 핵산에 의해 인코드되며, 상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17 펩티드를 더 포함할 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 아밀로라이드, 인플루엔자 항원, 및 인터루킨으로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함할 수 있다. 상기 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, BHA 항원, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 집단에서 선택될 수 있다. 상기 인터루킨은 IL-23, IL-33, IL-21 및 이의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 약학적으로 수용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. IL-17은 IL-17 펩티드의 단량체일 수 있다. IL-17은 IL-17 펩티드의 이량체일 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대항하여 치료를 요하는 대상을 치료하는 방법에 또한 관계하는데, 이 방법은 IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 대상은 이로 인하여 다중 인플루엔자 바이러스 아형들에 대항하여 저항성이 된다. IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17 펩티드를 인코드하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 아밀로라이드, 인플루엔자 항원, 및 인터루킨으로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함할 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물의 투여는 전기천공 또는 주사를 포함할 수 있다. 상기 대상의 면역 반응은 최소한 약 4-배 증가될 수 있다. 상기 대상의 면역 반응은 최소한 약 2-배 증가될 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H5N1, H7N9, 또는 H1N1일 수 있다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H5N1일 수 있다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H7N9일 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 최소한 약 70% 생존에서 대상의 증가된 면역 반응이 제공될 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 최소한 약 100% 생존에서 대상의 증가된 면역 반응이 제공될 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스성 감염 진단을 필요로 하는 대상에서 이를 진단하는 방법에 더 관계한다. 상기 방법은 상기 대상으로부터 수득된 시료를 제공하고, 이 시료 안에 IL-17의 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 측정된 IL-17 수준을 IL-17의 역치 수준과 비교하고, 그리고 만일 측정된 IL-17 수준이 IL-17의 역치 수준보다 더 높다면, 상기 대상은 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 또한 포함할 수 있다. IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다.
상기 시료는 혈액 시료, 혈청 시료, 또는 혈장 시료일 수 있다. 상기 방법은 IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물을 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상에게 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다. 상기 방법은 약한 인플루엔자 바이러스성 감염과 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 구별하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 아형 H5N1, H1N1, 또는 H7N9일 수 있다.
도 1a는 마우스 집단 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 1b는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 1c는 마우스 집단 vs. 폐 조직에서 바이러스 부하를 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 2a는 마우스 집단 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 2b는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 2c는 마우스 집단 vs. 폐 조직에서 바이러스 부하를 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 3a는 감염후 일수 (dpi) vs. 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 감염된 마우스의 경우 체중 감소 백분율을 플롯팅한 그래프를 도 3a에 나타내고; 도 3b는 dpi vs. 0.1μg rIL-17A로 사전 처리된 그리고 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 감염된 마우스의 체중 감소 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 3c는 0.5 μg rIL-17A로 사전 처리되고, 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 감염된 마우스의 체중 감소 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 4a는 순수(
Figure pct00001
) 마우스의 폐 조직(상위 패널), 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스 (중간 패널), 그리고 0.5 μg 재조합 IL-17A (rIL-17A)로 사전-처리된 후, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스 (아래 패널)를 나타내고; 그리고 도 4b는 순수 마우스의 폐 조직 (상위 패널), 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 (중간 패널)로 시험감염된 마우스, 그리고 0.5 μg rIL-17A로 사전 처리된 후 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스 (아래 패널)의 CD8+ T 세포에 특이적인 항체의 헤마토실린 및 에오신 (H&E) 착색 및 면역조직화학을 나타낸다. 화살표는 각 조직 단편에서 폐 조직으로 침윤된 CD8+ T 세포들을 표시한다.
도 5a는 인간 대상 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 5b는 인간 대상 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 5c는 인간 대상 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 5d는 인간 대상 vs. IL-17A 혈청 수준을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 6a는 마우스 집단 vs. 사이토킨 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도6b는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 6c는 dpi vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 7a는 마우스 집단 vs. 사이토킨 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 7b는 마우스 집단 vs. 사이토킨 수준을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 7c는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 8a는 세포 타입 vs. 인터페론-감마 (IFN-γ) 생산 세포들의 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 도 8b는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 8c는 dpi vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 9a는 CD8+ T 세포를 수용 마우스 안으로 선택 전달을 위한 실험 계획을 나타내는 설명이며; 도 9b는 감염후 일수 (dpi) vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 9c는 dpi vs. 생존 백분율을 플롯팅한 그래프를 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 10a는 마우스 타입 vs. 특이적 용해 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타내고; 그리고 도 10b는 CD8+ T 세포 집단 vs. 특이적 용해 백분율을 플롯팅한 그래프를 나타낸다.
도 11a는 무스 무스쿨루스(Mus musculus ) (마우스) IL-17A의 mRNA 뉴클레오티드 서열을; 도 11b는 코딩 뉴클레오티드 서열을; 그리고 도 11c는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12a는 호모 사피엔스(Homo sapiens) (인간) IL-17A의 mRNA 뉴클레오티드 서열을; 도 12b는 코딩 뉴클레오티드 서열을; 그리고 도 12c는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 13a는 최적화된 마우스 IL-17A 뉴클레오티드 서열이며, 이때 밑줄친 서열은 BamHI 부위 (GGA TCC) 및 Kozak 서열 (GCC ACC)을 포함하고, 이중 밑줄친 서열은 시작 코돈 TGA 및 TAA 그리고 XhoI 부위 (CTC GAG)를 포함하고; 도 13b는 최적화된 마우스 IL-17A 코딩 뉴클레오티드 서열을 나타내고; 그리고 도 13c는 도 13a 및 13b의 최적화된 뉴클레오티드 서열(예컨데, 서열 번호:7 및 8)에 의해 인코드된 마우스 IL-17A 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14a는 최적화된 인간 IL-17A 뉴클레오티드 서열이며, 이때 밑줄친 서열은 BamHI 부위 (GGA TCC) 및 Kozak 서열 (GCC ACC)을 포함하고, 이중 밑줄친 서열은 시작 코돈 TGA 및 TAA 그리고 XhoI 부위 (CTC GAG)를 포함하고; 도 14b는 최적화된 인간 IL-17A 코딩 뉴클레오티드 서열을 나타내며; 그리고 도 14c는 도 14a 및 14b의 최적화된 뉴클레오티드 서열(예컨데, 서열 번호:10 및 11)에 의해 인코드된 인간 IL-17A 아미노산 서열을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 인터루킨-17 (IL-17)을 포함하는 면역치료요법적 조성물에 관계한다. 상기 면역치료요법적 조성물은 임의의 수의 인플루엔자 바이러스들, 예를 들면, 병원성 인플루엔자 A 바이러스 H5N1, H1N1, 및 H7N9로부터 보호하고, 이를 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 보호 및 치료에 의해 인플루엔자 A 바이러스, 이를 테면 H5N1, H1N1 및 H7N9에 감염된 대상의 생존을 상당히 증가시킬 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 CD8+ T 세포에 의해 생산되는 항-바이러스성 사이토킨 인터페론-γ 수준을 증가시키기 때문에 생존은 상당히 증가된다. 이들 CD8+ T 세포는 세포용해 활성을 또한 보유하고, 이는 인플루엔자 A 바이러스를 품고있는 세포를 파괴하고, 이로 인하여 체내에서 다른 세포들을 용해시키고, 다른 세포들을 기하급수적으로 감염시키는 인플루엔자 A 바이러스 입자들의 추가 생산을 막는다. 따라서, 상기 면역치료요법적 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써, 인플루엔자 바이러스성 감염을 치료 및/또는 상기 감염으로부터 보호하는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.
혈청내 IL-17 수준은 인플루엔자 바이러스 감염시 증가된다. 따라서, 본 발명은 혈청내 IL-17 수준에 근거하여 인플루엔자 바이러스성 감염을 진단할 필요가 있는 대상에게서 이를 진단하는 방법에 또한 관계한다.
1. 정의
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은 이 분야의 통상적 숙련자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌이 있는 경우 정의를 포함하는 본 문서가 조정할 것이다. 본 명세서에서 설명된 것과 유사한 또는 대등한 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 테스트에 이용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 하기에서 설명된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허 출원, 특허 및 참고자료는 이들의 전문이 참고자료에 편입된다. 본 명세서에서 공개된 재료, 방법 및 예시는 설명을 위한 것이며, 이에 국한시키고자 하는 의도는 없다.
용어 "포함하다(comprise(s))", "함유하다(include(s))", "갖는(having)", "가지다(has)", "할 수 있는(can)", "내재하다(contain(s))", 및 본 명세서에 이용된 이의 변이형태는 추가적인 행동 또는 구조의 가능성을 방해하지 않는 개방-단부 이행 구절, 용어 또는 단어를 의미한다. 단수("a", "그리고" 및 "the")는 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다. 본 명세서는 명시적으로 제시되었건 또는 아니던 간에 본 명세서에서 제시된 구체예들 또는 요소들을 "포함하는(comprising)", "구성하는(consisting of)" 그리고 "필수적으로 구성하는(consisting essentially of)" 다른 구체예들을 또한 고려한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 "어쥬번트(Adjuvant)"는 항원들의 면역원성을 강화시키기 위하여 본 명세서에서 설명된 상기 면역치료요법적 조성물에 추가되는 임의의 분자를 의미한다.
"코딩 서열" 또는 "핵산을 인코딩하는"이란 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함된 핵산(RNA 또는 DNA 분자)를 말한다. 코딩 서열은 이 핵산이 투여되는 개인 또는 포유류의 세포 안에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호가 포함된 조절 요소들에 작용가능하도록 연계된 개시 및 종료 신호를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "보체(Complement)" 또는 "상보적인(complementary)"이란 뉴클레오티드 간에 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 유사체들 간에 Watson-Crick (가령, A-T/U 및 C-G) 또는 Hoogsteen 염기쌍형성을 의미할 수 있다.
"전기천공(Electroporation)", "전기-투과성(electro-permeabilization)", 또는 "전기-역학 강화(electro-kinetic enhancement)" ("EP")는 본 명세서에서 호환사용되며, 생물-막에서 미세 경로(구멍)을 유도하기 위하여 막경유 전기장 펄스를 이용한다는 의미이며; 이들이 존재함으로써, 생물분자, 이를 테면 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온 및 물이 세포 막의 한 측면에서 다른 측면으로의 통과가 허용된다.
"단편(Fragment)" 또는 "면역원 단편(immunogenic fragment)"은 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 포유류에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열 또는 이의 일부분을 의미한다. 상기 단편들은 하기에서 제시된 단백질 단편들을 인코드하는 다양한 뉴클레오티드 서열중 최소한 하나로부터 선택된 DNA 단편들일 수 있다. 단편들은 하기에서 제시된 하나 또는 그 이상의 핵산 서열의 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 또는 최소한 95%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 단편들은 하기에서 제시한 최소한 하나의 핵산 서열의 최소한 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 30개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 40개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 50개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 60개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 70개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 80개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 90개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 100개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 150개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 200개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 300개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 350개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 400개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 450개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 500개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 550개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 600개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 650개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 700개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 750개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 800개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 850개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 900개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 최소한 950개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 또는 최소한 1000개 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, 단편 또는 면역원 단편은 포유류에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드 서열 또는 이의 일부분을 의미한다. 상기 단편들은 하기에서 제시한 다양한 아미노산 서열중 최소한 하나로부터 선택된 폴리펩티드 단편들 일 수 있다. 단편들은 하기에서 제시된 하나 또는 그 이상의 단백질의 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%, 또는 최소한 95%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 단편은 하기에서 제시한 단백질중 최소한 하나의 최소한 20개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 30개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 40개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 50개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 60개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 70개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 80개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 90개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 100개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 110개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 120개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 130개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 140개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 150개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 160개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 170개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 180개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 190개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 200개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 210개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 220개 아미노산 또는 그 이상, 최소한 230개 아미노산 또는 그 이상, 또는 최소한 240개 아미노산 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "유전적 구조(Genetic construct)"는 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 말한다. 상기 코딩 서열은 이 핵산이 투여되는 개체의 세포 안에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호가 포함된 조절 요소들에 작용가능하도록 연계된 개시 및 종료 신호를 더 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "발현가능한 형태(expressible form)"은 개별 세포 안에 존재할 때 상기 코딩 서열이 발현되도록, 단백질을 인코드하는 코딩 서열에 작용가능하도록 연계된 필수 조절 요소들이 포함된 유전자 구조체를 말한다.
2 또는 그 이상 핵산 또는 폴리펩티드 서열관련 내용에서 본 명세서에서 이용된 "동일한(Identical)" 또는 "동일성(identity)"은 해당 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 명시된 백분율을 가진다는 것을 의미한다. 상기 백분율은 두 서열을 적절하게 배열하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 정합된 위치의 숫자를 얻기 위하여 두 서열 모두에서 동일한 잔기가 있는 위치들의 수를 파악하고, 명시된 영역에서 전체 위치 수를 정합되는 위치 수로 나누고, 그리고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써, 산출될 수 있다. 두 서열의 길이가 상이한 경우 또는 배열이 어긋난 단부(staggered ends)를 만들고, 그리고 명시된 비교 영역에 오직 하나의 서열을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기들은 분모에 포함되고, 산출 분자에 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T)과 우라실 (U)은 등가인 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수작업으로 실행되거나 또는 컴퓨터 서열 알고리즘, 이를 테면 BLAST 또는 BLAST 2.0를 이용하여 실행될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "면역 반응"은 항원 도입에 반응하여 숙주의 면역계, 가령, 포유류의 면역계의 활성화를 의미한다. 상기 면역 반응은 세포 반응 또는 체액 반응 또는 이 둘 모두의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 서로 공유적으로 연계된 최소한 2개의 뉴클레오티드를 말한다. 단일 가닥의 묘사는 상보적 가닥 서열로 또한 정의된다. 따라서, 핵산은 표사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 또한 포괄한다. 핵산의 많은 변이체들은 주어진 핵산과 동일한 목적에 이용될 수 있다. 따라서, 핵산은 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체들을 또한 포괄한다. 단일 가닥은 스트린젼트 혼성화(stringent hybridization) 조건하에서 표적 서열에 혼성화될 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 스트린젼트 혼성화 조건하에서 혼성화되는 프로브를 또한 포괄한다.
핵산은 단일 가닥으로 되어 있거나 또는 이중 가닥으로 되어 있을 수 있으며, 또는 가닥으로 된 서열과 단일 가닥으로 된 서열 모두의 일부를 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA, RNA, 또는 하이브리브일 수 있고, 이때 상기 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 그리고 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포산틴, 이소시토신 및 이소구아닌이 포함된 염기의 조합을 포함할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 획득될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "작동가능하도록 연계된(Operably linked)"이란 유전자의 발현이 공간적으로 연계된 프로모터의 조절 하에 있다는 것을 말한다. 프로모터는 프로모터의 조절하에서 유전자의 5' (상류) 또는 3' (하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자의 거리는 이 프로모터와 이 프로모터가 유도된 유전자에서 이를 조절하는 유전자와의 거리와 대략 동일한 거리가 될 수 있다. 당업계에서 공지된 바와 같이, 이 거리의 변이는 프로모터 기능의 상실없이도 변화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "펩티드", "단백질", 또는 "폴리펩티드"는 아미노산들이 연계된 서열이며, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현, 활성화 또는 강화시킬 수 있는 합성 또는 자연적으로 유도된 분자를 말한다. 프로모터는 발현을 더 강화시키기 위하여 및/또는 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 말단 인헨서 또는 리프레스 요소들을 또한 포함할 수 있는데, 이는 전사 시작 부위로부터 수천 염기쌍만큼 거리에 위치될 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 식물, 곤충 및 동물이 포함된 원천으로부터 유도될 수 있다. 프로모터는 유전자의 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기에 대하여, 또는 발현이 일어날 때 발생학적 단계에 대하여 , 또는 외부 자극, 이를 테면, 생리학적 스트레스, 병인균, 금속 이온 또는 유도 물질에 반응하여, 구성적으로 또는 차등적으로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예로는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 조기(early) 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 조기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함한다.
"신호(Signal) 펩티드" 및 "리더(leader) 서열"은 본 명세서에서 호환되며, 본 명세서에서 제시된 IL-17 단백질 (및/또는 하나 또는 그 이상의 다른 항원들)의 아미노 말단에서 연계될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 신호 펩티드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 국소화를 지시한다. 본 명세서에서 이용된 신호 펩티드/리더 서열은 단백질이 생산되는 세포로부터 이 단백질의 방출을 선호적으로 가능하게 한다. 신호 펩티드/리더 서열은 세포로부터 배출될 때, 대개 성숙 단백질이라고 불리는 이 단백질의 나머지로부터 대개 절단되고, 대개 이것을 성숙 단백질이라고 한다. 신호 펩티드/리더 서열은 이 단백질의 N 말단에 연계된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "대상(Subject)"은 본 명세서에서 설명된 면역치료요법적 조성물을 이용한 치료를 원하는 또는 치료를 요하는 포유류를 의미할 수 있다. 상기 포유류는 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 또는 렛이 될 수 있다.
번 명세서에서 이용된 바와 같이, 실질적으로 동일한(Substantially identical)"이란 첫번째 아미노산 서열과 두번째 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 이상 아미노산 영역에 걸쳐 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다는 것을 의미할 수 있다. 실질적으로 동일하다는 것은 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개 또는 그 이상 뉴클레오티드 영역에 결쳐 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다는 것을 또한 의미할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이 "테스트 시료" 또는 "시료"는 관심대상의 피분석물이 포함된 및/또는 포함된 것으로 의심되는 테스트되는 생물학적 물질을 일반적으로 말한다. 생물학적 물질은 임의의 생물학적 원천으로부터 유도될 수 있다. 생물학적 물질의 예로는 대변, 전혈, 혈청, 혈장, 적혈 세포, 혈소판, 간질액, 타액, 안구 렌즈 유체, 뇌척수액, 땀, 소변, 복수, 점막, 비강유체, 가래, 활액, 복막 유체, 질 유체, 월경, 양수, 정액 또는 토양, 발효 브로스 세포 배양물, 화학적 반응 혼합물 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 테스트 시료는 생물학적 원천으로부터 수득된 것으로 바로 이용되거나 또는 상기 시료의 성질을 변형시키기 위하여 전처리후 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 전처리는 혈액으로부터 혈장을 준비하고, 점성 유체를 희석 하는 등등을 포함할 수 있다. 전처리 방법은 여과, 침전, 희석, 증류, 혼합, 농축, 간섭 성분들의 비활성화, 시약의 추가, 용해 등이 또한 관련될 수 있다. 이러한 전처리 방법이 테스트 시료에 이용된다면, 이러한 전처리 방법은 관심 대상의 피분석물이 처리안된 테스트 시료(가령, 즉, 임의의 전처리 방법(들)을 받지 않은 테스트 시료)에 있는 것과 비례하는 농도로 테스트 시료에 남아있도록 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"이란 이 질환을 방지, 억제, 억압 또는 완전하게 제거하는 것을 의미한다. 질환의 방지(preventing)는 이 질환이 개시되기 전, 동물에게 본 발명의 면역치료요법적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 억제(suppressing)은 이 질환이 유도된 후, 그러나 임상적 출현이 있기 전, 동물에게 본 발명의 면역치료요법적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 억압(reppressing)는 이 질환의 임상적 출현이 있고 난 후, 동물에게 본 발명의 면역치료요법적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
핵산에 대하여 본 발명에서 이용된 바와 같이, "변이체(variant)"는 (i) 기준이 되는 뉴클레오티드 서열의 일부분 또는 단편; (ii) 기준이 되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분의 보체; (iii) 기준이 되는 핵산 또는 이의 보체에 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 스트리젼트 조건하에서 기준이 되는 핵산, 이의 보체, 또는 이에 실질적으로 동일한 서열에 혼성화되는 서열을 의미한다.
변이체는 아미노산의 삽입, 결손, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 최소한 한 가지 생물학적 활성은 유지하는 펩티드 또는 폴리펩티드로 추가 정의될 수 있다. "생물학적 활성"의 대표적인 예로는 특이적 항체에 결합하는 능력 또는 면역 반응을 촉진시키는 능력을 포함한다. 변이체는 최소한 한 가지 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 가진 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 또한 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 가령, 하나의 아미노산을 유사한 성질(이를 테면, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체시키는 것은 전형적으로 작은 변화가 포함되는 것으로, 당업계에서 인지된다. 당분야에서 인지되는 바와 같이, 이러한 작은 변화는 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려하여 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 소수성 지수는 이 아미노산의 소수성 및 전하를 근거로 한다. 유사한 소수성 지수의 아미노산들이 치환될 수 있으면, 여전히 단백질 기능을 유지할 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, 소수성 지수 ±2 를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능이 유지되는 단백질을 야기하는 치환을 드러내는데 또한 이용될 수 있다. 펩티드 내용에서 아미노산의 친수성으로 해당 펩티드의 최대 국소 평균 친수성을 산출할 수 있으며, 이는 항원성 및 면역원성과 잘 관련된 것으로 보고된 유용한 척도다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환으로 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성이 유지되는 펩티드가 만들어질 수 있으며, 이는 당분야에서 인지하는 것이다. 아미노산의 각 친수성 값이 ±2 인 아미노산으로 치환이 실행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수와 친수성 값 모두 아미노산의 아미노산의 특정 측쇄에 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 아미노산의 관련 유사성에 의존적이며, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 성질에 의해 드러나는 것과 같이, 이들 아미노산의 측쇄에 의존적인 것으로 이해된다.
변이체는 완전한 유전자 서열 또는 이의 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 상기 핵산 서열은 유전자 서열의 전체 길이 또는 이의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전체 길이 또는 단편에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 상기 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전체 길이 또는 이의 단편에 결쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 "벡터"는 복제 원점이 함유된 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스성 벡터, 박테리오파아지, 박테리아성 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제성 염색체외 벡터일 수 있고, 선호적으로 DNA 플라스미드일 수 있다.
본 명세서에서 소수성적 범위의 언급에서, 동일한 수준의 정밀도에 의해, 이들 사이에 각각 있는 수들도 명시적으로 고려된다. 예를 들면, 6-9 범위의 경우, 6과 9에 추가하여 숫자 7과 8이 고려되며, 그리고 6.0-7.0 범위의 경우, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0 숫자들이 명시적으로 고려된다.
2. 면역치료요법적 조성물
본 명세서는 인터루킨-17 (IL-17), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합이 포함된 면역치료요법적 조성물을 제공한다. 상기 면역치료요법적 조성물는 임의의 수의 인플루엔자 바이러스로부터 보호하고, 이로 인하여 다수의 상이한 플루 기반 병인을 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 보호 및 치료는 하기에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여되지 않은 대상과 비교하였을 때, 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상의 생존(및 사망 예방)을 상당히 증가시킬 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 이 면역치료요법적 조성물이 투여되지 않은 대상의 면역 반응과 비교하였을 때, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 상당히 증가시킬 수 있고, 이로 인하여 인플루엔자 바이러스성 감염으로부터 보호 및 치료를 제공할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 CD8+ T 세포 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 증가된 CD8+ T 세포 반응에는 증가된 세포독성 CD8+ T 림프구 (CTL) 반응을 포함할 수 있다. 상기 증가된 CTL 반응에는 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 표적 세포의 항원-특이적 용해 양의 증가가 포함할 수 있다. 상기 증가된 CD8+ T 세포 반응에는 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 집단 또는 빈도의 증가가 포함될 수 있다. IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포는 감염된 세포의 세포용해 활성을 보유할 수 있고, 이로 인하여 신종 인플루엔자 A 바이러스 입자가 세포 기전에 의해 어셈블리되는 것을 막고, 그리고 감염된 세포의 용해시 다른 세포에게 기하급수적으로 감염되는 것을 막을 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 면역 반응과 비교하여, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 약 0.5-배 내지 약 15-배, 약 0.5-배 내지 약 10-배, 또는 약 0.5-배 내지 약 8-배 증가시킬 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 면역 반응과 비교하여, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 최소한 약 0.5-배, 최소한 약 1.0-배, 최소한 약 1.5-배, 최소한 약 2.0-배, 최소한 약 2.5-배, 최소한 약 3.0-배, 최소한 약 3.5-배, 최소한 약 4.0-배, 최소한 약 4.5-배, 최소한 약 5.0-배, 최소한 약 5.5-배, 최소한 약 6.0-배, 최소한 약 6.5-배, 최소한 약 7.0-배, 최소한 약 7.5-배, 최소한 약 8.0-배, 최소한 약 8.5-배, 최소한 약 9.0-배, 최소한 약 9.5-배, 최소한 약 10.0-배, 최소한 약 10.5-배, 최소한 약 11.0-배, 최소한 약 11.5-배, 최소한 약 12.0-배, 최소한 약 12.5-배, 최소한 약 13.0-배, 최소한 약 13.5-배, 최소한 약 14.0-배, 최소한 약 14.5-배, 또는 최소한 약 15.0-배 증가시킬 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 면역 반응과 비교하였을 때, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 약 50% 내지 약 1500%, 약 50% 내지 약 1000%, 또는 약 50% 내지 약 800% 증가시킬 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 면역 반응과 비교하였을 때, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 최소한 약 50%, 최소한 약 100%, 최소한 약 150%, 최소한 약 200%, 최소한 약 250%, 최소한 약 300%, 최소한 약 350%, 최소한 약 400%, 최소한 약 450%, 최소한 약 500%, 최소한 약 550%, 최소한 약 600%, 최소한 약 650%, 최소한 약 700%, 최소한 약 750%, 최소한 약 800%, 최소한 약 850%, 최소한 약 900%, 최소한 약 950%, 최소한 약 1000%, 최소한 약 1050%, 최소한 약 1100%, 최소한 약 1150%, 최소한 약 1200%, 최소한 약 1250%, 최소한 약 1300%, 최소한 약 1350%, 최소한 약 1450%, 또는 최소한 약 1500% 증가시킬 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 DNA 면역치료요법적 조성물, 펩티드 면역치료요법적 조성물, 또는 DNA 및 펩티드 조합된 면역치료요법적 조성물일 수 있다. DNA 면역치료요법적 조성물은 IL-17을 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 핵산 서열은 펩티드 결합에 의해 IL-17에 연계된 링커, 리더, 또는 테그 서열을 인코드하는 추가 서열들을 또한 포함할 수 있다. 상기 펩티드 면역치료요법적 조성물은 IL-17 펩티드, IL-17 단백질, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. DNA 및 펩티드 조합된 면역치료요법적 조성물은 상기에서 설명된 IL-17을 인코드하는 핵산 서열 및 IL-17 펩티드 또는 단백질을 포함할 수 있는데, 이때 상기 IL-17 펩티드 또는 단백질과 인코드된 IL-17은 동일한 아미노산 서열을 보유한다.
상기 면역치료요법적 조성물은 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함할 수 있는데, 예를 들면, 작은 분자 (가령, 아밀로라이드), 인플루엔자 바이러스 폴리뉴클레오티드, 인플루엔자 바이러스 펩티드, IL-17 이외의 사이토킨을 인코딩하는 핵산, 그리고 IL-17 펩티드이외의 사이토킨 펩티드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 이들 하나 또는 그 이상의 다른 항원들은 하기에서 설명된다. 하나 또는 그 이상의 다른 항원들은 상기에서 설명된 DNA, 펩티드, 또는 DNA와 펩티드의 조합 면역치료요법적 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 면역치료요법적 조성물은 효과적인 면역치료요법적 조성물이 되기 위하여 요구되는 성질을 가질 수 있는데, 이를 테면 안전하여, 상기 면역치료요법적 조성물 자체가 질환 또는 사망의 원인이 아니며; 살아있는 병원균, 이를 테면 바이러스 또는 박테리아에 노출로 인한 질환으로부터 보호하고; 세포 감염을 방지하기 위하여 중화 항체를 유도하고; 세포내 병인균에 대항하여 보호성 T 세포를 유도하고; 그리고 용이한 투여를 제공하고, 부작용이 적고, 생물학적 안정성, 및 투여 단가가 낮아야 한다.
상기 면역치료요법적 조성물은 상이한 조직, 이를 테면 근육 또는 피부에 투여될 때, 면역 반응을 더 유도할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 전기천공 또는 주사 또는 피하루 투여될 때 면역 반응을 더 유도할 수 있다.
a. IL-17
상기에서 설명된 바와 같이, 상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17, 이의 단량체, 이의 이량체, 이의 동종이량체, 이의 이종이량체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 포함한다. 상기 IL-17은 IL-17A (CTLA-8로도 공지됨), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (IL-25로도 공지됨) 및 IL-17F일 수 있다. 상기 IL-17 사이토킨은 다중 세포 유형, 예를 들면, T 헬퍼 타입 17 (Th17) 세포, 활성화된 T 세포, 및 상피 세포로부터 단리되고, 이로부터 유래될 수 있다. IL-17 사이토킨은 매우 보존된 C-말단을 갖고, 이 말단은 시스테인-매듭 폴드 구조를 보유하고, IL-17B를 제외하고, 이황화물-연계된 이량체로 배출된다. IL-17B는 비-공유 이량체로 배출된다. 동종이량체이외에, IL-17A와 IL-17F 사이에 이종이량체가 형성될 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 약 0.001 μg 내지 약 5 μg, 약 0.005 μg 내지 약 4 μg, 약 0.01 μg 내지 약 3 μg, 약 0.05 μg 내지 약 2 μg, 또는 약 0.1 μg 내지 약 1 μg의 IL-17을 포함할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 최소한 약 0.001 μg, 최소한 약 0.002 μg, 최소한 약 0.003 μg, 최소한 약 0.004 μg, 최소한 약 0.005 μg, 최소한 약 0.006 μg, 최소한 약 0.007 μg, 최소한 약 0.008 μg, 최소한 약 0.009 μg, 최소한 약 0.01 μg, 최소한 약 0.02 μg, 최소한 약 0.03 μg, 최소한 약 0.04 μg, 최소한 약 0.05 μg, 최소한 약 0.06 μg, 최소한 약 0.07 μg, 최소한 약 0.08 μg, 최소한 약 0.09 μg, 최소한 약 0.1 μg, 최소한 약 0.2 μg, 최소한 약 0.3 μg, 최소한 약 0.4 μg, 최소한 약 0.5 μg, 최소한 약 0.6 μg, 최소한 약 0.7 μg, 최소한 약 0.8 μg, 최소한 약 0.9 μg, 최소한 약 1.0 μg, 최소한 약 1.5 μg, 최소한 약 2.0 μg, 최소한 약 2.5 μg, 최소한 약 3.0 μg, 최소한 약 3.5 μg, 최소한 약 4.0 μg, 최소한 약 4.5 μg, 또는 최소한 약 5.0 μg의 IL-17을 포함할 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물의 IL-17 사이토킨은 IL-17 수용체 패밀리 구성성분들을 통하여 신호를 보내고, 이들 수용체의 활성화는 전-염증성 사이토킨, 예를 들면, 인터페론-γ(IFN-γ), IL-6, 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 생산을 유도하는 세포간 경로를 촉발시킨다. 따라서, IL-17 사이토킨의 과다발현은 자가면역 및 염증성 질환 이를 테면 천식, 류마티스관절염, 건선, 이식거부반응, 염증성 장 질환, 및 다발경화증의 발달에 기여할 수 있다.
IFN-γ는 항바이러스성, 면역조절, 및 항-종양 성질을 갖고, 다양한 생리학적 그리고 세포 반응을 만들기 위하여 여러 유전자에서 전사를 변경시킬 수 있다. IFN-γ에 의한 일부 효과는 천연 킬러 (NK) 세포 활성 촉진, 정상 세포에 의한 클라스 I MHC 분자들의 발현 증가, 대식세포에서 항원 제공 증가 및 리소좀 활성 증가, 일산화질소 합성효소 (iNOS) 유도, 그리고 세포독성 CD8+ T 세포에 대하여 세포 면역성으로 Th1 분화 촉진시키는 한편, 체액(항체) 반응에서 Th2 분화의 억제를 포함한다.
세포독성 CD8+ T 세포 (세포독성 T 림프구 (CTLs))는 바이러스 및 다른 병인균에 감염된 세포의 사멸을 유도하는 T 세포 아집단이다. 활성시, CTLs는 항원-특이적인 작동세포(effector cells)를 생산하기 위하여 클론 확장을 거친다. 작동체 CTLs는 지시받은 세포외배출 (예컨데, 탈과립) 공정을 통하여 예를 들면, 퍼포린(perforin), 그래누리신(granulysin), 및 그랜자임(granzyme)과 같은 감염된 세포 또는 표적 세포를 사멸시키는 지시받은 세포외배출 (예컨데, 탈과립) 분자들을 방출한다. 더 이상 필요하지 않을 때, 많은 작동체 CTLs는 죽지만, 일부 작동세포는 기억 세포로 남아있게 되고, 항원을 다시 만나면, 이 기억 세포들은 작동세포로 분화되어, 더욱 신속하게 면역 반응을 시작한다.
상기에서 설명된 바와 같이, 상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 면역 반응과 비교하여 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상의 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 이 증가된 면역 반응에는 증가된 CD8+ T 세포 반응이 포함될 수 있다. 증가된 CD8+ T 세포 반응에는 증가된 세포독성 CD8+ T 림프구 (CTL) 반응을 포함할 수 있다. 상기 증가된 CTL 반응에는 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 표적 세포의 항원-특이적 용해 양의 증가가 포함할 수 있다. 상기 증가된 CD8+ T 세포 반응에는 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 집단 또는 빈도의 증가가 포함될 수 있다. IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포들은 세포용해 활성을 보유할 수 있다.
다시, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ의 수준은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상의 IFN-γ 수준과 비교하였을 때, 약 0.5-배 내지 약 15-배, 약 0.5-배 내지 약 10-배, 또는 약 0.5-배 내지 약 8-배 증가될 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ 수준은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상에서 IFN-γ 수준과 비교하였을 때, 최소한 약 0.5-배, 최소한 약 1.0-배, 최소한 약 1.5-배, 최소한 약 2.0-배, 최소한 약 2.5-배, 최소한 약 3.0-배, 최소한 약 3.5-배, 최소한 약 4.0-배, 최소한 약 4.5-배, 최소한 약 5.0-배, 최소한 약 5.5-배, 최소한 약 6.0-배, 최소한 약 6.5-배, 최소한 약 7.0-배, 최소한 약 7.5-배, 최소한 약 8.0-배, 최소한 약 8.5-배, 최소한 약 9.0-배, 최소한 약 9.5-배, 최소한 약 10.0-배, 최소한 약 10.5-배, 최소한 약 11.0-배, 최소한 약 11.5-배, 최소한 약 12.0-배, 최소한 약 12.5-배, 최소한 약 13.0-배, 최소한 약 13.5-배, 최소한 약 14.0-배, 최소한 약 14.5-배, 또는 최소한 약 15.0-배 증가될 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ 수준은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상에서 IFN-γ 수준과 비교하였을 때, 약 50% 내지 약 1500%, 약 50% 내지 약 1000%, 또는 약 50% 내지 약 800% 또한 증가될 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상에서 IFN-γ 수준은 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상에서 IFN-γ 수준과 비교하였을 때, 최소한 약 50%, 최소한 약 100%, 최소한 약 150%, 최소한 약 200%, 최소한 약 250%, 최소한 약 300%, 최소한 약 350%, 최소한 약 400%, 최소한 약 450%, 최소한 약 500%, 최소한 약 550%, 최소한 약 600%, 최소한 약 650%, 최소한 약 700%, 최소한 약 750%, 최소한 약 800%, 최소한 약 850%, 최소한 약 900%, 최소한 약 950%, 최소한 약 1000%, 최소한 약 1050%, 최소한 약 1100%, 최소한 약 1150%, 최소한 약 1200%, 최소한 약 1250%, 최소한 약 1300%, 최소한 약 1350%, 최소한 약 1450%, 또는 최소한 약 1500% 증가될 수 있다.
(1) IL-17A
IL-17은 IL-17A, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. IL-17A는 단량체, 동종이량체 또는 IL-17F와의 이종이량체일 수 있다.
IL-17A는 임의의 유기체로부터 유래된 IL-17A 단백질, 예를 들면, 마우스 (Mus musculus) IL-17A 단백질 및 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) IL-17A 단백질일 수 있다. 마우스 IL-17A 단백질은 도 11c 에 나타낸 아미노산 서열(예컨데, 서열 번호:3), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 보유할 수 있다. 인간 IL-17A 단백질은 도 12c에 나타낸 아미노산 서열 (예컨데, 서열 번호:6), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합을 보유할 수 있다. 상기 IL-17A 단백질은 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 서열 요소들, 예를 들면, 면역글로블린 E (IgE) 리더 서열 (가령, 서열 번호:14), 헤마글루티닌 (HA) 테그, 및 IgE 리더 서열과 HA 테그 모두를 더 포함할 수 있다.
IL-17A를 인코드하는 핵산은 임의의 수의 유기체로부터 유래될 수 있는데, 예를 들면, 마우스 (Mus musculus) (도 11a 및 11b, 차례로 서열 번호:1과 2) 그리고 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) (도 12a 및 12b, 차례로 서열 번호:4 및 5)일 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 코돈 용도 및 대응하는 RNA 전사체에 대하여 최적화될 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 발현에 최적화된 코돈 및 RNA일 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 해독 개시 효과를 증가시키기 위하여 Kozak 서열 (가령, GCC ACC)을 포함할 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 해독 개시 효과를 증가시키기 위하여 다중 시작 코돈 (가령, TGA TAA)을 포함할 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 또한 면역글로블린 E (IgE) 리더 서열을 인코드할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산에서 IL-17A에 대하여 5'에 위치될 수 있다. 상기 IL-17A를 인코드하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코드하는 뉴클레오티드 서열 (가령, 서열 번호:13)을 또한 포함할 수 있다.
최적화된 마우스 IL-17A는 서열 번호:9를 인코드하는 핵산 서열, 서열 번호:7 (도 13a 및 13c)일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 최적화된 마우스 IL-17A는 서열 번호:7에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 최적화된 마우스 IL-17A는 서열 번호:9에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열일 수 있다.
최적화된 마우스 IL-17A는 서열 번호:9를 인코드하는 핵산 서열, 서열 번호:8 (도 13b 및 13c)일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 최적화된 마우스 IL-17A는 서열 번호:8에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
마우스 IL-17A는 서열 번호:9에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열일 수 있다.
최적화된 인간 IL-17A는 서열 번호:12를 인코드하는 핵산 서열, 서열 번호:10 (도 14a 및 14c)일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 최적화된 인간 IL-17A는 서열 번호:10에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, 최적화된 인간 IL-17A는 서열 번호:12에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열일 수 있다.
최적화된 인간 IL-17A는 서열 번호:12를 인코드하는 핵산 서열, 서열 번호:11 (도 14b 및 14c)일 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 최적화된 인간 IL-17A는 서열 번호:11에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 핵산 서열일 수 있다.
인간 IL-17A는 서열 번호:12에서 제시된 핵산 서열 전체 길이에 걸쳐 최소한 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 서열일 수 있다.
서열 번호:9 및 서열 번호:12의 면역원 단편들이 제공될 수 있다. 면역원 단편들은 서열 번호:9 및/또는 서열 번호:12의 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열, 예를 들면, 면역글로블린 리더 서열, 이를 테면 면역글로블린 E (IgE) 리더 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열이 없다.
서열 번호:9 및 12의 면역원 단편들에 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가진 단백질의 면역원 단편들이 제공될 수 있다. 이러한 단편들은 서열 번호:9 및/또는 서열 번호:12에 대하여 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 단백질의 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 단백질 서열들의 면역원 단편에 대하여 96% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 단백질 서열들의 면역원 단편에 대하여 97% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 단백질 서열들의 면역원 단편에 대하여 98% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 단백질 서열들의 면역원 단편에 대하여 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열, 예를 들면, 면역글로블린 리더 서열, 이를 테면 IgE 리더 서열을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열이 없다.
일부 구체예들은 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:10 및 서열 번호:11의 면역원 단편들에 관련된다. 면역원 단편들은 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:10, 및/또는 서열 번호:11의 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열, 예를 들면, 면역글로블린 리더 서열, 이를 테면 IgE 리더 서열을 인코드하는 서열들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열을 인코드하는 코딩 서열이 없다.
서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:10, 및 서열 번호:11의 면역원 단편들에 대하여 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열의 핵산 면역원 단편들이 제공될 수 있다. 이러한 단편들은 서열 번호:7, 서열 번호:8, 서열 번호:10, 및/또는 서열 번호:11에 대하여 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 핵산의 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 핵산 서열들의 면역원 단편에 대하여 96% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 핵산 서열들의 면역원 단편에 대하여 97% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 핵산 서열들의 면역원 단편에 대하여 98% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들은 본 명세서의 IL-17A 핵산 서열들의 면역원 단편에 대하여 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 면역원 단편들에 관련된다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열, 예를 들면, 면역글로블린 리더 서열, 이를 테면 IgE 리더 서열을 인코드하는 서열들을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 면역원 단편들은 리더 서열을 인코드하는 코딩 서열이 없다.
b. 기타 항원들
상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17과 복합된 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함할 수 있다. 상기 항원은 작은 분자, 예를 들면, 하기에서 설명된 아밀로라이드 또는 다른 인플루엔자 핵산, 단백질 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 항원은 하기에서 설명된 바와 같이, 사이토킨, 예를 들면, IL-17이외의 인터루킨일 수 있다.
상기 항원은 핵산 서열, 아미노산 서열, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 핵산 서열은 펩티드 결합에 의해 항원에 연계된 링커 또는 테그 서열들이 인코드된 추가 서열들을 또한 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다.
상기 항원은 임의의 수의 유기체들, 예를 들면, 바이러스로부터 유래된 단백질, 핵산, 또는 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있고, 그리고 상기 항원은 인플루엔자와 연합될 수 있다.
(1) 아밀로라이드 ( Amiloride )
상기 면역치료요법적 조성물은 아밀로라이드를 더 포함할 수 있다. 아밀로라이드는 다음의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00002
아밀로라이드는 세포 안으로 DNA 취입(uptake)을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 아밀로라이드는 세포 안으로 DNA 취입을 용이하게 할 수 있는 양으로 상기 면역치료요법적 조성물 안에 존재할 수 있다. 임의의 아밀로라이드 없는 동일한 면역치료요법적 조성물과 비교하였을 때, 세포에 의한 DNA 취입의 적절한 증가는 5% 이상, 25% 이상 또는 50% 이상을 포함한다.
아밀로라이드는 세포 안으로 DNA 취입을 촉진시키는데 유용한 몇 가지 기능적 유도체들을 가진다. 기능적 유도체들은 피리미딘 링(3-위치에서) 또는 트리-아민에 아미노 모이어티의 변형에 의해 형성될 수 있다. 아밀로라이드의 기능적 유도체들은 벤자밀(benzamil) 또는 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드 (EIPA)일 수 있다.
(2) 인플루엔자 항원(Influenza Antigen)
상기 면역치료요법적 조성물은 인플루엔자 항원 또는 이의 단편, 또는 이의 변이체를 더 포함할 수 있다. 상기 인플루엔자 항원들은 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 혈청형에 대항하여 포유류에서 면역반응을 유도할 수 있는 것들이다. 상기 항원은 전장의 해독 산물 HA0, 소단위 HA1, 소단위 HA2, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 인플루엔자 항원은 임의의 인플루엔자 A 아형, 이를 테면 H7N9, H1N1, H5N1 아형에 의해 단리된 전장 펩티드 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다중 균주로부터 유도된 콘센수스 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H2의 다중 균주로부터 유도된 콘센수스 서열, 인플루엔자 A 혈청형 H1의 다중 균주로부터 유도된 콘센수스 서열 또는 인플루엔자 B의 다중 균주로부터 유도된 콘센수스 서열의 2개 상이한 서열의 일부분이 포함된 하이브리드 서열일 수 있다. 상기 인플루엔자 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B로부터 유래될 수 있다.
상기 인플루엔자 항원은 면역 반응이 유도될 수 있는 특정 인플루엔자 면역원에 대항하여 효과적인 최소한 하나의 항원성 에피토프를 또한 포함할 수 있다. 상기 항원은 고유 인플루엔자 바이러스에 존재하는 면역원 부위와 에피토프 전체 레퍼토리를 제공할 수 있다. 상기 항원은 하나의 혈청형의 다수 인플루엔자 A 바이러스 균주, 이를 테면, 혈청형 H1 혈청형 H2, 혈청형 H1N1, 혈청형 H7N9, 및/또는 혈청형 H7N1의 다수 인플루엔자 A 바이러스 균주의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유도될 수 있는 콘센수스 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 상기 항원은 상이한 2개의 콘센수스 헤마글루티닌 항원 서열 또는 이의 일부분의 복합으로부터 유도될 수 있는 하이브리드 콘센수스 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다. 상이한 2개의 각 콘센수스 헤마글루티닌 항원 서열은 하나의 혈청형의 인플루엔자 A 바이러스 균주 다수, 이를 테면, 혈청형 H1의 다수 인플루엔자 A 바이러스 균주의 상이한 세트로부터 유도될 수 있다. 상기 항원은 다수의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 헤마글루티닌 항원 서열로부터 유도될 수 있는 콘센수스 헤마글루티닌 항원 서열일 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, 또는 BHA 항원일 수 있다. 대안으로, 인플루엔자 항원은 콘센수스 H1 아미노산 서열 또는 콘센수스 H2 아미노산 서열을 포함하는 콘센수스 헤마글루티닌 항원일 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 각각 서로 상이한 서열로부터 유도된 상이한 2개의 콘센수스 H1 서열의 일부를 포함하는 합성 하이브리드 콘센수스 H1 서열일 수 있다. 합성 하이브리드 콘센수스 H1 단백질인 콘센수스 HA 항원의 예로는 U2 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 인플루엔자 B 균주의 헤마글루티닌 서열로부터 유도된 콘센수스 헤마글루티닌 단백질, 이를 테면 콘센수스 BHA 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.
상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 하나 또는 그 이상의 추가 아미노산 서열 요소들을 더 포함할 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 이의 N-말단에 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 용이하게 이용가능한 항체들에의해 탐지될 수 있는 독특한 면역원 에피토프인 면역원 테그를 더 포함할 수 있다. 이러한 면역원 테그의 예로는 콘센수스 헤마글루티닌 C 말단에서 연계될 수 있는 9개 아미노산 인플루엔자 HA 테그(Tag)가 있다. 일부 구체예들에 있어서, 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 이의 N-말단에 IgE 또는 IgG 리더 아미노산 서열을 더 포함하고, 이의 C 말단에 HA 테그를 더 포함할 수 있다.
상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 콘센수스 인플루엔자 아미노산 서열 또는 이의 단편들과 이의 변이체들로 구성된 콘센수스 헤마글루티닌 단백질일 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 항원은 비-인플루엔자 단백질 서열 및 인플루엔자 단백질 서열 또는 이의 단편들과 이의 변이체들을 포함하는 콘센수스 헤마글루티닌 단백질일 수 있다.
콘센수스 H1 단백질의 예로는 콘센수스 H1 아미노산 서열로 구성된 것들 또는 추가 요소들, 이를 테면 IgE 리더 서열, 또는 HA 테그 또는 IgE 리더 서열과 HA 테그 모두를 더 포함하는 것들이 포함된다.
콘센수스 H2 단백질의 예로는 콘센수스 H2 아미노산 서열로 구성된 것들 또는 이를 테면 IgE 리더 서열, 또는 HA 테그 또는 IgE 리더 서열과 HA 테그 모두를 더 포함하는 것들이 포함된다.
하이브리드 콘센수스 H1 단백질의 예로는 콘센수스 U2 아미노산 서열로 구성된 것들 또는 이를 테면 IgE 리더 서열, 또는 HA 테그 또는 IgE 리더 서열과 HA 테그 모두를 더 포함하는 것들이 포함된다.
하이브리드 콘센수스 인플루엔자 B 헤마글루티닌 단백질의 예로는 콘센수스 BHA 아미노산 서열로 구성된 것들을 포함하거나, 또는 이것은 IgE 리더 서열, 또는 HA 테그 또는 IgE 리더 서열과 HA 테그 모두를 포함할 수 있다.
상기 콘센수스 헤마글루티닌 단백질은 콘센수스 헤마글루티닌 핵산, 이의 변이체 또는 이의 단편에 의해 인코드될 수 있다. 상이한 균주 및 변이체의 다수의 상이한 헤마글루티닌 서열로부터 유도된 콘센수스 서열인 콘센수스 헤마글루티닌 단백질과 달리, 콘센수스 헤마글루티닌 핵산은 콘센수스 단백질 서열을 인코드하는 핵산 서열을 말하며, 그리고 이용된 코딩 서열은 콘센수스 헤마글루티닌 단백질 서열이 유도된 다수의 상이한 헤마글루티닌 서열에서 특정 아미노산 서열을 인코드하는데 이용된 것들과 상이할 수 있다. 상기 콘센수스 핵산 서열은 코돈 최적화된 및/또는 RNA 최적화된 것일 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 핵산 서열은 5' 해독안된 영역안에 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 핵산 서열은 리더 서열을 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. N 말단 리더 서열의 코딩 서열은 헤마글루티닌 코딩 서열의 5'이다. N-말단 리더는 배출을 용이하게 할 수 있다. N-말단 리더는 IgE 리더 또는 IgG 리더일 수 있다. 상기 콘센수스 헤마글루티닌 핵산 서열은 면역원 테그를 인코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 면역원 테그는 단백질의 C 말단에 있을 수 있고, 이를 인코드하는 서열은 HA 코딩 서열의 3'이다. 상기 면역원 테그는 용이하게 이용가능한 항체를 위한 독특한 에피토프를 제공하며, 이로 인하여 이러한 항체는 이 단백질을 탐지하고, 이의 발현을 확인하는 분석에 이용될 수 있다. 상기 면역원 테그는 상기 단백질의 C-말단에 HA 테그일 수 있다.
(3) 인터루킨( Interleukin )
상기 면역치료요법적 조성물은 인터루킨 또는 다른 인터루킨 및 또는 IL-17 이외의 사이토킨과의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 인터루킨은 IL-23, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 인터루킨은 또한 IL-33, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 상기 인터루킨은 IL-21, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다.
c. 벡터
상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17을 인코드하는 핵산이 포함된 하나 또는 그 이상의 벡터를 포함할 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 항원들을 더 포함할 수 있다. 상기 하나 또는 그 이상의 벡터는 IL-17을 발현시킬 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 항원들을 더 포함할 수 있다. 상기 벡터는 복제 원점이 포함된 핵산 서열을 가질 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드, 박테리오파아지, 박테리아 인위적 염색체 또는 효모 인위적 염색체일 수 있다. 상기 벡터는 자가-복제 엑스트라 염색체 벡터이거나 또는 숙주 게놈 안에 통합되는 벡터일 수 있다.
상기 하나 또는 그 이상의 벡터는 발현 구조체일 수 있으며, 상기 벡터는 발현 구조체일 수 있으며, 이 구조체는 일반적으로 플라스미드이며 표적 세포 안으로 특정 유전자를 도입시킬 때 이용된다. 상기 발현 벡터가 일단 세포 내부에 있으며, 유전자에 의해 인코드된 단백질은 세포성-전사 및 해독 기전 리보좀 복합체에 의해 생성된다. 상기 플라스미드는 인헨서(enhancer) 및 프로모터(promoter) 영역으로 작용하는 조절 서열을 포함하여, 상기 발현 벡터 상에 운반되는 유전자의 효과적인 전사를 유도하는 조절 서열들이 포함되도록 흔히 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정적인 메신져 RNA를 발현시키고, 따라서 단백질을 발현시킨다.
상기 벡터는 발현 시그날, 이를 테면 강력한 프로모터, 강력한 종료 코돈, 상기 프로모터와 클론된 유전자 간의 거리 조정, 그리고 전사 종료 서열 및 PTIS (이동가능한 해독 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.
(1) 발현 벡터
상기 벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산 백신일 수 있다. 상기 원형 플라스미드와 선형 핵산은 적절한 대상 세포 안에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 항원-인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연계된 프로모터를 가질 수 있으며, 이는 종료 시그날에 작용가능하도록 연계될 수 있다. 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 해독에 요구되는 서열들을 또한 포함할 수 있다. 관심 대상의 뉴클레오티드 서열이 포함된 백터는 키메라(chimeric)일 수 있으며, 이는 성분들중 최소한 하나는 이의 다른 성분들중 최소한 하나에 대하여 이종(heterologous)임을 의미한다. 발현 카세트 안에 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터의 조절하에, 또는 숙주 세포가 일부 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성(inducible)의 조절 하에 있을 수 있다. 다중세포 유기체의 경우에, 상기 프로모터는 특정 조직 또는 장기 또는 발생 단계에 또한 특이적일 수 있다.
(2) 원형 및 선형 벡터
상기 벡터는 원형 플라스미드일 수 있는데, 이는 세포성 게놈 안으로 통합됨으로써 표적 세포를 변형시킬 수 있거나, 또는 염색체외적으로 (이를 테면, 복제 원점과 함께 자가 복제가능한 플라스미드) 존재할 수 있다.
상기 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 항원을 인코딩하는 DNA를 발현시키고, 세포에 의해 상기 서열을 면역계에 의해 인지되는 항원으로 해독할 수 있도록 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 또한 제공되는데, 이것은 전기천공을 통하여 개체에게 효과적으로 운반될 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 바람직한 단백질, 펩티드 및/또는 항원들을 발현시킬 수 있다. 상기 LEC는 임의의 포스페이트 기본골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 인코드된 IL-17를 인코드할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 항원을 더 포함할 수 있다. 상기 LEC는 프로모터, 인트론, 중지 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. IL-17의 발현은 프로모터에 의해 조절될 수 있으며, 이 프로모터는 하나 또는 그 이상 항원들의 발현을 더 조절할 수 있다. 상기 LEC는 임의의 항생제 저항성 유전자들 및/또는 포스페이트 기본골격을 포함하지 않을 수 있다. 상기 LEC는 바람직한 IL-17 유전자 발현과 무관한 다른 핵산 서열들을 포함하지 않을 수 있고, 상기 LEC는 하나 또는 그 이상의 항원들과 무관한 다른 핵산 서열을 더 포함하지 않을 수 있다.
상기 LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유도될 수 있다. 상기 플라스미드는 항원을 발현시킬 수 있다. 상기 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 IL-17을 인코드하는 DNA를 발현시킬 수 있는 임의의 다른 벡터일 수 있고, 세포가 상기 서열을 IL-17로 해독되도록 할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항원과, 면역계에 의해 인지되는 임의의 하나 또는 그 이상의 항원을 더 포함할 수 있다.
상기 LEC는 pcrM2일 수 있다. 상기 LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR는 차례로 pNP (Puerto Rico/34) 및 pM2 (New Caledonia/99)로부터 유도될 수 있다.
(3) 프로모터, 인트론 , 중지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날
상기 벡터는 프로모터를 보유할 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 이끌고, 그리고 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리메라제를 통하여 전사에 요구되는 시스-작용(cis-acting) 서열 요소이며, 본 명세서에서 설명된 IL-17 서열을 전사시키고, 그리고 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 항원 서열을 더 전사시킬 수 있다. 이종성 핵산의 발현을 지시하는데 이용된 프로모터의 선택은 특정 용도에 의존적이다. 상기 프로모터는 벡터의 자연적 환경에서 이 벡터의 전사 시작 부위에 있는 거리와 대략 동일한 거리의 전사 시작으로부터 위치될 수 있다. 그러나, 프로모터 기능의 상실없이도 이 거리에 변화가 있을 수 있다.
상기 프로모터는 항원과 이 전사체(transcript)의 효과적인 폴리아데릴화, 리보솜 결합 부위, 및 해독 종료에 요구되는 시그날이 인코드된 핵산 서열에 작용가능하도록 연계될 수 있다. 상기 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기(early) 프로모터, SV40 후기(later) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포 안에서 발현에 효과를 보인 또다른 프로모터일 수 있다.
상기 벡터는 기능을 하는 접합(splice) 공여(donor) 부위 및 수용(acceptor) 부위와 함께, 인헨서와 인트론을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 효과적인 종료를 제공하는 구조 유전자의 하류에 전사 종료 영역을 포함할 수 있다. 상기 종료 영역은 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 획득될 수 있거나, 또는 상이한 유전자들로부터 획득될 수 있다.
d. 면역치료요법 조성물의 부형제 및 다른 성분들
상기 면역치료요법적 조성물은 약학적으로 수용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 비이클(vehicles), 어쥬번트, 운반체, 또는 희석제로써 기능을 하는 분자들일 수 있다. 상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 표면 활성 물질, 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A가 포함된 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체들, 소낭 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온, 또는 나노입자을 포함하는 형질감염 촉진(facilitating) 물질, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질일 수 있다.
상기 형질감염 촉진 물질은 폴리음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 폴리양이온, 또는 지질이다. 상기 형질감염 촉진 물질은 폴리-L-글루타메이트이며, 폴리-L-글루타메이트는 상기 면역치료요법적 조성물 안에 6 mg/ml 미만의 농도로 존재할 수 있다. 상기 형질감염 촉진 물질은 표면 활성 물질, 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A가 포함된 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체들 및 소낭 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 또한 포함할 수 있으며, 그리고 히알루론산은 이 유전자 구조체와 병용하여 또한 투여될 수 있다. DNA 플라스미드 면역치료요법적 조성물은 형질감염 촉진 물질, 이를 테면 지질, 레시틴 리포좀 또는 당분야에 공지된 다른 리포좀이 포함된 리포좀, 가령 DNA-리포좀 혼합물 (예를 들면 W09324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질을 또한 포함할 수 있다. 상기 형질감염 촉진 물질은 폴리음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 폴리양이온, 또는 지질이다. 상기 면역치료요법적 조성물 안에 상기 형질감염 물질의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트일 수 있다. 상기 어주번트은 대체 플라스미드에서 발현되는 다른 유전자이거나, 또는 상기 면역치료요법적 조성물 안에 플라스미드와 복합된 단백질로 운반되는 다른 유전자일 수 있다. 상기 어주번트는 α-인터페론(IFN- α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모킨 (CTACK), 표피 흉선-발현된 케모킨 (TECK), 점막-연합된 표피 케모킨 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 시그날 서열이 결손되고, 임의선택적으로 IgE의 시그날 펩티드가 포함된 IL-15를 포함하는 CD86으로 구성된 집단에서 선택될 수 있다. 상기 어주번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 복합일 수 있다.
유용한 어쥬번트가 될 수 있는 다른 유전자들은 다음을 인코딩하는 것들을 포함한다: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이형태, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 맥관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자들, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능을 하는 단편들.
상기 면역치료요법적 조성물은 1994년 4월 1일자로 제출된 U.S. 일련번호 021,579에서 설명된 유전적 면역치료요법적 조성물 촉진자를 더 포함할 수 있으며, 상기 출원은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
상기 면역치료요법적 조성물은 이용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 면역치료요법적 조성물 약학 조성물은 멸균된, 발열원이 없고, 미립자도 없을 것이다. 등장성 제제 또는 용액이 이용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 상기 등장성 용액은 포스페이트 완충된 염수를 포함할 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 젤라틴 및 알부민이 포함된 안정화제를 더 포함할 수 있다. LGS 또는 폴리양이온 또는 폴리음이온이 포함된, 상기 안정화제는 이 제제가 실온 또한 주변 온도에서 장시간 동안 안정하도록 할 수 있다.
3. 진단 방법
본 발명은 인플루엔자 바이러스성 감염 진단을 필요로 하는 대상에서 이를 진단하는 방법에 또한 관계한다. 상기 방법은 상기 대상으로부터 획득된 시료를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 상기 시료는 혈액 시료, 혈장 시료, 또는 혈청 시료일 수 있다. 상기 방법은 상기 시료 안에 IL-17 수준을 측정하고, 측정된 IL-17 수준을 정상적인 건강한 대상의 IL-17의 역치 수준과 비교하는 것을 또한 포함할 수 있다. 정상적인 건강한 대상은 약 50 pg/mL 미만의 IL-17 수준과 연관될 수 있다. 50 pg/mL은 정상적인 건강한 대상과 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상을 구별지을 수 있는 임계치 수준이 될 수 있으며, 이때 정상적인 건강한 대상은 약 50 pg/mL 미만의 IL-17 수준과 연관되고, 상기 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상은 약 50 pg/mL 이상의 IL-17 수준과 연관될 수 있다.
상기 방법은 측정된 IL-17 수준이 정상적인 건강한 대상의 IL-17의 역치 수준 이상이라면 이 대상은 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것을 더 포함할 수 있다. 정상적인 건강한 대상은 약 50 pg/mL 미만의 IL-17 수준과 연관될 수 있다. 측정된 IL-17 수준이 약 50 pg/mL이상이면, 대상이 인플루엔자 바이러스에 감염된 것이다. 측정된 IL-17 수준이 약 50 pg/mL 미만이라면, 상기 대상은 인플루엔자 바이러스에 감염되지 않았다. 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상은 상기 면역치료요법적 조성물의 투여에 의해 치료될 수 있다. 약 50 pg/mL 이상인 IL-17 수준을 가진 대상은 상기 면역치료요법적 조성물을 투여하여 치료할 수 있다.
상기 방법은 약한 인플루엔자 바이러스성 감염과 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 구별하는 것을 더 포함할 수 있다. 약한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상은 약 50 pg/mL 이상 또는 약 500 pg/mL이상의 IL-17 수준과 연관될 수 있다. 약한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상은 약 500 pg/mL이상의 IL-17 수준과 연관될 수 있다. 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상은 약 50 pg/mL 이상 또는 그러나 약 500 pg/mL미만의 IL-17 수준과 연관될 수 있다. 환언하면, 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상은 약 50 pg/mL 내지 500 pg/mL 사이의 IL-17 수준과 연관될 수 있다.
약한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료는 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료와 비교하여 더 높은 IL-17 수준을 가질 수 있다. 상기 약한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료는 상기 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료와 비교하였을 때, 최소한 약 0.2-배, 최소한 약 0.3-배, 최소한 약 0.4-배, 최소한 약 0.5-배, 최소한 약 0.6-배, 최소한 약 0.7-배, 최소한 약 0.8-배 , 최소한 약 0.9-배, 최소한 약 1.0-배, 최소한 약 1.1-배, 최소한 약 1.2-배, 최소한 약 1.3-배, 최소한 약 1.4-배, 최소한 약 1.5-배, 최소한 약 1.6-배, 최소한 약 1.7-배, 최소한 약 1.8-배, 최소한 약 1.9 폴드, 최소한 약 2.0-배, 최소한 약 2.1-배, 최소한 약 2.2-배, 최소한 약 2.3-배, 최소한 약 2.4-배, 최소한 약 2.5-배, 최소한 약 2.6-배, 최소한 약 2.7-배, 최소한 약 2.8-배, 최소한 약 2.9-배, 최소한 약 3.0-배, 최소한 약 3.1-배, 최소한 약 3.2-배, 최소한 약 3.3-배, 최소한 약 3.4-배, 최소한 약 3.5-배, 최소한 약 3.6-배, 최소한 약 3.7-배, 최소한 약 3.8-배, 최소한 약 3.9-배 또는 최소한 약 4.0-배 더 높은 IL-17 수준을 가질 수 있다. 상기 약한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료는 상기 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 가진 대상에서 얻은 시료와 비교하였을 때, 최소한 약 2.0-배 더 높은 IL-17 수준을 가질 수 있다.
4. 치료 및/또는 예방 방법
본 발명은 상기 면역치료요법적 조성물을 대상에게 투여함으로써 대상에게서 인플루엔자에 대한 면역 반응을 증가시키는 방법에 또한 관계한다. 상기 증가된 면역 반응은 상기 대상 질환, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스성 감염으로부터 치료, 예방 및/또는 보호를 위하여 이용될 수 있다. 상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스성 감염의 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 70% 생존을 제공할 수 있다. 상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스성 감염의 최소한 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 생존을 제공할 수 있다.
상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스성 감염으로 인한 사망을 약 60% 내지 약 100%, 약 65% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 75% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 약 60% 내지 약 95%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 85%, 약 60% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 75%, 또는 약 60% 내지 약 70% 막을 수 있다. 상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스성 감염으로 인한 사망을 최소한 약 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 막을 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물 투여분량은 시간당 체중 kg 당 1 μg 내지 10 mg의 활성 성분일 수 있고, 이는 시간당 체중 kg 당 20 μg 내지 10 mg의 성분일 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일에 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 면역치료요법적 조성물 투여분량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 일 수 있다.
a. 인플루엔자 바이러스
상기 면역치료요법적 조성물이 투여된 대상은 상기에서 설명된 바와 같이, 상기 면역치료요법적 조성물이 투여안된 대상과 비교하였을 때, 증가된 면역 반응을 보유할 수 있다. 상기 증가된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스로부터 치료, 예방 및/또는 보호를 위하여 이용될 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 타입 A, B, 또는 C형 바이러스일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.
(1) 인플루엔자 A 바이러스
상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 동일한 2개의 표면 단백질, 즉, 헤마글루티닌 (H) 및 뉴라미니다제 (N)에 근거하여 아형으로 나뉜다. 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제는 각각 17개 및 10개의 상이한 아형이 존재한다. 따라서, 인플루엔자 A 바이러스는 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제의 각 아형에 의해 식별된다. 상기 인플루엔자 A 바이러스는 다수의 아형, 예를 들면, H3N2, H1N1, H5N1, 및 H7N9일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
b. 투여
상기 면역치료요법적 조성물은 약학 분야의 당업자에게 잘 공지된 표준 기술에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 투약형으로 투여되는데, 나이, 성별, 체중 및 특정 개체의 상태 그리고 투여 경로와 같은 인자들을 고려하여 의료 분야의 당업자에게 공지된 기술에 의해 투여될 수 있다. 대상은 포유류, 이를 테면 인간, 말, 소, 돼지, 염소, 고양이, 개, 렛, 또는 마우스일 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 예방적으로 또는 치료요법적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에 있어서, 상기 면역치료요법적 조성물은 면역 반응을 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료요법적 용도에서, 상기 면역치료요법적 조성물은 치료요법적 효과를 유도하는데 충분한 양으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여된다. 이를 실행하는데 적합한 양은 "치료학적으로 효과적인 투여분량"이라고 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 이를 테면, 투여되는 면역치료요법적 조성물 요법의 특정 조성물, 투여 방식, 질환의 단계 및 심각성, 환자의 전반적인 건강 상태, 그리고 처방의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
상기 면역치료요법적 조성물은 Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (U.S. 특허 5,580,859, 1996년 12월 3일자로 공고됨); Felgner (U.S. 특허 5,703,055, 1997년 12월 30일자로 공고됨); 및 Carson et al. (U.S. 특허 5,679,647, 1997년 10월 21자로 공고됨)에서 설명된 바와 같이 공지된 방법들에 의해 투여될 수 있고, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 면역치료요법적 조성물의 DNA는 입자 또는 비드로 복합되어, 예를 들면, 면역치료요법적 조성물 총(gun)을 이용하여 개체에게 투여될 수 있다. 당업자는 생리학적으로 수용가능한 화합물이 포함된, 약학적으로 수용가능한 운반체의 선택은 예를 들면, 상기 발현 벡터의 투여 경로에 의존적이라는 것을 인지할 것이다.
상기 면역치료요법적 조성물은 다양한 경로를 통하여 운반될 수 있다. 전형적인 운반 경로는 비경구 투여, 이를 테면, 피내, 근육내, 또는 피부 아래 운반을 포함한다. 다른 경로는 경구, 비강내 및 질내 경로를 포함한다. 특히, 상기 면역치료요법적 조성물의 DNA 경우, 상기 면역치료요법적 조성물은 개체의 조직의 간질 공간으로 운반될 수 있다(Felgner et al., U.S. 특허 5,580,859 및 5,703,055, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 상기 면역치료요법적 조성물은 또한 근육으로 투여될 수 있거나, 또는 피부내 또는 피부아래 주사를 통하여 투여될 수 있거나, 또는 이를 테면 이온이동법(iontophoresis)에 의해 피부를 통하여 투여될 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물의 표피 투여가 또한 이용될 수 있다. 표피 투여는 자극제에 대한 면역 반응을 촉진시키기 위하여 표피의 가장 바깥 층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하는 것을 포함할 수 있다(Carson et al., U.S. 특허 5,679,647, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다).
상기 면역치료요법적 조성물은 비강 경로를 통하여 투여될 수 있도록 또한 제형화될 수 있다. 비강 투여에 적합한 제형, 이때 운반체는 고체가 되는 제형은 예를 들면, 약 10 내지 약 500 미크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말을 포함할 수 있고, 이는 분말이 포함된 용기를 코에 가까이 대고, 이 용기로부터 비강 통로를 통하여 신속하게 흡입함으로써, 코를 통하여 흡입되는 방식으로 투여된다. 상기 제제는 비강 스프레이, 비강 점적약제가 될 수 있거나, 또는 분무기를 통하여 에어로졸 투여될 수 있다. 상기 제제는 상기 면역치료요법적 조성물의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 액체 조제물, 이를 테면, 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르(elixir)가 될 수 있다. 상기 면역치료요법적 조성물은 비경구, 피하, 진피, 근육내 또는 정맥 투여 (이를 테면, 주사가능한 투여)용 조제물, 이를 테면 멸균 현탁액 또는 에멀젼(emulsion)일 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 리포좀, 미소구(microspheres) 또는 다른 폴리머 매트릭스 안에 통합될 수 있다 (Felgner et al., U.S. Pat. No. 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있으며, 상대적으로 만들고, 투여가 용이한, 비독성의, 생리학적으로 수용가능한 그리고 대사가능한 운반체가 될 수 있다.
상기 면역치료요법적 조성물은 전기천공, 이를 테면 U.S. 특허 번호　7,664,545에서 설명된 방법에 의해 투여될 수 있고, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 전기천공은 U.S. 특허 　6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에서 설명된 방법 및/또는 기구에 의해 실행될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 전기천공은 최소한의 침습성 장치를 통하여 실행될 수 있다.
상기 최소한의 침습성 전기천공 장치 ("MID")는 상기에서 설명된 면역치료요법적 조성물 과 연합된 유체를 신체 조직으로 주사하기 위한 기구일 수 있다. 상기 장치는 속이 빈 바늘, DNA 카세트, 그리고 유체 운반 수단을 포함할 수 있고, 이때 상기 장치는 신체 조직 안으로 바늘을 찌르는 동안 DNA를 동시에 주사(예를 들면, 자동)하기 위하여 유체 운반 수단을 작동시키도록 조정된다. 바늘이 삽입되어 있는 동안 DNA 및 연합된 유체를 점진적으로 주사하는 능력은 신체 조직을 통하여 상기 유체의 더욱 고른 분포를 유도하는 장점을 가진다. 주사되는 DNA가 더 넓은 부위로 분포되기 때문에 주사 동안 겪게 되는 통증이 감소될 수 있다.
MID는 바늘의 사용 없이 조직 안으로 상기 면역치료요법적 조성물을 주사할 수 있다. MID는 상기 면역치료요법적 조성물이 조직의 표면을 뚫고, 하부 조직 및/또는 근육으로 유입될 정도의 힘을 가진 작은 기류(stram) 또는 분출(jet)에 의해 상기 면역치료요법적 조성물을 주사할 수 있다. 작은 기류(stram) 또는 분출(jet)의 힘은 순식간에 마이크로 크기의 구멍을 통하여 압착 가스, 이를 테면 이산화탄소의 평창에 의해 제공될 수 있다. 최소한의 침습성 전기천공 장치의 예, 그리고 이를 사용하는 방법은 공개된 U.S. 특허 출원 번호 20080234655; U.S. 특허 번호 6,520,950; U.S. 특허 번호 7,171,264; U.S. 특허 번호 6,208,893; U.S. 특허 번호 6,009,347; U.S. 특허 번호 6,120,493; U.S. 특허 번호 7,245,963; U.S. 특허 번호 7,328,064; 및 U.S. 특허 번호 6,763,264에서 설명되며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
상기 MID는 통증없이 조직을 뚫을 수 있는 고속 액체 분출을 만드는 주입기를 포함할 수 있다. 이러한 바늘 없는 주입기가 시판되고 있다. 본 명세서에서 이용될 수 있는 바늘없는 주입기의 예들은 U.S. 특허 번호 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에서 설명된 것들이 포함되며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
직접 또는 간접 전기적전달에 적합한 형태의 바람직한 상기 면역치료요법적 조성물은 상기 면역치료요법적 조성물이 조직 안으로 침투될 수 있도록 충분한 힘을 가지고, 이 물질의 분출 운반되도록 하기 위하여, 치료되는 조직 안으로 바늘없는 주입기를 이용하여, 통상적으로 조직 표면에 주입기를 접촉시켜 도입(이를 테면 주사)될 수 있다. 예를 들면, 치료될 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 이 물질은 이 물질이 각질층을 통하여 진피 층 또는 아래 조직 및 근육으로 침투할 수 있도록 충분한 힘을 가지고 점막 또는 피부 표면을 향하여 분사된다.
바늘없는 주입기는 모든 유형의 조직, 특히 피부 및 점막으로 면역치료요법적 조성물을 운반하는데 적합하다. 일부 구체예들에 있어서, 바늘없는 주입기를 이용하여 상기 면역치료요법적 조성물이 포함된 액체를 표면 및 개체의 피부 또는 점막으로 밀어넣는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다양한 유형의 조직의 대표적인 예들은 췌장, 후두, 비인두, 후두인두, 입인두, 입술, 목, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부 점막 조직, 난소, 혈관, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 MID는 조직을 전기천공할 수 있는 바늘 전극을 보유할 수 있다. 직사각 또는 사각 패턴으로 설정된 다수의 전극 배열 안에 다수의 전극 쌍들 간에 펄스에 의해, 전극 쌍 사이의 펄스에 개선될 결과를 제공한다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,702,359 "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes"에서 바늘 배열이 공개되는데, 이때 다수의 바늘쌍은 치료 처리 동안 펄스된다. 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된, 이 출원에서 바늘은 원형 배열로 배치되었지만, 마주하는 전극 쌍 사이에 펄스를 제공하는 연결기와 스위치를 가지고 있다. 재조합 발현 벡터를 세포로 운반하는 한 쌍의 바늘 전극이 이용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 U.S. 특허 번호 6,763,264에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 대안으로, 정상적인 주사 바늘을 닮은 단일 바늘을 가지고 DNA 및 전기천공 주사가 허용되는 단일 바늘 장치가 이용될 수 있는데, 이때 본 장치에서 이용되는 것보다 낮은 전압의 펄스를 제공하고, 따라서, 환자가 겪게 되는 전기 자극이 감소될 수 있다.
MID는 하나 또는 그 이상의 전극 배열을 포함할 수 있다. 이 배열은 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2개 또는 그 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 이 바늘은 일정한 또는 일정하지 않은 공간 배열을 가질 수 있다. 이 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치 범위일 수 있다. 이 바늘은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘들은 서로 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상의 공간으로 떨어져 있을 수 있다.
MID는 면역치료요법적 조성물과 전기 천공 펄스를 단일 단계에서 전달하는 펄스 발생기와 2개 또는 그 이상-바늘 면역치료요법적 조성물 주사기로 구성될 수 있다. 상기 펄스 발생기는 개인 컴퓨터의 플래쉬 카드 뿐만 아니라, 전기천공 및 환자 데이터의 방대한 기록 및 저장을 위하여 펄스 및 주사 매개변수의 유연한 프로그래밍을 허용할 수 있다. 펄스 발생기는 단시간에 다양한 볼트 펄스를 운반할 수 있다. 예를 들면, 펄스 발생기는 지속기간 동안 100 ms의 15 볼트 펄스 3개를 운반할 수 있다. 이러한 MID의 예가 Inovio Biomedical Corporation의 Elgen 1000 시스템이며, 이는 U.S. 특허 번호 7,328,064에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
상기 MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있고, 이는 모듈식 전극 시스템으로, 신체 또는 식물의 선택된 조직 세포 안으로 거대 분자 이를 테면, DNA를 도입시킨다. 상기 모듈식 전극 시스템은 다수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램된 정전류 펄스 콘트럴러로부터 전도성 링크를 다수의 바늘에 제공하는 전기 연결기; 그리고 전력원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 탑재된 다수의 바늘 전극을 움켜쥐고, 신체 또는 식물의 선택된 조직 세포 안으로 이를 단단하게 삽입시킬 수 있다. 그 다음 거대분자는 피하 바늘을 통하여 선택된 조직 안으로 전달된다. 프로그램된 정전류 펄스 콘트럴러가 작동되며, 정전류 전기 펄스는 다수의 바늘 전극에 제공된다. 제공된 정전류 전기적 펄스는 다수의 전극 사이에 있는 세포 안으로 거대분자의 도입을 실행한다. 정전류 펄스에 의해 조직에서 전력 소산을 제한시킴으로써, 세포의 과열로 인한 세포 사멸을 최소화시킨다. Cellectra 장치 및 시스템은 U.S. 특허 번호 7,245,963에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
상기 MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 속이 빈 바늘; 그리고 유체 운반 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있고, 이때 상기 장치는 신체 조직 안으로 바늘을 찌르는 동안 유체, 본 명세서에서 설명된 면역치료요법적 조성물을 동시에 주사(예를 들면, 자동)하기 위하여 유체 운반 수단을 작동시키도록 조정된다. 장점은 바늘이 삽입되어 있는 동안 유체를 점진적으로 주사하는 능력은 신체 조직을 통하여 상기 유체의 더욱 고른 분포를 유도하는 능력이다. 주사되는 유체 용적이 더 넓은 부위로 분포되기 때문에 주사 동안 겪게 되는 통증이 감소되는 것으로 또한 믿는다.
또한, 유체의 자동 주사는 주사되는 유체의 실제 투여분량의 자동 모니터링 및 기록을 실시한다. 이 데이터는 필요한 경우 기록 목적으로 통제장치에 의해 저장될 수 있다.
주사 속도는 선형 또는 비-선형일 수 있고, 주사는 치료되는 개체의 피부를 통하여 바늘이 삽입된 후 그리고 신체 조직에 삽입되어 있는 동안 실시될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
본 발명의 기구에 의해 유체가 주사되는 적합한 조직은 종양 조직, 피부 또는 간 조직을 포함하지만, 근육 조직일 수도 있다.
상기 장치는 바늘 삽입을 신체 조직으로 안내하는 바늘 삽입 수단을 더 포함한다. 유체 주사 속도는 바늘 삽입 속도에 의해 조절된다. 이것은 삽입 속도가 필요에 따라 주사 속도와 일치될 수 있도록 바늘 삽입 및 유체 주사가 조절될 수 있는 장점을 가진다. 이는 사용자가 이 장치의 작동을 더 용이하게 또한 만든다. 원하는 경우, 신체 조직 안으로 바늘을 자동 삽입시키는 수단이 제공될 수 있다.
사용자는 유체 주사를 언제 시작할 지 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘 끝이 근육 조직에 닿을 때 시작되며, 상기 장치는 바늘이 유체 주입이 시작될 수 있는 충분한 깊이에 도달되었을 때를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이는 상기 바늘이 바람직한 깊이에 도달(통상적으로 근육 조직이 시작되는 깊이가 될 것이다)될 때 유체 주사가 자동적으로 개시될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는 예를 들면, 사전 설정된 바늘 삽입 깊이, 이를 테면 피부 층을 통하여 바늘이 들어가는 충분한 것으로 간주되는 4 mm가 될 수 있다.
상기 감지 수단(sensing means)은 초음파 프로브(ultrasound probe)를 포함할 수 있다. 상기 감지 수단은 임피던스(impedance) 또는 저항성의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에서, 상기 수단은 신체 조직에서 바늘 깊이를 기록하지는 못하더라도 바늘이 상이한 유형의 조직으로부터 근육으로 이동될 때, 임피던스 또는 저항성의 변화를 감지하도록 적용될 수 있다. 주사가 시작되어야 하는 것을 감지하는 수단을 작동시키기 위하여, 이들 변화는 상대적으로 정확하고 간단하다. 바늘의 삽입 깊이는 필요한 경우 추가 기록될 수 있고, 이것은 바늘 삽입 깊이가 기록될 때 주사되는 유체의 용적이 결정되도록, 유체 주사를 조절하는데 이용될 수 있다.
상기 장치는 다음을 추가 포함할 수 있다: 바늘을 지지하는 베이스; 그리고 베이스를 수용하는 용기(housing), 이때 상기 베이스는 하우징에 대하여 이동가능하여, 베이스가 하우징에 대해 제 1 후방 위치에 있을 때 바늘이 하우징 안으로 들어가고, 베이스가 하우징 안에서 제 2 전방 위치에 있을 때, 바늘이 하우징 밖으로 나오게 된다. 이것은 하우징을 환자의 피부 상에 정렬시키고, 그 다음 베이스에 대하여 하우징을 움직임으로써 환자의 피부 안으로 바늘이 삽입될 수 있도록 하는 장점이 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 바늘이 피부 안에 삽입될 때 바늘의 길이를 따라 유체가 고르게 분포되도록 유체 주사 속도를 조절하는 것이 바람직하다. 상기 유체 운반 수단은 조절된 속도로 유체를 주사하도록 적용된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 상기 피스톤 구동 수단은 예를 들면 서보(servo) 모터에 의해 작동될 수 있다. 그러나, 상기 피스톤 구동 수단은 하우징에 대하여 축 방향으로 베이스를 이동시켜 작동될 수 있다. 유체 운반을 위한 대체 수단이 제공될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 예를 들면, 조절된 또는 비-조절된 속도로 유체 운반을 위하여 압축될 수 있는 닫힌 용기가 주사기 및 피스톤 시스템을 대신하여 제공될 수 있다.
상기에서 설명된 기구는 임의의 유형의 주사에 이용될 수 있다. 그러나, 전기천공 분야에서 특히 유용할 것으로 예상되며, 따라서 바늘에 전압을 제공하는 수단을 더 포함할 수 있다. 바늘이 주사 뿐만 아니라, 전기천공 동안 전극으로도 이용될 수 있도록 한다. 전기장이 유체가 주사되는 동일한 지역에 제공된다는 의미로써 특히 유익하다. 이미 주사된 유체를 가진 전극을 정확하게 배치하는 것이 매우 어렵고, 따라서 사용자는 주사된 물질과 전기장 사이에 겹침을 보증하기 위한 시도로써, 더 넓은 지역을 통하여 요구되는 것보다 더 많은 양의 유체를 주사하는 경향이 있어, 전기 천공에서 전통적으로 문제점들이 있었다. 본 발명을 이용하여, 전기장과 유체 간에 조화를 잘 이루면서, 주사된 유체의 용적과 적용되는 전기장의 크기가 감소될 수 있다.
5. 치료 키트
상기에서 설명된 바와 같이 치료 방법 및/또는 예방을 이용하여 대상을 치료하는데 이용될 수 있는 치료 키트가 본 명세서에서 제공된다. 상기 치료 키트는 상기 면역치료요법적 조성물을 포함할 수 있다. 상기 치료 키트는 상기에서 설명된 바와 같이 치료 방법 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 치료 키트는 하나 또는 그 이상의 용기, 이를 테면 바이알 또는 병을 또한 포함할 수 있으며, 각 용기는 별도 시약을 포함한다.
본 명세서에 따른 치료 키트는 본 발명의 치료 및/또는 예방 방법을 실행하기 위한 지침 및/또는 이 치료 키트를 어떻게 사용하는지에 대한 지침을 바람직하게 포함한다. 본 발명의 치료 키트에 포함된 지침은 포장 물질에 부착되어 있거나 또는 포장 삽입물로 포함될 수 있다. 지침은 일반적으로 글로 적혀있거나 인쇄 물질이지만, 이러한 것에 국한되지 않는다. 지침을 보관할 수 있고, 최종 사용자에게 소통될 수 있는 임의의 매체도 본 명세서에서 고려된다. 이러한 매체는 전자 보관 매체 (가령, 자석 디스크, 테이프, 카트릿지, 및 칩), 광학 매체 (가령, CD ROM), 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "지침"은 지침을 제공하는 인터넷 세트의 주소를 포함할 수 있다.
6. 진단 키트
상기에서 설명된 진단 방법을 실행하여 인플루엔자 바이러스성 감염을 진단할 필요가 있는 대상에서 이를 진단하는데 이용될 수 있는 진단 키트가 본 명세서에서 제공된다. 상기 진단 키트는 설명된 바와 같이 진단 방법에 이용될 수 있다. 상기 진단 키트는 하나 또는 그 이상의 용기, 이를 테면 바이알 또는 병을 또한 포함할 수 있으며, 각 용기는 별도 시약을 포함한다. 상기 진단 키트는 사용자 입장에서 바람직할 수 있는 다른 물질(들)을 더 포함할 수 있는데, 이를 테면 완충액(들), 희석제(들), 기준(들), 및/또는 본 명세서에서 설명된 진단 방법의 시료 가공, 세척 또는 임의의 다른 단계를 실행하는데 유용한 물질이 될 수 있다.
본 명세서에 따른 진단 키트는 본 발명의 진단 방법을 실행하기 위한 지침 및/또는 이 진단 키트를 어떻게 사용하는지에 대한 지침을 바람직하게 포함한다. 본 발명의 진단 키트에 포함된 지침은 포장 물질에 부착되어 있거나 또는 포장 삽입물로 포함될 수 있다. 지침은 일반적으로 글로 적혀있거나 인쇄 물질이지만, 이러한 것에 국한되지 않는다. 지침을 보관할 수 있고, 최종 사용자에게 소통될 수 있는 임의의 매체도 본 명세서에서 고려된다. 이러한 매체는 전자 보관 매체 (가령, 자석 디스크, 테이프, 카트릿지, 및 칩), 광학 매체 (가령, CD ROM), 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기에서 설명된 바와 같이, 용어 "지침"은 지침을 제공하는 인터넷 세트의 주소를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 설명되는 다수의 측면들을 보유한다.
7. 실시예들
실시예 1
IL-17A는 H5N1 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 저항성을 중개한다.
IL-17A가 생체내에서 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 대한 저항성을 중개할 수 있는지를 판단하기 위하여, 하기에서 설명된 것과 같이 C57BL/6 마우스 및 IL-17A 녹아웃(knockout) 마우스에서 H5N1 인플루엔자 A 바이러스성 감염을 검사하였다.
야생형 C57BL/6 마우스에게 바이러스의 비강 투여를 통하여 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 (A/Chicken/Henan/1/2004)로 시험감염시켰다. 대조군으로는, 야생형 C57BL/6 마우스 제 2 집단에게 비강 경로를 통하여 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 대신 인산염 완충 염수(PBS)가 투여되었다. 감염 후(dpi) 6일 차에, BDTM Cytometric Bead Array (CBA)를 이용하여 시험감염된 마우스와 대조군 마우스의 혈청 내 IL-17A 단백질 수준이 측정되었다.
도 1a에서 나타낸 것과 같이, 대조(시험감염되지 않은) 마우스와 비교하였을 때, 시험감염된 마우스에서 IL-17A 단백질 수준이 상당히 증가되었다. 도 1a의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 오차 막대는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)를 반영하며, 그리고 **p < 0.01 (비쌍체 슈트던트 t-테스트(unpaired student's t-test)). 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스는 대조군 마우스와 비교하였을 때, 약 5-배 더 높은 IL-17 A 수준을 보유하였다. 따라서, 이 데이터는 H5N1 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 반응하여 혈청내 IL-17A 수준이 증가되었다는 것을 나타낸다.
IL-17A가 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 보호를 중개하는지를 판단하기 위하여, 2개 집단 (한 집단에 n=6)의 야생형 C57BL/6 마우스는 바이러스 감염에 앞서 7일차와 2일차에 각각 0.1 μg 및 0.5 μg의 재조합 IL-17A(rIL-17A)으로 복막내(i.p.) 사전-처리되었다. rIL-17A는 마우스 IL-17A 동종이량체다. 제 3 집단 (n=6)의 야생형 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았다. 제4 집단 (n=6)의 마우스는 IL-17A 녹아웃 마우스로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 또한 받지 않았다. 상기 IL-17A 녹아웃은 C57BL/6 배경에 있다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 비강을 통하여 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염되었고, 마우스의 치사율은 바이러스에 의한 시험감염 후 16일 동안 모니터되었다.
도 1b에서 볼 수 있는 바와 같이, IL-17A 녹아웃 마우스는 치료를 받지 않은 C57BL/6 마우스보다 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염에 더 민감하였다. 도 1b의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 특히, IL-17A 녹아웃 마우스는 10 dpi에 죽었지만, 치료를 받지 않은 C57BL/6 마우스는 13 dpi에 죽었다. 대조적으로, rIL-17A에 의해 사전-치료된 C57BL/6 마우스는 투여분량-의존적 방식으로 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염으로부터 보호받았다(도 1b). 0.1 μg의 rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스는 중간수준으로 보호받았고, 16일차에 마우스의 약 70%는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염을 견뎌내었다. 0.5 μg의 rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스는 정상이었고, 16일차(예컨데, 연구 종료시점)에 마우스 100%가 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염을 견뎌었다.
바이러스성 부하가 IL-17A에 의해 제공되는 보호에 대응하는지를 판단하기 위하여, 2개 집단 (한 집단에 n=6)의 야생형 C57BL/6 마우스는 바이러스 감염에 앞서 7일차와 2일차에 각각 0.1 μg 및 0.5 μg의 재조합 IL-17A(rIL-17A)으로 복막내(i.p.) 사전-처리되었다. 제 3 집단 (n=6)의 야생형 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았다. 제4 집단 (n=6)의 마우스는 IL-17A 녹아웃 마우스로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 또한 받지 않았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 비강을 통하여 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염되었다. 6 dpi에 상기 마우스를 죽이고, 각 마우스의 폐 조직을 수집하였다. 상기 폐 조직은 균질화되고, 각 폐 조직에 바이러스 부하는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석을 통하여 측정되었다. 상기 실시간 PCR 분석에서 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 HA 유전자가 탐지되었다.
도 1c에서 나타낸 것과 같이, rIL-17A에 의한 사전-치료에 의해 제공되는 보호는 바이러스성 부하와 연관있었다. 도 1c의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 오차 막대는 평균 ± SEM을 반영하며, 그리고 *p < 0.05 (비쌍체 슈트던트 t-테스트) 및 **p < 0.01 (비쌍체 슈트던트 t-테스트). rIL-17A가 투여된 C57BL/6 마우스 두 집단 모두 rIL-17A로 사전-치료되지 않은 C57BL/6 마우스와 비교하였을 때 바이러스 부하 수준은 더 낮았다. 상기 바이러스 부하는 C57BL/6 마우스에 투여되는 rIL-17A의 투여분량에 또한 대응하는데, 이때 0.5 μg 투여분량의 rIL-17A는 0.1 μg 투여분량의 rIL-17A보다 더 낮은 바이러스 부하를 초래하였다. 추가적으로, 상기에서 논의한 바와 같이, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염에 더 민감한 IL-17A 녹아웃 마우스는 rIL-17A로 사전-치료되지 않은 또는 사전치료된 야생형 C57BL/6 마우스보다 더 높은 바이러스 부하를 갖는다.
요약하면, 상기 데이터에서 IL-17A 녹아웃 마우스는 바이러스성 감염에 더 민감하고, 한편 rIL-17A로 사전-치료된 야생형 마우스는 바이러스 부하가 감소되었고, 투여분량 의존적 방식으로 생존이 증가되었기 때문에, IL-17A는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 대한 감염으로부터 보호를 제공한다(이의 감염에 저항성을 중개한다)는 것을 나타낸다. 추가적으로, 이들 데이터에서 IL-17A 수준은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 감염시 증가되었고, 따라서, IL-17A 수준은 인플루엔자 바이러스성 감염을 반영한다는 것을 나타낸다.
실시예 2
IL-17A는 H7N9 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 저항성을 중개한다.
상기에서 설명된 바와 같이, IL-17A 수준은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 감염에 반응하여 증가되었다. IL-17A는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 감염에 대항하여 또한 보호를 제공하였다. IL-17A가 생체내에서 다른 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 대한 저항성을 중개할 수 있는지를 판단하기 위하여, 하기에서 설명된 것과 같이 C57BL/6 마우스에서 H7N9 인플루엔자 A 바이러스성 감염을 검사하였다.
야생형 C57BL/6 마우스에게 바이러스의 비강 투여를 통하여 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 (A/Shanghai/4664T/2013)로 시험감염시켰다. 대조군으로는, 야생형 C57BL/6 마우스 제 2 집단에게 비강 경로를 통하여 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 대신 인산염 완충 염수(PBS)를 투여하였다. 감염 후(dpi) 7일 차에, BDTM Cytometric Bead Array (CBA)를 이용하여 시험감염된 마우스와 대조군 마우스의 혈청 내 IL-17A 단백질 수준이 측정되었다.
도 2a에서 나타낸 것과 같이, 대조(시험감염되지 않은) 마우스와 비교하였을 때, 시험감염된 마우스에서 IL-17A 단백질 수준이 상당히 증가되었다. 도 2a의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 오차 막대는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)를 반영하며, 그리고 ***p < 0.001 (비쌍체 슈트던트 t-테스트). 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스는 대조군 마우스와 비교하였을 때, 약 5-배 더 높은 IL-17 A 수준을 보유하였다. 이 데이터는 H7N9 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 반응하여 혈청내 IL-17A 수준이 증가되었다는 것을 나타낸다. 따라서, H7N9 인플루엔자 A 바이러스성 감염 (실시예 2) 또는 H5N1 인플루엔자 A 바이러스성 감염 (실시예 1)에 반응하여 혈청내 IL-17A 수준이 증가되었다는 것을 나타낸다.
IL-17A가 H7N9 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 보호를 중개하는지를 판단하기 위하여, 2개 집단의 야생형 C57BL/6 마우스는 바이러스 감염에 앞서 7일차와 2일차에 각각 0.1 μg (n=9)및 0.5 μg(n=7)의 재조합 IL-17A(rIL-17A)을 복막내(i.p.) 사전-처리되었다. 제 3 집단 (n=7)의 야생형 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았다. 3개 집단의 마우스는 0일차에 비강을 통하여 10 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 의해 감염되었고, 마우스의 치사율은 바이러스에 의한 시험감염 후 16일 동안 모니터되었다. 추가적으로, 바이러스의 시험 감염 후 16일 동안 마우스의 체중이 모니터되었다.
도 2b에 나타낸 것과 같이, rIL-17A로 사전-치료되지 않은 그리고 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 모든 C57BL/6 마우스는 8 dpi와 같이 조기에 죽었다. 도 2b의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 대조적으로, 0.1 μg rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스의 약 22.2%는 인플루엔자 A 바이러스 H7N9의 사전 감염을 견뎌내었고, 16 dpi 시점까지 생존하였다. 0.5 μg rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스의 약 71.4%는 인플루엔자 A 바이러스 H7N9의 사전 감염을 견뎌내었고, 16 dpi 시점까지 생존하였다. 추가적으로, rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스는 바이러스성 감염 후 초기에 체중감소를 나타내었지만, 그러나 두 집단 (예컨데, 0.1 μg 및 0.5 μg rIL-17A 사전-치료)에서 생존한 마우스는 16 dpi시점까지 감소된 체중 전부 또는 대부분을 다시 회복하였다 (도 3a, 3b, 및 3c). 상기 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 이용하여 관찰한 바와 같이, rIL-17A에 의한 사전-치료는 투여분량 의존적 방식으로 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로부터 보호를 제공하였으며, 이때 더 높은 투여분량의 rIL-17A는 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 감염으로부터 더 큰 보호(및 이에 대한 저항성)를 제공하였다.
H7N9 바이러스 부하가 IL-17A에 의해 제공되는 보호에 대응하는지를 판단하기 위하여, 2개 집단 (한 집단에 n=5)의 야생형 C57BL/6 마우스는 바이러스 감염에 앞서 7일차와 2일차에 각각 0.1 μg 및 0.5 μg의 재조합 IL-17A(rIL-17A)으로 복막내(i.p.) 사전-처리되었다. 제 3 집단 (n=5)의 야생형 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았다. 3개 집단의 마우스는 0일차에 비강을 통하여 10 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 의해 감염되었다. 7 dpi에 상기 마우스를 죽이고, 각 마우스의 폐 조직을 수집하였다. 상기 폐 조직은 균질화되고, 각 폐 조직에 바이러스 부하는 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석을 통하여 측정되었다. 상기 실시간 PCR 분석에서 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 HA 유전자가 탐지되었다.
도 2c에서 나타낸 것과 같이, rIL-17A에 의한 사전-치료에 의해 제공되는 보호는 바이러스성 부하와 연관있었다. 도 2c의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 오차 막대는 평균 ± SEM을 반영하며, 그리고 **p < 0.01 (비쌍체 슈트던트 t-테스트). rIL-17A가 투여된 C57BL/6 마우스 두 집단 모두 rIL-17A로 사전-치료되지 않은 C57BL/6 마우스와 비교하였을 때 바이러스 부하 수준은 상당히 더 낮았다. 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 이용하여 관찰한 바와 같이, 투여분량 의존적 방식으로 rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 폐 조직에서 더 낮은 수준의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9가 탐지되었다. 따라서, IL-17A를 이용한 사전-치료는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 및 H7N9 모두로부터 보호(및 이에 대한 저항성)을 제공하였고, 이 두 바이러스의 바이러스 부하를 낮추었다.
요약하면, 상기 데이터에서 rIL-17A로 사전-치료된 야생형 마우스는 바이러스 부하가 감소되었고, 투여분량 의존적 방식으로 생존이 증가되었기 때문에, IL-17A는 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 대한 감염으로부터 보호를 제공한다(이의 감염에 저항성을 중개한다)는 것을 나타낸다. 추가적으로, 이들 데이터에서 IL-17A 수준은 인플루엔자 A 바이러스 H7N9 감염시 증가되었고, 따라서, IL-17A 수준은 바이러스 감염을 반영한다는 것을 나타낸다. 따라서, 실시예 1 및 2의 데이터는 다중 인플루엔자 A 바이러스, 즉 H5N1 및 H7N9에 의한 감염으로부터 보호를 제공하고(및 이에 대한 저항성을 중개), 그리고 IL-17A 수준은 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염을 반영하였다.
실시예 3
rIL -17A로 사전-치료된 마우스에서 폐 염증 반응
인플루엔자 A 바이러스 H5N1 및 H7N9에 의한 감염시, 림프구들은 대다수의 폐 조직을 침윤하고, 이는 염증, 조직 손상, 및 사망의 원인이 된다. 조직화학 및 면역조직화학을 이용하여 rIL-17A로 사전-치료된 또는 사전 치료되지 않고, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 또는 H7N9에 의해 시험감염된 마우스의 폐 조직에서 CD8+ T 세포 침윤을 검사하엿다.
구체적으로, 한 집단의 C57BL/6 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 제 1 집단과 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 0일차에 비강을 통하여 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염되었다. 제 3 집단의 C57BL/6 마우스는 순수 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 투여받지 않았다. 6 dpi에 3개 집단 모두의 마우스를 죽이고, 각 마우스의 폐 조직을 수집하였다. 폐 단편은 헤마토실린과 에오신 (H&E)으로 착색되었다. CD8+ T 세포에 특이적인 항체로 조직 단편에서 면역조직화학 또한 실행되었다.
도 4a의 상위 패널은 순수 마우스의 대표 폐 조직 단편의 H&E (상부, 좌측 패널) 및 CD8+ T 세포 (상부, 우측 패널) 착색을 나타낸다. 고유 마우스는 정상 또는 건강한 폐 조직 모양의 대조군으로 삼는다. 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 시험감염된 마우스의 폐 조직은 폐포 벽이 두꺼워졌고, 광범위한 CD8+ T 세포 분포를 나타낸다 (도 4a, 중간 좌측 패널 및 우측 패널은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스의 대표적인 폐 조직 단편의 각 H&E 및 CD8+ T 세포 착색을 나타낸다). 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스의 폐 조직은 이들 마우스에서 심각한 기관지폐렴을 보여주었다.
대조적으로, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염되기 전, rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 폐 조직은 약한 손상 및 침윤하는 CD8+ T 세포의 공간적 분포가 불연속성인 것을 보여주었다 (도 4a, 하부 좌측 패널 및 우측 패널은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염되기 전, rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 대표적인 폐 조직 단편의 각 H&E 및 CD8+ T 세포 착색을 나타낸다). 환언하면, CD8+ T 세포의 침윤은 시험감염된 마우스와 비교하였을 때, 사전-치료된, 시험감염된 마우스의 폐 조직에서 발생되었고, 따라서, 사전-치료된, 시험감염된 마우스의 폐 조직은 시험감염된 마우스의 폐 조직과 비교하였을 때, 조직 손상 및 염증이 덜 나타났다. 이와 함께, 이들 데이터로부터 rIL-17A로 사전-치료는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염에 반응하여 폐 조직의 CD8+ T 세포 침윤을 감소시켰고, 이로 인하여 동일한 폐 조직에 손상 및 폐 조직의 염증을 감소시켰다는 것이 나타났다.
추가적으로, 폐 조직 안으로 CD8+ T 세포 침윤은 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스에서 검사되었다. 구체적으로, 한 집단의 C57BL/6 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 제 1 집단과 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 0일차에 비강을 통하여 10 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 의해 감염되었다. 제 3 집단의 C57BL/6 마우스는 순수 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H7N9를 투여받지 않았다. 6 dpi에 3개 집단의 마우스를 모두 죽이고, 각 마우스의 폐 조직을 수집하였다. 폐 단편은 H&E로 착색되었다. CD8+ T 세포에 특이적인 항체로 조직 단편에서 면역조직화학 또한 실행되었다.
도 4b의 상위 패널은 순수 마우스의 대표 폐 조직 단편의 H&E (상부, 좌측 패널) 및 CD8+ T 세포 (상부, 우측 패널) 착색을 나타낸다. 상기에서 설명된 바와 같이, 순수 마우스는 정상 또는 건강한 폐 조직 모양의 대조군으로 삼는다. 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 시험감염된 마우스의 폐 조직은 폐포 벽이 두꺼워졌고, 광범위한 CD8+ T 세포 분포를 나타낸다 (도 4b, 중간 좌측 패널 및 우측 패널은 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스의 대표적인 폐 조직 단편의 각 H&E 및 CD8+ T 세포 착색을 나타낸다). 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스의 폐 조직은 이들 마우스에서 심각한 기관지폐렴을 보여주었다.
대조적으로, 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염되기 전, rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 폐 조직은 약한 손상 및 침윤하는 CD8+ T 세포의 공간적 분포가 불연속성인 것을 보여주었다 (도 4b, 하부 좌측 패널 및 우측 패널은 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염되기 전, rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 대표적인 폐 조직 단편의 각 H&E 및 CD8+ T 세포 착색을 나타낸다). 환언하면, CD8+ T 세포의 침윤은 시험감염된 마우스와 비교하였을 때, 사전-치료된, 시험감염된 마우스의 폐 조직에서 발생되었고, 따라서, 사전-치료된, 시험감염된 마우스의 폐 조직은 시험감염된 마우스의 폐 조직과 비교하였을 때, 조직 손상 및 염증이 덜 나타났다. 이와 함께, 이들 데이터로부터 rIL-17A로 사전-치료는 인플루엔자 A 바이러스 H7N9의 시험감염에 반응하여 폐 조직의 CD8+ T 세포 침윤을 감소시켰고, 이로 인하여 동일한 폐 조직에 손상 및 폐 조직의 염증을 감소시켰다는 것이 나타났다.
요약하면, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 또는 H7N9로 시험감염된 마우스는 CD8+ T 세포에 의한 폐 조직의 상당한 침윤, 폐 조직 손상, 폐 조직 염증, 그리고 심각한 기관지폐렴을 나타내었다. 바이러스성 시험감염 전, rIL-17A로 사전-치료받지 않은 마우스와 비교하여, 폐 조직의 CD8+ T 세포 침윤은 감소되었기 때문에, rIL-17A에 의한 사전-치료는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 또는 H7N9로 시험감염된 마우스를 보호하였고, 따라서 보호된 마우스의 폐 조직 손상 및 염증은 감소되었다. 따라서, IL-17A은 폐 조직 손상 및 염증의 원인이 되는 폐 조직의 CD8+ T 세포 침윤 감소에 의해 H5N1 및 H7N9 바이러스성 감염으로부터 보호를 제공하였다(이에 대한 저항성을 중개한다).
실시예 4
인플루엔자 A 바이러스에 감염된 인간 개체에서 IL-17A 수준
상기 실시예 1-3에서 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 및 H7N9의 감염으로부터 IL-17A가 마우스를 보호하였다는 것을 설명하였다. 추가적으로, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 및 H7N9에 감염된 마우스에서 IL-17A 수준이 상승되었다. 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 인간 대상에서 IL-17A 수준이 변경되는지를 판단하기 위하여, 건강한 인간 대상 및 인플루엔자 A 바이러스 H3N2, H5N1, H1N1, 또는 H7N9에 감염된 인간 대상으로부터 획득한 혈청내 IL-17A 수준이 측정되었다.
50명의 건강한 인간 대상 및 인플루엔자 A 바이러스에 급성 감염된 99명의 인간 대상으로부터 혈청 시료를 수집하였고, 분석하였다. 특히, 수집단 혈청내 IL-17A 수준은 BDTM Cytometric Bead Array (CBA)에 의해 측정되었다. 16명의 인간 대상은 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 (예컨데, 계절성 플루)에 감염되었다. 65명의 인간 대상이 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 (예컨데, 범유행 플루)에 감염되었고, 이중 16명의 인간 대상과 49명의 인간 대상은 각각 심각한 감염과 약한 감염을 가진 것으로 확인되었다. 18명의 인간 대상이 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 감염되었고, 이중 10명의 인간 대상과 8명의 인간 대상은 각각 심각한 감염과 약한 감염을 가진 것으로 확인되었다.
건강한 대상과 비교하였을 때, IL-17A 수준은 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 또는 H7N9에 감염된 대상으로부터 수집된 혈청에서 상당히 상승되었다 (p<0.0001; 도 5a, 이때 각 기호는 개별 대상을 나타내고, 데이터는 평균 ± SEM이며, 그리고 수평선은 대상의 각 집단에 대한 해당 평균을 나타낸다). 건강한 대상의 혈청에서 IL-17A 수준은 50 pg/mL 미만이지만, 인플루엔자 A 바이러스 H1N1, H7N9, 또는 H3N2에 감염된 대상의 혈청 IL-17A 수준은 50 pg/mL이상이었다. 특히, H1N1 감염된 대상 및 H7N9 감염된 대상은 건강한 대상의 것과 비교하였을 때, 각각 평균 16-배 및 12-배 더 높은 수준의 IL-17A를 가졌다. 건강한 대상과 비교하였을 때 인플루엔자 A 바이러스 H3N2에 감염된 대상으로부터 획득된 혈청에서 IL-17A 수준이 또한 상당히 증가되었다(p<0.05, 도 5a). H3N2 감염된 대상은 건강한 대상과 비교하였을 때 혈청내 평균 2-배 더 높은 IL-17A 수준을 가졌다.
감염된 대상의 혈청에서 관찰된 상승된 IL-17A 수준은 바이러스성 감염의 심각성에 상응하였다. 약한 감염에 걸린 대상 (예컨데, 임상적으로 약한 대상)은 단지 플루와 유사한 증상만을 나타내고, 정상적인 흉부 X-선 및/또는 폐 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔을 나타내었다. 심각한 감염 대상 (예컨데, 임상적으로 심각한 대상)은 (1) 3일 이상의 고열, (2) 때로 가래, 피를 동반하는 급성 기침, 및/또는 흉부 통증; (3) 호흡 곤란 및 청색증; (4) 권태, 느린 반응, 졸림 및/또는 경련; (5) 구토, 및/또는 설사, 때로 탈수로 이어짐; (6) 흉부 X-선 및/또는 폐 CT 스캔에서 다중-잎 경화(multi-leaf consolidation) 및 심각한 폐렴을 보이며; (7) 호흡 부전 또는 쇼크 및/또는 다수-장기 부전을 가지고; 및/또는 (8) 중환자실에 입원한다.
인플루엔자 A 바이러스 H1N1 또는 H7N9에 감염된 대상의 경우, 임상적으로 "약한" 대상은 임상적으로 "심각한" 대상과 비교하였을 때 더 높은 IL-17A 수준을 나타내었다 (도 5b 및 5c, 이때 각 기호는 개별 대상을 나타내고, 데이터는 평균 ± SEM이며, 그리고 수평선은 대상의 각 집단에 대한 해당 평균을 나타낸다). 약한 대상은 심각한 감염 대상과 비교하였을 때 혈청내 2-배 더 높은 IL-17A 수준을 가졌다. 특히, 약한 대상의 혈청의 IL-17A 수준은 500 pg/mL 이상인 반면, 심각한 감염 대상의 혈청 IL-17A 수준은 50 pg/mL 이상, 그러나 500 pg/mL미만이었다.
H5N1 바이러스성 감염에 있어서, 효소-연계된 면역흡착 분석을 이용하여 감염이 확인된 후, 3일, 5일 및 10일차에 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 2명에서 수거한 혈청내 IL-17A 수준을 탐지하였다. 감염된 첫 대상은 중국 광조우 (GK 대상) 출신이며, 감염된 두번째 대상은 중국, 홍콩 (HK 대상) 출신이다. 대조군으로써, 3명의 건강한 대상과 인플루엔자를 제외한 바이러스성 감염을 가진 1명의 대상(예컨데, 비-인플루엔자 대상)으로부터 혈청 시료를 수거하였다.
GK 대상은 입원하고, 심각한 감염 폐 기능이상으로 인하여 10일 후 사망하였다. 상기 GZ 대상은 감염 과정동안 혈청내 낮은 IL-17A 수준을 보유하였다(도 5d, 이때 데이터는 평균± SEM이다). 대조적으로, HK 대상은 건강한 대상, 비-인플루엔자 대상, 및 GZ 대상과 비교하였을 때 상승된 IL-17A 수준을 보유하였다(도 5d). HK 대상은 H5N1 바이러스성 감염으로부터 회복하였다.
요약하면, 이들 데이터에서 건강한 대상과 비교하였을 때, 인플루엔자 A 바이러스 (예컨데, H3N2, H1N1, H7N9, 및 H5N1)에 감염된 인간 대상에서 IL-17A 수준은 증가되거나 또는 상승되었음이 나타났다. 따라서, 인플루엔자 A 바이러스 감염시 인간 (실시예 4) 및 마우스 (실시예 1 및 2)에서 IL-17A 수준은 증가되었고, 따라서, IL-17A 수준의 상승은 인플루엔자 A 바이러스에 감염을 나타내었다. IL-17A 수준은 또한 인간 대상에서 감염의 심각성에 상응하였는데, 이때 심각한 감염 바이러스성 감염을 가진 대상과 비교하여, 약한 바이러스성 감염을 가진 대상에서 IL-17A 수준은 더 높았다.
실시예 5
IL-6 및 TNF-α은 바이러스 감염으로부터 보호에 필요하지 않는다.
IL-17A은 선천적 면역 반응의 일부분인 사이토킨들, 예를 들면, 인터루킨-6 (IL-6) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)를 유도할 수 있다. IL-6 및 TNF-α은 염증을 중재할 수 있다. IL-17A가 IL-6 및/또는 TNF-α를 통하여 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 대한 저항성을 중재하는지를 검사하기 위하여, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스로부터 수거된 혈청내에서 IL-6 및 TNF-α의 수준이 측정되었다.
구체적으로, 두 집단의 C57BL/6 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 각각 i.p.로 0.1 μg 및 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 2개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 제 3 집단의 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염되지도 않았다(예컨데, 순수 마우스). 6 dpi에서, 마우스로부터 혈청에 수거되었고, 수거된 혈청내 IL-6 및 TNF-α 수준이 측정되었다.
순수 마우스와 비교하여, 바이러스 시험감염 전, rIL-17A로 사전-치료된 마우스의 혈청에는 증가된 수준의 IL-6를 가지고 있었다 (도 6a, **p<0.01). IL-6 수준 증가는 사전-치료에서 제공된 rIL-17A의 투여분량에 의존적이며, 이때 더 높은 투여분량의 rIL-17A는 혈청내 더 높은 수준의 IL-6를 초래하였다. 그러나, TNF-α 수준은 rIL-17A로 사전-치료 및 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염에 의해 변화되지 않았다.
추가적으로, 야생형 (예컨데,C57BL/6), IL-6 녹아웃, 및 TNFR1/2 (예컨데, TNF-α) 녹아웃 마우스에게 오직 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 단독으로 시험감염시키거나 또는 rIL-17A 사전-치료와 함께 시험감염시켰다. 감염 후 치사률이 측정되었다. 도 6b에서 나타낸 것과 같이, 야생형 마우스는 약 9 dpi에 죽었지만, IL-6 녹아웃 마우스는 12 dpi에 죽었다. 그러나 100%의 야생형 및 IL-6 녹아웃 rIL-17A로 사전-치료된 마우스는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1의 시험감염을 견뎌내었다. 이들 데이터에서 IL-6 수준은 rIL-17A로 사전-치료된 후 투여분량 의존적 방식으로 증가되었지만, IL-6이 바이러스 시험감염으로부터 IL-17A-중개된 보호에 필요하지는 않음이 나타났다.
도 6c에 나타낸 것과 같이, 야생형 및 TNFR1/1 녹아웃 마우스는 각각 9 dpi 및 12 dpi에서 죽었다. 100%의 야생형 및 TNFR1/2 녹아웃 rIL-17A로 사전-치료된 마우스는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염을 견뎌내었다. 이들 데이터에서 TNF-α 수준은 IL-17A로 사전-치료에 반응하여 변화가 없었고, TNF-α는 바이러스 시험감염으로부터 IL-17A-중개된 보호에 필요하지 않음이 나타났다.
요약하면, IL-17A는 IL-6 및 TNF-α와는 독립적으로 H5N1 바이러스성 감염으로부터 보호를 제공하였다(그리고 이에 대한 저항성을 중개하였다)
실시예 6
바이러스 감염으로부터 보호를 위하여 IFN -γ는 필요하지만, IL-4는 필요하지 않다.
사이토킨, 예를 들면, 인터루킨-4 (IL-4) 및 인터페론-γ (IFN-γ)는 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염을 제어할 수 있다. IL-17A가 IL-4 및/또는 IFN-γ를 통하여 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 대한 저항성을 중재하는지를 검사하기 위하여, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 또는 H7N9로 시험감염된 마우스로부터 수거된 혈청내에서 IL-4 및/또는 IFN-γ의 수준이 측정되었다.
구체적으로, 두 집단의 C57BL/6 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 각각 i.p.로 0.1 μg 및 0.5 μg의 rIL-17A로 사전-치료하였다. 제 3 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 3개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 제4 집단의 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염되지도 않았다(예컨데, 순수 마우스). 6 dpi에서, 마우스로부터 혈청에 수거되었고, 수거된 혈청내 IL-4 및/또는 IFN-γ 수준이 측정되었다.
도 7a에서 나타낸 것과 같이, 4개 집단의 마우스 간에 IL-4 수준에서 유의적인 차이가 관찰되지는 않았다. 도 7a의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. IFN-γ 수준은 순수 마우스와 비교하였을 때 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스에서 증가되었다. 그러나, IFN-γ 수준은 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염된 마우스와 비교하여, rIL-17A 사전-치료에 반응하여 투여분량 의존적 방식으로 상당히 증가되었다 (도 7A, *p < 0.05 (비쌍계 스튜던트 t-테스트)). 0.5 μg의 rIL-17A로 사전-치료된 마우스는 0.1 μg의 rIL-17A로 사전치료된 마우스, H5N1로 사전감염된 마우스 및 순수 마우스보다 혈청에서 더 높은 수준의 IFN-γ를 가졌다(도 7a, 차례로 약 1.6-배, 약 3.25-배, 및 약 6.5-배 더 높은 IFN-γ 수준). 이들 데이터에서 IFN-γ는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 투여분량 의존적 방식으로 혈청내 수준이 증가되었지만, IL-4의 수준은 증가되지 않았다는 것을 나타내었다.
IL-4 및 IFN-γ 수준을 더 검사하기 위하여, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1를 대신하여, 인플루엔자 A 바이러스 H7N9를 이용하여 상기 실험이 반복되었다. 구체적으로, 두 집단의 C57BL/6 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 각각 i.p.로 0.1 μg 및 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 3 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 3개 집단의 마우스는 0일차에 10 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H7N9에 의해 시험감염되었다. H7N9 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 제4 집단의 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염되지도 않았다(예컨데, 순수 마우스). 6 dpi에서, 마우스로부터 혈청에 수거되었고, 수거된 혈청내 IL-4 및/또는 IFN-γ 수준이 측정되었다.
도 7b에서 나타낸 것과 같이, 4개 집단의 마우스 간에 IL-4 수준에서 차이가 관찰되지는 않았다. 도 7b의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 인플루엔자 A 바이러스 H7N9로 시험감염된 마우스와 바이러스 사전감염 전, 0.1 μg rIL-17로 사전-치료된 마우스 간에 IFN-γ 수준은 필적하였다. 그러나, IFN-γ 수준은 사전-치료를 받지 않은 마우스와 0.1 μg rIL-17A로 사전-치료된 마우스와 비교하였을 때, 0.5 μg rIL-17A로 사전-치료된 마우스에서 상당히 증가되었다(도 7b, **p < 0.01 (비쌍체 슈트던트 t-테스트)). 특히, 0.5 μg rIL-17A로 사전-치료된 마우스는 rIL-17A로 사전-치료를 받지 않은 마우스와 비교하였을 때, 1.9-배 더 높은 수준의 IFN-γ를 보유하였다. 이들 데이터에서 IFN-γ는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 투여분량 의존적 방식으로 혈청내 수준이 증가되었지만, IL-4의 수준은 증가되지 않았다는 것을 나타내었다.
IFN-γ를 더 검사하기 위하여, 야생형 (예컨데, C56BL/6) 및 IFN-γ 녹아웃 마우스는 오직 인플루엔자 A 바이러스 H5N1 단독으로 시험감염시키거나 또는 rIL-17A 사전-치료와 함께 시험감염시켰다. 특히, 야생형 마우스 한 집단(n=6)과 IFN-γ 녹아웃 마우스 한 집단(n=6)은 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A로 사전-치료받았다. 제 2 집단의 야생형 마우스 (n=6)와 제 2 집단의 IFN-γ 녹아웃 마우스 (n=6)는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 감염 후 16일 동안 매일 치사율에 대하여 마우스를 모니터하였다.
도 7c에 나타낸 것과 같이, 야생형 및 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 사전감염된 IFN-γ 녹아웃 마우스는 각각 14dpi 및 10 dpi에서 죽었다. 이 데이터에서 IFN-γ 녹아웃 마우스가 야생형 마우스보다 H5N1 바이러스성 감염에 더 민감하였다는 것이 드러났다. 추가적으로, rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스와 비교하였을 때, rIL-17A로 사전-치료된 IFN-γ 녹아웃 마우스의 사망이 지연되었다. 16 dpi까지, 약 15%의 rIL-17A로 사전-치료된 IFN-γ 녹아웃 마우스는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염을 견뎌내었다. 대조적으로, 야생형 rIL-17A로 사전-치료된 마우스 100%는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염을 견뎌내었다. 이들 데이테에서 IL-17A는 IFN-γ를 통하여 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 저항성이 중개됨을 나타내었다. 환언하면, 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 효과적인 보호에 있어서 IFN-γ가 필요하였다.
요약하면, rIL-17A 사전-치료에 반응하여 IL-4 수준은 변화되지 않았다. 그러나, IFN-γ 수준은 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 투여분량 의존적 방식으로 증가되었고, IL-17A는 IFN-γ을 통하여 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 보호하였다.
실시예 7
CD8 + T 세포와 천연 킬러 세포에 의해 생산된 IFN -γ
바이러스성 감염 동안, IFN-γ는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및/또는 천연 킬러 (NK) 세포에 의해 분비될 수 있다. rIL-17A 사전-치료에 의해 유도된 IFN-γ 증가된 수준을 담당하는 세포 집단(들)을 확인하기 위하여, 6 dpi에서 IFN-γ 양성 세포들이 탐지되었다.
구체적으로, 야생형 마우스 (예컨데, C57BL/6) 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 야생형 마우스 2집단과 IL-17A 녹아웃 마우스 한 집단은 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 또다른 집단의 C57BL/6 마우스는 대조군으로써, rIL-17A에 의한 사전-치료를 받지 않았고, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염되지도 않았다(예컨데, 순수 마우스). 6 dpi에 4개 집단의 마우스로부터 비장세포를 단리하였고, 포르말린-비활성화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 12 시간 (h) 동안 시험관에서 자극하였다. CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 NK 세포의 IFN-γ 분비는 유동 세포분석에 의해 측정되었고, IFN-γ의 세포내 착색을 탐지하였다.
도 8a에서 나타낸 것과 같이, C57BL/6 rIL-17A로 사전-치료된 (그리고 바이러스로 시험감염된) 마우스로부터 단리된 CD4+ T 세포로부터 IFN-γ의 분비는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않고 (그러나 바이러스로 시험감염된) 마우스로부터 단리된 CD4+ T 세포로부터 분비되는 IFN-γ과 비교하여 감소되었다. 따라서, CD4+ T 세포로부터 IFN-γ 분비는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 감소되었다. 도 8a의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 대조적으로, rIL-17A 사전-치료는 rIL-17A 사전-치료없는 경우와 비교하였을 때, CD8+ T 세포로부터 IFN-γ 배출을 상당히 증가시켰다(도 8a, ** p < 0.01). rIL-17A 사전-치료는 rIL-17A 사전-치료 없는 것과 비교하였을 때, NK 세포로부터 IFN-γ 분비를 또한 상당히 증가시켰다(도 8a, *p < 0.05). 따라서, 이들 데이터로부터 CD8+ T 세포 및 NK 세포는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 관찰된 IFN-γ의 증가된 수준에 상당히 기여하였다는 것을 나타낸다.
CD8+ T 세포는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 IFN-γ를 배출하기 때문에, IL-17A가 CD8+ T 세포를 통하여 바이러스성 감염으로부터 보호하는지를 판단하기 위하여 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염을 이겨내는 CD8+ T 세포가 부족한 마우스 (예컨데, CD8 녹아웃 마우스)의 능력을 검사하였다. 구체적으로, 야생형 (예컨데, C57BL/6) 마우스 및 CD8 녹아웃 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다 제 2 집단의 C57BL/6 마우스와 제 2 집단의 CD8 녹아웃 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 감염 후 16일 동안 매일 치사율에 대하여 마우스를 모니터하였다.
도 8b에 나타낸 것과 같이, 야생형 및 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 사전감염된 CD8 녹아웃 마우스는 각각 12dpi 및 7 dpi에서 죽었다. 이 데이터에서 CD8 녹아웃 마우스가 야생형 마우스보다 H5N1 바이러스성 감염에 더 민감하였다는 것이 드러났다. 추가적으로, rIL-17A로 사전-치료된 CD8 녹아웃 마우스는 8 dpi에 죽었고, 따라서 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 CD8 녹아웃 마우스와 비교하였을 때, rIL-17A로 사전-치료된 CD8 녹아웃 마우스의 사망은 1일 지연되었다 (도 8b). 상기에서 관찰된 바와 같이, 야생형 rIL-17A로 사전-치료된 마우스 100%는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염을 견뎌내었다. 이들 데이테에서 IL-17A는 CD8+ T 세포들을 통하여 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 저항성이 중개됨을 나타내었다. 환언하면, 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 효과적인 보호에 있어서 CD8+ T 세포들이 필요하였다.
상기에서 설명된 바와 같이, rIL-17A 사전-치료에 반응하여 NK 세포에 의해 IFN-γ가 또한 분비되었다. 따라서, IL-17A가 NK 세포를 통하여 바이러스성 감염으로부터 보호하는지를 판단하기 위하여, 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염을 이겨내는 NK 세포가 부족한 마우스(예컨데, 항-NK 1.1 마우스) 의 능력을 검사하였다. 구체적으로, 4개 집단의 C57BL/6 마우스가 검사되었다. C57BL/6 마우스의 첫 집단은 NK 세포가 고갈되지 않았으며, rIL-17A로 사전-치료되지 않았다. C57BL/6 마우스 제 2 집단은 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. C57BL/6 마우스의 제 3 집단은 바이러스성 감염 전, 7일, 3일 및 1일에 항-NK 1.1 중화 단클론 항체를 i.p.로 주사하였다. C57BL/6 마우스의 제 4 집단은 바이러스성 감염 전, 7일, 3일 및 1일에 항-NK 1.1 중화 단클론 항체를 ip.로 주사맞았고, 바이러스 감염 전 7일 및 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A로 사전-치료받았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 감염 후 16일 동안 매일 치사율에 대하여 마우스를 모니터하였다.
도 8c에 나타낸 것과 같이, 야생형 및 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 사전감염된 NK 고갈된(가령, 항-NK 1.1) 마우스는 각각 12dpi 및 9 dpi에서 죽었다. 이 데이터로부터 NK 고갈된 마우스가 야생형 마우스보다 H5N1 바이러스성 감염에 더 민감하였다는 것이 드러났다. 16 dpi까지, 약 70%의 rIL-17A로 사전-치료된 NK 고갈된 마우스 (예컨데, 항-NK 1.1 + rIL-17A)는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 시험감염을 견뎌내었다.(도 8c). 야생형 rIL-17A로 사전-치료된 마우스 100%는 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의한 시험감염을 견뎌내었다. 이들 데이터에서 NK 세포는 고갈되었지만, rIL-17A로 사전-치료된 마우스는 야생형 rIL-17A로 사전-치료된 마우스와 비교하여 생존률이 중간정도로 감소되었기 때문에 (예컨데, 바이러스 시험감염에 대한 생존률 약 70% vs. 100%), 바이러스 감염으로부터 IL-17A 중개된 보호를 실행함에 있어서 NK 세포는 CD8+ T 세포보다 역할이 더 작다는 것이 드러났다.
요약하면, CD8+ T 세포 및 NK 세포에 의해 분비되나, CD4+ T 세포에 의해서는 분비되지 않는 IFN-γ분비는 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 상당히 증가되었다. rIL-17A 사전-치료에 의해 제공되는 보호는 CD8+ T 세포 부재시 상당히 감소되었지만, NK 세포 부재시에는 중간수준으로 감소되었다. 오히려, CD8+ T 세포 부재시, rIL-17A 사전-치료는 사망을 지연시키지만, 사망을 막지는 못하였다. 이와 함께, 이들 데이터에서 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포는 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 IL-17A-중개된 보호 (및 이에 대한 저항성)에 상당히 기여한다는 것이 드러났다.
실시예 8
CD8 + T 세포의 선택적 전달
상기에서 설명된 바와 같이, IL-17A는 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포를 통하여 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 보호 (및 이에 대한 저항성)를 제공하였다. 하기에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 선택적 전달은 IL-17A-중개된 보호가 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포에 의해 실행된다는 것을 더 확인하는데 이용되었다. CD8+ T 세포의 선택적 전달 계획은 도 9a에서 설명된다.
특히, rIL-17A 사전-치료된, H5N1 감염된 마우스 또는 치료를 받지 않은, H5N1 감염된 마우스의 야생형 CD8+ T 세포는 선택적으로 H5N1 감염된, 야생형 마우스로 전달되었다. 간략하게 설명하자면, C57BL/6 마우스의 제 1 집단(예컨데, 야생형)은 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 2 집단의 C57BL/6 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 제 3 집단의 마우스, 즉 CD8+ T 세포가 부족한 마우스 (예컨데, CD8 녹아웃 마우스)는 대조군으로 이용되었고, 또한 rIL-17A로 사전-치료받지 않았다. C57BL/6 마우스 3개 집단은 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. 선택적 전달을 제공받았던 C57BL/6 마우스(예컨데, 수령 마우스)는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다.
6 dpi에 CD8+ T 세포는 C57BL/6 rIL-17A로 사전-치료된 마우스 (예컨데, 상기 제 1 집단 마우스)와 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 C57BL/6 마우스(예컨데, 상기 제 2 집단 마우스)로부터 단리되었다. 마우스의 제 1 집단으로부터 단리된 1 x 107의 CD8+ T 세포는 6일 동안 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 감염된 C57BL/6 (예컨데, 야생형) 마우스로 전달되었고, 이들 수령 마우스에서 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다 (도 9b에서 예컨데, WT CD8 T 세포 + rIL-17A). 추가적으로, 마우스의 제 2 집단으로부터 단리된 1 x 107의 CD8+ T 세포는 6일 동안 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 감염된 C57BL/6 (예컨데, 야생형) 마우스로 전달되었고, 이들 수령 마우스에서 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다 (도 9b에서 예컨데, WT CD8+ T 세포). 이들 CD8 녹아웃 마우스 또한 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다 (도 9b에서 예컨데, CD8 KO).
도 9b에서 보여준 바와 같이(그리고 실시예 7 및 도 8b에서 관찰된 바와 같이), CD8 녹아웃 마우스는 7 dpi에 죽었고, CD8+ T 세포가 부족한 마우스의 대조군으로 이용되었다. 도 9b의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 마우스 제 2 집단 (예컨데, rIL-17A 사전-치료를 받지 않았지만, 인플루엔자 A H5N1 바이러스로 시험감염된 C57BL/6 마우스)로부터 CD8+ T 세포를 수용한 감염된 C57BL/6 마우스는 10 dpi에 죽었다 (도 9b, WT CD8 T 세포). 대조적으로, 마우스의 제 1 집단 (예컨데, C57BL/6 rIL-17A로 사전-치료된 후, 인플루엔자 A H5N1 바이러스로 시험감염된 C57BL/6 마우스)로부터 CD8+ T 세포를 수용한 감염된 C57BL/6 마우스의 50%는 16 dpi에 생존하였다(도 9b, WT CD8 T 세포 + rIL-17A). 이들 데이터에서 rIL-17A로 사전-치료된 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포는 바이러스성 감염으로부터 수령 마우스를 보호하였다(그리고 이에 대한 저항성을 중개하였다)는 것이 드러났다. 이들 데이터는 또한 rIL-17A 치료시 CD8+ T 세포가 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 보호할 수 있으며, 이 바이러스에 이미 감염된 마우스도 보호할 수 있다는 것을 나타내었다.
추가적으로, 바이러스성 시험감염 전, rIL-17A 사전-치료를 받거나 또는 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스의 CD8+ T 세포를 야생형, H5N1 감염된 마우스에 선택적으로 전달하여 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포가 인플루엔자 A 바이러스성 감염에 대항하여IL-17A-중개된 보호를 촉진시킨다는 것을 더 확인하였다. 간략하게 설명하자면, C57BL/6 (예컨데, 야생형) 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 1 집단은 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 2 집단은 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. IFN-γ 녹아웃 마우스와 rIL-17A 사전-치료된 C57BL/6 마우스 두 집단은 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. 선택적 전달을 제공받았던(예컨데 수령 마우스) C57BL/6 마우스(예컨데, 수령 마우스)는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다.
6dpi에, CD8+ T 세포는 rIL-17A로 사전-치료된 C57BL/6 마우스로부터 단리되었고, 1 x 107의 이들 단리된 세포는 6일 동안 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염된 C57BL/6 마우스에게 선택적으로 이동되었다. 수령 마우스(예컨데, 도 9c에서 WT CD8 T 세포 + rIL-17A )들은 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다
6 dpi에서, CD8+ T 세포는 rIL-17A로 사전-치료된 IFN-γ 녹아웃 마우스 (예컨데,상기 IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 1 집단)와 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스(예컨데, 상기 IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 2 집단)으로부터 단리되었다. IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 1 집단으로부터 단리된 1 x 107의 CD8+ T 세포는 6일 동안 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염된 C57BL/6 (예컨데, 야생형) 마우스에게 선택적으로 이동되었다. 이들 수령 마우스(예컨데, 도9c에서 IFN-γ KO CD8 T 세포 + rIL-17A)들은 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다. 추가적으로, IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 2 집단으로부터 단리된 1 x 107의 CD8+ T 세포는 6일 동안 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 감염된 C57BL/6 (예컨데, 야생형) 마우스에게 선택적으로 이동되었다. 이들 수령 마우스의 경우, 16dpi까지 매일 치사률이 모니터되었다.(예컨데, 도 9c에서 IFN-γ KO CD8 T 세포).
도 9c에서 보이는 바와 같이 (그리고 도 9b에서 관찰된 바와 같이), rIL-17A 사전-치료된, 감염된 C57BL/6 마우스의 CD8+ T 세포를 제공받은 감염된 C57BL/6 마우스의 50%는 16 dpi에 생존하였다 (예컨데, 도 9c에서 WT CD8 T 세포 + rIL-17A). 이들 데이터는 도 9b에서 나타내고 설명된 관찰과 일치되며, 따라서, 도 9c의 선택적 이동 실험의 양성 대조건으로 이용되었다. 도 9c의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 2 집단 (예컨데, 바이러스 시험감염 전 rIL-17A 치료를 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스)의 CD8+ T 세포를 제공받은 감염된 C57BL/6 마우스는 11 dpi에 죽었다 (도 9c, IFN-γ KO CD8 T 세포). 이 데이터에서 IFN-γ를 생산할 수 없는, 그리고 rIL-17 사전-치료를 받지 않은 마우스로부터 유도된 CD8+ T 세포는 인플루엔자 A H5N1 바이러스성 감염으로부터 보호할 수 없다는 것을 나타내었다. IFN-γ 녹아웃 마우스의 제 1 집단 (예컨데, 바이러스 시험감염 전 rIL-17A 치료를 받은 IFN-γ 녹아웃 마우스)의 CD8+ T 세포를 제공받은 감염된 C57BL/6 마우스는 12 dpi에 죽었다 (도 9c, IFN-γ KO CD8 T 세포 + rIL-17A). 이 데이터에서 IFN-γ를 생산할 수 없는, 그리고 rIL-17 사전-치료를 받은 마우스로부터 유도된 CD8+ T 세포는 인플루엔자 A H5N1 바이러스성 감염으로부터 보호할 수 없다는 것을 나타내었다.
요약하면, 상기 데이터에서 rIL-17A 사전-치료된 마우스의 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포를 제공받은 후, H5N1 감염된 마우스는 회복되고, 생존하였다는 것이 드러났다. IFN-γ를 생산할 수 없는 CD8+ T 세포를 제공받은 H5N1 감염된 마우스는 바이러스성 감염 (rIL-17A 사전-치료와 무관하게)으로부터 회복되지 못하고, 생존하지 못하였다. 따라서, IFN-γ 생산 CD8+ T 세포는 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 IL-17A-중개된 보호를 촉진시키지만, IFN-γ 생산하지 못하는 CD8+ T 세포는 그러지 못하였다. CD8+ T 세포 및 이들 CD8+ T 세포로부터 생산된 IFN-γ는 인플루엔자 A 바이러스성 감염으로부터 IL-17A-중개된 보호에 상당히 기여하였다.
실시예 9
CD8 + T 세포의 용해 활성
세포용해성인 CD8+ T 세포는 세포용해 T 림프구 (CTLs)로 또한 공지되어 있다. CTLs는 항-바이러스성 활성을 가질 수 있다. 따라서, 인플루엔자 감염으로부터 IL-17A-중개된 보호를 촉진시키는 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포를 세포용해 활성에 대하여 검사하였다. 특히, 하기에서 설명된 바와 같이 세포용해 활성에 대한 생체내 그리고 시험관 분석이 이용되었다.
세포용해 활성의 생체내 분석의 경우, 동계 비장세포는 순수 C57BL/6 마우스 (예컨데, rIL-17A 사전-치료를 받지 않고, 인플루엔자 바이러스 사전감염도 되지 않은 마우스)로부터 준비되었다. 상기 동계 비장세포는 두 집단으로 나뉘었다. 첫번째 동계 비장세포 집단은 비활성화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 펄스되었고, 10 μM의 카르복시플로로레신 숙시니미딜 에스테르(CFSE, 착색 세포를 위한 형광 염료)로 라벨되었다. 두번째 동계 비장세포는 0.5 μM의 CFSE로 라벨되었다. 두 집단에서 동수의 비장세포를 함께 혼합하였다.
야생형(예컨데, C57BL/6) 마우스와 CD8+ T 세포가 부족한 마우스 (예컨데, CD8 녹아웃 마우스)에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다. 제 2 집단의 C57BL/6 마우스와 제 2 집단의 CD8 녹아웃 마우스는 rIL-17A의 사전-치료를 받지 않았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. H5N1 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 6 dpi에서, 상기에서 설명된 혼합된 비장세포는 이들 4개 집단 마우스의 정맥으로 주사되었다. 8시간 후, 비장세포들은 수령 마우스로부터 단리되어 생체내 항원-특이적 세포용해 수준이 결정되었다.
도 10a에서 보이는 바와 같이, 항원-특이적 용해는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 야생형 마우스와 비교하여, rIL-17A로 사전-치료된 야행형 마우스에서 상당히 증가되었다 (예컨데, 도 10a에서 WT + rIL-17A와 WT). 도 10a의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 평균 ± SEM을 반영하며, 그리고 ***p < 0.001 (비쌍체 슈트던트 t-테스트). 구체적으로, rIL-17A 사전-치료된, 야생형 마우스에서 항원-특이적 용해는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 야생형 마우스의 항원-특이적 용해보다 약 4-배 더 높았다. 이 데이터는 rIL-17A 사전-치료가 CTL 활성을 상당히 유도하였다는 것을 나타내었다.
추가적으로, rIL-17A 사전-치료를 받은 그리고 받지 않은 CD8 녹아웃 마우스들은 유사한 수준의 항원-특이적 세포용해 활성을 가졌다 (도 10a, 차례로 CD8 KO + rIL-17A 및 CD8 KO). 오히려, CD8 녹아웃 마우스는 rIL-17A 사전-치료와 무관하게, 야생형 마우스에서 관찰된 항원-특이적 용해 수준보다 더 낮은 항원-특이적 용해 수준을 가졌다. 따라서, 야생형 마우스의 CTL 활성과 비교하였을 때, rIL-17A 사전-치료를 받은 그리고 받지 않은 모든 CD8 녹아웃 마우스들의 CTL 활성은 약 2-배 감소되었다. 요약하면, 이들 데이터에서 CD8+ T 세포는 세포용해 활성에 필요하며, 세포용해 활성은 rIL-17A 사전-치료에 반응하여 상당히 증가되었음이 드러났다.
CD8+ T 세포의 세포용해 활성을 더 검사하고, IFN-γ 생산이 세포용해 활성에 필요한지를 판단하기 위하여, 상이한 집단의 CD8+ T 세포의 세포용해 활성을 평가하기 위하여 시험관내 분석이 이용되었다. 특히, 야생형 및 IFN-γ 녹아웃 마우스에게 바이러스 감염 전 7일차와 2일차에 i.p.로 0.5 μg의 rIL-17A를 사전-치료하였다 제 2 집단의 야생형 마우스와 제 2 집단의 IFN-γ 녹아웃 마우스는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않았다. 4개 집단의 마우스는 0일차에 5 LD50의 인플루엔자 A 바이러스 H5N1에 의해 시험감염되었다. 상기 바이러스는 상기 마우스의 비강으로 투여되었다. 6 dpi에서 4개 집단의 마우스로부터 CD8+ T 세포가 단리되었고, 작동체 T 세포로 이용되었다.
동계 비장세포는 순수 C57BL/6 마우스 (예컨데, rIL-17A 사전-치료를 받지 않고, 인플루엔자 바이러스 사전감염도 되지 않은 마우스)로부터 준비되었다. 상기 동계 비장세포는 두 집단으로 나뉘었다. 첫번째 동계 비장세포 집단은 비활성화된 인플루엔자 A 바이러스 H5N1로 펄스되었고, 10 μM의 CFSE로 라벨되었다. 두번째 동계 비장세포는 0.5 μM의 CFSE로 라벨되었고, 음성 대조군으로 이용되었다.
상기 제 1 및 제 2 비장세포 집단은 4개 집단 마우스 각각으로부터 단리된 작동체 T 세포와 독립적으로 혼합되었다. 3 일 후, 특이적 용해는 유동 세포분석에 의해 분석되었다.
도 10b에서 보이는 바와 같이, rIL-17A로 사전-치료된 야생형 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 야생형 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포와 비교하였을 때 더 높은 수준의 항원-특이적 용해를 가졌다 (도 10b에서 차례로 WT CD8 + rIL-17A 및 WT CD8). 도 10b의 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표하며, 평균 ± SEM을 반영하며, 그리고 **p < 0.01 (비쌍체 슈트던트 t-테스트). 이 데이터에서 rIL-17A 사전-치료는 상기에서 논의된 생체 분석에서 관찰되는 바와 같이 CD8+ T 세포의 세포용해 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(도 10a 및 10b). 생산 IFN-γ를 생산하지 못하는 CD8+ T 세포는 rIL-17A 사전-치료된, 야생형 마우스로부터 단리된 CD8+ T와 비교하였을 때, 항원-특이적 용해 활성 수준이 상당히 감소되었다(도 10b, 차례로 IFN-γ KO CD8 및 WT CD8 + rIL-17A). 추가적으로, rIL-17A 사전-치료된, IFN-γ 녹아웃 마우스로부터 수득된 CD8+ T 세포는 rIL-17A 사전-치료를 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포의 항원-특이적 용해 활성 수준과 유사한 수준을 가졌다 (도 10b, 차례로 IFN-γ KO CD8 + rIL-17A 및 IFN-γ KO CD8). rIL-17A 사전-치료된, 야생형 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포의 CTL 활성과 비교하였을 때, rIL-17A 사전-치료를 받은 그리고 받지 않은 IFN-γ 녹아웃 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포의 CTL 활성은 차례로 약 3-배 및 약 2-배 감소되었다. 이들 데이터에서 CD8+ T 세포의 세포용해 활성은 야생형 마우스와 비교하여 IFN-γ 녹아웃 마우스에서 상당히 손상되었음이 드러났다. 이들 데이터에서 IFN-γ 생산없는, CD8+ T 세포의 세포용해 활성은 rIL-17A 사전-치료에 의해 유의미적으로 유도되지 않았다는 것 또한 드러났다.
요약하면, 생체내 그리고 시험관내 항원-특이적 용해 분석으로부터 얻은 데이터에서 rIL-17A 사전-치료에 의해 유도된 CD8+ T 세포의 세포용해 활성은 IFN-γ 생산에 의존적이라는 것이 설명되었다.
따라서, 상기 실시예들의 데이터와 함께, 이들 데이터에서 IL-17A 혈청 수준은 인플루엔자 바이러스에 감염된 마우스와 인간 모두에서 상당히 증가되었고, 인플루엔자 바이러스성 감염의 심각성은 인간에서 IL-17A 혈청 수준과 상응하며, IL-17A 녹아웃 마우스는 인플루엔자 바이러스 감염에 더 민감하였고, rIL-17A로 사전-치료는 투여분량 의존적 방식으로 마우스를 죽음으로부터 보호하였다는 것이 설명되었다. 인플루엔자 바이러스성 감염으로부터 IL-17A-중개된 보호(및 이에 대한 저상헝)은 항원-특이적 세포용해 활성을 갖는 IFN-γ 생산하는 CD8+ T 세포에 의해 촉진되었다. 이들 IFN-γ 생산하는 세포독성 CD8+ T 세포는 IL-17A 치료에 의해 유도되었다. 요약하면, IL-17A 치료는 이러한 IL-17A 치료를 받은 대상을 인플루엔자 바이러스성 감염으로부터 보호하는 항-바이러스 면역 반응을 상당히 유도하였다.
전술한 설명 및 수반 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 본 발명의 범위는 첨부 청구범위 및 이의 등가 범위에 의해 한정됨을 인지해야 한다.
공개된 구체예에 대하여 다양한 변화 및 수정은 당업자들에게 자명할 것이다. 화학 구조, 치환체, 유도체, 중간생성물, 합성, 조성물, 제제 또는 본 발명의 이용 방법이 포함된 이러한 변화 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 만들어 질 수 있다.
<110> Wang, Bin et al. <120> IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITION, THERAPEUTIC METHOD AND DIAGNOSTIC METHOD <130> VGX00134 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1115 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gaggctcaag tgcacccagc accagctgat caggacgcgc aaacatgagt ccagggagag 60 cttcatctgt gtctctgatg ctgttgctgc tgctgagcct ggcggctaca gtgaaggcag 120 cagcgatcat ccctcaaagc tcagcgtgtc caaacactga ggccaaggac ttcctccaga 180 atgtgaaggt caacctcaaa gtctttaact cccttggcgc aaaagtgagc tccagaaggc 240 cctcagacta cctcaaccgt tccacgtcac cctggactct ccaccgcaat gaagaccctg 300 atagatatcc ctctgtgatc tgggaagctc agtgccgcca ccagcgctgt gtcaatgcgg 360 agggaaagct ggaccaccac atgaattctg ttctcatcca gcaagagatc ctggtcctga 420 agagggagcc tgagagctgc cccttcactt tcagggtcga gaagatgctg gtgggtgtgg 480 gctgcacctg cgtggcctcg attgtccgcc aggcagccta aacagagacc cgcggctgac 540 ccctaagaaa cccccacgtt tctcagcaaa cttacttgca tttttaaaac agttcgtgct 600 attgattttc agcaaggaat gtggattcag aggcagattc agaattgtct gccctccaca 660 atgaaaagaa ggtgtaaagg 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tcctgaagag ggagcctgag agctgcccct tcactttcag ggtcgagaag 420 atgctggtgg gtgtgggctg cacctgcgtg gcctcgattg tccgccaggc agcctaa 477 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Ser Pro Gly Arg Ala Ser Ser Val Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser 20 25 30 Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys 35 40 45 Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg 50 55 60 Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His 65 70 75 80 Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln 85 90 95 Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His 100 105 110 Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu 115 120 125 Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly 130 135 140 Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser Ile Val Arg Gln Ala Ala 145 150 155 <210> 4 <211> 1874 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaattccggc aggcacaaac 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Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 7 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized Mouse IL-17A Nucleotide Sequence <400> 7 ggatccgcca ccatgtctcc aggtcgggct tccagtgtct ctctgatgct gctgctgctg 60 ctctccctcg ccgccacagt gaaggctgcc gctattattc ctcagagctc cgcctgccca 120 aacactgagg ctaaggactt cctgcagaac gtgaaggtca atctgaaagt gtttaattcc 180 ctcggcgcta aagtctctag taggagaccc tctgattacc tgaacaggtc aaccagccct 240 tggacactcc accgaaatga ggaccccgat 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<223> Amino Acid Sequence Encoded by Optimized Mouse IL-17A Nucleic Acid Sequences <400> 9 Met Ser Pro Gly Arg Ala Ser Ser Val Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser 20 25 30 Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys 35 40 45 Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg 50 55 60 Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His 65 70 75 80 Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln 85 90 95 Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His 100 105 110 Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu 115 120 125 Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly 130 135 140 Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser Ile Val Arg Gln Ala Ala 145 150 155 <210> 10 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized Human IL-17A Nucleotide Sequence <400> 10 ggatccgcca ccatgacccc tggaaaaaca agtctggtgt 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aacgctgacg ggaatgtgga ttatcatatg aattcagtcc caatccagca ggagattctg 360 gtcctgcgga gagaaccccc tcactgtccc aacagctttc gactggaaaa aatcctggtg 420 tccgtgggct gtacctgcgt gactccaatc gtccatcatg tggct 465 <210> 12 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence Encoded by Optimized Human IL-17A Nucleic Acid Sequences <400> 12 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader sequence <400> 13 atggactgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgcgtgca tagc 54 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader sequence <400> 14 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser

Claims (30)

  1. 인플루엔자 바이러스에 대항하여 치료를 요하는 대상을 치료하는 방법에 있어서, 이 방법은 IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 대상은 이로 인하여 다중 인플루엔자 바이러스 아형들에 대항하여 저항성이 되는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 면역치료요법적 조성물의 투여는 전기천공 또는 주사를 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H5N1, H7N9, 또는 H1N1인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H5N1인, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 A 바이러스는 아형 H7N9인, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 대상의 면역 반응은 최소한 약 4-배 증가되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 이때 상기 대상의 면역 반응은 최소한 약 2-배 증가되는, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 이때 증가된 상기 대상의 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 최소한 약 70% 생존을 제공하는, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 이때 증가된 상기 대상의 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 최소한 약 100% 생존을 제공하는, 방법.
  12. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17 펩티드를 인코드하는 핵산을 더 포함하는, 방법.
  13. 청구항 2에 있어서, 이때 상기 면역치료요법적 조성물은 아밀로라이드, 인플루엔자 항원, 및 인터루킨으로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함하는, 방법.
  14. 인플루엔자 바이러스성 감염 진단을 필요로 하는 대상에서 이를 진단하는 방법에 있어서, 이 방법은
    (a) 상기 대상으로부터 획득된 시료를 제공하고;
    (b) 상기 시료내 IL-17 수준을 측정하고;
    (c) 상기 측정된 IL-17 수준을 IL-17의 역치 수준과 비교하고; 그리고
    (d) 만일 측정된 IL-17 수준이 IL-17의 역치 수준보다 더 높다면, 상기 대상은 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 판단하는 것이 포함된 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 이때 IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 이때 시료는 혈액 시료, 혈장 시료, 또는 혈청 시료인, 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물을 인플루엔자 바이러스에 감염된 대상에게 투여하는 것을 더 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 방법.
  19. 청구항 14에 있어서,약한 인플루엔자 바이러스성 감염과 심각한 인플루엔자 바이러스성 감염을 구별하는 것을 더 포함하는, 방법.
  20. 청구항 14에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 바이러스는 아형 H5N1, H1N1, 또는 H7N9인, 방법.
  21. IL-17을 포함하는 면역치료요법적 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 이때 IL-17은 서열 번호:10 또는 서열 번호:11에 의해 인코드되는, 면역치료요법적 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, 이때 이때 IL-17은 서열 번호:12에서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 면역치료요법적 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, 이때 IL-17은 핵산에 의해 인코드되며, 이때 상기 면역치료요법적 조성물은 IL-17 펩티드를 더 포함하는, 면역치료요법적 조성물.
  25. 청구항 21에 있어서, 아밀로라이드, 인플루엔자 항원, 및 인터루킨으로 구성된 집단으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 다른 항원들을 더 포함하는, 면역치료요법적 조성물.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 인플루엔자 항원은 H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, BHA 항원, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 집단에서 선택되는, 면역치료요법적 조성물.
  27. 청구항 25에 있어서, 이때 상기 인터루킨은 IL-23, IL-33, IL-21 및 이의 조합으로 구성된 집단에서 선택되는, 면역치료요법적 조성물.
  28. 청구항 21에 있어서, 약학적으로 수용가능한 부형제를 더 포함하는, 면역치료요법적 조성물.
  29. 청구항 21에 있어서, 이때 IL-17은 IL-17 펩티드의 단량체인, 면역치료요법적 조성물.
  30. 청구항 21에 있어서, 이때 IL-17은 IL-17 펩티드의 이량체인, 면역치료요법적 조성물.
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