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KR101809858B1 - 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산을 이용한 병용 치료 - Google Patents

항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산을 이용한 병용 치료 Download PDF

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에이치. 마이클 셰퍼드
커티스 비. 톰슨
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할로자임, 아이엔씨
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Abstract

본원 발명은 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 및 종양-표적 탁산, 및 선택적으로 추가적인 화학 치료 제제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 병용 치료를 제공한다. 병용 치료는 암 및 특히 고형 종양 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.

Description

항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산을 이용한 병용 치료 {COMBINATION THERAPY WITH AN ANTI-HYALURONAN AGENT AND A TUMOR-TARGETED TAXANE}
본원 발명은 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소, 및 종양-표적 탁산, 및 선택적으로 추가적인 화학 치료 제제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 병용 치료를 제공한다. 상기 병용 치료는 암 및 특히 고형 종양암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PH20은 암 및 특히 히알루로난-연관된 암 또는 종양을 포함하는 히알루로난-연관된 질환 또는 상태를 치료하는 방법에 사용된다. 히알루로난(히알루론 산; HA)은 포유류 내 결합 조직(connective tissue), 피부, 연골 및 윤활액(synovial fluid)에서 주로 존재하는 글리코사미노글리칸이다. 결합 조직에서, 히알루로난과 연관된 수화수(water of hydration)는 조직 사이에 수화된 기질들(matrices)을 만든다. HA는 많은 세포의 세포외 기질, 특히 연결합 조직(soft connecitve tissue)에서 발견된다. 특정 질환은 고형 종양을 포함하여 히알루로난의 발현 및/또는 생산과 연관되어 있다. 항-히알루로난 제제는 HA 합성 또는 분해를 조절하는 제제로써, 조직 또는 세포 내 HA 수준을 변경한다. 특히, 히알루로니다아제는 히알루로난을 분해하는 효소이다. HA의 분해를 촉진함으로써, 히알루로니다아제는 암 및 종양을 포함하여, HA 또는 다른 글리코사미노글리칸의 축적과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 암, 특히 고형 종양 암의 치료를 위해, 증진 또는 변경된 치료법에 대한 요구가 있다.
관련된 출원
본 출원은 2012년 4월 4일 출원된, 발명의 명칭이 "폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 및 치료학적 제제를 이용한 병용 치료"인 미국 가출원번호 제61/686,429호 및 2012년 10월 16일 출원된, 발명의 명칭이 "항-히알루로난 제제 및 치료학적 제제를 이용한 병용 치료"인 미국 가출원번호 제61/714,719호의 우선권의 이익을 주장한다.
본 출원은 미국 가출원번호 제61/686,429호 및 미국 가출원번호 제61/714,719호의 우선권의 이익을 주장하는 발명의 명칭이 "항-히알루로난 제제 및 치료학적 제제를 이용한 병용 치료"이고 상기와 동일자에 출원된 미국 특허 출원 번호(변호사 도켓 번호 제33320.03108.US02호)와 관련되어 있다.
본 출원은 미국 공개공보 제 US20100003238호로 공개되고 미국 가출원 번호 제61/124,278호, 제61/130,357호 및 제61/195,624호의 우선권을 주장하는 2009년 4월 14일자로 출원된 발명의 명칭이 "변형된 히알루로니다아제 및 히알루로난-관련 질환 및 상태를 치료하는 용도"인 미국 특허 출원번호 제12/386,222호와 관련되어 있다. 본 출원은 WO2009/128917로 공개되고 또한 미국 가출원 번호 제61/124,278호, 제61/130,357호 및 제61/195,624호의 우선권을 주장하는 2009년 4월 14일에 출원된 국제 PCT 출원번호 PCT/US2009/002352호와 또한 관련되어 있다.
본 출원은 미국 공개공보 제 US20120020951호로 공개되고 미국 가출원 번호 제61/399,993호 및 제61/455,260호의 우선권을 주장하는 2011년 7월 15일자로 출원된 발명의 명칭이 "항-히알루로난제의 투여와 관련된 유해 부작용 및 부작용을 개선 또는 예방하는 방법"인 미국 특허 출원번호 제13/135,817호와 관련되어 있다. 본 출원은 WO2012/012300로 공개되고 또한 미국 가출원 번호 제61/399,993호 및 제61/455,260호의 우선권을 주장하는 2011년 7월 15일에 출원된 국제 PCT 출원번호 PCT/US2011/044281호와 또한 관련되어 있다.
상기 표시된 관련된 출원 각각의 주제는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
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요약
본원 발명은 항-히알루로난 제제를 포함하는 조성물 및 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 또한, 본원 발명은 항-히알루로난 제제를 포함하는 조성물, 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물 및 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 본원 발명은 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물을 더 포함할 수 있는 상기 임의의 조합물을 제공한다. 본원 발명은 항-히알루로난 제제를 포함하는 조성물 및 종양-표적 탁산 제형을 포함하는 조성물이 투여되는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물의 투여를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 코르티코스테로이드의 투여를 더 포함한다. 또다른 실시예에서, 상기 방법은 암 치료의 수행(투여)을 더 포함한다. 이러한 조합물 및 방법에서, 상기 제제는 본원에서 기술된 치료학적 유효량으로 제공된다.
또한, 본원 발명은 병용 치료의 의약적 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원 발명은 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산이 각각 또는 함께 제형화된 암을 치료하기 위한 항-히알루로난-제제 및 종양-표적 탁산의 용도를 제공한다. 또한 본원 발명은 암을 치료하기 위한 항-히알루로난 제제의 용도를 제공하며, 여기서 상기 치료는 종양-표적 탁산을 대상체에 대하여 동시에, 분리하여 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 또한 본원 발명은 암의 치료에 사용하기 위한 항-히알루로난 제제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 치료는 종양-표적 탁산을 대상체에 대하여 동시에, 분리하여 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 본원의 의약 용도의 실시예에서, 상기 치료는 또한 항-히알루로난 제제 또는 종양-표적 탁산과 동시에, 분리하여 또는 순차적으로 뉴클레오시드 유사체를 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 다른 또는 추가적인 실시예에서, 상기 치료는 항-히알루로난 제제와 동시에, 분리하여 또는 순차적으로 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
상기 본원에서 제공되는 조합물, 조성물, 방법 및 용도에서, 상기 항-히알루로난 제제는 히알루로난 분해 효소 또는 히알루로난 합성을 억제하는 제제이다. 일부 실시예에서, 상기 항-히알루로난 제제는 히알루로니다아제인 히알루로난 분해 효소이다. 다른 실시예에서, 상기 항-히알루로난 제제는 폴리머에 대해 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소이다. 일부 실시예에서, 상기 항-히알루로난 제제는 HA 생성 효소(synthase)에 대한 센스 또는 안티센스 핵산 분자로부터 선택되거나 저분자 약물이다. 일부 실시예에서, 상기 항-히알루로난 제제는 4-메틸움벨리페론(MU) 또는 이의 유도체, 또는 레플루노마이드 또는 이의 유도체로부터 선택된 저분자 약물이다. 다른 실시예에서, 상기 항-히알루로난 제제는 6,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린 또는 5,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린으로부터 선택된 4-메틸움벨리페론(MU)의 유도체인 저분자 약물이다.
본원 발명은 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물 및 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 또한 본원 발명은 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물, 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물 및 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 본원 발명은 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물을 더 포함할 수 있는 상기 임의의 조합물을 제공한다. 본원 발명은 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물 및 종양-표적 탁산 제형을 포함하는 조성물이 투여되는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물의 투여를 더 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 코르티코스테로이드의 투여를 더 포함한다. 또다른 실시예에서, 상기 방법은 암 치료의 수행(투여)를 더 포함한다.
본원 발명은 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물, 여기서 상기 히알루로난-분해 효소는 폴리머에 컨주게이션되며; 및 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물을 포함하는 조합물, 방법 및 용도를 제공한다. 상기 조합물의 일부 실시예에서, 상기 조성물은 직접 투여를 위해 제형화되고, 상기 히알루로난 분해 효소의 농도는 종양-연관된 히알루로난을 분해하기 충분하며, 및 상기 종양-표적 탁산의 농도는 종양 내 전달을 성취하기 충분하다. 일부 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산 제형의 농도는 종양 내 탁산 제형의 부재에서 뉴클레오시드 탈아미노산 효소의 수준 또는 활성과 대비하여 종양 내 뉴클레오시드 탈아미노 효소(deaminase) 단백질 수준 또는 단백질 활성을 감소시키기 충분하다. 상기 조합물의 일부 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산은 공-제형화된다. 상기 조합물의 다른 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산은 분리되어 제공된다.
상기 임의의 실시예에서, 상기 제공되는 조합물은 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 조성물은 직접 투여를 위하여 제형화되고 상기 뉴클레오시드 유사체의 농도는 종양 내 전달을 성취하기 충분하다. 상기 조합물의 일부 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산으로부터 분리되어 제공된다. 상기 조합물의 다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 상기 히알루로난 분해 효소와 함께 공제형화되거나 또는 상기 종양 표적 탁산과 함께 공제형화된다. 상기 조합물의 또다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 상기 히알루로난 분해 효소 및 종양-표적 탁산으로 공제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물, 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물 및/또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물은 다중 용량 투여(multiple dosage administration)를 위해 제형화된다. 본원에서 제공되는 상기 조합물의 다른 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물, 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물 및/또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물은 단일 용량 투여(single dosage administration)를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 조성물은 약 0.5 μg 내지 50 mg, 100 μg 내지 1 mg, 1 mg 내지 20 mg, 100 μg 내지 5 mg, 0.5 μg 내지 1450 μg, 1 μg 내지 1000 μg, 5 μg 내지 1250 μg, 10 μg 내지 750 μg, 50 μg 내지 500 μg, 0.5 μg 내지 500 μg, 500 μg 내지 1450 μg 의 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하거나 포함하도록 제형화된다. 본원에서 제공되는 상기 조합물의 다른 실시예에서, 상기 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소는 적어도 약 20,000 U/mg, 25,000 U/mg, 30,000 U/mg, 31,000 U/mg, 32,000 U/mg, 33,000 U/mg, 34,000 U/mg, 35,000 U/mg, 36,000 U/mg, 37,000 U/mg, 38,000 U/mg, 39,000 U/mg, 40,000 U/mg, 45,000 U/mg, 50,000 U/mg, 55,000 U/mg, 60,000 U/mg 또는 그 이상의 비활성(specific activity)을 가진다. 본원에서 제공되는 상기 조합물의 추가적인 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 조성물은 약 150 유닛(U) 내지 60,000U, 300 U 내지 30,000 U, 500 U 내지 25,000 U, 500 U 내지 10,000 U, 150 U 내지 15,000 U, 150 U 내지 5000 U, 500 U 내지 1000 U, 5000 U 내지 45,000 U 10,000 U 내지 50,000 U or 20,000 U 내지 60,000 U의 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함한다. 상기 히알루로난 분해 효소를 포함하는 상기 조성물의 부피는 약 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 40 mL, 1 mL 내지 20 mL, 1 mL 내지 10 mL, 또는 3 mL 내지 10 mL일 수 있다. 본원에서 제공되는 상기 조합물의 일부 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물은 히스티딘 및/또는 염화나트륨을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물은 약 6.0 내지 7.4인 pH를 가진다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 히알루로니다아제이다. 예를 들어, 상기 히알루로니다아제는 PH20 또는 C-말단 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 부착 부위 또는 GPI 부착 부위의 부분이 결여된 이의 절단 형태일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로니다아제는 인간 또는 비-인간 PH20인 PH20이다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 절단된 PH20이고 상기 절단된 PH20은 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로니다아제는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함하는 PH20이다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 PH20은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하거나; 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 85 %이상의 서열동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 이의 변이체이다. 예를 들어, 상기 PH20은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 파크리탁셀 또는 도세탁셀이거나 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드러그이다. 상기 종양-표적 탁산은 종양 표적 모이어티(moiety)에 대하여 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 마이셀, 나노파티클, 마이크로스피어, 리포좀 또는 하이드로젤 중 선택된 전달 비히클로 제형화된다. 상기 전달 비히클은 종양 표적 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 고분자(macromolecule), 단백질, 펩티드, 단일클론 항체 또는 지방산 지질 중 선택된다. 다른 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 중 선택되는 단일 클론 항체이다. 또다른 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 알부민이다. 일부 실시예에서, 상기 종양 표적 탁산은 알부민-결합 파크리탁셀 또는 알부민-결합 도세탁셀이다.
본원 발명에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산 조성물은 약 10 mg 내지 1000 mg, 예컨대 20 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 250 mg, 75 mg 내지 400 mg, 100 mg 내지 200 mg, 150 mg 내지 400 mg, 200 mg 내지 800 mg, 50 mg 내지 200 mg 또는 50 mg 내지 150 mg의 종양-표적 탁산을 포함하거나 포함하도록 제형화된다. 다른 실시예에서, 상기 종양 표적 탁산을 포함하는 조성물의 부피는 약 0.5 mL 내지 100 mL, 1 mL 내지 500 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 40 mL, 1 mL 내지 20 mL, 1 mL 내지 10 mL 또는 3 mL 내지 10 mL이다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 퓨린 또는 피리미딘 유사체 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 플루오로피리미딘 5-플루오로우라실(fluoropyrimidine 5-fluorouracil), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘(5-fluoro-2'-deoxycytidine), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 트로사시타빈(troxacitabine), 데시타빈(decitabine), 아자시티딘(Azacytidine), 슈도이소시티딘(pseudoisocytidine), 제부라린(Zebularine), 안시타빈(Ancitabine), 파자라빈(Fazarabine), 6-아자시티딘(6-azacytidine), 카페시타빈(capecitabine), N4-옥타데실-시타라빈(N4-octadecyl cytarabine), 엘라이드산 시타라빈(elaidic acid cytarabine), 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 넬아라빈(nelarabine), 포로데신(forodesine), 및 펜토스타틴(pentostatin) 또는 이들의 유도체 중 선택된다. 일실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 아데노신 탈아미노 효소 또는 시티딘 탈아미노 효소인 뉴클레오시드 탈아미노 효소에 대한 기질이다. 일부 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 플루다라빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈 및 아자시티딘 또는 이들의 유도체 중에서 선택된다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체 조성물은 100 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2500 mg, 1000 mg 내지 2500 mg, 1500 mg 내지 2500 mg 또는 2000 mg 내지 5000 mg의 뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 포함하도록 제형화된다. 다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물의 부피는 약 0.5 mL 내지 1000 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 500 mL, 1 mL 내지 10 mL이다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 조합물, 방법 및 용도는 코르티코스테로이드를 포함하는 조성물을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 코르티손(cortisones), 덱사메타손(dexamethasones), 하이드로코르티손(hydrocortisones), 메틸프레드니솔론(methylprednisolones), 프레드니솔론(prednisolones) 및 프레드니손(prednisones)으로부터 선택된 글루코코르티코이드이다. 일부 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드 조성물은 약 0.1 내지 20 mgs, 0.1 내지 15 mgs, 0.1 내지 10 mgs, 0.1 내지 5 mgs, 0.2 내지 20 mgs, 0.2 내지 15 mgs, 0.2 내지 10 mgs, 0.2 내지 5 mgs, 0.4 내지 20 mgs, 0.4 내지 15 mgs, 0.4 내지 10 mgs, 0.4 내지 5 mgs, 0.4 내지 4 mgs, 1 내지 20 mgs, 1 내지 15 mgs 또는 1 내지 10 mgs의 코르티코스테로이드를 포함하거나 포함하도록 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 조성물(들)은 경구, 정맥(IV), 피하, 근육 내, 종양 내, 피내, 국소, 경피, 직장, 경막내 또는 표피 하로 투여하기 위해 제형화된다. 예를 들어, 상기 조성물(들)은 정맥 투여 또는 피하 투여를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 조합물, 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜, 덱스트란, 풀루란 또는 셀룰로오즈이다. 일실시예에서, 상기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)로부터 선택되는 폴리알킬렌 글리콜이다. 특정 실시예에서, 상기 폴리머는 PEG이고, 상기 PEG는 분쇄 또는 직쇄 PEG이다. 일부 실시예에서, 상기 폴리머는 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (5 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-부티르알데히드 (mPEG-부티르알데히드) (30 kDa), 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (30 kDa); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (10 kDa 분쇄); (메톡시 폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (20 kDa 분쇄); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (40 kDa 분쇄); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (60 kDa 분쇄); 비오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(비오틴-PEG-NHS) (5 kDa 비오틴화); 폴리(에틸렌 글리콜)-p-니트로페닐 카르보네이트 (PEG-p-니트로페닐-카르보네이트) (30 kDa); 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-프로피온알데히드 (PEG-프로피온알데히드) (30 kDa)로 반응에 의해 생산된다. 특정 실시예에서, 상기 폴리머는 약 30 킬로달톤(kilodalton)의 분자량을 가지는 PEG이다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 조합물은 키트로 패킹(package)되고 선택적으로 사용을 위한 지침서를 포함할 수 있다.
또한, 본원 발명은 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물이 투여되며, 여기서 상기 히알루로난-분해 효소는 폴리머에 컨주게이션되며, 및 종양-표적 탁산 제형을 포함하는 조성물이 투여되는, 암을 치료하는 방법 및 용도가 제공된다. 상기 방법의 임의의 실시예에서, 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물은 또한 투여된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 암은 종양이다. 일실시예에서, 상기 종양은 고형 종양이다. 본원의 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 종양은 같은 조직 타입의 비-암화 조직과 대비하거나 같은 종양 타입의 비-전이 종양과 대비하여, 히알루로난의 증가된 세포 및/또는 기질 발현을 가진다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 암은 췌장암, 난소암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁 경부암, 두경부암 및 유방암으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 암은 췌장암이다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 히알루로니다아제이다. 예를 들어, 상기 히알루로니다아제는 PH20 또는 C-말단 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 부착 부위 또는 GPI 부착 부위의 부분이 결여된 이의 절단 형태이다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로니다아제는 인간 또는 비-인간 PH20인 PH20이다. 특정 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 절단된 PH20이고 상기 절단된 PH20은 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 PH20은 적어도 서열번호 1의 아미노산 36-464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 PH20은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하거나; 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 85 %이상의 서열동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 이의 변이체이다. 또다른 실시예에서, 상기 PH20은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열의 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 또는 500 번째 아미노산 위치 뒤에 C-말단 절단을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜, 덱스트란, 풀루란 또는 셀룰로오즈이다. 일실시예에서, 상기 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)로부터 선택되는 폴리알킬렌 글리콜이다. 특정 실시예에서, 상기 폴리머는 PEG이고, 상기 PEG는 분쇄 또는 직쇄 PEG이다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 폴리머는 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (5 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 부타노에이트 (mPEG-SBA) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 α-메틸부타노에이트 (mPEG-SMB) (30 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-부티르알데히드 (mPEG-부티르알데히드) (30 kDa), 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (20 kDa); 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)-숙신이미딜 프로피오네이트 (mPEG-SPA) (30 kDa); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (10 kDa 분쇄); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (20 kDa 분쇄); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시 숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (40 kDa 분쇄); (메톡시-폴리(에틸렌 글리콜))2-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (mPEG2-NHS) (60 kDa 분쇄); 비오틴-폴리(에틸렌 글리콜)-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(비오틴-PEG-NHS) (5 kDa 비오틴화); 폴리(에틸렌 글리콜)-p-니트로페닐 카르보네이트 (PEG-p-니트로페닐-카르보네이트) (30 kDa); 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-프로피온알데히드 (PEG-프로피온알데히드) (30 kDa)로 반응에 의해 생산된다. 특정 실시예에서, 상기 폴리머는 약 30 킬로달톤(kilodalton)의 분자량을 가지는 PEG이다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 약 (대상체의) 0.01 μg/kg 내지 25 mg/kg, 0.5 μg/kg 내지 25 mg/kg, 0.5 μg/kg 내지 10 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 1.5 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 15 μg/kg, 0.05 μg/kg 내지 10 μg/kg, 0.75 μg/kg 내지 7.5 μg/kg 또는 (대상체의) 1.0 μg/kg 내지 3.0 μg/kg의 투여량 범위로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 (대상체의) 1 Unit/kg 내지 800,000 Units/kg, 예컨대 10 내지 800,000 Units/kg, 10 내지 750,000 Units/kg, 10 내지 700,000 Units/kg, 10 내지 650,000 Units/kg, 10 내지 600,000 Units/kg, 10 내지 550,000 Units/kg, 10 내지 500,000 Units/kg, 10 내지 450,000 Units/kg, 10 내지 400,000 Units/kg, 10 내지 350,000 Units/kg, 10 내지 320,000 Units/kg, 10 내지 300,000 Units/kg, 10 내지 280,000 Units/kg, 10 내지 260,000 Units/kg, 10 내지 240,000 Units/kg, 10 내지 220,000 Units/kg, 10 내지 200,000 Units/kg, 10 내지 180,000 Units/kg, 10 내지 160,000 Units/kg, 10 내지 140,000 Units/kg, 10 내지 120,000 Units/kg, 10 내지 100,000 Units/kg, 10 내지 80,000 Units/kg, 10 내지 70,000 Units/kg, 10 내지 60,000 Units/kg, 10 내지 50,000 Units/kg, 10 내지 40,000 Units/kg, 10 내지 30,000 Units/kg, 10 내지 20,000 Units/kg, 10 내지 15,000 Units/kg, 10 내지 12,800 Units/kg, 10 내지 10,000 Units/kg, 10 내지 9,000 Units/kg, 10 내지 8,000 Units/kg, 10 내지 7,000 Units/kg, 10 내지 6,000 Units/kg, 10 내지 5,000 Units/kg, 10 내지 4,000 Units/kg, 10 내지 3,000 Units/kg, 10 내지 2,000 Units/kg, 10 내지 1,000 Units/kg, 10 내지 900 Units/kg, 10 내지 800 Units/kg, 10 내지 700 Units/kg, 10 내지 500 Units/kg, 10 내지 400 Units/kg, 10 내지 300 Units/kg, 10 내지 200 Units/kg, 10 내지 100 Units/kg, 16 내지 600,000 Units/kg, 16 내지 500,000 Units/kg, 16 내지 400,000 Units/kg, 16 내지 350,000 Units/kg, 16 내지 320,000 Units/kg, 16 내지 160,000 Units/kg, 16 내지 80,000 Units/kg, 16 내지 40,000 Units/kg, 16 내지 20,000 Units/kg, 16 내지 16,000 Units/kg, 16 내지 12,800 Units/kg, 16 내지 10,000 Units/kg, 16 내지 5,000 Units/kg, 16 내지 4,000 Units/kg, 16 내지 3,000 Units/kg, 16 내지 2,000 Units/kg, 16 내지 1,000 Units/kg, 16 내지 900 Units/kg, 16 내지 800 Units/kg, 16 내지 700 Units/kg, 16 내지 500 Units/kg, 16 내지 400 Units/kg, 16 내지 300 Units/kg, 16 내지 200 Units/kg, 16 내지 100 Units/kg, 160 내지 12,800 Units/kg, 160 내지 8,000 Units/kg, 160 내지 6,000 Units/kg, 160 내지 4,000 Units/kg, 160 내지 2,000 Units/kg, 160 내지 1,000 Units/kg, 160 내지 500 Units/kg, 500 내지 5000 Units/kg, 1000 내지 100,000 Units/kg 또는 (대상체의) 1000 내지10,000 Units/kg의 투여량 범위로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 파크리탁셀 또는 도세탁셀이거나, 또는 이의 유사체, 유도체 또는 프로드러그이다. 상기 종양-표적 탁산은 종양 표적 모이어티(moiety)에 대하여 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 마이셀, 나노파티클, 마이크로스피어, 리포좀 또는 하이드로젤 중 선택된 전달 비히클로 제형화된다. 상기 전달 비히클은 종양 표적 모이어티에 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 고분자(macromolecule), 단백질, 펩티드, 단일클론 항체 또는 지방산 지질 중 선택된다. 다른 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 세툭시맙 또는 트라스투주맙 중 선택되는 단일 클론 항체이다. 또다른 실시예에서, 상기 종양 표적 모이어티는 알부민이다. 특정 실시예에서, 상기 종양 표적 탁산은 알부민-결합 파크리탁셀 또는 알부민-결합 도세탁셀이다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 약 1 mg/m2 내지 1000 mg/m2(대상체의 체표면적), 10 mg/m2 내지 500 mg/m2, 50 mg/m2 내지 400 mg/m2, 또는 25 mg/m2 내지 300 mg/m2의 투여량 범위로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 퓨린 또는 피리미딘 유사체 또는 이들의 유도체이다. 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 플루오로피리미딘 5-플루오로우라실, 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 시타라빈, 젬시타빈, 트로사시타빈, 데시타빈, 아자시티딘, 슈도이소시티딘(pseudoisocytidine), 제부라린, 안시타빈, 파자라빈, 6-아자시티딘, 카페시타빈, N4-옥타데실-시타라빈, 엘라이드산 시타라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 넬아라빈, 포로데신 및 펜토스타틴, 또는 이들의 유도체 중 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드 탈아미노 효소에 대한 기질이며 상기 뉴클레오시드 탈아미노 효소는 아데노신 탈아미노 효소 또는 시티딘 탈아미노 효소이다. 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 플루다라빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈 및 아자시티딘 또는 이들의 유도체 중에서 선택된다. 또다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 젬시타빈 또는 이의 유도체이다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 약 100 mg/m2 내지 2500 mg/m2, 500 mg/m2 내지 2000 mg/m2, 750 mg/m2 내지 1500 mg/m2, 1000 mg/m2 내지 1500 mg/m2 또는 500 mg/m2 내지 1500 mg/m2인 투여량으로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 적어도 약 200 mg/m2 또는 500 mg/m2 이지만 1000 mg/m2 또는 1250 mg/m2 이하인 양으로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 조성물(들)은 경구, 정맥(IV), 피하, 근육 내, 종양 내, 피내, 국소, 경피, 직장, 경막내 또는 표피 하로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다. 특정 실시예에서, 상기 조성물(들)은 정맥 또는 피하로 투여된다. 본원의 임의의 상기 방법 또는 용도에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 상기 종양-표적 탁산보다 전에, 동시 또는 거의 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여되거나 사용된다.
본원에서 제공되는 상기 방법의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 종양-표적 탁산의 투여 전에 투여된다. 일실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 적어도 약 종양-표적 탁산의 투여 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 전에 투여된다. 본원에서 제공되는 상기 방법의 또다른 실시예에서, 상기-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산은 동시 또는 거의 동시에 투여된다.
본원에서 제공되는 방법의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난 분해 효소의 투여 빈도는 매주2회, 매주1회, 매14일에 1회, 매21일에 1회 또는 매달 1회이다. 다른 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산의 투여 빈도는 매주2회, 매주1회, 매14일에 1회, 매21일에 1회 또는 매달 1회이다. 본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 및/또는 종양-표적 탁산은 뉴클레오시드 유사체보다 전에, 동시 또는 거의 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여되거나 투여를 위해 제형화된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 또는 용도의 임의의 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산은 투여 주기 내 미리 결정된 수주 동안 투여된다. 일실시예에서, 상기 미리 결정된 수주는 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 4주일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소는 적어도 약 뉴클레오시드 유사체의 투여 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 전에 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 적어도 약 뉴클레오시드 유사체의 투여 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간 또는 24 시간 전에 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 종양-표적 탁산은 뉴클레오시드 유사체와 동시 또는 거의 동시에 투여된다. 상기 제공되는 방법에서, 상기 뉴클레오시드 유사체의 투여 빈도는 매주 2회, 매주 1회, 매14일에 1회, 매21일에 1회 또는 매달 1회일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 투여 주기 내 미리 결정된 수주 동안 투여된다. 예를 들어, 상기 미리 결정된 수주는 적어도 2주, 적어도 3주 또는 적어도 4주일 수 있다. 본원에서 제공되는 상기 방법의 또다른 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체의 미리 결정된 수주 투여 후에, 투여는 첫 번째 미리 결정된 기간에 대해 중단되며, 그리고 나서 적어도 일주일동안 재개된다.
본원에서 제공되는 방법 또는 용도의 특정 실시예에서, 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산은 뉴클레오시드 유사체의 투여 전에 투여되고; 동시 또는 거의 동시에 투여되고; 및 미리 결정된 수주 동안 매주2회 또는 매주1회의 투여 빈도로 투여된다. 일부 실시예에서, 상기 미리 결정된 수주는 4주이다. 이러한 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 적어도 약 상기 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산의 투여 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 후에 투여된다.
본원에서 제공되는 상기 방법 및 용도의 임의의 실시예에서, 상기 뉴클레오시드 유사체는 미리 결정된 수주 동안 매주1회 투여된다. 일실시예에서, 상기 미리 결정된 수주는 3주이다. 이러한 실시예에서, 상기 투여는 적어도 일주일 동안 중단될 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 방법 또는 용도에서, 상기 투여의 주기 및/또는 투여의 중단은 복수 회 반복될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 투여의 첫번째 주기 내 투여 빈도는 투여의 차후 주기 내 투여와 같거나 다르다. 예를 들어, 투여 빈도는 첫 번째 투여 주기 내 매주 2회 및 차후 투여 주기 내 매주 1회이다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 방법 또는 용도는 코르티코스테로이드의 투여하는 단계를 더 포함할 수 있거나 코르티코스테로이드를 투여하는 것을 포함하는 치료를 더 포함할 수 있다. 이러한 임의의 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손으로부터 선택될 수 있는 글루코코르티코이드이다. 상기 방법의 일부 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소의 투여 전에, 동시에, 간헐적으로 또는 이후에 투여된다. 일실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소와 함께 공-투여된다. 또다른 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 적어도 약 히알루로난-분해 효소의 투여 1시간 전에 투여된다. 상기 제공되는 방법의 또다른 실시예에서, 상기 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소의 투여 후 적어도 8 시간 내지 12 시간에 투여된다. 일부 실시예에서, 투여되거나 투여를 위해 제형화되는 코르티코스테로이드의 양은 0.1 내지 20 mgs, 0.1 내지 15 mgs, 0.1 내지 10 mgs, 0.1 내지 5 mgs, 0.2 내지 20 mgs, 0.2 내지 15 mgs, 0.2 내지 10 mgs, 0.2 내지 5 mgs, 0.4 내지 20 mgs, 0.4 내지 15 mgs, 0.4 내지 10 mgs, 0.4 내지 5 mgs, 0.4 내지 4 mgs, 1 내지 20 mgs, 1 내지 15 mgs 또는 1 내지 10 mgs이다. 상기 코르티코스테로이드는 경구로 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 상기 방법 또는 용도는 암 치료의 수행(투여)을 더 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 암 치료는 수술, 방사선, 화학 치료 제제, 생물학 제제, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 저분자, 유전자 치료 벡터, 바이러스 및 DNA 중으로부터 선택된다. 본원에서 제공되는 임의의 상기 방법은 인간인 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또한 본원 발명은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 본원에서 제공되는 상기 조성물의 조합물의 용도를 제공한다. 본원에서 제공되는 임의의 상기 조성물의 조합물은 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 암은 종양이다. 예를 들어, 상기 암은 고형 종양이다. 일부 실시예에서, 상기 종양은 같은 조직 타입의 비-암화 조직과 대비하거나 같은 종양 타입의 비-전이 종양과 대비하여, 히알루로난의 증가된 세포 및/또는 기질 발현을 가진다. 일부 실시예에서, 상기 암은 췌장암, 난소암, 폐암, 대장암, 전립선암, 자궁 경부암, 두경부암 및 유방암으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 암은 췌장암이다. 또한 본원 발명은 폴리머에 컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 및 뉴클레오시드 유사체의 종양 내 활성을 증가시키기 위한 종양-표적 탁산을 포함하는 조성물을 포함하는 조합물의 용도를 제공한다.
도 1은 마우스 BxPC-3 PDA 종양 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 PEGPH20 (P) 및/또는 납-파크리탁셀 (NAB, N)의 효과를 보여준다.
도 2는 마우스 BxPC-3 PDA 종양 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 다양한 농도의 젬시타빈(GEM)을 투여한 효과를 보여준다.
도 3은 마우스 BxPC-3 PDA 종양 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 PEGPH20 (P), 젬시타빈(GEM, G) 및/또는 납-파크리탁셀 (NAB, N)의 효과를 보여준다.
도 4는 마우스 BxPC-3 PDA 종양 이종이식 모델에서 PEGPH20 (P), 젬시타빈(GEM, G) 및/또는 납-파크리탁셀 (NAB, N)로 처리된 마우스의 평균 생존 기간을 보여준다.
도 5는 마우스 BxPC-3 PDA 종양 이종이식 모델에서 PEGPH20 (P), 젬시타빈(GEM, G) 및/또는 납-파크리탁셀 (NAB, N)로 처리된 마우스의 혈청으로부터 CA19-9 (도 5A) 및 CEA 마커 (도 5B)의 수준을 보여준다.
도 6은 이종 이식 모델에서 PEGPH20 및 알부민-컨주게이션된 파크리탁셀 (Ab-pac)의 종양 성장 억제를 보여준다. 도 6A는 MDA-MB-468/HAS3 종양 모델에서 비히클, 알부민에 컨주게이션된 파크리탁셀(Ab-pac), PEGPH20, 또는 Ab-pac 및 PEGPH20으로 처리된 마우스에서 종양 성장 억제를 보여준다. 도 6B는 MDA-MB-468/HAS3 종양 모델에서 비히클, 알부민에 컨주게이션된 파크리탁셀(Ab-pac) 1 mg/kg, Ab-pac 3 mg/kg, Ab-pac 1 mg/kg 및 PEGPH20, 또는 Ab-pac 10 mg/kg로 처리된 마우스에서 종양 성장 억제를 보여준다.
개요
A. 정의
B. 항- 히알루로난 제제 병용 치료
1. 고형 종양 및 종양 표적 치료
a. 종양-표적 탁산 ( Taxane )
b. 항- 히알루로난 제제
2. 항- 히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산 병용 치료
C. 병용 치료 제제
1. 항- 히알루로난 제제
a. 히알루로난 합성을 억제하는 제제
b. 히알루로난 -분해 효소 및 폴리머 - 컨주게이션된 (polymer-conjugated) 히알루로난-분해 효소
ⅰ. 히알루로니다아제
(a) 포유류 타입 히알루로니다아제
PH20
(b) 박테리아 히알루로니다아제
(c) 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제
ⅱ. 기타 히알루로난 분해 효소
ⅲ. 가용성 히알루로난 분해 효소
(a) 가용성 인간 PH20
(b) rHuPH20
ⅳ. 히알루로난 분해 효소의 글리코실화
ⅴ. 변형된 ( 폴리머 - 컨주게이션된 ) 히알루로난 분해 효소
PGE화 가용성 히알루로난 분해 효소
2. 탁산 및 이의 제형
a. 탁산
b. 종양- 또는 기질- 표적 탁산
알부민-결합 탁산 (Albumin-Bound Taxane )
3. 추가 화학 치료 제제(Chemotherapeutic agent) {예: 뉴클레오시드 유사체(Nucleoside analog)}
뉴클레오시드 유사체의 예시
ⅰ. 젬시타빈 ( Gemcitabine )
ⅱ. 시타라빈 ( Cytarabine )
ⅲ. 데시타빈 ( Decitabine )
ⅳ. 아자시티딘 ( Azacytidine )
D. 히알루로난 분해 효소의 핵산 및 암호화 폴리펩티드를 생산하는 방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵세포
b. 효모 세포
c. 곤충 세포
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제 기술
4. 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드의 PEG화
E. 약제학적 조성물 및 제형
1. 제형
a. 주사제, 용액 및 에멀젼
b. 동결 건조된 분말 (Lyophilized powder)
c. 국소 투여 (Topical administration)
d. 투여의 기타 경로를 위한 조성물
2. 배합량 (Formulation amounts)
3. 포장 (Packaging) 및 제조품 (Articles of Manufacture)
F. 활성, 생체 이용률( bioavailability ) 및 약동학( pharmacokinetics )의 평가 방법
1. 시험관 내 (In vitro) 검정
a. 히알루로난 분해 효소의 히알루로니다아제 활성
b. 탁산 활성
c. 항암 활성
2. 생체 내 (In vivo ) 동물 모델
3. 약동학 및 내약성 (Tolerability)
G. 병용 치료의 방법 및 용도
1. 암
치료를 위한 대상체의 선택
2. 투여량 및 투여
3. 투여 용법: 투여의 빈도 및 주기
4. 추가 병용 치료
a. 코르티코스테로이드 ( Corticosteroid )
b. 항암 제제 및 기타 치료
H. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명(들)이 속하는 당해 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원의 전체 개시를 통해 언급되는 모든 특허, 특허출원, 공개된 출원 및 공보, 젠뱅크(Genbank) 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 다른 출판물은, 달리 알려진 바 없다면, 그 전체가 참조로써 삽입된다. 본원에서 용어들에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우, 본 섹션의 것들이 우선한다. URL 또는 다른 이러한 식별자 또는 주소로 참조된 경우, 이러한 식별자는 바뀔 수 있으며, 인터넷 상의 특정 정보는 변화될 수 있으나, 동등한 정보가 인터넷을 검색하여 발견될 수 있다는 것이 이해된다. 여기의 참조는 상기 정보의 공중의 보급성 및 이용가능성을 증명한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "병용 치료"는 둘 또는 그 이상의 치료제, 예컨대 적어도 둘 또는 적어도 셋의 치료제가 단일 질환의 치료를 위해 주어질 때 대상체에서 치료를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, 병용 치료는 폴리머-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소 및 종양-표적 탁산으로의 치료 및 선택적으로 추가의 항암제 또는 화학치료제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 탁산(taxane)은 미세소관(microtubule) 중합을 방해함으로 인해 세포 분열 및 유사분열(mitosis)을 중지하여 세포 성장을 억제하는 세포분열저지성(antimitotic) 제제 또는 항미세소관(antimicrotubule) 제제의 패밀리를 지칭한다. 탁산은 주목(Taxus)속 (주목나무(yews))의 식물로부터 생산되는 자연적으로 생산되는 디테르펜(diterpene)을 포함한다. 탁산은 또한 세포분열저지성 또는 항미세소관 활성을 나타내는 합성적으로 생산된 탁산을 포함한다. 전형적으로, 탁산은 네 개의 고리(ring)(6원(member)의 A 고리 및 C 고리, 8원의 B 고리 및 4원의 D 고리)를 포함하는 공통적인 핵심(core) 구조를 공유한다. 탁산의 예는 파클리탁셀(paclitaxel), 탁산 또는 이의 유도체 또는 유사체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포분열저지성 활성(antimitotic activity)은 유사분열을 억제하거나, 감소시키거나 방지함을 지칭한다. 상기 활성 때문에, 세포 성장이 억제되고, 감소되거나 방지된다. 예를 들어, 그 제제가 없을 때 세포 성장과 비교하여 세포 성장이 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 억제된다면 제제는 세포분열저지성 활성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항미세소관 활성(antimicrotubule activity)은 예컨대 미세소관 중합을 낮추거나, 감소시키거나 또는 방지하는 미세소관을 방해하는 임의의 제제의 활성을 지칭한다. 따라서, 항미세소관 활성은 자연적으로 불안정하고 역동적인 탈중합(depolymerization) (단축) 및 중합 (연장) 과정을 거치는 미세소관을 안정화하는 임의의 활성을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 항미세소관 활성은 미세소관의 말단과 상호작용하여, 이에 따라 분해 또는 조립을 동결하거나 방지하는 제제, 예컨대 탁산에 의해 달성된다. 미세소관 중합을 평가하는 검정(assays)이 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예시적인 검정이 본원에 기술된다. 그 제제가 없을 때 중합과 비교하여 미세소관 중합이 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 억제된다면 제제는 항미세소관 활성을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양-표적 탁산"은 모이어티(moiety)에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되고, 종양 모이어티에 연결되지 않은 탁산과 비교하여 종양 표면상 하나 또는 그 이상의 분자와 증가된 특이성(specificity)을 나타내는 탁산을 지칭한다. 예를 들어, 상기 모이어티는 종양 표면상에 존재하는 분자, 예컨대 종양 표면상에 존재하는 당, 지질, 글리코사미노글리칸 또는 단백질과 상호작용하거나 결합하는 (예를 들어, 특이적 결합) 거대분자, 펩티드, 단백질, 항체 (예를 들어, 단일클론 항체) 또는 지질일 수 있다. 일반적으로, 종양 표면상에 존재하는 상기 분자는 비종양 조직 또는 정상 조직 또는 세포로부터 구별되거나 비정상적인 수준 또는 정도로 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양내 전달을 달성하기 충분한"의 문구는 그 탁산이 비종양 세포보다 종양 세포에 증가된 또는 더 큰 표적화를 나타내고, 따라서 그 안에 증가된 또는 더 큰 세포내의 국소화를 나타냄을 의미한다. 종양내 전달을 평가하는 검정은 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 검정, 예컨대 결합 또는 세포내 국재성 검정을 포함할 수 있고, 이에 의해 약물, 예컨대 탁산의 결합된 또는 세포내 수준 또는 양이 정상 세포와 종양 세포 사이에서 비교된다. 상기 검정은, 방사면역측정법(radioimmunoassay) 또는 ELISA(예를 들어, 용해물(lysate)-기반 ELISA 및 적외선 ELISA; 또한 Svojanovsky 외 (1999) Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 20:549-555 참조)를 포함하는 면역학적 검정(immunoassay); 튜불린-기반 생물학적 검정(bioassay)(예를 들어, Suye 외 (1997) Anal. Chem., 69:3633-3635 참조); 조직화학 또는 면역조직화학 (Hong 외 (2007) Mol . Cancer. Ther ., 6: 3239); HPLC; 유동세포계수법(flow cytometry) 및 기타 방법을 포함하는 형광-기반 검정(fluorescent-based assay)(예를 들어, Sheikh 외 (2001) Biosensors & Bio electronics, 16:647-652 참조) 및 당해 기술분야의 당업자에게 공지된 기타 유사함 검정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 사용하기 위한 탁산에 대한 항체가 이용가능하다(예를 들어, Grothaus 외 (1995) J Nat. Prod., 58:1003-14; Leu 외 (1993) Cancer Res., 53:1388-1391; 카탈로그 번호 ab26953, Abeam 참조). 바이오센서 기술이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, Braunhut 외 (2005) Assay and Drug Dev . Tech., 3:77-88 참조). 검정은 또한 종양 크기 및 부피를 포함하는, 종양 성장 및 종양 세포 아폽토시스(apoptosis)에 대한 효과를 포함하는, 세포 조직(cellular machinery)상에서 탁산의 활성이 평가되는 간접적 검정을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항-히알루로난 제제는 히알루로난 (HA) 합성 또는 분해를 조절함으로써, 이에 따라 조직 또는 세포에서 히알루로난 수준을 변경시키는 임의의 제제를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, 항-히알루로난제는 그 제제가 없을 때와 비교하여 조직 또는 세포에서 히알루로난 수준을 감소시킨다. 상기 제제는 HA 생성효소(HA synthase, HAS) 및 히알루로난 대사에 관여하는 기타 효소 또는 수용체를 암호화하는 유전 물질의 발현을 조절하는 화합물, 또는 HAS 작용 또는 활성을 포함하는 히알루로난을 합성 또는 분해하는 단백질을 조절하는 화합물을 포함한다. 상기 제제는 소분자, 핵산, 펩티드, 단백질 또는 기타 화합물을 포함한다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제는, 안티센스 또는 센스 분자, 항체, 효소, 소분자 억제제 및 HAS 기질 유사체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "컨주게이트(conjugate)"는 하나 또는 그 이상의 기타 폴리펩티드 또는 화학적 모이어티에 직접적 또는 간접적으로 연결된 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 컨주게이트는 융합 단백질, 화학적 컨주게이트에 의해 생산되는 것 및 임의의 기타 방법에 의해 생산되는 것을 포함한다. 예를 들어, 컨주게이트는 하나 또는 그 이상의 기타 폴리펩티드 또는 화학적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제 또는 가용성 PH20 폴리펩티드를 지칭하고, 이에 의해 적어도 하나의 가용성 PH20 폴리펩티드는 상기 컨주게이트가 히알루로니다아제 활성을 유지하는 한은 다른 하나의 폴리펩티드 또는 화학적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소"는 폴리머에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 히알루로난-분해 효소를 지칭한다. 상기 연결(linkage)은 이온 및 공유 결합, 및 임의의 다른 충분히 안정한 관련된 상호작용을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 타입일 수 있다. 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소에 대한 언급은 그 컨주게이트가 히알루로니다아제 활성을 나타냄을 의미한다. 전형적으로, 상기 폴리머-컨주게이트는 폴리머에 컨주게이션 되지 않은 히알루로난-분해 효소와 비교하여 히알루로니다아제 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로난 분해 효소(hyaluronan degrading enzyme)는 히알루로난 폴리머(또한 히알루론산 또는 HA로 지칭됨)를 더 작은 분자량의 단편으로 절단하는 것을 촉매작용하는 효소를 지칭한다. 히알루로난 분해 효소의 예는 히알루로니다아제 및, 히알루로난을 탈중합(depolymerize)하는 능력을 가진 특정 콘드로이티나아제(chondroitinase) 및 리아제(lyase)이다. 히알루로난 분해효소인 예시적인 콘드로이티나아제는 콘드로이틴 ABC 리아제(또한 콘드로이티나아제 ABC로 공지됨), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나아제(eliminase)로 공지됨) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 콘드로이틴 ABC 리아제는 두 개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(endolyase) (EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(exolyase) (EC 4.2.2.21)를 포함한다. 예시적인 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum) (프로테우스 불가리스 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있다; Sato 외 (1994) Appl . Microbiol . Biotechnol . 41(1):39-46)에서 유래된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나아제 AC 효소는 서열번호 99에 기재된 플라보박테리움 헤파리넘(Flavobacterium heparinum), 서열번호 100에 기재된 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 아우레스켄스(Arthrobacter aurescens (Tkalec 외 (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 외 (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 박테리아 유래 콘드로이티나제 C 효소는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) (Hibi 외 (1989) FEMS -Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci 외 (1976) J. Biol . Chem . 251:1154-8; Tsuda 외 (1999) Eur . J. Biochem . 262:127-133)에서 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루로난 분해 효소의 한 분류이다. 히알루로니다아제는 박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1), 거머리, 기타 기생동물, 및 갑각류 유래 히알루로니다아제(EC 3.2.1.36), 및 포유류-형 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35)를 포함한다. 히알루로니다아제는 쥐과(murine), 개, 고양이과, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 어류, 개구리(ranine), 박테리아, 및 거머리, 기타 기생동물 및 갑각류 유래의 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는, 비-인간 기원의 임의의 것을 포함한다. 예시적인 비인간 히알루로니다아제는 젖소 (서열번호 10, 11, 64 및 BH55(미국특허 제5,747,027호, 및 제5,827,721호), 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16), 마우스(서열번호 17 내지 19, 32), 돼지(서열번호 20 내지 21), 랫트(서열번호 22 내지 24,31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 26,27,63 및 65), 침팬지(서열번호 101), 붉은털 원숭이(서열번호 102), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰구스 원숭이(서열번호 29), 기니피그(서열번호 30), 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp .) (균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 및 혈청형 III(서열번호 73), 스타피로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소 RF122(서열번호 79 및 80); 및 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Staphylococcus pneumoniae)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호 83);및 혈청형 2, 균주 D39/NCTC7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 및 혈청형 M28(서열번호 92), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri )(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96))로부터 히알루로니다아제 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는 스트렙토마이세스 히알루로니티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다아제 효소 (Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim . Biophys . Acta 198:607)를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 인간 기원의 것을 포함한다. 예시적인 인간 히알루로니다아제는 HYAL1 (서열번호 36), HYAL2 (서열번호 37), HYAL3 (서열번호 38), HYAL4 (서열번호 39), 및 PH20 (서열번호 l)을 포함한다. 또한, 히알루로니다아제 중에서 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20을 포함하는 가용성 히알루로니다아제가 있다. 시판되는 소 또는 양 가용성 히알루로니다아제로서는 비트라제®(Vitrase)(양 히알루로니다아제) 및 암파다제®(Amphadase)(소 히알루로니다아제) 및 히다제™(Hydase™)(소 히알루로니다아제)가 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "정제된 소 고환 히알루로니다아제"는 소 고환 추출물로부터 정제된 소 히알루로니다아제를 지칭한다(미국 특허번호 제2,488,564호, 제2,488,565호, 제2,806,815호, 제2,808,362호, 제2,676,139호, 제2,795,529호, 제5,747,027호 및 제5,827,721호 참조). 시판되는 정제된 소 고환 히알루로니다아제의 예는 암파다제® 및 히다제™를 포함하고, Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc., 및 Calzyme 사에서 구입할 수 있는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 소 히알루로니다아제를 포함한다. 또한 재조합적으로 생산된 소 히알루로니다아제, 예컨대 서열번호 190 내지 192 중 어느 하나에 기재된 것이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "정제된 양 고환 히알루로니다아제"는 양 고환 추출물로부터 정제된 양 히알루로니다아제를 지칭한다(미국 특허번호 제2,488,564호, 제2,488,565호 및 제2,806,815호 및 국제 PCT 공개번호 WO2005/118799호 참조). 시판되는 정제된 양 고환 추출물의 예는 비트라제® 및 Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com 및 Raybiotech, Inc.로부터 이용가능한 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 양 히알루로니다아제를 포함한다. 또한 재조합적으로 생산된 양 히알루로니다아제 예컨대 서열번호 66 및 193 내지 194 중 임의의 서열로 기재되는 핵산 분자의 발현으로 제조되는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "PH20"은 정자에서 발생하고 중성-활성을 가진 히알루로니다아제 타입을 지칭한다. PH20은 정자 표면 상, 및 리소좀에서 유래된 첨체 내에 발생하는데, 여기서 이것은 첨체 내막에 결합되어 있다. PH20은 인간, 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 붉은털 원숭이, 쥐, 소, 양, 기니피그, 토끼 및 랫트 기원을 포함하나, 이에 제한되지 않는 어느 하나의 기원의 것을 포함한다. 예시적인 PH20 폴리펩티드는 인간(서열번호 1), 침팬지(서열번호 101), 붉은털 원숭이(서열번호 102), 사이노몰구스 원숭이(서열번호 29), 젖소(예를 들어, 서열번호 11 및 64), 마우스(서열번호 32), 랫트(서열번호 31), 토끼(서열번호 25), 양(서열번호 27, 63, 및 65) 및 기니피그(서열번호 30)로부터 유래된 것을 포함한다.
히알루로난 분해효소에 대한 언급은 전구체 히알루로난 분해효소 폴리펩티드 및 성숙형 히알루로난 분해효소 폴리펩티드(예컨대 신호 서열이 제거된 것들), 활성을 가지는 이들의 말단절단된 형태를 포함하며, 서열번호 1 및 10 내지 48, 63 내지 65, 67 내지 102에 기재된 전구체 폴리펩티드 또는 이의 성숙형 형태에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함하는, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화되는 변이체, 및 기타 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해효소에 대한 언급은 또한 서열번호 50 내지 51에 기재된 인간 PH20 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로난 분해 효소는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형은 PEG화(pegylation), 알부민화(albumination), 글리코실화(glycosylation), 파르네실화(farnesylation), 카복실화(carboxylation), 하이드록실화(hydroxylation), 인산화(phosphorylation) 및 기타 당해 기술분야에 공지된 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 말단절단된 PH20 히알루로니다아제는 이의 임의의 C-말단 짧아진 형태, 특히 N-글리코실화되었을 때 말단절단되거나 중성 활성인 형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "가용성 PH20"은 생리적 상태하에서 가용성인 PH20의 임의의 형태를 지칭한다. 예를 들어, 가용성 PH20은 37℃에서 트리톤(Triton)® X-114 용액의 수상으로 분할(partition)됨으로써 확인될 수 있다(Bordier 외, (1981) J. Biol . Chem., 256:1604-7). 막-앵커 고정된 PH20, 예컨대 GPI 앵커 고정된(anchored) PH20을 포함하는 지질-앵커 고정된 PH20은 계면활성제-풍부상으로 분할될 것이나, 포스포리파제-C 처리 이후에 계면활성제 부족상 또는 수상으로 분할할 것이다. 가용성 PH20 중에는 막에 PH20의 앵커링(anchoring)과 관련되는 하나 또는 그 이상의 영역이 제거되거나 변형된 막-앵커 고정되는 PH20이 포함되고, 여기서 가용성 형태는 히알루로니다아제 활성을 유지한다. 가용성 PH20은 또한 재조합 가용성 PH20 및 천연적 출처 예컨대 예를 들어, 양 또는 소의 고환 추출물로부터 포함되어 있는 또는 정제된 것을 포함한다. 상기 가용성 PH20의 예는 가용성 인간 PH20이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20은 발현시 C-말단에 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 서열의 전부 또는 일부를 결여한 PH20 폴리펩티드를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 생리적 상태하에서 가용성이다. 가용성(solubility)은 생리적 상태하에서 가용성을 나타내는지 보여줄 수 있는 임의의 적절한 방법에 의해 평가될 수 있다. 상기 방법의 예는 트리톤® X-114 검정인데, 이는 수상에서 분할 정도를 평가하는 것이며 상기 및 실시예에서 기술하고 있다. 또한, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는, CHO 세포 예컨대 CHO-S 세포로부터 생산된 것이라면, 발현되어 세포 배양 배지로 분비되는 폴리펩티드이다. 그러나 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 생산된 것에 제한되지 않으며, 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함하는 임의의 방법에 의해서 또는 임의의 세포에서 생산될 수 있다. CHO 세포로부터 분비에 대한 언급은 정의적인(definitional) 것이다. 따라서, 폴리펩티드가 CHO 세포로부터 발현되고 분비될 수 있고 가용성이라면, 즉 트리톤® X-114에 의해 추출되었을 때 수상으로 분할되는 경우, 그것이 그렇게 생산되었든 아니든 가용성 PH20 폴리펩티드이다. sHuPH20 폴리펩티드에 대한 전구체 폴리펩티드는 신호 서열 예컨대, 이종성의 또는 비-이종성의(즉, 본래 상태) 신호 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 전구체는 신호 서열 예컨대, 아미노산 위치 1 내지 35에 천연의 35 아미노산 신호 서열(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 35 참조)을 포함하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "연장된 가용성 PH20" 또는 "esPH20"은 GPI 앵커(anchor)-부착 신호 서열까지의 잔기 및 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 인접한 하나 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하며, 상기 esPH20은 생리적 상태에서 가용성이다. 생리적 상태하에서의 가용성은 당해 기술분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 및 실시예에서 기술된 트리톤(Triton)® X-114 검정에 의해 평가될 수 있다. 또한, 상기 논의한 바와 같이, 가용성 PH20은, CHO-S 세포와 같은 CHO 세포로부터 생산된다면, 발현되어 세포 배양 배지로 분비되는 폴리펩티드이다. 그러나, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드는 CHO 세포로부터 생산되는 것에 제한되지 않으며, 임의의 세포에서 또는 재조합 발현 및 폴리펩티드 합성을 포함하는 임의의 방법에 의해서 생산될 수 있다. CHO 세포로부터 분비에 대한 언급은 정의적인 것이다. 따라서, CHO 세포로부터 발현되고 분비될 수 있는 폴리펩티드가 가용성이라면, 즉 트리톤® X-114에 의해 추출되었을 때 수상으로 분할된다면, 그것은 그렇게 생산되었든 아니든 가용성 PH20 폴리펩티드이다. 인간 가용성 esPH20 폴리펩티드는, 서열번호 1의 36 내지 490 잔기뿐 아니라, 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 491로부터 하나 또는 그 이상의 인접한 아미노산을 포함하는데, 이러한 생성된 폴리펩티드는 가용성이다. 예시적인 인간 esPH20 가용성 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 36 내지 491, 36 내지 492, 36 내지 493, 36 내지 494, 36 내지 495, 36 내지 496 및 36 내지 497에 상응하는 아미노산 잔기를 갖는 것이다. 상기 예는 서열번호 151 내지 154 및 185 내지 187 중 어느 하나에 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 또한 대립형질 변이체 및 기타 변이체 예컨대 중성 활성을 유지하고 가용성인 서열번호 151 내지 154 및 서열번호 185 내지 187의 상응하는 폴리펩티드와 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가지는 어느 하나를 포함한다. 서열 동일성에 대한 언급은 아미노산 치환을 갖는 변이체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "esPH20들"에 대한 언급은 전구체 esPH20 폴리펩티드 및 성숙형 esPH20 폴리펩티드(예컨대 신호 서열이 제거된 것), 효소 활성을 가지고(전장(full length) 형태의 적어도 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상을 유지하는) 가용성인 이의 말단절단된 형태를 포함하고, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화되는 변이체, 및 서열번호 1 및 3으로 기재된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드, 또는 이의 성숙형 형태를 포함하는 기타 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "esPH20들"에 대한 언급은 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것을 포함한다. 상기 변형은 PEG화(PEGylation), 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카복실화, 하이드록실화, 인산화, 및 기타 당해 기술분야에 공지된 폴리펩티드 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)" 은 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 재조합적으로 발현되고 분비되는 바와 같은 인간 PH2O의 가용성 형태를 포함하는 조성물을 지칭한다. 가용성 rHuPH20은 신호 서열을 포함하고 서열번호 49에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화된다. 가용성 rHuPH20를 암호화하는 핵산은 성숙형 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 생산되면, C-말단에는 이질성(heterogeneity)이 있게 되는데, 따라서 상기 산물은 서열번호 4 내지 9 중 하나 또는 그 이상을 다양하고 풍부하게 포함할 수 있는 종들의 혼합물을 포함한다.
마찬가지로, PH20의 다른 형태, 예컨대 esPH20에 대하여, 재조합적으로 발현된 폴리펩티드 및 이의 조성물은 이질성을 보이는 C-말단이 있는 다수 종을 포함한다. 예를 들어, 아미노산 36 내지 497을 가지는 esPH20을 암호화하는, 서열번호 151의 폴리펩티드의 발현에 의해 생산된 재조합적으로 발현된 esPH20의 조성물은, 더 적은 수의 아미노산 예컨대 36 내지 496, 36 내지 495을 가지는 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "N-결합된(N-linked) 모이어티"는 폴리펩티드의 번역후 변형에 의해 글리코실화될 수 있는 폴리펩티드의 아스파라긴(N) 아미노산 잔기를 지칭한다. 인간 PH20의 예시적인 N-결합된 모이어티는 서열번호 1에 기재되는 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "N-글리코실화 폴리펩티드"는 적어도 3개의 N-결합된 아미노산 잔기, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 잔기 N235, N368 및 N393에 상응하는 N-결합된 모이어티의 올리고당 연결(linkage)을 포함하는 PH20 폴리펩티드 또는 그것에 말단절단된 형태를 지칭한다. N-글리코실화 폴리펩티드는 N-결합된 모이어티의 3, 4, 5 및 최대 모두가 올리고당에 결합된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. N-결합된 올리고당은 올리고만노스, 복합, 혼성(hybrid) 또는 황산화 올리고당, 또는 기타 올리고당 및 단당류를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "N-부분적 글리코실화 폴리펩티드"는 적어도 3개의 N-결합된 모이어티에 결합된 N-아세틸글루코사민 글리칸을 최소한으로 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 부분적으로 글리코실화된 폴리펩티드는 단당류, 올리고당류, 및 EndoH, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3으로 폴리펩티드의 처리에 의해 형성된 것들을 포함하는 분지된 당 형태를 포함하는 다양한 글리칸 형태를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "탈글리코실화 PH20 폴리펩티드"는 모든 가능한 글리코실화 부위보다 적은 수가 글리코실화되어 있는 PH20 폴리펩티드를 지칭한다. 탈글리코실화는 예를 들어, 글리코실화를 제거함으로써, 글리코실화를 방지함으로써, 또는 글리코실화 부위를 제거하기 위해 폴리펩티드를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 특정한 N-글리코실화 부위가 다른 부위와 달리 활성에 꼭 필요한 것은 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리머"는 반복되는 유닛으로 구성되는 임의의 고분자량 자연적 또는 합성 모이어티를 지칭한다. 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 덱스트란, 셀룰로스 및 시알산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 및 기타 예시적인 폴리머가 본원에 기술되고, 많은 것이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 본원의 목적을 위해, 상기 폴리머는 즉, 링커를 통해 폴리펩티드에 안정하게 직접적 또는 간접적으로 결합되어 컨주게이션될 수 있다. 상기 폴리머 컨주게이트는 전형적으로 혈청 반감기를 증가시키고, 시알산 모이어티, PEG화 모이어티, 덱스트란, 및 당 및 기타 모이어티들, 예컨대 글리코실화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 PH20 또는 rHuPH20은 폴리머에 컨주게이션될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "PEG화(PEGylated)"는 전형적으로 히알루로난 분해 효소의 반감기를 증가시키기 위해, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제를 포함하는 단백질에 폴리머 분자, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG화 모이어티 PEG)의 공유결합 또는 기타 안정한 부착을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항암제 또는 화학치료제는 빠르게 분열하는 세포, 예컨대 암세포를 살해할 수 있는 제제를 지칭한다. 당해 기술분야의 당업자는 화학치료제를 포함하는 항암제에 익숙하다. 예시적인 제제가 본원에 기술된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오시드 유사체(analog) (또는 유사체(analogue))는 DNA 복제 동안에 핵산, 예컨대 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오시드의 빌딩 블록(building block)의 하나를 대체하거나 모방하는 제제를 지칭한다. 상기 과정은 추가적인 뉴클레오시드가 부착할 수 없기 때문에 종양 성장을 저지할 수 있다. 뉴클레오시드 유사체의 예는 데옥시시티딘(deoxycytidine) 유사체인 젬시타빈(gemcitabine)이고 젬시타빈은 대사 활성화시 뉴클레오시드 시티딘을 모방하거나 대체하여 DNA로 삽입되어 DNA 합성을 경쟁적으로 억제하는 트리포스페이트(triphosphate)를 형성한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오시드 탈아미노산 효소(deaminase)는 뉴클레오시드의 탈이미노화를 가져오는 효소이다. 예를 들어, 시티딘 탈아미노 효소(cytidine deaminase)(CDA)는 시티딘과 데옥시시티딘을 각각 유리딘과 데옥시유리딘으로 탈아미노화한다. 아데노신 탈아미노 효소(adenosine deaminase)(ADA)는 아미노 그룹의 하이드록시 그룹으로 치환에 의해 아데노신을 탈아미노화하여, 그것을 관련된 뉴클레오시드 이노신으로 전환시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오시드 탈아미노산 효소의 기질은 불활성 대사물질로 탈아민화될 수 있는 분자이고, 따라서 뉴클레오시드 탈아미노산 효소의 존재에서 불활성화된다. 탈아미노화를 평가하는 검정(assay)이 당해 기술분야의 당업자에게 공지되어 있고, 대사물질 및 탈아미노 대사물질에 대한 질량 분석계 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 탈아미노화 검정 예컨대 초과량 우라실-DNA 글리코실라아제(glycosylase)를 사용하는 UDG-기반 탈아미노산 효소 검정(예를 들어, Morgan 외 (2004) J. Biol . Chem ., 279:52353-52360 참조) 또는 뉴클레오시드 탈아미노산 효소를 발현하는 것으로 알려진 세포에서 세포독성을 평가함에 의한 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문구 "뉴클레오시드 탈아미노산 효소 단백질 수준 또는 단백질 활성을 감소시키기에 충분한"은 뉴클레오시드 탈아미노산 효소의 활성을 억제하기 위해 요구되는 탁산의 양을 지칭한다. 예를 들어, 상기 억제는 상기 기술한 바와 같이 탈아미노화를 위한 검정을 사용하여 탈아미노산 효소 (예를 들어, 시티딘 탈아미노 효소의 탈아미노화 활성을 분석함으로써 평가될 수 있다. 상기 억제는 또한 세포내(intracellular) 탈아미노산 효소 단백질 수준에 대해 분석함으로써 평가될 수 있다. 세포내(subcellular) 단백질을 평가하는 검정이 당해 기술분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, 세포-기반 ELISA, 유세포 분석기 또는 단백질 검출 방법 예컨대 웨스턴 블롯을 포함한다. 일반적으로 상기 검정은 세포 용해물 또는 투과된 세포상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 시티딘 탈아미노 효소에 대한 웨스턴 블롯이 총 세포 용해물의 가용화, 단백질의 분리, 및 CDA (예를 들어, 카탈로그 번호 ab82346, Abeam)에 대한 항체를 사용하는 탈아미노산 효소에 대한 면역블롯팅(immunoblotting), 이어서 2차 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase) 항체로 배양, 및 검출에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로, 단백질 수준 또는 활성이 약 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상으로 감소한다면 뉴클레오시드 탈아미노산 효소 단백질 수준 또는 단백질 활성을 감소시키기에 양은 충분하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 프로드러그는 생체 내 변화(biotransformation) 후에 약리학적 활성을 나타내는 화합물이다. 예를 들어, 젬시타빈과 같은 뉴클레오시드 유사체는 프로드러그이고, 이에 의해 활성이 데옥시시티딘 키나아제에 의한 두 개의 활성 대사물질, 젬시타빈 디포스페이트 및 젬시타빈 트리포스페이트로의 세포 내 변환의 결과로 일어난다. 상기 트리포스페이트(디플루오로데옥시시티딘 트리포스페이트)는 DNA로의 삽입에 대해 내인성 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트와 경쟁한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유도체는 참조 약물 또는 제제로부터 변화 또는 변경을 겪었으나, 참조 약물 또는 제제와 비교하여 여전히 활성을 유지하는(예를 들어, 증가된 또는 감소된 활성을 나타냄) 약물의 형태를 지칭한다. 전형적으로 화합물의 유도체 형태는 화합물의 측쇄(side chain)가 변형 또는 변경되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 약물 또는 제제의 유사체(analogue) 또는 유사체(analog)는 참조 약물과 관련되나, 그것의 화학적 또는 생물학적 활성이 다른 약물 또는 제제이다. 전형적으로, 유사체는 참조 약물 또는 제제와 유사한 활성을 나타내나, 활성이 증가 또는 감소되거나 그렇지않으면 향상될 수 있다. 전형적으로, 화합물 또는 약물의 유사체 형태는 구조의 백본(backbone) 핵심(core)이 참조 약물과 비교하여 변경 또는 변화된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "활성"은 전장(완전한) 단백질과 관련된 이의 폴리펩티드 또는 이의 부분의 기능적 활성 또는 활성들을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 활성 단편은 전장 단백질의 활성을 나타낼 수 있다. 기능적 활성은 생물학적 활성, 촉매적 또는 효소적 활성, 항원성(항-폴리펩티드 항체에 결합에 대해 폴리펩티드와 경쟁하거나 결합하는 능력), 면역원성, 다량체를 형성하는 능력, 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "히알루로니다아제 활성"은 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 능력을 지칭한다. 히알루로니다아제에 대한 미국약전(The United State Pharmacopeia; USA) XXII 검정은 효소를 HA와 37℃에서 30분간 반응시킨 후에 잔류하는 더 높은 분자량의 히알루론산 또는 히알루로난, (HA) 기질의 양을 측정함으로써 간접적으로 히알루로니다아제 활성을 측정한다 (USP XXII-NF XVII(1990) 644-645, United Strate Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). 참조 표준용액은 임의의 히알루로니다아제의 유닛 내에 상대적인 활성을 측정하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 PH20 및 esPH20을 포함하는 PH20의 히알루로니다아제 활성을 측정하기 위한 시험관 내(in vitro) 검정이 당해 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기술된다. 예시적인 분석법은 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때에 형성된 불용성 침전물을 검출함으로써 간접적으로 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 측정한 미세탁도 검정 및 스트렙타비딘-겨자무과산화효소 컨주게이트 및 발색 기질로 미세적정 플레이트 웰(microtiter plate well)에 비-공유 결합한 잔류 바이오틴화-히알루론산을 검출함으로써 간접적으로 히알루론산의 절단을 측정한 바이오틴화(biotinylated)-히알루론산 검정을 포함한다. 참조 표준은 예를 들어, 히알루로니다아제 유닛이 시험될 때 활성을 측정하기 위한 표준곡선을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 특이적 활성은 단백질 mg 당 활성의 유닛을 지칭한다. 히알루로니다아제의 밀리그램은 몰 소거 계수(molar extinction coefficient)가 M-1 cm-1의 단위(unit)로 약 1.7이라고 가정할 때, 280 nm에서의 용액의 흡광도에 의해 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "중성 활성"은 중성 PH (예를 들어, 약 pH 7.0)에서 히알루론산의 절단을 효소적으로 촉매작용하는 PH20 폴리펩티드의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "GPI-앵커 부착 신호 서열"은 ER의 내강(lumen)에서 폴리펩티드에 미리형성된 GPI-앵커의 부가를 지시하는 아미노산의 C-말단 서열이다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 GPI-앵커 고정된 폴리펩티드, 예컨대, GPI-앵커 고정된 PH20 폴리펩티드의 전구체 폴리펩티드 내에 존재한다. C-말단 GPI-앵커 부착 신호 서열은 GPI-앵커 부착 위치 또는 ω-위치 바로 하류에 전형적으로 8 내지 20 아미노산의 대부분 소수성 영역, 그 앞의 8 내지 12 아미노산의 친수성 스페이서(spacer) 영역을 포함한다. GPI-앵커 부착 신호 서열은 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이들은 생물정보 웹사이트, 예컨대, ExPASy 프로테오믹스 툴 사이트 (예를 들어, World Wide Web site expasy.ch/tools/)에서 쉽게 이용할 수 있는 것들을 포함하여, 인실리코(in silico) 방법 및 알고리즘을 포함하나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, Udenfriend 외 (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber 외,(1999) J. Biol. Chem . 292:741-758, Fankhauser 외 (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria 외 (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni 외 (2008) BMC Bioinformatics 9:392 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 DNA, RNA, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함하는 이의 유사체 및 이의 혼합물을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대 검출가능한 표지, 예컨대 형광 또는 방사성 동위원소로 선택적으로 표지되어 있는 프로브 또는 프라이머를 언급할 때, 단일-가닥 분자가 고려된다. 상기 분자는 전형적으로 라이브러리 탐색(probing) 또는 프라이밍(priming)을 위하여 그들의 표적이 통계적으로 고유하거나, 낮은 복제수(copy number) (전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)이도록 하는 길이를 갖는다. 일반적으로 프로브 또는 프라이머는 관심있는 유전자와 상보적이거나 동일한 서열의 적어도 14, 16 또는 30의 인접한 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 2 아미노산 길이와 동일하거나 더 길고, 40 아미노산 길이와 동일하거나 더 짧은 길이인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공되는 아미노산의 다양한 서열 내에 존재하는 아미노산은 그들의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어(표 1)에 의해 표시된다. 다양한 핵산 단편 내 존재하는 뉴클레오티드는 당해 기술분야에서 일상적으로 사용되는 표준 단일-문자 명명법으로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산"은 아미노기와 카복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 두 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 본원의 목적을 위해, 아미노산은 20개의 천연-발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 갖는 아미노산)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 그 펩티드 결합(linkage)에서 폴리펩티드의 화학적 소화(가수분해)시 형성되는 아미노산을 지칭한다. 본원에서 기술된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태로 간주된다. "D" 이성질체 형태 내 잔기라 명명된 잔기들은 원하는 기능적 성질이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 임의의 L-아미노산 잔기로 대체될 수 있다. NH2는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 자유 아미노기를 지칭한다. COOH는 폴리펩티드의 카복시 말단에 존재하는 자유 카복실기를 지칭한다. J. Biol. Chem., 243:3557-3559(1968)에 기술되고, 37 C.F.R. §§1.821-1.822를 채택한 표준 폴리펩티드 명명법을 유지하면서, 아미노산 잔기들에 대한 약어를 표 1에 나타낸다:
[표 1] 대응 표
Figure 112016024482551-pat00001
본원에 식으로 나타난 모든 아미노산 잔기 서열은 아미노 말단에서 카복시 말단의 통상적인 방향인 좌측에서 우측으로의 방향성을 가진다. 또한, 문구 "아미노산 잔기"는 대응 표(표 1)에 열거된 아미노산 및 변형되고 희귀한 아미노산, 예컨대 37 C.F.R. §§1.821-1.822에 언급된 것들 및 참조로써 본원에 삽입된 것들을 포함하도록 정의된다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 끝의 대쉬(dash)는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, 아미노-말단기, 예컨대, NH2에, 또는 카복실-말단기, 예컨대, COOH에 대한 펩티드 결합을 나타냄을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연적으로 발생하는 α-아미노산"은 인간에서 동족(cognate) mRNA 코돈과 함께 대전된 tRNA 분자의 특이적 인지에 의해 단백질로 삽입되는, 자연계에서 발견되는 상기 20개의 α-아미노산 잔기이다. 따라서, "비-천연 아미노산"은 예를 들어 20개의 천연-발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-입체이성질체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 비-천연 아미노산이 본원에 기술되고, 당해 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병치된 DNA 분절을 포함하는, 단일 또는 이중 가닥의, 선형 또는 원형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로써 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 다른 카피(copy)들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절(segment)은 명시된 성질을 가지는 더 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 더 긴 DNA 분자, 예컨대, 5'에서 3' 방향으로 해독시 명시된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 말단으로 해독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고, 천연 출처로부터 분리되거나, 시험관 내(in vitro)에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 본원에서 뉴클레오티드(약어로 "nt") 또는 염기쌍(약어로 "bp")이라는 용어로 주어진다. 상기 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우 단일- 및 이중-가닥 분자에 대해 사용된다. 상기 용어가 이중-가닥 분자에 적용되는 경우, 총 길이를 나타내기 위하여 사용되며, 상기 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 가닥은 길이에 있어 약간 상이할 수 있으며, 이의 말단이 엇갈려 있을 수 있고, 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드들이 짝을 이루지 않을 수 있다는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 인식될 것이다. 상기 짝이 없는 말단은, 일반적으로, 20 뉴클레오티드의 길이를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산 사이의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 지칭한다. 유사성은 잔기들 및 그안에 포함된 잔기들의 서열의 동일성 및/또는 상동성의 정도에 기초될 수 있다. 단백질 또는 핵산 사이의 유사성의 정도를 평가하는 방법이 당해 기술분야에 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 서열 사이에 최고 수준의 동일성을 나타내는 방식으로 정렬된다. "동일성(identity)"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 다르지 않은 정도를 지칭한다. 아미노산 서열, 어느 정도 뉴클레오티드 서열에 대한 정렬(alignment)은 또한 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기들의 물리-화학적 성질을 보존하는 것들이다. 정렬은 전체적(서열의 전장 및 모든 잔기들을 포함하는 것에 대한, 비교되는 서열의 정렬)이거나 지역적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열 부분의 정렬)일 수 있다.
"동일성(identity)"은 그 자체가 당업계-인식되는 의미를 가지며, 공개된 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics 및 Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 참조). 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성을 측정하는 수많은 방법들이 있지만, 용어 "동일성"은 당업자에게 널리 공지되어 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073(1988)).
본원에 사용된 바와 같이, (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 상동인(homologous)은 약 25% 이상의 서열 상동성(homology), 전형적으로 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 의미하며; 필요하다면, 정확한 백분율이 명시될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 상기 용어 "상동성" 및 "동일성"은 다르게 나타낸 바 없다면 종종 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성의 결정을 위하여, 가장 높은 순(order) 매칭이 얻어지도록 서열이 정렬된다(예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 37 1991; Carrillo 외 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 참조). 서열 상동성에 의하여, 보존된 아미노산의 수가 표준 정렬 알고리즘 프로그램에 의하여 측정되어, 각 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(defualt gap penalty)를 가지고 사용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심있는 핵산의 길이를 모두 따라 전형적으로 중등도(moderate)의 엄격성(stringency)으로, 또는 고도의 엄격성으로 혼성화된다. 또한 혼성화하는 핵산 분자 내 코돈 대신에 동의 코돈(degenerate codon)을 포함하는 핵산 분자가 고려된다.
임의의 두개의 분자가 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 "동일한" 또는 또는 "상동인" 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 가지는지 여부는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 Pearson 외(1988) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 85:2444(기타 프로그램은 GCG 프로그램 패키지를 포함한다(Devereux, J., 외, Nucleic Acids Research 12(I):387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. 외, J Molec Biol 215:403(1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 외 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)에서와 같은 디폴트 파라미터들을 사용한 예컨대 "FASTA" 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 생물공학 정보를 위한 국립센터(the National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 BLAST 함수가 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 기타 상업적으로 또는 대중적으로 이용가능한 프로그램은 DNAStar "MegAlign" 프로그램(Madison, WI) 및 위스콘신대학 유전학 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG)) "Gap" 프로그램(Madison WI)을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 GAP 컴퓨터 프로그램을 사용한 서열 정보를 비교하여 측정될 수 있다(예를 들어, Needleman 외 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, Smith 및 Waterman에 의해 개정((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). 요약하면, 상기 GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것 내의 기호의 총 수로 나눈, 유사한, 정렬된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)들의 수로써 유사성을 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 매트릭스(동일성에 대해 1의 값을, 비동일성에 대해 0의 값을 포함) 및 Schwartz 및 Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 기술된 것과 같은 Gribskov 외(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745의 편중 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대하여 3.0의 페널티 및 각각의 갭 내 각각의 기호에 대하여 추가의 0.10 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 페널티 없음을 포함할 수 있다.
따라서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 적어도 "~에 90% 이상 동일한"은 참조 핵산 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 90 내지 99.99 백분율의 동일성을 지칭한다. 90% 또는 그 이상의 수준의 동일성은 예증 목적을 위하여 가정하여 100개 길이의 아미노산의 시험 및 참조 폴리펩티드가 비교된다고 가정한 사실을 가리킨다. 시험 폴리펩티드 내 아미노산의 10% 이하(즉, 100개 중 10개)가 참조 폴리펩티드와 다르다. 유사한 비교가 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 사이에 수행될 수 있다. 상기 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포된 점 돌연변이(point mutation)로서 나타날 수 있거나, 또는 이들은 최대 허용가능한, 예를 들어, 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 길이를 달리하는 하나 또는 그 이상의 위치 내 모여 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 약 85 내지 90% 초과의 상동성 또는 동일성의 수준에서, 상기 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트에 독립적이어야 하고; 상기 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 의지함이 없이 수동 정렬에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 정렬된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열 내 상응하는 위치를 정렬하기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 50% 또는 그 이상의 동일성으로 관련된 둘 또는 그 이상의 서열이 정렬된다. 서열들의 정렬된 세트는 상응하는 위치에서 정렬되는 2 또는 그 이상의 서열을 지칭하며, EST와 같은 RNA 및 게놈 DNA 서열과 정렬되는 기타 cDNA로부터 유래한 서열을 정렬하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 적절한 상태 하(예를 들어, 4개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합화제, 예컨대 DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재)에 적절한 완충액 및 적절한 온도에서 주형-지시된(template-directed) DNA 합성의 개시점으로써 작용할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머"로서 제공될 수 있음이 인식될 수 있다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 하이드록시기를 가진다. 프라이머는 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역-전사효소(RT) PCR, RNA PCR, LCR, 다중(multiple) PCR, 팬핸들(panhandle) PCR, 캡쳐(capture) PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 원위치(in situ) PCR, 라이게이션-매개 PCR 및 기타 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍"은 (예를 들어, PCR에 의해)증폭되는 서열의 5' 말단과 혼성화하는 5'(상류) 프라이머 및 증폭되는 서열의 3' 말단의 상보물(complement)과 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화한다"는 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)가 표적 핵산 분자에 상보적 염기-쌍에 의해 어닐링하는 것을 지칭한다. 당해 기술분야의 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 시험관 내(in vitro) 혼성화에 특히 관련된 파라미터는 추가로 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도를 포함한다. 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 예시적인 세척 조건은 고도 엄격성에서는 0.1x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 중등도(medium) 엄격성에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 동등한 엄격성 조건이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 당업자는 특정한 적용을 위하여 적절한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위하여 상기 파라미터들을 용이하게 조정할 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 상보적인(complementary)은 뉴클레오티드의 두 서열이 전형적으로 상대되는 뉴클레오티드 사이에 25%, 15% 또는 5% 미만의 불일치를 가지고 혼성화할 수 있다는 것을 의미한다. 필요하다면, 상보성의 백분율이 특정될 것이다. 전형적으로 상기 2개의 분자는 그들이 높은 엄격성의 조건 하에서 혼성화하도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 산물에 실질적으로 동일한(substantially identical)은 관심있는 성질이 충분히 바뀌지 않아 실질적으로 동일한 산물이 본래 산물 대신 사용될 수 있을 정도로 충분히 유사하다는 의미이다.
본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어 "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"은 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 문맥에 따라 변경되는 것으로도 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체(allelic variant) 또는 대립형질 변이(allelic variation)는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 임의의 둘 또는 그 이상의 선택적인(대안적인) 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내 표현형의 다형성(polymorphism)을 초래한다. 유전자 돌연변이는 침묵이거나(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음), 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 상기 용어 "대립형질 변이체"는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화되는 단백질을 나타내기 위하여 사용된다. 전형적으로 유전자의 참조 형태는 군집 또는 종의 하나의 참조 일원으로부터의 폴리펩티드의 야생형 형태 및/또는 우세형 형태를 암호화한다. 전형적으로, 대립형질 변이체는 종 간 및 종 중에 변이체를 포함하며, 전형적으로 동일 종으로부터의 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 80%, 90% 또는 그 이상의 아미노산 동일성을 가지며; 동일성의 정도는 유전자, 및 비교가 이종간인지 종내인지에 의존한다. 일반적으로, 종내 대립형질 변이체는 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형 형태와 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하여 야생형 및/또는 우세형 형태와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 가진다. 본원에서 대립형질 변이체에 대한 언급은 일반적으로 동일한 종의 일원 중에 단백질 내 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 "대립형질 변이체"와 상호교환적으로 사용되는 "대립형질(allele)"은 이의 유전자 또는 일부의 선택적인(대안적인) 형태를 지칭한다. 대립형질은 상동 염색체 상의 동일 장소 또는 위치를 차지한다. 대상체가 한 유전자의 2개의 동일한 대립형질을 가지는 경우 그 대상체는 그 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합적(homozygous)이라고 언급된다. 대상체가 한 유전자의 2개의 상이한 대립형질을 가지는 경우 그 대상체는 그 유전자에 대해 이형접합적(heterozygous)이라고 언급된다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있으며, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입과 같은 변형을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는 다른 포유류 종들, 예컨대 마우스와 사람을 포함한 다른 종 중에 폴리펩티드의 변이체를 지칭한다. 예를 들어 PH20에 대해, 본원에 제공되는 종 변이체의 예는 영장류의 PH20, 예컨대 인간, 침팬지, 마카크(macaque) 원숭이, 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이이나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 종 변이체는 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진다. 종 변이체 간 및 중에서 상응하는 잔기들은 매칭되는 뉴클레오티드 또는 잔기들의 수를 최대화하기 위하여, 예를 들어, 상기 서열들 사이의 동일성이 95% 이상이거나, 96% 이상이거나, 97% 이상이거나, 98% 이상이거나, 99% 이상이도록 서열을 비교하고, 정렬하여 측정될 수 있다. 이어서, 관심있는 위치에 참조 핵산 분자에서 할당된 숫자를 부여한다. 정렬은 특히 서열 동일성이 80% 초과인 경우 수동으로 또는 눈으로 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 인간 단백질은 모든 대립형질 변이체 및 이의 보존적 변이체를 포함하는 인간의 게놈에 존재하는 핵산 분자, 예컨대 DNA에 의해 암호화되는 것이다. 단백질의 변이체 또는 변형은, 만일 상기 변형이 인간 단백질의 야생형 또는 우세한 서열을 기초로 한다면 인간 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 하나 초과의 mRNA의 유형을 초래하는 게놈 DNA의 일차(primary) 전사체의 차별적 프로세싱에 의해 생산되는 변이체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 변형(modification)은, 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 변형에 관한 것이며, 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 치환(replacement)(예를 들어, 치환(substitutions))을 포함한다. 예시적인 변형은 아미노산 치환이다. 아미노산이 치환된 폴리펩티드는 아미노산 치환을 포함하지 않는 폴리펩티드에 65%, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 아미노산 치환은 보존적일 수도 비보존적일 수도 있다. 일반적으로, 폴리펩티드에 임의의 변형을 가하더라도 폴리펩티드의 활성은 유지된다. 폴리펩티드를 변형하는 방법들은 재조합 DNA 방법론을 사용하는 것과 같이 당업자가 통상적으로 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산의 적합한 보존적 치환이 당업자에게 공지되어 있고 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않고도 일반적으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 당업자는 폴리펩티드의 비-필수적 영역에 있어서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 것으로 인식한다 (예를 들어, Watson 외 Molecular Biology of the Gene, 4판, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조). 상기 치환은 다음 표 2에 기재된 바에 따라 수행될 수 있다.
[표 2]
Figure 112016024482551-pat00002
기타 치환도 가능하며 경험적으로 또는 공지된 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 전사의 개시를 위해 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 항상은 아니나 일반적으로 유전자의 5' 비-암호화 영역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 분리된 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이들의 생물학적으로 활성인 부분은 상기 단백질이 유래한 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성시 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제(preparation)는, 순도를 측정하기 위하여 당업자에 의해 사용되는 분석 표준 방법, 예컨대, 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 측정되어, 쉽게 검출가능한 불순물이 없는 것으로 나타나거나, 추가 정제가 물질의 물리적 및 화학적 성질, 예컨대, 효소 및 생물학적 활성을 검출가능하게 변경하지 않을 만큼 충분히 순수하다면, 실질적으로 없는 것으로 측정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 생산하기 위한 화합물의 정제 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그러한 경우, 추가 정제가 상기 화합물의 특이적 활성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본원에서 실질적으로 정제된 폴리펩티드, 예컨대 실질적으로 정제된 가용성 PH20에 대한 언급은, 상기 단백질이 그것이 분리되거나 재조합적으로 생산되는 세포의 세포 구성성분들로부터 분리되는 단백질 제제를 포함하는 세포 물질이 실질적으로 없는 단백질 제제를 지칭한다. 일 구현예에서, 상기 용어 세포 물질이 실질적으로 없음은 약 30% 미만(건중량)의 비-효소 단백질(또한 본원에서 오염 단백질로서 지칭됨), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 효소 단백질이 재조합적으로 생산시, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 없는 것이다. 즉, 배양 배지가 효소 단백질 제제의 부피의 약 또는 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학적 전구체 또는 기타 화학물질의 실질적으로 없음은 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 상기 단백질이 분리되어 있는 효소 단백질 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30% (건중량) 미만, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 비-효소 화학물질 또는 성분을 가지는 효소 단백질 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어, 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드와 관련한 합성은 재조합 방법 및/또는 화학적 합성 방법에 의하여 생산된 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 수단 또는 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합 수단에 의한 생산은 클로닝된 DNA에 의해 암호화되는 단백질 발현을 위한 분자 생물학의 널리 공지된 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이종성(heterologous) 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포 내에 도입하기 위하여 사용되는 별개의 요소를 지칭한다. 벡터는 전형적으로 에피좀(episome)으로 남지만, 유전자 또는 그의 일부가 게놈의 염색체 내로 통합(integration)을 가져 오도록 설계될 수 있다. 또한 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터가 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 사용이 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 DNA 단편의 발현을 가져올 수 있는 조절 서열, 예컨대 프로모터 영역과 작동가능하게 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 부가적 분절(segment)은 프로모터 및 터미네이터(terminator) 서열을 포함할 수 있으며, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 복제 기점, 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 둘 다의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 재조합 DNA 또는 RNA 구축물, 예컨대, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 적절한 숙주 세포 내 도입시, 클로닝된 DNA의 발현을 초래하는 기타 벡터를 지칭한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜으로 남는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합되는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vector)"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 (비히클 또는 셔틀로써) 외인성 유전자를 세포 내로 운반하도록 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절을 언급할 때의 "작동가능하게" 또는 "작동가능하게 연결된"은 상기 분절이 그들의 의도된 목적을 위해, 예를 들어, 전사가 프로모터 하류 및 임의의 전사된 서열 상류에서 개시되도록 협력하여 기능할 수 있게 배열된 것을 의미한다. 프로모터는 보통 전사기구가 결합하여 전사가 개시되고 코딩 분절을 따라 터미네이터까지 진행되도록 하는 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "평가(측정)(assessing)"는 시료 내 존재하는 예컨대 효소, 또는 이의 도메인과 같은 단백질의 활성에 대한 절대값의 획득 및 또한 상기 활성의 수준을 나타내는 지표, 비율, 백분율, 시각적 또는 다른 값의 획득과 관련한 정량적 및 정성적 측정을 포함하는 것을 의미한다. 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 실제 검출되는 화학 종은 물론 효소로 절단된 산물 그 자체일 필요는 없으나, 그의 유도체 또는 어떤 추가 물질일 수 있다. 예를 들어, 절단 산물의 검출은 형광 모이어티(moiety)와 같은 검출가능한 모이어티가 될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은 화합물의 생체 내(in vivo ) 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체 내(in vivo)로 투여시 초래되는 생리학적 반응을 지칭한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료적 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험하거나 사용하기 위해 설계된 시험관 내(in vitro) 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원의 목적상, 히알루로니다아제 효소의 생물학적 활성은 히알루론산의 분해이다.
본원에 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열을 언급할 때의 동등함(equivalent)은 문제된 2개의 서열들이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 암호화하는 것을 의미한다. 동등함이 2개의 단백질 또는 펩티드를 언급하는데 사용되는 경우, 이는 2개의 단백질 또는 펩티드가 상기 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 아미노산 치환만을 가지는, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. 동등함이 성질을 언급하는 경우, 상기 성질은 동일한 정도로 나타날 필요는 없으나(예를 들어, 2개의 펩티드가 동일한 유형의 효소 활성을 다른 속도로 나타낼 수 있다), 상기 활성은 대개 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "조절하다(modulate)" 및 "조절(modulation)" 또는 "변경하다(alter)"는 분자, 예컨대 단백질의 활성의 변화를 지칭한다. 예시적인 활성은 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달(signal transduction)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조절은 활성의 증가(즉, 상향조절 또는 작용제(agonist) 활성), 활성의 감소(즉, 하향조절 또는 억제) 또는 활성의 임의의 다른 변경(예컨대, 주기성, 빈도, 지속시간, 동역학 또는 다른 파라미터의 변화)를 포함한다. 조절은 문맥에 좌우되며, 전형적으로 조절은 지정된 상태, 예를 들어, 야생형 단백질, 구성적 상태의 단백질, 또는 지정된 세포 유형 또는 상태에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 직접 투여는 희석 없이 투여되는 조성물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일 투여량 제형(single dosage formulation)은 단지 한 번의 사용을 위한 제형을 지칭한다. 전형적으로, 단일 투여량 제형은 직접 투여를 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 다중 투여량 제형(multiple dosage formulation)은 반복되는 투여에서 사용을 위한 제형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이의 임의의 조합물일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 조합물은 2개 또 그 이상의 물질(item) 사이의 또는 중의 임의의 연합을 지칭한다. 상기 조합물은 2개 또는 그 이상의 별개의 물질, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물일 수 있고, 이의 혼합물, 예컨대 2개 또는 그 이상의 물질의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 연합되거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천성 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 기인하고 확인가능한 증상을 특징으로 하는 유기체 내 병리학적 상태를 의미한다. 본원의 관심의 질환 및 장애는 히알루로난-관련 질환 및 장애이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "정맥 내 투여"는 치료제의 정맥으로 직접 전달을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "히알루로난-연관된 암" 또는 "히알루로난 풍부암"은 질환 또는 상태에서 히알루로난 수준이 원인, 결과로 상승되거나 또는 관찰되는 암을 포함한다. 히알루로난-연관된 암 또는 종양은 조직 또는 세포에서 상승된 히알루로난 수준, 증가된 간질액 압력, 감소된 혈관 부피, 및/또는 조직에서 증가된 수분 함량에 관련된다. 상기 암은 예를 들어, 예컨대 후기(late-stage) 암, 전이암, 미분화 암, 난소암, 상피내암(in situ carcinoma, ISC), 편평세포암(SCC), 전립선암, 췌장암, 비소세포 폐암, 유방암, 결장암 및 기타 암을 포함하는 종양을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 상승된 히알루로난 수준은 질환 또는 상태, 결과 또는 상기 질환에서 달리 관찰되는 것에 좌우되는, 특히 조직, 체액 또는 세포에서 히알루로난의 양을 지칭한다. 예를 들어, 히알루로난-풍부 종양의 존재 결과에 따라, 히알루로난 (HA) 수준이 체액, 예컨대 혈액, 뇨, 타액 및 혈청, 및/또는 종양 조직 또는 세포에서 상승될 수 있다. 상기 수준은 표준 또는 다른 적합한 대조군, 예컨대 HA-연관된 질환을 가지지 않는 대상체로부터의 비교할만한 시료와 비교될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상체를 "치료하는 것"은 치료후 대상체의 증상이 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약학적으로 유효한 제제는 예를 들어, 화학치료제, 마취제, 혈관수축제, 산포제, 소분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료 약물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 치료적 제제 또는 생물활성 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 기타 적응증의 증상을 개선하거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변경하는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 효과는 질환 또는 상태의 증상을 변경, 전형적으로는, 개선하거나 완화시키는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상체의 치료로부터 얻어지는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상체에 투여 후 치료 효과를 초래하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 포유동물, 예컨대 인간을 포함한 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 질환 또는 장애 증상을 보이는 인간 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 대체로 동일함은 당업자가 동일하거나 허용 가능한 오차 범위 내에 있다고 판단할 양 이내를 의미한다. 예를 들어, 전형적으로, 약학적 조성물에 있어서, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 내에 있는 경우 대체로 동일한 것으로 본다. 상기 양은 대상체에 의해 특정 조성물에 있어서의 변이에 대한 내약성에 의존하여 다양할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투약 요법(dosing regime)은 투여되는 항-히알루로난 제제, 예를 들어 가용성 히알루로니다아제 또는 다른 제제를 포함하는 조성물의 제제의 양, 및 투여 빈도를 지칭한다. 투약요법은 치료될 질환 또는 상태의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 빈도는 치료의 연속적 투여 사이의 시간을 지칭한다. 예를 들어, 빈도는 수일, 수주 또는 수개월 일 수 있다. 예를 들어, 빈도는 매주 1회 이상, 예를 들어, 일주일 마다 2회, 일주일 마다 3회, 일주일 마다 4회, 일주일 마다 5회, 일주일 마다 6회 또는 매일 일 수 있다. 빈도는 또한 1, 2, 3, 또는 4 주일 수 있다. 특정 빈도는 치료되는 특정 질환 또는 상태의 함수이다. 일반적으로, 빈도는 매주 1회 초과이며, 일반적으로 매주 2회이다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여 주기"는 연속적 투여에 대하여 반복되는, 상기 효소 및/또는 제2 제제의 투여의 투약요법의 반복된 일정을 지칭한다. 예를 들어, 예시적인 투여 주기는 3주일 동안 매주 2회 투여에 이어서 1주일간 투여를 중단하는 28일 주기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체의 mg/kg에 기초한 참조 투여량에서, 평균 인간 대상체는 약 70 kg-75 kg, 예컨대 70 kg의 중량 및 1.73의 체표면적(BSA)을 갖는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대 약학적 조성물 또는 기타 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 개선은 영구적이든지 또는 일시적이든지, 지속적이든지 또는 일시적이든지 증상 또는 상태의 유해한 효과(adverse effect)의 완화, 예컨대 예를 들어 항-히알루로난 제제, 예컨대 PEG화된 히알루로니다아제의 투여와 관련되는 또는 이의 투여시 발생하는 유해 효과의 임의의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태를 발전시킬 위험에서의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적으로 유효한 양" 또는 "치료적으로 유효한 용량"은 치료 효과를 생성하기에 적어도 충분한 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 물질, 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 질환 또는 장애의 증상의 예방, 치유, 개선, 정지 또는 부분적 정지에 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단위 용량 형태(unit dose form)는 인간 및 동물 대상체에 적절하고, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 개별 포장된 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일 투여량 제형은 단일 용량으로서의 제형을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 직접 투여 제형은 투여를 위해 추가적인 희석이 요구되지 않는 조성물을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이,"제조품(article of manufacture)"은 제조되어 판매되는 제품이다. 본 출원을 통해 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장 물품 내에 포함된 항-히알루로난 제제, 예를 들어 히알루로난 분해효소, 예컨대 히알루로니다아제, 및 제2 제제 조성물을 포함하려는 의도이다. 예를 들어, 제2 제제는 코르티코스테로이드, 종양-표적 탁산(taxane) 또는 화학치료제이다.
본원에 사용된 바와 같이, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 따라서, 유체는 반-고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 다른 기타 상기 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합물(combination), 예컨대 본원에서 제공하는 조성물의 조합물은 조합물의 구성요소들의 연합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 구성성분의 조합물, 예컨대 본원의 조성물과 재구성, 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는 목적을 위한 다른 물품, 및 전달, 투여, 진단, 및 생물학적 활성 또는 성질의 평가를 위한 및 장비/장치의 조합물을 의미한다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)은 용해되거나 또는 파괴된 세포로부터 만들어진 제제 또는 분획을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함한 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지 및 다른 동물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비-인간 동물은 고려되는 동물로서 인간을 배제한다. 본원에서 제공되는 히알루로니다아제는 임의의 출처, 동물, 식물, 원핵 및 진균(fungal) 유래이다. 대부분 히알루로니다아제들은 포유동물 기원을 포함한 동물 기원이다. 일반적으로 히알루로니다아제는 인간으로부터 기원된다.
본원에 사용된 바와 같이, 항암 치료는 암을 치료하기 위한 약물 및 다른 제제의 투여와, 또한 치료 프로토콜, 예컨대 외과적 수술이나 방사선을 포함한다. 항암치료는 항암제의 투여를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 항암제는 항암치료에 사용되는 임의의 제제 또는 화합물을 지칭한다. 이들은 다른 화합물과 단독 또는 조합으로 사용될 때, 종양 또는 암과 관련된 임상적 증상 또는 진단 마커를 완화, 감소, 개선, 예방, 또는 차도에 놓이게 하거나 유지시킬 수 있는 임의의 약물을 포함하며, 본원에서 제공되는 조합물 및 조성물에서 이용될 수 있다. 예시적인 항암제는 단독으로 또는 기타 항암제, 예컨대 화학치료제, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 소분자 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA와 병용하여 이용되는 히알루로난-분해 효소, 예컨대 본원에서 제공되는 PEG화 히알루로난 분해 효소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은 시험 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고는 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 지칭하거나, 또는 만약 그것이 혈장 시료라면, 그것은 관심 있는 상태에 영향받지 않은 정상적 지원자 유래일 수 일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나의" "한" 및 "상기"는 문맥상 명백하게 달리 구술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하거나 함유하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위로서 표현될 수 있다. "약"은 또한 정확한 양을 포함한다. 따라서 "약 5개의 염기"는 "약 5개의 염기" 및 또한 "5개의 염기"를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의적인(선택적인)" 또는 "임의적으로(선택적으로)"는 그 다음에 기술되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기술이 사건 또는 상황이 발생하는 경우의 예 및 그것이 발생하지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 기는 상기 기가 비치환되거나 또는 치환된 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 보호기, 아미노산, 및 다른 화합물에 대한 약어는 달리 기재되어 있지 않으면, 통상적인 사용법에 따라서 약어 또는 IUPAC-IUB 위원회 생화학 명명법으로 인식된다((1972), Biochem. 11:1726 참조).
B. 항- 히알루로난 제제 병용 치료
본원에서 제공되는 것은 암의 치료에서 사용하기 위한 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및 종양 표적 탁산, 예컨대 알부민 결합된 파클리탁셀의 병용 치료이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 것은 암의 치료에서 사용하기 위한 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 히알루로니다아제, 예컨대 PEGPH20, 및 종양 표적-탁산, 예컨대 알부민 결합된 파클리탁셀의 병용 치료이다. 특히, 본원에서 제공되는 병용 치료는 기질 층으로 인해 침투할 수 없는 고형 암으로 특징화되는 임의의 암의 치료에서 사용된다. 예시적인 상기 암은 고형 종양 암, 예컨대 췌장암, 유방암, 전립선암, 위암, 결장암, 난소암, 두경부암 및 기타를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 병용 치료는 예를 들어 하나 또는 둘의 항-히알루로난 제제, 예를 들어 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산에 의해 이의 활성이 증가되는(예를 들어, 증가된 전달 및/또는 증가된 반감기로 인함) 임의의 추가의 세포독성 화학치료제 약물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 화학치료제는 직접적인 항-종양 활성을 나타내는 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 젬시타빈 또는 이의 유도체일 수 있다.
1. 고형 종양 및 종양 표적 치료
고형 종양은 세포외 기질 및 혈관 네트워크로 둘러싸여진 기질(stroma) 세포(예를 들어, 섬유아세포(fibroblast) 및 염증성 세포) 및 암세포로 구성된다. 상기 기질 세포, 세포외 기질(matrix) 구성성분 및/또는 맥관구조(vasculature)는 정상 조직에 존재하는 것과 비교하여 일반적으로 비정상이다. 예를 들어, 많은 고형 종양은 정상 조직과 비교하여 섬유아세포의 수가 증가되어 있다. 또한, 고형 종양에서 맥관구조는 정상 맥관구조와 비교하여 분지형 또는 나선형 구조를 나타낼 수 있고, 팽창된 혈관, 혈관 내벽의 감소 및/또는 압축된 혈관으로 특징화되는 구조적 이상(aberration)을 나타낼 수 있다. 마지막으로, 상기 종양 및 기질 세포는 세포외 기질 구성성분, 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 (예를 들어, 히알루로난) 및 고밀도 덩어리를 형성하는 기타 분자의 복잡한 네트워크를 생산 및 조립하고 높은 종양 간질 압력에 기여할 수 있다. 말단 세동맥 및 모세혈관에서 혈관내 압력보다 높은 간질 유체 압력은 간질(interstitium)로 유체 및 용질의 관류를 저해할 수 있다. 따라서, 높은 간질 압력은 치료제의 종양 조직으로 흡수를 방해할 수 있고, 또한 종양 세포 증식을 지원하는 종양 세포의 성장 성질에 영향을 미칠 수 있다.
효과적인 종양 치료를 위해, 약물은 종양 혈관에서 효과적으로 나가야하고 암 세포에 도달하기 위해 종양 조직을 침투해야 한다. 세포외 기질 및 관련된 세포의 고밀도 조성물 및 조직뿐 아니라 높은 간질 유체 압력은 약물 침투에 영향을 미친다. 상기 결과는 기질 장벽이 종종 항암 약물의 종양으로의 침투를 방지한다는 것이고, 이것은 많은 종래의 암 치료가 비효율적이게 한다.
예를 들어, 췌장암은 모든 고형 종양 암 중에 가장 비침습성이다. 결과적으로, 췌장 유관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma)을 포함하는 췌장암은 종래 화학치료제에 선천적인 저항성에 의해 특징화되고, 5년 생존 비율이 5% 미만이다. 췌장암에 대한 표준 치료는 젬시타빈에 의한 치료이다. 젬시타빈은 환자의 생존을 증가시키는데 제한적인 효과가 있다. 예를 들어, 젬시타빈 단독요법으로 치료되는 환자의 약 4분의 1만이 단지 5개월 이상의 중앙(median) 생존의 임상적 혜택을 나타내고, 이것은 화학치료제 플루오로우라실(fluorouracil)(5-FU)에 의한 치료보다 단지 일 개월이 더 길었다(Burris 외 (1997) J Clin Oncol, 15:2403-2413). 치료가 췌장암 수술 또는 기타 비-화학치료 어주번트 치료에 의해 또한 동반되는 어주번트(adjuvant) 환경에서, 젬시타빈은 수술만을 했던 환자와 비교하여 2개월 생존을 증가시켰다(Neuhaus 외 (2008) J. Clin . Oncol. 26: May 20 suppl; abst.).
최근에, 기질 층 및 관련된 맥관구조를 침투할 수 있는 치료제를 포함하는 치료가 개발되었다. 기질을 감소시키거나 구멍(hole)을 뚫거나 달리 기질을 침투할 수 있는 치료가 비투과성 기질 층에 의해 특징화되는 많은 암에 대한 유망한 치료제로 볼 수 있다. 상기 제제는, 예를 들어, 알부민--컨주게이션된 탁산 (Von Hoff 외 (2011) J. Clin . Oncol , 29:4548-54; Frese 외 (2012) Cancer Discovery, 2:260-269), 헤지호그(hedgehog) 억제제 (Olive 외 (2009) Science, 324:1457-61) 및 폴리머-컨주게이션된 히알루로니다아제 (Provenzano 외 (2012) Cancer Cell, 21:418-429)를 포함한다. 상기 치료의 각각은 또한 비-기질 표적 화학치료제의 증가된 전달과 연관되고, 화학치료제(예를 들어, 젬시타빈) 단독요법과 비교하여 향상된 항암 효과 및 두 배의 생존 시간을 초래한다.
a. 종양-표적 탁산
탁산(Tanxane), 예컨대 파클리탁셀(paclitaxel)(예를 들어, 탁솔(Taxol)®) 및 도세탁셀(docetaxel)(예를 들어, 탁소테레(Taxotere)®)은 다수의 종양 유형의 치료에서 사용하기 위한 강력한 화학치료제이다. 탁산은 미세소관에 높은 친화력으로 결합함으로써 유사분열 억제제로서 작용을 하고, 이에 따라 세포 분열을 방해한다. 상기 결과는 탁산이 종양 세포 성장 및 전이를 방지하고, 세포 사멸을 일으킬 수 있다는 것이다. 탁산의 치료적 용도는 가용성 및 관련 독성, 장기간 전신적 유용성(systemic availability) 및 종양 기질에 도달불능(inaccessibility)의 문제에 의해 제한되어 왔다.
탁산의 치료적 용도와 관련된 문제를 극복하기 위해, gp60 수용체 표적 나노입자 약물 제형이 탁산의 알부민 결합 입자 형태를 이루어 개발되었다. 이들은 예를 들어, 나노입자 알부민-결합(nab)-파클리탁셀 (ABI-007, 예를 들어, 아브락산(Abraxane)®) 및 나노입자 알부민-결합 도세탁셀 (ABI-008)을 포함한다. Gp60은 혈관 내피상의 알부민 수용체이다. gp60을 통한 알부민 수용체-매개 흡수는 세포내 카베올린-1(caveolin-1)과 연합을 초래하여, 세포외 공간 트랜스사이토시스(transcytosis), 및 카베올라(caveolae) 성분의 혈관 밖 퇴적(extravascular deposition)으로부터 결합한 혈장 구성성분을 포함하는 트랜스사이토시스 베지클(vesicle)(카베올라라고 지칭됨)을 형성하는 세포막의 함입으로 이어진다. 게다가, 알부민은 또한 다양한 암에서 불량한(poor) 예후와 관련된 과발현된 세포외 기질 당단백질인, SPARC(산성 및 시스테인 풍부 분비된 단백질, secreted protein acid and rich in cysteine)에 결합한다. 상기 결과는 약물 전달에 대한 기질 장벽이 회피되고, 약물의 더 높은 종양내 농도가 달성된다는 것이다. Nab-파클리탁셀은 종래의 용매-기반의 파클리탁셀과 비교하여 더 높은 종양내 농도 및 증가된 생체이용률을 달성할 수 있다(Foote (2007) Biotechnology Annual Review, 13:345).
종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-컨주게이션된 탁산이 기질(stroma)을 투과시키고 감소시키거나 붕괴 되게 할 수 있기 때문에, 상기 제제는 종양으로 다른 제제의 전달을 향상시키도록 다른 비-기질 표적 화학치료제와 병용하여 사용될 수 있다. 향상된 전달에 대한 기전은 증가된 관류 및 화학치료제의 전달로 이어지는 기질 구조의 파괴 및 반응성 혈관신생의 유도에 기인한다(예를 들어, Frese 외 (2012) Cancer Discovery, 2:260-269 참조). 예를 들어, 연구들은 젬시타빈과 병용한 알부민-컨주게이션된 탁산인 nab-파클리탁셀이 젬시타빈 단독으로 치료와 비교하여 종양에서 젬시타빈의 양이 거의 2.8 배 향상되었음을 보여주었다(Von Hoff 외 (2011) J. Clin . Oncol ., 29:4548- 4554). 상기 결과는 또한 병용 치료가 췌장암을 가진 환자의 생존 시간을 두 배로 한 것을 보여주었다(Von Hoff 외 (2011)).
nab-파클리탁셀 치료와 병용한 젬시타빈의 향상된 종양내 양에 대한 기전은 더욱 최근에는 nab-파클리탁셀 처리 군에서 시티딘 탈아미노 효소 (Cda)의 감소와 관련된 독립적인 기전의 탓으로 여겨졌다(Frese 외 (2012) Cancer Discovery 2:260-269). Cda는 세포 내 어디에나 발현되고, 대사물질 디플루오로데옥시유리딘(difluorodeoxyuridine)(dFdU)으로 탈아미노화에 의해 젬시티빈을 불활성화할 수 있다. nab-파클리탁셀 처리는 반응성 산소 종(ROS)을 증가시켰고, 이것은 mRNA 수준의 임의의 조절 없이 Cda의 분해(degradation)로 이어졌다. 따라서, nab-파클리탁셀과 공동-치료는 젬시타빈의 탈아미노화의 감소를 초래하고, 이에 따라 젬시타빈을 안정화시켜서 종양내 젬시타빈의 수준의 상승으로 이어진다.
b. 항- 히알루로난 제제
항-히알루로난 제제는 히알루론산(HA; 또한 본원에서 히알루로난으로 지칭됨)의 합성을 방해하거나 그것의 분해를 증가시킴에 의해 히알루론산을 감소시킨다. 예를 들어, 히알루로난-분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제 효소는 히알루론산을 방해하거나 분해하는 효소이다. 히알루로난은 고형 종양의 세포외 기질의 주요한 구성성분이다. HA는 반복되는 이당류 단위체인 β-1,3 N-아세틸-D-글루코사민-결합된(linked) β-1,4 투(to) D-글루쿠론산을 반복하여 포함하는 고분자량 선형의 글리코사미노글리칸이다. HA는 생체에서 자연적으로 발생하고 췌장 암세포를 포함하는 일부 암세포에 매우 높은 수준으로 분비된다. HA 대사의 국소 이상(aberration)이 많은 고형 종양 악성에서 보고되어 왔고, 여기서 HA의 상승된 수준은 종양 예컨대 유방, 위, 대장, 난소, 전립선 및 폐 암종(carcinoma)에서 불량한 예후와 자주 관련된다.
HA는 질환 조직, 예컨대 종양에서 증가된 물 흡수 및 간질 유체 압력(IFP)과 관련되고, 이에 따라 압축된 종양 맥관구조(vasculature)를 초래한다. 예를 들어, 염증 부위 또는 종양 병소(focus)에서, 히알루로난, 기타 기질 구성성분 및 물의 신속한 축적이 있다. 상기 신속한 축적 때문에, 질환 부위는 그의 환경과 평형이 될 수 없고 따라서 정상 조직보다 높은 간질 유체 압력을 갖는다. 상술한 바와 같이, 대부분의 고형 종양 및 축적된 HA와 관련되는 기타 질환 조직의 IFP가 상승되고, 효율적인 약물 전달의 장벽으로 작용한다(Heldin 외 (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813). HA 축적은 또한 종양 세포 사이 및 중에 접촉 억제를 감소시킨다(예를 들어, Itano 외 (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 99:3609-3614 참조).
HA 합성을 억제하거나 히알루로난을 분해하는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 예를 들어, 히알루로니다아제(예를 들어, PH20)는 히알루로난을 감소시켜서 조직을 수축시키고, 혈관을 확장시키고, 더욱 혈액이 부위를 통해 흐를 수 있도록 한다. 이것은 조직 부위에서 간질 유체 압력의 감소 및 혈관 관류에서 관련된 증가를 초래한다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 증가된 종양 침투를 가능하게 하여 종양으로부터 HA를 제거하여 종양 부피를 감소시키고, 종양내 간질 압력을 감소시키고, 종양 세포 증식을 둔화(slowing)시키고, 그리고 병용 투여된 화학치료 약물 및 생물학적 제제의 향상된 효율을 초래하는 것을 보여주었다(예를 들어, 미국 출원 공개번호 제20100003238호 및 국제출원 공개번호 WO 2009/128917호 참조).
전신적 치료를 위한 히알루로니다아제, 예컨대 PH20 효소의 사용은 효소의 짧은 반감기와 관련된 문제를 앓고 있다. 예를 들어, 비변형된 히알루로니다아제는 전형적으로 혈액에서 수분, 일반적으로 5분 미만의 짧은 반감기의 효소적 활성을 갖는다. 이는 상기 효소가 일반적으로 정맥 투여, 및 작용의 지속이 짧은 수명인 기타 투여에 적합하지 않다는 의미이다. 이것은 분해에 따라, HA 기질이 약 5시간의 반감기로 바뀌기 때문이다. 반면에, 전달을 증가시키고 그리고/또는 세포 관련된 히알루로난(예를 들어, 종양 관련된 세포주위(pericellular) 히알루로난)과 히알루로니다아제의 연합을 연장시키는 방법은 HA가 풍부한 종양의 치료를 허용한다. 상기 방법은 폴리머에 효소의 컨주게이션(conjuation), 탈글리코실화된(aglycosylated) 또는 감소된 글리코실화를 갖도록 변형된 효소의 사용, 효소의 지속적 주입 및/또는 효소의 국소 전달을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 히알루로니다아제의 폴리머-변형, 예컨대 PEG화(PEGylation)에 의한 변형은 효소의 반감기를 약 48 내지 72 시간으로 증가시키고 HA 풍부한 종양의 전신 치료를 허용한다(예를 들어, 미국 출원 공개번호 제20100003238호 및 국제 출원 공개번호 WO 2009/128917호 참조). 비변형된 히알루로니다아제에 관한 증가된 반감기는 HA의 계속된 제거를 허용하고, 이에 따라 질환 조직, 예컨대 종양 내 HA의 재생의 정도를 감소시키거나 감소하게한다. 따라서, 폴리머 컨주게이션에 의한 혈장 효소 수준의 유지는 HA, 예컨대 종양 HA를 제거하고, 또한 HA 재합성을 방해한다.
또한, 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로니다아제 또는 PH20, 예를 들어 PEGPH20은 HA를 분해함으로써 암세포를 둘러싸는 기질을 감소시킬 수 있다. 상기 제제는 비-기질 표적 화학치료제, 예컨대 젬시타빈의 전달을 향상시키기 위해 종양의 치료를 위한 단일 제제 치료 또는 병용 치료에서 사용될 수 있다. 췌장암을 가진 환자의 임상 시험의 결과는 또한 젬시타빈과 병용한 PEGPH20 치료가 젬시타빈 단독의 치료와 비교하여 생존기간을 거의 두 배로 함을 보여준다(Provenzano 외 (2012) Cancer Cell, 21:418-429).
2. 항- 히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산 병용 치료
본원에서 적어도 두 개의 다른 기질 또는 종양 표적 치료제를 포함하는 병용 치료는 단일 기질 표적 제제보다 더 큰 효능을 나타내는 것으로 보인다. 예를 들어, 본원에서 HA 수준을 감소시키기에 충분한 시간 동안 종양에 세포주변(pericellular) HA에 도달할 수 있는 종양-표적 탁산 및 항-히알루로난 제제, 특히 항-히알루로난 제제와의 병용 치료는 어느 하나만의 단독 치료와 비교하여 증가된 효능을 나타내는 것으로 보인다. 예를 들어, 종양-표적 탁산 및 폴리머-컨주게이션된 히알루로니다아제의 병용 치료는 단일 제제 치료와 비교하여 25% 초과의 효능의 증가를 초래한다. 비-기질 표적 화학치료 약물 젬시타빈과의 추가 병용에서, 예시적인 암의 중앙(median) 생존은 젬시타빈만의 치료와 비교하여 췌장암의 마우스 모델에서 79%로 증가하였고 단일 기질 표적 제제만을 포함하는 기존 치료와 비교하여 30% 이상 증가하였다. 상기 효능의 증가는 기존 치료와 비교하여 췌장암 및 비침투성 기질로 특징화되는 기타 암을 가진 환자의 생존에 상당한 향상으로 해석될 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 것은 고형 종양 기질 암의 치료를 위한, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소 또는 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다아제 또는 PH20), 및 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민 결합-탁산을 포함하는 병용 치료를 사용하는 방법이다. 예를 들어, 상기 병용 치료는 췌장암, 유방암, 전립선암, 위암, 결장암, 결장직장암, 폐암, 난소암 및 기타의 치료를 위해 사용될 수 있다. 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다아제 또는 PH20), 및 종양-표적 탁산 (예를 들어, 알부민 결합-탁산)을 포함하는 조성물이 조합물에서 별도로 제공되거나 단일 조성물로 제공될 수 있다. 별도로 제공되고 투여되는 경우, 상기 제제는 임의의 순서로 동시에 또는 거의 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제, 예를 들어, 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다아제 또는 PH20) 및 종양-표적 탁산 (예를 들어, 알부민 결합 탁산)이 별도로 투여될 수 있고, 여기서 이들은 거의 동시에 투여되거나 수시간 또는 수일 떨어져서 투여될 수 있다. 상기 주사 부위는 동일하거나 상이할 수 있다. 다르다면, 상기 주사 부위는 첫 번째 투여된 제제의 주사 부위 근처일 수 있다.
종양-표적 제제의 조합물은 고형 종양 기질 암을 치료하기 위해 함께 사용될 수 있거나, 기타 화학치료제 또는 치료와 추가적으로 병용하여 사용될 수 있다. 특정 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다아제 또는 PH20), 및 종양-표적 탁산 (예를 들어, 알부민 결합-탁산)의 조합이 화학치료제와 추가 병용하여 사용된다. 기타 제제가 기질 또는 비-기질 표적 제제일 수 있다. 전형적으로 기타 제제는 직접적으로 항종양 활성을 나타내는 비-기질 세포독성 제제이다. 예를 들어, 추가의 화학치료제는 세포독성 제제, 예컨대 백금 (시스플라틴(cisplatin) 또는 카보플라틴(carboplatin)), 파클리탁셀, 젬시타빈, 도세탁셀, 비노렐빈(vinorelbine), 이리노테칸(irinotecan), 및 페메트렉세드(pemetrexed)일 수 있다. 전형적으로, 추가의 화학치료제는 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 젬시타빈이다. 상기 추가 치료 또는 제제는 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 (예를 들어, 히알루로니다아제), 및/또는 종양-표적 탁산 (예를 들어, 알부민 결합-탁산) 병용 치료로 별도로 또는 함께 투여될 수 있다. 추가 제제는 조합하여 별도로 투여되거나 단일 조성물로 제공될 수 있다. 별도로 제공되고 투여된다면, 추가 제제는 항-히알루로난 제제 및/또는 알부민 결합-탁산 병용 치료와 함께 임의의 순서로 동시에 또는 거의 동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 추가 제제의 향상된 전달을 달성하기 위해, 추가 제제는 항-히알루로난 제제 및/또는 알부민 결합-탁산 병용 치료의 투여 후에 투여된다. 추가 화학치료제의 향상된 전달 및 반감기로 인해, 기존 투여량 요법과 비교하여 추가 제제의 투여량이 감소될 수 있고 그리고/또는 투여의 빈도가 감소될 수 있다. 상기 결과는 본원에서 제공되는 병용치료가 그의 투여 단독 또는 항-히알루로난 제제, 예를 들어 히알루로난-분해 효소, 또는 종양-표적 탁산 단독 중 어느 하나의 그의 투여와 비교하여 병용-투여된 추가 치료제(예를 들어, 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 젬시타빈)의 감소된 부작용을 초래할 수 있는 것이다.
다음 섹션은 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 예시적인 항-히알루로난 제제, 종양-표적 탁산 및 본원에서 제공되는 병용 치료에서 사용을 위한 기타 예시적인 비-제한적 화학치료제를 기술한다. 기질 고형 종양 암의 예시적인 투여량 요법 및 방법이 또한 기술된다.
C. 병용 치료 제제
본원에서 제공되는 것은 암의 치료에서 사용하기 위한, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민 결합-파클리탁셀의 병용 치료이다. 특히, 본원에서 제공되는 것은 암의 치료에서 사용하기 위한, 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 히알루로니다아제, 예컨대 PEGPH20, 및 종양 표적-탁산, 예컨대 알부민 결합-파클리탁셀의 병용 치료이다. 특히, 본원에서 제공되는 상기 병용 치료는 세포외 기질(matrix)에서 HA로 인한 비침투성 고형 종양으로 특징화되는 임의의 암의 치료에 사용된다. 예시적인 상기 암은 고형 종양 암, 예컨대 췌장암, 유방암, 전립선암, 위암, 결장암, 난소암, 두경부암 및 기타를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 병용 치료는 예를 들어 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 항-히알루로난 제제, 및/또는 종양-표적 탁산의 하나 또는 둘 다에 의해 이의 활성이 증가되는(예를 들어, 증가된 전달 및/또는 증가된 반감기로 인함) 임의의 세포독성 화학치료 약물을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 추가의 화학치료제는 직접적인 항-종양 활성을 나타내는 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 젬시타빈 또는 이의 유도체일 수 있다.
1. 항- 히알루로난 제제
본원에서 제공되는 조합물 및 방법을 포함하는 병용 치료 및 이의 사용은 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 예를 들어, 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함한다. 상기 항-히알루로난 제제는 그것의 표적에 도달하도록 투여될 수 있는 것이고, 특히 상승된 세포주위(pericellular) HA를 포함하는 종양 세포에 도달한다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소는 지속적 주입에 의해 투여될 수 있거나 국소 주사될 수 있고, 폴리머로 변형될 수 있거나, 또는 탈글리코실화되거나 탈글리코실화되거나 감소된 글리코실화를 갖도록 변형된 것이다. 일 예에서, 제공되는 조성물 및 조합물은 전형적으로, 히알루로난-분해 효소의 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 대상체에서 연장된/지연된 치료 효과를 촉진하기 위해 하나 또는 그 이상의 폴리머 분자(폴리머)에 컨주게이션에 의해 변형된 히알루로난-분해 효소, 특히 히알루로니다아제, 예컨대 가용성 히알루로니다아제 (예를 들어, PH20 또는 말단절단된 PH20)을 포함한다.
히알루로난은 세포외 기질(matrix)의 성분 및 간질성 장벽의 주성분이다. 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해 효소는 히알루로난의 점성을 낮추고, 이에 따라 조직 투과성을 증가시키고 비경구 투여된 유체의 흡수 비율을 증가시킨다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제를 포함하는 그러한, 항-히알루로난 제제는 다른 제제, 약물 및 단백질과 함께 사용되어, 예를 들어 그들의 분산 및 전달을 증가시키기 위한 분산제 또는 산포제로서 사용된다.
항-히알루로난 제제는 그의 합성을 방해하거나 그의 분해를 증가시킴에 의해 히알루론산 (HA; 또한 본원에서 히알루로난으로 지칭됨) 수준을 감소시킨다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제는 히알루론산 (HA)을 방해하고 분해한다. 히알루로난 합성을 분해하거나 억제하는 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소로 치료는 히알루로난을 감소시켜서 조직을 감소시키고, 혈관을 확장하고, 더 많은 혈액이 부위를 통해 흐르도록 한다. 예시적인 상기 항-히알루로난 제제는 히알루로난 합성을 억제하거나 히알루로난을 분해하는 제제이다.
a. 히알루로난 합성을 저해하는 제제
항-히알루로난 제제는 히알루로난 합성을 억제하는 제제, 예컨대 HA 생성효소 (synthase), HA 합성 억제제 및 티로신 키나제 억제제의 발현을 억제하거나, 감소시키거나 또는 하향조절하는 제제를 포함한다.
HA는 has-1, has-2 및 has- 3로 표기되는, HA 생성 효소 (synthase)로 확인되는 세 개의 관련된 포유류 유전자의 산물인 세 개의 효소에 의해 합성될 수 있다. 다른 세포 유형은 다른 HAS 효소를 발현하고 HAS mRNA의 발현은 HA 생합성과 관련이 있다. 종양 세포에서 침묵(silencing) HAS 유전자는 종양 성장 및 전이를 억제하는 것으로 알려져 있다. 항-히알루로난 제제는 HA 생성 효소 (synthase)의 발현 또는 수준을 억제하거나, 감소시키거나 하향조절하는 임의의 제제를 포함한다. 상기 제제는 당해 기술분야 당업자에게 공지되어 있거나 확인될 수 있다.
예를 들어, HAS의 하향 조절은 HAS를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들과 특이적으로 혼성화하거나 달리 상호작용을 하는 올리고뉴클레오티드를 제공함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 합성을 억제하는 항-히알루로난 제제는 has 유전자에 대한 안티센스 또는 센스 분자를 포함한다. 상기 안티센스 또는 센스 억제는 전형적으로 수소결합에 기초한 올리고뉴클레오티드 가닥 또는 분절의 혼성화에 기반으로하며, 적어도 하나의 가닥 또는 분절이 절단되거나, 분해되거나, 그렇지 않으면 작동불능이 되게한다. 다른 예에서, 번역후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing, PTGS), RNAi, 리보자임 및 DNA자임이 적용될 수 있다. HAS1(서열번호 195에 기재됨), HAS2(서열번호 196에 기재됨) 또는 HAS3(서열번호 197 또는 198에 기재됨)의 서열에 기초한 상기 구축물을 생성하는 것은 당해 기술분야의 당업자의 수준의 범위 내에 있다. 안티센스 또는 센스 화합물이 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 핵산과 100% 상보적일 필요가 없다는 것은 당해 기술분야에서 이해될 수 있다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 분절과 혼성화될 수 있어, 개입 분절 또는 인접 분절은 혼성화 사례(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 관련되지 않는다. 일반적으로, 안티센스 또는 센스 화합물은 표적 핵산 내의 표적 영역에 적어도 70%의 서열 상보성을 가지고, 예를 들어, 75% 내지 100%, 예컨대 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 상보성을 가진다. 예시적인 센스 또는 안티센스 분자는 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Chao 외 (2005) J. Biol . Chem., 280:27513-27522; Simpson 외 (2002) J. Biol . Chem., 277:10050-10057; Simpson 외 (2002) Am. J Path., 161:849; Nishida 외 (1999) J. Biol . Chem., 274:21893-21899; Edward 외 (2010) British J Dermatology, 162:1224-1232; Udabage 외 (2005) Cancer Res., 65:6139; 및 미국 출원 공개번호 US20070286856호 참조).
HA 합성 억제제인 다른 예시적인 항-히알루로난 제제는 4-메틸움벨리페론(4-Methylumbelliferone, 4-MU; 7-하이드록시-4-메틸쿠마린(7-hydroxy-4-methylcoumarin)) 또는 이의 유도체이다. 4-MU는 HA 합성에 필수적인 UDP-GlcUA 전구체 풀(pool)을 감소시킴으로써 작용한다. 예를 들어, 포유류 세포에서, HA는 UDP-글루쿠론산(UGA) 및 UDP-N-아세틸-D-글루코사민 전구체를 사용하여 HAS에 의해 합성된다. 4-MU는 UGA가 생산되는 과정을 방해하여, 이에따라 세포내 UGA 풀을 대폭 감소시켜서 HA 합성을 억제를 초래한다. 4-MU는 항암 활성을 가진 것으로 알려져 있다(예를 들어, Lokeshwar 외 (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa 외 (2006) Cancer Chemother . Pharmacol ., 57:165-170; Morohashi 외 (2006) Biochem . Biophys. Res. Comm ., 345-1454-1459 참조). B16 흑색종 모델에서 600 mg/kg/일로 4-MU의 경구투여가 전이를 64%까지 감소시킨다(Yoshihara 외 (2005) FEBS Lett ., 579:2722-6). 4-MU의 구조는 하기에 기재되어 있다. 또한, 4-MU의 유도체는 항암 활성을 나타내는데, 특히 6,7-디하이드로지-4-메틸 쿠마린 및 5,7-디하이드록시-4-메틸 쿠마린이 그렇다(예를 들어, Morohashi 외 (2006) Biochem . Biophys . Res. Comm., 345-1454-1459 참조).
4-메틸움벨리페론(4-MU; C10H8O3)
Figure 112016024482551-pat00003
또 다른 예시적인 항-히알루로난 제제는 레플루노마이드(Leflunomide) (아라바, Arava), 제니스테인(genistein) 또는 에르브스타틴(erbstatin)과 같은 타이로신 키나제 억제제이다. 레플루노마이드는 또한 피리미딘 합성 억제제이기도 하다. 레플루노마이드는 류마티스성 관절염(RA) 치료 약물로 알려져 있으며, 이종이식(xenograft)뿐 아니라 동종이식(allograft)에 대한 거부반응 치료에도 효과적이다. HA는 직접적 또는 간접적으로 HA에 기여하는 것으로 알려져 있다(예컨대 Stuhlmeier (2005) J Immunol ., 174:7376-7382 참조). 타이로신 키나제 억제제는 HAS1 유전자 발현을 억제한다(Stuhlmeier 2005).
b. 히알루로난 -분해 효소 및 폴리머 - 컨주게이션된 히알루로난 -분해 효소
항-히알루로난 제제는 히알루로난 분해 효소를 포함한다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제는 히알루로난을 분해하는 효소 패밀리이고, 상기 히알루로난은 세포외 기질(matrix)의 필수적인 성분이고 간질 장벽의 주성분이다. 히알루로난 분해효소는 히알루로난 폴리머를 절단함으로써 히알루로난을 분해하도록 작용하고, 상기 폴리머는 교대하는 β-1→4 및 β-1→3 글리코시드 결합을 통하여 함께 연결된, 반복되는 이당류 단위인, D-글루쿠론산(GlcA) 및 N-아세틸-D-글루 코사민(GlcNAc)으로 구성되어 있다. 히알루로난 쇄(chain)는 길이가 약 25,000 이당류 반복(repeats) 또는 그 이상에 달하고, 히알루로난의 폴리머는 생체 내(in vivo) 크기가 약 5,000 내지 20,000,000Da 범위에 이를 수 있다. 기질 장벽의 주요한 구성요소인 히알루로난의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로난 분해 효소는 히알루로난의 점도를 낮추어, 조직 투과성을 증가시킨다.
따라서, 상기 제공되는 조합물, 용도 및 방법을 위한 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 이당류 쇄 또는 폴리머의 절단을 촉매하는 능력을 가진 임의의 효소를 포함한다. 일부 예에서 상기 히알루로난 분해 효소는 히알루로난 쇄 또는 폴리머에서 β-1→4 글리코시드 결합을 절단한다. 다른 예에서, 상기 히알루로난 분해효소는 히알루로난 쇄 또는 폴리머에서 β-1→3 글리코시드 결합의 절단을 촉매한다.
히알루로난-분해 효소는 히알루로난를 절단하는 능력을 가진 기타 효소, 예컨대 콘드로이티나아제(chondrotinase) 및 리아제뿐 아니라, 히알루로니다아제를 포함한다. 더 나아가, 히알루로난-분해 효소는 또한 세포로부터 발현되고 분비될 수 있는 이의 가용성 형태를 또한 포함한다. 하기 기술하는 바와 같이, 히알루로난-분해 효소는 막 결합 또는 세포로부터 분비되는 가용성 형태로 존재한다. 본원의 목적을 위해, 가용성 히알루로난-분해 효소가 본원에서의 조합물에서의 용도, 방법 및 용도를 위해 제공된다. 그러므로, 히알루로난-분해 효소는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 포함하고 그리고/또는 그렇지 않으면 막-앵커 고정되고 또는 불용성인, 상기 히알루로난 분해 효소는 효소가 분비되고 가용성이 되도록 GPI 앵커의 말단절단 또는 결실에 의해 형성되는 가용성 형태로 제공된다. 따라서, 히알루로난-분해 효소는 말단 절단된 변이체, 예를 들어, GPI 앵커의 부분 또는 전부를 제거하도록 말단절단된 변이체를 포함한다. 예시적인 상기 가용성 히알루로니다아제는 가용성 PH20 히알루로니다아제, 예컨대 미국 특허번호 제7,767,429호; 미국 공개번호 US20040268425호 또는 US20100143457호에 기재된 임의의 것이다.
본원에서 제공되는 히알루로난-분해 효소는 또한 임의의 히알루로난-분해 효소, 예컨대 임의의 히알루로니다아제 또는 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어 당해 기술분야 당업자에게 공지되거나 본원에 기술된 PH20을 포함한다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 그의 1차 서열에 하나 또는 그 이상의 변이, 예컨대 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 히알루로난-분해 효소의 변이체는 일반적으로 변이를 포함하지 않는 히알루로난-분해 효소와 비교할 때 적어도 약 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타낸다. 상기 효소는 히알루로니다아제 활성, 예컨대 상기 변이를 포함하지 않는 히알루로난 분해 효소의 활성의, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 활성을 유지한다면(당해 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있는 시험관내 및/또는 생체내 검정으로 측정된 바와 같은), 본원에서의 목적을 위해, 임의의 변이가 히알루로난 분해 효소에 포함될 수 있다. 예를 들어, 폴리머에 컨주게이션될 수 있는 것을 포함하는, 예시적인 히알루로난-분해 효소는 서열번호 2, 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170, 183 내지 189 및 199 내지 210의 어느 하나에 기재된 임의의 것, 또는 서열번호 2, 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170, 183 내지 189 및 199 내지 210의 임의의 것과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 나타내는 임의의 것이다.
히알루로니다아제를 포함하는 여러가지 형태의 히알루로난 분해 효소가, 인간을 포함하는 대상체에서의 치료 용도를 위해 제조 및 승인되었다. 예를 들어, 동물-유래된 히알루로니다아제 제제는 정제된 양 고환 히알루로니다아제인 비트라아제(Vitrase)®(ISTA Pharmaceuticals), 소 고환 히알루로니다아제인 암파다아제(Amphadase)®(Amphastar Pharmaceuticals), 및 소 고환 히알루로니다아제인 히다제™(Prima Pharm Inc.)를 포함한다. 하일레넥스(Hylenex)®(Halozyme Therapeutics)는 rHuPH20으로 명명된, PH20의 가용성 형태를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전적으로 조작된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생산된 인간 재조합 히알루로니다아제이다(예를 들어, 미국 공개번호 US20040268425; 미국 특허번호 7,767,429 참조). 본원에서 제공되는 조합물, 방법 및 용도에는 임의의 히알루로니다아제 제제가 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허번호 제2,488,564호, 제2,488,565호, 제2,676,139호, 제2,795,529호, 제2,806,815호, 제2,808,362호, 제5,747,027 및 제5,827,721호 및 국제 출원 공개번호 WO2005/118799호; 미국 출원 공개번호 US20040268425호; 미국 특허번호 제7,767,429호; 또는 본원에서 제공되는 임의의 것 참조.
본원에서 제공되는 조합물 및 방법에서 사용을 위한 예시적인 히알루로난-분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제 효소 또는 가용성 히알루로니다아제 효소, 예를 들어 PH20의 비제한적인 설명이 하기에 기술된다. 일반적으로, 상기 히알루로난-분해 효소는 폴리머에 컨주게이션된 것을 포함한다.
i. 히알루로니다아제
히알루로니다아제는 히알루로난 분해효소의 거대 패밀리의 일원이다. 히알루로니다아제에는 세가지의 일반적인 분류(class): 포유류 타입(type) 히알루로니다아제, 박테리아 히알루로니다아제, 및 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제가 있다. 기타 히알루로니다아제는 공지된 예컨대 말벌(서열번호 12 및 13), 꿀벌(서열번호 14), 흰얼굴 호박벌(서열번호 15), 페이퍼 말벌(서열번호 16)이다. 임의의 상기 효소가 본원에서 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다.
(a) 포유류 타입 히알루로니다아제
포유류-타입 히알루로니다아제(EC 3.2.1.35)는 히알루로난의 β1→4 글리코시드 결합을 다양한 길이의 올리고당류, 예컨대, 사당류(tetrasaccharide) 및 육당류(hexasaccharide)로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다제(endo -β-N-acetyl-hexosaminidase)이다. 상기 효소는 가수분해 및 트랜스글리코시다제(transglycosidase) 활성을 모두 가지며, 히알루로난 및 콘드로이틴 술페이트(CS), 일반적으로 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. 상기 타입의 히알루로니다아제는 젖소(소의)(서열번호 10, 11, 64, 203 및 204 및 서열번호 190 내지 192에 기재된 핵산 분자), 양(면양, Ovis aries)(서열번호 26, 27, 63 및 65, 서열번호 66 및 193 내지 194에 기재된 핵산 분자), 돼지(서열번호 20 내지 21), 마우스(서열번호 17 내지 19, 32, 205), 랫트(서열번호 22 내지 24, 31, 206), 토끼(서열번호 25, 207), 오랑우탄(서열번호 28), 사이노몰구스 원숭이(서열번호 29, 202), 기니피그(서열번호 30, 208), 침팬지(서열번호 101, 199, 200), 붉은털 원숭이(서열번호 102, 201), 여우 (서열번호 209 및 210) 및 인간 히알루로니다아제 (서열번호 1 내지 2, 36 내지 39) 유래의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 히알루로니다아제는 PH20 히알루로니다아제를 포함한다. 또한, BH55 히알루로니다아제는 미국 특허번호 제5,747,027호 및 제5,827,721호에 기술된 이러한 타입이다. 본원에서 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 히알루로니다아제의 예는 가용성 히알루로니다아제이다.
포유류 히알루로니다아제는 고환 추출물에서 우세하게 발견되는, 중성 활성인 것들 및 간 등의 기관에서 우세하게 발견되는 산성 활성인 것들로 추가로 하위분류될 수 있다. 예시적인 중성 활성인 히알루로니다아제는 양(서열번호 27, 63 및 65), 소(서열번호 11 및 64) 및 인간(서열번호 1)과 같은 서로 다른 종 유래 PH20을 포함하나 이에 제한되지 않는 PH20을 포함한다. 인간 PH20 (또한 SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20로도 알려짐)은 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커를 통해 원형질막에 부착된다. 이는 정자-난자 부착에 자연적으로 관여하고, 히알루론산을 소화하여 정자의 난구세포 층의 침투를 돕는다.
인간 PH20 (SPAM1로도 지칭됨)이외에도, 5 가지 히알루로니다아제-유사(like) 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 는 가성유전자(pseudogene)이고, HYAL3 (서열번호 38)은 임의의 공지된 기질에 대한 효소 활성을 보유하는 것으로 보이지 않았다. HYAL4 (서열번호 39 에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 콘드로티나아제이고, 히알루로난에 대한 활성은 거의 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호 36에 기재된 전구체 폴리펩티드)은 원형(prototype)의 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 원형의 중성-활성 효소이다. 산성-활성 히알루로니다아제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호 37에 기재된 전구체 폴리펩티드)는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7)에서 촉매 활성이 결여되어 있다. 예를 들어, HYAL1은 pH 4.5를 초과해서는 시험관 내(in vitro)에서 촉매 활성이 거의 없다(Frost 외 (1997) Anal. Biochem . 251:263-269). HYAL2 는 시험관 내에서 매우 낮은 특이적 활성을 가진 산성-활성 효소이다. 히알루로니다아제-유사 효소는 또한, 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 원형질막에 결합되어 있는 것, 예컨대 인간 HYAL2 및 인간 PH20 (Danilkovitch-Miagkova 외 (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), 및 일반적으로 가용성인 것, 예컨대 인간 HYAL1 (Frost 외 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 할 수 있다.
PH20
PH20은 기타 포유류 히알루로니다아제와 마찬가지로, 히알루론산의 β1→4 글리코시드 결합을 여러 길이의 다당류, 예컨대 사탄당 및 육탄당으로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 활성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 술페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S를 분해할 수 있다. PH20은 본래 정자-난자 부착에 관련되고, 히알루론산 소화에 의해, 정자에 의한 난구세포층의 침투를 보조한다. PH20 은 정자 표면 및 리소좀-유도성 첨체에 위치해 있으며, 여기서 내첨체막에 결합되어 있다. 원형질막 PH20은 중성 pH에서만 히알루로니다아제 활성을 갖는 반면, 내첨체막 PH20는 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 갖는다. 히알루로니다아제인 것 뿐 아니라, PH20은 또한 HA-유도성 세포 신호전달에 대한 수용체, 및 난자를 둘러싼 투명층에 대한 수용체인 것으로 나타난다.
전구체 및 이의 성숙형 형태를 포함하는, 예시적인 PH20 단백질은 인간 (서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드, 서열번호 2에 기재된 성숙형 폴리펩티드), 침팬지 (서열번호 101, 199, 200), 붉은털 원숭이 (서열번호 102, 201), 소 (서열번호 11 및 64, 203, 204), 토끼 (서열번호 25, 207), 양 PH20 (서열번호 27, 63 및 65), 사이노몰구스 원숭이 (서열번호 29, 202), 기니피그 (서열번호 30, 208), 랫트 (서열번호 31, 206) 및 마우스 (서열번호 32, 205) 및 여우 (서열번호 209 및 210) PH20 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
소 PH20은 553 개 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호 11) 이다. 소 PH20 와 인간 PH20의 정렬은 오직 약한 상동성만을 보여주는데, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카복시 말단까지에는 다중적인 갭들이 존재한다 (예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin . Drug. Deliv.4: 427-440 참고). 사실, 명백한 GPI 앵커는 인간을 제외한 다수의 기타 PH20 종들에서는 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 생산된 PH20 폴리펩티드는 본래 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20은 원형질막에 매우 느슨하게 결합되어 존재함에도, 이는 포스포리파아제 감수성 앵커를 통해 앵커 고정되어 있지 않다(Lalancette 외 (2001) Biol Reprod . 65(2):628-36). 소 히알루로니다아제의 상기 독특한 특성은 임상 용도를 위한 추출물로서 가용성 소 고환 히알루로니다아제 효소의 이용을 가능하게 한다 (와이다제(Wydase)®, 히알라제(Hyalase)®).
인간 PH20 mRNA 전사물은 일반적으로 번역되어 N-말단에 35 개의 아미노산 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 및 C-말단에 19 개의 아미노산 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 부착 신호 서열 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509)를 포함하는 509개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호 1)를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20은 서열번호 2에 기재된 474 아미노산 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 ER로의 수송 및 신호 펩티드의 제거 후, C-말단 GPI-부착 신호 펩티드는 절단되어, 서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 490에 상응하는 아미노산 위치에서 새롭게 형성된 C-말단 아미노산에 대한 GPI 앵커의 공유결합성 부착을 촉진한다. 따라서, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 GPI-앵커 고정된(anchored) 성숙형 폴리펩티드가 생산된다.
인간 PH20은 중성 및 산성 pH의 모두에서 히알루로니다아제 활성을 나타낸다. 일 측면에서, 인간 PH20은 일반적으로 GPI 앵커를 통해 원형질막에 고정되어 있는 원형의 중성-활성 히알루로니다아제이다. 또 다른 측면에서, PH20은 중성 및 산성 pH에서 히알루로니다아제 활성을 갖는 내첨체막 상에 발현된다. PH20가 폴리펩티드의 서로 떨어진 영역에 2 개의 촉매 부위를 포함하는 것으로 보인다: 펩티드 1 및 펩티드 3 영역(Cherr 외, (2001) Matrix Biology 20:515-525). 증거는, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 107 내지 137 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 142 내지 172에 상응하는 PH20의, 펩티드 1 영역이 중성 pH에서의 효소 활성에 필요하다는 것을 나타낸다. 상기 영역 내 위치 111 및 113의 아미노산(서열번호 2에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 상응)은 활성에 중요한 것으로 나타나는데, 이는 그의 아미노산 대체에 의한 돌연변이가, 야생형 PH20에 비해, 각각 3% 히알루로니다아제 활성을 갖거나 히알루로니다아제 활성이 검출되지 않는 PH20 폴리펩티드를 초래한다 (Arming 외, (1997) Eur . J. Biochem. 247:810-814).
상기 펩티드 3 영역은, 서열번호 2 에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 아미노산 위치 242 내지 262, 및 서열번호 1 에 기재된 전구체 폴리펩티드의 위치 277 내지 297에 상응하는데, 산성 pH 에서의 효소 활성에 중요한 것으로 보인다. 상기 영역 내에서, 성숙형 PH20 폴리펩티드의 위치 249 및 252에서의 아미노산은 활성에 핵심적인 것으로 보이고, 이들 중 하나에서라도 돌연변이가 발생하면 활성이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 초래한다(Arming 외, (1997) Eur . J. Biochem . 247:810-814).
촉매 부위에 부가하여, PH20은 또한 히알루로난-결합 부위를 포함한다. 실험적인 증거는, 상기 부위가 펩티드 2 영역에 위치하고 있음을 나타내며, 이는 서열번호 1에 기재된 전구체 폴리펩티드의 아미노산 위치 205 내지 235 및, 서열번호 2에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 위치 170 내지 200 에 상응한다. 상기 영역은 히알루로니다아제 중에 고도로 보존성이고, 헤파린 결합 모티프와 유사하다. 위치 176 (서열번호 2에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드에 상응)에서의 아르기닌 잔기의 글리신으로의 돌연변이는, 야생형 폴리펩티드의 히알루로니다아제 활성이 오직 약 1% 만 있는 폴리펩티드를 초래한다(Arming 외, (1997) Eur . J. Biochem. 247:810-814).
서열번호 1 로 예시되는 인간 PH20의 폴리펩티드의 N82, N166, N235, N254, N368, N393 및 S490에는 N- 및 O- 결합된(linked) 글리코실화 부위를 포함하는 7 개의 잠재적인 글리코실화 부위가 있다. 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464는 최소 활성인 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 포함하는 것으로 나타나기 때문에, 상기 S490에 글리코실화 부위는 적절한 히알루로니다아제 활성에 필요하지 않다. 인간 PH20에는 6 개의 이황화 결합이 있다. 서열번호 1로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C60 과 C351 사이, 및 C224 과 C238 사이에 2 개의 이황화 결합이 있다 (각각, 서열번호 2에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C25 및 C316, 및 C189 및 C203 에 상응함). 서열번호 1로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376 과 C387 사이; C381 과 C435 사이; C437 과 C443 사이; 및 C458 과 C464 사이에는 추가로 4 개의 이황화 결합이 형성된다 (각각, 서열번호 2에 기재된 성숙형 폴리펩티드의 잔기 C341 및 C352; C346 과 C400 사이; C402 과 C408 사이; 및, C423 과 C429 사이에 상응함).
(b) 박테리아 히알루로니다아제
박테리아 히알루로니다아제(EC 4.2.2.1 또는 EC 4.2.99.1)는 히알루로난 및 다양한 정도로 콘드로이틴 술페이트 및 데르마탄 술페이트를 분해한다. 박테리아에서 분리된 히알루로난 리아제는 작용방식에 의해 히알루로니다아제(기타 출처 유래, 예를 들어, 히알루로노글루코사미니다제(hyaluronoglucosamimdase), EC 3.2.1.35)와 다르다. 이들은 히알루로난 내의 N-아세틸-베타-D-글루코사민(N-acetyl-beta-D-glucosamine)과 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 잔기 사이의 β1→4-글리코시드결합의, 가수분해보다는, 제거반응을 촉매하여, 3-(4-데옥시-β-D-글루크-4-에누로노실)-N-아세틸-D-글루코사민(3-(4-deoxy-P-D-gluc-4-enuronosyl)- N-acetyl-D-glucosamine) 사당류- 및 육당류, 및 이당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-N-아세틸헥소사미니다제(endo-β-N-acetylhexosaminidase)이다. 상기 반응으로 이들의 비환원 말단에서 불포화 헥수론산(hexuronic acid) 잔기를 가지는 올리고당이 형성된다.
제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 박테리아 유래 히알루로니다아제의 예는 아르쓰로박터(Arthrobacter), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 클로스트리듐(Clostridium), 마이크로코커스(Micrococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 펩토코커스(Peptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 박테로이드(Bacteroides) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)의 균주를 포함한, 미생물 내 히알루로난 분해효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균주 및 효소의 특정 예는 아르쓰로박터속(Arthrobacter sp .)(균주 FB24)(서열번호 67), 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus)(서열번호 68), 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)(서열번호 69), 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)(서열번호 70); 18RS21(서열번호 71); 혈청형 Ia(서열번호 72); 혈청형 Ⅲ(서열번호 73), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(균주 COL(서열번호 74); 균주 MRSA252(서열번호 75 및 76); 균주 MSSA476(서열번호 77); 균주 NCTC 8325(서열번호 78); 균주 소(bovine) RF122(서열번호 79 및 80); 및 균주 USA300(서열번호 81), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(서열번호 82); 균주 ATCC BAA-255/R6(서열번호 83); 및 혈청형 2, 균주 D39/NCTC 7466(서열번호 84), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(혈청형 M1)(서열번호 85); 혈청형 M2, 균주 MGAS10270(서열번호 86); 혈청형 M4, 균주 MGAS10750(서열번호 87); 혈청형 M6(서열번호 88); 혈청형 M12, 균주 MGAS2096(서열번호 89 및 90); 혈청형 M12, 균주 MGAS9429(서열번호 91); 혈청형 M28(서열번호 92); 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(서열번호 93 내지 95); 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri)(균주 ATCC 700601/ES114(서열번호 96)), 및 히알루론산에 특이적이고 콘드로이틴 또는 콘드로이틴 술페이트를 절단하지 않는, 스트렙토마이세스 히알루로노리티쿠스(Streptomyces hyaluronolyticus) 히알루로니다아제 효소(Ohya, T. 및 Kaneko, Y.(1970) Biochim . Biophys . Acta 198:607)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
(c) 거머리류, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제
거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래 히알루로니다아제(EC 3.2.1.36)는 사당류 - 및 육당류 최종산물을 생성하는 엔도-β-글루쿠로니다아제이다. 상기 효소는 히알루로네이트 내 β-D-글루쿠로네이트와 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 사이에 1→3-결합의 가수분해를 촉매한다. 거머리로부터 유래 히알루로니다아제의 예는 거머리과(Hirudinidae)(예를 들어, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis)), 돌거머리과(Erpobdellidae)(예를 들어, 네펠롭시스 옵스쿠라(Nephelopsis obscura) 및 에르포브델라 펀타타(Erpobdella punctata)), 넙적거머리과(Glossiphoniidae)(예를 들어, 데쎄로브델라 픽타(Desserobdella picta), 헤로브델라 스타그날리스(Helobdella stagnalis), 그로씨포니아 콤플란타(Glossiphonia complanata), 플라코브델라 오르나타(Placobdella ornata) 및 테로마이존속(Theromyzon sp .)) 및 말거머리과(Haemopidae)(해모피스 마르모라타(Haemopis marmorata))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 (Hovingh 외(1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26). 거머리 히알루로니다아제와 동일한 작용기전을 가지는 박테리아 유래 히알루로니다아제의 예는 시아노박테리아(cyanobacteria), 시네코코커스속(Synechococcus sp.)의 히알루로니다아제(균주RCC307, 서열번호 97)이다.
ii. 기타 히알루로난 분해 효소
히알루로니다아제 패밀리 뿐만 아니라 다른 히알루로난 분해효소가 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 콘드로이티나아제 및 리아제를 포함한, 히알루로난 절단능을 가지는 효소가 이용될 수 있다. 히알루로난을 분해할 수 있는 콘드로이티나아제의 예는 콘드로이틴 ABC 리아제 (또한 콘드로이티나아제 ABC로서 알려짐), 콘드로이틴 AC 리아제(또한 콘드로이틴 술페이트 리아제 또는 콘드로이틴 술페이트 엘리미나제로서 알려짐) 및 콘드로이틴 C 리아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제공되는 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 상기 효소의 생산 및 정제 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허번호 제6,054,569호; Yamagata 외 (1968) J. Biol . Chem . 243(7):1523-1535; Yang 외 (1985) J. Biol . Chem . 160(30):1849-1857).
콘드로이틴 ABC 리아제는 두 개의 효소, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제(EC 4.2.2.20) 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제(EC 4.2.2.21)를 포함하고(Hamai 외(1997) J Biol Chem. 272(14):9123-30), 이들은 콘드로이틴-술페이트 및 데르마탄-술페이트 타입의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해한다. 콘드로이틴 술페이트, 콘드로이틴-술페이트 프로테오글리칸 및 데르마탄 술페이트는 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제의 바람직한 기질이나, 상기 효소는 또한 더 낮은 비율로 히알루로난에 작용할 수도 있다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제는 콘드로이틴-술페이트- 및 데르마탄-술페이트 타입의 다양한 글리코사미노글리칸을 분해하여, 궁극적으로 Δ4-불포화 사당류- 및 이당류로 분해되는 다른 크기의 Δ4-불포화 올리고당의 혼합물을 생성한다. 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제는 동일한 기질특이성을 가지나, 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제에 의해 생성된 폴리머 콘드로이틴-술페이트 및 이들의 올리고당 단편의 둘 다의 비-환원 말단으로부터 이당류 잔기를 제거한다(Hamai, A. 외 (1997) J. Biol . Chem . 272:9123-9130). 콘드로이틴-술페이트-ABC 엔도리아제 및 콘드로이틴-술페이트-ABC 엑소리아제의 예는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 및 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(프로테우스 불가리스 술페이트-콘드로이틴-ABC 엔도리아제는 서열번호 98에 기재되어 있음(Sato 외 (1994) Appl . Microbiol . Biotechnol. 41(1):39-46).
콘드로이틴 AC 리아제(EC 4.2.2.5)는 콘드로이틴 술페이트 A 및 C, 콘드로이틴 및 히알루론산에 대해 활성이나, 데르마탄 술페이트(콘드로이틴 술페이트 B)에 대해 불활성이다. 박테리아 유래 콘드로이티나아제 AC 효소의 예는 서열번호 99 및 100에 각각 기재된, 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum) 및 빅티발리스 바덴시스(Victivallis vadensis), 및 아르쓰로박터 이리시스(Arthrobacter aurescens) 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Tkalec 외 (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst 외 (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
콘드로이티나아제 C 는 콘드로이틴 술페이트 C를 절단하여, 사당류와 불포화 6-황산화 이당류(delta Di-6S)를 생성한다. 이는 또한 히알루론산을 절단하여 불포화 비-황산화 이당류(delta Di-OS)를 생성한다. 박테리아의 콘드로이티나아제 C 효소의 예는 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 플라보박테리움(Flavobacterium)의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Hibi 외 (1989) FEMS - Microbiol - Lett . 48(2):121-4; Michelacci 외 (1976) J. Biol . Chem . 251:1154-8; Tsuda 외 (1999) Eur. J. Biochem . 262:127-133).
iii. 가용성 히알루로난 분해 효소
가용성 히알루로니다아제를 포함한, 가용성 히알루로난 분해효소가 본원의 상기 조성물, 조합물 또는 방법에서 제공된다. 가용성 히알루로난 분해효소는 발현시 세포(예를 들어, CHO 세포)로부터 분비되고 가용성 형태로 존재하는 임의의 히알루로난 분해 효소를 포함한다. 상기 효소들은, 비-인간 동물 가용성 히알루로니다아제, 박테리아 가용성 히알루로니다아제 및 인간 히알루로니다아제, Hyal1, 소의 PH20 및 양의 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 다른 변이체를 포함한 비-인간 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 가용성 히알루로니다아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 가용성 히알루로난 분해효소 중에서, 예를 들어, 가용성으로 변형된 임의의 히알루로난 분해효소가 포함된다. 예를 들어, GPI 앵커를 포함하는 히알루로난 분해효소는 GPI 앵커의 모두 또는 일부를 말단절단(truncation) 및 제거에 의해 가용성으로 만들어질 수 있다. 일 예에서, GPI 앵커를 통해 정상적으로 막에 앵커 고정된, 인간 히알루로니다아제 PH20은 C-말단에서 GPI 앵커의 모두 또는 일부의 말단절단(truncation) 및 제거에 의해 가용성으로 만들어질 수 있다.
가용성 히알루로난 분해효소는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제를 포함한다. 투여 후 효소 활성의 원하는 수준 및/또는 투여부위와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 요인들에 좌우되어, 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제가 선택될 수 있다. 특정 예에서, 본원의 상기 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위한 히알루로난 분해 효소는 가용성 중성 활성인 히알루로니다아제이다.
예시적인 히알루로니다아제는 임의의 종 유래 PH20의 가용성 형태, 예컨대 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29 내지 32, 63 내지 65, 101 내지 102 및 199 내지 210 중 어느 하나의 PH20의 가용성 형태를 포함한다. 히알루로니다아제가 가용성이고 (발현시 분비됨) 히알루로니다아제 활성을 유지하는 한, 상기 가용성 형태는 C-말단 GPI 앵커의 모두 또는 일부가 결실된 이의 말단절단된 형태를 포함한다. 상기 형태는 또한 전형적으로 세포에서 발현될 때, 신호 펩티드가 결실된 성숙형 형태이다. 가용성 히알루로니다아제 중에는 히알루로니다아제 활성을 나타내는, 서열번호 l, 2, 11, 25, 27, 29 내지 32, 63 내지 65, 101 내지 102 및 199 내지 210에 기재된 어느 하나의 종, 또는 이의 말단절단된 형태로부터 유래한 어느 하나의 PH20의 변이체의 가용성 형태가 또한 포함된다. 변이체는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29 내지 32, 63 내지 65, 101 내지 102 및 199 내지 210 중 어느 하나, 이의 성숙형(예를 들어, 신호 서열이 결실된) 또는 말단절단된 형태이다. 변이체는 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29 내지 32, 63 내지 65, 101 내지 102 및 199 내지 210 중 어느 하나, 이의 성숙형(예를 들어, 신호 서열이 결실된) 또는 말단절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 아미노산 변이체는 보존적 및 비-보존적 돌연변이를 포함한다. 히알루로니다아제의 활성을 위하여 중요하거나, 그렇지 않으면 요구되는 잔기들, 예컨대 상기 기재되거나 당해 기술분야에 공지된 임의의 것들이 일반적으로 불변이며, 변형될 수 없는 것으로 이해된다. 이들은 예를 들면 활성 부위 잔기들을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 인간 PH20 폴리펩티드, 또는 이의 가용성 형태의 아미노산 잔기 111, 113 및 176 (서열번호 2에 기재된 성숙형 PH20 폴리펩티드 내 잔기들에 상응)이 일반적으로 불변이고, 변경되지 않는다. 적절한 접힘(folding)을 위하여 필요한 이황화 결합의 형성 및 글리코실화를 제공하는 기타 잔기들이 또한 불변일 수 있다.
일부 예에서, 가용성 히알루로난 분해효소는 일반적으로 GPI-앵커 고정되어있고 (예컨대, 예를 들어, 인간 PH20) C 말단에 말단절단에 의해 가용성을 제공한다. 상기 말단절단은 GPI 앵커 부착 신호 서열의 모두를 제거하거나 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부만을 제거할 수 있다. 그러나 생성된 폴리펩티드는 가용성을 갖는다. 가용성 히알루로난 분해효소가 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 예에서, 폴리펩티드가 가용성이면 GPI 앵커 부착 신호 서열내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 유지할 수 있다. GPI 앵커의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 연장된 가용성 히알루로난 분해효소라고 한다. 당업자는 폴리펩티드가 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용한 GPI-앵커 고정된 것인지를 측정할 수 있다. 상기 방법은 공지의 알고리즘을 사용하여 GPI-앵커 부착 신호 서열 및 ω-부위의 존재 및 위치를 예상하고 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC) 또는 D(PI-PLD)로 소화 전 및 후의 가용성 분석을 실시하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
연장된 가용성 히알루로난 분해효소는 임의의 자연적 GPI-앵커 고정된 히알루로난 분해 효소에 C-말단 말단절단에 의해 생성될 수 있고, 생성된 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들어, 미국 출원 공개번호 US20100143457호 참조). C-말단 말단절단되지만 GPI 앵커 부착 신호 서열의 일부를 유지하는 예시적인 연장된 가용성 히알루로난 분해 효소는 영장류 기원인 연장된 가용성 PH20 (esPH20) 폴리펩티드, 예컨대, 예를 들어, 인간 및 침팬지 esPH20 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, esPH20 폴리펩티드는 이의 활성 단편을 포함하는, 서열번호 1, 2, 50, 51 또는 101에 기재된 성숙형 또는 전구체 폴리펩티드, 또는 이의 변이체의 임의의 C-말단 말단절단에 의해 만들어질 수 있는데, 상기 생성된 폴리펩티드는 가용성이고 GPI-앵커 부착 신호 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 유지한다. 변이체는 히알루로니다아제 활성을 유지하는 서열번호 1, 2, 50, 51 또는 101 중 어느 하나와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 생성된 esPH20 폴리펩티드가 가용성이고 GPI 앵커 부착 신호 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 유지하면, 본원에서 제공되는 상기 esPH20 폴리펩티드는 야생형 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1, 2, 50, 51 또는 101에 기재된 서열을 가진 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산에 의해 C-말단 말단절단될 수 있다.
전형적으로, 본원의 조성물, 조합물 및 방법에서 사용을 위하여, 가용성 인간 히알루로난 분해효소, 예컨대 가용성 인간 PH20이 사용된다. 다른 동물 유래 히알루로난 분해효소, 예컨대 PH20이 이용될 수 있으나, 상기 제제는 동물 단백질이므로, 잠재적으로 면역원성이 있다. 예를 들어, 현저한 비율의 환자가 사전에 섭취된 음식물에 대해 이차적인 감작(sensitization)을 보여주고, 이들은 동물 단백질이기 때문에, 모든 환자는 차후에 감작의 위험을 가진다. 따라서, 비-인간 제제는 만성적인 사용에 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제를 원한다면, 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 가지도록 제조될 수 있음이 본원에서 고려된다. 상기 변형은 당업자의 수준내에 있으며, 예를 들어 분자에서 하나 또는 그 이상의 항원성 에피토프의 제거 및/또는 대체를 포함할 수 있다.
본원의 방법에서 사용된, 히알루로니다아제(예를 들면, PH20)를 포함한, 히알루로난 분해효소는 재조합적으로 생산되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 출처로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. 재조합 히알루로난 분해효소를 포함한, 재조합 단백질의 생산방법이 본원의 다른 곳에서 제공되며, 당업자에게 널리 공지되어 있다.
(a) 가용성 인간 PH20
예시적인 가용성 히알루로니다아제는 가용성 인간 PH20이다. 재조합 인간 PH20의 가용성 형태가 생산되어 왔고 본원에 기재된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 상기 PH20의 가용성 형태의 생산은 미국 출원 공개번호 US20040268425호; US20050260186호, US20060104968호, US20100143457 및 국제 출원 공개번호 WO2009111066호에 기재되어 있다. 예를 들어, 가용성 PH20 폴리펩티드는 C-말단 말단절단된 변이체 폴리펩티드를 포함하고 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1 또는 2에 포함된 아미노산 서열과 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 서열 동일성을 갖고, 히알루로니다아제 활성을 유지하고 가용성이다. 상기 폴리펩티드 중에, GPI-앵커 부착 신호 서열의 전부 또는 일부가 완전히 결실된 가용성 PH20 폴리펩티드가 포함되어 있다.
또한, GPI 앵커의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 연장된 가용성 PH20 (esPH20) 폴리펩티드가 포함되어 있다. 따라서, ER 내에 단백질의 C-말단에 GPI 앵커가 공유결합 부착되고 원형질막의 세포외 소엽(leaflet)에 앵커 고정되는 것 대신에, 상기 폴리펩티드는 분비되고 가용성을 갖는다. C-말단 말단절단된 PH20 폴리펩티드는 전장의 야생형 폴리펩티드, 예컨대 서열번호 1 또는 2에 기재된 서열을 갖는 전장의 야생형 폴리펩티드, 또는 대립형질 변이체 또는 종변이체 또는 다른 변이체에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 그 이상의 아미노산이 C-말단 말단절단될 수 있다.
예를 들어, 가용성 형태는 서열번호 1에 기재된 아미노산의 서열의 C-말단의 아미노산 잔기 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 또는 500을 가지는, 서열번호 1에 기재된 인간 PH20의 C-말단 말단절단된 폴리펩티드, 또는 이와 적어도 85%의 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 PH20의 가용성 형태는 일반적으로 서열번호 1에 기재된 아미노산 36 내지 464를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 포유류 세포 내에서 발현되면, 상기 35 아미노산 N-말단 신호 서열은 프로세싱 중에 절단되고, 성숙형 형태의 단백질이 분비된다. 따라서, 그 성숙형 가용성 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열의 아미노산 36 내지 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 및 483을 포함한다. 표 3은 C-말단 말단절단된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하는, 예시적인 C-말단 말단절단된 PH20 폴리펩티드의 비제한적 예를 제공한다. 하기 표 3에서 전구체 및 성숙형 폴리펩티드의 길이(아미노산 내) 및 C-말단 말단절단된 PH20 단백질의 전구체 및 성숙형 폴리펩티드의 예시적인 아미노산 서열이 기재된 서열 식별기호(서열번호)가 제공된다. 또한, 비교를 위해 야생형 PH20 폴리펩티드도 표 3에 포함된다. 특히, 가용성 히알루로니다아제의 예는 442, 443, 444, 445, 446 또는 447개 아미노산 길이의, 예컨대 서열번호 4 내지 9에 기재된, 가용성 인간 PH20 폴리펩티드, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 종 변이체 또는 이의 기타 변이체이다.
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예를 들어, PH20의 가용성 형태는, 예를 들어, 서열번호 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189, 또는 서열번호 4-9, 47, 48, 150-170, 183-189에 대하여 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내고 히알루로니다아제 활성을 유지하는 임의의 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
글리코실화가 히알루로니다아제의 촉매적 활성 및 안정성을 위해 중요하기 때문에, 일반적으로 PH20의 가용성 형태는 정확한 N-글리코실화를 용이하게 하는 단백질 발현 시스템을 사용하여 생산된다. 이러한 세포는, 예를 들어 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포(예컨대 DG44 CHO 세포)를 포함한다.
(b) rHuPH20
인간 PH20의 재조합 가용성 형태가 생성되고, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및 방법에서 사용될 수 있다. 상기 재조합 인간 PH20의 가용성 형태의 생성은 미국 특허출원 공개번호 US20040268425호; US20050260186호 US20060104968호; US201143457호 및 국제 PCT 출원번호 WO2009111066호에 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드의 예는 (서열번호 3에 기재된) 아미노산 1 내지 482를 암호화하는 핵산분자의 발현에 의해 생성되는 것들이다. 이러한 예시적인 핵산 분자는 서열번호 49에 기재되어 있다. 번역 후 가공은 35 아미노산 신호 서열을 제거하고 447 아미노산 가용성 재조합 인간 PH20(서열번호 4)를 남긴다. 배양배지에서 생산되기 때문에, C-말단에서 불균질성(heterogeneity)이 있으며, 따라서 rHuPH20으로 불리는 산물은 다양하고 풍부하게 서열번호 4-9 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있는 종의 혼합물을 포함한다. 전형적으로, rHuPH20은 활성을 유지하기 위해 정확한 N-글리코실화를 용이하케 하는 세포, 예를 들면 CHO 세포(예를 들면 DG44 CHO 세포)내에서 생성된다.
ⅳ. 히알루로난 분해 효소의 글리코실화
촉매활성 및 안정성을 위해, 히알루로니다아제를 포함하는 일부의 히알루로난 분해 효소의 N-결합 및 O-결합 글리코실화를 포함하는 글리코실화가 중요할 수 있다. 당단백질의 글리칸의 변형의 유형을 변경하는 것이 단백질의 항원성, 구조적 접힘, 가용성 및 안정성에 대한 현저한 효과를 가지는 반면, 대부분의 효소는 최적의 효소활성을 위해 글리코실화가 필요하다고 생각되지 않는다. 일부 히알루로니다아제에 대해, N-결합 글리코실화를 제거하여 히알루로니다아제 활성의 거의 완전한 불활화를 일으킬 수 있다. 따라서, 이러한 히알루로니다아제에 대해, 활성 효소를 생성하기 위해 N-결합 글리칸의 존재가 중요하다.
N-결합 올리고당류는 여러 주요한 유형(올리고만노스(oligomannose), 복합(complex), 혼성(hybrid), 술페가트 형태(sulfated))로 분류되고, 모두 Asn-Xaa-Thr/Ser 서열(여기서 Xaa는 Pro가 아니다)내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 부착된 (Man)3-GlcNAc-GlcNAc 핵삼(core)을 갖는다. Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화가 응고단백질 C에 대해 보고되었다. 일부 예에서, 히알루로니다아제와 같은 히알루로난 분해 효소는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PH20은 O-결합 올리고당류 뿐만 아니라 N-결합 올리고당류를 갖는다. 서열번호 1에서 예시된 인간 PH20의 N82, N166, N235, N254, N368, N393에서 6개의 잠재 N-결합 글리코실화 부위가 있다. 아미노산 잔기 N82, N166 및 N254가 복합 유형 글리칸에 의해 채워지는 반면, 아미노산 잔기 N368 및 N393은 고 만노스(high mannose) 유형 글리칸에 의해 채워진다. 아미노산 잔기 N235는 대략 80% 고 만노스 유형 글리칸 및 20% 복합 유형 글리칸에 의해 채워진다. 상기 기재된 바와 같이, 히알루로니다아제 활성을 위해서 S490에서 O-결합 글리코실화가 필요하지 않다.
일부 예에서, 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해 효소는 글리코실화 부위의 하나 또는 전부에서 글리코실화된다. 예를 들면, 인간 PH20 또는 이의 가용성 형태에 대해, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368 및 N393에 상응하는 2, 3, 4, 5 또는 6의 N-글리코실화 부위가 글리코실화된다. 일부 예에서, 히알루로난 분해 효소는 하나 이상의 천연 글리코실화 부위에서 글리코실화된다. 다른 예에서, 히알루로난 분해 효소는 하나 이상의 비천연 글리코실화 부위에서 변형되어 하나 이상의 부가적인 부위에서 폴리펩티드의 글리코실화를 제공한다. 이러한 예에서, 부가적인 당 모이어티의 부착은 개선된 반감기 및/또는 개선된 활성과 같은 분자의 약동학 특성을 향상시킬 수 있다.
다른 예에서, 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용하기 위한 히알루로난 분해 효소는 부분적으로 탈글리코실화(또는 N-부분적 글리코실화 폴리펩티드)된다. 예를 들면, 부분적 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 히알루로니다아제의 히알루로니다아제 활성의 전부 또는 일부를 유지하고 본원에서 제공된 조성물, 조합물 및/또는 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 부분적 탈글리코실화 히알루로니다아제는 임의의 종으로부터 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드의 가용성 형태, 예를 들면 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 및 199-210에 기재된 것 또는 이의 대립형질 변이체, 말단절단된 변이체, 또는 다른 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 당업자에게 공지되어 있고 서열번호 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, 101-102 및 199-210의 어느 하나 또는 그 말단절단된 형태와 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 제공된 부분적 탈글리코실화 히알루로니다아제는 혼성, 융합 및 키메릭 부분적 탈글리코실화 히알루로니다아제 및 부분적 탈글리코실화 히알루로니다아제 컨주게이트를 포함한다.
글리코시다제 또는 글리코시드 하이드롤라제(hydrolase)는 글리코시드 결합의 가수분해를 촉매작용하여 2개의 더 작은 당을 생성하는 효소이다. 척추동물에서 N-글리칸의 주요한 형태는 고 만노스 글리칸, 혼성 글리칸 및 복합 글리칸을 포함한다. 고 만노스 글리칸, 혼성형 글리칸을 절단하는 EndoF1; 2분기(biantennary) 복합형 글리칸을 절단하는 EndoF2; 2분기 이상의 분지쇄 복합 글리칸을 절단하는 EndoF3; 및 고 만노스 글리칸 및 혼성형 글리칸을 절단하는 EndoH를 포함하는 부분적인 단백질 탈글리코실화만 일으키는 여러개의 글리코시다제가 있다. 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 가용성 히알루로니다아제, 예를 들면 가용성 PH20의 하나 또는 모든 글리코시다제로의 처리는 부분적인 탈글리코실화만을 일으키고, 따라서 히알루로니다아제 활성이 유지될 수 있다.
부분적 탈글리코실화 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 부분적 탈글리코실화 가용성 히알루로니다아제는 하나 이상의 글리코시다제, 일반적으로 모든 N-글리칸을 제거하지 않고 부분적으로 단백질을 탈글리코실화하는 글리코시다제로의 소화에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, PH20(예를 들면, rHuPH20라고 명명되는 재조합 PH20)의 상기 글리코시다제(예를 들면, EndoF1, EndoF2 및/또는 EndoF3)의 하나 또는 전부로의 처리는 부분적 탈글리코실화를 일으킨다. 이러한 부분적 탈글리코실화 PH20 폴리펩티드는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드에 필적하는 히알루로니다아제 효소 활성을 나타낼 수 있다. 반면, PH20을 모든 N-글리칸을 절단하는 글리코시다제인 PNGaseF로의 처리에 의해 모든 N-글리칸을 완전히 제거하여 PH20 효소적인 비활성을 제공할 수 있다. 따라서, 모든 N-결합 글리코실화 부위 (예를 들면, 서열번호 1에서 예시된 인간 PH20의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393에서의 것)가 글리코실화될 수 있지만, 하나 이상의 글리코시다제로의 처리는 하나 이상의 글리코시다제에 의해 소화되지 않은 히알루로니다아제에 비해 감소된 글리코실화의 정도를 제공할 수 있다.
부분적으로 탈글리코실화된 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함한 부분적 탈글리코실화 히알루로난 분해 효소는 완전히 글리코실화된 폴리펩티드의 글리코실화 수준의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%를 가질 수 있다. 일 예에서, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393에 상응하는 N-글리코실화 부위의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6은 부분적으로 탈글리코실화되어, 더 이상 고 만노스 또는 복합 유형 글리칸을 포함하지 않고, 오히려 적어도 하나의 N-아세틸글루코사민 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166 및 N254에 상응하는 N-글리코실화 부위의 1, 2 또는 3은 탈글리코실화되는데, 즉 이들은 당 모이어티를 포함하지 않는다. 다른 예에서, 서열번호 1의 아미노산 N82, N166, N235, N254, N368, 및 N393에 상응하는 N-글리코실화 부위의 3, 4, 5 또는 6은 글리코실화된다. 글리코실화된 아미노산 잔기는 최소한 하나의 N-아세틸글루코사민 모이어티를 포함한다. 전형적으로, 부분적 탈글리코실화 가용성 PH20 폴리펩티드를 포함하여,부분적 탈글리코실화 히알루로난 분해 효소는, 완전히 글리코실화된 폴리펩티드에 의해 나타나는 히알루로니다아제 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 또는 그 이상인 히알루로니다아제 활성을 나타낸다.
ν. 변형된 ( 폴리머 - 컨주게이션된 (polymer-conjugated)) 히알루 로난 분해 효소
폴리머 분자, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG화 모이어티(PEG))이 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 히알루로니다아제와의 공유결합 또는 다른 안정한 결합(컨주게이션)은 야기되는 히알루로난 분해 효소-폴리머 조성물에 유익한 성질을 부여한다. 이러한 성질은 개선된 생체적합성, 대상체내의 혈액, 세포 및/또는 다른 조직내에서의 단백질(및 효소활성) 반감기의 연장, 프로테아제 및 가수분해로부터 단백질의 효율적인 차폐(shielding), 개선된 생체내분포, 개선된 약동학 및/또는 약력학 및 증가된 수용성을 포함한다.
히알루로난 분해 효소, 예를 들면 히알루로니다아제에 컨주게이션될 수 있는 폴리머로는 천연 및 합성 호모폴리머(homopolymer), 예를 들면 폴리올(즉, poly-OH), 폴리아민(즉, poly-NH2) 및 폴리카복실산(즉, poly-COOH), 및 추가의 헤테로폴리머(heteropolymer), 즉 하나 이상의 다른 커플링기, 예를 들면 하이드록실기 및 아민기를 포함하는 폴리머를 포함한다. 적합한 폴리머 분자의 예는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카보닐이미다졸(CDI-PEG) 분지 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카복실레이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리(에틸렌이민)(PEI), 선형 폴리아미도아민, 폴리아크릴아미드(PAAm), 폴리디메틸 아크릴아미드(PDAAm), 폴리디메틸 아크릴아미드(PDAAm), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-co-말레산 무수물, 폴리스티렌-co-말레산 무수물, 카복시메틸-키토산, 덱스트린, 덱스트란을 포함하는 덱스트란, 헤파린, 동종 알부민, 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 카복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산 가수분해산물, 전분, 예를 들면 하이드록시에틸 전분 및 하이드록시프로필 전분, 글리코겐, 아가로스 및 그 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 잔탄검, 카라기난, 펙틴, 알기닌산 가수분해물 및 생폴리머를 포함한다.
전형적으로, 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), 예를 들면 폴리에틸렌 옥사이드, 예를 들면 PEG, 전형적으로 mPEG이고 이것은 덱스트란 및 풀루란과 같은 다당류에 비해 가교결합할 수 있는 반응성기를 거의 갖고 있지 않다. 전형적으로, 폴리머는 비독성 폴리머 분자, 예를 들면 (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이고, 이것은 상대적으로 단순화학을 이용하여 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 히알루로니다아제(예를 들면 단백질 표면에 부착된 기에 대한)에 공유적으로 컨주게이션될 수 있다.
치료제의 PEG화는 단백질 분해에 대한 저항을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것에 대해 보고되어 있다. PEG화 방법론의 예는 당업계에 알려져 있다(예를 들면, Lu and Felix, Int . J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 140-6, 1993 ; Felix 외, Int . J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar 외, J. Biol . Chem ., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 외, J Immunol ., 154: 3088-95, 1995 참조; Caliceti 외. (2003) Adv . DrugDeliv . Rev. 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-SS) 참조). PEG화는 생체내 핵산분자의 전달에 사용될 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스의 PEG화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (예를 들면, Cheng 외. (2003) Pharm . Res. 20(9): 1444-51 참조).
히알루로니다아제를 포함한 히알루로난 분해 효소에 부착하기 위한 적합한 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG 유도체, 예를 들면 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지형 PEGs 및 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다(Roberts 외, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar 외, J. Pharm . Pharmaceut. Sci ., 3(1):125-136, 2000; Harris(2003), Nature Reviews Drug Discovery 2:214-225; 및 Tsubery(2004), J Biol . Chem 279(37):38118-24 참조). 폴리머 분자는 전형적으로 약 3kDa 내지 약 60kDa의 범위의 분자량의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질, 예컨대 히알루로니다아제, 예를 들면 PH20에 컨주게이션된 폴리머 분자는 약 5 내지 60 kDa의 분자량 예컨대 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 갖는다.
PEG화 가용성 히알루로난 분해 효소
본원에서 방법, 조성물 및 조합물에서 사용된 히알루로난 분해 효소는 PEG화 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 PEG화 가용성 히알루로난 분해 효소일 수 있다. 일 예에서, 이는 PEG화 가용성 히알루로니다아제, 예를 들면 PEG화 PH20이다. PEG 또는 PEG 유도체를 공유적으로 부착(컨주게이션)함으로써 폴리펩티드를 변형하는 다양한 방법(즉, "PEG화")이 당업계에 알려져 있다 (예를 들면, US 2006/0104968호; US5,672,662호; US6,737,505호; 및 US2004/0235734호 참조). PEG화하는 기술은 특별한 링커 및 커플링 화학(Roberts 외, Adv . Drug Deliv . Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 컨주게이션부위에 복수의 PEG 모이어티의 부착(예컨대 분지 PEG를 사용함으로써; 예컨대 Guiotto 외, Bioorg . Med . Chem . Lett . 12:177-180, 2002 참조), 부위 특이적 PEG화 및/또는 모노PEG화(Chapman 외, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조) 및 위치 지정 효소 PEG화(예를 들면, Sato, Adv . Drug Deliv . Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 당업계에 기술된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10초과의 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예컨대 US2006/0104968호 참조).
PEG화용 수많은 시약은 당업계에 기술되어 있다. 이러한 시약은 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 활성화 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-하이드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카복시메틸 3-하이드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 하이드라지드, p-니트로페닐 카보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지형 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 디설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 외, Bioconjugate Chem . 6:62-69, 1995; Veronese 외, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S.5,672,662호; U.S.5,932,462호; U.S.6,495,659호; U.S.6,737,505호; U.S.4,002,531호; U.S.4,179,337호; U.S.5,122,614호; U.S.5,324,844호; U.S.5,446,090호; U.S.5,612,460호; U.S.5,643,575호; U.S.5,766,581호; U.S.5,795,569호; U.S.5,808,096호; U.S.5,900,461호; U.S.5,919,455호; U.S.5,985,263호; U.S.5,990,237호; U.S.6,113,906호; U.S.6,214,966호; U.S.6,258,351호; U.S.6,340,742호; U.S.6,413,507호; U.S.6,420,339호; U.S.6,437,025호; U.S.6,448,369호; U.S.6,461,802호; U.S.6,828,401호; U.S.6,858,736호; U.S. 2001/0021763호; U.S. 2001/0044526호; U.S. 2001/0046481 호; U.S. 2002/0052430호; U.S. 2002/0072573호; U.S. 2002/0156047호; U.S. 2003/0114647호; U.S. 2003/0143596호; U.S. 2003/0158333호; U.S. 2003/0220447호; U.S. 2004/0013637호; U.S. 2004/0235734호; WO 0500360호; U.S. 2005/0114037호; U.S. 2005/0171328호; U.S. 2005/0209416호; EP1064951 호; EP0822199호; WO010176640호; WO0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925호)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
2. 탁산 ( taxane ) 및 이의 제형
본원에서 제공되는, 조성물, 조합물 및 방법 및 용도를 포함하는 병용치료는 탁산(taxane)을 포함한다. 탁산은 일반적으로 수용성이 낮은데, 이로 인해 치료적 사용이 제한된다. 본원에서 제공되는 조성물 및 조합물에서, 탁산은 수용성을 나타내는 제형으로서 제공된다. 본원에서 제공되는 특정 예에서, 탁산은 종양의 기질 또는 세포를 표적으로 하고 및/또는 투과하는 제형으로서 제공된다. 이러한 탁산 제형의 예는 알부민-결합 탁산이다.
a. 탁산
탁산은 탁서스 속(genus Taxus)의 식물로부터 생산되는 디테르펜(diterpene)이다. 탁산은 튜불린(tubulin)에 결합하고 미세소관 중합체화를 안정화시키는 작용을 함으로써 미세소관 조립 및 해체와 관련된 정상적 평형을 방해하고 미세소관 기능을 지연시키는 세포분열저지성 제제(antimitotic agent)이다. 탁산은 미세소관의 형성을 촉진하면서, 유사분열 방추사의 미세소관을 형성하는 튜불린의 탈중합을 방지한다. 미세소관은 세포 분열을 위해 필수적이며 탁산에 노출된 세포는 유사분열 전기 G2 기에 억제되고 분열에 실패한다. 이러한 약물은 따라서 이러한 약물로 처리된 세포가 유사분열에서 정지됨으로써 세포 분열 과정을 방해한다. 이는 성공적이지 못한 유사분열로 인해 궁극적으로 세포사를 유발한다.
탁산은 또한 처리된 세포에서 O2 및 H2O2 축적을 포함하여 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성한다. ROS의 축적은 파클리탁셀(paclitaxel)을 포함하는 탁산의 직접적 세포독성 활성 뿐 아니라 이웃하는 세포들에 대한 방관자 효과(bystander effect)와 관련이 있다(예컨대 Alexandre 외 (2007) Cancer Res., 67:3512 참조).
본원에서 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 탁산은 튜불린의 탈중합을 억제하는 임의의 디터르펜 화합물을 포함한다. 특히, 이러한 탁산은 또한 처리된 세포에서 ROS의 축적을 야기하는 임의의 것을 포함한다. 탁산은 천연적으로 생산되는 디터르펜의 정제된 형태 또는 인공적으로 합성되는 것들을 포함한다. 탁산은 비-결정형이고 및/또는 무정형인 것들을 포함한다. 탁산은 또한 탁산의 무수 형태(anhydrous form)를 포함할 수 있다.
파클리탁셀(탁솔, taxol)은 천연적으로 발생하는 디터르페노이드(diterpenoid)이다. 파클리탁셀의 화학명은 5β,20-에폭시-1,2a,4,7β,10β,13a-헥사하이드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트(5β,20-epoxy-1,2a,4,7β,10β,13a-hexahydroxytax-11-en-9-one 4,10-diacetate 2-benzoate)이다. 탁솔은 서양 주목(Western Yew), 탁서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia ) 뿐 아니라 T. 바카타 (T. baccata ) 및 T. 커스피다타(T. cuspidata)의 줄기 수피에서 발견된다. 파클리탁셀은 태평양 주목 나무(Pacific yew tree), 탁서스 브레비폴리아의 수피에서 최초로 분리되었다(Wani 외 (1971) J. Am. Chem. Soc., 93:2325). A. 파클리탁셀의 핵심(core) 구조는 4개의 고리(6원의(6-membered) A 고리 및 C 고리, 8원의 B 고리 및 4원의 D 고리)를 포함한다. 이 분류의 약물에 대한 기존의 넘버링 시스템을 사용하여 나타낸 넘버링(numbering)으로 표시한, 파클리탁셀의 구조는 하기에 기재된다.
Figure 112016024482551-pat00005
파클리탁셀은 유럽 또는 히말라야 주목의 침엽 및 잔가지로부터 유래된 바카틴(baccatin)이라고 불리는 전구체 화합물로부터 반-합성적 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 파클리탁셀은 파클리탁셀의 하이드록실기가 될 바카틴의 하이드록실기에 보호기(protecting group)를 부착하여, 전구체 바카틴을 파클리탁셀로 전환시키고, 그 다음 파클리탁셀을 수득하기 위해 하이드록실기로부터 보호기를 제거함으로써 바카틴으로부터 제조될 수 있다. 또한, 파클리탁셀은 최근에 단순한 전구체로부터 합성된 바 있다(예컨대 국제 PCT 공개번호 WO93/10076호, WO93/16059호; 미국 특허번호 제5,200,534호, 미국 특허번호 제5,015,744호; 미국 특허번호 제4,960,790호; Nicolaou (1993) Nature 364: 464-466; Nicolaou, K. C. 외 (1994) Nature, 367:630-634; 및 Holton 외 (1994) J. Am. Chem . Soc., 116: 1597-1600 참조).
도세탁셀(docetaxel)(탁소테레, taxotere)는 본원에서 제공되는 조합물 및 조성물 내에 사용하기 위한 또 다른 예시적인 탁산이다. 도세탁셀은 화합물명 1,7β,10β-트리하이드록시-9-옥소-5β,20-에폭시탁스-11-엔-2α,4,13α-트리일 4-아세테이트 2-벤조에이트 13-{(2R,3S)-3-[(터트-부톡시카보닐)아미노]-2-하이드록시-3-페닐프로파노에이트(1,7β,10β-trihydroxy-9-oxo-5β,20-epoxytax-11-ene-2α,4,13α-triyl 4-acetate 2-benzoate 13-{(2R,3S)-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-2-hydroxy-3-phenylpropanoate)을 가지며 이 분류의 약물에 대한 기존의 넘버링을 사용하여 보여지는 넘버링으로 표시한 구조가 하기에 기재된다.
Figure 112016024482551-pat00006
도세탁셀은 유럽 주목 나무 탁서스 바카타(Taxus baccata)에서 발견된 화합물로부터 유래된 반-합성적, 2세대 탁산이다. 도세탁셀은 유럽 주목 나무로부터 추출되는 10-데아세틸 바카틴 Ⅲ(10-deacetyl baccatin Ⅲ)의 에스테르화 산물이다. 도세탁셀은 화학적 구조에 있어서 파클리탁셀과 두 위치에서 다르다: 파클리탁셀은 아세테이트 에스테르를 결여하며, 파클리탁셀에서 벤질 아미드 대신에 페닐프로피오네이트 측쇄에 터트-부틸 카바메이트 에스테르(tert-butyl carbamate ester)가 존재한다. 파클리탁셀의 유사체(analog)인 도세탁셀은 탁서스 바카타의 침엽으로부터 추출된 비-세포독성 전구체인 10-데아세틸 바카틴 Ⅲ으로부터 반합성적으로 생산되고 화학적으로 합성된 측쇄로 에스테르화된다(Cortes and Pazdur, 1995,　J. Clin. Oncol. 13(10):2643-55).
본원에서 제공되는 조성물, 조합물 및 방법에서 사용하기 위한 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 유사체, 유도체 및 전구체 형태를 포함한다. 이러한 탁산 유도체는 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 비교하여 개선된 수용성을 나타내는 것들을 포함한다. 예를 들어, 탁산 유도체, 유사체 및 전구체 형태는 고리 위치가 변형되거나 유도체 합성된 것들, 및 특히 2'- 및 7 또는 10-위치가 적합한 기(group)로 유도체 합성된 것들을 포함한다(예컨대 Fu 외 (2009) Current Medicinal Chemistry, 16:1-13 참조).
예를 들어, 탁산 유도체, 유사체 또는 전구체 형태는 2'-O-위치에서 다양한치환된 아실(acyl) 기를 갖는 수용성 탁솔(예컨대 미국 특허번호 제4,942,184호 참조); 2' 및/또는 7' 하이드록시가 선택된 아미노산 또는 아미노산 모방 화합물로 유도체 합성된 수용성 탁솔(예컨대 미국 특허번호 제4,960,790호); 설폰화 2'-아크릴오일, 설폰화 2'-O-아실 산 탁솔 및 치환된 2'-벤조일 및 2'7-디벤조일 탁솔(예컨대 미국 특허번호 제5,352,805호 및 5,411,984호 참조); 탁솔의 2' 및/또는 7-O-에스테르 및 2'- 및/또는 7-O-카보네이트 유도체(예컨대 미국 특허번호 제5,817,840호 참조); 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(L-글루탐산)(poly(L-glutamic acid)), 폴리(L-아스파르트산)(poly(L-aspartic acid))과 같은 폴리머와의 컨주게이션에 의해 형성된 탁산 유도체(예컨대 미국 특허번호 제5,977,163호 참조); 탁산의 측쇄의 C-7, C-10 및/또는 2'위치에서 포스포노옥시(phosphonooxy) 기를 갖는 탁산의 프로드러그(prodrug) 형태(예컨대 WO9414787호 참조); 2'-석시닐파클리탁셀(2'-succinylpaclitaxel) 및 2'글루타릴파클리탁셀(2'glutarylpaclitaxel)의 염(Deutch 외 (1989) J. Med . Chem., 32:788-792); 파클리탁셀의 2' 및 7-아미노산 유도체(2'and 7-amino acid derivatives) 및 그 염(Matthew 외 (1992) J. Med . Chem., 35:145-151; 설포네이트 유도체(sulfonate derivatives)(Zhao 외 (1991) J. Nat. Prod., 54:1607-1611; 7-포스페이트(7-phosphate) 파클리탁셀 유사체(Vyas 외 (1993) Bioorg . Med . Chem ., Lett ., 3:1357-1360); 파클리탁셀의 2' 및 7-폴리에틸렌 글리콜 에스테르(2' and 7-polyethylene glycol esters)(Greenwald 외 (1995) J. Org . Chem., 60:331-336; Greenwald 외 (1996) J. Med . Chem ., 39:424-431); 2' 및 7-포스포녹시페닐-프로피오네이트 파클리탁셀(2' and 7-Phosphonoxyphenyl-propionate paclitaxel)(Ueda 외 (1993) Bioorg . Med . Chem . Lett., 3:1761-1766); 파클리탁셀의 2' 및 7-메틸피리디니움 아세테이트 유사체(2' and 7-Methylpyridinium acetate analogues)(Nicolaou 외 (1994) Angew Chemie , 106:1672-1675); Paloma 외 (1994) Chem . Biol., 1:107-112); 2' 위치에서 말레산(maleic acid)을 가진 파클리탁셀의 프로드러그(Damen 외 (2000) Bioorg . Med . Chem. Lett., 8:427-432); 탁산 특히 탁솔의 설포네이트 염(미국 특허번호 제5,059,699호); 탁산의 지용성을 향상시키기 위해 아실 쇄(acyl chain)가 부착된 유도체(예컨대 미국 특허번호 제6,482,850호 참조); 무수 산물(anhydrous product)보다 더 큰 안정성을 나타내는 도세탁셀의 삼수화물 형태(미국 특허번호 제6,022,985호 및 제6,838,569호); C-10 위치에서 카바메이트(carbamate) 모이어티를 포함하는 것들을 포함하는, C-10 탁산 유도체(미국 특허번호 제8,138,361호); 소수성 탁산 유도체(미국 특허 공개번호 US20090263483호); 및 탁산의 카복실레이트(carboxylate) 유도체를 포함하는 하이드라지드(hydrazide)(예컨대 미국 특허번호 제8,133,888호 참조).
b. 종양- 또는 기질- 표적 탁산
본원의 조성물 및 조합물에서 제공되는 탁산 화합물은 일반적으로 종양 또는 종양을 둘러싼 기질을 표적화하기 위해 제조된다. 본원에서 제공되는 조성물 및 조합물에서 탁산은 또한 개선된 가용성을 나타내는 가용화된 또는 나노분산된(nanodispersed) 제형으로서 제공된다.
천연 또는 반-합성적으로 생산된 파클리탁셀(탁솔)은 낮은 수용성 및 비-특이적 표적화 또는 국소화(localization)와 같은 문제로부터 고통받는다. 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하여, 탁산은 수용성이 매우 낮고(10 μg/mL 미만), 결과적으로, 정맥내 투여를 위한 수성 매체로 사실상 제형화될 수 없다. 수용성 문제를 극복하기 위하여, 파클리탁셀의 현재의 제형은 암환자에게 정맥내 투여를 위해 폴리옥시에틸화 피마자유(폴리옥시 35(Polyoxyl 35) 또는 크레모포어®(Cremophor®))를 주된 용매/계면활성제로 하고, 공동 용매로 고농도의 에탄올을 사용한 용액 내에 제형화된다. 파클리탁셀과 마찬가지로, 도세탁셀은 물에서 매우 가용성이 낮다. 현재, 도세탁셀을 용해하기 위해 사용되는 용매/계면활성제는 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)(Tween 80)이다(Bissery 외 1991　Cancer Res. 51(18):4845-52; Tomiak 외 1992). 기존의 제형 내의 에탄올, 크레모포어 및/또는 트윈은, 심각한 피부 발적(skin rash), 두드러기(hives), 홍조(flushing), 호흡 장애(dyspnea), 빈맥(tachycardia) 및 기타를 포함할 수 있는, 과민반응의 발생과 관련이 있다.
더 나아가, 암 조직에 대한 특이성을 증가시킴으로써, 탁산 분자는 감소된 전신적 효과 또는 노출로 인한 독성을 더 적게 나타낸다. 전형적으로, 종양-표적 탁산은 종양 인식 모이어티(tumor recognition moiety)에 대한 링커를 통해 직접적 또는 간접적으로 컨주게이션되거나 연결된 탁산, 유도체, 유사체 또는 프로드러그이다. 종양 인식 모이어티는 정상 세포와 비교하여 암세포에 선택적으로 발현되는 종양-특이적 마커 또는 모이어티를 인식하는 단일클론 항체, 단백질, 펩티드, 지질 또는 거대분자 복합체일 수 있다. 암세포는 탁산을 전달하기 위해 표적화될 수 있는 많은 종양-특이적 마커 또는 수용체를 과발현한다.
종양-표적 탁산은 미셀(micelle), 나노입자(nanoparticle), 마이크로스피어(microsphere), 리포좀(liposome) 또는 하이드로겔(hydrgel) 제형으로서 제공될 수 있다. 이러한 제형은 수성 매체 내에서 낮은 가용성을 나타낼 수 있는 탁산과 같은 활성 성분을 캡슐화하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 제형은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 예에서, 전달 비히클은 종양-표적화 모이어티, 예컨대 거대분자 복합체, 단일클론 항체, 단백질, 펩티드 또는 지질로 코팅 또는 컨주게이션된다. 그러므로, 일부 예에서, 약물 전달 플랫폼은 탁산을 캡슐화하고, 그 자체가 종양 표적화를 달성하기 위해 표면상에 표적 리간드 또는 기타 폴리머 코팅을 나타낸다.
예시적인 종양-표적 탁산 및 이의 제형은 폴리-L-글루타메이트(poly-L-glutamate)와 같은 거대분자인 종양 표적 모이어티(PGA-TXL, Xyotax; Li 외 (1998) Cancer Res., 58:2404-2409); p140 TrkA 또는 p75 수용체와 같은 종양 마커에 대해 특이적인 단일클론 항체(Guillemard and Saragovi (2001) Cancer Res., 61:694) 또는 항-표피 성장 인자 수용체(anti-epidermal growth factor receptor)(즉, 항-EGFR 단일클론 항체, 예컨대 세툭시맙(cetuximab); Safavy 외 (2003) Bioconjug., 14:302-10; Ojima 외 (2002) J. Med . Chem ., 45:5620-3), 항-HER2 (허셉틴(Herceptin), 트라스투주맙(trastuzumab), Cirstoiu-Hapca 외 (2010) J. Control Release, 144:324-31); 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid)과 같은 다가불포화 지방산 (DHA; Bradley 외 (2001) Clin . Cancer Research, 7:3229-38), 리놀렌산(linolenic acid) 또는 리놀레산(linoleic acid) (Kuznetsova 외 (2006) Bioorg . Med. Chem . Lett., 15:974-7); 세포 표면 봄베신(bombesin)/가스트린(gastrin)-방출 펩티드(BBN/GRP)에 결합하는 BBN[7-13]으로 명명된 7-아미노산 합성 펩티드와 같은 펩티드(Safavy 외 (1999) J. Med . Chem., 42:4919-4924), LRP-1 표적 19 아미노산 펩티드 안지오펩-2(angiopep-2) (Wen 외 (2011) Molecular Cancer Therapeutics, 10 (11 Suppl):Abstract B49), 기질 메탈로프로테아제 2(matrix metalloprotease 2)에 의해 절단되는 옥타펩티드(octapeptide)(MMP2; Yamada 외 (2010) Cancer Biology and Therapy, 9:192-203), RGD 펩티드 (예컨대 Zhao 외 (2009) J. Drug Target, 17:10-8 참조); 바이오틴(biotin)을 포함하는, 비타민 수용체와 같은 종양-특이적 수용체를 표적화하는 단백질(비타민 H 또는 B-7, 폴레이트(folate) 또는 엽산(folic acid), 비타민 B12 또는 리보플라빈(riboflavin)(예컨대 Chen 외 (2010) Biconjug . Chem., 21:979-987, Li 외 (2011) International Journal of Nanomedicine, 6:1167-1184 참조); 히알루론산(HA)(Auzenne 외 (2007) Neoplasia, 9:479-486); 트랜스페린(transferrin)(Sahoo 외 (2004) Int . J. Cancer, 112:335-40); 및 알부민(albumin)을 포함한다.
알부민-결합 탁산
가용성 폴리머-약물 복합체의 예는 알부민-컨주게이션된 탁산이다. 알부민은 내인성 소수성 분자, 예컨대 비타민 또는 호르몬의 천연 담체이다. 담체로서 작용할 뿐 아니라, 알부민은 또한 내피세포의 표면상의 gp60에 결합함으로써 단백질-결합한 혈장 구성요소의 내피 트랜스사이토시스(transcytosis)를 용이하게 하는데, 이는 소포-매개 트랜스사이토시스(caveolae-mediated transcytosis)를 달성한다. 알부민은 또한 많은 종양 세포에 존재하는, 시스테인(cystein)이 풍부한 분비된 단백질(SPARC, 오스테오넥틴(osteonectin)으로도 알려짐)에 결합할 수 있다. 따라서, 알부민은 알부민-결합 약물의 종양 세포 축적을 촉진한다.
알부민은 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 뿐 아니라 비-인간 알부민 예컨대 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 포함한다. HSA는 Mr　65K의 가용성이 높은 구형 단백질이고 585 아미노산(서열번호 211)을 포함한다. HSA는 혈장 내에 가장 풍부한 단백질이며 인간 혈장의 교질 삼투압(colloid osmotic pressure)의 70-80%를 차지한다. HSA의 아미노산 서열은 총 17개의 디설파이드 가교(disulfide bridge), 1개의 자유 티올(thiol)(Cys 34), 및 단일 트립토판(single tryptophan)(Trp 214)을 포함한다.
인간 혈청 알부민(HSA)은 복수 개의 소수성 결합 부위를 갖고(HSA의 내인성 리간드인 지방산에 대해 총 8개) 다양한 세트의 약제학적 제제, 특히 중성 및 음성 전하를 띤 소수성 화합물에 결합하는 것으로 보여진 바 있다(Goodman 외,　The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th　ed., McGraw-Hill New York (1996)). 2개의 친화성이 높은 결합 부위가 HSA의 서브도메인(subdomain) ⅡA 및 ⅢA에 제시되는데, 이는 극성 리간드 특징에 대한 부착 지점으로서 기능하는 표면에 가까운 하전된 라이신(lysine) 및 아르기닌(arginine) 잔기를 갖는 매우 연장된 소수성 포켓(pocket)이다(예컨대 Fehske 외,　Biochem . Pharmcol., 30, 687-92 (1981), Vorum,　Dan. Med . Bull., 46, 379-99 (1999), Kragh-Hansen,　Dan. Med . Bull., 37:57-84 (1990), Curry 외,　Nat. Struct . Biol., 5, 827-35 (1998), Sugio 외,　Protein. Eng., 12, 439-46 (1999), He 외,　Nature, 358, 209-15 (1992), 및 Carter 외,　Adv . Protein. Chem., 45, 153-203 (1994) 참조). 파클리탁셀 및 도세탁셀은 HSA에 결합하는 것으로 보여진 바 있다(예컨대 Paal 외,　Eur . J. Biochem., 268(7), 2187-91 (2001), Purcell 외,　Biochim . Biophys . Acta, 1478(1), 61-8 (2000), Altmayer 외,　Arzneimittelforschung, 45, 1053-6 (1995), Garrido 외,　Rev. Esp . Anestestiol . Reanim., 41, 308-12 (1994); 및 Urien 외,　Invyvest. New Drugs, 14(2), 147-51 (1996) 참조).
조성물 내의 탁산에 대한 알부민의 중량비는 약 20:1 또는 그 미만, 예컨대 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 또는 그 미만, 및 일반적으로 적어도 약 9:1이다. 야기되는 산물은 용매 및/또는 계면활성제가 없도록 생성될 수 있다. 탁산은 알부민으로 코팅된다. 탁산/알부민 나노입자는 일반적으로 200 nm을 초과하지 않는 평균 지름, 일반적으로 100 nm 내지 200 nm, 예컨대 130 nm의 평균 지름을 가진다.
예를 들어, 알부민-결합 탁산은 알부민-결합(nab-)파클리탁셀(예컨대 아브락산(Abraxane), American Bioscience, Inc. (Santa Monica, CA); 또한 미국 특허번호 제5,439,686호 및 제6,749,868호에 기술됨) 또는 알부민-결합 도세탁셀(예컨대 예를 들어 미국 특허출원 공개번호 제20080161382호, 제20070117744호 및 제20070082838호 참조)을 포함한다. 인간 알부민은 응집을 방지하기 위해 파클리탁셀 나노입자에 전하 및 입체적 안정화를 제공하는 표면-활성 폴리머로서 기능한다. 안정화는 알부민이 파클리탁셀 나노입자의 표면상에 흡착하여, 파클리탁셀 입자의 응집을 방지하는 표면-활성 폴리머로서 기능하는 판(sheet)을 생성한다는 사실에 의해 달성된다. 파클리탁셀과 인간 알부민 간의 상호작용은 약하고 두 물질 모두 재구성 후 자유롭게 해리한다. 따라서, 재구성되어 혈류 내로 주사되었을 때, 파클리탁셀 농도는 빠르게 감소하며 알부민 입자는 개별적인 알부민 분자 내로 해리한 후 파클리탁셀이 여전히 부착된 상태로 순환한다고 믿어진다. 특히, 알부민-결합된 파클리탁셀(예컨대 nab-파클리탁셀 또는 아브락산)은 파클리탁셀 및 인간 혈청 알부민이 식염수 용액(0.9% NaCl) 내에 희석된 동결건조된 제형으로부터 유래된 콜로이드 현탁액으로서 사용될 수 있다. 야기되는 약물 입자 복합체는 130 nm의 평균 크기로 안정화된다. 기타 탁산을 포함하는 나노입자, 예컨대 본원의 상기에서 언급된 임의의 나노입자가, 또한 생성되고 사용될 수 있고, 상기 기술된 것과 같은 동일한 특징을 포함할 수 있다.
3. 추가적인 화학치료제(예컨대 뉴클레오시드(nucleoside) 유사체)
선택적으로, 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 및/또는 탁산 제형의 하나 또는 둘 다와의 공동-투여에 의해 활성이 개선되거나 증가된 추가적인 화학치료제가 본원에서 제공되는 병용치료에 포함될 수 있다. 예를 들어, 1 또는 그 이상의 뉴클레오시드 유사체, 특히 항-대사물질은 본원에서 제공되는 병용치료에 포함될 수 있다. 그들이 세포로 진입한 후에, 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드 5'-모노-포스페이트, 디-포스페이트 및 트리-포스페이트로 연속적으로 인산화(phosphorylate)된다. 예를 들어, 일반적으로, 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드가 트리포스페이트로 인산화됨으로써 활성 화합물로 전환되는데(예컨대 디포스페이트 키나제에 의해), 이는 그 후 DNA 내로의 통합을 위한 기질(substrate)로서 생리적 뉴클레오시드(예컨대 dCTP)와 경쟁할 수 있다. 따라서, 뉴클레오시드 유사체는 생리적 뉴클레오시드를 모방한다. 일단 통합되면, 상기 유사체는 비효율적인 기질이어서, 복제를 지연시키고 및/또는 연쇄 종결(chain termination)을 야기한다. 뉴클레오시드 유사체의 리뷰를 위해서는 Sampath 외 (2003), Oncogene, 22:9063-9074를 참조하라. 뉴클레오시드 유사체가 활성 형태로의 전환을 요구하기 때문에, 뉴클레오시드 유사체는 일반적으로 활성 형태로 인산화되어야만 하는 프로드러그이다.
본원의 조성물 및 조합물에서 사용하기 위한 뉴클레오시드 유사체는 퓨린(purine) 및 피리미딘(pyrimidine) 뉴클레오시드 유사체 뿐 아니라 이의 유도체 및 프로드러그 형태를 포함한다. 피리미딘 뉴클레오시드 유사체는 플루오로피리미딘 5-플루오로우라실(fluoropyrimidine 5-fluorouracil)(5-FU; fluorouracil), 5-플루오로-2'-데옥시시티딘(5-fluoro-2'-deoxycytidine)(FCdR), 아라비노실사이토신(arabinosylcytosine)(아라-C(ara-C); 또한 사이토신 아라비노사이드(cytosine arbinoside) 또는 시타라빈(cytarabine)으로도 알려짐), 젬시타빈(gemcitabine) (2'-데옥시-2'2'-디플루오로시티딘(2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine)), 트록사시타빈(troxacitabine)(베타-L-디옥솔레인 시티딘(beta-L-dioxolane cytidine), BCH-4556), 데시타빈(decitabine)(5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)), 아자시티딘(Azacytidine)((4-아미노-1-β-D-리보퓨라노실-1,3,5-트리아진-2(1H)-온(4-amino-1-β-D-ribofuranosyl-1,3,5-triazin-2(1H)-one)), 슈도이소시타빈(pseudoisocytidine)(psi ICR), 5-아자-2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘(5-aza-2'-deoxy-2',2'-difluorocytidine); 5-아자-2'-데옥시-2'-플루오로시티딘(5-aza-2'-deoxy-2'-fluorocytidine); 1-β-D-리보퓨라노실-2(1H)-피리미딘온(1-β-D-ribofuranosyl-2(1H)-pyrimidinone)(제불라린(Zebularine)); 2'3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아시티딘(2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine)(엠트리바(Emtriva)); 2'-사이클로시티딘(2'-cyclocytidine)(안시타빈(Ancitabine)); 1-β-D-아라비노퓨라노실-5-아자사이토신(1-β-D-arabinofuranosyl-5-azacytosine)(파자라빈(Fazarabine) 또는 아라-AC(ara-AC)); 6-아자시티딘(6-azacytidine)(6-aza-CR); 5,6-디하이드로-5-아자시티딘(5,6-dihydro-5-azacytidine)(dH-aza-CR); N4-펜틸옥시카보닐-5'-데옥시-5-플루오로시티딘(N4-pentyloxycarbonyl-5'-deoxy-5-fluorocytidine)(카페시타빈(Capecitabine)); N4-옥타데실-시타라빈(N4-octadecyl-cytarabine); 및 엘라딕산 시타라빈(elaidic acid cytarabine), 및 이의 유도체 및 전구체 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 퓨린(purine) 뉴클레오시드 유도체는, 예를 들어 플루다라빈(fludarabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 넬라라빈(nelarabine), 포로데신(forodesine), 펜토스타틴(pentostatin) 및 테자시타빈(tezacitabine), 및 유도체 및 전구체 형태를 포함한다.
뉴클레오시드 유사체의 기타 프로드러그 형태는 알려져 있거나 생성될 수 있다. 예를 들어, 기타 프로드러그 형태는 세포적 흡수의 성질 및/또는 탈아미노산 효소(deaminase)에 의한 불활화에 대한 저항성을 변화시키기 위해 변형된 것들을 포함한다(하기에서 논의됨). 예를 들어, 이러한 프로드러그 형태는 개선된 경구 흡수 및/또는 증가된 또는 특이적인 조직 표적화를 허용할 수 있다(Li 외 (2008) Journal Pharm . Science, 97:1109-1134).
일부 뉴클레오시드 유사체의 항종양 활성은 달성될 수 있는 낮은 세포독성 수준에 의해 제한되어 왔다. 이는 상당 부분 많은 조직에서 발생할 수 있는 효소의 불활화로 인한 것이다. 예를 들어, 일부 뉴클레오시드 유사체의 대사적 불활화는 탈아미노화에 의해 유발될 수 있다. 탈아미노화는 뉴클레오티드-특이적 탈아미노산 효소, 예컨대 아데노신 탈아미노 효소 또는 시티딘 탈아미노 효소(cdA)에 의해 촉매될 수 있다. 따라서, 일부 암 약물은 유기체의 천연적으로 발생하는 효소, 예컨대 아데노신 탈아미노 효소(ADA, EC 3.5.4.4) 및 시티딘 탈아미노 효소(CDA, 또는 사이토신 뉴클레오시드 탈아미노산 효소, 시티딘 아미노하이드롤라제(cytidine aminohydrolase, 또는 EC 3.5.4.5로 명명됨)에 의해 대사된다. 이러한 효소는 인간 및 기타 유기체에서 천연 아미노퓨린 및 아미노피리미딘 뉴클레오시드를 탈아미노화하는 기능을 한다. 이러한 효소는 또한 활성 뉴클레오시드-기반 암 약물을 불활성 대사물질로 전환한다. 예를 들어, CDA는 피리미딘 회수경로(salvage pathway)의 구성요소이다. 이는 가수분해 탈아미노화(hydrolytic deamination)에 의해 시티딘 및 데옥시시티딘을 유리딘(uridine) 및 데옥시유리딘(deoxyuridine)으로 각각 전환한다(Cacciamani 외 (1991) Arch. Biochem . Biophys. 290:285-292; Wentworth and Wolfenden (1978) Methods Enzymol . 57:401-407; Wisdom and Orsi (1967) Biochem . J. 104:7P). 이는 또한 아라-C 및 기타 하기에서 기술되는 것들과 같은 임상적으로 유용한 약물인 다수의 합성 사이토신 유사체를 탈아미노화한다(Eliopoulos 외 (1998) Cancer Chemother . Pharmacol. 42:373-378; Kees 외 (1989) Cancer Res. 49:3015-3019; Antiviral Chem . Chemother. (1990) 1:255-262).　예를 들어, 내인성 효소 데옥시시티딘 탈아미노 효소에 의한 상응하는 우라실 유도체(dFdU)로의 급속한 탈아미노화로 인해, 혈장 내의 젬시타빈의 반감기는 대략적으로 10분이다(P. G. Johnston 외, Cancer Chromatography and Biological Response Modifiers, Annual 16, 1996, Chap. 1, ed. Pinedo H. M. 외).
예를 들어, 퓨린 뉴클레오시드 약물 아라비노실아데닌(araninosyladenine)(플루다라빈(fludarabine), 아라-A)는 ADA에 의해 탈아미노화된다; 부모 아미노기가 하이드록실로 치환된, 야기되는 화합물은 부모 화합물과 비교하여 항종양 제제로서 불활화된다. 유사하게, 약물 아라비노실사이토신(arabinosylcytosine)(또한 시타라빈 아라-C 또는 아라 C로 명명됨); 4-아미노-1-(β-D-아라비노퓨라노실)-2(1H)-피리미딘온(4-Amino-l-(β-D-arabinofuranosyl)-2(lH)-pyrimidinone); 사이토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside); 또는 1-(β-D-아라비노퓨라노실)사이토신)( l-(β-D- Arabinofuranosyl)cytosine) )은 CDA에 의해 불활성 아라비노실우라실(arabinosyluracil)로 대사적으로 분해된다. 젬시타빈, 데시타빈, 아자시티딘 및 기타는 또한 유사하게 불활화된다. 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 사이토신 뉴클레오시드 및 그 유사체(예컨대 시타라빈 및 젬시타빈)의 탈아미노화는, 활성 대사물질로서 작용하는 그들의 독성 세포내 트리포스페이트 유도체의 축적을 방지한다.
사이토신 화합물의 유리딘 유도체로의 전환은 보통 치료적 활성의 소실 또는 부작용의 부가를 부여한다. 또한 사이토신 유사체 약물에 대해 저항성을 획득한 암이 종종 CDA를 과발현한다고 보여진 바 있다(Leuk . Res. 1990, 14, 751-754). 높은 수준의 CDA를 발현하는 백혈병 세포 및 고형 종양은 사이토신 항대사물질에 대해 저항성을 초래하여 이러한 치료제의 항신생물적 활성을 제한할 수 있다(Biochem . Pharmacol. 1993, 45:1857-1861). 뉴클레오시드 유사체에 대한 저항성은 증가된 투여량, 지속되는 주입 또는 반복적 투여를 요구할 수 있다. 이러한 효과는 특히 골수억제 및 면역억제와 관련된 심각한 유해한 효과(adverse effect)로 이어질 수 있다.
반응성 산소 종(ROS)은 뉴클레오시드 탈아미노산 효소를 포함하는 효소의 불활화와 관련된다. 탁산은 종양내 ROS를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 뉴클레오시드 탈아미노산 효소의 활성을 불활화할 수 있다(예컨대 Frese 외 (2012) Cancer Discovery, 2:260-269 참조).
따라서, 본원의 목적을 위해, 본원에서 제공되는 조합물 및 조성물에서 사용하기 위한 예시적인 뉴클레오시드 유사체는 탈아미노산 효소의 기질이고, 이에 의해 불활화되는 것들이다. 예를 들어, 상기 탈아미노산 효소는 시티딘 탈아미노 효소 또는 아데노신 탈아미노 효소일 수 있다. 이러한 유사체의 종양내 수준 및 활성은 폴리머-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소 및 탁산 제형으로의 병용치료에서 크게 증가될 수 있다. 이러한 뉴클레오시드 유사체의 예는 플루다라빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈 및 아자시티딘 또는 이의 유사체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 방광, 유방, 폐, 난소, 췌장 및 기타 암과 같은 고형 종양을 치료할 수 있는 것이다.
본원에서 제공되는 임의의 뉴클레오시드 유사체는 리포좀, 마이크로입자, 나노입자, 또는 폴리머-컨주게이트로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 투여되는 약물의 전달을 조절 및/또는 투여되는 약물의 반감기를 증가시키기 위해서 제조될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 리포좀 제형이 알려져 있다(예컨대 미국 특허번호 제5,736,155호 및 제8,022,279호 참조).
예시적인 뉴클레오시드 유사체
ⅰ) 젬시타빈 ( gemcitabine )
젬시타빈(2',2'-디플루오로데옥시시티딘, 2'2'-difluorodeoxycytidine, dFdC)은 데옥시시티딘의 디플루오르화 유사체이고 따라서 뉴클레오시드 유사체 또는 항대사물질이다. 젬시타빈이 세포로 진입한 후, 뉴클레오시드 모노포스페이트 및 디포스페이트 키나제에 의한 세포내 인산화는 5'-디포스페이트(5'-diphosphate, dFdCDP) 및 5'-트리포스페이트(5'-triphosphate, dFdCTP) 유도체를 각각 생산한다. 젬시타빈 트리포스페이트는 DNA 내로의 통합에 대해 dCTP와 경쟁하는 거짓 염기(fraudulent base)이다. DNA 내로 통합되는 경우, DNA 쇄 연장이 정지되기 전에 오직 1개의 추가적인 뉴클레오티드가 통합될 수 있다. DNA 폴리머라제 엡실론(epsilon)은 그 때 젬시타빈 뉴클레오티드를 제거할 수 없으며 성장하는 DNA 가닥을 수선할 수 없다(마스킹(mask)된 쇄 종결).
젬시타빈은 동결건조된 분말 제형인 젬자(Gemzar®)로서 판매된다. 주사용 젬시타빈, USP인 젬자®은 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘 모노하이드로클로라이드(2'2-difluorocytidine monohydrochloride)(β-이성질체)인 젬시타빈 HCl을 포함한다. 젬자®은 멸균 동결건조 분말로서 만니톨(mannitol)(각각 200 mg 또는 1 g) 및 소디움 아세테이트(sodium acetate)(각각 12.5 mg 또는 62.5 mg)로 제형화된 젬시타빈 HCl(자유 염기로서 나타남)을 200 mg 또는 1 g 포함하는 정맥내 제형으로서 공급된다. 상기 제형의 pH는 염산 및/또는 수산화나트륨의 첨가에 의해 조정될 수 있다. 젬자®을 제조하는 과정 및 이를 사용하는 방법은 미국 특허번호 제5,464,826호 및 미국 특허번호 제4,808,614호에서 기술된다. 젬자®은 췌장암, 유방암 및 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에 대해 승인되었으며 난소암에 대하여 평가되고 있다. 또한 젬자®은 HCV의 치료에서 뿐 아니라 면역 기능의 조절자(modulator)로서 사용될 수 있다(미국 특허번호 제6,555,518호 참조). 젬자®은 최대 7주까지 주 1회 투여하고 그 후 1주 동안 치료를 쉬면서, 대략 1000 내지 1250 mg/m2의 용량으로 30분에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다.
수 개의 프로드러그 형태를 포함하여, 젬시타빈의 합성 유도체가 알려져 있다(예를 들어, Ishitsuka 외, 국제 공개공보 WO03/043631호; Alexander 외 (2003) J. Med . Chem., 46: 4205-4208; 미국 특허번호 제6,303,569호; Guo 외 (2001)　Cancer Chemother . Pharmacol.,48:169-176; 국제 공개번호 WO01/21135호; Di Stefano 외 (1999)　Biochem . Pharmacol., 57: 793-799; Guo 외 (1999)　J. Org . Chem., 64: 8319-8322; 국제 공개번호 WO99/33483호; 국제 공개번호 W098/32762호; 국제 공개번호 WO98/00173호; 미국 특허번호 제5,606,048호; 미국 특허번호 제5,594,124호; 유럽 특허 출원 번호 EP712860호; 미국 특허번호 제5,521,294호; 미국 특허번호 제5,426,183호; 미국 특허번호 제5,401,838호; 유럽 특허번호 EP0376518호; 유럽 특허 출원 번호 EP577303호; 유럽 특허 출원 번호 EP576230호; Chou 외 (1992)　Synthesis, 565-570; Richardson 외 (1992)　Nucleic Acid Res., 20: 1763-1768; Baker 외 (1991)　J. Med . Chem., 34: 1879-1884; 국제 공개번호 WO91/15498호; 유럽 특허 출원 번호 EP329348호; 유럽 특허 출원 번호 EP272891호 참조).
예시적인 개선된 프로드러그는 젬시타빈 엘라이데이트(gemcitabine elaidate)(또한 9(E)-옥타데세노산 2'-데옥시-2',2'-디플루오로시티딘-5'-일 에스테르(9(E)-Octadecenoic acid 2'-deoxy-2',2'-difluorocytidin-5'-yl ester)로 불림); 2'-데옥시-2',2'-디플루오로-5'-O-[9(E)-옥타데세노일]시티딘(2'-Deoxy-2',2'-difluoro-5'-0-[9(E)-octadecenoyl]cytidine); CP-4126; 또는 CAS 등록번호 제210829-30-4호); 아젤레인산 젬시타빈 에스테르 메글루민염(Azelaic acid gemcitabine ester meglumine salt)(1-[5-O(9-카복시노나노일)-β-D-아라비노퓨라노실] 사이토신 메글루민염(l-[5-0-(9-Carboxynonanoyl)-β-D-Darabinofuranosyl] cytosine meglumine salt)으로도 명명됨); 기타 아젤레인산 젬시타빈 에스테르의 염; 및 1-[4-(2-프로필펜탄아미도)-2-옥소-1H-피리미딘-1-일]-2-데옥시-2,2-디플루오로-β-D-리보퓨라노스(l-[4-(2-Propylpentanamido)-2-oxo- lH-pyrimidin-l-yl]-2-deoxy-2,2-difluoro-β-D-ribofuranose)(또한 LY-2334737로도 명명됨)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, CP-4126은 친지성(lipophilic)이고, 젬시타빈의 불포화 지방산 에스테르이다. CP-4126은 친지성으로 인하여 증가된 세포 흡수 및 축적을 나타내어 활성 대사물질로의 전환 증가를 야기한다.
기타 뉴클레오시드 유사체와 비교하여, 젬시타빈 및 이의 유도체 또는 프로드러그는 특히 고형 종양에 대해, 더 큰 항종양 활성을 나타낸다. 젬시타빈의 항종양 활성은 췌장암, 소-세포 및 비-소세포 폐암, 및 방광암에 대해 보여진 바 있다.
상대적으로 친수성 화합물인, 젬시타빈은 수동 확산을 통해 혈장으로 투과하는 데 제한된 능력을 갖는다. 따라서, 증가된 투여량 또는 주입이 요구된다. 젬시타빈 투여는 일부 부작용과 관련되어 있다. 세포독성 수준을 유지하기 위해 투여되는 투여량 또는 더 긴 주입 시간은 골수독성과 관련된 수 있으며, 상승된 간 트랜스아미나아제(liver transaminase) 효소, 오심 및 구토 및 피부 발적과 같은 유해한 효과와 관련될 수 있다.
ⅱ) 시타라빈 ( Cytarabine )
시타라빈은 본래 해면(spongy) 크립토테티야 크립타(Cryptotethya crypta)로부터 분리된 뉴클레오시드 유사체이다. 시타라빈은 아라-CTP(ara-CTP)로 인산화되는데, 이는 dCTP와 경쟁할 수 있다. 아라-CTP는 DNA 내로 통합되어 연쇄 중합(chain polymerization) 및 DNA 수선을 방해할 수 있다. 시타라빈은 시티딘 탈아미노 효소에 의해 불활화될 수 있다.
시타라빈은 혈액암(hematologic cancer)에서 주로 사용되어 왔다. 시타라빈의 합성 유도체가 개발되었고 고형 종양에 대해 효능을 나타내는 것으로 보여진 바 있다. 이는 예를 들어 젬시타빈(상기 참조)을 포함한다. 예를 들어, 시타라빈의 에스테르 유도체가 알려져 있다. 이러한 유도체의 예는 시타라빈의 5'-엘라딕산 에스테르(elaidic acid ester)인 CP-4055이다(예컨대 Breistol 외 (1999) Cancer Res., 59:2944 참조).
세포독성 효과의 충분한 수준을 유지하는 문제로 인하여, 투여되는 투여량 또는 증가된 주입 시간은 골수 억제 및 기타 특정한 조직 손상과 같은 부작용을 유발할 수 있다.
ⅲ) 데시타빈 ( Decitabine )
데시타빈(5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine), 5-아자-CdR(5-aza-CdR)은 시티딘의 피리미딘 뉴클레오시드 유사체이다. 데시타빈은 퍼아실글리코실 이소시아네이트(peracylglycosyl isocyanate)의 고리화(cyclization)에 의해 처음에 제조되었다(Pliml and Sorm (1964) Collect. Czech. Chem . Commun. 29:2576-2577). 데시타빈의 2가지 이성질체 형태(isomeric form)가 구별될 수 있다. β-이성질체(β-anomer)가 활성 형태이다. 데시타빈은 주사를 위한 멸균 동결건조 분말의 형태로, 상업적으로 판매되는 DACOGEN™ 제품의 활성 성분이다.
세포 내에서, 세포 주기의 S 기 동안 주로 합성되는 데옥시시티딘 키나제에 의해 데시타빈은 먼저 활성 형태인 인산화 5-아자-데옥시시티딘(5-aza-deoxycytidine)으로 전환된다. 데옥시시티딘 키나제의 촉매 부위에 대한 데시타빈의 친화성은 천연 기질인 데옥시시티딘과 유사하다(Momparler 외 (1985) Pharmacol Ther 30:287-299). 데옥시시티딘 키나제에 의한 트리포스페이트(triphospate) 형태로의 전환 후, 데시타빈은 천연 기질인 dCTP의 속도와 유사한 속도로 복제되는 DNA 내로 통합된다(Bouchard and Momparler (1983) Mol . Pharmacol. 24:109-114).
데시타빈의 기능 중 하나는 DNA 메틸화를 특이적이고 강력하게 억제하는 능력이다. 사이토신의 5-메틸사이토신으로의 메틸화는 DNA의 수준에서 일어난다. 데시타빈의 DNA 가닥 내로의 통합은 저메틸화 효과(hypomethylation effect)를 갖는다. 분화된 세포의 각 분류는 고유의 뚜렷한 메틸화 패턴을 갖는다. 염색체 복제(chromosomal duplication) 후, 이 패턴의 메틸화를 보존하기 위해서, 부모 가닥 상의 5-메틸사이토신은 상보적인 딸 DNA 가닥 상의 메틸화를 유도하도록 작용한다. 사이토신의 5 위치의 탄소를 질소로 치환하는 것은 이 DNA 메틸화의 정상적 과정을 방해한다. 메틸화의 특정 위치에서 데시타빈으로 5-메틸사이토신의 치환은 아마도 효소와 데시타빈 간에 공유 결합의 형성으로 인해 DNA 메틸트랜스퍼라제의 비가역적 불활화를 유발한다(Juttermann 외 (1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:11797-11801). 메틸화를 위해 요구되는 효소인 DNA 메틸트랜스퍼라제를 특이적으로 억제함으로써, 종양 억제 유전자의 비정상적 메틸화가 방지될 수 있다.
데시타빈, 특히 β-이성질체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대 미국 특허번호 제3,350,388호; 미국 특허번호 제3,817,980호; 미국 특허번호 제4,209,613호; 미국 출원 공개번호 US20120046457호; 국제 출원 공개번호 WO2008/101448호; Winkley 외 (1970) J Org Chem, 35:491-495; Piskala 외 (1978) Nucleic Acids Research, 1:s109-s114; Ben-Hattar 외 (1986) J Org Chem, 51:3211-3213 참조). 데시타빈은 당업계에 알려진 표준 방법에 의해 제형화될 수 있다. 상기 제형은 액체 또는 동결건조 제형일 수 있다. 예를 들어, 데시타빈은 종종 완충 염, 예컨대 포타슘 디하이드로진 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 및 pH 조절제, 예컨대 수산화나트륨과 함께, 주사용 멸균 동결건조 분말로서 통상적으로 공급된다. 예를 들어, 데시타빈은 SuperGen, Inc.에 의해 50 mg의 데시타빈, 일염기(monobasic) 포타슘 디하이드로진 포스페이트, 및 수산화나트륨을 포함하는 20 mL 유리 바이알에 포장된 동결건조된 분말로서 공급된다. 주사를 위해 10 mL의 멸균수로 재구성되었을 때, 각 mL은 5 mg의 데시타빈, 6.8 mg의 KH2P04, 및 대략 1.1 mg의 NaOH를 포함한다. 야기되는 용액의 pH는 6.5-7.5이다. 재구성된 용액은 차가운 주입 액체, 즉 0.9% 소디움 클로라이드(sodium chloride); 또는 5% 덱스트로스; 또는 5% 글루코스; 또는 락테이트 링거액(Lactated Ringer's)에 1.0 또는 0.1 mg/mL의 농도로 추가적으로 희석될 수 있다. 개봉되지 않은 바이알은 본래 포장 내에서, 전형적으로 냉장 하에(2-8 ℃; 36-46 ℉) 보관된다. 액체 제형이 또한 알려져 있다(예컨대 미국 특허번호 제6,982,253호 참조).
데시타빈은 시티딘 탈아미노 효소에 의해 촉매되는, 데시타빈의 5-아자-2'-데옥시유리딘(5-aza-2'-deoxyuridine)의 탈아미노화로 인해 생체내에서 짧은 반감기를 나타낸다(Chabot 외 (1983) Biochemical Pharmacology 22:1327-1328). 데시타빈의 추정된 Km은 천연 기질인 데옥시시티딘에 대한 12 μM의 Km과 비교하여 인간 간으로부터 정제된 효소에 대해 250 μM이었다. 데옥시시티딘의 탈아미노화의 속도는 같은 농도에서 시티딘 탈아미노 효소에 의한 데시타빈의 탈아미노화 속도보다 6배 더 컸다. 짧은 반감기로 인해, 데시타빈은 가장 전형적으로 주사, 예컨대 볼루스 정맥내 주사(bolus I.V. injection), 지속적 정맥내 주입(continuous I.V. infusion), 또는 정맥내 주입(I.V. infusion)에 의해 환자에게 투여된다.
정맥내 주입의 길이는 수성 용액 내의 데시타빈의 분해에 의해 제한될 수 있다. 데시타빈의 유도체는 수성 용액 내에서 보다 안정하게 존재한다(예컨대 미국 특허번호 제7,250,416호 참조).
ⅳ) 아자시티딘 ( Azacytidine )
아자시티딘, AZA, 또는 4-아미노-1-β-D-리보퓨라노실-1,3,5-트리아진-2(1H)-온(4-amino-1-β-D-ribofuranosyl-1,3,5-triazin-2(1H)-one)으로도 알려진 5-아자시티딘(국립 서비스 센터 명명 NSC-102816; CAS 등록번호 320-67-2)은 데시타빈의 유사체이다(예컨대 Hanna 외 (1998) Collect. Czech. Chem . Commun., 63:222-230 참조). 이는 현재 약물 제품 비다자(VIDAZA ®)로서 판매된다. 아자시티딘은 뉴클레오시드 유사체, 보다 자세하게는 시티딘 유사체이다. 이는 천연 뉴클레오시드의 길항제이다. 예를 들어, 아자사이토신과 사이토신의 유일한 구조적 차이점은 아자사이토신에서 사이토신 고리의 위치 5에서 사이토신의 이 위치의 탄소와 비교하여 질소 원자의 존재이다.
아자시티딘을 제조하는 방법, 특히 물의 사용을 회피하는 방법이 당업계에 알려져 있다(미국 특허번호 제3,350,388호; 미국 특허번호 제8,058,424호; Winkley and Robins (1970) J. Org . Chem., 35:491; Piskala and Sorm (1978) Nucl . Acid. Chem., 1:435; 및 Vorbrueggen 외 (1981) Chemische Berichte, 114:1234-1255 참조).
아자시티딘은 시티딘 탈아미노 효소에 대한 기질이다(예컨대 Voytek 외 (1977) Cancer Res., 37:1956-61 참조). 생체내에서 세포독성 효과를 나타내기 위해 고농도 또는 지속적 주입이 요구된다. 부작용은 특히 감소된 백혈구 및 적혈구 및 혈소판 수, 오심, 구토, 피로, 설사 및 기타 효과를 포함한다.
D. 히알루로난 분해 효소의 핵산 및 암호화 폴리펩티드를 생산하는 방법
히알루로난 분해 효소, 예컨대 본원에 기술된, 가용성 히알루로니다아제의 폴리펩티드가 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현에 대해 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 희망하는 유전자를 암호화하는 핵산의 확인을 위해 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 당업계에 이용가능한 임의의 방법은 예컨대 세포 또는 조직 기원으로부터 히알루로니다아제를 암호화하는 전장(full length)(즉, 전체 코딩 영역을 포괄하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 변형된 또는 변이체 가용성 히알루로니다아제가 예컨대 위치-지정 돌연변이에 의해 야생형 폴리펩티드로부터 조작될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산분자의 클로닝 및 분리에 대하여 당업계에서 알려진 임의의 이용가능한 방법들을 이용하여 클로닝되거나 분리될 수 있다. 이러한 방법들은 핵산의 PCR 증폭, 및 핵산 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함한, 라이브러리 스크리닝을 포함한다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함한, 핵산의 증폭방법은 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 분리하는데 사용될 수 있다. 핵산 포함 재료는 원하는 폴리펩티드-암호화 핵산분자가 분리될 수 있는 출발재료로써 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포추출물, 조직추출물, 액체시료(예컨대, 혈액, 혈청, 타액), 건강한 대상 및/또는 병에 걸린 대상의 시료가 증폭방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발재료의 기원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현된 서열을 기초로 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기초로 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산분자를 시퀀싱하여 원하는 폴리펩티드를 암호화하는지 확인할 수 있다.
벡터, 예를 들어 단백질 발현벡터, 또는 DNA 서열을 코딩하는 핵심 단백질의 증폭을 위하여 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 링커서열을 포함하는, 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정하는 추가 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-암호화 핵산분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하는 분비서열, 예를 들어 이종(heterologous) 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 서열은 당업자에게 알려져 있다. 추가 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합영역을 특정화하는 염기의 서열이 또한 효소-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 상기 영역은 특정 표적세포 내로 효소 흡수(uptake)를 용이하게 하는 단백질을 촉진하거나 암호화하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자 산물의 약동학을 변화시키는 잔기서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 효소는 PEG 모이어티(moiety)에 연결될 수 있다.
또한, 예를 들어, 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제(affinity purification)를 돕기 위한 태그 또는 다른 모이어티가 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가 핵산 잔기서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 다른 검출가능한 마커를 특정화하는 염기서열이 또한 효소-암호화 핵산분자에 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 His 태그(예컨대, 6xHis, HHHHHH; 서열번호 54) 또는 Flag 태그(DYKDDDDK; 서열번호 55)를 암호화하는 핵산서열을 포함한다.
그다음 확인되고 분리된 핵산이 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당해 기술분야에서 알려진 많은 벡터-숙주 시스템들이 이용될 수 있다. 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 아니하나, 벡터 시스템은 사용된 숙주세포에 적합(compatible)해야만 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체, 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)와 같은 플라스미드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 발현벡터는 본원에서 예시된 HZ24 발현벡터를 포함한다. 클로닝 벡터 내로의 삽입은, 예를 들어 상보성 점착종단(cohesive termini)을 가지는 클로닝 벡터 내로 DNA 절편을 연결(ligation)함으로써 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(INVITROGEN, Carlsbad, CA)를 이용하여 행해질 수 있다. 만약 DNA 단편화에 사용된 상보적 제한부위(restriction sites)가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결함으로써 원하는 임의의 부위가 제조될 수 있다; 이러한 연결된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식서열을 암호화하는, 특정한, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 호모폴리머 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공(electroporation) 및 초음파천공(sonoporation)을 통해 숙주세포 내로 도입되어, 많은 카피(copy)의 유전자 서열을 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 통합한 재조합 DNA 분자로 숙주세포를 형질전환하는 것은 상기 유전자의 복수카피의 생성을 가능케 한다. 따라서, 형질전환체를 성장시키고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 분리하고, 필요한 경우 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써, 상기 유전자가 다량으로 획득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 원하는 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드의 재조합 발현을 위하여, 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산이 적절한 발현벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 포함하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 필수 전사 및 번역 신호가 또한 효소 유전자용 본래 프로모터, 및/또는 이들의 인접부위에 의해 제공될 수 있다.
또한 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터를 포함하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵 및 원핵세포를 포함하며, 벡터는 그안에 사용하기 적합한 임의의 것이다.
상기 벡터를 포함하는, 내피세포를 포함하는 원핵 및 진핵세포가 제공된다. 이러한 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균세포, 고세포(Archea), 식물세포, 곤충세포 및 동물세포를 포함한다. 암호화된 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기-기술된 세포를 성장시키고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 상기 세포를 이용하여 이들의 단백질을 생산한다. 본원의 목적을 위하여, 예를 들어, 효소가 배지 내로 분비될 수 있다.
고유의 또는 이종의 신호 서열에 연결된, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드, 일부 경우 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 이들의 복수카피를 포함하는 벡터가 제공된다. 세포 내에서 효소 단백질의 발현을 위하여, 또는 상기 효소 단백질이 분비성 단백질로서 발현되도록 벡터를 선택할 수 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예컨대, 백시니아바이러스(vaccinia virus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 다른 바이러스)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예컨대, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 포함하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현요소는 그들의 강도 및 특이성에서 다르다. 사용된 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 번역요소 중에서 임의의 하나가 사용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터 내로 삽입하기 위한 당업자에 알려진 임의의 방법들이 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 코딩 서열을 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 발현벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법, 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산서열, 또는 도메인, 유도체, 단편, 또는 이의 동족체(homologs)의 발현이 제2 핵산서열에 의해 조절됨으로써, 이의 유전자 및 단편이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 단백질 발현은 해당 기술분야에서 알려진 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 고유한 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: SV40 초기 프로모터(early promoter)(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310(1981)), 라우스육종(Rous sarcoma) 바이러스의 3' 장 말단반복(long terminal repeat) 내에 포함된 프로모터(Yamamoto 외, Cell 22:787-797(1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1441-1445(1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절서열(Brinster 외, Nature 296:39-42(1982)); 원핵생물 발현벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay 외,(1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:5543) 또는 택(tac) 프로모터(DeBoer 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25(1983)); 또한 [Scientific American 242:79-94(1980)] 내 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria" 참조; 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 프로모터를 포함하는 식물 발현벡터(Herrar-Estrella 외, Nature 303:209-213(1984)) 또는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 35S RNA 프로모터(Gardner 외, Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카복실라제(ribulose bisphosphate carboxylase)의 프로모터(Herrera-Estrella 외, Nature 310:115-120(1984)); 효모 및 다른 진균 유래 프로모터 요소, 예컨대 Gal4 프로모터, 알코올 데하이드로지나아제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 및 조직특이성을 보이고 유전자 이식(transgenic) 동물에서 사용되어온 다음의 동물 전사조절부위: 췌장 포상세포(pancreatic acinar cells)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절영역(Swift 외, Cell 38:639-646(1984); Ornitz 외, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . 50:399-409(1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515(1987)); 췌장 베타세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan 외, Nature 315:115-122(1985)), 림프계 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl 외, Cell 38:647-658(1984); Adams 외, Nature 318:533-538(1985); Alexander 외, Mol . Cell Biol . 7:1436-1444(1987)), 고환, 유방, 림프계 및 비만세포에서 활성인 마우스 유선암 바이러스 조절 영역(Leder 외, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinckert 외, Genes and Devel. 1:268-276(1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백질(fetoprotein) 유전자 조절영역(Krumlauf 외, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648(1985); Hammer 외, Science 235:53-58(1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절 영역(Kelsey 외, Genes and Devel. 1:161-171(1987)), 골수세포에서 활성인 베타글로빈 유전자 조절 영역(Magram 외, Nature 315:338-340(1985); Kollias 외, Cell 46:89-94(1986)), 뇌의 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)에서 활성인 수초염기성단백질(myelin basic protein) 유전자 조절영역(Readhead 외, Cell 48:703-712(1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절영역(Shani, Nature 314:283-286(1985)), 및 시상하부의 성선자극세포(gonadotrophs)에서 활성인 성선자극호르몬 분비호르몬(Mason 외, Science 234:1372-1378(1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질 또는 도메인, 이들의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제기점 및 선택적으로 하나 이상의 선별마커(예컨대, 항생제 저항성(resistance) 유전자)를 포함하는 벡터가 사용된다. E . coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 예는 예를 들어, pQE 발현벡터(Qiagen, Valencia, CA에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Qiagen에 의해 공개된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 E. coli에서 엄격하게 조절되는, 재조합 단백질의 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합부위(RBS II), 6XHis 태그 코딩서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제기점, 및 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 가진다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 상기 플라스미드는 세개의 판독프레임 모두를 위한 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)를 제공하고, N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 가능하게 하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31을 포함한다. E . coli 세포의 형질전환용 플라스미드 벡터의 다른 예는, 예를 들어, pET 발현벡터(미국특허번호 제4,952,496호 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 입수가능; 또한 상기 시스템을 설명하는 Novagen에서 공개된 문헌 참조)를 포함한다. 상기 플라스미드는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터 및 lac 억제유전자를 포함하는 pET11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 E. coli ompT 분비 신호를 포함하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제에서 사용하기 위한 His-TagTM 리더서열, 및 컬럼을 통한 정제후 절단을 가능케 하는 트롬빈 절단부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 터미네이터를 포함하는 pET 15b와 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
포유류 세포 발현용 벡터의 예는 HZ24 발현벡터이다. HZ24 발현벡터는 pCI 벡터 백본(Promega)로부터 유래되었다. 이는 베타-락타마제 저항성 유전자(AmpR)를 암호화하는 DNA, F1 복제기점, 사이토메갈로바이러스의 극-초기(immediate-early) 인핸서/프로모터 부위(CMV) 및 SV40 후기(late) 폴리아데닐화 신호(SV40)를 포함한다. 상기 발현벡터는 또한 ECMV 바이러스(Clontech)의 내부 리보솜 도입부위(Internal Ribosome Entry Site, IRES) 및 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자를 가진다.
2. 발현
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 포함한, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 방법을 포함한 당업자에게 알려진 임의의 방법들에 의하여 생산될 수 있다. 원하는 단백질은 예컨대 투여 및 치료에 필요한, 상기 단백질의 요구되는 양 및 형태를 생산하기에 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현숙주는 진핵생물 및 원핵생물 유기체, 예컨대 E. coli, 효모, 식물, 곤충세포, 인간 세포주 및 유전자 이식 동물을 포함한 포유류 세포를 포함한다. 발현숙주는 그 단백질 생산 수준 뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역후 변형의 형태에서 상이하다. 발현숙주는 상기 및 기타 요인들, 예컨대 규제 및 안전성 고려사항, 생산비용 및 정제 필요성과 방법에 기초하여 선택될 수 있다.
많은 발현벡터들이 이용가능하고, 당업자에게 알려져 있으며, 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 발현벡터의 선택은 숙주발현시스템의 선택에 의해 영향받을 것이다. 일반적으로, 발현벡터는 전사 프로모터와 선택적으로 인핸서, 번역 신호, 및 전사와 번역의 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현벡터는 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케하는 선별마커를 전형적으로 가진다. 일부 경우, 벡터의 카피수를 증폭시키기 위해 복제기점이 이용될 수 있다.
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드는 또한 단백질 융합으로서 활용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소융합은 효소에 추가 기능성을 부가하도록 생성될 수 있다. 효소융합 단백질의 예는 신호 서열, 예컨대 국소화(localization)용 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예를 들어 GST 융합, 그리고 단백질 분비 및/또는 막 연합을 지시하는 서열의 융합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
a. 원핵세포
원핵생물, 특히 E. coli는 대량의 단백질을 생산하기 위한 시스템을 제공한다. E . coli의 형질전환은 당업자에게 잘 알려진 간단하고 신속한 기술이다. E . coli용 발현벡터는 유도성 프로모터를 포함할 수 있고, 이러한 프로모터는 고수준의 단백질 발현 유도 및 숙주세포에 어떤 독성을 나타내는 단백질 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 lac 프로모터, trp 프로모터, 혼성 tac 프로모터, T7과 SP6 RNA 프로모터 및 온도로 조절되는 λPL 프로모터를 포함한다.
단백질, 예컨대 본원에서 제공되는 임의의 것은 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 상기 세포질은 환원성 환경이고, 일부 분자에 대하여, 이는 불용성 봉입체(inclusion bodies) 형성을 야기할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올 및 변성화제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 요소가 단백질을 재용해하는데 사용될 수 있다. 대안적 접근법은 산화성 환경 및 샤페로닌-유사의 디설파이드 이소머라제(disulfide isomerases)를 제공하여, 가용성 단백질의 생산을 야기할 수 있는, 박테리아의 주변세포질공간(periplasmic space) 내 단백질 발현이다. 전형적으로, 주변세포질로 단백질을 유도하는 리더서열이 발현되는 단백질에 융합된다. 이어서, 상기 리더는 주변세포질 내 신호 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적 리더서열의 예는 펙테이트 리아제 유전자의 pelB 리더 및 알칼라인 포스파타제 유전자 유래 리더를 포함한다. 일부 경우, 주변세포질 발현은 배양배지 내로 발현된 단백질의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 신속하고 간단한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투압성 용해에 의해 주변세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우 단백질은 불용성이 되며, 재용해 및 재-접힘(refolding)을 촉진하기 위해 변성화제와 환원제를 사용할 수 있다. 유도 및 성장 온도는 또한 발현수준 및 가용성에 영향을 줄 수 있으며, 전형적으로 25℃와 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 전형적으로, 박테리아는 탈글리코실화된(aglycosylated) 단백질을 생산한다. 따라서, 만약에 단백질이 기능하는데 글리코실화를 필요로 한다면, 숙주세포로부터 정제후 시험관내에서 글리코실화가 부가될 수 있다.
b. 효모 세포
효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 아료위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 패스토리스(Pichia pastoris)가 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것의 생산에 사용될 수 있는 잘 알려진 효모 발현숙주이다. 효모는 에피솜 복제 벡터 또는 동종성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해서 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유도성 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용된다. 이러한 프로모터의 예는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 다른 피치아(Pichia), 또는 다른 효모 프로모터를 포함한다. 발현벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선별 및 유지를 위한 선별마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이다. 샤페로닌, 예컨대 Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라제와 공동-발현은 발현수준 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 신호 펩티드 융합, 예컨대 사카로마이세스 세레비제의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호, 및 효모 세포표면 단백질, 예컨대 Aga2p 교배 부착수용체(mating adhesion receptor) 또는 아르술라 아데니니보란스(Arxula adreninivorans) 글루코아밀라제와 융합을 이용하여 분비되도록 유도될 수 있다. Kex-2 프로테아제와 같은 프로테아제 절단부위는 분비경로를 탈출시, 발현된 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거되도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충세포
특히 배큘로바이러스 발현을 이용하는, 곤충세포는 폴리펩티드, 예컨대 히알루로니다제 폴리펩티드의 발현에 유용하다. 곤충세포는 고수준의 단백질을 발현하고, 고등 진핵생물에 의해 이용되는 번역-후 변형 대부분이 가능하다. 배큘로바이러스는 안전성을 개선하고, 진핵발현의 조절 우려(regulatory concerns)를 감소시키는 제한성 숙주범위를 가진다. 전형적인 발현벡터는 고수준 발현을 위한 프로모터, 예컨대 배큘로바이러스의 다각체(polyhedrin) 프로모터를 사용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcNPV), 및 누에나방(Bombyx mori) 핵다각체병 바이러스(BmNPV) 및 곤충세포주, 예컨대 도둑나방(Spodoptera frugiperda), 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 제왕나비(Danaus plexippus)(DpN1)에서 유래된 Sf9를 포함한다. 고수준의 발현을 위하여, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 다각체 개시코돈의 바로 하류에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충세포에서 정확히 처리되고, 발현된 단백질을 배양배지 내로 분비하기 위하여 이용될 수 있다. 또한, 세포주 멸강나방(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 곤주나비(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 생산한다.
곤충세포에서 대체 발현시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 Schneider 2(S2) 및 Kc 세포(Drosophila melanogaster) 및 C7 세포(Aedes albopictus)가 발현에 사용될 수 있다. 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 이용하여 카드뮴 또는 구리로 중금속 유도 존재 하 고수준의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다. 발현벡터는 선별마커, 예컨대 네오마이신 및 하이그로마이신을 사용하여 전형적으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현 시스템은 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드와 같은 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드를 포함하는, 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물(constructs)은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염, 또는 리포좀, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 전달, 및 전기천공과 미세주입과 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 전달될 수 있다. 포유류 세포용 발현벡터는 전형적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 번역개시서열(코작(Kozak) 공통서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 다른 유전자, 예컨대 선별마커를 이용한 바이시스트로닉(bicistronic) 발현을 가능케 하도록 부가될 수 있다. 상기 벡터는 종종 고수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스육종 바이러스(RSV)의 장 말단반복(long terminal repeat)을 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포 유형에서 활성이다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 부위가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 프로모터/인핸서 영역의 예는 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유선종양 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질(fetoprotein), 알파 1 항트립신, 베타글로빈, 수초염기성단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극호르몬 분비호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 것들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선별마커는 발현 구축물을 가진 세포를 선별하고 유지하는데 사용될 수 있다. 선별마커 유전자의 예는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 탈아미노 효소, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 메토트렉세이트 존재하에 발현을 수행하여 DHFR 유전자를 발현하는 세포만을 선별할 수 있다. 세포표면 신호 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와 융합은 세포표면에서 활성상태인 단백질 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 많은 세포주가 포유류 발현에 이용가능하다. 세포주의 예는 CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비성) 및 다른 골수종(myeloma) 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 세포배양 배지로부터 분비된 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 적응된 세포주 또한 이용가능하다. 예는 CHO-S 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, cat# 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham 외,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42)를 포함한다. 최대발현을 위해 최적화된 특별 배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규명된, 동물 산물이 없는 배지 내 현탁 배양물에서 성장하도록 적응되어 있다.
e. 식물
유전자 이식 식물세포 및 식물이 단백질, 예컨대 본원에서 기술된 임의의 것을 발현하는데 이용될 수 있다. 발현 구축물은 전형적으로 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질체 내로의 PEG-매개 전달과 같은 직접적 DNA 전달을 이용하여, 그리고 아그로박테리움-매개 형질전환으로 식물로 전달될 수 있다. 발현벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사종결요소 및 번역조절요소를 포함할 수 있다. 발현벡터 및 형질전환 기술은 보통 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 애기장대(Arabidopsis)와 담배(tobacco), 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 사이에서 나뉜다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예는 컬리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 리보스비스포스페이트 카복실라제 프로모터, 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 선별마커, 예컨대 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제가 종종 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물세포는 세포, 응집체(캘러스 조직)로서 배양물 내 유지되거나 전체식물로 재생될 수 있다. 유전자 이식 식물세포는 또한 히알루로니다아제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지므로, 이는 이들 숙주 내에서 생산되는 단백질 선택에 영향을 미칠 수 있다.
3. 정제기술
숙주세포로부터, 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드) 또는 다른 단백질을 포함하는 폴리펩티드의 정제방법은 선택된 숙주세포 및 발현시스템에 좌우될 것이다. 분비된 분자에 대하여, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현을 위하여, 세포는 용해되고, 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 유전자 이식 유기체, 예컨대 유전자 이식 식물 및 동물이 발현을 위해 사용될 때, 용해된 세포추출물을 만들기 위하여 조직 또는 기관이 출발재료로써 사용될 수 있다. 또한, 유전자 이식 동물 생산은 젖 또는 알에서 폴리펩티드 생산을 포함할 수 있으며, 이는 수집되어, 필요하다면, 상기 단백질이 추출되고, 당해 기술분야의 표준방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 SDS-PAGE, 크기분획(size fraction) 및 크기배제(size exclusion) 크로마토그래피, 암모늄 술페가트 침전, 및 이온교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당해 기술분야에 알려진 표준 단백질 정제기술을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제기술 또한 제제의 효율 및 순도를 개선시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 수용체 및 히알루로니다아제 효소에 결합하는 기타 분자가 친화성 정제에서 이용될 수 있다. 발현 구축물은 또한 단백질, 예컨대 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6에 친화성 태그를 부가하도록 조작되고, myc 항체, 글루타치온 레진 및 Ni-레진으로 각각 친화성 정제될 수 있다. 겔 전기영동 및 염색 및 분광광도기술을 포함한, 당해 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 순도가 평가될 수 있다. 본원에 제공된, 정제된 rHuPH20 조성물은 전형적으로 적어도 70,000 내지 100,000 유닛/mg, 예를 들어 약 120,000 유닛/mg의 비활성을 갖는다. 비활성은 변형, 예컨대 폴리머로의 변형에 따라 다양할 수 있다.
4. 히알루로난 분해 효소 폴리펩티드의 PEG화
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 PEG가 전형적으로 비면역원성인 생체적합성, 무독성, 및 수용성 폴리머이기 때문에 생체적합재료, 생명공학 및 약물에서 널리 사용되어 왔다 (Zhao and Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). 약물 전달 영역에서 PEG 유도체는 단백질과의 공유적 부착(즉, PEG화)에 널리 사용되어 단백질의 면역원성, 단백질분해 및 신장 클리어런스를 감소시키고 가용성을 개선시킨다(Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). 마찬가지로, PEG는 저분자량의, 상대적으로 소수성인 약물에 부착되어 가용성을 증가시키고 독성을 감소시키고 생체내분포를 변화시킨다. 일반적으로 PEG화 약물은 용액으로서 주입된다.
분해성 및 가용성 약물 담체의 설계에서 사용된 많은 동일한 화학이 분해성 겔의 설계에서도 사용될 수 있기 때문에 약물전달에 사용하기 위한 가교결합된 분해성 PEG망의 합성 또는 제형화에 밀접하게 관련된다(Sawhney 외, Macromolecules 26: 581-87, 1993). 고분자간 복합체는 2개의 상보적 폴리머의 용액을 혼합함으로써 형성될 수 있다. 이러한 복합체는 일반적으로 관련 폴리머 사이에 정전기적 상호작용(다가음이온-다가양이온) 및/또는 수소결합(다가산-다가염기) 및/또는 수성 환경에서 폴리머 사이에 소수성 상호작용에 의해 안정화된다(Krupers 외., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996). 예를 들면, 적당한 조건하에서 다가아크릴산(PAAc)과 폴리에틸렌 옥사이드(PEO)의 혼합용액은 대부분 수소결합에 기초한 복합체를 형성시킨다. 생리적 조건에서 이들 복합체의 해리는 유리 약물(즉, 비-PEG화된 약물)의 전달을 위해 사용되고 있다. 또한, 상보적인 폴리머의 복합체는 호모폴리머와 코폴리머로부터 형성된 바 있다.
PEG화용 수많은 시약이 당업계에 기술되어 있다. 이러한 시약은 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 활성화 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-하이드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카복시메틸 3-하이드록시부탄산 숙신이미딜 에스테르, 호모 2관능성 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 호모 2관능성 PEG 프로피온 알데히드, 호모 2관능성 PEG 부티르알데히드, PEG 말레이미드, PEG 하이드라지드, p-니트로페닐 카보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카보네이트, 프로피온알데히드 PEG, mPEG 부티르알데히드, 분지 mPEG2 부티르알데히드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커없는" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 티올, mPEG 오르쏘피리딜티오에스테르, mPEG 오르쏘피리딜 디설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS 및 바이오틴 PEG-NHS(예를 들면, Monfardini 외, Bioconjugate Chem . 6:62-69, 1995; Veronese 외, J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S.5,672,662호; U.S.5,932,462호; U.S.6,495,659호; U.S.6,737,505호; U.S.4,002,531호; U.S.4,179,337호; U.S.5,122,614호; U.S.5,324,844호; U.S.5,446,090호; U.S.5,612,460호; U.S.5,643,575호; U.S.5,766,581호; U.S.5,795,569호; U.S.5,808,096호; U.S.5,900,461호; U.S.5,919,455호; U.S.5,985,263호; U.S.5,990,237호; U.S.6,113,906호; U.S.6,214,966호; U.S.6,258,351호; U.S.6,340,742호; U.S.6,413,507호; U.S.6,420,339호; U.S.6,437,025호; U.S.6,448,369호; U.S.6,461,802호; U.S.6,828,401호; U.S.6,858,736호; U.S. 2001/0021763호; U.S. 2001/0044526호; U.S. 2001/0046481 호; U.S. 2002/0052430호; U.S. 2002/0072573호; U.S. 2002/0156047호; U.S. 2003/0114647호; U.S. 2003/0143596호; U.S. 2003/0158333호; U.S. 2003/0220447호; U.S. 2004/0013637호; U.S. 2004/0235734호; WO 0500360호; U.S. 2005/0114037호; U.S. 2005/0171328호; U.S. 2005/0209416호; EP01064951 호; EP0822199호; WO 00176640호; WO 0002017호; WO 0249673호; WO 9428024호; 및 WO 0187925호)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 예에서, 폴리에틸렌글리콜은 약 3 kD 내지 약 50 kD, 전형적으로 약 5 kD 내지 약 30 kD의 범위의 분자량을 갖는다. 약물에 PEG의 공유적 부착(PEG화라고 알려진)은 공지의 화학적 합성기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 PEG화는 적합한 반응조건하에서 NHS-활성화된 PEG와 단백질을 반응시킴으로써 달성될 수 있다.
수많은 반응은 PEG화에 대해 기재되어 있지만, 일반적으로 적용할 수 있는 것은 방향성을 제공하고 온화한 반응조건을 이용하고 독성 촉매 또는 부산물을 제거하기 위한 광범위한 하류처리는 필요로 하지 않는다. 예를 들면, 모노메톡시 PEG(mPEG)는 단지 하나의 반응성 말단 하이드록실을 가지므로 그 이용은 얻어진 PEG 단백질 산물 혼합물의 일부의 불균질물을 제한한다. 친핵성 공격에 민감한 유도체합성된 PEG를 만들 목적으로 말단 메톡시기와 반대의 폴리머의 말단에서 하이드록실기의 활성화가 일반적으로 효율적인 단백질 PEG화를 달성하기 위해 필수적이다. 공격성 친핵제는 보통 라이실잔기의 엡실론-아미노기이지만 국소조건이 바람직하다면 다른 아민이 반응할 수 있다(예를 들면, 히스티딘의 N-말단 알파 아민 또는 고리 아민). 더욱 유도된 부착은 단일 라이신 또는 시스테인을 포함하는 단백질에서 가능하다. 후자의 잔기는 티올 특이적 변형에 대한 PEG-말레이미드에 의해 표적이 될 수 있다. 또한, PEG 하이드라지드는 과요오드산(periodate) 산화된 히알루로난 분해 효소와 반응하고 NaCNBH3의 존재하에서 환원된다. 보다 구체적으로, PEG화 CMP 당은 적절한 글리코실 트랜스퍼라제의 존재하에서 히알루로난 분해 효소와 반응할 수 있다. 하나의 기술은 문제의 폴리펩티드에 많은 폴리머 분자가 결합되는 "PEG화" 기술이다. 이 기술을 사용하면 면역 시스템은 항체의 형성을 담당하는 폴리펩티드 표면에 에피토프를 인지하는 데에 어려움을 가지며 이에 의해 면역반응을 감소시킨다. 특별한 생리적 효과를 제공하기 위해 인체의 순환계에 직접적으로 도입된 폴리펩티드(즉 약제학적 제제)에 대해, 전형적인 가능한 면역반응은 IgG 및/또는 IgM 반응이지만 호흡계를 통해 흡입된 폴리펩티드(즉, 산업용 폴리펩티드)는 IgE 반응(즉 알러지)을 일으킬 수 있다. 감소된 면역반응을 설명하는 이론 중 하나는 중합성 분자가 항체 형성을 야기하는 면역반응을 담당하는 폴리펩티드의 표면의 에피토프를 차폐하는 것이다. 다른 이론 또는 적어도 부분적인 인자는 컨주게이트가 무거울수록 감소된 면역반응이 얻어진다는 것이다.
전형적으로, PEG화 히알루로니다아제를 포함하는 본원에서 제공된 PEG화 히알루로난 분해 효소를 제조하기 위해, PEG화 모이어티는 폴리펩티드에 공유적 부착을 통해 부착된다. PEG화 기술은 특별한 링커 및 커플링 화학(예를 들면 Roberts 외, Adv . Drug Deliv . Rev. 54:459-476, 2002 참조), 단일 컨주게이션부위에 다중 PEG 모이어티를 부착(예를 들면 분지 PEG를 사용하여; 예컨대 Guitto 외., Bioorg . Med. Chem . Lett . 12:177-180, 2002), 부위 특이적 PEG화 및/또는 모노PEG화(Chapman 외, Nature Biotech. 17:780-783, 1999 참조), 및 위치-지정 효소 PEG화(예컨대 Sato, Adv . Drug Deliv . Rev., 54:487-504, 2002 참조)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 종래에 기재된 방법 및 기술은 단일 단백질 분자에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 초과 PEG 또는 PEG 유도체를 갖는 단백질을 생산할 수 있다(예컨대 U.S. 2006/0104968호 참조).
PEG화 히알루로난 분해 효소, 예를 들면 PEG화 히알루로니다아제를 제조하기 위한 PEG화 방법의 예시로서, PEG 알데히드, 숙신이미드 및 카보네이트는 PEG 모이어티, 전형적으로 숙신이미딜 PEG를 rHuPH20에 컨주게이션하는데 적용되어 왔다. 예를 들면, rHuPH20은 mPEG-숙신이미딜 프로피오네이트(mPEG-SPA), mPEG-숙신이미딜 부타노에이트(mPEG-SBA), 및 ("분지"PEG 부착용)mPEG-N-하이드록시숙신이미드를 포함하는 예시의 숙신이미딜 모노PEG(mPEG) 시약과 컨주게이션되어 있다. 이들 PEG화 숙신이미딜 에스테르는 PEG기와 활성화 가교 링커 사이에 다른 길이의 탄소골격, 및 단일 또는 분지 PEG기 중의 어느 하나를 포함한다. 이러한 차이는, 예를 들면 컨주게이션처리 중 다른 반응역학을 가능하게 하고 rHuPH20에 PEG 부착에 이용가능한 부위를 잠재적으로 제한하는데 사용될 수 있다.
(상기 기재된)선형 또는 분지 PEG 중 어느 하나를 포함하는 숙신이미딜 PEG는 rHuPH20에 컨주게이션될 수 있다. PEG는 히알루로니다아제 당 평균 약 3개 내지 6개의 PEG 분자를 갖는 분자의 조합물을 포함하는 rHuPH20을 재생산적으로 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 PEG화 rHuPH20 조성물은 용이하게 정제되어 대략 25,000 또는 30,000 유닛/mg 단백질 히알루로니다아제 활성의 비활성도를 갖고 실질적으로 비-PEG화 rHuPH20가 없는(5% 비PEG화 미만) 조성물을 생산할 수 있다.
각종 PEG 시약을 사용하여, 히알루로난 분해 효소의 예시 버전, 특히 가용성 인간 재조합 히알루로니다아제(예를 들면, rHuPH20)는 예를 들면 mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), 및 mPEG2-NHS (40 kD), mPEG2-NHS (60 kD)에 기초한 분지형을 사용하여 제조할 수 있다. rHuPH20의 PEG화 형태는 NHS 약물 및 카보네이트 및 알데히드를 사용하고 하기의 각각의 시약을 사용하여 제조되고 있다: mPEG2-NHS-40K 분지형, mPEG-NHS-lOK 분지형, mPEG-NHS-20K 분지형, mPEG2-NHS-60K 분지형; mPEG-SBA-5K; mPEG-SBA-20K; mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K; mPEG-SMB-30K; mPEG-부티르알데히드; mPEG-SPA-2OK; mPEG-SPA-30K; 및 PEG-NHS-5K-바이오틴. PEG화 히알루로니다아제는 Dowpharma의 p-니트로페닐 카보네이트 PEG(30kDa) 및 프로피온알데히드 PEG(30kDa)로 PEG화된 히알루로니다아제를 포함하는 Dow Chemical Corporation의 사업부인 Dowpharma로부터 시판된 PEG화 시약을 사용하여 제조되었다.
일 예에서, PEG화는 mPEG-SBA, 예를 들면 mPEG-SBA-30K(약 30Kda의 분자량을 갖는) 또는 다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르의 가용성 히알루로니다아제에 대한 컨주게이션을 포함한다. PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K는 단백질의 아미노기에 용이하게 결합한다. 예를 들면, m-PEG-SBA-30K 및 rHuPH20의 공유적 컨주게이션(크기가 대략 60KDa임)은 하기 반응식 1에서 나타낸 rHuPH20와 mPEG 사이의 안정한 아미드 결합을 제공한다.
반응식 1:
Figure 112016024482551-pat00007
전형적으로 mPEG-SBA-30K 또는 다른 PEG를 히알루로난 분해 효소, 일부 예에서, 히알루로니다아제에, 적합한 완충액, 예를 들면 pH 6.8에서 130 mM NaCl/10mM HEPES 또는 70 mM 포스페이트 완충액, pH 7 중에서 10:1의 PEG:폴리펩티드 몰비로 첨가하고, 이어서 멸균화, 예를 들면 멸균여과를 실시하고, 예를 들면 밤새동안 4℃에서 냉각실에서 교반하면서 계속된 컨주게이션을 실시한다. 일 예에서, 컨주게이션된 PEG-히알루로난 분해 효소는 농축되고 완충액-교환된다.
다른 PEG 부탄산 유도체의 숙신이미딜 에스테르, 예를 들면 mPEG-SBA-30K를 결합하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대 U.S.5,672,662호; U.S.6,737,505호; 및 U.S.2004/0235734호 참조). 예를 들면, 폴리펩티드, 예를 들면 히알루로난 분해 효소(예를 들면, 히알루로니다아제)는 붕산 완충액(0.1M, pH 8.0) 중에서 4℃에서 1시간 동안 반응하여 NHS 활성화된 PEG 유도체에 결합될 수 있다. 야기되는 PEG화된 단백질은 초여과에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 소 알칼라인 포스파타제의 PEG화는 4℃에서 30분간 0.2M 소디움 포스페이트와 0.5M NaCl(pH 7.5)를 포함하는 완충액중에서 포스파타제를 mPEG-SBA와 혼합함으로써 달성될 수 있다. 미반응된 PEG는 초여과에 의해 제거될 수 있다. 다른 방법은 폴리펩티드를, 트리에틸아민을 첨가하여 pH를 7.2-9로 상승시킨 탈이온수 중에서 mPEG-SBA와 반응시킨다. 야기되는 혼합물은 수시간동안 실온에서 교반하여 PEG화를 완성한다.
히알루로난 분해 폴리펩티드의 PEG화를 위한 방법은 예를 들어 동물-유래 히알루로니다아제 및 박테리아 유래 히알루로난 분해 효소를 포함하여, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 소 고환 히알루로니다아제 및 콘드로이틴 ABC 리아제(chondroitin ABC lyase)를 기술하는 유럽 특허번호 EP0400472호를 참조하라. 또한, 미국 공개번호 제2006014968호는 인간 PH20으로부터 유래된 인간 히알루로니다아제의 PEG화를 기술한다. 예를 들어, PEG화된 히알루로난-분해 효소는 분자 당 일반적으로 적어도 3개의 PEG 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 히알루로난-분해 효소는 5:1 내지 9:1, 예컨대 7:1의 단백질에 대한 PEG의 몰비를 가질 수 있다.
E. 약제학적 조성물 및 제형
본원에서 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산 제형의 조성물 또는 조합물이 제공된다. 예를 들어, 본원에서 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적 탁산 제형의 조성물 또는 조합물이 제공된다. 탁산 제형은 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물과 공동-제형화 또는 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 조합물 및 조성물은 본원에서 기술되는 바와 같이 고형 종양을 포함하는 암의 치료에서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 히알루로난-분해 효소와 같은 항-히알루로난 제제는 별개로 투여되는 별개의 조성물의 조합물로서 제공될 수 있다. 다른 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및 탁산은 동일한 조성물 내에 제공될 수 있고 함께 투여될 수 있다. 조성물 또는 조성물의 조합물은 비경구적 전달(즉 전신적 전달을 위해)을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 조성물의 조합물은 피하 전달 또는 정맥내 전달을 위해 제형화된다.
또한 본원에서 암을 치료하기 위한 추가적인 화학치료제인 제3제제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체 또는 기타 항대사물질(예컨대 젬시타빈 또는 유도체 또는 기타 뉴클레오시드 유사체)을 포함하는 조합물 및 조성물이 제공된다. 이러한 제제의 예는 상기 및 본원의 다른 곳에서 기술된다. 추가적인 화학치료제, 예컨대 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소를 포함하는 조성물, 및/또는 종양-표적화 탁산을 포함하는 조성물과 공동-제형화되거나 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 화학치료제, 예를 들어 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소 및 탁산의 조합물 및 조성물로부터 별개의 조성물로서 제공될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예를 들어 히알루로난-분해 효소, 및 탁산의 하나 또는 둘 다와 공동-제형화될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및 종양-표적 탁산과 공동-제형화되고, 종양-표적 탁산은 별개의 조성물로서 제공된다. 또 다른 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 종양-표적 탁산과 공동-제형화되고 항-히알루로난 제제, 예를 들어 히알루로난-분해 효소는 별개의 조성물로서 제공된다. 추가적인 예로서, 뉴클레오시드 유사체, 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산은 동일한 조성물 내에 함께 공동-제형화된다. 조성물 또는 조성물의 조합물은 비경구적 전달(즉, 전신적 전달을 위해)을 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 조성물의 조합물은 피하 전달을 위해 또는 정맥내 전달을 위해 제형화된다.
조성물은 단일 투여량 투여를 위해 또는 다중 투여량 투여를 위해 제형화될 수 있다. 제제는 직접 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 액체 또는 동결건조된 제형으로서 제공될 수 있다.
상기 화합물은 적절한 약제학적 제제, 예컨대, 경구 투여를 위한, 용액, 현탁액, 정제, 분산정(dispersible tablets), 환제(pills), 캡슐, 분말, 지연방출 제형 또는 엘릭시르(elixirs) 뿐만 아니라, 경피전달 패치 제제 및 건조분말 흡입제로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 상기 화합물은 당해 기술분야에서 잘 알려진 기술 및 절차를 이용하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다(예컨대, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126 참조). 일반적으로, 제형화 방식은 투여 경로의 함수이다. 상기 조성물은 공동-제형화되거나, 별개의 조성물로서 제공될 수 있다.
일반적으로, 조성물은 동결건조 또는 액체 형태로 제형화된다. 조성물이 동결건조된 형태로 제공되는 경우, 이들은 사용 직전에 적당한 완충액, 예를 들어 멸균 식염수 용액에 재구성될 수 있다. 상기 조성물은 함께 또는 따로 제공될 수 있다. 본원의 목적을 위해, 상기 조성물들은 전형적으로 별개로 제공된다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대, 가용성 히알루로니다아제와 같은 항-히알루로난 제제, 종양-표적 탁산 및/또는 추가적인 화학치료제가 순차적으로 또는 간헐적으로 투여하기 위한 별개의 조성물로서 포장될 수 있다. 조합물은 키트로서 포장될 수 있다.
조성물은 근육내, 정맥내, 진피내, 병변내, 복강내 주사, 피하, 종양내, 경막외(epidural), 비강, 경구, 질, 직장, 국소(topical), 국부(local), 귀, 흡입, 구강(예컨대, 설하), 및 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함한, 당업자에게 알려진 임의의 경로로 투여하기 위하여 제형화될 수 있다. 기타 투여 방식이 또한 고려된다. 투여는 치료 위치에 따라 국부, 국소 또는 전신일 수 있다. 치료가 필요한 지역에 국소투여는 예컨대, 수술중 국소주입, 국소적용, 예를 들어, 수술후 상처드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 순차적으로, 간헐적으로 또는 동일한 조성물내에 투여될 수 있다. 투여는 또한 제어방출 제형 및 예컨대 펌프에 의한 장치로 제어되는 방출을 포함하는 제어방출 시스템을 포함할 수 있다.
임의의 주어진 사례에 있어 가장 적절한 경로는 다양한 요인, 예컨대 질환의 성질, 질환의 진행, 질환의 중증도, 사용되는 특정 조성물에 좌우된다. 본원의 목적을 위하여, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 가용성 히알루로니다아제와 같은 항-히알루로난-제제, 종양-표적 탁산 및/또는 추가적인 화학치료제는 약제학적으로 이용가능한 양 또는 수준이 혈장 내에 존재하도록 투여되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 조성물은 예컨대 정맥내 투여를 통해 전신으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여와 비교하여 등가의 생체이용률을 보장하기 위해서 증가된 흡수 시간이 필요할 수 있음에도 불구하고, 피하 방법 또한 이용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 종양-표적 탁산 및/또는 추가적인 화학치료제(예컨대 뉴클레오시드 유사체)와 같은 제제들은 상이한 투여 경로로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 각 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제형화될 수 있다.
투여 방법은 히알루로난 분해 효소, 예컨대, 가용성 히알루로니다아제 및 다른 분자의 분해적 과정, 예컨대 단백질분해적 소화, 및 항원성 및 면역원성 반응을 통한 면역학적 개입에 대한 노출을 감소시키기 위하여 채택될 수 있다. 상기 방법의 예는 항-히알루로난 제제의 치료 부위에 국소 투여 또는 지속적 주입을 포함한다.
1. 제형화
약제학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 규제 기관 또는 기타 기관에 대한 승인을 고려하여 제조된다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 분말 및 지연 방출 제형의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세리드를 가지는 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구제형은 표준 담체, 예컨대 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카보네이트 및 다른 기타 제제를 포함할 수 있다. 상기 제형은 투여방식에 부합해야 한다.
약제학적 조성물은 효소 또는 활성화제와 같이 투여되는 담체, 예컨대 희석제, 어쥬번트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기 위한 형태를 제공하기 위하여 치료적 유효량의 화합물을, 일반적으로 정제된 형태로, 적절한 양의 담체와 함께 포함할 것이다. 이러한 약제학적 담체는 물 및 석유, 동물, 채소 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유 및 참기름을 포함한, 오일과 같은 멸균액체일 수 있다. 물은 상기 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용액을 위한 액체담체로써 활용될 수 있다. 조성물은 활성성분과 함께 다음을 포함할 수 있다: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트, 또는 카복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검(gums), 예컨대 검 아카시아, 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로오스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 알려진 다른 그와 같은 결합제. 적절한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크(chalk), 실리카겔, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소디움 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 조성물은, 원한다면, 또한 적은 양의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 소디움 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소디움 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 다른 그와 같은 제제를 포함할 수 있다.
일 예에서, 약제학적 제제는 액체형태, 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액일 수 있다. 이러한 액체 제제는 약제학적으로 허용가능한 첨가제, 예컨대 현탁화제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소첨가 식용지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예컨대, 아몬드유, 유성 에스테르 또는 분획된(fractionated) 식물성 오일); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 또다른 예에서, 약제학적 제제는 사용전 물 또는 다른 적절한 비히클과 재구성하기 위한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다.
약제학적 및 치료적 활성인 화합물 및 이의 유도체는 전형적으로 단위 투여량 제형(unit dosage form) 또는 다중 투여량 제형(multiple dosage form)으로 제형화 되고 투여된다. 각각의 단위 용량(unit dose)은, 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 예정된 양의 치료용 활성 화합물을 포함한다. 단위 제형은 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 및 경구용 용액 또는 현탁액, 및 적당량의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 그의 유도체를 포함하는 유수 에멀젼(oil water emulsion)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단위 용량 형태는 앰풀 및 시린지 또는 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 단위 용량 형태는 분획으로 또는 이의 복수로 투여될 수 있다. 다중 용량 형태는, 분리된 단위 용량 형태로 투여될 단일 용기에 포장되어 있는 여러개의 동일한 단위 투여량 형태이다. 다중 용량 형태의 예는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병, 또는 파인트(pint) 또는 갤론(gallon) 의 병이 포함된다. 이에 따라, 다중 용량 형태는 포장에서 분리되어 있지 않은 여러개의 단위 투여량이다. 일반적으로, 무독성 담체로 균형을 맞추어, 0.005% 내지 100% 범위의 활성 성분을 포함하는 투여량 형태 또는 조성물이 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 각 투여 경로에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다.
a. 주사제, 용액 및 에멀젼
일반적으로 주사를 특징으로 하는, 피하, 근육내, 종양내, 정맥내 또는 진피내(intradermally) 중 어느 하나의 비경구 투여가 본원에서 고려된다. 주사제(injectables)는 통상적인 형태, 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체내 용해 또는 현탁하기 적합한 고체 형태로써, 또는 에멀젼으로써 제조될 수 있다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 추가로, 원한다면, 투여되는 약제학적 조성물은 또한 용매, 예컨대 pH 완충제, 금속이온염 또는 다른 그와 같은 완충액의 형태로 활성화제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 다른 소량의 비-독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 가용성 향상제, 및 다른 그와 같은 제제, 예컨대 소디움 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로 덱스트린을 포함할 수 있다. 일정수준의 복용량이 유지되는, 서방(slow-release) 또는 지연-방출(sustained-release) 시스템(예컨대, 미국특허번호 제3,710,795호 참조)의 이식이 또한 본원에서 고려된다. 상기 비경구 조성물에 포함된 활성 화합물의 백분률은 이들의 특이적 본질 뿐만 아니라 화합물의 활성 및 대상체의 요구에 크게 좌우된다.
예를 들면, 본원에 제공되는 폴리머-컨주게이션된 가용성 히알루로니다아제와 같은 폴리머-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소의 표준 안정화 제형은 EDTA, NaCl, CaCl2, 히스티딘, 락토오스, 알부민, 플루로닉(Pluronic)® F68, 트윈(TWEEN)® 및/또는 다른 계면활성제 또는 다른 유사한 제제 중 어느 하나로 제형화된다. 예를 들면, 본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 pH 완충액(예를 들면, 히스티딘, 포스페이트 또는 다른 완충액) 또는 산성 완충액(예를 들면, 아세테이트, 시트레이트, 피루베이트, Gly-HCl, 숙시네이트, 락테이트, 말레이트 또는 다른 완충액), 탄성조절제(예를 들면, 아미노산, 폴리알코올, NaCl, 트레할로스, 다른 염 및/또는 당), 안정화제, 킬레이트제, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라아세테이트, 또는 칼슘 EDTA; 탈산소제, 예를 들면 메티오닌, 아스코르브산/아스코베이트, 시트르산/시트레이트 또는 알부민; 및/또는 보존제, 예를 들면 방향족 고리(예를 들면 페놀 또는 크레졸)를 포함하는 보존제 중 하나 이상을 포함한다. 히알루로난 분해 효소를 포함하는 조성물에 유용한 예시적인 안정화제로는 폴리소르베이트 등의 계면활성제 및 인간 혈청 알부민 등의 단백질을 포함한다. 본원에서 조성물에 유용한 혈청 알부민의 예시적인 농도로는 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL, 예컨대 적어도 약 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL 또는 1 mg/mL를 포함하지만, 그 이상 또는 미만일 수 있다. 폴리소르베이트는 또한 예를 들면 약 0.001 % 내지 0.1%의 농도, 예컨대 적어도 약 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09% 또는 0.1%의 농도로 상기 조성물에 존재할 수 있다. 칼슘 EDTA(CaEDTA) 등의 금속 킬레이트제는, 예컨대 대략 0.02 mM 내지 20 mM, 예를 들면 적어도 약 0.02 mM, 0.04 mM, 0.06 mM, 0.08 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM 이상의 농도로 존재할 수 있다. 조성물의 pH 및 오스몰 농도는 조성물의 원하는 활성 및 안정성에 대한 조건을 최적화하도록 당업자에 의해 조정될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 제공된 조성물은 100 mOsm/kg 내지 500 mOsm/kg, 예컨대 적어도 약 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 mOsm/kg 이상의 오스몰 농도 및 약 6 내지 8, 예컨대 6 내지 7.4, 예를 들어 약 6, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8 또는 8의 pH를 갖는다.
일반적으로 NaCl은 본원의 히알루로난-분해 효소를 포함하는 제형에서, 예를 들면 약 100 mM 내지 150mM 이상인 양으로 제공된다. 예를 들면, 예시의 제형은 약 10mM 히스티딘 및/또는 약 또는 130 mM NaCl을 포함할 수 있다. 다른 제형은 부가적으로 또는 대안적으로 락토오스를, 예를 들면 약 13 mg/ml로 포함할 수 있다. 또한, 티오메살(thiomersal)을 포함하나 이에 제한되지 않는 항균제 또는 항진균제가 제형에 존재할 수 있다. 제형은 알부민, Pluronic® F68, TWEEN® 및/또는 다른 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 제형은 약 6.0 내지 7.4, 예컨대 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1 , 7.2, 7.3 또는 7.4의 pH, 일반적으로 약 6.5의 pH에서 제공된다. 본원에서 사용하는 변형된 가용성 히알루로니다아제의 농축된 제형은 적절한 염농도를 유지하기 위해 투여전에 일반적으로 식염수 용액 또는 다른 염 완충용액에서 희석된다.
주사제는 국소 및 전신투여를 위하여 설계된다. 본원의 목적을 위해, 국소투여는 히알루로난 축적 또는 과잉과 관련된, 병에 걸린 간질에 대해 직접 투여가 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제는 주사용으로 준비된 멸균 용액; 진피하정(hypodermic tablets)을 포함한, 사용직전 용매와 결합되도록 준비된 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 동결건조 분말; 주사용으로 준비된 멸균 현탁액; 사용직전에 비히클과 결합되도록 준비된 멸균 건조 불용성 제품; 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리식염수 또는 인산완충식염수(PBS), 및 가용화제와 증점제(thickening agents), 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 및 이의 혼합물을 포함한 용액을 포함한다.
비경구 제제에서 사용되는 약제학적으로 허용가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충액, 항산화제, 국소마취제, 현탁화제 및 분산제, 유화제, 봉쇄제(sequestering agents) 또는 킬레이트제, 및 다른 약제학적으로 허용가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 소디움 클로라이드 주사액, 링거 주사액, 등장 덱스트로스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로스 및 락테이트 (Lactated) 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 채소 기원의 고정유(fixed oils), 면실유, 옥수수유, 참기름 및 낙화생유를 포함한다. 항미생물제는 정균(bacteriostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도로 다중-용량 용기로 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있고, 페놀 또는 크레졸, 수은제(mercurials), 벤질알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 등장화제는 소디움 클로라이드 및 덱스트로스를 포함한다. 완충액은 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 소디움 비술페가트(중황산나트륨, sodium bisulfate)를 포함한다. 국소마취제는 프로카인 하이드로클로라이드를 포함한다. 현탁화제 및 분산제는 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN 80)을 포함한다. 금속이온의 봉쇄제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약제학적 담체는 또한 수-혼화성(water miscible) 비히클로 에틸알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과, pH 조정을 위한 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 젖산을 포함한다.
정맥내로 투여된다면, 적절한 담체는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 및 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 증점제 및 가용화제, 및 이들의 혼합물을 포함하는 용액을 포함한다.
주사가 원하는 약리학적인 효과를 나타내는 유효량을 제공하도록 약제학적으로 활성인 화합물의 농도가 조정된다. 정확한 용량은 당업자에게 알려진 바와 같이 환자 또는 동물의 연령, 체중 및 상태에 좌우된다. 단위-용량 비경구 제제는 앰풀, 바이알 또는 니들(needle)이 있는 시린지 내에 포장된다. 약제학적으로 활성인 화합물을 포함하는, 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는 치료할 질환과 포장을 위해 선택된 특정 제조품의 함수이다. 당업계에 알려지고 실행되는 바와 같이, 비경구 투여를 위한 모든 제제는 멸균되어야 한다.
b. 동결건조된 분말(Lyophilized powder)
용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로써 투여를 위해 재구성될 수 있는 동결건조 분말이 본원의 관심이 된다. 이들은 또한 고체 또는 겔로써 재구성되고 제형화될 수 있다. 동결건조된 분말은 상기 기술된 임의의 용액으로부터 제조될 수 있다.
멸균되고 동결건조된 분말은 완충용액 내에 가용성 히알루로니다아제와 같은, 히알루로난-분해 효소인 항-히알루로난 제제의 화합물 및/또는 제2 제제를 용해시켜 제조될 수 있다. 완충용액은 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말 또는 분말로부터 조제된, 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 포함할 수 있다. 그 다음 용액의 멸균여과후, 당업자에게 알려진 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제형을 제공한다. 요약하면, 동결건조된 분말은 적절한 완충액, 예컨대 시트레이트, 소디움 포스페이트 또는 포타슘 포스페이트, 또는 당업자에게 알려진 기타 이러한 완충액에 부형제, 예컨대 덱스트로스, 소르비톨, 과당, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스, 또는 기타 적절한 제제를 용해시켜 조제된다. 그 다음, 선택된 효소를 생성된 혼합물에 첨가하고, 용해될까지 교반한다. 생성된 혼합물을 멸균여과하거나, 미립자를 제거하고 무균성을 보장하기 위해 처리하여, 동결건조를 위한 바이알 내로 배분한다. 각각의 바이알은 화합물의 단일 투여량(1mg 내지 1g, 일반적으로 1 내지 100mg, 예를 들어 1 내지 5mg) 또는 다중 투여량을 포함할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다.
완충용액과 상기 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여로 사용하기 위한 제형을 제공한다. 정확한 양은 치료되는 적응증 및 선택된 화합물에 좌우된다. 상기 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
c. 국소 투여 (Topical administration)
국소 혼합물은 상기 국소 및 전신투여를 위해 기술된 바와 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고제, 에멀젼, 용액, 엘릭시르(elixirs), 로션, 현탁액, 틴크제, 페이스트, 폼(foams), 에어로졸, 관류액(irrigations), 스프레이, 좌약, 붕대(bandage), 피부 패치(dermal patch) 또는 국소투여에 적절한 임의의 다른 제형으로서 제형화된다.
화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 유도체는 흡입제와 같은, 국소적용을 위한 에어로졸로써 제형화될 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 제4,044,126호; 제4,414,209호; 및 제4,364,923호 참조, 염증성 질환, 특히 천식 치료에 유용한 스테로이드 전달을 위한 에어로졸을 기술하고 있음). 기도(respiratory tract)로 투여하기 위한 이러한 제형은 분무기용 에어로졸 또는 용액의 형태, 또는 흡입(insufflation)을 위한 초미립자(microfine) 분말로, 단독으로 또는 락토오스와 같은 불활성 담체와 조합될 수 있다. 이러한 경우에, 제형의 입자는 전형적으로 50 미크론 미만, 바람직하게는 10 미크론 미만의 직경일 것이다.
화합물은 국부(local) 또는 국소(topical) 적용을 위하여, 예컨대 피부 및 눈(eye) 안 과 같은 점막으로의 국소투여를 위하여, 겔, 크림 및 로션의 형태로, 그리고 눈으로의 적용을 위하여, 또는 수조내(intracisternal) 또는 척수내 적용을 위하여 제형화될 수 있다. 경피전달용, 및 또한 눈 또는 점막 투여용, 또는 흡입치료용 국소투여가 고려된다. 활성 화합물 단독 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 부형제와 조합한 비강용액이 또한 투여될 수 있다.
경피투여에 적절한 제형이 제공된다. 이들은 임의의 적절한 포맷, 예컨대 연장된 시간 동안 수여자의 표피와 긴밀한 접촉을 유지하도록 적응된 별개의 패치로써 제공될 수 있다. 상기 패치는 활성 화합물과 관련하여, 예를 들어 0.1 내지 0.2M 농도의 선택적으로 완충화된 수성용액 내에 활성 화합물을 포함한다. 경피투여에 적절한 제형은 또한 이온영동법(iontophoresis)에 의해 전달될 수 있고(예를 들어, Pharmaceutical Research 3(6),318(1986) 참조), 전형적으로 활성 화합물의 선택적으로 완충화된 수성용액의 형태를 취한다.
d. 투여의 기타 경로를 위한 조성물
치료되는 상태에 따라, 다른 투여경로, 예컨대 국소적용, 경피패치, 경구 및 직장투여가 또한 본원에서 고려된다. 예를 들어 직장투여를 위한 투여량 형태(dosage forms)는 전신적 효과를 위한 직장좌제, 캡슐 및 정제이다. 직장좌제는 체온에서 녹거나 부드러워지면서 하나 이상의 약리학적 또는 치료적 활성성분을 방출하는, 직장내로 삽입을 위한 고체 바디(body)를 포함한다. 직장좌제에 이용되는 약제학적으로 허용가능한 물질은 기제(bases) 또는 비히클 및 녹는점을 높이는 제제이다. 기제의 예는 코코아 버터(테오브로마 오일), 글리세린-젤라틴, 카보왁스(폴리옥시에틸렌 글리콜) 그리고 지방산의 모노-, 디- 및 트리글리세리드의 적당한 혼합물을 포함한다. 다양한 기제의 조합물이 사용될 수 있다. 좌제의 녹는점을 높이는 제제는 경랍(spermaceti) 및 왁스를 포함한다. 직장좌제는 압축법 또는 몰딩 중 하나에 의해 제조될 수 있다. 직장좌제의 전형적인 중량은 약 2 내지 3mg이다. 직장투여를 위한 정제 및 캡슐은 동일한 약제학적으로 허용가능한 물질을 이용하여, 경구투여를 위한 제형화와 동일한 방법에 의해 제조된다.
직장투여에 적절한 제형은 단위 투여량 좌제로써 제공될 수 있다. 이들 제형은 활성 화합물을 하나 이상의 통상적인 고체 담체, 예를 들어 코코아 버터와 혼합한 다음, 생성된 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
경구투여를 위하여, 약제학적 조성물은 예를 들어, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어, 결합제(예를 들어, 전젤라틴화된 옥수수 전분(pregelatinized maize starch), 폴리비닐 피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충진제(예를 들어, 락토오스, 미세결정성 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로진 포스페이트); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자전분 또는 소디움 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 소디움 라우릴 술페이트)를 이용하여 통상적인 수단으로 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업자에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다.
구강(설하)투여에 적절한 제형은, 예를 들어 맛이 나는 기제, 보통 수크로스와 아카시아 또는 트래거캔스(tragacanth) 내에 활성 화합물을 포함한 로젠지(lozenges); 및 불활성 기제, 예컨대 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아 내에 화합물을 포함하는 캔디(pastilles)를 포함한다.
약제학적 조성물은 또한 제어방출 제형 및/또는 전달장치에 의해 투여될 수 있다(예를 들어 미국특허번호 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제3,630,200호; 제3,845,770호; 제3,847,770호; 제3,916,899호; 제4,008,719호; 제4,687,660호; 제4,769,027호; 제5,059,595호; 제5,073,543호; 제5,120,548호; 제5,354,566호;제5,591,767호; 제5,639,476호; 제5,674,533호 및 제5,733,566호).
리포좀 내 캡슐화(encapsulation), 미세입자, 미소캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스, 및 레트로바이러스 전달시스템과 같은 가용성 히알루로니다아제 또는 다른 제제를 암호화하는 핵산분자의 전달과 같은, 그러나 여기에 제한되지 않는, 다양한 전달시스템이 알려져 있으며, 선택된 조성물을 투여하는데 이용될 수 있다.
따라서, 어떤 구현예에서, 리포좀 및/또는 나노입자가 또한 본원의 조성물의 투여와 함께 이용될 수 있다. 리포좀은 수성 매체 내 분산된 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 다층 동심 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)(다층소포(MLV)로도 불림)를 형성한다. MLV 는 일반적으로 25nm 내지 4μm의 직경을 가진다. MLV 의 초음파처리는 중심에 수성용액을 포함하는 200 내지 500옹스트롬(angstrom) 범위의 직경을 갖는 작은 단층소포(SUV) 형성을 유발한다.
인지질은, 물에 분산됐을 때, 물에 대한 지질의 몰비에 따라 리포좀 외에 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비율에서, 리포좀이 형성된다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온강도 및 이가(divalent) 양이온의 존재에 좌우된다. 리포좀은 이온 및 극성 물질에 낮은 투과성을 보일 수 있으나, 상승된 온도에서 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상전이를 겪는다. 상전이는 겔 상태로 알려진 가깝게 뭉쳐진 정돈된(ordered) 구조로부터 유체(fluid) 상태로 알려진 느슨하게 뭉쳐진 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특유의 상-전이 온도에서 일어나고, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성 증가를 유발한다.
리포좀은 상이한 기전들: 세망내피계(reticuloendothelial system)의 탐식세포(phagocytic cells), 예를 들어 대식세포 및 호중구에 의한 엔도사이토시스; 비특이적이고 약한 소수성 또는 정전기적 힘, 또는 세포-표면 구성요소와의 특이적인 상호작용 중 어느 하나에 의한 세포표면에 대한 흡착; 세포질 내 리포좀 내용물의 동시 방출을 수반하는, 원형질막 내로 리포좀의 지질이중층 삽입에 의한 원형질막과의 융합; 및 리포좀 내용물의 연계없이, 리포좀 지질의 세포 또는 세포하(subcellular) 막으로 이동, 또는 그 반대에 의하여 세포와 상호작용한다. 하나 이상이 동시에 작동할 수 있지만, 리포좀 제형을 달리함으로써 작동하는 기전을 바꿀 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방법으로 화합물을 포집할 수 있다. 세포내 폴리머의 과부하(overloading)로 인한 부작용을 회피하기 위하여, 상기 초미립자(약 0.1μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계되어야 한다. 본원의 용도로 상기 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 고려되며, 상기 입자는 쉽게 제조될 수 있다.
2. 배합량 (Formulation amounts)
조성물은 단일 투여량 투여를 위해 또는 다중 투여량 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 제제는 직접 투여를 위해 제형화될 수 있다.
항-히알루로난제가 히알루로난-분해 효소 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소인 본원에서 제공되는 조성물 또는 조성물의 조합물에서, 상기 폴리머-컨주게이션된 히알루로난 분해 효소는 약 0.5 μg 내지 50 mg, 예컨대 100 μg 내지 1 mg, 1 mg 내지 20 mg, 100 μg 내지 5 mg, 0.5 μg 내지 1450 μg, 1 μg 내지 1000 μg, 5 μg 내지 1250 μg, 10 μg 내지 750 μg, 50 μg 내지 500 μg, 0.5 μg 내지 500 μg 또는 500 μg 내지 1450 μg의 범위에서 직접 투여를 위한 양으로 제형화된다. 예를 들어, 상기 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소는 용량(dose) 당 약 15 유닛(Units, U) 또는 150 유닛(U) 내지 60,000 유닛, 300 U 내지 30,0000 U, 500 U 내지 25,000 U, 500 U 내지 10,000 U, 150 U 내지 15,000 U, 150 U 내지 5000 U, 500 U 내지 1000 U, 5000 U 내지 45,000 U, 10,000 U 내지 50,000 U 또는 20,000 U 내지 60,000 U, 예를 들어 적어도 약 15 U, 50 U, 100 U, 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1,000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5,000 U; 6,000 U; 7,000 U; 8,000 U; 9,000 U; 10,000 U; 20,000 U; 30,000 U; 40,000 U; 또는 50,000 U의 양으로 제형화된다. 상기 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소는 약 50 U/mL 내지 15,000 U/mL, 예컨대 10 U/mL 내지 500 U/mL, 1000 U/mL 내지 15,000 U/mL, 100 U/mL 내지 5,000 U/mL, 500 U/mL 내지 5,000 U/mL 또는 100 U/mL 내지 400 U/mL, 예를 들어 적어도 약 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL, 1000 U/mL, 2000 Units/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10,000 U/mL, 11,000 U/mL, 12,000 U/mL, 또는 12,800 U/mL에서 저장 용액(stock solution)으로서 제공될 수 있다. 조성물의 부피는 0.5 mL 내지 1000 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1 mL 내지 500 mL, 1 mL 내지 10 mL, 예컨대 적어도 약 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL 또는 그 이상일 수 있다. 조성물은 일반적으로 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소가 약 50 mL을 초과하는 부피로 투여되지 않도록 제형화되고, 전형적으로 5-30 mL의 부피, 일반적으로 약 10 mL를 초과하지 않는 부피로 투여된다. 더 큰 부피에 대해서, 주입의 시간은 더 큰 부피의 전달을 용이하게 하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 주입 시간은 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 1 시간 또는 그 이상일 수 있다.
본원에서 제공되는 조성물 또는 조성물의 조합물에서, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산, 예를 들어 알부민-결합 파클리탁셀은, 약 10 mg 내지 1000 mg, 예컨대 20 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 250 mg, 75 mg 내지 400 mg, 100 mg 내지 200 mg, 150 mg 내지 400 mg, 200 mg 내지 800 mg, 50 mg 내지 200 mg 또는 50 mg 내지 150 mg의 범위에서 탁산의 직접 투여를 위한 양으로서 제형화된다. 조성물은 추후 재구성을 위한 동결건조된 형태 또는 액체 제형으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 액체 제형의 재구성은 물 또는 0.9% 소디움 클로라이드 또는 기타 생리적 용액으로 이루어질 수 있다. 액체 제형으로서 재구성 또는 제공되었을 때, 조성물은 약 0.01 mg mL 내지 100 mg/mL, 예컨대 1 mg/mL 내지 50 mg/ml, 2.5 mg/mL 내지 25 mg/mL, 5 mg/mL 내지 15 mg/mL 또는 10 mg/mL 내지 100 mg/mL, 예를 들어 적어도 약 5 mg/mL의 저장 용액으로서 종양-표적 탁산 제형 내에 탁산을 포함하여 제공될 수 있다. 조성물의 부피는 0.5 mL 내지 1000 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1mL 내지 500 mL, 1mL 내지 10 mL, 예컨대 적어도 약 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL 또는 그 이상일 수 있다. 전체 바이알 내용물이 투여를 위해 인출되거나 다중 투여를 위해 복수의 투여량으로 나누어질 수 있다. 더 큰 부피에 대해, 주입의 시간은 더 큰 부피의 전달을 용이하게 하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 주입 시간은 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 1 시간 또는 그 이상일 수 있다. 탁산의 제형이 담체, 폴리머, 지질 및 기타 부형제를 포함하는 기타 구성요소를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 상기에서 제공되는 투여량은 활성 성분인 탁산 성분에 관한 것이다.
예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀인 아브락산®(Abraxane®)은 파클리탁셀이 안정한 입자 또는 약 130 nm의 크기를 형성하기 위한 알부민으로만 복합체를 이룬 파클리탁셀의 무-용매 제형으로서 제형화된다. 각 아브락산®의 50 mL 바이알은 100 mg의 파클리탁셀 및 대략 900 mg의 인간 알부민을 멸균, 동결건조된 케이크(cake)로서 포함한다. 각 바이알은 20 mL의 0.9% 소디움 클로라이드 주사, USP로 재구성되어 5 mg/mL의 파클리탁셀을 포함하는 현탁액을 생산한다. 재구성된 아브락산 현탁액은 30분에 걸쳐 정맥내로 260 mg/m2의 권장 용량으로 주입된다.
본원에서 제공되는 조성물 또는 조성물의 조합물에서, 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 젬시타빈 또는 이의 유도체는 약 100 mg 내지 5000 mg, 예컨대 500 mg 내지 5000 mg, 500 mg 내지 2500 mg, 1000 mg 내지 2500 mg, 2000 mg 내지 5000 mg 또는 1500 mg 내지 2500 mg, 일반적으로 적어도 약 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg 또는 1000 mg의 범위에서 직접 투여를 위한 양으로서 제형화된다. 조성물은 추후 재구성을 위한 동결건조 형태로서 또는 액체 제형으로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 액체 제형의 재구성은 물 또는 0.9% 소디움 클로라이드 또는 기타 생리적 용액으로 이루어질 수 있다. 액체 제형으로서 재구성되거나 제공되었을 때, 조성물은 뉴클레오시드 유사체를 약 1 mg/mL 내지 500 mg/mL, 예컨대 5 mg/mL 내지 100 mg/ml, 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 25 mg/mL 내지 200 mg/mL 또는 20 mg/mL 내지 100 mg/mL, 예를 들어 적어도 약 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL 또는 40 mg/mL, 및 불완전한 용해를 최소화하기 위해 일반적으로 40 mg/mL을 초과하지 않도록 포함하는 저장 용액으로서 제공될 수 있다. 조성물의 부피는 0.5 mL 내지 1000 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 1mL 내지 500 mL, 1mL 내지 10 mL, 예컨대 적어도 약 0.5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL 또는 그 이상일 수 있다. 전체 바이알 내용물이 투여를 위해 인출될 수 있거나, 다중 투여를 위해 복수의 투여량으로 나누어질 수 있다. 더 큰 부피에 대하여, 주입의 시간은 더 큰 부피의 전달을 용이하게 하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 주입 시간은 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 1 시간 또는 그 이상일 수 있다. 투여를 위한 약물의 양의 인출에 있어서, 제형은 희망되는 경우 추가적으로 희석될 수 있는데, 예를 들어 물, 식염수(예컨대 0.9%) 또는 기타 생리적 용액 내에 희석될 수 있다. 뉴클레오시드 유사체(예컨대 젬시타빈 또는 유도체)의 제형이 담체, 폴리머, 지질 및 기타 부형제를 포함하는 기타 구성요소를 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 상기 제공되는 투여량은 활성 성분인 뉴클레오시드 유사체 구성요소에 대한 것이다.
예를 들어, 주사용 젬시타빈인 젬자®는 200 mg 또는 1000 mg의 활성 제제를 바이알 당 포함하는 동결건조된 제형으로서 제공된다. 각 바이알은 0.9% 소디움 클로라이드 주사, USP의 각각 5 mL 또는 25 mL로 재구성되어 젬시타빈 40 mg/mL을 포함하는 현탁액(동결건조된 분말의 이동 부피를 차지하는 재구성된 농도는 약 38 mg/mL일 수 있음)을 생산하도록 제공된다. 투여 전에, 약물의 적절한 양이 0.9% 소디움 클로라이드 또는 기타 생리적 용액으로 추가적으로 희석될 수 있다.
3. 포장(Packaging) 및 제조품(Articles of Manufacture)
또한, 포장 재료, 본원에서 제공되는 임의의 약제학적 조성물 또는 조합물, 및 조성물 및 조합물이 기질 종양 암 또는 고형 종양 암과 같은 암의 치료에 사용되기 위한 것임을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품이 제공된다. 제조품의 예는 단일 챔버 및 이중 챔버 용기를 포함하는 용기이다. 용기는 튜브, 병 및 시린지를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 용기는 추가로 피하 투여용 니들을 포함할 수 있다.
한 예에서, 약제학적 조성물을 포함하는 제조품은 추가적인 제제 또는 치료 없이 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소 및 종양-표적화 탁산을 포함한다. 다른 예에서, 제조품은 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소, 종양-표적 탁산 및 추가적인 화학치료제(예컨대 뉴클레오시드 유사체)를 포함한다. 상기 예에서, 제제들은 제조품으로써 포장을 위하여 함께 또는 별도로 제공될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 포함한다. 약제학적 제품을 포장하는데 사용되는 포장재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 본원에서 전체로 통합되는 미국특허번호 제5,323,907호, 제5,052,558호 및 제5,033,252호 참조. 약제학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이알, 용기, 시린지, 병, 그리고 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료방식에 적절한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
포장의 선택은 제제, 및 이러한 조성물이 함께 또는 별도로 포장될 것인지 여부에 좌우된다. 일반적으로, 포장은 포장 내의 조성물과 비-반응성이다. 다른 예에서, 일부 구성요소는 혼합물로서 포장될 수 있다. 다른 예에서, 모든 구성요소는 별도로 포장될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 구성요소는 투여 직전에 혼합하여 함께 직접적으로 투여될 수 있는, 별개의 조성물로서 포장될 수 있다. 대안적으로, 구성요소들은 별도로 투여되기 위한 별개의 조성물로서 포장될 수 있다.
구성요소들은 용기 내에 포장될 수 있다. 구성요소들은 동일한 용기 내에 별도로 포장된다. 일반적으로, 이러한 용기의 예는 폴리머-컨주게이션된 히알루로난-분해 효소를 포함하는 밀봉된, 구별된 공간, 및 다른 구성요소들 또는 구성요소를 포함하는 별개의 밀봉된, 구별된 공간을 포함하며, 이어지는 공간들은 쉽게 제거될 수 있는 막으로 분리되어 있어, 막을 제거시 구성요소들이 혼합되도록 허용하거나, 구성요소들이 별도로 투여되도록 허용한다. 제제들이 투여 전 다른 구성요소들로부터 분리되는 한, 임의의 용기 또는 제조품이 고려된다. 적합한 구현예를 위해서 예컨대 미국 특허번호 제3,539,794호 및 제5,171,081호를 참조하라.
이의 제조품을 포함하는 선택된 조성물은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에서 기술되는 약제학적 조성물 및 제조품으로서 제공되는 투여를 위한 물품을 포함할 수 있다. 상기 키트는, 선택적으로 투여량, 투여 요법 및 투여 방식에 대한 지침을 포함하는 투여에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에서 기술되는 약제학적 조성물 및 진단을 위한 물품을 포함할 수 있다.
F. 활성, 생체 이용률( BIOAVAILABILITY ) 및 약동학( PHARMACOKINETICS )의 평가방법
본원의 조성물의 상기 제제는 성질 및 활성에 대해 평가될 수 있다. 상기 성질 및 활성은 생물학적 활성 및/또는 종양형성 활성과 관련될 수 있다. 상기 검정은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 이러한 검정은 조직 또는 종양 생검에서의 히알루로난 또는 혈장 내 가용성 히알루로난의 양의 측정, 또는 혈액 또는 뇨 내 히알루로난 이화물의 측정, 혈장 내 히알루로니다아제 활성의 측정, 간질액 압력, 종양에 있어서의 혈관 부피 또는 물 함량의 측정을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 검정은 용량의 효과 및 투여의 경로를 포함하는, 제제의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
1. 시험관 내(In Vitro) 검정
a. 히알루로난 분해 효소의 히알루로니다아제 활성
히알루로난 분해 효소의 활성은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제에 대한 USP XXII 검정은 효소를 30분 동안 37℃에서 HA와 반응시킨 후 남은 분해되지 않은 히알루론산, 또는 히알루로난, (HA) 기질의 양을 측정함으로써 활성을 간접적으로 결정한다(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 미국 약전 협회(United States Pharmacopeia Convention, Inc), 미국 메릴랜드주 락빌 소재). 히알루로니다아제 표준품 (USP) 또는 국가 의약품집 (NF) 표준 히알루로니다아제 용액이 임의의 히알루로니다아제의 활성을, 단위로, 확인하기 위한 검정에서 사용될 수 있다. 일 예에서, 활성은 미세탁도 검정을 사용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 불용성 침전물의 형성함을 기초로 한다. 상기 활성은 히알루로니다아제를 나트륨 히알루로네이트 (히알루론산)와 설정된 시간 동안 (예를 들어, 10분) 배양한 후 소화되지 않은 나트륨 히알루로네이트를 산성화된 혈청 알부민의 첨가에 의해 침전시켜 측정된다. 생성된 시료의 탁도는 추가 전개 기간 후 640 nm에서 측정된다. 나트륨 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다아제 활성에 의해 유발된 탁도의 감소는 히알루로니다아제 효소 활성의 척도이다. 다른 예에서, 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제와 배양 후 잔류 비오틴화된 히알루론산을 측정하는 미세역가 검정을 이용하여 측정된다(예를 들어, Frost 및 Stern (1997) Anal. Biochem . 251:263-269, 미국 특허 공개 번호 제20050260186호 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기 상의 유리 카르복실기를 비오틴화시키고, 비오틴화된 히알루론산 기질을 미세역가 플레이트에 공유결합으로 커플링시킨다. 히알루로니다아제와의 배양 후, 잔류 비오틴화된 히알루론산 기질을 아비딘-퍼옥시다제 반응을 이용하여 검출하고, 공지된 활성의 히알루로니다아제 표준과의 반응 후 얻어지는 것과 비교한다. 히알루로니다아제 활성을 측정하기 위한 다른 검정이 또한 당업계에 공지되어 있고, 본원의 방법에서 사용될 수 있다 (예를 들어, Delpech 외., (1995) Anal. Biochem . 229:35-41; Takahashi 외., (2003) Anal. Biochem . 322:257-263 참조).
산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 가용성 히알루로니다아제 (예를 들어, PEG화 rHuPH20)의 활성은 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 트립판 블루 염료는 히알루로난 분해 효소와 함께 또는 히알루로난 분해 효소 없이 예컨대 피하로 또는 피부내로 누드 마우스의 각 측면 상의 가측 피부로 주사될 수 있다. 그 후, 산포제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소의 활성을 결정하기 위하여 염료 면적을 예컨대 마이크로캘리퍼스로 측정한다(예를 들어, 미국 공개 특허 번호 제20060104968호 참조). 제제의 약동학적 및 약력학적 성질에 있어서 다른 제제, 예컨대 화학 치료와 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제의 병용-투여의 효과는 또한 동물 모델 및/또는 인간 대상을 사용하는 생체 내에서, 예컨대 설정된 임상 실험에서 상기 논의되고 하기 실시예 1에 입증된 바와 같이 평가될 수 있다. 히알루로니다아제가 아닌 히알루로난 분해 효소의 기능적 활성은 임의의 이러한 검정을 이용하여 히알루로니다아제와 비교될 수 있다. 이것은 히알루로난 분해 효소의 기능적으로 동등한 양을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 산포제 또는 확산제로서 작용하는 히알루로난 분해 효소 활성은 트립판 블루와 함께 그것을 마우스의 가측 피부에 주사(예컨대 피하로 또는 피부내로) 함으로써 평가될 수 있고, 예를 들면 100 유닛의 히알루로니다아제 기준 표준과 동일한 양의 확산을 달성하기 위해 필요한 양이 결정될 수 있다. 그러므로, 필요한 히알루로난 분해 효소의 양은 100 히알루로니다아제 유닛과 기능적으로 동등하다. 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다아제의 처리 전 및 후에, 예를 들어 종양에서의 수리 전도도(hydrauric conductivity, K)가 또한 변형된 히알루로난 분해 효소 제형의 활성을 평가하기 위해 측정될 수 있다.
상기 기술된 임의의 하나 이상의 히알루로난-관련 질환 및 상태와 관련된 마커, 또는 임의의 다른 관련 마커 또는 표현형에 영향을 주는, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제를 포함하는 변형된 히알루로니다아제의 활성은 상기 기술된 임의의 하나 이상의 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 수준 또는 함량, 할로(halos)의 형성 또는 크기, 간질액 압력, 물 함량 및/또는 혈관 부피를 감소시키는, 변형된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 변형된 히알루로니다아제의 활성은 상기 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내의 임의의 하나 이상의 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 일 예에서, 변형된 히알루로니다아제는 종양을 가진 대상 또는 적절한 동물 모델에 투여될 수 있고 히알루로난 수준, 할로(halos)의 형성 또는 크기, 간질액 압력, 물 함량 및/또는 혈관 부피에 대한 효과가 평가될 수 있고 변형된 히알루로니다아제가 투여되지 않은 대상 또는 동물 모델과 비교될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 히알루로니다아제는 다른 제제, 예컨대 화학 치료제와 함께 투여될 수 있다.
HA 합성 또는 분해에 대한 효과를 포함하는, 히알루로니다아제 활성을 평가하는 다른 검정 다양한 검정은 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 것에 제한되지 않고, 예를 들어, 히알루로난 분해를 측정하는 시험관 내 검정 (예를 들어, Frost 및 Stern (1997) Anal. Biochem . 137 251:263-269 참조), 예컨대 HA-결합 단백질 또는 기타 항-HA 시약을 이용하는 HA에 대한 조직 또는 기타 시료의 염색(예를 들어, Nishida 외. (1999) J. Biol . Chem ., 274:21893-21899 참조), 입자 배제 검정(Nishida 외. 1999; Morohashi 외. (2006) Biochem Biophys . Res. Comm ., 345:1454-1459); has 유전자에 대한 HAS mRNA 발현 측정 또는 분석(Nishida 외. 1999)을 포함한다.
b. 탁산 활성
표준 생리적, 약리학적 및 생화학적인 절차가 튜불린 연관 억제에 대한 원하는 생물학적 활성을 갖는 그들을 식별하기 위하여 화합물들을 시험하는데 이용가능하다. 시험관 내 및 생체 내 검정은 생물학적 활성, 예컨대 세포 독성 및 튜불린 중합을 평가하는데 사용될 수 있다(예컨대 Hidaka 외. (2012) Biosci . Biotechnol . Biochem., 76:349-352 참조).
예를 들어, 본원에서 제공되는 탁산 화합물은 미세소관 안정화 검정에서 시험될 수 있다(Barron 외., (2003) Anal. Biochem., 315:49-56). 튜불린 조립 또는 이의 억제는 흡광도 또는 형광형에서의 튜불린 중합 검정에서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 광학 밀도 기반 튜불린 중합 검정은 미세소관 중합체의 농도가 미세소관에 의해 산란되는 빛의 정도에 비례하기 때문에, 사용될 수 있다. 이러한 검정의 예시는 튜불린 중합 HTS 검정이다(카탈로그 번호. BK004P 또는 BK006P; Cytoskeleton, Denver, CO). 중합 후 미세소관으로의 형광 리포터의 합체에 기인하는 형광 향상이 일어나는 형광 기반 검정 또한 사용될 수 있다(카탈로그 번호. BK011P, Cytoskeleton, Denver). 이러한 검정에서, 튜불린은 탁산 화합물, 예컨대 파클리탁셀, 빈플라스틴 또는 도셀레탁셀과 배양될 수 있고, 중합은 시간에 걸쳐 측정될 수 있다. 예를 들어, 형광 검정에서, 중합은 360 nm에서의 여기 및 420 nm에서의 발광의 형광 변화를 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 튜불린 조립은 또한 350 nm에서의 겉보기 흡수와 비슷한, 광 분산에 의해 모니터링될 수 있다. 상기 검정에서, 소 혈청 알부민(BSA)은 일반적으로 응집을 예방하기 위해 사용된다. 또한, 튜불린 중합 촉진제인 글리세롤은 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 제외된다. 대조군으로서, 튜불린을 안정화시키고 해중합(depolymerization)에 영향을 끼치지 않는 미세소관 불안정화 약물, 빈블라스틴이 사용될 수 있다.
c. 항암 활성
히알루로난-분해 효소, 종양-탁산 표적 및/또는 다른 화학 치료제(예를 들어, 뉴클레오시드 유사체) 및 이의 제형을 포함하는, 본원에서 기술되는 화합물 및 제제의 항암 활성은 시험관 내에서, 예를 들어, 유도체와 함께 암세포 배지를 배양하고 그 후 배지에서 세포 성장 억제를 평가함으로써, 검사될 수 있다. 이러한 시험에 적합한 세포는 쥣과 P388 백혈병, B16 흑색종 및 루이스 폐 암 세포, 뿐만 아니라 인간 유선 MCF7, 난소 OVCAR-3, A549 폐 암 세포, MX-1 (인간 유방 종양 세포), HT29 (결장 암 세포주), HepG2 (간 암 세포주), 및 HCT116 (결장 암 세포)를 포함한다.
2. 생체 내(In Vivo ) 동물 모델
동물 모델은 히알루로난 수준 또는 함량, 간질액 압력, 물 함량, 혈관 부피, 및 종양 크기, 부피 또는 성장에 대한 본원에서 제공되는 조성물 또는 조합물의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 동물 모델은 조성물 또는 조합물의 약동학 또는 내약성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
동물 모델에는 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 사이노몰거스 원숭이 또는 히말라야 원숭이(rhesus macaques)와 같은 비-인간 영장류 모델이 있으나 이에 제한되지 않는다. 동물 모델은 이종이식 모델 뿐만 아니라 유전적 모델을 포함하는 것이다. 예를 들어, 이종이식 모델은, 제제를 시험하기 전에, 적합한 시험 동물, 예를 들어, 누드 마우스에서 종양이 확립할 수 있는 것들을 포함한다. 일부 예에서, 누드마우스나 SCID 마우스와 같은 면역결핍 마우스에 예컨대 히알루로난 관련 암으로부터 얻은 종양 세포주를 이식하여 암에 대한 동물 모델을 확립할 수 있다. 히알루로난 관련 암유래를 포함하는 세포주는 예시적으로 PC3 전립선암 세포, BxPC-3 췌장 선암 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, MCF-7 유방 종양 세포, BT474 유방 종양 세포, Tramp C2 전립선 종양 세포 및 Mat-LyLu 전립선암 세포, 및 히알루로난과 관련된 것으로 본원에서 기술된, 예컨대 히알루로난 수준이 증가되어 있는 기타 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 췌장 암 동물 종양 모델의 예시는 BxPC-3 췌장 선암 세포를 이용한 동물에서 종양의 생성을 포함한다(예컨대 Von Hoff 외. (2011) J. Clin . Oncol ., 29:4548-54 참조).
종양의 생성 또는 형성을 초래하도록 하나 또는 그 이상의 유전자가 결핍되도록 만들어진 동물인 유전적 모델이 또한 사용될 수 있다. 이러한 유전적으로 설계된 마우스 모델(GEMM)은 질환의 분자 및 임상적 특성을 개괄할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 췌장 암 유전적 모델은 결핍 표현형을 나타내는 돌연변이 마우스에서 일어나는, 내생 돌연변이 Kras 및 Trp53 형질의 췌장 특이적 발현을 포함한다(용어 KPC 마우스; LSL-KrasG12D, LSL-Trp53R172H, Pdx-l-Cre). KPC 마우스는 뉴클레오시드 유사체 젬시타빈에 대한 저항성을 포함하는, 인간 질환에 유사한 특성을 나타내는 일차 췌장 종양을 발달시킨다(예컨대 Frese 외. (2012) Cancer Discovery, 2:260-269 참조).
본원에서 제공되는 조성물 또는 조합물은 질환에 미치는 영향을 평가하기 위해 마우스에 투여될 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 수준은 평가되거나 측정될 수 있다. 다른 실시예에서, 종양 성장 또는 종양 세포 억제에 대한 효과는 평가될 수 있다. 예를 들어, ED50 값, 즉, 동물에서 종양 성장의 50% 억제를 달성하는데 필요한 제제(들)의 양이 결정될 수 있다. 생존율 또한 결정될 수 있다.
3. 약동학 및 내약성 (tolerability)
약동학 및 내약성 연구는 동물 모델을 사용하여 수행될 수 있거나 본원에서 제공되는 조합물 및 조성물의 효과를 평가하기 위해 환자와 함께하는 임상적 연구 동안에 수행될 수 있다. 동물 모델은 마우스, 랫트, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 사이노몰거스 원숭이 또는 히말라야 원숭이가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 약동학 및 내약성 연구는 건강한 동물을 사용하여 수행된다. 다른 실시예에서, 연구는 본원의 조합물 또는 조성물로의 치료가 고려되는 질환의 동물 모델, 예컨대 암 동물 모델을 사용하여 수행된다.
본원에서 제공되는 조합물 또는 조성물의 약동학적 특성은 투여 이후 최대(피크) 화학 치료제 농도 (Cmax), 피크 시간(즉, 최대 화학 치료제 농도가 발생할 때; Tmax), 최소 화학 치료제 농도(즉, 화학 치료제의 투여 사이의 최소 농도; Cmin), 제거 반감기(T1/2) 및 곡선 하 면적(즉, 시간대 농도를 플롯팅하여 생성된 곡선하 면적; AUG)과 같은 매개변수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 화학 치료제가 피하로 투여되는 경우, 제제의 절대 생체 이용률은, 정맥 전달(AUGⅳ) 후 화학 치료제의 AUC와 피하 전달 (AUGSC) 후 화학 치료제의 곡선 하 면적을 비교함으로써 결정될 수 있다. 절대 생체 이용률(F)은 식: F = ([AUC]sc ×용량(dose)sc) / ([AUC]iv ×용량(dose)iv)를 이용하여 계산될 수 있다. 피하 투여 후 혈장에서의 화학 치료제의 농도는 혈액 시료에서 화학 치료제의 농도를 평가하기 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
다양한 투여량 및 다른 투여 빈도 투여가 병용-투여 제제(예컨대, 뉴클레오시드 유사체)의 증가 또는 감소 농도의 효과를 평가하기 위한 약동학적 연구에 있어서 투여될 수 있다. 피하로 투여된 화학 치료제의 약동학적 성질, 예컨대 생체 이용률은 또한 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소 및/또는 종양-표적 탁산의 병용투여와 함께 또는 이를 제외하고 평가될 수 있다. 예를 들어, 개, 예컨대 비글에 하나 이상의 투여 경로를 이용하여, 화학 치료제(예를 들어, 뉴클레오시드 유사체 예컨대 젬시타빈)와 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소 및/또는 종양-표적 탁산을 조합하여, 또는 화학 치료제 단독으로 투여될 수 있다. 이러한 연구는 화학 치료제의 약동학적 성질, 예컨대 생체 이용률에 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로니다아제와 병용-투여의 효과를 평가하기 위해 수행될 수 있다.
안정성 및 내약성을 평가하는 연구는 또한 당업계에 공지되어 있고 본원에서 사용될 수 있다. 본원의 조합물 및 조성물의 투여 후, 임의의 유해한 반응의 발생은 모니터링될 수 있다. 유해한 반응은 주사 부위 반응, 예컨대 부종 또는 붓기, 두통, 발열, 피로, 오한(chills), 홍조, 현기증, 두드러기, 천명 또는 흉부 압박, 구역질, 구토, 오한(rigors), 허리 통증, 가슴 통증, 근육 통증, 발작 또는 경련, 혈압의 변화 및 과민증(anaphylactic) 또는 중증의 과민 반응을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 다양한 투여량 및 다른 투여 빈도는 안전성 및 내약성 연구에서 투여량에 있어서의 화학 치료제 및/또는 항-히알루로난제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난 분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 증가 또는 감소 농도의 효과를 평가하기 위하여 투여된다.
G. 병용 치료의 방법 및 용도
본원에서 제공되는 조합물 및 조성물은 암, 특히 고형 종양 암을 치료하는 치료 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난 분해 효소(예컨대, PH20와 같은 히알루로니다아제, 예를 들어 PEGPH20) 및 탁산 제형(예컨대, 알부민-결합 탁산 제형)의 병용 치료는 고형 종양을 가진 대상에 투여된다. 일부 예에서, 추가의 뉴클레오시드 유사체 제제, 특히 고형 종양을 위한 치료 및/또는 아미노기 이탈에 의해 억제에 영향받기 쉬운 뉴클레오시드 유사체(예컨대, 젬시타빈 또는 이의 유사체) 또한 투여될 수 있다. 본원에서 발견된 바와 같이, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난 분해 효소 및 탁산 제형과의 병용 요법에서의 뉴클레오시드 유사체의 종양내 양, 및 이의 세포독성 효과는 뉴클레오시드 유사체가 오직 하나의 제제(즉, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소 또는 탁산 제형)와 함께 투여될 때의 효과를 훨씬 초과한다. 예를 들어, 상기 효과는 상승적 효과가 될 수 있다. 본원에서 제공되는 병용 치료에서 관찰되는 뉴클레오시드 유사체 종양내 활성의 함량 및 수준은 기존 치료 요법을 능가하는 증가된 효능 및 생존을 포함하는, 기존 치료로 지금까지는 달성할 수 없는 결과를 달성한다.
1. 암
항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 탁산 제형 및/또는 뉴클레오시드 유사체의 병용 치료는 암세포, 신생물, 종양 및 전이의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 병용 치료는 항종양 효능을 나타내고 종양 성장의 감속 또는 감소, 종양 부피의 감소를 일으키고 일부의 경우에 종양의 제거 또는 근절을 일으킨다. 병용 치료는 단일 또는 이중 병용 치료로서 동일한 제제로 치료되는 대상과 비교하여 대상의 증가된 생존을 유발한다. 치료되기 어려운 췌장암과 같은 암에서, 병용 치료는 기존의 방법에 비해 중요한 이점을 제공한다.
예를 들어, 병용 치료는 고형 종양, 예컨대 폐 및 기관지, 유방, 결장 및 직장, 신장, 위, 식도, 간 및 간내 담관, 방광, 뇌 및 다른 신경계, 두경부, 구강 및 인두, 자궁 경부, 자궁 체부, 갑상선, 난소, 고환, 전립선, 악성 흑색종, 담관암종(cholangiocarcinoma), 흉선종, 비-흑생종 피부 암, 뿐만 아니라 혈액 종양 및/또는 혈액 악성종양, 예컨대 소아 백혈명 및 림프종, 다발성 골수종, 호킨스 질환, 림프구성 및 피부의 기원의 림프종, 급성 및 만성 백혈병 예컨대 급성 림프구성, 급성 골수성 또는 만성 골수성 백혈병, 형질 세포 종양, 림프의 신생물 및 AIDS와 관련된 암의 치료에 사용될 수 있다. 전형적으로, 병용 치료는 고형 종양, 예를 들어, 고형 종양 기질조직 암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 종양은, 예를 들어, 췌장 종양, 난소 종양, 폐 종양, 결장 종양, 전립선 종양, 자궁 종양 및 유방 종양을 포함한다.
특히, 상기 암은 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소에 의해 표적화되기에 적합한 히알루로난-풍부 암이 될 수 있다. 몇몇의 히알루로난-풍부 암이 확인되었다. 히알루로난-풍부 종양은 전립선, 유방, 결장, 난소, 위, 두경부 및 다른 종양 및 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부의 경우에, 히알루로난 수준은 불량한 예후, 예를 들어 감소된 생존율 및/또는 재발-없는 생존율, 전이, 혈관형성, 다른 조직/영역으로의 암 세포 침윤, 및 불량한 예후의 다른 지표와 상관관계가 있다. 이러한 상관관계는 예를 들어, 히알루로난-풍부 종양, 예를 들어 난소암, SCC, ISC, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC)을 포함하는 폐암, 유방암, 결장암 및 췌장암에서 관찰되었다(예를 들어, Anttila 외, (2000) Cancer Research, 60:150-155; Karvinen 외, (2003) British Journal of Dermatology, 148:86-94; Lipponen 외, (2001) Eur . Journal of Cancer, 849-856; Pirinen 외, (2001) Int . J. Cancer. 95:12-17; Auvinen 외., (2000) American Journal of Pathology, 156(2):529-536; Ropponen 외, (1998) Cancer Research, 58:342-347 참조). 그러므로, 히알루로난-풍부 암은 암의 하나 이상의 증상을 치료하기 위해 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로니다아제의 투여에 의해 치료될 수 있다.
히알루로난-풍부 암을 치료하는 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소는 그 자체에 의해 치료적으로 작용할 수 있고/있거나 다른 병용-투여 또는 병용 치료의 활성을 강화할 수 있다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제는 종양에 주사되는 경우 직접적인 항발암 효과를 가진다. 히알루로니다아제는 마우스에 이식된 종양의 성장을 막고(De Maeyer 외., (1992) Int. J. Cancer 51:657-660) 발암물질에 노출시 종양 형성을 억제한다(Pawlowski 외. (1979) Int . J. Cancer 23:105-109) 히알루로니다아제는 뇌 암(신경교종)의 치료에 유일한 치료제로서 효과가 있다(국제 공개 공보 번호 WO198802261호 참조).
항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로니다아제를 포함하는 히알루로난 분해 효소는, 또한 종양에 화학 치료제의 전달을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 히알루로난 분해 효소는 하나 이상의 다른 화학 치료 또는 다른 항암제 또는 치료와 병용하여, 예를 들어, 동시에 또는 그 전에 투여될 수 있다(예컨대, 탁산 제형을 이용한 치료 및/또는 뉴클레오시드 유사체를 이용한 치료). 일부의 경우에, 효소는 종래의 화학 치료에 저항성이 있는 종양의 감도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제를 포함하는 히알루로난 분해 효소, 예컨대 rHuPH20은 종양 부위 주변에 확산을 증가시키기 위해(예컨대 종양 부위 및 주변에 화학 치료제의 순환 및/또는 농도를 촉진하기 위해), 종양 세포 운동성, 예컨대 히알루론산 분해에 의한 것을 억제시키기 위해, 및/또는 종양 세포 자연사(apoptosis) 임계점을 낮추기 위한 유효량으로 환자에게 투여될 수 있다. 이것은 화학 치료제의 작용에 더 민감한 종양 세포를 만드는, 아노이키스(anoikis)의 상태로 종양 세포(들)을 가져올 수 있다. 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제의 투여는 종래의 화학 치료-저항 종양인 췌장, 위, 결장, 난소, 및 유방의 반응을 유도할 수 있다(Baumgartner 외. (1988) Reg . Cancer Treat. 1:55-58; Zanker 외. (1986) Proc . Amer. Assoc . Cancer Res. 27:390). 히알루로난 분해 효소, 예컨대 히알루로니다아제는 전형적으로 고형 종양에 화학 치료제 또는 다른 항암제의 침투를 향상시켜 질환을 치료한다.
치료를 위한 대상체의 선택
이 방법들은 히알루로난-관련 종양 또는 암을 갖는 치료를 위한 대상을 선택하기 위한 단계를 포함한다. 이러한 방법들은 히알루로난-관련 질환 마커를 검출하기 위한 방법을 포함하는데, 이는 대상이 히알루로난 관련 질환을 갖는지, 대상이 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소에 의한 치료에 반응할 것 같은지, 및/또는 대상으로부터의 시료, 예컨대 조직, 세포 또는 체액이 상승된 히알루로난 발현을 포함하는지에 대한 임의의 지표들을 포함한다. 마커의 검출을 위한 예시적인 검정들은 하기와 같이 기술되며, 대상으로부터의 시료 내의 HA 수준 및/또는 상대적 HA 수준을 측정하기 위한 검정, 대상으로부터의 시료에 있어서 히알루로난-분해 효소의 효과를 분석하기 위한 검정, 및 특정한 히알루로난-관련 질환/상태와 관련된 일반적인 판독(readouts), 예컨대 낮은 히알루로니다아제 발현 또는 활성, 높은 간질액 압력, 혈관 부피 및 물 함량을 측정하기 위한 검정을 포함한다. 일반적으로, 대상의 시료에서 단백질 또는 핵산을 검출하거나 시험관 내에서 세포/조직에서의 치료 효과를 평가하기 위한 임의의 공지된 검정이 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 방법들에 있어서 치료를 위해 선택된 대상은, 질환 또는 상태를 갖고 있지 않은 대상 또는 HA 발현이 상승되거나 비정상적이거나 축적되지 않은 정상 조직 또는 시료와 비교하여, 상승되거나 비정상적이거나 축적된 히알루로난 수준을 갖는 대상을 포함한다. 대상으로부터 임의의 시료 또는 조직은 시험될 수 있거나 정상 시료 또는 조직과 비교될 수 있다. 히알루로난 수준은 조직(예컨대 생검(biopsy))유래, 종양, 세포 또는 혈액, 혈청, 뇨 또는 다른 체액 유래의 임의의 공급원으로부터 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원의 다른 부분에 기술된 바와 같이, 고형 종양에서의 HA 축적 프로파일(profiles of HA deposition)은 일반적으로 세포주위 또는 기질로 분류된다. 증가된 혈장 수준의 HA는 빌름즈 종양(Wilm's tumor), 중피종 및 간 전이가 있는 환자에서 가장 현저하게 관찰되었다. 따라서, 질환 또는 상태에 의존하여, 다른 시료는 히알루로난 수준에 대해 측정될 수 있다. 시료의 선택은 당업자의 수준 내의 일이다.
히알루로니다아제 기질 수준을 측정하기 위해 사용되는 검정은 질환 또는 상태와 상관관계이고 특정한 질환 또는 상태에 기초하여 선택될 수 있다. 당업자는 히알루로난을 검출하기 위한 방법들에 익숙한데, 여기에는 면역조직화학적 방법, 또는 ELISA 방법이 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 예를 들어, 대상이 히알루로난-분해 효소로 치료될 수 있을 히알루로난-관련 상태 또는 질환을 갖는지 여부를 결정하기 위해, 마커를 검출하기 위한 단계가 대상 치료 전에 수행된다. 이 예에서, 마커가 검출되면(예를 들어 환자유래의 세포, 조직 또는 체액이 상승된 히알루로난 발현을 함유하고 있는지 또는 히알루로난 분해 효소에 반응하는지 여부가 결정되면), 치료 단계가 수행될 수 있는데, 여기서 히알루로난 분해 효소가 대상에 투여된다. 일 예에서, 마커가 검출되지 않으면(예를 들어 환자유래의 세포, 조직 또는 체액이 정상 또는 비-상승된 히알루로난 발현을 함유하고 있는지 또는 히알루로난 분해 효소에 반응하지 않는지 여부가 결정된다면), 다른 치료 옵션이 선택될 수 있다.
다른 예에서, 마커를 검출하기 위한 단계는, 예를 들어, 항-히알루로난 제제를 이용한 치료가 질환 또는 상태의 치료에 대한 효과를 가지는지 여부를 결정하기 위해, 대상을 치료한 후에, 또는 대상의 치료 과정 중에 수행된다(예를 들어 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소(예를 들어 가용성 변형된 히알루로니다아제)를 처리(병용-투여되는 약물과 함께 또는 병용-투여되는 약물 없이)). 이러한 예에서, 마커가 검출되지 않거나 치료 전 양/수준과 비교하여, 또는 다른 시료와 비교하여 감소된 양 또는 상대적 수준으로 검출될 때, 치료를 계속하고, 다른 차례(주기)의 치료가 수행되고, 또는 다른 치료, 예컨대 병용 치료가 개시된다. 이러한 다른 예에서, 마커가 치료 전 또는 다른 시료와 동일한 수준으로 검출된다면, 다른 치료 옵션을 선택할 수 있다.
히알루로난-관련 질환 및 상태의 마커를 검출하기 위한 검정은 대상체의 조직, 세포 및/또는 체액, 예를 들어 종양 내의 히알루로난 및/또는 히알루로니다아제 발현의 양 (예를 들어, 상대적 양)을 측정하기 위한 검정을 포함한다. 이러한 검정 중에서 특히, HA 발현, 히알루로난 생성 효소 1 (Hyaluronan synthase 1, HAS1) 발현, 히알루로난 생성 효소 2 (HAS2) 발현, 히알루로난 생성 효소 3 (HAS3) 발현, HALO (히알루로난을 포함하는 프로테오글리칸이 풍부한 세포주위 매트릭스 영역)의 존재, 및 히알루로난-분해 효소, 예를 들어, 대상 유래 시료 내 예컨대 히알루로니다아제의 존재를 검출할 수 있는 검정이 포함된다.
단백질 및 핵산 수준을 검출하기 위한 검정은 당업계에 익히 공지되어 있고, 본원의 방법에서 히알루로난, 히알루로난 생성 효소 또는 다른 단백질 및/또는 핵산 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 검정에는 ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 및 유동세포계측법이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 대상 유래의 시료, 예컨대 조직 시료(예를 들어, 환자 또는 동물 모델로부터의 종양의 생검, 기질 시료), 유체(예를 들어, 혈액, 뇨, 혈장, 타액 또는 다른 시료), 세포 또는 세포의 시료, 또는 추출물, 또는 기타 시료는 예를 들면 조직학적 염색, 예컨대 조직 또는 시료 내의 히알루로난의 존재 및 양을 결정하기 위한 고정된 또는 동결된 조직 절편의 면역조직화학적 염색 또는 면역 형광세포 염색, 풀-다운(pull-down) 검정 및 유동세포계측법을 이용하여 항-HA 항체 또는 HA 결합 단백질로 염색될 수 있다. 다른 예에서, 시료, 예를 들어 생검은 HA mRNA의 양을 평가하기 위해 RT-PCR에 의해 분석될 수 있다.
암 내의 히알루로난-발현을 검출하기 위한 공지된 방법에는 방광암을 갖는 대상의 뇨 또는 방광 조직 추출물 내의 HA 수준을 측정하기 위한, Lokeshwar 외., Cancer Res. 57:773-777 (1997)에 기술된 ELISA-유사 검정이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 검정을 위해, 뇨 또는 추출물을 마이크로웰 플레이트 (표준으로서 사용된 제대 HA 또한 코팅됨) 상에 코팅한 후, 본원에 기술된 바와 같은 표지된 (예를 들어, 비오틴화된) HA 결합 단백질과 함께 배양하고 (예를 들어, 16시간, 실온), 세척하고, 웰에 결합된 HA-결합 단백질을 아비딘-바이오틴 검출제 기질을 사용하여 정량한다. 이러한 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 일 예에서, HA-관련 방광암을 갖는 대상 유래의 뇨는 정상적인 환자 (건강한 대상 또는 다른 위-비뇨기 질환 또는 상태를 갖는 대상)유래의 뇨/추출물과 비교하여 2 내지 9배 상승된 HA 수준을 함유하였으며; 그러므로, 마커는 뇨 내의 HA 수준이 정상적인 대상과 비교하여 상승된 경우, 예를 들어 정상적인 대상과 비교하여 약 2배 내지 약 9배 사이, 예를 들어 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배 상승된 경우 검출될 것이다.
추가 예에서, 종양 세포 내의 시험관 내 히알루로난 발현 및 생성은 상기 기술된 임의의 방법 중 하나를 사용하여 평가될 수 있다. 유사하게, 세포에 의한 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내 히알루로난 생성 효소 생성(예를 들어, HAS1, HAS2 또는 HAS3) 및/또는 발현은 또한 예를 들어, ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블럿, PCR, RT-PCR, 면역조직화학, 조직학 또는 유동세포 계측법에 의해 검정될 수 있다.
다른 예에서, 대상 유래의 시료, 예컨대 혈액 또는 혈장 내의 히알루로니다아제 활성의 양은 예를 들어, 탁도 검정에 의해 결정된다.
다른 예에서, 환자 유래의 세포 또는 다른 조직, 예컨대 종양 세포가 분리되고, 치료에 대해 반응하여 상기 세포 또는 조직이 시험관 내에서 히알루로난 분해 효소의 처리에 반응성인지 여부를 결정하기 위한, 예를 들면, 세포 또는 조직, 예컨대 종양 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 측정하기 위한 클론원성 검정 또는 임의의 다른 검정을 사용하는 연구에 사용된다. 예를 들어, 대상 유래의 암 세포는 표면, 예컨대 세포외 매트릭스 또는 단백질 혼합물, 예컨대 상표명 마트리겔®(Matrigel®)(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 시판되는 혼합물 상에 접종될 수 있다. 이 예에서, 히알루로난-관련 마커는 히알루로난 분해 효소의 투여에 대한 상기 세포 또는 조직의 민감성이다. 이 예에서, 세포의 임의의 성질, 예컨대 증식, 성장 또는 생존이 히알루로난 분해 효소의 첨가에 의해 억제되거나 차단되는 경우, 대상은 히알루로난 분해 효소 함유 조성물에 의한 치료에 잘 반응하는 것으로 판단된다.
히알루로난 발현 수준를 결정하기 위한 검정뿐 아니라, 치료 대상을 선택하기 위해서, 및/또는 치료 효능 및/또는 지속 기간을 평가하기 위해서 다른 검정이 사용될 수 있다. 간질액 압력 (IFP)은 적절한 프로브 또는 기구를 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 변환기-장착된 카테터는 암 조직 또는 관심있는 다른 조직 내의 IFP를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 카테터를 수술용 바늘의 내부 구멍을 통해 통과시킨 다음, 종양의 중심에 삽입한다. 카테터를 제자리에서 유지시키면서 바늘을 회수한다. 그 후, IFP (mmHg)는 적절한 데이터 획득 단위 (Ozerdem 외. (2005) Microvasc . Res. 70:116-120)를 사용하여 측정될 수 있다. IFP를 측정하기 위한 다른 방법에는 바늘-중심지(wick-in-needle) 방법 (Fadnes 외. (1977) Microvasc. Res. 14:27-36)이 포함된다.
혈관 부피는 예를 들어, 초음파 영상화에 의해 측정될 수 있다. 이 방법은 검출되는 강한 초음파 반사율을 제공하는 과다-에코 마이크로버블(hyper-echoic microbubbles)을 적용한다. 마이크로버블은, 예컨대 정맥내로 대상 또는 동물 모델에 주사되는 경우 그의 크기로 인해 혈관 공간을 통해 이동한다. 조직 물 함량, 예컨대 종양 조직 물 함량을 평가하기 위한 검정은 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 종양 유래의 시료를 수확하고, 블럿팅하고, 중량측정하고, 동결건조 전에 순간 동결할 수 있다. 그 후, 물 중량을 건조 (즉, 동결건조된) 중량에 대한 조직 습윤 중량의 비로서 보고한다.
세포주위 매트릭스 (HALO)를 형성하는 종양 세포의 능력은 입자 배제 검정 을 사용하여 시험관 내에서 평가될 수 있다. 작은 입자(포르말린-고정된 적혈구)를 예를 들어, 큰 응집 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸인 어그리칸(aggrecan)의 존재하에 종양 세포의 저밀도 배양물에 첨가할 수 있다. 입자가 침강한 후, 임의의 할로가 종양 세포에 의해 형성되었는가를 결정하기 위하여 배양물을 400x 확대로 관찰할 수 있다. 이는 입자가 배제된 세포 주변의 구역으로서 시각화될 수 있다.
임의의 검출 방법에 대하여, 마커의 검출이 전형적으로 대조 시료와 비교하여 판독 결과가 증가되거나 감소된 것을 결정하는 것을 포함하도록, 마커(예를 들어, HA 발현, 히알루로난 분해 효소에 대한 반응성, HA-생성 효소 발현 또는 히알루로니다아제 활성)는 전형적으로 대조 시료와 비교된다.
예를 들어, 대조 시료는 기타 조직, 세포 또는 체액, 예를 들어 정상 조직, 세포 또는 체액이 될 수 있고, 예를 들어, 시험될 시료과 유사하나 상이한 대상, 예컨대 정상적인 대상(즉, 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상, 또는 시험될 대상이 갖는 유형의 질환 또는 상태를 갖지 않은 대상)으로부터 분리된 조직, 세포 또는 체액이 될 수 있고, 예를 들어 히알루로난-관련 질환 또는 상태를 갖지 않는 대상, 또는 유사한 질환 또는 상태를 갖고 있으나 그 질환이 중증은 아니고/아니거나 히알루로난과 관련되어 있지 않거나 상대적으로 적은 히알루로난을 발현하여 적은 등급의 히알루로난-관련도인 다른 대상으로부터의 유사 조직일 수 있다. 예를 들어, 시험될 세포, 조직 또는 체액이 암을 갖는 대상인 경우, 이는 덜 중증인 암, 예컨대 초기 암, 분화 또는 다른 유형의 암을 갖는 대상으로부터의 조직, 세포 또는 체액과 비교될 수 있다. 다른 예에서, 대조 시료는 공지된 양 또는 상대적 양의 HA를 갖는 체액, 조직, 추출물 (예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제형, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료, 예컨대 상대적으로 낮은 수준의 HA를 발현하는 것으로 공지된 시료, 예를 들어 종양 세포주, 예컨대 낮은 수준의 HA를 발현하는 본원에서 기술된 예시적인 종양 세포주, 예를 들어, HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양이다.
HA의 특정 변화, 예를 들어 증가 또는 감소는 사용된 검정에 의존한다는 것이 이해된다. 예를 들어, ELISA에서, 단백질의 특정 파장에서의 흡광도 또는 양의 몇 배 증가 또는 감소 (예를 들어, 표준 곡선을 사용하여 결정됨)는 대조군에 대해 상대적인 것으로 표시될 수 있다. PCR 검정, 예컨대 RT-PCR에서, 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 표준을 사용하여 대조군의 발현 수준과 비교될 수 있다 (예를 들어, 몇 배(fold) 변화로서 표시됨).
예를 들어, 대상 유래의 시료 내의 히알루로난의 양을 시험하는 경우, 마커의 검출은 대상으로부터의 시료 (예를 들어, 암성 세포, 조직 또는 유체) 내의 HA의 양이 대조 시료, 예컨대 이전 단락에 기술된 대조 시료와 비교하여 상승되었는가를 결정할 수 있다. 일 예에서, 암은 조직, 세포 또는 체액 내의 HA의 양이 대조 시료와 비교하여 약 0.5 배, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 11 배, 12 배, 13 배, 14 배, 15 배, 20 배 또는 그 이상으로 상승된 경우 히알루로난-풍부 암인 것으로 결정되고, 대조 시료는 예를 들어, 체액, 조직, 추출물(예를 들어, 세포 추출물 또는 핵 추출물), 핵산 또는 펩티드 제형, 세포주, 생검, 표준 또는 다른 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, HA의 공지된 양 또는 상대적 양을 갖는 예컨대 시료, 예를 들어, HA를 상대적으로 낮은 수준으로 발현하는 것으로 공지된, 종양 세포주, 예컨대 HA를 낮은 수준으로 발현하는 본원에서 기술된 예시적인 종양 세포주, 예를 들어, HCT 116 세포주, HT29 세포주, NCI H460 세포주, DU145 세포주, Capan-1 세포주, 및 이러한 세포주를 사용하여 생성된 종양 모델로부터의 종양일 수 있다.
또한, 이러한 방법에서, 세포-관련 히알루로난의 수준을 저, 중 또는 고로 점수화할 수 있다. 예를 들어, 종양 면적의 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상이 지속된 HA 신호를 나타낸 경우, HA 발현은 고 또는 중으로 고려된다. 전형적으로, 적어도 중 내지 고 HA를 갖는 대상의 치료가 본원에서 고려된다.
2. 투여량 및 투여
항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 및 종양-표적 탁산, 및 선택적으로 뉴클레오시드 유사체와의 추가적인 조합물을 포함하는 본원에서 제공되는 병용 치료는 치료적으로 유용한 효과를 낼 수 있는 충분한 양으로 투여된다. 전형적으로, 활성제는 치료될 대상의 바람직하지 않은 부작용을 유발하지 않는, 또는 상기 제제 중 하나를 갖는 단일 치료에 요구되는 투여량 및 용량과 비교하여 관찰되는 부작용을 최소화하거나 감소시키는 양으로 투여된다. 예를 들어, 본원의 다른곳에서 기술된 바와 같이, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소와 종양-표적 탁산과의 병용 치료는 증가된 종양내 전달 및 병용-투여된 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어, 젬시타빈의 증가된 종양내 반감기를 유발하는 것으로 본원에서 발견된다. 따라서, 본원에서 제공되는 병용 치료에서 투여될 수 있는 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈)의 양은, 종래의 방법(예를 들어, 젬시타빈 단일치료 또는 다른 제제와 함께 이중 치료)을 이용하여 투여되는 뉴클레오시드 유사체의 양과 비교하여, 실질적으로 동일 또는 개선된 치료적 효능을 달성하는 동시에 감소된다. 투여되는 감소된 투여량 덕분에, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈) 투여와 관련된 부작용, 예컨대 면역억제 또는 골수억제는 감소, 최소화 또는 회피된다.
대상에 투여하기 위해 항-히알루로난 제제, 예를 들어 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 종양-표적 탁산, 및 선택적으로 뉴클레오시드 유사체를 포함하는, 활성제의 정확한 양을 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어, 이러한 제제 및 질환 및 상태, 예컨대 암 및 고형 종양을 치료하는 용도는 당업계에 익히 공지되어 있다. 따라서, 조성물 또는 병용 치료에서의 이러한 제제의 투여량은 주어지는 투여 경로 하에서 그 제제에 대한 표준 투여 요법에 기반을 두어 선택될 수 있다.
정확한 투여량 및 치료 지속기간은 치료될 조직 또는 종양과 상관관계가 있고 공지된 시험 프로토콜을 사용하여 또는 생체 내 또는 시험관 내 시험 데이터로부터 추론에 의해 경험적으로 결정될 수 있고 및/또는 특정 제제의 공지된 투여 요법으로부터 결정될 수 있다고 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 치료되는 개인의 연령, 개인의 체중, 투여 경로 및/또는 질환의 범위 또는 중증도 및 숙련된 의사가 고려할 수준 내의 다른 요인에 따라 다양할 수 있다는 점이 언급된다. 일반적으로, 투여 요법은 독성을 제한하기 위해 선택된다. 담당의사는 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 또는 다른 조직 기능장애에 따라 어떻게 그리고 언제 치료를 종결, 중단 또는 투여량을 낮추도록 치료를 조정할 지에 대해 알 것이라고 언급되어야 한다. 반대로, 담당의사는 또한 임상적 반응이 적절하지 않다면(독성 부작용을 막으면서) 어떻게 또는 언제 더 높은 수준으로 처리를 조정할 지에 대해 알 것이다. 임의의 특정한 대상에서, 특이적인 투여 요법은 개인적 필요 및 제형의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하고 여기서 서술된 농도 범위는 단지 예시이며 그 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것으로 또한 이해될 것이다.
예를 들어, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 PH20 (예를 들어, PEGPH20)과 같은 히알루로니다아제가 종양-관련 히알루로난을 분해하거나 전달하기에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 질환 또는 상태, 예를 들어 암 또는 HA-풍부 종양과 같은 고형 종양의 치료를 위해 투여되는 히알루로난 분해 효소 예컨대 가용성 히알루로니다아제의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 검정 및 동물 모델은 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되도록 이용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는, 정확한 투여량은 특정 효소, 투여 경로, 치료될 질환의 종류 및 질환의 중증도에 의존적일 수 있다. 예시적인 투여량 범위는 약 50 유닛 내지 50,000,000 유닛의 폴리머에 콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 또는 폴리머에 콘주게이트된 다른 히알루로난 분해 효소의 기능적으로 동등한 양이다. 활성의 유닛은 표준 활성, 예를 들어 히알루로니다아제 활성을 검정하는 미세탁도 검정에서 측정되는 활성에 대하여 정규화되는 것으로 본원에서 이해된다.
따라서, 예를 들어, 폴리머에 콘주게이트된 히알루로난 분해 효소, 예컨대 PH20과 같은 히알루로니다아제, 예를 들어, PEG는 약 10 내지 50,000,000 유닛, 10 내지 40,000,000 유닛, 10 내지 36,000,000 유닛, 10 내지 12,000,000 유닛, 10 내지 1,200,000 유닛, 10 내지 1,000,000 유닛, 10 내지 500,000 유닛, 100 내지 100,000 유닛, 500 내지 50,000 유닛, 1000 내지 10,000 유닛, 5000 내지 7500 유닛, 5000 유닛 내지 50,000 유닛, 또는 1,000 내지 10,000 유닛으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소는 대상에 약 0.01 μg/kg 내지 25 mg/kg, 예컨대 0.0005 mg/kg (0.5 μg/kg) 내지 25 mg/kg, 0.5 μg/kg 내지 10 mg/kg, 0.02 mg/kg 내지 1.5 mg/kg, 0.01 μg/kg 내지 15 μg/kg, 0.05 μg/kg 내지 10 μg/kg, 0.75 μg/kg 내지 7.5 μg/kg 또는 1.0 μg/kg 내지 3.0 μg/kg의 양으로 투여된다. 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소는 예를 들어, 전형적으로 약 70 kg 내지 75 kg의 체중인 평균 성인 대상에게 한번의 투여량으로 적어도 약 0.0005 mg/kg (대상의), 0.0006 mg/kg, 0.0007 mg/kg, 0.0008 mg/kg, 0.0009 mg/kg, 0.001 mg/kg, 0.0016 mg/kg, 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.016 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg.kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8 mg/kg, 8.5 mg/kg, 9 mg/kg, 9.5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다.
본원에서 제공되는, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 PEG화 히알루로니다아제(예컨대 PEGPH20)는 투여되는 대상 질량의 약 1 유닛/kg 내지 800,000 유닛/kg, 예컨대 10 내지 800,000 유닛/kg, 10 내지 750,000 유닛/kg, 10 내지 700,000 유닛/kg, 10 내지 650,000 유닛/kg, 10 내지 600,000 유닛/kg, 10 내지 550,000 유닛/kg, 10 내지 500,000 유닛/kg, 10 내지 450,000 유닛/kg, 10 내지 400,000 유닛/kg, 10 내지 350,000 유닛/kg, 10 내지 320,000 유닛/kg, 10 내지 300,000 유닛/kg, 10 내지 280,000 유닛/kg, 10 내지 260,000 유닛/kg, 10 내지 240,000 유닛/kg, 10 내지 220,000 유닛/kg, 10 내지 200,000 유닛/kg, 10 내지 180,000 유닛/kg, 10 내지 160,000 유닛/kg, 10 내지 140,000 유닛/kg, 10 내지 120,000 유닛/kg, 10 내지 100,000 유닛/kg, 10 내지 80,000 유닛/kg, 10 내지 70,000 유닛/kg, 10 내지 60,000 유닛/kg, 10 내지 50,000 유닛/kg, 10 내지 40,000 유닛/kg, 10 내지 30,000 유닛/kg, 10 내지 20,000 유닛/kg, 10 내지 15,000 유닛/kg, 10 내지 12,800 유닛/kg, 10 내지 10,000 유닛/kg, 10 내지 9,000 유닛/kg, 10 내지 8,000 유닛/kg, 10 내지 7,000 유닛/kg, 10 내지 6,000 유닛/kg, 10 내지 5,000 유닛/kg, 10 내지 4,000 유닛/kg, 10 내지 3,000 유닛/kg, 10 내지 2,000 유닛/kg, 10 내지 1,000 유닛/kg, 10 내지 900 유닛/kg, 10 내지 800 유닛/kg, 10 내지 700 유닛/kg, 10 내지 500 유닛/kg, 10 내지 400 유닛/kg, 10 내지 300 유닛/kg, 10 내지 200 유닛/kg, 10 내지 100 유닛/kg, 16 내지 600,000 유닛/kg, 16 내지 500,000 유닛/kg, 16 내지 400,000 유닛/kg, 16 내지 350,000 유닛/kg, 16 내지 320,000 유닛/kg, 16 내지 160,000 유닛/kg, 16 내지 80,000 유닛/kg, 16 내지 40,000 유닛/kg, 16 내지 20,000 유닛/kg, 16 내지 16,000 유닛/kg, 16 내지 12,800 유닛/kg, 16 내지 10,000 유닛/kg, 16 내지 5,000 유닛/kg, 16 내지 4,000 유닛/kg, 16 내지 3,000 유닛/kg, 16 내지 2,000 유닛/kg, 16 내지 1,000 유닛/kg, 16 내지 900 유닛/kg, 16 내지 800 유닛/kg, 16 내지 700 유닛/kg, 16 내지 500 유닛/kg, 16 내지 400 유닛/kg, 16 내지 300 유닛/kg, 16 내지 200 유닛/kg, 16 내지 100 유닛/kg, 160 내지 12,800 유닛/kg, 160 내지 8,000 유닛/kg, 160 내지 6,000 유닛/kg, 160 내지 4,000 유닛/kg, 160 내지 2,000 유닛/kg, 160 내지 1,000 유닛/kg, 160 내지 500 유닛/kg, 500 내지 5000 유닛/kg, 1000 내지 100,000 유닛/kg 또는 1000 내지 10,000 유닛/kg으로 투여될 수 있다. 일부 예에서, 히알루로난-분해 효소, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 예컨대 PEG화 히알루로니다아제 (예를 들어 PEGPH20)는 약 1 유닛/kg 내지 1000 유닛/kg, 1 유닛/kg 내지 500 유닛/kg 또는 10 유닛/kg 내지 50 유닛/kg로 투여될 수 있다.
일반적으로, PEG화 히알루로니다아제의 특정 활성은 대상의 질량당 약 10,000 U/mg 내지 80,000 U/mg, 예컨대 20,000 U/mg 내지 60,000 U/mg 또는 l8,000 U/mg 내지 45,000 U/mg, 일반적으로 약 1 유닛/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8 U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/kg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1,000 U/kg, 2,000 U/kg, 3,000 U/kg, 4,000 U/kg, 5,000 U/kg, 6,000 U/kg, 7,000 U/kg, 8,000 U/kg, 9,000 U/kg, 10,000 U/kg, 12,800 U/kg, 20,000 U/kg, 32,000 U/kg, 40,000 U/kg, 50,000 U/kg, 60,000 U/kg, 70,000 U/kg, 80,000 U/kg, 90,000 U/kg, 100,000 U/kg, 120,000 U/kg, 140,000 U/kg, 160,000 U/kg, 180,000 U/kg, 200,000 U/kg, 220,000 U/kg, 240,000 U/kg, 260,000 U/kg, 280,000 U/kg, 300,000 U/kg, 320,000 U/kg, 350,000 U/kg, 400,000 U/kg, 450,000 U/kg, 500,000 U/kg, 550,000 U/kg, 600,000 U/kg, 650,000 U/kg, 700,000 U/kg, 750,000 U/kg, 800,000 U/kg 또는 그 이상이 투여된다. 예를 들어, 60,000 U; 70,000 U; 80,000 U; 90,000 U; 100,000 U; 200,000 U; 300,000 U; 400,000 U; 500,000 U; 600,000 U; 700,000 U; 800,000 U; 900,000 U; 1,000,000 U; 1,500,000 U; 2,000,000 U; 2,500,000 U; 3,000,000 U; 3,500,000 U; 4,000,000 U 또는 그 이상이 투여된다.
본원의 예에서, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 종양내 전달을 달성하기에 충분한 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 일부 예에서, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 치료가 부존재하는 경우와 비교하여 종양내 탈아미노 효소(deaminase)(예를 들어, 시티딘 탈아미노 효소(deaminase)) 단백질 수준을 예컨대 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상까지 감소 또는 저하시키기 위해 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 특정 예에서, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 치료가 부존재하는 경우와 비교하여 병용-투여된 뉴클레오시드 유사체(예를 들어 젬시타빈 또는 유도체)의 종양내 수준을 증가시키기에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 예를 들어, 종양내 젬시타빈은 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상까지 증가된다. 질환 또는 상태 예를 들어 암 또는 고형 종양 예컨대 HA-풍부 종양의 치료를 위해 투여되는 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 검정 및 동물 모델은 최적 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는, 정확한 투여량은 특정 탁산, 특정 제형(예를 들어 나노입자 또는 리포솜 제형), 투여 경로, 치료될 질환 유형 및 질환의 중증도에 의존적일 수 있다.
전형적으로, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 대상의 체표면적(BSA; ㎡)에 관하여 대상에 약 1 mg/㎡ 내지 1000 mg/㎡, 예컨대 약 10 mg/㎡ 내지 500 mg/㎡, 50 mg/㎡ 내지 400 mg/㎡, 25 mg/㎡ 내지 300 mg/㎡, 및 일반적으로 적어도 약 20 mg/㎡, 30 mg/㎡, 40 mg/㎡, 50 mg/㎡, 60 mg/㎡, 70 mg/㎡, 80 mg/㎡, 90 mg/㎡, 100 mg/㎡, 150 mg/㎡, 200 mg/㎡, 250 mg/㎡, 300 mg/㎡ 가 투여된다. 일부의 경우에, 기존의 제형 또는 투여 요법과 비교하여, 적은 투여량의 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)이 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 적어도 약 50 mg/㎡ 또는 100 mg/㎡ 그러나 260 mg/㎡, 200 mg/㎡ 또는 150 mg/㎡보다 적은 양으로 대상에 투여된다. 다른 예에서, 투여당 투여되는 투여량은 기존의 투여량 및 투여 요법과 동일하지만, 투여 스케줄은 투여의 주기당 적은 양의 뉴클레오시드 유사체가 투여되도록 감소된다. 다른 경우, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 기존의 제형 또는 투여 요법에 비해 대상에 높은 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 종양-표적 탁산, 예컨대 알부민-결합 탁산(예를 들어, 알부민-결합 파클리탁셀)은 적어도 약 300 mg/㎡, 예컨대 약 300 mg/㎡ 내지 1000 mg/㎡의 양으로 대상에 투여된다. 대상의 키 및 체중에 기초하여 mg/kg 으로 상응하는 투여량을 전환시키거나 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어, BSA는 식 (키 (cm) x 체중 (kg)/3600)1 /2 에 의해 결정된다. 평균 어른의 BSA는 1.73 ㎡이다.
본원의 예에서, 병용 치료는 선택적으로 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈 또는 유도체 또는 다른 유사체)의 추가적인 투여를 포함한다. 젬시타빈은 종양내 전달을 달성하기에 충분한 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 특정의 예에서, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈 또는 유도체 또는 다른 유사체)는 단독으로 투여되는 경우의 종양내 수준과 비교하여 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 10-배 또는 그 이상 증가된 종양내 수준을 달성하기 위한 양으로 본원의 병용 치료에서 병용-투여된다. 질환 또는 상태, 예를 들어 암 또는 HA-풍부 종양과 같은 고형 종양의 치료를 위해 투여되는 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈, 이의 유도체 또는 본원에서 기술된 다른 유사체)의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 시험관 내 검정 및 동물 모델은 최적 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는 정확한 투여량은 특정 뉴클레오시드 유사체, 특정 제형, 투여 경로, 치료될 질환의 유형 및 질환의 중증도에 의존적일 수 있다.
전형적으로, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈 또는 이의 유도체 또는 다른 유사체)는 대상의 체표면적(BSA;㎡)에 관하여 약 100 mg/㎡ 내지 2500 mg/㎡, 예컨대 약 500 mg/㎡ 내지 2000 mg/㎡, 750 mg/㎡ 내지 1500 mg/㎡, 1000 mg/㎡ 내지 1500 mg/㎡, 또는 500 mg/㎡ 내지 1500 mg/㎡, 및 일반적으로 적어도 약 500 mg/㎡, 600 mg/㎡, 700 mg/㎡, 800 mg/㎡, 900 mg/㎡, 1000 mg/㎡, 1250 mg/㎡, 1500 mg/㎡, 1750 mg/㎡, 2000 mg/㎡ 또는 그 이상으로 대상에 투여된다. 일부 경우에, 기존의 제형 또는 투여 요법과 비교하여 적은 투여량의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈 또는 이의 유도체 또는 다른 탁산)가 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 젬시타빈 또는 이의 유도체 또는 다른 탁산)가 적어도 약 200 mg/㎡ 또는 500 mg/㎡, 그러나 1000 mg/㎡ 또는 1250 mg/㎡보다 적은 양으로 대상에 투여된다. 다른 경우에, 투여당 투여되는 투여량은 기존의 투여량 및 투여 요법과 동일하지만, 투여 스케줄은 투여의 주기당 적은 양의 뉴클레오시드 유사체가 투여되도록 감소된다. mg/kg로 상응하는 투여량을 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다.
본원에서 제공되는 제제는 정맥내, 피하, 종양내, 피부내, 경구 또는 다른 투여 경로로 투여될 수 있다. 특정 경로는 투여되는 제제 간에 다르거나 동일할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상, 또는 모든 제제는 피하로 투여될 수 있다. 특정 예에서, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소는 피하로 투여될 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 이러한 예에서, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소는 동시 정맥내 투여 요법만큼 유사한 종양 활성을 유발하기 위하여 혈류내 생체이용가능한 효소를 달성하기 위한 1-8 시간, 예컨대 1-2 시간 흡수를 허용하는 투여 요법으로 투여된다. 본원의 예에서, 종양-표적 탁산 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 또한 피하로 투여될 수 있다. 특정 피하 제형 또는 하나 이상의 제제의 공동-제형은 제제의 충분한 생체이용률을 달성하기 위해 그리고 주사 부위 반응을 최소화하기 위해 제공된다.
다른 예에서, 하나 이상 또는 모든 제제는 정맥내로 투여될 수 있다. 이러한 예에서, 하나 이상 또는 모든 제제는 푸시에 의해 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 푸시 또는 주입시간은 1 분 내지 60 분일 수 있고, 일반적으로 약 10 분 내지 40 분일 수 있고 60 분을 넘지 않는다. 상기 제제는 동시 주입에 의해 또는 이후의 주입에 의해 투여될 수 있다. 일 예에서, 본원에서 제공되는 병용 치료의 두 개의 제제 또는 세 개의 투여된 모든 제제는 동시에 주입된다. 이러한 예에서, 투여된 제제는 동일한 포장 내에 함께 주입을 하기 위한 동일한 조성물로 제공된다. 다른 경우에, 투여되는 제제는 별개의 조성물로 제공되지만, 주입 바로 전에 하나의 주입액(infusate)으로서 단일 포장으로 조합된다. 추가의 예에서, 투여되는 제제는 동시에 또는 거의 동시에 주입 또는 이어서 주입되고 별개의 주입을 위한 별개의 포장으로 되어 있다.
3. 투여 용법: 투여의 빈도 및 주기
항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소는 종양-표적 탁산 전에, 동시에 또는 거의 동시에, 연속적으로 또는 간헐적으로 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제, 예컨대, 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 및 종양-표적 탁산은 함께 또는 별개로 병용-투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 제제는 서로간에 즉시, 예컨대 서로 30 초 내지 15 분 내에 투여, 예컨대 15 분, 14 분, 12 분, 10 분, 5 분, 2 분, 1 분 또는 30 초 보다 적은 시간 내로 투여될 수 있다. 다른 경우에, 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 및 종양-표적 탁산은 연속적으로 및/또는 간헐적으로 투여된다. 이러한 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소가 첫번째로 투여될 수 있거나 종양-표적 탁산이 첫번째로 투여될 수 있다. 일반적으로, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소는 종양-표적 탁산 전에 투여된다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제, 또는 히알루로난 분해 효소는 종양-표적 탁산 투여의 적어도 약 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 전에 투여된다.
본원의 병용 치료의 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소) 및/또는 종양 표적-탁산 전에, 동시에 또는 거의 동시에, 연속적으로 또는 간헐적으로 그와 함께 투여될 수 있다. 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소) 및/또는 종양-표적 탁산 중 하나 또는 둘과 함께 또는 별개로 병용-투여될 수 있다. 별개로 투여되는 경우, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 투여 바로 전 또는 후에, 예컨대 서로 30 초 내지 15 분 내, 예컨대 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소) 및/또는 종양-표적 탁산으로부터 15 분, 14 분, 12 분, 10 분, 5 분, 2 분, 1 분 또는 30 초 보다 적은 시간 내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소 후에 투여된다. 일부의 경우에, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 및 종양-표적 탁산 후에 투여된다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소) 및/또는 종양-표적 탁산의 투여의 적어도 약 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 후에 투여된다.
본원의 일 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소는 다른 제제와 별개로 투여되고 종양-표적 탁산 전 또는 후에 즉시 투여된다. 예를 들어, 히알루로난 분해 효소는 종양-표적 탁산의 15 분, 14 분, 12 분, 10 분, 5 분, 2 분, 1 분 또는 30 초보다 적은 시간 전 또는 후에 투여된다. 이러한 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소) 및 종양-표적 탁산 후에 투여된다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 히알루로난 분해 효소 및 종양-표적 탁산 투여의 적어도 약 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 후에 투여된다.
다른 예에서, 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소는 종양-표적 탁산 전에 투여되고, 종양-표적 탁산은 뉴클레오시드 유사체 전에 투여된다. 예를 들어, 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난 분해 효소)는 종양-표적 탁산의 투여의 적어도 약 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 전에 투여된다. 이러한 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 종양-표적 탁산의 투여의 적어도 약 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 18 시간, 20 시간, 22 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간 또는 48 시간 후에 투여된다.
투여의 빈도 및 시기, 및 투여량은 원하는 길이의 시간동안 활성제의 연속적 및/또는 장기간의 효과를 유지하기 위해 투여의 주기동안 정기적으로 투여될 수 있다. 조합물 또는 조성물은 매 시간, 매 일, 매 주, 매 달, 매 년 또는 한 번 투여될 수 있다. 투여 주기의 시간의 길이는 경험적으로 결정될 수 있고, 치료될 질환, 질환의 중증도, 특정 환자, 및 치료하는 의사의 수준 내의 다른 고려사항에 의존적이다. 본원에서 제공되는 병용 치료로의 치료의 시간의 길이는 일 주, 이 주, 한 달, 몇 달, 일 년, 몇 년 또는 그 이상일 수 있다. 투여량은 치료 과정동안 복수의 투여 주기로 분할될 수 있다. 예를 들어, 변형된 히알루로니다아제 효소는 일 년 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 매 주 두 번 투여될 수 있다. 질환의 증상이 치료 중단의 부재하에서 지속되는 경우, 치료는 추가적인 길이의 시간동안 계속될 수 있다. 치료 과정동안, 질환의 증거 및/또는 치료-관련 독성 또는 부작용이 모니터링될 수 있다.
또한, 투여의 주기는 제제에 대한 노출로부터 휴지기를 제공하기 위해 치료 중단의 기간을 추가하도록 맞추어질 수 있다. 치료의 중단을 위한 시간의 길이는 예정된 기간일 수 있거나 환자가 어떻게 반응하는지에 의존하여 또는 관찰된 부작용에 의존하여 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 치료는 일 주, 이 주, 한 달, 또는 몇 달동안 중단될 수 있다. 일반적으로, 치료 중단의 기간은 환자에 대해 투여 요법의 주기로 내재되어 있다.
예를 들어, 예시적인 투여 요법은 28일의 치료 주기 또는 투여 주기이다. 상기 제제, 예컨대 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 종양-표적 탁산 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 매주 한 번 또는 매주 두 번 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 첫 3 주 동안은 매주 한 번 또는 매주 두 번씩, 이후 일주일 동안 투여하지 않게 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 환자에 28-일 주기의 과정동안, 1, 4, 8, 11, 15 및 18 일 (또는 0, 3, 6, 9, 12 및 15 일)에 매주 두 번씩 제제가 투여될 수 있고 이 후, 1 주 동안의 치료 중단 기간이 이어진다. 다른 예에서, 환자에 28-일 주기의 과정동안 1, 8 및 16 일에 매주 한 번씩 제제가 투여될 수 있고, 1 주의 치료 중단 기간이 이어진다. 다른 예에서, 상기 제제는 매주 한 번 또는 매주 두 번씩 전체 28일 동안 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 환자에 전체 28일 주기동안 매주 두 번 1, 4, 8, 11, 15, 18, 21 및 24일에(또는 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21 또는 25 일에) 상기 제제가 투여될 수 있다. 다른 예에서, 환자에 전체 28일 주기동안 매주 한 번 1, 8, 16 또는 24일에 상기 제제가 투여될 수 있다. 상기 상세한 설명은 예시적인 목적만을 위한 것이고, 상기의 변형이 이용될 수 있다는 것이 이해된다. 또한, 유사한 투여 주기가 모든 투여 제제에 적용될 수 있거나 각각의 투여된 제제는 본원에서 제공되는 병용 치료에서 그의 투여 요법에 적용될 수 있다.
정확한 투여 주기 및 투여 스케줄을 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다. 상기 기재한 바와 같이, 투여의 주기는 임의의 원하는 시간의 길이일 수 있다. 그러므로, 28-일 투여 주기는 임의의 시간 길이로 반복될 수 있다. 치료될 환자 및 질환에 특이적인 개인적 고려사항에 의존적으로 환자의 요구를 만족시키는 투여의 주기 및 투여 요법을 채택하는 것은 치료하는 의사의 능력의 수준 내이다.
일반적으로, 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 젬시타빈 또는 유사체의 투여의 시기는 전형적으로 항-히알루로난 제제, 예컨대 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 투여 주기와 상관관계가 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 투여 주기에서 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난 분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 첫번째 투여 후 및/또는 상기 주기에서 임의의 하나 이상의 연속적인 투여 후에 투여될 수 있다. 다른 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 주기에서 항-히알루로난 제제(예컨대 히알루로난-분해 효소) 및/또는 종양-표적 탁산의 각각의 연속적인 투여 이후, 주기에서 히알루로난-분해 효소 및/또는 종양-표적 탁산의 한 번 걸러 연속적인 모든 다른 투여 이후 투여되거나 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 투여 주기동안 1 주에 한 번, 매 2 주에 한 번, 매 3 주에 한 번, 또는 한 달에 한 번 투여된다. 일부 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 오직 항-히알루로난 제제, 예컨대 히알루로난-분해 효소, 및/또는 종양-표적 탁산의 투여 주기당 한 번 투여된다. 추가적인 예에서, 뉴클레오시드 유사체는 투여의 주기 사이에 간헐적으로 투여된다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 투여의 첫번째 주기 동안 투여되지 않으나, 두번째 주기동안 투여되고, 이후 세번째 주기는 건너뛰고 네번째 주기동안 다시 투여되는 등, 또는 이의 임의의 변화가 가능하다.
본원의 병용 치료의 특정 예에서, 상기 방법은 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산을 동시에 또는 거의 동시에, 예를 들어 부수적으로 투여하는 것을 포함한다. 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산은 예정된 수 주 동안 매주 두 번 또는 매주 한 번의 투여 빈도로 투여될 수 있다. 특정한 경우, 항-히알루로난 제제는 매주 두 번 투여되고 종양-표적 탁산은 매주 한 번 투여된다. 선택적으로, 뉴클레오시드 유사체는 또한 병용 치료에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 유사체는 예정된 수 주 동안 매주 한 번 투여되고, 전형적으로 뉴클레오시드 유사체는 항-히알루로난 제제 및 종양-표적 탁산의 투여 1 주 후 투여된다. 상기 방법은 또한 항-히알루로난 제제의 투여 전, 동시에, 간헐적으로 또는 그 이후에 코르티코스테로이드의 투여를 포함할 수 있다. 투여의 주기는 임의의 기간동안 일 수 있고, 치료하는 의사 또는 임상의의 수준 내이다. 전형적으로, 예정된 수 주는 3 주 또는 4 주이지만, 더 길 수 있다. 투여의 주기는 질환 상태 및 대상의 반응에 의존적으로 수 회로 반복될 수 있다.
4. 추가 병용 치료
본원에서 제공되는 병용 치료는 단독으로 또는 다른 치료 또는 처리와 추가적으로 병용하여 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 조합물 또는 조성물은 다른 치료적 또는 약리학적 제제 또는 치료, 예컨대 절차와 함께, 그 전에, 그와 함께 간헐적으로, 또는 그 다음에 공-제형화되거나 병용-투여될 수도 있다. 예를 들어, 이러한 제제는 다른 생물제제, 항암제, 저분자 화합물, 분산제, 마취제, 혈관수축제 및 수술, 그리고 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 제제는 또한 부작용을 개선, 감소 또는 예방하기 위한 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다. 일부의 경우, 병용 치료는 일차 종양을 제거하거나 치료 전 대상의 면역반응을 억제하는 하나 이상의 암 치료와 병용하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 화학 치료 또는 방사선 치료는 본원에서 제공되는 병용 치료에 추가하여 사용될 수 있다. 이러한 추가적 치료는 대상 면역 시스템을 약화시키는 효과를 가질 수 있다. 다른 예에서, 외과적 제거 수술 및/또는 면역-시스템 약화 치료가 필요하지 않을 수 있다. 본원에서 조합될 수 있는 예시적인 다른 방법은 면역 시스템의 약화(예를 들어, 종양 억제 화합물 또는 종양 세포-특이적 화합물을 투여함으로써) 또는 혈관형성-억제 화합물의 투여 없이 종양 또는 신생 세포의 증식률을 감소시키는 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
제2 제제 또는 제제들의 제제 또는 치료 또는 치료들은 즉각 투여될 수 있거나, 시간 간격을 두고 투여될 수 회의 더 작은 용량으로 분할될 수 있다. 선택된 제제/치료 제제는 치료 시간의 과정 예를 들어 몇 시간, 몇 일, 몇 주, 또는 몇 달을 통해 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부의 경우, 지속된 투여는 유용하다. 정확한 투여량 및 투여의 과정은 징후 및 환자의 내약성에 의존하는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본원의 제2제제/치료를 위한 투여 요법은 당업자에게 공지되어 있다.
a. 코르티코스테로이드( Corticosteroids )
본원에서 제공되는 병용 치료는 단독으로 또는 추가적으로 하나 이상의 코르티코스테로이드와 병용하여 사용될 수 있다. 코르티코스테로이드는 폴리머-콘주게이트된 히알루로난 분해 효소 또는 다른 제제의 투여의 하나 이상의 유해한 효과, 특히, 유해한 근골격 효과를 개선하거나 감소시키는데 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 치료적으로 유효한 양은 하나 이상의 증상 또는 유해한 효과를 개선, 예방, 제거 또는 감소시키는데 충분한 투여량이다. 개선 또는 성공적 전처리의 지표는 CTCAE 등급상의 해당 스코어 또는 CTCAE 등급상의 등급 또는 중증도의 변화를 나타내는 실패의 결정을 포함한다.
코르티코스테로이드는 부신 피질에서 생산되는 스테로이드 호르몬의 한 종류이다. 코르티코스테로이드는 스트레스 반응, 면역반응 및 염증 조절, 탄수화물 대사, 단백질 대사, 혈액 전해질 수준, 및 행동과 같은 넓은 범위의 생리적 시스템과 관련이 있다. 코르티코스테로이드는, 다수의 다른 작용을 갖는 항-염증성 제제인 글루코코르티코이드 및 신장에 대한 작용을 통하여 염 및 물의 균형을 주로 조절하는 미네랄로코르티코이드를 포함한다.
글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체에 결합하는 스테로이드 호르몬, 예를 들어 코르티코스테로이드의 한 종류이다. 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체에 결합함으로써 그들의 효과를 야기한다. 활성 중에서 특히, 활성화된 글루코코르티코이드 복합체는 교대로 핵내에서 항-염증 단백질의 발현을 상향-조절하고, 세포기질(cytosol)로부터 핵 내로 다른 전사 인자들의 위치 이동(translocation)을 막음으로써, 세포 기질내 전-염증 단백질의 발현을 억제한다.
일반적으로, 임의의 코르티코스테로이드, 예를 들어 글루코코르티코이드를 본원에서 제공된 방법 또는 조합물에 사용될 수 있다. 글루코코르티코이드는 합성 및 비-합성 글루코코르티코이드를 포함한다. 예시적인 글루코코르티코이드는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 알클로메타손(alclometasones), 알게스톤(algestones), 베클로메타손(beclomethasones)(예컨대 베클로메타손 디프로피오네이트(beclomethasone dipropionate)), 베타메타손(betamethasones)(예컨대 베타메타손 17-발레레이트(betamethasone 17-valerate), 베타메타손 소디움 아세테이트(betamethasone sodium acetate), 베타메타손 소디움 포스페이트(betamethasone sodium phosphate), 베타메타손 발레레이트(betamethasone valerate)), 부데소나이드(budesonides), 클로베타솔(clobetasols)(예컨대 클로베타솔 프로피오네이트(clobetasol propionate)), 클로베타손(clobetasones), 클로코르톨론(clocortolones)(예컨대 클로코르톨론 피발레이트(clocortolone pivalate)), 클로프레드놀(cloprednols), 코르티코스테론(corticosterones), 코르티손(cortisones) 및 하이드로코르티손(hydrocortisones)(예컨대 하이드로코르티손 아세테이트(hydrocortisone acetate)), 코티바졸(cortivazols), 데플라자코트(deflazacorts), 데소나이드(desonides), 데속시메타손(desoximetasones), 덱사메타손(예컨대 덱사메타손 21-포스페이트(dexamethasone 21-phosphate), 덱사메타손 아세테이트(dexamethasone acetate), 덱사메타손 소디움 포스페이트(dexamethasone sodium phosphate)), 디플로라존(diflorasones)(예컨대 디플로라존 디아세테이트(diflorasone diacetate)), 디플루코르톨론(diflucortolones), 디플루프레드네이트(difluprednates), 에녹솔론(enoxolones), 플루아자코르트(fluazacorts), 플루클로로나이드(flucloronides), 플루드로코르티손(fludrocortisones)(예컨대 플루드로코르티손 아세테이트(fludrocortisone acetate)), 플루메타손(flumethasones)(예컨대 플루메타손 피발레이트(flumethasone pivalate)), 플루니솔라이드(flunisolides), 플루시놀론(fluocinolones)(예컨대 플루시놀론 아세토나이드(fluocinolone acetonide)), 플루오시노나이드(fluocinonides), 플루오코르틴(fluocortins), 플루오코르톨론(fluocortolones), 플루오로메톨론(fluorometholones)(예컨대 플루오로메톨론 아세테이트(fluorometholone acetate)), 플루페롤론(fluperolones)(예컨대 플루페롤론 아세테이트(fluperolone acetate)), 플루프레드니덴(fluprednidenes), 플루프레드니솔론(fluprednisolones), 플루란드레놀라이드(flurandrenolides), 플루티카손(fluticasones)(예컨대 플루티카손 프로피오네이트(fluticasone propionate)), 포르모코르탈(formocortals), 할시노나이드(halcinonides), 할로베타솔(halobetasols), 할로메타손(halometasones), 할로프레돈(halopredones), 하이드로코르타메이트(hydrocortamates), 하이드로코르티손(hydrocortisones)(예컨대 하이드로코르티손 21-부티레이트(hydrocortisone 21-butyrate)), 하이드로코르티손 아세포네이트(hydrocortisone aceponate), 하이드로코르티손 아세테이트(hydrocortisone acetate), 하이드로코르티손 부테프레이트(hydrocortisone buteprate), 하이드로코르티손 부티레이트(hydrocortisone butyrate), 하이드로코르티손 싸이피오네이트(hydrocortisone cypionate), 하이드로코르티손 헤미석시네이트(hydrocortisone hemisuccinate), 하이드로코르티손 프로부테이트(hydrocortisone probutate), 하이드로코르티손 소디움 포스페이트(hydrocortisone sodium phosphate), 하이드로코르티손 소디움 석시네이트(hydrocortisone sodium succinate), 하이드로코르티손 발레레이트(hydrocortisone valerate)), 로테프레드놀 에타보네이트(loteprednol etabonate), 마지프레돈(mazipredones), 메드라이손(medrysones), 메프레드니손(meprednisones), 메틸프레드니솔론(methylprednisolones)(메틸프레드니솔론 아세포네이트(methylprednisolone aceponate), 메틸프레드니솔론 아세테이트(methylprednisolone acetate), 메틸프레드니솔론 헤미석시네이트(ethylprednisolone hemisuccinate), 메틸프레드니솔론 소디움 석시네이트(methylprednisolone sodium succinate)), 모메타손(mometasones)(예컨대 모메타손 퓨로에이트(mometasone furoate)), 파라메타손(paramethasones)(예컨대 파라메타손 아세테이트(paramethasone acetate)), 프레드니카베이트(prednicarbates), 프레드니솔론(prednisolones)(예컨대 프레드니솔론 25-디에틸아미노아세테이트(prednisolone 25-diethylaminoacetate), 프레드니솔론 소디움 포스페이트(prednisolone sodium phosphate), 프레드니솔론 21-헤미석시네이트(prednisolone 21-hemisuccinate), 프레드니솔론 아세테이트(prednisolone acetate); 프레드니솔론 파네실레이트(prednisolone farnesylate), 프레드니솔론 헤미석시네이트(prednisolone hemisuccinate), 프레드니솔론-21(prednisolone-21)(베타-D-글루쿠로나이드(beta-D-glucuronide)), 프레드니솔론 메타설포벤조에이트(prednisolone metasulphobenzoate), 프레드니솔론 스테아글레이트(prednisolone steaglate), 프레드니솔론 테부테이트(prednisolone tebutate), 프레드니솔론 테트라하이드로프탈레이트(prednisolone tetrahydrophthalate)), 프레드니손(prednisones), 프레드니발(prednivals), 프레드닐리덴(prednylidenes), 리멕솔론(rimexolones), 틱소코르톨(tixocortols), 트리암시놀론(triamcinolones)(예컨대 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 트리암시놀론 베네토나이드(triamcinolone benetonide), 트리암시놀론 헥사세토나이드(triamcinolone hexacetonide), 트리암시놀론 아세토나이드 21-팔미테이트(triamcinolone acetonide 21-palmitate), 트리암시놀론 디아세테이트(triamcinolone diacetate)). 이 글루코코르티코이드 및 그의 염은 자세하게, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (16th ed. 1980)에서 논의된다.
일부 예에서, 글루코코르티코이드는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프레드니손 중에서 선택된다. 특정 예에서, 글루코코르티코이드는 덱사메타손이다.
코르티코스테로이드는 치료적으로 유효한 투여량으로 제공된다. 치료적으로 유효한 농도는 공지의 시험관 내 또는 생체 내(예컨대 동물 모델) 시스템에서 시험됨으로써 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 유해한 효과를 개선하기 위해 투여되도록 선택된 코르티코스테로이드의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 동물 모델은 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있다. 경험적으로 결정될 수 있는 정확한 투여량은 특정한 치료적 제제, 투여 요법 및 투여 스케줄, 투여 경로 및 질환의 심각성에 의존할 수 있다.
조성물에 있어서 선택된 치료제의 농도는 흡수, 불활성화 및 배설 비율, 생리화학적 특징, 투여 스케줄, 및 투여되는 양 뿐만 아니라 기타 당업자에게 공지된 다른 요소들에 의존한다. 예를 들어, 정확한 투여량 및 치료 지속은 질환 또는 상태, 치료될 조직, 환자 또는 대상 및 투여량 및 투여 요법을 포함한, 항-히알루로난 제제와 상관관계인 것으로 이해된다. 코르티코스테로이드의 용량은 환자의 나이와 건강, 투여하는 폴리머-콘주게이트된 히알루로난-분해 효소(예를 들어, 투여하는 PEG화 히알루로난 분해 효소), 코르티코스테로이드의 효능 및 투여 경로에 의존적으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 농도와 투여량 값은 히알루로난 분해 효소의 치료적 용량 및 투여 요법과 더불어 다양할 것으로 언급된다. 추가적으로, 원하는 결과를 얻기 위해 코르티코스테로이드는 매일, 매주, 또는 매월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 특정한 투여량 부피는 다양할 수 있고 투여 요법, 투여 빈도 및 원하는 투여 속도에 의존된다. 농도와 투여량 값은 또한 치료되는 개인의 연령에 따라 다양할 것으로 언급된다.
정확한 투여량 및 치료 지속은 공지의 시험 프로토콜을 이용하여 또는 생체 내 또는 시험관 내 시험 데이터의 외삽에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 임의의 특정한 대상에서, 특이적인 투여 요법은 개인적 필요 및 제형의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조절되어야 하고, 본원에서 기재된 서술된 농도 범위는 단지 예시이며 그 범위를 제한하기 위한 것이 아니라는 것으로 또한 이해될 것이다. 일반적으로, 투여 요법은 독성을 제한하기 위해 선택되며, 본원에서는 유해한 부작용을 개선하기 위해 선택된다. 담당의사는 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 또는 다른 조직 기능장애으로 인해 어떻게 그리고 언제 치료를 종결, 중단 또는 투여량을 낮추도록 치료를 조정할 지에 대해 알 것이라고 언급되어야 할 것이다. 반대로, 담당의사는 또한 임상적 반응이 적절하지 않는다면(독성 부작용을 막으면서) 어떻게 또는 언제 더 높은 수준으로 치료를 조정할 지에 대해 알 것이다. 치료제의 투여는 미국 식품 의약품국(Food and Drug Administration)에 의해 확립되거나 미국의사약전(Physicians' Desk Reference)에 출판된 최대 투여량 수준을 초과하지 않아야 할 것이다.
일반적으로, 투여되는 코르티코스테로이드의 용량은 특정한 코르티코스테로이드에 의존적인데, 이는 효능에 있어서의 차이가 다른 코르티코스테로이드 사이에서 존재하기 때문이다(하기 표 4 참조). 코르티코스테로이드, 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어 덱사메타손은, 경구(정제, 액체 또는 액체 농축액) PO, 정맥내(IV) 또는 근육내로 투여될 수 있다. 코르티코스테로이드는 전형적으로 볼루스(bolus)로 투여되나, 항-히알루로난 제제, 예컨대 PEG화 히알루로니다아제의 투여와 관련된 하나 이상의 부작용을 개선하기에 유효인 양인 한, 많은 것이 일정 기간에 걸쳐 투여된다.
Figure 112016024482551-pat00008
코르티코스테로이드는 히알루로난 분해 효소의 투여와 관련된 하나 또는 그 이상의 부작용을 개선하기에 유효한 임의의 양으로 투여될 수 있다. 그러므로, 코르티코스테로이드, 예컨대 글루코코르티코이드는, 예를 들어 70 kg의 성인 인간 대상에 있어서, 1회 투여량 당, 약 0.1 및 100 mg 사이의 양으로, 0.1 내지 80 mg, 0.1 내지 60 mg, 0.1 내지 40 mg, 0.1 내지 30 mg, 0.1 내지 20 mg, 0.1 내지 15 mg, 0.1 내지 10 mg, 0.1 내지 5 mg, 0.2 내지 40 mg, 0.2 내지 30 mg, 0.2 내지 20 mg, 0.2 내지 15 mg, 0.2 내지 10 mg, 0.2 내지 5 mg, 0.4 내지 40 mg, 0.4 내지 30 mg, 0.4 내지 20 mg, 0.4 내지 15 mg, 0.4 내지 10 mg, 0.4 내지 5 mg, 0.4 내지 4 mg, 1 내지 20 mg, 1 내지 15 mg 또는 1 내지 10 mg의 양으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 글루코코르티코이드와 같은 코르티코스테로이드는 평균 성인 인간 대상에게 1회 투여량 당 약 0.4 및 20 mg, 예를 들어, 약 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.75 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg 또는 20 mg의 양으로 투여된다.
코르티코스테로이드는, 예를 들어, 전형적으로 70kg 내지 75kg의 체중인 평균 성인 인간 대상에게, 약 0.001 mg/kg (대상의), 0.002 mg/kg, 0.003 mg/kg, 0.004 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.006 mg/kg, 0.007 mg/kg, 0.008 mg/kg, 0.009 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.30 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.40 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.50 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.60 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.70 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.80 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.90 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1 mg/kg, 1.05 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.15 mg/kg, 1.20 mg/kg, 1.25 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.35 mg/kg 또는 1.4 mg/kg으로 투여될 수 있다.
코르티코스테로이드 투여가 히알루로난-분해 효소의 투여와 관련된 하나 이상의 유해한 부작용을 개선하는 한 투여되는 투여량 투여는 다양할 수 있다. 일 예에서, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손의 투여량은 치료 주기당 연속적으로 더 낮은 투여량으로 투여된다. 그러므로, 이러한 치료 요법에서, 코르티코스테로이드 투여량은 점점 줄어든다. 예를 들어, 덱사메타손은 히알루로난-분해 효소의 투여 전에, 최초 투여량 4 mg으로 투여되고, 그리고 각 히알루로난-분해 효소의 연속적인 투여에서 덱사메타손 투여량이 더 낮아지도록, 이의 투여량은 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제의 다음 투여에 대하여 3 mg, 그 다음 항-히알루로난 제제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제의 투여 당 2 mg, 그 다음 항-히알루로난 제제, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제의 투여 당 1 mg가 되도록 한다. 임의의 용량은 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제의 투여와 관련된 하나 이상의 부작용을 감소시키는 데 유효한 코르티코스테로이드의 용량인 한 고려된다.
투여의 시기는 코르티코스테로이드의 투여가 히알루로난-분해 효소 예를 들어, PEG화 히알루로니다아제 투여와 관련된 하나 이상의 유해한 부작용을 개선하는 한 다양할 수 있다. 코르티코스테로이드는 연속적으로, 간헐적으로, 동시에 또는 히알루로난-분해 효소, 예컨대 PEG화 히알루로난 분해 효소와 동일한 조성물로 투여될 수 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소 예를 들어, PEG화 히알루로니다아제의 투여 전, 투여 중, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 코르티코스테로이드 및 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로니다아제는 간헐적으로 투여된다. 일반적으로, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다아제와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손과 같은 글루코코르티코이드는 항-히알루로난 제제, 예를 들어, PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상 전에 투여될 수 있다.
일부 예에서, 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여와 동시에 투여된다. 이 예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다아제와 같은 히알루로난-분해 효소와 함께, 또는 별개로 투여될 수 있다. 전형적으로, 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소와 별도로 투여된다. 다른 예에서, 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소, 예를 들어 PEG화 히알루로난 분해 효소의 투여 약 0.5 분, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 그 이상 후에 투여된다.
일 예에서, 코르티코스테로이드는 히알루로난-분해 효소 예를 들어, PEG화 히알루로니다아제의 투여 전에 투여된다. 예를 들어, 글루코코르티코이드와 같은 코르티코스테로이드, 예를 들어 덱사메타손은 PEG화 히알루로니다아제와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 1시간 전에 투여된다. 다른 예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 5분 전에 투여된다. 또 다른 예에서, 코르티코스테로이드는 PEG화 히알루로니다아제와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 전 및 후에 모두 투여된다. 이 예에서, 코르티코스테로이드, 예컨대 덱사메타손은 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 직전 1 분 내지 5 분 전에 투여되고, PEG화 히알루로난 분해효소와 같은 항-히알루로난 제제 투여 8 시간 후에 투여된다. 또 다른 예에서, 코르티코스테로이드 예컨대 덱사메타손은 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 히알루로난-분해 효소의 투여 1시간 전에 투여되고 PEG화 히알루로난 분해 효소와 같은 항-히알루로난 제제의 투여 8 내지 12시간 후에 투여된다.
임의의 투여 요법은 코르티코스테로이드의 투여 시간이 히알루로난 분해 효소 예를 들어, PEG화 히알루로니다아제의 투여와 관련된 하나 이상의 유해한 부작용을 개선하는 한 고려된다. 또한, 코르티코스테로이드의 투여량 또는 투여 요법은 암 또는 고형암을 치료하는 것을 포함하는, 본원에서 제공되는 조성물 및 조합물에서, 히알루로난-분해 효소 또는 다른 제제의 치료적 효과를 방해 또는 감소시키지 않는 것이다.
b. 항암제제 및 기타 치료
본원에서 제공되는 병용 치료는 단독으로 또는 추가적으로 다른 항암제와 병용하여 사용될 수 있다. 항암제제(들) 또는 처리(들)은 외과적 수술, 방사선 조사, 약물, 화학 치료, 폴리펩티드, 항체, 펩티드, 소분자 또는 유전자 치료 벡터, 바이러스 또는 DNA가 될 수 있다.
본원의 병용 치료의 투여 후, 동시에 또는 전에 투여될 수 있는 항암제의 예는 아시비신(Acivicins); 아비신(Avicin); 아클라루비신(Aclarubicins); 아코다졸(Acodazoles); 아크로닌(Acronines); 아도젤레신(Adozelesins); 알데스류킨(Aldesleukins); 알렘투주맙(Alemtuzumabs); 알리트레티노인(9-시스-레티노산)(Alitretinoins(9-Cis-Retinoic Acids)); 알로퓨리놀(Allopurinols); 알트레타민(Altretamines); 알보시딥(Alvocidibs); 암바존(Ambazones); 암보마이신(Ambomycins); 아메탄트론(Ametantrones); 아미포스틴(Amifostines); 아미노글루테티미드(Aminoglutethimides); 암사크린(Amsacrines); 아나스트로졸(Anastrozoles); 아낙시론(Anaxirones); 안시타빈(Ancitabines); 안트라마이신(Anthramycins); 아파지퀀(Apaziquones); 아르기메스나(Argimesnas); 삼산화비소(Arsenic Trioxides); 아스파라기나제(Asparaginases); 아스페를린(Asperlins); 아트리무스틴(Atrimustines); 아자시티딘(Azacitidihes); 아제테파(Azetepas); 아조토마이신(Azotomycins); 바녹산트론(Banoxantrones); 바타불린(Batabulins); 바티마스타트(Batimastats); BCG 라이브(BCG Live); 베낙시빈(Benaxibines); 벤다무스틴(Bendamustines); 벤조데파(Benzodepas); 벡사로텐(Bexarotenes); 베바시주맙(Bevacizumab); 비칼루타미드(Bicalutamides); 비에타세르핀(Bietaserpines); 비리코다르(Biricodars); 비산트렌(Bisantrenes); 비스나피드 디메실레이트(Bisnafide Dimesylates); 비젤레신(Bizelesins); 블레오마이신(Bleomycins); 보르테조밉(Bortezomibs); 브레퀴나르(Brequinars); 브로피리민(Bropirimines); 부도티탄(Budotitanes); 부술판(Busulfans); 칵티노마이신(Cactinomycins); 칼루스테론(Calusterones); 카네르티닙(Canertinibs); 카페시타빈(Capecitabines); 카라세미드(Caracemides); 카르베티머(Carbetimers); 카보플라틴(Carboplatins); 카르보퀀(Carboquones); 카르모푸르(Carmofurs); 폴리페프로산과의 카르무스틴(Carmustines with Polifeprosans); 카르무스틴(Carmustines); 카루비신(Carubicins); 카르젤레신(Carzelesins); 세데핑골(Cedefingols); 셀레콕시브(Celecoxibs); 세마도틴(Cemadotins); 클로람부실(Chlorambucils); 시오테로넬(Cioteronels); 시롤레마이신(Cirolemycins); 시스플라틴(Cisplatins); 클라드리빈(Cladribines); 클란페누르(Clanfenurs); 클로파라빈(Clofarabines); 크리스나톨(Crisnatols); 시클로포스파미드(Cyclophosphamides); 리포좀 시타라빈(Cytarabine liposomals); 시타라빈(Cytarabines); 다카르바진(Dacarbazines); 닥티노마이신(Dactinomycins); 다르베포에틴 알파(Darbepoetin Alfas); 리포좀 다우노루비신(Daunorubicin liposomals); 다우노루비신/다우노마이신(Daunorubicins/Daunomycins); 다우노루비신(Daunorubicins); 데시타빈(Decitabines); 데니류킨 디프티톡스(Denileukin Diftitoxes); 덱스니굴디핀(Dexniguldipines); 덱소나플라틴(Dexonnaplatins); 덱스라족산(Dexrazoxanes); 데자구아닌(Dezaguanines); 디아지퀀(Diaziquones); 디브로스피듐(Dibrospidiums); 디에노게스트(Dienogests); 디날린(Dinalins); 디세르몰리드(Disermolides); 도세탁셀(Docetaxels); 도페퀴다르(Dofequidars); 독시플루리딘(Doxifluridines); 리포좀 독소루비신(Doxorubicin liposomals); 독소루비신 HCL(Doxorubicin HCL); 독소루비신 HCL 리포좀 주사(Doxorubicin HCL liposome injection); 독소루비신(Doxorubicins); 드롤록시펜(Droloxifenes); 드로모스타놀론 프로피오네이트(Dromostanolone Propionates); 두아조마이신(Duazomycins); 에코무스틴(Ecomustines); 에다트렉세이트(Edatrexates); 에도테카린(Edotecarins); 에플로르니틴(Eflornithines); 엘라크리다르(Elacridars); 엘리나피드(Elinafides); 엘리엇 B 용액(Elliott's B Solutions); 엘사미트루신(Elsamitrucins); 에미테푸르(Emitefurs); 엔로플라틴(Enloplatins); 엔프로메이트(Enpromates); 엔자스타우린(Enzastaurins); 에피프로피딘(Epipropidines); 에피루비신(Epirubicins); 에포에틴 알파(Epoetin alfas); 엡탈로프로스트(Eptaloprosts); 에르불로졸(Erbulozoles); 에소루비신(Esorubicins); 에스트라무스틴(Estramustines); 에타니다졸(Etanidazoles); 에토글루시드(Etoglucids); 에토포시드 포스페이트(Etoposide phosphates); 에토포시드 VP-16(Etoposide VP-16s); 에토포시드(Etoposides); 에토프린(Etoprines); 엑세메스탄(Exemestanes); 엑시술린드(Exisulinds); 파드로졸(Fadrozoles); 파자라빈(Fazarabines); 펜레티니드(Fenretinides); 필그라스팀(Filgrastims); 플록수리딘(Floxuridines); 플루다라빈(Fludarabines); 플루오로우라실(Fluorouracils); 5-플루오로우라실(5-fluorouracils); 플루옥시메스테론(Fluoxymesterones); 플루로시타빈(Flurocitabines); 포스퀴돈(Fosquidones); 포스트리에신(Fostriecins); 포스트리에신(Fostriecins); 포트레타민(Fotretamines); 풀베스트란트(Fulvestrants); 갈라루비신(Galarubicins); 갈로시타빈(Galocitabines); 젬시타빈(Gemcitabines); 젬투주맙/오조가미신(Gemtuzumabs/Ozogamicins); 게로퀴놀(Geroquinols); 기마테칸(Gimatecans); 기메라실(Gimeracils); 글록사존(Gloxazones); 글루포스파미드(Glufosfamides); 고세렐린 아세테이트(Goserelin acetates); 하이드록시우레아(Hydroxyureas); 이브리투모맙/티욱세탄(Ibritumomabs/Tiuxetans); 이다루비신(Idarubicins); 이포스파미드(Ifosfamides); 일모포신(Ilmofosines); 일로마스타트(Ilomastats); 이매티닙 메실레이트(Imatinib mesylates); 이멕손(Imexons); 임프로술판(Improsulfans); 인디술람(Indisulams); 인프로퀀(Inproquones); 인터페론 알파-2a(Interferon alfa-2as); 인터페론 알파-2b(Interferon alfa-2bs); 인터페론 알파(Interferon Alfas); 인터페론 베타(Interferon Betas); 인터페론 감마(Interferon Gammas); 인터페론(Interferons); 인터류킨-2(Interleukin-2s) 및 다른 인터류킨(재조합 인터류킨 포함); 인토플리신(Intoplicines); 이오벤구안 [131-I](Iobenguanes [131-1]); 이프로플라틴(Iproplatins); 이리노테칸(Irinotecans); 이르소글라딘(Irsogladines); 익사베필론(Ixabepilones); 케토트렉세이트(Ketotrexates); L-알라노신(L-Alanosines); 란레오티드(Lanreotides); 라파티닙(Lapatinibs); 레독산트론(Ledoxantrones); 레트로졸(Letrozoles); 류코보린(Leucovorins); 류프롤리드(Leuprolides); 류프로렐린(류프로렐리드)(Leuprorelins (Leuprorelides)); 레바미솔(Levamisoles); 렉사칼시톨(Lexacalcitols); 리아로졸(Liarozoles); 로바플라틴(Lobaplatins); 로메트렉솔(Lometrexols); 로무스틴/CCNU(Lomustines/CCNUs); 로무스틴(Lomustines); 로나파르닙(Lonafamibs); 로속산트론(Losoxantrones); 루르토테칸(Lurtotecans); 마포스파미드(Mafosfamides); 만노술판(Mannosulfans); 마리마스타트(Marimastats); 마소프로콜(Masoprocols); 마이탄신(Maytansines); 메클로레타민(Mechlorethamines); 메클로레타민/질소 머스타드(Mechlorethamines/Nitrogen mustards); 메게스트롤 아세테이트(Megestrol acetates); 메게스트롤(Megestrols); 멜렌게스트롤(Melengestrols); 멜팔란(Melphalans); 멜팔란l/L-PAM(MelphalanslL-PAMs); 메노가릴(Menogarils); 메피티오스탄(Mepitiostanes); 머캅토퓨린(Mercaptopurines); 6-머캅토퓨린(6-Mercaptopurine); 메스나(Mesnas); 메테신드(Metesinds); 메토트렉세이트(Methotrexates); 메톡살렌(Methoxsalens); 메토미데이트(Metomidates); 메토프린(Metoprines); 메투레데파(Meturedepas); 미보플라틴(Miboplatins); 미프록시펜(Miproxifenes); 미소니다졸(Misonidazoles); 미틴도미드(Mitindomides); 미토카르신(Mitocarcins); 미토크로민(Mitocromins); 미토플락손(Mitoflaxones); 미토길린(Mitogillins); 미토구아존(Mitoguazones); 미토말신(Mitomalcins); 미토마이신 C(Mitomycin Cs); 미토마이신(Mitomycins); 미토나피드(Mitonafides); 미토퀴돈(Mitoquidones); 미토스퍼(Mitospers); 미토탄(Mitotanes); 미톡산트론(Mitoxantrones); 미토졸로미드(Mitozolomides); 미보불린(Mivobulins); 미조리빈(Mizoribines); 모파로텐(Mofarotenes); 모피다몰(Mopidamols); 무브리티닙(Mubritinibs); 미코페놀산(ycophenolic Acids); 난드롤론 펜프로피오네이트(Nandrolone Phenpropionates); 네다플라틴(Nedaplatins); 넬자라빈(Nelzarabines); 네모루비신(Nemorubicins); 니트라크린(Nitracrines); 노코다졸(Nocodazoles); 노페투모맙(Nofetumomabs); 노갈라마이신(Nogalamycins); 놀라트렉세드(Nolatrexeds); 노르토픽산트론(Nortopixantrones); 옥트레오티드(Octreotides); 오프렐베킨(Oprelvekins); 오르마플라틴(Ormaplatins); 오르타탁셀(Ortataxels); 오테라실(Oteracils); 옥살리플라틴(Oxaliplatins); 옥시수란(Oxisurans); 옥소페나르신(Oxophenarsines); 파클리탁셀(Paclitaxels); 파미드로네이트(Pamidronates); 파투빌론(Patubilones); 페가데마제(Pegademases); 페가스파르가제(Pegaspargases); 페그필그라스팀(Pegfilgrastims); 펠데신(Peldesines); 펠리오마이신(Peliomycins); 펠리트렉솔(Pelitrexols); 페메트렉세드(Pemetrexeds); 펜타무스틴(Pentamustines); 펜토스타틴(Pentostatins); 페플로마이신(Peplomycins); 페르포스파미드(Perfosfamides); 페리포신(Perifosines); 피코플라틴(Picoplatins); 피나피드(Pinafides); 피포브로만(Pipobromans); 피포술판(Piposulfans); 피르페니돈(Pirfenidones); 피록산트론(Piroxantrones); 픽산트론(Pixantrones); 플레비트렉세드(Plevitrexeds); 플리카마이시드 미트라마이신(Plicamycid Mithramycins); 플리카마이신(Plicamycins); 플로메스탄(Plomestanes); 플로메스탄(Plomestanes); 포르피머 나트륨(Porfimer sodiums); 포르피머(Porfimers); 포르피로마이신(Porfiromycins); 프레드니무스틴(Prednimustines); 프로카르바진(Procarbazines); 프로파미딘(Propamidines); 프로스피듐(Prospidiums); 퓨미테파(Pumitepas); 퓨로마이신(Puromycins); 피라조푸린(Pyrazofurins); 퀴나크린(Quinacrines); 라니무스틴(Ranimustines); 라스부리카제(Rasburicases); 리보프린(Riboprines); 리트로술판(Ritrosulfans); 리툭시맙(Rituximabs); 로글레티미드(Rogletimides); 로퀴니멕스(Roquinimexs); 루포크로모마이신(Rufocromomycins); 사바루비신(Sabarubicins); 사핑골(Safingols); 사르그라모스팀(Sargramostims); 사트라플라틴(Satraplatins); 세브리플라틴(Sebriplatins); 세무스틴(Semustines); 심트라젠(Simtrazenes); 시조피란(Sizofirans); 소부족산(Sobuzoxanes); 소라페닙(Sorafenibs); 스파르포세이트(Sparfosates); 스파르포스산(Sparfosic Acids); 스파르소마이신(Sparsomycins); 스피로게르마늄(Spirogermaniums); 스피로무스틴(Spiromustines); 스피로플라틴(Spiroplatins); 스피로플라틴(Spiroplatins); 스쿠알라민(Squalamines); 스트렙토니그린(Streptonigrins); 스트렙토바리신(Streptovarycins); 스트렙토조신(Streptozocins); 수포스파미드(Sufosfamides); 술로페누르(Sulofenurs); 수니티닙 말레이트(Sunitinib Malate); 6-티오구아닌(6-thioguanine, 6-TG); 타세디날린(Tacedinalines); 탈크(Talcs); 탈이소마이신(Talisomycins); 탈리무스틴(Tallimustines); 타목시펜(Tamoxifens); 타리퀴다르(Tariquidars); 타우로무스틴(Tauromustines); 테코갈란(Tecogalans); 테가푸르(Tegafurs); 텔록산트론(Teloxantrones); 테모포르핀(Temoporfins); 테모졸로미드(Temozolomides); 테니포시드/VM-26(Teniposides/VM-26s); 테니포시드(Teniposides); 테록시론(Teroxirones); 테스토락톤(Testolactones); 티아미프린(Thiamiprines); 티오구아닌(Thioguanines); 티오테파(Thiotepas); 티아미프린(Tiamiprines); 티아조푸린(Tiazofurins); 틸로미솔(Tilomisoles); 틸로론(Tilorones); 팀코다르(Timcodars); 티모나시크(Timonacics); 티라파자민(Tirapazamines); 토픽산트론(Topixantrones); 토포테칸(Topotecans); 토레미펜(Toremifenes); 토시투모맙(Tositumomabs); 트라벡테딘(Trabectedins) (엑테이나시딘 743(Ecteinascidin 743)); 트라스투주맙(Trastuzumabs); 트레스톨론(Trestolones); 트레티노인/ATRA(Tretinoins/ATRA); 트리시리빈(Triciribines); 트릴로스탄(Trilostanes); 트리메트렉세이트(Trimetrexates); 트리플라틴 테트라니트레이트(Triplatin Tetranitrates); 트립토렐린(Triptorelins); 트로포스파미드(Trofosfamides); 투불로졸(Tubulozoles); 우베니멕스(Ubenimexs); 우라실 머스타드(Uracil Mustards); 우레데파(Uredepas); 발루비신(Valrubicins); 발스포다르(Valspodars); 바프레오티드(Vapreotides); 베르테포르핀(Verteporfms); 빈블라스틴(Vinblastines); 빈크리스틴(Vincristines); 빈데신(Vindesines); 비네피딘(Vinepidines); 빈플루닌(Vinflunines); 빈포르미드(Vinformides); 빈글리시네이트(Vinglycinates); 빈류시놀(Vinleucinols); 빈류로신(Vinleurosines); 비노렐빈(Vinorelbines); 빈로시딘(Vinrosidines); 빈트립톨(Vintriptols); 빈졸리딘(Vinzolidines); 보로졸(Vorozoles); 크산토마이신 A(Xanthomycin As) (구아메사이클린(Guamecyclines)); 제니플라틴(Zeniplatins); 질라스코르브 [2-H](Zilascorbs [2-H]); 지노스타틴(Zinostatins); 졸레드로네이트(Zoledronate); 조루비신(Zorubicins); 및 조수퀴다르(Zosuquidars), 예를 들어: 알데스류킨(Aldesleukins) (예를 들어, 프로류킨®(PROLEUKIN®)); 알렘투주맙( Alemtuzumabs) (예를 들어, 캠패스®(CAMPATH®)); 알리트레티노인(Alitretinoins) (예를 들어, 판레틴®(PANRETIN®)); 알로퓨리놀(Allopurinols) (예를 들어, 질로프림®(ZYLOPRIM®)); 알트레타민(Altretamines) (예를 들어, 헥살렌®(HEXALEN®)); 아미포스틴(Amifostines) (예를 들어, 에티올®(ETHYOL®)); 아나스트로졸(Anastrozoles) (예를 들어, 아리미덱스®(ARIMIDEX®)); 삼산화비소(Arsenic Trioxides) (예를 들어, 트리세녹스®(TRISENOX®)); 아스파라기나제(Asparaginases) (예를 들어, 엘스파르®(ELSPAR®)); BCG 라이브(BCG Live) (예를 들어, 타이스® BCG(TICE® BCG); 벡사로텐(Bexarotenes) (예를 들어, 타그레틴®(TARGRETIN®)); 베바시주맙(Bevacizumab) (아바스틴®(AVASTIN®)); 블레오마이신(Bleomycins) (예를 들어, 블레녹산®(BLENOXANE®)); 정맥 부술판(Busulfan intravenous) (예를 들어, 부술펙스®(BUSULFEX®)); 경구 부술판(Busulfan orals) (예를 들어, 밀레란®(MYLERAN®)); 칼루스테론(Calusterones) (예를 들어, 메토사르브®(METHOSARB®)); 카페시타빈(Capecitabines) (예를 들어, 젤로다®(XELODA®)); 카보플라틴(Carboplatins) (예를 들어, 파라플라틴®(PARAPLATIN®)); 카르무스틴(Carmustines) (예를 들어, BCNU®, BiCNU®); 폴리페프로산과 카르무스틴(Carmustines with Polifeprosans) (예를 들어, 글리아델® 웨이퍼(GLIADEL® Wafer)); 셀레콕시브(Celecoxibs) (예를 들어, 셀레브렉스®(CELEBREX®)); 클로람부실(Chlorambucils) (예를 들어, 류케란®(LEUKERAN®)); 시스플라틴(Cisplatins) (예를 들어, 플라티놀®(PLATINOL®)); 클라드리빈(Cladribines) (예를 들어, 류스타틴®(LEUSTATIN®), 2-CdA®); 시클로포스파미드(Cyclophosphamides) (예를 들어, 사이톡산®(CYTOXAN®), 네오사르®(NEOSAR®)); 시타라빈(Cytarabines) (예를 들어, 사이토사르-U®(CYTOSAR-U®)); 리포좀 시타라빈(Cytarabine liposomals) (예를 들어, 디포사이트®(DepoCyt®)); 다카르바진(Dacarbazines) (예를 들어, DTIC-Dome): 닥티노마이신(Dactinomycins) (예를 들어, 코스메겐®(COSMEGEN®)); 다르베포에틴 알파(Darbepoetin Alfas) (예를 들어, 아라네스프®(ARANESP®)); 리포좀 다우노루비신(Daunorubicin liposomals) (예를 들어, 다누옥솜®(DANUOXOME®)); 다우노루비신/다우노마이신(Daunorubicins/Daunomycins) (예를 들어, 세루비딘®(CERUBIDINE®)); 데니류킨 디프티톡스(Denileukin Diftitoxes) (예를 들어, 온타크®(ONTAK®)); 덱스라족산(Dexrazoxanes) (예를 들어, 지네카드®(ZINECARD®)); 도세탁셀(Docetaxels) (예를 들어, 탁소테레®(TAXOTERE®)); 독소루비신(Doxorubicins) (예를 들어, 아드리아마이신®(ADRIAMYCIN®), 루벡스®(RUBEX®)); 리포좀 독소루비신(Doxorubicin liposomals), 예를 들어 독소루비신 HCL(Doxorubicin HCL) 리포좀 주사 (예를 들어, 독실®(DOXIL®) 포함함); 드로모스타놀론 프로피오네이트(Dromostanolone propionates) (예를 들어, 드로모스타놀론®(DROMOSTANOLONE®) 및 마스터론®(MASTERONE®) 주사); 엘리엇 B 용액(Elliott's B Solutions) (예를 들어, 엘리엇 B 용액®(Elliott's B Solution®)); 에피루비신(Epirubicins) (예를 들어, 엘렌스®(ELLENCE®)); 에포에틴 알파(Epoetin alfas) (예를 들어, 에포겐®(EPOGEN®)); 에스트라무스틴(Estramustines) (예를 들어, 엠사이트®(EMCYT®)); 에토포시드 포스페이트(Etoposide phosphates) (예를 들어, 에토포포스®(ETOPOPHOS®)); 에토포시드 VP-16(Etoposide VP-16s) (예를 들어, 베페시드®(VEPESID®)); 엑세메스탄(Exemestanes) (예를 들어, 아로마신®(AROMASIN®)); 필그라스팀(Filgrastims) (예를 들어, 뉴포겐®(NEUPOGEN®)); 플록수리딘(Floxuridines) (예를 들어, FUDR®); 플루다라빈(Fludarabines) (예를 들어, 플루다라®(FLUDARA®)); 5-FU를 포함하는 플루오로우라실(Fluorouracils) (예를 들어, 아드루실®(ADRUCIL®)); 풀베스트란트(Fulvestrants) (예를 들어, 파슬로덱스®(FASLODEX®)); 젬시타빈(Gemcitabines) (예를 들어, 젬자®(GEMZAR®)); 젬투주맙/오조가미신(Gemtuzumabs/Ozogamicins) (예를 들어, 밀로타르그®(MYLOTARG®)); 고세렐린 아세테이트(Goserelin acetates) (예를 들어, 졸라덱스®(ZOLADEX®)); 하이드록시우레아(Hydroxyureas) (예를 들어, 하이드레아®(HYDREA®)); 이브리투모맙/티욱세탄(Ibritumomabs/Tiuxetans) (예를 들어, 제발린®(ZEVALIN®)); 이다루비신(Idarubicins) (예를 들어, 이다마이신®(IDAMYCIN®)); 이포스파미드(Ifosfamides) (예를 들어, 이펙스®(IFEX®)); 이매티닙 메실레이트(Imatinib mesylates) (예를 들어, 글리벡®(GLEEVEC®)); 인터페론 알파-2a(Interferon alfa-2as) (예를 들어, 로페론-A®(ROFERON-A®)); 인터페론 알파-2b(Interferon alfa-2bs) (예를 들어, 인트론 A®(INTRON A®)); 이리노테칸(Irinotecans) (예를 들어, 캄프토사르®(CAMPTOSAR®)); 레트로졸(Letrozoles) (예를 들어, 페마라®(FEMARA®)); 류코보린(Leucovorins) (예를 들어, 웰코보린®(WELLCOVORIN®), 류코보린®(LEUCOVORIN®)); 레바미솔(Levamisoles) (예를 들어, 에르가미솔®(ERGAMISOL®)); 로무스틴/CCNU(Lomustines/CCNUs) (예를 들어, CeeBU®); 메클로레타민/질소 머스타드(Mechlorethamines/Nitrogen mustards) (예를 들어, 머스타겐®(MUSTARGEN®)); 메게스트롤 아세테이트(Megestrol acetates) (예를 들어, 메가스®(MEGACE®)); 멜팔란/L-PAM(Melphalans/L-PAMs) (예를 들어, 알케란®(ALKERAN®)); 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurines)을 포함하는 머캅토퓨린(Mercaptopurine) (6-MP; 예를 들어 퓨리네톨®(PURINETHOL®)); 메스나(Mesnas) (예를 들어, 메스넥스®(MESNEX®)); 메토트렉세이트(Methotrexates); 메톡살렌(Methoxsalens) (예를 들어, 우바덱스®(UVADEX®)); 미토마이신 C(Mitomycin Cs) (예를 들어, 뮤타마이신®(MUTAMYCIN®), 미토지트렉스®(MITOZYTREX®)); 미토탄(Mitotanes) (예를 들어, 리소드렌®(LYSODREN®)); 미톡산트론(Mitoxantrones) (예를 들어, 노반트론®(NOVANTRONE®)); 난드롤론 펜프로피오네이트(Nandrolone Phenpropionates) (예를 들어, 듀라볼린-50®(DURABOLIN-50®); 노페투모맙(Nofetumomabs) (예를 들어, 베르루마®(VERLUMA®)); 오프렐베킨(Oprelvekins) (예를 들어, 뉴메가®(NEUMEGA®)); 옥살리플라틴(Oxaliplatins) (예를 들어, 엘록사틴®(ELOXATIN®)); 파클리탁셀(Paclitaxels) (예를 들어, 팍센®(PAXENE®), 탁솔®(TAXOL®)); 파미드로네이트(Pamidronates) (예를 들어, 아레디아®(AREDIA®)); 페가데마제(Pegademases) (예를 들어, 아다겐®(ADAGEN®)); 페가스파르가제(Pegaspargases) (예를 들어, 온카스파르®(ONCASPAR®)); 페그필그라스팀(Pegfilgrastims) (예를 들어, 뉴라스타®(NEULASTA®)); 펜토스타틴(Pentostatins) (예를 들어, 니펜트®(NIPENT®)); 피포브로만(Pipobromans) (예를 들어, 베르사이트®(VERCYTE®)); 플리카마이신/미트라마이신(Plicamycin/Mithramycins) (예를 들어, 미트라신®(MITHRACIN®)); 포르피머 나트륨(Porfimer sodiums) (예를 들어, 포토프린®(PHOTOFRIN®)); 프로카르바진(Procarbazines) (예를 들어, 마튤란®(MATULANE®)); 퀴나크린(Quinacrines) (예를 들어, 아타브린®(ATABRINE®)); 라스부리카제(Rasburicases) (예를 들어, 엘리테크®(ELITEK®)); 리툭시맙(Rituximabs) (예를 들어, 리툭산®(RITUXAN®)); 사르그라모스팀(Sargramostims) (예를 들어, 프로카인®(PROKINE®)); 스트렙토조신(Streptozocins) (예를 들어, 자노사르®(ZANOSAR®)); 수니티닙 말레이트(Sunitinib Malates) (예를 들어, 수텐트®(SUTENT®)); 탈크(Talcs) (예를 들어, 스클레로솔®(SCLEROSOL®)); 타목시펜(Tamoxifens) (예를 들어, 놀바덱스®(NOLVADEX®)); 테모졸로미드(Temozolomides) (예를 들어, 테모다르®(TEMODAR®)); 테니포시드/VM-26(Teniposides/VM-26s) (예를 들어, 부몬®(VUMON®)); 테스토락톤(Testolactones) (예를 들어, 테슬락®(TESLAC®)); 6-티오구아닌 (6-TG)을 포함하는 티오구아닌(Thioguanines); 티오테파(Thiotepas) (예를 들어, 티오플렉스®(THIOPLEX®)); 토포테칸(Topotecans) (예를 들어, 하이캄틴®(HYCAMTIN®)); 토레미펜(Toremifenes) (예를 들어, 파레스톤®(FARESTON®)); 토시투모맙(Tositumomabs) (예를 들어, 벡사르®(BEXXAR®); 트라스투주맙(Trastuzumabs) (예를 들어, 헤르셉틴®(HERCEPTIN®)); 트레티노인/ATRA(Tretinoins/ATRA) (예를 들어, 베사노이드®(VESANOID®)); 우라실 머스타드(Uracil Mustards); 발루비신(Valrubicins) (예를 들어, 발스타르®(VALSTAR®)); 빈블라스틴(Vinblastines) (예를 들어, 벨반®(VELBAN®)); 빈크리스틴(Vincristines) (예를 들어, 온코빈®(ONCOVIN®)); 비노렐빈(Vinorelbines) (예를 들어, 나벨빈®(NAVELBINE®)); 및 졸레드로네이트(Zoledronates) (예를 들어, 조메타®(ZOMETA®))가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
H. 실시예
다음의 실시예는 오직 목적을 분명히하기 위하여 포함되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
인간 췌장 종양 이종이식 모델에서
PEGPH20 및 Nab- 파클리탁셀 병용 치료의 항종양 효과
인간 췌장암 이종이식 모델을 알부민-결합 (nab)-파클리탁셀 나노입자와 병용한 PEGPH20의 항종양 효과에 대해 평가하였다.
BxPC3 췌장암 세포주 유래의 종양 세포(미국 미생물 보존 센터(American Tissue Culture Collection(ATCC) CRL-1687)를 약 80%까지 성장시키고, 트립신화하고, 수집하고 HBSS(행크 균형 염 용액, Mediatech 사.)에서 한 번 세척하였다. 접종 전에 세포를 멸균 HBSS로 두 번 세척하고, 트립판 블루 배제를 통해 세포 농도 및 생존률을 결정하는 자동화된 계수 기구 Nexcelom Cellometer(Nexcelom Bioscience; Lawrence, MA)를 사용하여 계수하고, 동물에 접종되기 전에 얼음 상에서 1 x 108 세포/mL 의 농도가 되도록 HBSS로 희석하였다. 약 6 주령의 수컷 누드 마우스(무흉선 NCr nu / nu 마우스, Taconic Laboratories, 사.)의 왼쪽 뒷다리(경골 골막(tibia periosteum)에 인접한), 경골 주위로 상기 세포 현탁액 0.05mL를 근육 내로(IM) 접종하였다. 동물내 종양은 주당 2회 평가하였고 평균 종양 부피가 약 350 - 400 mm3 으로 자라도록 두었다. 실제 종양 부피는 VisualSonic Vevo 770 고해상도 초음파(VisulaSonics 사.; 토론토, 온타리오, 캐나다)를 이용하여 관찰하였다.
종양-내포 동물을 한 군당 8 마리씩 8 개의 처리군으로 나누어 다음을 정맥내로 처리하였다: 1) 비히클(API 완충액); 2) PEGPH20 (4.5 mg/kg); 3) nab-파클리탁셀 (3 mg/kg; 저용량); 4) nab-파클리탁셀 (10 mg/kg; 중간 용량); 5) nab-파클리탁셀 (30 mg/kg; 고용량); 6) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + nab-파클리탁셀 (3 mg/kg); 7) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + nab-파클리탁셀 (10 mg/kg); 또는 8) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + nab-파클리탁셀(30 mg/kg). PEGPH20 및 nab-파클리탁셀을 별개로 투여하였다. PEGPH20을 첫번째로 투여하였고 이후 즉시 nab-파클리탁셀을 투여하였다. 0.1 mL/25 g 마우스, 또는 4.0 mL/kg의 용량 부피로, 0일에 시작하여 3일마다 총 6번의 주입을 하기 위한 것을 처리 용량 및 빈도로 하였다(즉, 0, 3, 6, 9, 12, 15일).
모든 마우스의 종양 부피는 주당 2회 VisualSonics 초음파 시스템을 이용한 이미지를 캡쳐하여 측정되었다. 종양 부피는 3D-모드 이미지 소프트웨어 프로그램(VisualSonics® Vevo 770®, v 3.0.0)을 사용하여 계산되었다. 종양 성장 억제 퍼센트(% TGI)는 다음 식에 의해 계산되었다.
[l-(Tn-T0) / (Cn-C0)] x lOO%
상기 식에서, Tn은 처리 후 지시된 시점에서 각 "n" 일차의 처리군에서의 평균 종양 부피이다; T0은 처리 전 0일차에 처리군의 평균 종양 부피이다; Cn은 비히클로 처리한 후에 지시된 시점에서 각 "n" 일차의 대조군에서의 평균 종양 부피이다; 그리고 C0은 처리 전 0일차에서 대조군의 평균 종양 부피이다.
결과는 도 1에 도시하였다. 결과는 고용량 및 중간 용량에서 nab-파클리탁셀이 종양 성장을 억제하고, 이것이 PEGPH20의 존재 하에서 강화되는 것을 보여준다. 예를 들어, 종양 부피가 측정되는 마지막 시점에, nab-파클리탁셀의 중간 내지 고용량(10 mg/kg 및 30 mg/kg)은 종양 성장을 비히클 처리 대조군과 비교하여, 각각, 62% (p<0.01) 및 74% (p<0.01) 억제하였다. PEGPH20의 존재 하에, 종양 성장 억제는 nab-파클리탁셀 10 mg/kg 용량 처리군에서 72% (p<0.01)까지 증가되었고 nab-파클리탁셀의 30 mg/kg 용량 치료군은 91% (p<0.01)까지 증가하였다. 이것은 중간 용량 nab-파클리탁셀에서 19%, 그리고 고용량 nab-파클리탁셀에 대해서 26% 의 PEGPH20-매개된 효능의 증가이다. PEGPH20 존재 또는 부재 하 4.5 mg/mg의 PEGPH20 처리군 또는 3 mg/kg 저용량 nab-파클리탁셀 처리군에서는 실질적인 종양 성장 억제가 관찰되지 않았다.
실시예 2
인간 췌장 종양 이종이식 모델에서
PEGPH20 , Nab- 파클리탁셀 및 젬시타빈 병용 치료의 항종양 효과
A. 종양 성장 억제
실시예 1에서 기술되는 인간 췌장암 이종이식 모델은 PEGPH20 및 nab-파클리탁셀 병용치료 뿐만 아니라 젬시타빈의 병용 처리의 항종양 효과를 평가하기 위해 사용되었다. 연구 수행 전에, 기반이 되는 젬시타빈에 대한 경로 및 용량 수준을 선택하였다. 이 종양-내포 마우스를 21일 동안 주당 1회(0, 7, 14 및 21일) 다양한 용량의 젬시타빈(60 mg/kg, 120 mg/kg, 180 mg/kg 및 240 mg/kg)으로 처리하였고 종양의 부피를 상기 상기 기술된 바와 같이 모니터링하였다. 결과는 도 2에 도시하였다. 결과는 비히클 단독 경우와 비교하여 시험된 모든 용량에서 젬시타빈이 종양 성장을 억제하는 것을 보였다. 차선의 용량인 180 mg/kg 을 PEGPH20 조합 화학 치료 연구에서 사용하기 위해 선택하였다. 젬시타빈 및 nab-파클리탁셀 두 개의 차선의 용량을 선택하여 세 개의 항-암제를 결합하는 잠재적인 이점을 평가하였다: PEGPH20, 젬시타빈 및 nab-파클리탁셀.
종양-내포 마우스를 군당 12마리씩 8 개의 처리군으로 나누어 다음을 처리하였다: 1) 비히클 (API 완충액); 2) PEGPH20 (4.5 mg/kg); 3) nab-파클리탁셀 (10 mg/kg); 4) 젬시타빈 (180 mg/kg); 5) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + nab-파클리탁셀 (10 mg/kg); 6) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + 젬시타빈 (180 mg/kg); 7) nab-파클리탁셀 (10 mg/kg) + 젬시타빈 (180 mg/kg); 또는 8) PEGPH20 (4.5 mg/kg) + nab-파클리탁셀 (10 mg/kg) + 젬시타빈 (180 mg/kg). PEGPH20 및 nab-파클리탁셀은 정맥내로 투여하였고 처리의 용량 및 빈도는 4 주의 투여 주기 동안 주당 2회(2x/wk)였다. 젬시타빈은 3 주의 투여주기 동안 매 7일째마다 PEGPH20 및/또는 nab-파클리탁셀 24시간 후에 복강내로 투여하였다. 시험군에 따라, 4 주 주기의 제제의 투여를 위한 투여 스케줄이 표 5에 기재되어 있다.
Figure 112016024482551-pat00009
종양 부피 및 종양 성장 억제는 실시예 1에 기술된 바와 같이 결정되었다. 결과는 도 3에 도시하였다. 결과는 젬시타빈 단독, PEGPH20 단독 및 PEGPH20 + 젬시타빈은 일부 항종양 활성을 나타내지만, PEGPH20, nab-파클리탁셀 및 젬시타빈이 처리된 동물에서 나타나는 가장 큰 항종양 효과를 가진 nab-파클리탁셀을 포함하는 치료에서 항종양 효과가 훨씬 크게 나타났다는 것을 보여준다. 표 6은 26일차에 종양 부피 측정으로부터 결정되는 바와 같이 비히클에 상대적인 성장 억제 퍼센트로서의 결과를 도시한다. 그 결과는 nab-파클리탁셀 및 젬시타빈의 처리에 추가하여 PEGPH20과 함께 동물을 치료하는 것은 비히클과 비교하여 81%의 종양 성장 억제 결과를 나타내고, 반면 PEGPH20없는 nab-파클리탁셀과 젬시타빈 치료는 오직 66% 종양 성장 억제를 나타낸다는 것을 보여준다. 따라서, 결과는 nab-파클리탁셀 및 젬시타빈에 추가한 PEGPH20의 병용 치료가 효능면에서 23% 증가를 유발한 것을 보여준다.
Figure 112016024482551-pat00010
B. 생존 시간 중앙값(Median Survival Time)
A 부분에 기재된 바와 같은 첫번째 4 주 투여 주기에 따라, 투여 주기는 2회 반복되었고 생존 종말점(endpoint)까지의 시간을 시간에 따라 취했다. 요약하면, 각각의 투여 주기에서, 동물에 4 주 동안 주당 2회 비히클 또는 정맥내로 nab-파클리탁셀(10 mg/kg)과 함께 또는 nab-파클리탁셀 없이 PEGPH20 (4.5 mg/mL)로 처리하였다. 각각의 주기에서, 젬시타빈을 받는 군은 3 주의 투여 주기동안 매 7일째마다 PEGPH20 및/또는 nab-파클리탁셀 24시간 후 젬시타빈(180 mg/kg)을 투여하였다. 생존 종말점까지의 시간, 대리 동물의 생존은 (a) 2000 mm3 초과의 종양 부피까지의 시간, (b) 20% 초과의 체중 손실까지의 시간, 또는 (c)동물 강박 또는 죽음까지의 시간으로 정의한다.
결과를 도 4 및 표 7에 기재하였다. 결과는 젬시타빈만 단독 처리한 동물의 종말점(endpoint)까지의 생존 시간 중앙값은 38 일이었고, nab-파클리탁셀 및 젬시타빈을 처리한 동물은 52 일이었고, PEGPH20, nab-파클리탁셀 및 젬시타빈을 처리한 동물은 68일임을 보여준다. 따라서, 결과는 nab-파클리탁셀 및 젬시타빈의 처리에 PEGPH20을 추가하는 것은 PEGPH20이 없이 nab-파클리탁셀 및 젬시타빈을 처리한 것과 비교하여 31 %의 증가된 효능 그리고 젬시타빈만 단독 처리한 것과 비교하여 79 %의 증가된 효능을 가지고 다른 임의의 처리에 비해 생존 시간 중앙값을 증가시킨다는 것을 보여준다.
Figure 112016024482551-pat00011
C. 종양 바이오마커의 측정
바이오마커 탄수화물 항원 19-9 (CA19-9) 및 췌장암과 관련이 있는 카르시노(carcino) 배아 항원(CEA)을 치료적 반응을 측정하기 위해 시험하였다. 동물을 A부분에서 기술된 바와 같이 처리하였다. 혈청은 첫번째 투여 주기의 0, 6, 13 및 20 일에 각각의 군 유래의 멸균된 동물 (n<3)로부터 수집되었다. 인간 CA19-9는 CA 19-9 ELISA 키트(카탈로그 번호. CA199T, Calbiotech, Spring Valley, CA)를 이용하여 측정하였고 CEA 종양 항원은 CEA ELISA 키트(카탈로그 번호. CE062T, Calbiotech, Spring Valley, CA)를 이용하여 측정하였다.
결과는 도 5에 기재하였다. 결과는 PEGPH20 처리의 존재가 모든 처리군에서 측정된 마커의 감소를 유발한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 20일 차에, 검출된 CA19-9 마커의 수준은 약 40-60 U/mL의 범위로 PEGPH20를 처리한 모든 그룹에서 유사하였다. 반대로, nab-파클리탁셀 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈을 처리한 동물에서 CA19-9 마커의 수준은 PEGPH20도 처리되는 동물의 약 두 배였고 약 110 U/mL이었다. 젬시타빈만을 단독 처리한 동물은 비히클만 처리되는 대조군과 거의 유사한 CA19-9 수준을 나타내었다. 그러므로, 결과는 PEGPH20 + nab-파클리탁셀로 처리된 동물은 nab-파클리탁셀만 단독 처리되는 동물에 비해 감소된 CA19-9 수준을 갖는다는 것; PEGPH20 + 젬시타빈으로 처리되는 동물은 젬시타빈만 단독 처리된 동물에 비해 감소된 CA19-9 수준을 갖는다는 것; 및 PEGPH20 + nab-파클리탁셀 + 젬시타빈으로 처리되는 동물은 오직 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈만 처리된 동물에 비해 감소된 CA19-9 수준을 갖는다는 것을 보여준다. PEGPH20 + nab-파클리탁셀 + 젬시타빈으로 처리된 동물의 경우, PEGPH20없이 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈이 처리된 동물에 비해 CA19-9가 49% 감소되었다.
CEA 마커가 측정되었을 때 결과는 유사하였다. 이 마커를 사용하여, 결과는 CEA의 수준이 이 군에서 CEA가 약 20 내지 25 ng/mL 에서 측정된 비히클 처리 대조군과 비교하여 nab-파클리탁셀만 단독 처리된 동물에서 20일차에 많이 변화하지 않았음을 보여준다. 젬시타빈 또는 nab-파클리탁셀 + 젬시타빈이 처리된 동물에서 CEA 마커는 20일차에 약 15 ng/mL로 일부 감소하였다. PEGPH20의 존재 하에서, 측정되는 마커의 수준은 PEGPH20이 처리되지 않은 군과 비교하여 상당히 감소하였다. 예를 들어, PEGPH20 만이 처리된 동물에서, 20 일차에 측정된 CEA는 약 7-8 ng/mL이었다. PEGPH20 + 젬시타빈, PEGPH20 +nab-파클리탁셀, 또는 PEGPH20 + nab-파클리탁셀 + 젬시타빈이 처리된 동물에서, 20 일 차의 CEA의 수준은 너무 낮아 ELISA에 의해 정량화할 수 없었다.
실시예 3
rHuPH20 발현 세포주
A. 초기 가용성 rHuPH20 -발현 세포주의 생성
중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 HZ24 플라스미드 (서열번호 52에 기재)로 형질감염시켰다. 가용성 rHuPH20 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본 (Promega), 인간 PH20 히알루로니다아제 (서열번호:49)의 아미노산 1 내지 482를 암호화하는 DNA, ECMV 바이러스로부터 유래된 내부 리보솜 유입점 (internal ribosomal entry site, IRES) (Clontech), 및 마우스 디하이드로엽산 환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자를 함유한다. pCI 벡터 백본은 또한 베타 락타마아제 저항성 유전자 (AmpR), f1 복제기점, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 전초기 인핸서(immediate-early enhancer)/프로모터 부위 (CMV), 키메릭 인트론, 및 SV40 후기 폴리아데닐화 신호(SV40)를 포함한다. 가용성 rHuPH20 구조를 암호화하는 DNA는 Nhel 자리 및 인간 PH20의 천연 35 아미노산 신호 서열의 아미노산 위치 1에서 메티오닌을 암호화하는 DNA 전의 코작(Kozak) 공통 서열, 및 서열번호 1에 기재된 인간 PH20 히알루로니다아제의 아미노산 위치 482에 상응하는 티로신을 암호화하는 DNA 뒤, BamHI 제한효소 자리 앞의 종결 코돈을 포함한다. 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24)는 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되고, 인간 PH20의 아미노산 1 내지 482(서열번호 3에 기재된) 및 마우스 디히드로엽산 환원효소의 아미노산 1 내지 186(서열번호 53에 기재된)을 암호화하는 CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA 종을 생성한다.
4 mM 글루타민 및 18 ml/L 플루로닉(Pluronic) F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장하는 비-형질감염된 CHO 세포를 형질감염을 위해 준비한 진탕 플라스크에 0.5 x 106 세포/ml로 접종하였다. 세포를 120 rpm으로 진탕시키면서, 습식배양기에서 5% CO2, 37 ℃로 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 비-형질감염된 CHO 세포의 생존력을 형질감염 전에 시험하였다.
비-형질감염된 CHO 세포 배양물의 6천만 생존세포를 펠렛화하고, 2x 형질감염 완충액(2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM 덱스트로오스) 0.7 mL 내에 2×107 세포밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각의 분액에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs)로 밤새 소화시켜 선형화됨) 0.09 mL(250 μg)를 첨가하고, 상기 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳 내로 이동시켰다. 전기천공 음성대조군은 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않은 것으로 실시하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF 또는 350V 및 960μF의 캐패시터 방전으로 전기천공하였다.
전기천공 후에 큐벳으로부터 상기 세포를 제거하여, 4 mM의 글루타민 및 18 ml/L의 플루로닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 변형된 CD-CHO 배지 5 mL 내로 옮기고, 습식배양기에서 5% CO2, 37℃에서 2일 동안 선별없이 6-웰 조직배양 플레이트의 웰 내에서 성장하도록 하였다.
전기천공 2일 후, 조직배양 배지 0.5 mL를 각각의 웰로부터 제거하고, 실시예 6에 기술된 미세탁도 분석법을 이용하여, 히알루로니다아제 활성의 존재를 시험하였다. 히알루로니다아제 활성이 가장 높게 나타내는 세포들을 조직 배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104개의 생존세포가 되도록 희석하였다. 세포 현탁액 0.1 mL 분액을 5개의 96 웰 원형 바닥 조직배양 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. GlutaMAX™-1 보충물질(GIBCO™, Invitrogen Corporation) 4 mM 을 함유하고 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine) 보충물을 첨가하지 않은 CD-CHO 배지 (GIBCO)의 100 마이크로리터를 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다(최종 부피는 0.2 mL).
10개의 클론을 메토트렉세이트(methotrexate) 부재 하에서 성장시킨 5개의 플레이트로부터 확인하였다. 이 중 6개의 HZ24 클론을 배양물 내에서 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕 플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 원형 바닥 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 배양물내에 초기 몇 일 동안 필수성장인자들을 제공하기 위하여 웰당 500개의 비-형질감염된 DG44 CHO 세포의 백그라운드에서 성장시켰다. 서브클론당, 50nM 메토트렉세이트를 함유한 플레이트 5개 및 메토트렉세이트 부재의 플레이트 5개를 가지는, 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3는 24개의 가시적인 서브클론을 생산하였다(메토트렉세이트 미처리로부터 13개, 및 50 nM 메토트렉세이트 처리로부터 11개). 유의적인 히알루로니다아제 활성이 24개 서브클론 중 8개의 상층액에서 측정되었으며(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리된 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재 하에 확장시켰다. 클론 3D35M을 진탕 플라스크에서 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 1,000 유닛/ml 히알루로니다아제 활성을 초과하는 생산하는 클론을 생성하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 그 다음 3D35M 세포의 마스터 세포은행(master cell bank, MCB)을 준비하였다.
B. 가용성 rHuPH20을 발현하는 제 2 세대 세포주 생성
실시예 3A에서 기술된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 2세대(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-함유 배양물로부터 4 mM GlutaMAX-1™ 및 1.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지 내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 약 4주 후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4 mM GlutaMAX-1™ 및 2.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(MCB)을 만들고 동결시켰으며 후속연구에 사용하였다.
4 mM GlutaMAX-1™ 및 4.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12 번째 계대후, 세포를 연구세포은행(research cell bank, RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 배양하였다. 5일 후, 배지내 메토트렉세이트 농도를 16.0 μM로, 그리고나서 18일 후에는 20.0 μM로 증가시켰다. 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지내 8번째 계대 유래의 세포를 4 mM GlutaMAX-1™ 및 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0 μM 메토트렉세이트를 함유한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대후, 2B2 세포를 연구세포은행(RCB)으로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로엽산 환원효소 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 PH20은 약 206 카피(copy)/세포의 복제수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한 개의 주된 혼성화밴드 및 네 개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0 kb의 한 개의 주된 혼성화밴드 및 두 개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한 개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사체의 서열분석은 유래된 cDNA(서열번호 56)가 위치 1131에서, 예상했던 시토신(C) 대신에 티미딘(T)인 것으로 관찰되는, 하나의 염기쌍 차이를 제외하고 참조서열(서열번호: 49)과 동일함을 나타내었다. 이는 아미노산 서열에는 영향이 없는, 침묵성 돌연변이(silent mutation)이다.
실시예 4
rHuPH20의 생산과 정제
A. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산
HZ24-2B2 세포의 바이알(실시예 3B)을 해동하고, 20 μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX-1™(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 진탕 플라스크로부터 36 L 스피너(spinner) 플라스크를 통하여 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20 mL가 있는 125 mL 진탕 플라스크에서 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕 플라스크에서 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 x 106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200 mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000 mL 배양부피로 6 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 x 106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 32 L 배양부피로 36 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400 L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230 mL를 첨가하였다. 사용전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30 L의 세포를 36 L 스피너 플라스크로부터 접종 밀도가 mL당 4.0 x 105 개 생존세포일 때 총 부피 260 L로, 400 L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점, 37℃; 임펠러속도 40 내지 55 RPM; 용기압력: 3 psi; 공기 분사(Sparge) 0.5 내지 1.5 L/분; 공기 오버레이(Overlay): 3 L/분이었다. 세포계수, pH 검사(verification), 배지분석, 단백질 생산 및 보유(retention)를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 작동 동안에 영양분 피드(nutrient feeds)를 첨가하였다. 120 시간(5일차)에, 피드#1 배지(4×CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 160 mL/L Glutamax-1™ + 83 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 33 mg/L rHuInsulin) 10.4 L를 첨가하였다. 168 시간(7일차)에, 피드#2 (2×CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 80 mL/L Glutamax-1™ + 167 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 0.92 g/L 부티르산 나트륨(Sodium Butyrate)) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216 시간(9일차)에, 피드#3 (1×CD-CHO + 50 g/L 글루코오스 + 50 mL/L Glutamax-1™ + 250 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 1.80 g/L 부티르산 나트륨) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264 시간(11일차)에, 피드#4 (1×CD-CHO + 33 g/L 글루코오스 + 33 mL/L Glutamax-1™ + 250 mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 0.92 g/L 부티르산 나트륨) 10.8 L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 1200만 세포/mL의 최대세포밀도를 갖고 ml당 17000 유닛의 최종 생산성 결과를 가져왔다. 수확시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도(bioburden), 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4-8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4-1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 함유하는, 평행한 4 개의 밀리스택 여과시스템 모듈(Millistak filtration system module) (Millipore) 이어서 셀룰로오스 막을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 0.4-0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore), 그 다음 셀룰로오스 막을 통과 후, 그 다음 350 L 용량의 멸균 일회용 연성 백 내로 0.22 μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10 mM EDTA 및 10 mM 트리스로 pH 7.5 까지 보충하였다. 4 개의 Sartoslice TFF 30kDa 분자량 차단(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22 μm 최종필터 내로, 50 L 멸균 저장백 내로 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과(diafilter)된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리(n-부틸) 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 직전 36 L 유리 반응용기에서 1 시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
B. Gen2 가용성 rHuPH20의 정제
Q 세파로스(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9 L 레진, H=29 cm, D=20 cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석의 결정을 위해서 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물(실시예 4A)을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0으로 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 히알루로니다아제 활성을 시험하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 측정하였다.
페닐-세파로스(Pharmacia) 소수성 상호작용 크로마토그래피를 다음으로 실시하였다. 페닐-세파로스(PS) 컬럼(19-21 L 레진, H=29 cm, D=30 cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼 유래의 단백질 용출물에 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM 을 얻기 위하여 2 M 암모늄 설페이트, 1 M 포타슘 포스페이트 및 1 M CaCl2 모액을 보충하였다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과유체(flow thru)를 수집하였다. 컬럼을 100 cm/시간으로 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl2 pH 7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과유체에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과유체를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과유체를 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과유체를 100 cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM 염화나트륨, pH 9.0으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 시험하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(BioRad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 시험하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제 단백질을 5 mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2의 최종 농도로 보충하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10 mM 포타슘 포스페이트, pH 7, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0으로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22 μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 시험하였다.
그 다음 HAP 정제된 단백질을 바이러스 제거필터로 통과시켰다. 멸균된 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 2 L의 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 로 세척하여 준비하였다. 사용전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP 정제된 단백질을 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22 μm 멸균필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일링을 시험하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 시험하였다.
실시예 5
rHuPH20의 PEG화의 준비
이 실시예에서, rHuPH20은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산(mPEG-SBA-30K)의 선형 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)와 효소 반응에 의해 PEG화되었다.
A. mPEG- SBA -30K의 준비
PEGPH20을 생성시키기 위해, rHuPH20 (크기가 약 60 KDa임)을 약 30 kDa의 분자량을 갖는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 부탄산의 선형 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-SBA-30K)에 공유결합으로 컨주게이션시켰다. mPEG-SBA의 구조는 하기 반응식에 나타내었고, 여기에서 n
Figure 112016024482551-pat00012
681 이다.
Figure 112016024482551-pat00013
rHuPH20을 PEG화하는데 사용된 mPEG-SBA-30K를 제조하기 위해 사용된 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,672,662호에 기술되어 있다. 요약하면, mPEG-SBA-30K를 하기 절차에 따라 제조하였다:
디옥산에 용해된 에틸 말로네이트 (2 당량)의 용액을 질소 기체 하에 수소화나트륨 (2 당량) 및 톨루엔에 적가하였다. mPEG 메탄 술포네이트 (1 당량, MW 30 kDa, 쉬어워터(Shearwater))를 톨루엔에 용해시키고, 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 약 18 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 원래 부피의 절반으로 농축시키고, 10% 수성 NaCl 용액으로 추출하고, 1% 수성 염산으로 추출하고, 수성 추출물을 혼합하였다. 수집된 수성층을 디클로로메탄 (3x)으로 추출하고, 유기층을 황산마그네슘으로 건조, 여과하고, 건조물이 되도록 증발시켰다. 생성된 잔류물을 염화나트륨을 함유하는 1 N 수산화나트륨에 용해시키고, 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 6 N 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 3으로 조정하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (2x)으로 추출하였다.
유기층을 황산마그네슘 상에서 건조, 여과, 농축시키고, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켰다. 생성된 화합물을 디옥산에 용해시키고, 8시간 동안 환류시킨 후, 건조물이 되도록 농축시켰다. 생성된 잔류물을 물에 용해시키고, 디클로로메탄 (2x)으로 추출하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 용액을 회전식 증발에 의해 농축시킨 후, 냉 디에틸 에테르에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에 건조시켰다. 생성된 화합물 (1 당량)을 디클로로메탄에 용해시키고, N-히드록시숙신이미드(2.1 당량)를 첨가하였다. 용액을 0℃로 냉각하고, 디클로로메탄 중 디시클로헥실카르보디이미드 (2.1 당량)의 용액을 적가하였다. 용액을 실온에서 약 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과, 농축시키고, 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 진공 하에서 건조시켜, mPEG-SBA-30K 분말을 얻었고, 이를 ≤ -15 ℃에서 동결하였다.
B. rHuPH20으로의 mPEG- SBA -30K의 컨주게이션
PEGPH20을 제조하기 위하여, 하기에서 나타낸 바와 같이, mPEG-SBA-30K을, rHuPH20 및 mPEG 사이에 안정한 아미드 결합을 제공하는, 공유결합 컨주게이션(covalent conjugation)에 의해 rHuPH20의 아미노기(들)에 커플링시켰고, 여기에서 n
Figure 112016024482551-pat00014
681이다.
Figure 112016024482551-pat00015
컨주게이션 전에, 실시예 4B에서 얻은 정제된 rHuPH20 벌크 단백질을, 0.2 m2 여과 영역을 가진 10 kDa 폴리에테르설폰(PES) 접선유동여과(TFF) 카셋트(Sartorius)를 이용하여, 10 mg/mL로 농축하였고, 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.2에 대하여 완충액을 교환하였다. 농축된 단백질은 사용 전까지 2-8 ℃에서 보관하였다.
rHuPH20을 컨주게이션시키기 위해, mPEG-SBA-30K (Nektar)를 2시간 미만 동안 실온 암조건에서 해동시켰다. 배치(batch)의 크기에 맞추어, 멸균된 3" 교반 막대를 1 또는 3 리터의 엘렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 안에 넣고, 완충액을 교환시킨 rHuPH20 단백질을 첨가하였다. 진공 후드 하에서, rHuPH20 1 g 당 mPEG-SBA-30K 건조분말 5 g(mPEG-SBA-30K: rHuPH20가 10:1의 몰비)을 플라스크에 첨가하고 혼합물을 10 분간 또는 mPEG-SBA-30K 가 완전히 용해될때까지 혼합하였다. 교반 속도는 거품이 발생되지 않고 소용돌이가 발생하는 정도로 하였다.
그 후 class 100 후드 하에서 연동 펌프를 이용해 용액을 펌핑하여, 0.22 ㎛ 폴리스티렌, 셀룰로오스 아세테이트 필터 캡슐(Corning 50 mL Tubetop filter)을 통해 멸균된 3" 교반 막대가 들어있는 새 1 또는 3 리터 엘렌마이어 플라스크로 용액을 여과시켰다. PEGPH20 반응 혼합물의 부피는 질량(1 g/mL 밀도)에 의해 결정되었고, 여과에 사용한 0.22 ㎛ 필터는 사용-후 완전성 검사(post-use integrity test)를 거쳤다.
혼합물을 그 후 교반 플레이트상에서 2-8 ℃로 위치시켰고, 20±1 시간 동안 암실에서 혼합되었다. 교반 속도는 거품을 일으키지 않으면서 소용돌이가 발생할 정도로 다시 설정되었다. 엘렌마이어 용기 전체를 호일로 싸서 용액을 빛으로부터 보호하였다. 혼합 후에, 1 M 글리신을 최종 농도가 25 mM이 될 때까지 첨가하여 반응을 종결시켰다. pH와 전도도(conductivity)를 측정하기 위하여 용기로부터 시료를 제거하였다. 5 mM 트리스 염기(5.65 L/L) 및 5 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 8.0(13.35 L/L) 용액을 첨가하여 Q 세파로스 정제를 진행할 수 있도록 pH와 전도도를 조정하였다.
컬럼부피 5배(36 L)의 5 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 8.0으로 QFF 세파로스(GE Healthcare) 이온 교환 컬럼 (높이 = 21.5-24.0 cm, 지름 = 20 cm)을 평형화하여 준비하였다. 컨주게이션 산물은 QFF 칼럼에 유속 95 cm/시간으로 적재되었다. 컬럼을 그 후 평형 완충액(5 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 8.0) 11 L로 유속 95 cm/시간으로 흘려 세척하고, 이어서 평형 완충액 25 L를 유속 268 cm/시간으로 흘려 세척하였다. 그 후 5 mM 트리스, 130 mM NaCl, pH 8.0을 유속 268 cm/시간으로 흘려 단백질 산물을 용출시켰다. 그 결과 얻은 정제된 PEGPH20을 0.2 m2 여과 영역을 가진 30 kDa 폴리에테르설폰(PES) 접선유동여과(TFF) 카셋트(Sartorius)를 이용하여, 3.5 mg/mL로 농축하였고, pH 6.5에서 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl에 대하여 완충액을 교환하였다. 그 결과 얻은 물질을 하기 실시예 6에 기술된 바와 같이, 효소 활성을 시험하였다. PEG화 rHuPH20 물질을 3.5 mg/mL의 농도로(최종 효소 활성 140,000 U/mL) 실리콘화된 브로모부틸 고무 스토퍼(stopper)와 알루미늄 플립 오프 밀봉(seal)이 장착된 5 mL 유리 바이알에 3 mL 부피가 되도록 채우고, 동결시켰다(－80 ℃ 냉동고에서 밤새 동결시키고, 장기보관을 위해 －20 ℃ 냉동고로 이동시킴). PEG화 rHuHP20은 rHuHP20 1 몰당 약 4.5 몰의 PEG를 함유하고 있다.
실시예 6
가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성의 결정
세포배양물, 혈장, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 시료 내의 가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성은, 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때 불용성 침천물을 형성하는 것에 기초한 비탁법(turbidimetric assay) 또는 플라스틱 다중-웰 미세역가 플레이트에 비공유결합으로 결합된 비오틴화된 히알루론산(b-HA) 기질의 분해에 의한 효소적으로 활성인 rHuPH20 또는 PEGPH20의 양을 측정하는 비오틴화-히알루론산 기질 검정을 이용하여 측정되었다.
A. 미세탁도 검정( Microturbidity Assay)
가용성 rHuPH20을 정해진 기간의 시간(10 분) 동안 히알루론산 나트륨(히알루론산)과 함께 배양한 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 히알루론산 나트륨을 침전시킴으로써 가용성 rHuPH20의 히알루로니다아제 활성이 측정되었다. 생성된 시료의 탁도는 30 분의 현상(development) 기간 후에 640 nm에서 측정되었다. 히알루론산 나트륨 기질에 대한 효소 활성에서 유래한 탁도 감소는 가용성 rHupH20 히알루로니다아제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 검정 상용표준품(working reference standard)의 희석물로 생성된 검정곡선을 이용하여 수행되며, 이 검정곡선과 비교하여 시료활성 측정이 이루어졌다.
시료 희석물이 효소 희석 용액(Enzyme Diluent Solutions)에서 준비되었다. 효소 희석 용액은 가수분해된 젤라틴 33.0±0.05 mg을 50 mM PIPES 반응 완충액(140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 25.0 mL 및 멸균 주사용수(sterile water for injection; SWFI) 25.0 mL에 용해하고, 25% 부미네이트(Buminate) 용액 0.2 mL를 상기 혼합물 내로 희석하고 30 초간 볼텍싱(vortexing)하여 준비되었다. 이는 사용하기 2 시간 이내에 수행되었고, 필요할 때까지 얼음위에서 보관되었다. 시료는 추산된 1-2 U/mL로 희석되었다. 일반적으로, 각 단계당 최대희석은 1:100을 초과하지 않았으며, 초기 희석을 위한 초기 시료의 크기는 20 μL 이상이었다. 검정을 수행하는데 필요한 최소 시료 부피는 다음과 같았다: 공정 중 시료(In-process Samples), FPLC분획: 80 μL; 조직배양 상청액: 1 mL; 농축된 물질(Material) 80 μL; 정제된 또는 최종단계의 물질(Material): 80 μL. 희석물은 저 단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에서 3반복적으로(triplicate)로 만들어졌고, 각각의 희석물 30 μL은 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD 바이오사이언스(BD BioSciences))로 옮겨졌다.
2.5 U/mL 농도를 갖는 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물은 표준곡선(Standard Curve)을 작성하기 위해 효소희석용액에서 제조되었고, 옵틸럭스(Optilux) 플레이트에 3반복적으로 첨가되었다. 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL 및 2.5 U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60 μL를 함유한“매질바탕시료(시약 블랭크; Reagent blank)”웰은 음성대조군으로서 플레이트에 포함되었다. 그리고 나서 플레이트는 덮혔고, 37℃에서 5 분 동안 열블록(heat block)으로 가온되었다. 덮개는 제거되었고 플레이트는 10 초간 진탕되었다. 진탕 후, 플레이트는 열블록에 되돌려졌고, MULTIDROP 384 액체 핸들링 장비는 따뜻한 0.25 mg/mL 히알루론산 나트륨 용액(100 mg 히알루론산 나트륨은 20.0 mL SWFI에 용해함으로써 준비됨. 이는 2 내지 4 시간 동안 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전시키거나/시키고 흔들어 혼합됨)로 프라이밍되었다. 반응 플레이트는 멀티드롭(MULTIDROP) 384로 옮겨졌고, 반응은 시작키를 눌러서 각 웰 내로 히알루론산 나트륨 30 μL를 분주하여 개시되었다. 그 다음 플레이트는 멀티드롭(MULTIDROP) 384로부터 제거되었고, 플레이트 덮개는 교체되었고 열블록으로 옮기기 전에 10 초간 진탕되었다. 37℃에서 10 분간 플레이트는 배양되었다.
멀티드롭(MULTIDROP) 384는 혈청 작업용액(serum working solution)으로 기계(machine)를 프라이밍하고 240 μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 준비되었다. (500 mM 아세테이트 완충용액 75 mL 내에 혈청 저장용액(Stock Solution) 25 mL[1 부피의 말 혈청(Sigma)을 9 부피의 500 mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정함]). 플레이트는 열블록으로부터 제거되어 멀티드롭(MULTIDROP) 384 위에 놓였고, 혈청 작업용액 240 μL는 웰로 분주되었다. 플레이트는 제거되었고 10 초간 플레이트 리더에서 진탕되었다. 추가 15 분 후에, 시료의 탁도는 640 nm에서 측정되었고, 각 시료의 히알루로니다아제 활성(U/mL로)은 표준곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정되었다.
비활성(specific activity)(U/mg)은 히알루로니다아제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나눔으로써 계산되었다.
B. 비오틴화된 히알루로난 검정
비오틴화된 히알루론산 검정은 플라스틱 다중-웰 미세역가 플레이트에 비공유결합으로 결합된 큰 분자량[~ 1.2 메가달톤(megadaltons)] 비오틴화된 히알루론산(b-HA) 기질의 분해에 의해 생물학적 시료 내의 효소적으로 활성인 rHuPH20 또는 PEGPH20의 양을 측정한다. 표준(Standards) 및 시료 내의 rHuPH20 또는 PEGPH20은 b-HA로 코팅된 플레이트에서 37℃로 배양되도록 한다. 일련의 세척 과정을 거친 후에, 잔존하는 분해되지 않은/결합된 b-HA는 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합물(컨주게이트; conjugate) (SA-HRP)로 처리된다. 고정화된(immobilized) SA-HRP와 발색기질(chromogenic substrate), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 간의 반응은 푸른색의 용액을 생성한다. 산으로 반응을 정지시킨 후에, 가용성 황색 반응 생성물의 생성은 미세역가 플레이트 분광 광도계를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 읽음으로써 결정되었다. 비오틴화된 히알루론산(b-HA)기질에 대한 효소 활성에 기인한 450 nm에서의 흡광도 감소는 가용성 rHuPH20 히알루로니다제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 또는 PEGPH20 표준품(reference standard)의 희석으로 생성된 검정곡선을 이용하여 수행되었으며, 시료 활성 측정은 이 검정곡선과 비교하여 이루어졌다.
시료의 희석과 캘리브레이터(calibrator)는 검정 희석액(Assay Diluent)에서 준비되었다. 검정 희석액이 1% v/v 혼주 혈장(pooled plasma)(적절한 종으로부터 유래된)을 HEPES 내의 0.1%(w/v) BSA, pH 7.4에 첨가함으로써 준비되었다. 이는 매일 준비되었고, 2-8 ℃에서 보관되었다. 예상된 히알루니다아제 수준 뿐만 아니라 종 타입(species type)에 의존하여, 단일 또는 다중 희석액은 적어도 하나의 시료 희석이 검정 곡선 범위 내 포함되는 것이 보장되도록 제조되었다. 시험 시료 희석액(들)의 선별을 가이드하기 위하여, 투여된 히알루로니다제 용량(dose), 투여 경로, 상기 종의 대략의 혈장 부피 및 시점(time point)에 관하여 공지된 정보는 히알루니다아제 활성 수준을 추산하는데 이용되었다. 각 시료 희석액은 이를 짧은 펄스(brief pulse)-볼텍싱(vortexing)에 의해 준비하는 것과 같이 혼합되었고, 피펫 팁은 각 희석 사이에 교체되었다. 일반적으로, 희석은 최초 50 또는 100배 희석으로 시작하여, 추가적인 단계적 희석을 하였다. rHuPH20 또는 PEGPH20의 7-포인트 검정곡선(투여된 처리물 의존적)은 rHuPH20에 대해서는 0.004에서 3.0 U/mL의 농도 범위로, PEGPH20에 대해서는 0.037 에서 27 U/mL의 농도 범위로 준비되었다. 각 시험 시료 희석액 100 마이크로리터(100 μL)와 검정곡선 포인트는, 이전에 0.1 mg/mL로 웰 당 b-HA 100 μL로 코팅되고 PBS 내의 1.0 % (w/v)의 소 혈청 알부민 250 μL으로 블록(block)되어 있었던 96-웰 미세역가 플레이트 (이뮤론(Immulon) 4HBX, 써모(Thermo))의 웰들에 3 반복적으로 적용되었다. 플레이트(들)은 접착성 플레이트 밀봉으로 덮히고 약 90분 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 기간 마지막에, 접착성 밀봉은 플레이트로부터 제거되었고, 시료는 흡입되었고 플레이트는 자동 플레이트 세척기(BioTek ELx405 Select CW, 프로그램 '4HBX1')를 이용하여 웰 당 300 μL의 세척 완충액(10 mM 인산염 완충액, 2.7 mM 염화칼륨, 137 mM 염화나트륨, pH 7.4, 0.5 % (v/v) 트윈 20을 갖는, PBST)으로 5 회 세척되었다. 100 마이크로리터의 스트렙타비딘-HRP 접합물 작업용액(working solution)[20 mM 트리스-염산 내의 스트렙타비딘-HRP 접합물(1:5,000 v/v), 137 mM 염화나트륨, 0.025 % (v/v) 트윈 20, 0.1 %(w/v) 소혈청 알부민]은 웰마다 첨가되었다. 플레이트는 밀봉되었고 진탕 없이 빛으로부터 보호된 상태로 주위 온도(ambient temperature)에서 약 60분 동안 배양되었다. 배양 기간 마지막에, 접착성 밀봉은 플레이트로부터 제거되었고, 시료는 흡입되고, 플레이트는 웰 당 300 μL의 전술한 세척 완충액으로 5 회 세척되었다. TMB 용액(주위 온도에서)은 각 웰마다 첨가되었고 실온에서 약 5분간 빛으로부터 보호된 상태로 배양되도록 하였다. 그 후 TMB 정지 용액(KPL, Catalog # 50-85-06)은 웰 당 100 μL씩 첨가되었다. 450 nm에서 각각의 웰의 흡광도는 미세역가 플레이트 분광 광도계를 이용하여 결정되었다. 각 플레이트의 검정곡선 반응은 4-변수 로지스틱 곡선 피트(4-parameter logistic curve fit)를 이용하여 모델링되었다. 각각의 미지의 히알루로니다아제 활성은 검정곡선의 내삽법(interpolation)에 의해 계산되었고, 시료 희석 인자로 보정되었고, U/mL로 보고되었다.
실시예 7
높은 종양 주위 히알루로난 (High Peritumoral Hyaluronan (HA)) 종양 모델에서 PEGPH20 처리의 효과
종양 주위 HA의 높은 수준에 대한 PEGPH20의 효과를 평가하기 위해, BXPC3-Has3 종양 세포주는 HAhigh 마우스 이종이식 종양 모델을 확립하기 위해 제조되었다. BxPC3 세포 (ATCC Cat.No. CRL-1687)는 완전(complete) RPMI 배지를 사용하여 표준 배양 조건 하에 배양되었다. 렌티 바이러스 시스템은 인간 히알루로난 합성 3 cDNA 전사체 (서열번호 212로 기재됨) 발현을 위해 제조되었다. hHAS3 cDNA를 발현하는 제조된 렌티바이러스 벡터는 pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg로 표기되었고 서열번호 213으로 기재되었다. BX-PC3-Has3 안정한 세포주(stable cell line)는 pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg로 바이러스 감염에 의해 제조되었고, 이어서 히그로마이신(hygromycin)으로 선택되었다. hHAS3 과발현을 위해 감염된 세포는 모든 실험에서 사용되었다.
HA 수준을 확인하기 위하여, 종양 절편 내 색도(color intensity)는 아페리오 스펙트럼 프로그램(Aperio spectrum program)으로 측정되었다. 종양은 종양 절편의 25% 이상을 염색하는 강한 HA에서 HAhigh; 종양 절편의 10 내지 25 %를 염색하는 강한 HA에서 HAmoderate; 종양 절편의 10% 이하를 염색하는 강한 HA에서 HAlow로 등급이 매겨졌다.
5 내지 6주령 및 20-25g의 무게를 가진 NCr(nu/nu) 마우스는 고압 종양을 생성하기 위해 우경골 골막(right tiial periosteum)에 인접하여 BxPC-3-3Has3 세포 (5 × 106/50 μL)로 접종되었다. 고형 종양 덩어리의 길이(L) 및 폭(W)은 캘리퍼스에 의해 측정되었고 종양 부피(TV)는 다음과 같이 계산되었다: (L×W2)/2. 종양의 부피가 직경으로 약 1500 내지 2000 mm3 에 도달하였을때, 마우스는 두 처리군으로 나뉘었다: (1) BxPC3 HAHigh, 비히클 대조군 또는 (2) BxPC HAhigh, PEGPH20.
동물은 0 시간 및 다시 42 시간에 비히클 (10 mM 히스티딘, pH6.5, 130 mM 염화나트륨) 또는 PEGPH20 (4.5 mg/kg)로 투어되었다. 제1차 PEGPH20 또는 비히클 대조군 처리 (48시간에 희생에 앞서, 즉, t= 0시간) 동물은 또한 복강내로 240 mg/kg 젬시타빈으로 및 정맥으로 10 mg/kg 파클리탁셀(Abraxane®)으로 처리되었다. 희생 2시간 전 (46 시간)에, 동물은 60 mg/kg HYPOXYPROBE™(피모니다졸 하이드로클로라이드; Chemicon International, Temecula, CA)과 또한 0.5 ml의 BrdU로 복강내로 처리되었다. 희생 5분 전에 (48시간), 동물은 75% DMSO 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate )(DiI)에 용해된 0.6 mg/ml 형광 카보시아닌 75 μL로 정맥내로 처리되었다.
동물은 48시간에 희생되었다. 모든 종양은 수거되었고, 조직은 알루미늄 블럭에서 -20 ℃로 냉각하였고, OCT 배지 (Sakura Finetek, Torrance, CA)로 포매하여 덥고 자르기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다. 종양 동결 절편(cryosection)은 10 um 절편으로 잘렸으며 면역조직화학을 위하여 처리되거나 현미경으로 이미징화되었다. 혈류량과 종양 저산소증(Tumor hypoxia)에 대한 영향이 평가되었다.
A. 혈류량
염색되지 않은, 깨끗한 동결 절편은 형광 현미경 이미징 시스템 (BD CARV II Confocal Imager, Sparks, MD; Quentem 512sc camera (Photometries, Tucson, AZ); MIV2000 motorized x-y stage, 및 MetaMorph System, Sunnyvale, CA)으로 스캔되었다. 전체 종양 절편은 종양 관류(perfusion)를 결정하기 위해 형광 카보시아닌 (DiI) 신호 (들뜸 562 nm/ 방출 624 nm)에 대하여 10X로 스캔되었다. 이미지는 Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD)를 이용하여 분석되었다. 전체 종양 면적 및 양성 염색 면적은 결정되었다. 각각의 종양 내 혈류량은 전체 종양 절편에 대한 양성 퍼센트(신호)로 계산되었다.
결과를 표 8에 기재하였다. 결과는 PEG-PH20 처리가 종양 처리된 대조군에 대하여 PEGPH20으로 처리된 마우스로부터 종양 내 혈관 관류에서 상당한 증가와 함께 BxPC-HAS3 종양에서 염료 관류를 매개한 것을 보여준다. 표 8을 요약하면, PEGPH20으로 처리된 동물은 대조군 동물에 대하여 116.9 % 증가인 7.24 ± 1.78의 평균 면적을 가진 혈류량에서 증가를 보여주었다.
Figure 112016024482551-pat00016
B. 저산소증( Hypoxia )
처리된 동물로부터 종양 절편은 피모니다졸 하이드로클로라이드 (HYPOXYPROBE™)를 시각화함으로써 저산소 면적에 대해 비교되었다. 구체적으로, 희생 후에, 비-특이적 염색을 위해 염소 혈청으로 블록킹된 동결절편은 피모니다졸 부가물을 탐지하기 위해 1:50 희석 항-피모니다졸 항체 (Hypoxyprobe™-l Mab-1, mouse IgGj; Chemicon International, Temecula, CA) 또는 내피 세포를 탐지하기 위해 1:100 희석 항-CD31 항체 (렛드, BD Pharmingen, San Diego, CA)로 상온에서 1시간 동안 프로빙되었다. 제1차 시약을 제거하기 위해 워싱 후에, FITC 염소 항-마우스 이차 항체 (Hypoxyprobe™-1 Mab-1을 시각화하기 위해, 1 : 100 희석; Vector Labs Burlingame, C A, USA) 또는 텍사스 레드 염소 항-렛드 이차 항체 (CD31 내피 세포를 시각화하기 위해; 1 : 100 희석; Vector Labs Burlingame, CA USA)는 상온에서 30분 동안 제2차 항체로 사용되었다. 절편은 Image-Pro Analyzer 7.0 (Media Cybermetrics, Bethesda, MD) 이미지 시스템을 사용하여 이미지화되었다. CD31 이미징에 대하여, 들뜸 파장은 562 nm였고 방출 파장은 624 nm 파장이었다. 피모니다졸 하이드로클로라이드 (HYPOXYPROBE™)에 대한 이미징을 위하여, 들뜸 파장은 490 nm였고 방출 파장은 520 nm였다.
결과를 표 9에 기재하였다. 결과는 HA 제거를 매개하는 PEGPH20이 BxPC3-Has3 종양에서 감소된 저산소증을 야기하였다. 대조군 동물은 전체 종양 절편의 3.98 ± 2.70 %에서 저산소 면적의 평균 퍼센트를 가졌다. PEGPH20으로 처리된 동물은 대조군 동물에 대해 78 % 감소인 0.86 ± 1.07의 평균 면적으로 종양에서 감소된 저산소증 면적을 가졌다.
Figure 112016024482551-pat00017
실시예 8
높은 종양 주위 히알루로난 (High Peritumoral Hyaluronan (HA)) 3중 음성 유방암 종양 모델에서 PEGPH20 및 납-파크리탁셀(nab paclitaxel) 병용 치료의 효과
MDA-MB-468 3중 음성 유방암 (TNBC) 세포주는 hHAS3A cDNA 전사체 (서열번호 212)를 과발현하기 위해 제조됨으로써 HAhigh TNBC 모델을 확립하였다. 완전 RPMI 배지를 이용하여 표준 배양 조건에서 배양된 MDA-MB-468 세포 (ATCC Cat. No. HTB-132)는 렌티 바이러스 벡터 pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg(서열번호 213)을 발현하는 hHAS3 cDNA로 감염되었고, 상기 기술된 바에 따라, 이어서 안정한 hHAS3-발현 세포주 MDA-MB-468/HAS3 제조를 위해 히그로마이신 선택되었다.
RPMI에서 현탁된 MDA-MB-468/HAS3 세포는 누드 마우스에 주입되었다. 종양 부피는 상기 기술된 것과 같이 측정되었다. 17일째, 종양이 약 300 mm3의 부피에 도달하였을 때, 동물은 1) 비히클; 2) 1 mg/kg 납-파크리탁셀; 3) 3 mg/kg 납-파크리탁셀; 4) 10 mg/kg 납-파크리탁셀; 5) 4.5 mg/kg PEGPH20; 또는 6) 1 mg/kg 납-파크리탁셀 및 4.5 mg/kg PEG20가 정맥으로 투여되는 6 처리군으로 나뉘었다. 종양 부피는 45일 동안 매 3일 내지 4일에 측정되었다.
결과는 도 6에 나타내었다. 비히클만 받은 제1처리군 내 동물은 연구 과정 동안 점진적 종양 성장을 보였다. 연구 마지막 날(62일차)에, 평균 종양 크기는 부피에서 막 두 배가 되었다. 납-파크리탁셀 1 또는 3 mg/kg을 받은 제2처리군 및 제3처리군 내 동물의 종양은 세포 이식 (0-10일차 처리 후) 후 17-27일차에 종양 부피에서 초기 감소(약 30%)를 보였지만, 그리고 나서 종양 성장은 비히클 대조군 동물과 대비하여 감소된 비율로 시작하였다. 연구의 마지막날, 평균 종양 부피는 시작 부피의 갓 2 배 이하였다.
PEGPH20-처리 동물 (제5군)에 대하여 관찰된 종양 성장의 패턴은 제2군 및 제3군에 대한 것과 유사하였지만, 제5군에 대한 평균 종양 크기는 마지막 날 제2군 및 제3군에 대한 것보다 약간 더 작었다. 10 mg/kg 납-파크리탁셀을 받은 제4군 내 동물의 평균 종양 크기는 처리 후(연구 17-27일차) 처음 10일 동안 제2, 4, 및 5군과 같이 동일한 경향을 따랐으나, 그리고 나서 추가 11일 동안 감소된 부피를 유지하였으며, 그 후 평균 초기 종양 부피의 1/3인 평균 종양 부피를 연구 마지막에 산출하도록 추가적인 30%를 연구의 남은 날 동안 꾸준히 감소하였다.
1 mg/kg 납-파크리탁셀 및 PEGPH20(제6군)의 병용은 평균 종양 부피의 점진적인 감소를 야기하였다. 이러한 결과는 동일 용량의 개별 처리와 비교하여 종양 성장억제에 상당히 증진된 효율을 야기하는 납-파크리탁셀 및 PEGPH20의 병용 처리에 관한 시너지 효과를 나타낸다. 병용 치료는 또한 평균 초기 종양 부피의 약 1/3인 최종 평균 종양 부피를 산출하는 단일 치료(10 mg/kg 납-파크리탁셀 (제5군))로 10배 더 큰 납-파크리탁셀을 받은 동물에서 관찰되는 것과 종양 부피에서 유사한 감소를 야기하였다.
변형들이 당 분야의 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 이 발명이 첨부된 청구항들의 범위에 의해서만 제한하려는 의도는 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> Halozyme, Inc. Maneval, Daniel C. Shepard, Harold Michael Thompson, Curtis B. <120> Combination Therapy with an anti-Hyaluronan Agent and Therpeutic Agent <130> 033320.03108.WO01/3108PC <140> Not Yet Assigned <141> Herewith <150> US 61/686,429 <151> 2012-04-04 <150> US 61/714,719 <151> 2012-10-16 <160> 213 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys 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aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446 <210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 variant P48A <400> 50 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 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aries <220> <223> encoding sheep PH20 <400> 66 ttttccgtgt tggttggctc tggacttcag agcaccccct ctcatttcaa acacttcttt 60 cctctgggcc tggaatgccc cagctgaacg ttgtattaaa atctttaaac tacctccaga 120 tctgagactc ttctctgtaa aaggaagccc ccaaaaaagt gctacgggac aatttattac 180 attattttat gctgatagac ttggctacta tcctcatata gatgaaaaaa caggcaacac 240 tgtatatgga ggaattcccc agttgggaaa cttaaaaaat catttggaaa aagccaaaaa 300 agacattgcc tattacatac caaatgacag cgtgggcttg gcggtcattg actgggaaaa 360 ctggaggcct acctgggcaa gaaactggaa acctaaagat gtttacaggg atgagtctgt 420 tgagttggtt ctgcaaaaaa atccacaact cagtttccca gaggcttcca agattgcaaa 480 agtggatttt gagacagcag gaaagagttt catgcaagag actttaaaac tgggaaaatt 540 acttcggcca aatcacttat ggggttatta tctttttcct gattgttaca atcataatta 600 taaccagcct acttacaatg gaaattgctc tgatttagaa aaaaggagaa atgatgatct 660 cgactggttg tggaaggaaa gcactgccct tttcccttct gtttatttga atatcaagtt 720 aaaatctact ccaaaagctg ccttctatgt tcgtaatcgt gtccaggaag ccattcggtt 780 gtctaaaata gcgagtgttg aaagtccact tcccgttttt gtatatcacc gtccagtttt 840 tactgatggg tcttcaacat acctttctca gggtgacctt gtgaattcgg ttggtgagat 900 cgttgctcta ggtgcctctg ggattataat gtggggcagt ctcaatctaa gcctaactat 960 gcaatcttgc atgaacctag gcaattactt gaacactaca ctgaatcctt acataatcaa 1020 cgtcacccta gcagccaaaa tgtgcagcca agtgctttgc cacgatgaag gagtgtgtac 1080 aaggaaacaa tggaattcaa gcgactatct tcacctgaac ccaatgaatt ttgctattca 1140 aactgggaaa ggtggaaaat acacagtacc tgggaaagtc acacttgaag acctgcaaac 1200 gttttctgat aaattttatt gcagttgtta tgccaacatc aactgtaaga agagagttga 1260 tataaaaaat gttcatagtg ttaatgtatg tatggcagaa gacatttgta tagagggccc 1320 tgtgaagtta caacccagtg atcattcctc tagccagaat gaggcatcta ctaccaccgt 1380 cagcagtatc tcaccctcta ctacagccac cacagtatct ccatgtactc ctgagaaaca 1440 gtcccctgag tgcctcaaag tcaggtgttt ggaagccatc gccaacgtca cccaaacggg 1500 gtgtcaaggt gttaaatgga agaacacttc cagtcagtca agtattcaaa atattaaaaa 1560 tcaaacaacc tattaaaata taaattcagt gcttataaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 <210> 67 <211> 793 <212> PRT <213> Arthrobacter sp. <220> <223> hyaluronan lyase (strain FB24) <400> 67 Met Thr Arg Glu Phe Ser Arg Arg Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Gly Leu Leu Leu Ala Met Val His Gly Pro Ala His Ala Ala Ala 20 25 30 Thr Ala Asn Ala Thr Leu Thr Pro Ala Asp Phe Ala Gly Leu Arg Gln 35 40 45 Arg Trp Val Asp Gln Ile Thr Gly Arg Lys Val Leu Val Ala Gly Asp 50 55 60 Asn Asp Phe Val Thr Ala Leu Ala Ala Leu Asp Lys Lys Ala Arg Thr 65 70 75 80 Ala Ile Asp Leu Leu Glu Arg Ser Ala Gly Arg Leu Thr Val Phe Ser 85 90 95 Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Thr Asp Leu Val Thr Thr His Thr Arg 100 105 110 Leu Ala Thr Met Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Gly Ser Glu His Phe 115 120 125 Ala Asp Ala Gly Leu Leu Ala Ala Ile Arg Ala Gly Leu Ala Asp Ala 130 135 140 Asn Ser Leu Cys Tyr Asn Ala Ser Lys Glu Glu Gln Gly Asn Trp Trp 145 150 155 160 Ser Trp Glu Ile Gly Thr Pro Lys Ala Leu Ala Asp Thr Met Val Leu 165 170 175 Leu His Ala Glu Leu Thr Ala Ala Glu Arg Ala Ala Tyr Cys Ala Ala 180 185 190 Ile Asp His Phe Val Pro Asp Pro Trp Gln Gln 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(strain RCC307) <220> <223> hyaluronan lyase <400> 97 Met Gly Ala Pro Ala Ile Pro Lys Val Pro Arg Ser Pro Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu His Thr Thr Arg Pro Asn Ser Gly Glu Ser Glu Val Val Arg Gln 20 25 30 Ala Glu Glu Leu Phe Glu Gln Thr Leu Val Asn Val Arg Gly Gln Leu 35 40 45 Ala Gly Ala Val Ala Ala Leu Glu Ser Ser Val His Asp Ser Glu Leu 50 55 60 Asn Tyr Gly Glu Ile Phe Leu Arg Asp Asn Val Pro Val Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Leu Arg Gly Arg Phe Glu Ile Val Arg His Phe Leu Asp Leu 85 90 95 Cys Leu Glu Leu Gln Ser Arg Ser Tyr Arg Thr Arg Gly Val Phe Pro 100 105 110 Thr Ser Phe Val Glu Glu Asp Asp Lys Ile Leu Ala Asp Tyr Gly Gln 115 120 125 Arg Ser Ile Gly Arg Ile Thr Ser Val Asp Ala Ser Leu Trp Trp Pro 130 135 140 Val Leu Cys Trp Met Tyr Val Arg Ala Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Pro Lys Val Gln Arg Ala Val Gln Leu Leu Leu Asp Leu Val 165 170 175 Leu Gln Pro Ser Phe Tyr Glu Pro Pro Val Leu Phe Val Pro Asp Cys 180 185 190 Ala Phe Met Ile Asp Arg Pro Met Asp Val Trp 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ccccaaccag cccttcacta ccatctggaa 240 tgccaacacc gagtggtgta tgaagaaaca cggcgtggac gtagacatca gtatctttga 300 tgtggtgacc aacccggggc agaccttccg cggccctaac atgaccattt tctacagctc 360 ccagctgggt acctaccctt actatacatc tgctggggag cctgtgtttg gtggcctgcc 420 ccagaatgcc agcctgaatg cccacctggc ccgcacattc caggacatcc tggctgccat 480 gcctgagcct cgcttctcag ggctggcagt cattgactgg gaggcatggc gcccgcgctg 540 ggccttcaac tgggacacca aggacattta ccggcagcgc tcacgggcat tggtacagaa 600 gcagcaccca gactggctag ctcctcgggt ggaggccgca gctcaggacc agttcgaggg 660 ggctgcagag gagtggatgg caggcaccct caagctggga caagcactgc gccctcaggg 720 cctctggggc ttctataatt tccctgagtg ctacaactat gactttaaaa gtcccaacta 780 tacaggccgg tgtccactaa acatctgtgc ccagaatgac cagctcgggt ggctgtgggg 840 ccagagccgt gccctctacc ccagcatcta cctgcctgca gcactggagg gcacgaagaa 900 gacacagatg ttcgtgcagc accgtgtggc tgaggcattc cgtgtggcag cgggtgcggg 960 ggaccccaag ctgccggtgc tgccctacat gcagctcttc tacgacatga ctaaccactt 1020 tctgcccgcg gaggagctgg agcacagcct gggggagagt 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tccattctcc tcagtggctt ctccagggaa ttcttacagc 3120 caagttgtga cagtcactgc atttgcctgc ttctttccag aaaccaaact aggagatgaa 3180 actggttcct acatcctaag gttcttgctt tctctctcat gcctcctgag gctgtttttg 3240 gctgttttcc ctctgctgct tttggggaat gaggggaagc cattttccag tgacttgcaa 3300 tccaggctgt tctcagcgtt ttgagtttaa aacctgggat cctgactaag cctttgactt 3360 aagggttgct tgcttgccct ccaaatgtcc tttctcagag gggccagcta acccgtgcag 3420 aaccagcact aaggtggaca gcagacaaga gggcaagcct ctagtgtacc aagtgcttcc 3480 tacaaagacg caaggtgtgc tctgagccac agatgggcaa accctggtgc tttccttcat 3540 ctcccacgaa ctcaagggtt ttccaggtgt agctaacagt tgccacatca cacagacctc 3600 gagtttctgg taagactgct ggttgacatc agacccaacc catgaaggct ggaaggcagc 3660 aggcatttgc taaggcagct gatccaggca atcgttctgc tggccaagaa gttaaactat 3720 tttgagcatt agaatggagg aaatccggtc agccaagtgc agagttcaga cttcgctaag 3780 ggcttgtttt tcttcagcat ttacttgaag attaatgtag gatgacaggc tctcctggct 3840 gtcctaccat cagctctgcc ttgcactgtg gtcgtcaact ttcctcaaat caaaaacagg 3900 caggtacagg tagtgggctc acaacgtttg acctcgactg gtttttctaa gttattttgt 3960 acatttttca gcagcaaaac caaactgggt cttcagcttt atccccgttt cttgcaaggg 4020 aagagccttt atacaattgg acgcattttg gtttttcctc attgagaatt caaatcctct 4080 tttgtattgt ttctacaata atttgtaaac atatttattt ttacctgctt tttttttttt 4140 ttttaatttt caggtcaagt tttttatact gcacttattt gtcaaaataa agattctcac 4200 atatgccggt tatctcgaaa 4220 <210> 198 <211> 1229 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> HAS3 transcript variant 2 <400> 198 ggaggggcat ggagccgccg cgggcctgct gagctccgga gcgcggcagc cggcggcacg 60 atgccggtgc agctgacgac agccctgcgt gtggtgggca ccagcctgtt tgccctggca 120 gtgctgggtg gcatcctggc agcctatgtg acgggctacc agttcatcca cacggaaaag 180 cactacctgt ccttcggcct gtacggcgcc atcctgggcc tgcacctgct cattcagagc 240 ctttttgcct tcctggagca ccggcgcatg cgacgtgccg gccaggccct gaagctgccc 300 tccccgcggc ggggctcggt ggcactgtgc attgccgcat accaggagga ccctgactac 360 ttgcgcaagt gcctgcgctc ggcccagcgc atctccttcc ctgacctcaa ggtggtcatg 420 gtggtggatg gcaaccgcca ggaggacgcc tacatgctgg 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gcaccatcga gatgcttcga gtcctggagg aggatcccca agtaggggga 720 gtcgggggag atgtccagat cctcaacaag tacgactcat ggatttcctt cctgagcagc 780 gtgcggtact ggatggcctt caacgtggag cgggcctgcc agtcctactt tggctgtgtg 840 cagtgtatta gtgggccctt gggcatgtac cgcaacagcc tcctccagca gttcctggag 900 gactggtacc atcagaagtt cctaggcagc aagtgcagct tcggggatga ccggcacctc 960 accaaccgag tcctgagcct tggctaccga actaagtata ccgcgcgctc caagtgcctc 1020 acagagaccc ccactaagta cctccggtgg ctcaaccagc aaacccgctg gagcaagtct 1080 tacttccggg agtggctcta caactctctg tggttccata agcaccacct ctggatgacc 1140 tacgagtcag tggtcacggg tttcttcccc ttcttcctca ttgccacggt tatacagctt 1200 ttctaccggg gccgcatctg gaacattctc ctcttcctgc tgacggtgca gctggtgggc 1260 attatcaagg ccacctacgc ctgcttcctt cggggcaatg cagagatgat cttcatgtcc 1320 ctctactccc tcctctatat gtccagcctt ctgccggcca agatctttgc cattgctacc 1380 atcaacaaat ctggctgggg cacctctggc cgaaaaacca ttgtggtgaa cttcattggc 1440 ctcattcctg tgtccatctg ggtggcagtt ctcctgggag ggctggccta cacagcttat 1500 tgccaggacc tgttcagtga gacagagcta gccttccttg tctctggggc tatactgtat 1560 ggctgctact gggtggccct cctcatgcta tatctggcca tcatcgcccg gcgatgtggg 1620 aagaagccgg agcagtacag cttggctttt gctgaggtgt ag 1662 <210> 213 <211> 10836 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg vector <400> 213 aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta 60 gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg 120 gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg gacgaaccac 180 tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacgggtc 240 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360 ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg 420 cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg acgcaggact 480 cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa 540 attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg 600 gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat 660 aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc 720 ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag 780 acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat 840 caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 900 aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat 960 gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg 1020 agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat 1080 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 1140 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 1200 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 1260 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat 1320 ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 1380 taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat 1440 taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 1500 gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat 1560 aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt 1620 aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 1680 atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga 1740 agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 1800 tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 1860 agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaattcaa 1920 aattttatcg atgcctcccc gtcaccaccc cccccaaccc gccccgaccg gagctgagag 1980 taattcatac aaaaggactc gcccctgcct tggggaatcc cagggaccgt cgttaaactc 2040 ccactaacgt agaacccaga gatcgctgcg ttcccgcccc ctcacccgcc cgctctcgtc 2100 atcactgagg tggagaagag catgcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca 2160 catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga 2220 gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg 2280 agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg 2340 ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2400 cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt 2460 cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga 2520 gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga 2580 atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat 2640 ttttgatgat atcctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 2700 gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc 2760 cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg 2820 tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 2880 ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt 2940 cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 3000 gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc 3060 acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg 3120 tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 3180 actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 3240 tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 3300 caggtgtcgt gaaaactacc cctctagacc cgggccacca tgccggtgca gctgacgaca 3360 gccctgcgtg tggtgggcac cagcctgttt gccctggcag tgctgggtgg catcctggca 3420 gcctatgtga cgggctacca gttcatccac acggaaaagc actacctgtc cttcggcctg 3480 tacggcgcca tcctgggcct gcacctgctc attcagagcc tgtttgcctt cctggagcac 3540 cggcgcatgc gacgtgccgg ccaggccctg aagctgccct ccccgcggcg gggctcggtg 3600 gcactgtgca ttgccgcata ccaggaggac cctgactact tgcgcaagtg cctgcgctcg 3660 gcccagcgca tctccttccc tgacctcaag gtggtcatgg tggtggatgg caaccgccag 3720 gaggacgcct acatgctgga catcttccac gaggtgctgg gcggcaccga gcaggccggc 3780 ttctttgtgt ggcgcagcaa cttccatgag gcaggcgagg gtgagacgga ggccagcctg 3840 caggagggca tggaccgtgt gcgggatgtg gtgcgggcca gcaccttctc gtgcatcatg 3900 cagaagtggg gaggcaagcg cgaggtcatg tacacggcct tcaaggccct cggcgattcg 3960 gtggactaca tccaggtgtg cgactctgac actgtgctgg atccagcctg caccatcgag 4020 atgcttcgag tcctggagga ggatccccaa gtagggggag tcgggggaga tgtccagatc 4080 ctcaacaagt acgactcatg gatttccttc ctgagcagcg tgcggtactg gatggccttc 4140 aacgtggagc gggcctgcca gtcctacttt ggctgtgtgc agtgtattag tgggcccttg 4200 ggcatgtacc gcaacagcct cctccagcag ttcctggagg actggtacca tcagaagttc 4260 ctaggcagca agtgcagctt cggggatgac cggcacctca ccaaccgagt cctgagcctt 4320 ggctaccgaa ctaagtatac cgcgcgctcc aagtgcctca cagagacccc cactaagtac 4380 ctccggtggc tcaaccagca aacccgctgg agcaagtctt acttccggga gtggctctac 4440 aactctctgt ggttccataa gcaccacctc tggatgacct acgagtcagt ggtcacgggt 4500 ttcttcccct tcttcctcat tgccacggtt atacagcttt tctaccgggg ccgcatctgg 4560 aacattctcc tcttcctgct gacggtgcag ctggtgggca ttatcaaggc cacctacgcc 4620 tgcttccttc ggggcaatgc agagatgatc ttcatgtccc tctactccct cctctatatg 4680 tccagccttc tgccggccaa gatctttgcc attgctacca tcaacaaatc tggctggggc 4740 acctctggcc gaaaaaccat tgtggtgaac ttcattggcc tcattcctgt gtccatctgg 4800 gtggcagttc tcctgggagg gctggcctac acagcttatt gccaggacct gttcagtgag 4860 acagagctag ccttccttgt ctctggggct atactgtatg gctgctactg ggtggccctc 4920 ctcatgctat atctggccat catcgcccgg cgatgtggga agaagccgga gcagtacagc 4980 ttggcttttg ctgaggtgta gacgcgtctc cggcctaggg ataacagggt aatccgctag 5040 cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 5100 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 5160 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 5220 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 5280 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 5340 ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 5400 cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 5460 ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 5520 cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 5580 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacactagag atccaccggt 5640 cgccaccatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa 5700 gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag 5760 cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta 5820 caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct 5880 tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt 5940 cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg tcgcggaggc 6000 catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc 6060 gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca 6120 tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct 6180 cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga 6240 tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag 6300 cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct ggaggccgtg 6360 gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg agcttgcagg 6420 atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct atcagagctt 6480 ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg caatcgtccg 6540 atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac 6600 cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag 6660 ggcaaaggaa taggcggccg cgtcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 6720 ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 6780 cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 6840 tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 6900 actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 6960 tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 7020 gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 7080 aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 7140 tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 7200 ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 7260 tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtaccttt aagaccaatg acttacaagg 7320 cagctgtaga tcttagccac 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ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 9060 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 9120 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 9180 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 9240 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 9300 tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 9360 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 9420 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 9480 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 9540 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 9600 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 9660 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 9720 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 9780 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 9840 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 9900 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 9960 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 10020 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 10080 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 10140 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 10200 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 10260 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 10320 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 10380 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 10440 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 10500 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 10560 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 10620 acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 10680 ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 10740 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa 10800 ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctgc 10836

Claims (61)

  1. (ⅰ) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 폴리머인 폴리머에 컨쥬게이션에 의해 PEG화되어 혈청 반감기가 증가된 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 제1 조성물; 및
    (ⅱ) 알부민에 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해 직접 또는 간접적으로 연결된 탁산을 포함하는 종양-표적 탁산을 포함하는 제2 조성물을 포함하는,
    암 치료용 조성물의 조합물로서,
    여기서, 상기 암은 같은 조직 타입의 비-암성 조직과 비교하거나 같은 종양 타입의 비-전이성 종양과 비교하여 히알루로난의 증가된 세포성 및/또는 기질 발현을 나타내는 기질 고형 종양이고, 췌장암, 난소암, 폐암, 대장암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 상피 내암(ISC), 편평상피암(SCC), 자궁 경부암, 두경부암 및 유방암 중에서 선택되는 것인, 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 종양-표적 탁산이 알부민-결합 파클리탁셀 또는 알부민-결합 도세탁셀인 것을 특징으로 하는 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    조성물이 직접 투여용으로 제형화되고;
    히알루로니다아제의 농도가 종양-관련 히알루로난을 분해하기에 충분하며; 및
    종양-표적 탁산의 농도가 종양 내 전달을 달성하기에 충분한 것임을 특징으로 하는 조합물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양-표적 탁산의 농도가, 종양 내 탁산의 부재시 뉴클레오시드 탈아미노 효소(deaminase) 단백질의 수준 또는 활성과 대비하여 종양 내 뉴클레오시드 탈아미노 효소 단백질의 수준 또는 활성을 감소시키기에 충분한 것임을 특징으로 하는 조합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 히알루로니다아제 및 종양-표적 탁산이 단일 조성물로 공-제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2 조성물이 별개로 제공되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학치료제인 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  8. 제3항에 있어서, 화학치료제인 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  9. 제4항에 있어서, 화학치료제인 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  10. 제5항에 있어서, 화학치료제인 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  11. 제6항에 있어서, 화학치료제인 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  12. 제7항에 있어서,
    조성물(들)이 직접 투여용으로 제형화되고; 및
    뉴클레오시드 유사체의 농도가 종양 내 전달을 달성하기에 충분한 것임을 특징으로 하는 조합물.
  13. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 히알루로니다아제 및 종양-표적 탁산과는 별개로 제공되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  14. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 히알루로니다아제와 공-제형화되거나 또는 종양-표적 탁산과 공-제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  15. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 히알루로니다아제 및 종양-표적 탁산과 공-제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 다중 용량 투여(multiple dosage administration)용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 단일 용량 투여(single dosage administration)용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 히알루로니다아제 조성물이 50 유닛 히알루로니다아제 활성 (U)/ml 내지 15,000 U/mL을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 히알루로니다아제가 가용성 PH20인 것을 특징으로 하는 조합물.
  20. 제19항에 있어서, 가용성 PH20이 소 또는 양 PH20이거나, 또는 C-말단 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 부착 부위 또는 GPI 부착 부위의 일부분이 결여된 인간 PH20의 가용성 형태인 것을 특징으로 하는 조합물.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    히알루로니다아제가 절단된 PH20이고;
    히알루로니다아제가 중성 활성 및 가용성이고; 및
    절단된 PH20이 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  22. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183-189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양-표적 탁산이 마이셀, 나노파티클, 마이크로스피어, 리포좀 또는 하이드로젤 중에서 선택되는 전달 비히클로 제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 표적 탁산 조성물이 0.01 mg 탁산/mL 내지 100　mg/mL인 종양-표적 탁산의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  29. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 퓨린 또는 피리미딘 유사체인 것을 특징으로 하는 조합물.
  30. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 플루오로피리미딘 5-플루오로우라실, 5-플루오로-2'-데옥시시티딘, 시타라빈, 젬시타빈, 트로사시타빈, 데시타빈, 아자시티딘, 슈도이소시티딘(pseudoisocytidine), 제불라린, 안시타빈, 파자라빈, 6-아자시티딘, 카페시타빈, N4-옥타데실-시타라빈, 엘라이드산 시타라빈, 플루다라빈, 클라드리빈, 클로파라빈, 넬라라빈, 포로데신 및 펜토스타틴 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  31. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 뉴클레오시드 탈아미노 효소에 대한 기질인 것을 특징으로 하는 조합물.
  32. 제31항에 있어서, 뉴클레오시드 탈아미노 효소가 아데노신 탈아미노 효소 또는 시티딘 탈아미노 효소인 것을 특징으로 하는 조합물.
  33. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체가 플루다라빈, 시타라빈, 젬시타빈, 데시타빈 및 아자시티딘 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  34. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 조성물이 1 mg/mL 내지 500 mg/mL인 뉴클레오시드 유사체의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루코코르티코이드를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  36. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물(들)이 경구, 정맥(IV), 피하, 근육내, 종양내, 피내, 국소, 경피, 직장, 경막내 또는 표피하 투여용으로 제형화된 것을 특징으로 하는 조합물.
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 제1항에 있어서, 폴리머가 30 킬로달톤(kilodalton)의 분자량을 가지는 PEG인 것을 특징으로 하는 조합물.
  40. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용을 위한 지침서를 더 포함하고 키트(kit)로 포장된 것을 특징으로 하는 조합물.
  41. 종양-표적 탁산과 조합하여 히알루로니다아제를 포함하는 암 치료용 조성물로서,
    여기서, 상기 암은 같은 조직 타입의 비-암성 조직과 비교하거나 같은 종양 타입의 비-전이성 종양과 비교하여, 히알루로난의 증가된 세포성 및/또는 기질 발현을 나타내는 기질 고형 종양이고, 췌장암, 난소암, 폐암, 대장암, 전립선암, 비소세포 폐암(NSCLC), 상피 내암(ISC), 편평상피암(SCC), 자궁 경부암, 두경부암 및 유방암 중에서 선택되고;
    상기 히알루로니다아제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 폴리머인 폴리머에 컨쥬게이션에 의해 PEG화되고;
    상기 히알루로니다아제는 상기 종양-표적 탁산과 동시에, 별개로 또는 순차적인 처치를 위해 제형화되고;
    상기 종양-표적 탁산은 알부민에 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해 직접 또는 간접적으로 연결된 탁산을 포함하는, 조성물.
  42. 삭제
  43. 제41항에 있어서, 암이 췌장암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루로니다아제 조성물은 10 유닛 히알루로니다아제 활성 (U)/ml 내지 500 U/mL을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  45. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루로니다아제 조성물은 1,000 유닛 히알루로니다아제 활성 (U)/ml 내지 15,000 U/mL을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  46. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히알루로니다아제 조성물은 100 유닛 히알루로니다아제 활성 (U)/ml 내지 5,000 U/mL을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  47. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    히알루로니다아제가 절단된 PH20이고;
    히알루로니다아제가 중성 활성 및 가용성이고; 및
    절단된 PH20이 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  48. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    히알루로니다아제가 절단된 PH20이고;
    히알루로니다아제가 중성 활성 및 가용성이고; 및
    절단된 PH20이 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  49. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    히알루로니다아제가 절단된 PH20이고;
    히알루로니다아제가 중성 활성 및 가용성이고; 및
    절단된 PH20이 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 적어도 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464를 포함하는 아미노산 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 가지며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  50. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183-189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  51. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183-189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  52. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183-189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 보이며 히알루로니다아제 활성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  53. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 표적 탁산 조성물이 1 mg/mL 내지 50 mg/ml인 종양-표적 탁산의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  54. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 표적 탁산 조성물이 10 mg/mL 내지 100 mg/ml인 종양-표적 탁산의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  55. 제1항 또는 제2항에 있어서, 종양 표적 탁산 조성물이 2.5 mg/mL 내지 25 mg/ml인 종양-표적 탁산의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  56. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 조성물이 5 mg/mL 내지 100 mg/ml인 뉴클레오시드 유사체의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  57. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 조성물이 10 mg/mL 내지 50 mg/ml인 뉴클레오시드 유사체의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  58. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 조성물이 25 mg/mL 내지 200 mg/ml인 뉴클레오시드 유사체의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  59. 제7항에 있어서, 뉴클레오시드 유사체 조성물이 20 mg/mL 내지 100 mg/ml인 뉴클레오시드 유사체의 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  60. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조합물.
  61. 제21항에 있어서, PH20이 서열번호 4 내지 9, 47, 48, 150 내지 170 및 183 내지 189 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조합물.


















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