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JP7727086B2 - 抗ｐｖｒｉｇ／抗ｔｉｇｉｔ二重特異性抗体及び応用 - Google Patents

抗ｐｖｒｉｇ／抗ｔｉｇｉｔ二重特異性抗体及び応用

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JP7727086B2 JP2024505449A JP2024505449A JP7727086B2 JP 7727086 B2 JP7727086 B2 JP 7727086B2 JP 2024505449 A JP2024505449 A JP 2024505449A JP 2024505449 A JP2024505449 A JP 2024505449A JP 7727086 B2 JP7727086 B2 JP 7727086B2
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Description

本発明は、抗体の分野に関し、具体的には、抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体に関する。
免疫療法の基礎は、自然免疫反応及び獲得免疫反応の両方を含む免疫系の操作及び／又は調節である。免疫療法の目的は、「外来因子」（例えば病原体又は腫瘍細胞）の免疫反応を制御することによって疾患を治療することである。免疫系は、相互作用及び反応を制御する複雑且つ微細なシステムを持つ多くの細胞タイプで構成される非常に複雑なシステムである。がん免疫監視の概念は、免疫系が腫瘍細胞を認識し、免疫反応を開始し、更に腫瘍の発生及び／又は進行を阻害することができる理論に基づく。ところが、多くのがん細胞が免疫系を回避する機序を生じ、阻害されない腫瘍の成長を可能にすることは明らかである。がん／腫瘍免疫療法は、より効果的な抗腫瘍反応を達成し、腫瘍細胞の殺傷を強化する及び／又は腫瘍成長を阻害するために、免疫系の活性化及び／又はアクティブ化を可能にする新型且つ新規なアンタゴニスト及び／又は拮抗薬の開発を焦点に当てる。
ＰＶＲＩＧはＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞で発現され、そして他の既知の免疫チェックポイントと幾つかの類似点を有する。ＰＶＲＩＧが免疫チェックポイント受容体であることを証明するための同定及び方法は、ＷＯ２０１６／１３４３３３で論じられており、上記文献は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。ＰＶＲＩＧがそのリガンド（ＰＶＲＬ２）に結合する場合、標的細胞に対するＮＫ細胞及びＴ細胞の免疫反応を弱める（即ちＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１と類似する）ように作用する阻害シグナルが引き起こされる。ＰＶＲＬ２のＰＶＲＩＧへの結合をブロックすると、ＰＶＲＩＧのこのような阻害シグナルが遮断され、また、それによってＮＫ細胞及びＴ細胞の免疫反応が調節される。ＰＶＲＬ２への結合をブロックするＰＶＲＩＧ抗体の使用は、ＮＫ細胞及びＴ細胞によるがん細胞の殺傷を強化する治療方法である。ＰＶＲＩＧに結合すると共に、そのリガンドＰＶＲＬ２への結合をブロックするブロック抗体が生成されている。
類似的には、ＴＩＧＩＴは別の注目される標的であり、その相同リガンドＰＶＲへの結合は、その細胞内ＩＴＩＭドメインを介してＮＫ細胞及びＴ細胞の細胞毒性を直接阻害することが示されている。ＴＩＧＩＴ遺伝子のノックアウト又はＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ相互作用のブロック抗体は、インビトロでＮＫ細胞殺傷を強化するか、又はインビボで自己免疫疾患を悪化させることが示されている。Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する直接作用に加えて、ＴＩＧＩＴは、樹状細胞又は腫瘍細胞においてＰＶＲ媒介性シグナル伝達を誘導することで、抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ１０）の産生を増加させることができる。注意すべきことは、ＴＩＧＩＴの発現は、別の重要な共阻害受容体ＰＤ－１の発現に緊密に関連している。ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１は、多くのヒト及びマウスの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で共発現される。
ＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧは両方ともＤＮＡＭスーパーファミリーに属し、また多くの腫瘍浸潤リンパ球で共発現されて免疫阻害作用を発揮することが示されると同時に、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲＩＧ及びＰＤ－１で共発現される腫瘍浸潤エフェクターＴ細胞は、浸潤Ｔ細胞集団における最も重要なエフェクターＴ細胞であると考えられている。従って、ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴを同時に標的とする二重特異性抗体は、潜在的な相乗効果を有し、単一抗体療法に用いられる魅力的な治療方法である。このような二重特異性抗体は、２つの免疫チェックポイントを同時に標的とする受容体が、同時に従来の抗ＰＤ－１／Ｌ－１抗体療法と潜在的な相乗効果を更に有することができ、がん治療において新たな治療手段を提供することにおいて重要な役割を果たす。
二重特異性抗体の潜在的な相乗効果を鑑み、免疫阻害作用を向上させ、免疫チェックポイント阻害剤の応答効率が低下するという問題を解決するために、特に本発明を提案する。
本発明は、抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ抗体、それらをコードする核酸、抗体の製造方法、上記抗体を含む医薬組成物、及び腫瘍を治療するための医薬組成物の関連する用途を提供する。
第１態様において、本発明は抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を提供し、それは、
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１抗原結合部分であって、上記ＶＨ及びＶＬは抗ＴＩＧＩＴ抗原結合ドメインを形成し、そのうち、上記ＴＩＧＩＴ ＶＨは配列番号７２又は８７の何れか１項に記載のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、上記ＴＩＧＩＴ ＶＬは配列番号６８又は９１の何れか１項に記載のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、第１抗原結合部分と、
（ｂ）ＰＶＲＩＧに特異的に結合するＶＨＨを含む第２抗原結合部分であって、上記ＶＨＨは配列番号２００又は２１１の何れか１項に記載の配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、第２抗原結合部分と、を含む。
幾つかの実施例において、（ａ）上記第１抗原結合部分のＨＣＤＲ１は配列番号２１又は３３の何れか１項に記載の配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２２又は３４の何れか１項に記載の配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号２３又は３５の何れか１項に記載の配列を含み、
（ｂ）上記第１抗原結合部分のＬＣＤＲ１は配列番号１８又は９６の何れか１項に記載の配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１９又は３１の何れか１項に記載の配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号２０又は３２の何れか１項に記載の配列を含み、
（ｃ）上記第２抗原結合部分のＣＤＲ１は配列番号１６８又は１４７の何れか１項に記載の配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２０７又は１４８の何れか１項に記載の配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号２０８又は１４９の何れか１項に記載の配列を含む。
幾つかの実施例において、上記第１抗原結合部分は、
（１）配列番号がそれぞれ２１、２２、２３、１８、１９及び２０である配列、或いは
（２）配列番号がそれぞれ３３、３４、３５、９６、３１及び３２である配列、或いは
（３）上記（１）～（２）に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は１個、２個、３個若しくはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記第２抗原結合部分は、
（１）配列番号がそれぞれ１６８、２０７及び２０８である配列、或いは
（２）配列番号がそれぞれ１４７、１４８及び１４９である配列、或いは
（３）上記（１）～（２）に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するか、又は１個、２個、３個若しくはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記第１抗原結合部分のＶＨは配列番号７２又は８７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、上記第１抗原結合部分のＶＬは配列番号６８又は９１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施例において、第２抗原結合部分は配列番号２００又は２１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施例において、上記第１抗原結合部分は２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む完全長抗体であり、上記第２抗原結合部分のＣ末端は第１抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。
幾つかの実施例において、重鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までＰＶＲＩＧ ＶＨＨ－（Ｇ４Ｓ）４ Ｌｉｎｋｅｒ－ＴＩＧＩＴ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までＴＩＧＩＴ ＶＬ－ＣＬを含む。
幾つかの実施例において、上記重鎖融合ポリペプチドは配列番号２２７、２２９、２３１又は２３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、軽鎖ポリペプチドは配列番号２２６、２２８、２３０又は２３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施例において、上記二重特異性抗体はヒト化抗体である。
幾つかの実施例において、上記二重特異性抗体はヒト、サルＰＲＶＩＧ又はＴＩＧＩＴタンパク質に特異的に結合し、好ましくは、ヒト、サルＴＩＧＩＴに結合するＫＤが１．００Ｅ－７Ｍよりも高く、ヒト、サルＰＲＶＩＧに結合するＫＤが１．００Ｅ－８Ｍよりも高く、より好ましくは、ＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧに同時に結合できる。
別の態様において、本発明は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片を提供し、それは、
（１）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３という３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、そのうち、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる場合、上記ＨＣＤＲ１は配列番号２１、２７、３３、３９に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２は配列番号２２、２８、３４、４０に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ３は配列番号２３、２９、３５、４１に示されるアミノ酸配列を含み、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けされる場合、上記ＨＣＤＲ１は配列番号４５、５１、５７、６３に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＨＣＤＲ２は配列番号４６、５２、５８、６４を含み、上記ＨＣＤＲ３は配列番号４７、５３、５９、６５を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（２）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３という３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、そのうち、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる場合、上記ＬＣＤＲ１は配列番号１８、２４、３０、３６、９３、９４、９５、９６に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ２は配列番号１９、２５、３１、３７に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ３は配列番号２０、２６、３２、３８に示されるアミノ酸配列を含み、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けされる場合、上記ＬＣＤＲ１は配列番号４２、４８、５４、６０に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ２は配列番号４３、４９、５５、６１に示されるアミノ酸配列を含み、上記ＬＣＤＲ３は配列番号４４、５０、５６、６２に示されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、
（１）配列番号がそれぞれ１８、１９、２０、２１、２２及び２３である配列、或いは
（２）配列番号がそれぞれ２４、２５、２６、２７、２８及び２９である配列、或いは
（３）配列番号がそれぞれ３０、３１、３２、３３、３４及び３５である配列、或いは
（４）配列番号がそれぞれ３６、３７、３８、３９、４０及び４１である配列、或いは
（５）配列番号がそれぞれ４２、４３、４４、４５、４６及び４７である配列、或いは
（６）配列番号がそれぞれ４８、４９、５０、５１、５２及び５３である配列、或いは
（７）配列番号がそれぞれ５４、５５、５６、５７、５８及び５９である配列、或いは
（８）配列番号がそれぞれ６０、６１、６２、６３、６４及び６５である配列、或いは
（９）配列番号がそれぞれ９３、３１、３２、３３、３４及び３５である配列、或いは
（１０）配列番号がそれぞれ９４、３１、３２、３３、３４及び３５である配列、或いは
（１１）配列番号がそれぞれ９５、３１、３２、３３、３４及び３５である配列、或いは
（１２）配列番号がそれぞれ９６、３１、３２、３３、３４及び３５である配列、或いは
（１３）上記（１）～（１２）に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するか、又は１個、２個、３個若しくはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換を有する配列の、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、
（１）配列番号１０、１１、１２、１３、６９、７０、７１、７２、８１、８２、８３、８４、８５、８７、１０１、１０２又は１０３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は／及び
（２）配列番号１４、１５、１６、１７、６６、６７、６８、７８、７９、８０、８６、８８、８９、９０、９１、９８、９９又は１００と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含む。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、
（１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（２）配列番号１１に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号１５に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（３）配列番号１２に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号１６に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号１７に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（５）配列番号６９に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（６）配列番号７０に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（７）配列番号７１所示重鎖可変領域を含み、及び、配列番号６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（８）配列番号７２に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号６６、６７又は６８に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（９）配列番号８１、８２、８３、８４又は８５に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号７８に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（１０）配列番号８１、８２、８３、８４又は８５に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号７９に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（１１）配列番号８１、８２、８３、８４又は８５に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号８０に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（１２）配列番号８７に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号８６、８８、８９、９０又は９１に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（１３）配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号９８、９９又は１００に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
（１４）配列番号１０２に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号９８、９９又は１００に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、
（１５）配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域を含み、及び、配列番号９８、９９又は１００に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域を含み、或いは
上記（１）～（１５）に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するか、又は最大２０個の変異を有する配列であり、上記変異は挿入、欠失及び／又は置換から選ばれてもよく、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は重鎖可変領域を含み、そのうち、上記重鎖可変領域は、配列番号１０に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＳ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｗ４７Ｙ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ又はＶ７１Ｒからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＳ３０Ｔ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｗ４７Ｙ及びＶ７１Ｒ変異を有し、
或いは、配列番号１１に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＴ２８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ又はＡ７６Ｓからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＴ２８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ及びＡ７６Ｓ変異を有し、
或いは、配列番号１２に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＩ２９Ｍ、Ｓ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｗ４７Ｙ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ又はＶ７１Ｒからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＳ３０Ｔ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＩ２９Ｍ、Ｓ３０Ｔ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＩ２９Ｍ、Ｓ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＩ２９Ｍ、Ｓ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｉ４８Ｍ、Ｖ６７Ｉ及びＶ７１Ｒ変異を有し、より好ましくは、少なくともＩ２９Ｍ、Ｓ３０Ｔ、Ｇ４４Ｋ、Ｗ４７Ｙ及びＶ７１Ｒ変異を有し、
或いは、配列番号１３に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＲ４４Ｇ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７５Ｌ又はＡ７６Ｓからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＲ７２Ｖ及びＴ７４Ｋ変異を有し、より好ましくは、少なくともＲ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７５Ｌ及びＡ７６Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＲ４４Ｇ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ、Ｓ７５Ｌ及びＡ７６Ｓ変異を有する。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は軽鎖可変領域を含み、そのうち、上記軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるＶＬと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＬ３７Ｑ、Ｐ４３Ｓ又はＬ４７Ｍからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＬ４７Ｍ変異を有し、より好ましくは、少なくともＬ３７Ｑ及びＬ４７Ｍ変異を有し、より好ましくは、少なくともＰ４３Ｓ及びＬ４７Ｍ変異を有し、
或いは、配列番号１５に示されるＶＬと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＮ３１Ｑ、Ｎ３１Ｔ、Ｎ３１Ｄ、Ｇ３２Ａ、Ｑ３８Ｈ又はＰ４３Ｓからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＱ３８Ｈ及びＰ４３Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＮ３１Ｑ、Ｑ３８Ｈ及びＰ４３Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＮ３１Ｔ、Ｑ３８Ｈ及びＰ４３Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＮ３１Ｄ、Ｑ３８Ｈ及びＰ４３Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＧ３２Ａ、Ｑ３８Ｈ及びＰ４３Ｓ変異を有し、
或いは、配列番号１６に示されるＶＬと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＬ３７Ｑ、Ｐ４３Ｓ又はＱ４５Ｋからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＬ３７Ｑ及びＱ４５Ｋ変異を有し、より好ましくは、少なくともＰ４３Ｓ変異を有し、
或いは、配列番号１７に示されるＶＬと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＡ４３Ｓ、Ｐ４３Ｓ又はＩ４８Ｖからなる群より選ばれる変異を有し、好ましくは、少なくともＡ４３Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ４３Ｓ及びＩ４８Ｖ変異を有し、より好ましくは、少なくともＰ４３Ｓ及びＩ４８Ｖ変異を有する。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、ヒト、サルＴＩＧＩＴタンパク質に特異的に結合し、好ましくは、ヒト、サルＴＩＧＩＴに結合するＫＤが１．００Ｅ－８Ｍよりも高い。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、マウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体である。
幾つかの実施例において、上記抗体若しくは抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、改変された抗体、単一特異性抗体、多重特異性分子（例えば二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、完全抗体、完全抗体の断片、裸抗体、結合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）又は単一ドメイン抗体から選ばれる。
別の態様において、本発明は、ＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片であって、配列番号１０７～１１９、１９８～２０４、２１１～２１６、２１９～２２５の何れか１項に記載のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、ナノ抗体若しくは抗原結合断片を提供する。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片の上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＩＭＧＴ番号付けシステムに従って決定され、例えば表２１から選ばれ、上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って決定され、例えば表２２、表２９から選ばれる。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は、配列番号１０７に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１２０～１２２又は配列番号１５９～１６１に示される配列を有し、
配列番号１０８に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１２３～１２５又は配列番号１６２～１６４に示される配列を有し、
配列番号１０９に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１２６～１２８又は配列番号１６５～１６７に示される配列を有し、
配列番号１１０に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１２９～１３１又は配列番号１６８～１７０に示される配列を有し、
配列番号１１１に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１３２～１３４、配列番号１７１～１７３に示される配列を有し、
配列番号１１２に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１３５～１３７又は配列番号１７４～１７６に示される配列を有し、
配列番号１１３に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１３８～１４０又は配列番号１７７～１７９に示される配列を有し、
配列番号１１４に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１４１～１４３又は配列番号１８０～１８２に示される配列を有し、
配列番号１１５に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１４４～１４６又は配列番号１８３～１８５に示される配列を有し、
配列番号１１６に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１４７～１４９又は配列番号１８６～１８８に示される配列を有し、
配列番号１１７に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１５０～１５２又は配列番号１８９～１９１に示される配列を有し、
配列番号１１８に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１５３～１５５又は配列番号１９２～１９４に示される配列を有し、
配列番号１１９に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ又はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１５６～１５８又は配列番号１９５～１９７に示される配列を有し、
配列番号１９８に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８～１７０に示される配列を有し、
配列番号１９９に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８、２０７及び１７０に示される配列を有し、
配列番号２００に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８、２０７及び２０８に示される配列を有し、
配列番号２０１に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８、２０７及び２０９に示される配列を有し、
配列番号２０２に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８、１６９及び２０８に示される配列を有し、
配列番号２０３、２０４に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＫａｂａｔ番号付けシステムに従って、配列番号１６８、２１０及び２０８に示される配列を有し、
配列番号２１１～２１５に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ番号付けシステムに従って、配列番号１４７～１４９に示される配列を有し、
配列番号２１６に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ番号付けシステムに従って、配列番号１４７、１４８及び２１８に示される配列を有し、
配列番号２１９～２２５に示されるＶＨのＨＣＤＲ１～３はＩＭＧＴ番号付けシステムに従って、配列番号１５６～１５８に示される配列を有する。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は、上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と少なくとも８０％の同一性を有するか、又は１個、２個、３個若しくはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失及び／又は置換を有するＣＤＲｓ配列を含み、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は、配列番号１０７～１１９、１９８～２０４、２１１～２１６、２１９～２２５の何れか１項に示されるＶＨ、若しくは、配列番号１０７～１１９、１９８～２０４、２１１～２１６、２１９～２２５の何れか１項に示されるＶＨと少なくとも８０％の同一性を有するか、又は最大２０個の変異を有する配列を含み、上記変異は挿入、欠失及び／又は置換から選ばれてもよく、好ましくは、上記置換は保存的アミノ酸の置換である。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は、配列番号１１０に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ、Ｎ５４Ｄ、Ｎ１０８Ｓ、Ｓ１１０Ａ、Ｇ５５Ａ又はＳ７５Ｔからなる群より選ばれる変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ及びＫ９８Ｅ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ及びＮ５４Ｄ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ、Ｎ５４Ｄ及びＮ１０８Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ、Ｎ５４Ｄ及びＳ１１０Ａ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ及びＮ１０８Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＡ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ、Ｇ５５Ａ及びＮ１０８Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ７５Ｔ、Ａ９７Ｖ、Ｋ９８Ｅ、Ｇ５５Ａ及びＮ１０８Ｓ変異を有する配列を含み、
或いは、配列番号１１６に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＳ３５Ｔ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ、Ｎ５０Ｔ、Ｌ７９Ｖ、Ｖ６１Ｓ、Ｄ６２Ｈ、Ｔ１２２Ｉ又はＭ１２３Ｑからなる群より選ばれる変異を有し、より好ましくは、少なくともＶ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ及びＮ５０Ｔ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｔ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ及びＮ５０Ｔ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｔ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ、Ｎ５０Ｔ及びＬ７９Ｖ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｔ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ、Ｎ５０Ｔ、Ｖ６１Ｓ及びＤ６２Ｈ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｔ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｆ、Ｎ５０Ｔ、Ｔ１２２Ｉ及びＭ１２３Ｑ変異を有する配列を含み、
或いは、配列番号１１９に示されるＶＨと比べて、自然な順序で番号付けされる場合、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｙ５９Ｉ、Ｄ７２Ｇ、Ｎ７３Ｄ、Ｙ７９Ｓ、Ｌ７８Ｖ又はＹ９４Ｆからなる群より選ばれる変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ及びＮ５０Ｔ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ及びＹ５８Ｋ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｄ７２Ｇ及びＮ７３Ｄ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｄ７２Ｇ、Ｎ７３Ｄ及びＹ７９Ｓ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｄ７２Ｇ、Ｎ７３Ｄ及びＬ７８Ｖ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｙ５９Ｉ、Ｄ７２Ｇ及びＮ７３Ｄ変異を有し、より好ましくは、少なくともＳ３５Ｇ、Ｖ３７Ｙ、Ｇ４４Ｄ、Ｌ４５Ｒ、Ｗ４７Ｌ、Ｎ５０Ｔ、Ｙ５８Ｋ、Ｄ７２Ｇ、Ｎ７３Ｄ及びＹ９４Ｆ変異を有する配列を含む。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は、（１）キメラナノ抗体又はその断片、（２）ヒト化ナノ抗体又はその断片、或いは（３）完全ヒトナノ抗体又はその断片である。
幾つかの実施例において、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片抗体は、重鎖定常領域を含むか又は含まず、選択的に、上記抗体重鎖定常領域はヒト、アルパカ、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジから選ばれてもよく、選択的に、上記抗体重鎖定常領域はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤから選ばれてもよく、上記ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選ばれてもよく、選択的に、上記重鎖定常領域はＦｃ領域、ＣＨ３領域又は完全重鎖定常領域から選ばれてもよく、好ましくは、上記重鎖定常領域はヒトＦｃ領域であり、好ましくは、上記ナノ抗体若しくは抗原結合断片は重鎖抗体である。
別の態様において、本発明に記載の抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片は、治療剤又はトレーサーに更に結合され、好ましくは、上記治療剤は薬物、毒素、放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ、上記トレーサーは放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選ばれる。
別の態様において、本発明は、上記抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、或いは上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片を含む多重特異性分子であって、好ましくは、上記多重特異性分子は二重特異性、三重特異性又は四重特異性であってもよく、より好ましくは、上記多重特異性分子は二価、四価又は六価であってもよい、多重特異性分子を提供する。
幾つかの実施例において、上記多重特異性分子は、タンデムｓｃＦｖ、二重機能抗体（Ｄｂ）、単鎖二重機能抗体（ｓｃＤｂ）、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）抗体、Ｆ（ａｂ’）２、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体、ノブイントゥホール（ＫｉＨ）抗体、ドックアンドロック（ＤＮＬ）抗体、化学架橋抗体、ヘテロポリマーナノ抗体又はヘテロ複合体抗体である。
別の態様において、本発明は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、上記細胞外抗原結合ドメインが上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片を含み、或いは上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
別の態様において、本発明は、上記キメラ抗原受容体を発現するか、又は上記キメラ抗原受容体をコードする核酸断片を含み、好ましくは、上記免疫エフェクター細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、ＮＫＴ細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＤＮＴ細胞（ｄｏｕｂｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）、単球、マクロファージ、樹状細胞又は肥満細胞から選ばれ、好ましくは、上記Ｔ細胞が細胞毒性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞から選ばれ、好ましくは、上記免疫エフェクター細胞が自己免疫エフェクター細胞又は同種異系免疫エフェクター細胞である、免疫エフェクター細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つの多重特異性分子、又は上記の何れか１つのキメラ抗原受容体をコードする、単離された核酸断片を提供する。
別の態様において、本発明は、上記核酸断片を含むベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を提供する。
別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、上記細胞が原核細胞又は真核細胞であり、例えば細菌（大腸菌）、真菌（酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）である、宿主細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、又は上記の何れか１つの多重特異性分子を製造する方法であって、上記宿主細胞の培養、及び上記細胞で発現する抗体若しくは分子の単離を含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、上記免疫エフェクター細胞を製造する方法であって、上記の何れか１つのＣＡＲをコードする核酸断片を上記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、選択的に、上記免疫エフェクター細胞による上記の何れか１つのＣＡＲの発現を開始することを更に含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つの多重特異性分子、上記免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、又は上記方法により製造された製品と、薬学的に許容されるベクターと、を含む、医薬組成物を提供する。
幾つかの実施例において、上記医薬組成物は、更なる治療剤を更に含み、好ましくは、上記更なる治療剤は抗腫瘍剤であり、より好ましくは、上記抗腫瘍剤はＰＤ－１軸結合拮抗薬である。
別の態様において、がん又は感染性疾患を治療するための薬物の製造における、本発明により開示された上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つの多重特異性分子、上記免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、上記方法により製造された製品、又は医薬組成物の用途であって、そのうち、上記がんが固形腫瘍及び血液腫瘍から選ばれ、好ましくは、上記腫瘍が白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、骨髄異形成症候群、前立腺がん、肝がん、結腸直腸がん、肛門がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腹部がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、精巣がん、尿路上皮がん、肺がん、黒色腫、非黒色腫皮膚がん、神経膠腫、腎臓がん、中皮腫、食道がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、肉腫、神経膠芽腫、胸腺がん、キノコ肉芽腫、メルケル細胞がん、高頻度マイクロサテライト不安定性がん及びＫＲＡＳ変異型腫瘍から選ばれる、用途を更に提供する。
幾つかの実施例において、上記薬物は更なる治療剤又は手術と組み合わせて使用され、そのうち、上記更なる治療剤又は上記手術は放射線療法、化学療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、サイトカイン、外科手術、免疫刺激性抗体、免疫調節薬、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン又は細胞免疫療法から選ばれる。
幾つかの実施例において、上記更なる治療剤は上記薬物の前若しくは後に投与されるか、又は上記薬物と同時に投与される。
幾つかの実施例において、上記薬物はＰＤ－１軸結合拮抗薬と組み合わせて使用される。
幾つかの実施例において、上記ＰＤ－１軸結合拮抗薬はＰＤ－１結合拮抗薬、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬及びＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－１結合拮抗薬は抗ＰＤ－１抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－１結合拮抗薬はＭＤＸ １１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＴ－０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０及びＢＧＢ－１０８からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬はＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ａｖｅｌｕｍａｂ）からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ２抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬はイムノアドヘシンである。
別の態様において、本発明は、がん又は感染性疾患を治療する方法であって、有効量の上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つの多重特異性分子、上記免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、上記方法により製造された製品、又は医薬組成物を、必要とする患者に投与することを含み、そのうち、上記がんが固形腫瘍及び血液腫瘍から選ばれ、好ましくは、上記腫瘍が白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、骨髄異形成症候群、前立腺がん、肝がん、結腸直腸がん、肛門がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腹部がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、精巣がん、尿路上皮がん、肺がん、黒色腫、非黒色腫皮膚がん、神経膠腫、腎臓がん、中皮腫、食道がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、肉腫、神経膠芽腫、胸腺がん、キノコ肉芽腫、メルケル細胞がん、高頻度マイクロサテライト不安定性がん及びＫＲＡＳ変異型腫瘍から選ばれる、方法を更に提供する。
幾つかの実施例において、上記方法は、有効量のＰＤ－１軸結合拮抗薬を、必要とする患者に投与することを更に含み、そのうち、上記ＰＤ－１軸結合拮抗薬はＰＤ－１結合拮抗薬、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬及びＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－１結合拮抗薬は抗ＰＤ－１抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－１結合拮抗薬はＭＤＸ １１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＴ－０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０及びＢＧＢ－１０８からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬はＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ及びＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ａｖｅｌｕｍａｂ）からなる群より選ばれ、好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ２抗体であり、より好ましくは、上記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬はイムノアドヘシンである。
別の態様において、本発明は、がん又は感染性疾患を予防又は治療するために使用される、上記の何れか１つの二重特異性抗体、上記の何れか１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つのＰＶＲＩＧに特異的に結合するナノ抗体若しくは抗原結合断片、上記の何れか１つの多重特異性分子、上記免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、上記方法により製造された製品、又は医薬組成物を更に提供し、そのうち、上記がんが固形腫瘍及び血液腫瘍から選ばれ、好ましくは、上記腫瘍が白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、骨髄異形成症候群、前立腺がん、肝がん、結腸直腸がん、肛門がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、腹部がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、頭頸部がん、甲状腺がん、精巣がん、尿路上皮がん、肺がん、黒色腫、非黒色腫皮膚がん、神経膠腫、腎臓がん、中皮腫、食道がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、肉腫、神経膠芽腫、胸腺がん、キノコ肉芽腫、メルケル細胞がん、高頻度マイクロサテライト不安定性がん及びＫＲＡＳ変異型腫瘍から選ばれる。
本発明の抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体は、腫瘍細胞を特異的に標的とし、腫瘍細胞株に対する殺傷作用を効果的に媒介することができ、優れた腫瘍阻害効果を奏すると同時に、良好な安全性を有する。
用語の定義及び説明
本発明で別途定義しない限り、本発明に関連する科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。
更に、本明細書で別途説明しない限り、本明細書における単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。より具体的には、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、明らかに別段の指示がない限り、単数形「１種」及び「このような」には複数の指示対象が含まれる。
本明細書における「含む」、「包含」及び「有する」という用語は、互換的に使用され、方法の網羅性を示すことを意図し、上記方法には、列挙された要素以外の要素が存在することを意味する。同時に、本明細書で「含む」、「包含」及び「有する」という記述が使用されており、「……からなる」という方法も提供されていることを理解されるべきである。例示的に、「Ａ及びＢを含む組成物」は、Ａ及びＢからなる組成物、並びにＡ及びＢに加えて他の成分を更に含む組成物が何れも、前述の「組成物」の範囲に含まれるという技術的解決手段と理解されるべきである。
「及び／又は」という用語は、本明細書で使用される場合、「及び」、「又は」並びに「属する用語によってリンクされる要素の全て又は任意の組み合わせ」の意味を含む。
「Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」、「ＴＩＧＩＴ」、「ＴＩＧＩＴ抗原」、「Ｖｓｔｍ３」及び「ＷＵＣＡＭ」という用語は互換的に使用され、そしてヒトＴｉｇｉｔ、ヒトＴｉｇｉｔのオルソログなどの様々な哺乳動物アイソタイプ、並びにＴｉｇｉｔ内の少なくとも１つのエピトープを含む類似体及びＴＩＧＩＴと共有する少なくとも１つのエピトープを有する類似体を含む。ＴＩＧＩＴ（例えばヒトＴＩＧＩＴ）のアミノ酸配列、及びそれをコードするヌクレオチド配列は当該分野で公知である。
本明細書における「ＰＶＲＩＧ」又は「ＰＶＲＩＧタンパク質」という用語は、任意選択的に、本明細書に記載されている既知又は野生型ＰＶＲＩＧ、並びに天然に生じる任意のスプライス変異体、アミノ酸変異体又はアイソフォーム、特にＰＶＲＩＧのＥＣＤ断片を含む（これらに限定されない）、任意のそのようなタンパク質又はその変異体、複合体又は断片を含んでもよい。ＰＶＲＩＧに結合すると共にＰＶＲＬ２による活性化（例えば、ＰＶＲＩＧとＰＶＬＲ２との相互作用をブロックすることによって、最も一般的である）を防止する「抗ＰＶＲＩＧ抗体」（抗原結合断片を含む）は、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞の活性化を強化すると共に、がん及び病原体感染などの疾患を治療するのに用いられる。
本明細書における「抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ抗体」、「二重特異性ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体」及び「抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体」という用語は、互換的に使用され、本発明の抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、ヒトＴＩＧＩＴ、好ましくはヒトＴＩＧＩＴのＥＣＤ、及びＰＶＲＩＧ、より好ましくはヒトＰＶＲＩＧのＥＣＤに特異的に結合する。
本明細書における「特異的に結合」という用語は、抗原結合分子（例えば抗体）が抗原及び実質的に同じ抗原に高親和性で特異的に結合するが、関連しない抗原に高親和性で結合しないことを意味する。親和性は一般的に、平衡解離常数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）によって反映され、そのうち、比較的低いＫＤは、比較的高い親和性を表す。抗体を例に取ると、高親和性は一般的に、約１×１０－７Ｍ又はそれ以下、約１×１０－８Ｍ又はそれ以下、約１×１０－９Ｍ又はそれ以下、約１×１０－１０Ｍ又はそれ以下、１×１０－１１Ｍ又はそれ以下或いは１×１０－１２Ｍ又はそれ以下のＫＤを有することを意味する。ＫＤの計算式はＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａであり、そのうち、Ｋｄは解離速度を表し、Ｋａは結合速度を表す。表面プラズモン共鳴（例えばＢｉａｃｏｒｅ）又は平衡透析法測定などの、当該分野で周知の方法を用いて平衡解離定数ＫＤを測定することができる。
本明細書における「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で使用され、抗原に特異的に結合する分子を指す。例示的に、抗原結合分子は、抗体又は抗体模倣物を含むが、これらに限定されない。「抗体模倣物」は、抗原に特異的に結合できるが、抗体構造に関係がない有機化合物又はドメインを指し、例示的に、抗体模倣物は、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｆｆｉｌｉｎ、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、核酸アプタマー又はＫｕｎｉｔｚ型ドメインペプチドを含むが、これらに限定されない。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、免疫グロブリン重鎖可変領域からの十分な配列及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域からの十分な配列を含むため、抗原に特異的に結合できるポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせを指す。本明細書における「抗体」は、所望の抗原結合活性を示す限り、様々な形態及び様々な構造をカバーする。本明細書における「抗体」は、移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）或いはＣＤＲ誘導体の代替タンパク質足場又は人工足場を有する。このような足場は、抗体により誘導された足場（抗体の三次元構造を安定させる変異などの導入を含む）を含み、並びに、生体適合性ポリマーなどの完全合成足場を含む。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、５３（１）：１２１－１２９（２００３）、Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４（２００４）を参照する。このような足場は、テネイシン、フィブロネクチン、ペプチドアプタマーなどを含むが、これらに限定されない当該分野で既知のＣＤＲ移植に使用可能な足場タンパク質などの、非抗体により誘導される足場を更に含んでもよい。
本明細書における「抗体」は、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）からなる免疫グロブリンに属する典型的な「４鎖抗体」を含む。そのうち、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向において、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン、重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなり、また、上記完全長抗体がＩｇＥアイソタイプである場合、任意選択的に、重鎖定常領域ＣＨ４ドメインを更に含むポリペプチド鎖を指し、軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向において、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるポリペプチド鎖を指し、重鎖と重鎖との間、重鎖と軽鎖との間はジスルフィド結合により連結され、「Ｙ」字形構造が形成される。免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸の組成及び配列順序が異なるため、その抗原性も異なる。これによって、本明細書における「免疫グロブリン」は、５つのクラス、即ちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとも呼ばれる免疫グロブリンのアイソタイプに分類することができ、その対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一クラスのＩｇは、そのヒンジ領域アミノ酸組成、重鎖ジスルフィド結合の数及び位置の違いにより、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けることができる。軽鎖は、定常領域の違いにより、κ鎖又はλ鎖に分ける。Ｉｇの５つのクラスにおけるそれぞれＩｇは、κ鎖又はλ鎖を有してもよい。
本明細書における「抗体」は、例えば、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、グアニコエ（Ｌａｍａ ｇｕａｎｉｃｏｅ）及びアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）などのラクダ科動物から生じた重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨＣＡｂｓ）及びサメなどの軟骨魚類で見つかった免疫グロブリンネオアンチゲン受容体（Ｉｇ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＩｇＮＡＲ）など、軽鎖を持たない抗体を更に含む。
本明細書で使用される場合、「重鎖抗体」という用語は、従来の抗体の軽鎖を欠いた抗体を指す。当該用語は、具体的には、ＣＨ１ドメインが存在しない場合、ＶＨ抗原結合ドメイン及びＣＨ２とＣＨ３恒定ドメインを含むホモ二量体抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ナノ抗体」という用語は、ラクダのインビボで軽鎖を欠いた天然の重鎖抗体が存在し、その可変領域をクローニングすると、ＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれる重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体が得られた、最小の機能的抗原結合断片を指す。
本明細書における「ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「単一ドメイン抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）という用語は同じ意味を持ち、互換的に使用され、重鎖抗体の可変領域をクローニングし、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築した、完全な機能を有する最小の抗原結合断片を指す。一般的に、まず軽鎖及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）を欠いた天然の重鎖抗体を取得した後、更に抗体重鎖の可変領域をクローニングし、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築する。
「重鎖抗体」及び「ナノ抗体」に関する更なる説明は、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ．１９９３、３６３、４４６－８、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの概説（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２、２００１）、並びに、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９、ＷＯ９６／３４１０３、ＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１、ＷＯ０２／４８１９３、ＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６、ＷＯ０３／０５５５２７、ＷＯ０３／０５０５３１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、ＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７及びＷＯ０６／１２２８２５といった一般的な背景技術として言及される上記特許出願、及びこれらの出願で言及される他の従来技術を参照することができる。
本明細書における「抗体」は、ヒトや非ヒト動物を含むがこれらに限定されない、任意の動物に由来してもよく、上記非ヒト動物は、霊長類動物、哺乳動物、齧歯動物及び脊椎動物、例えばラクダ科動物、グラマ、グアニコエ、アルパカ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット又は軟骨魚類（例えばサメ）から選ばれてもよい。
本明細書における「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、完全抗体、完全抗体の断片、裸抗体、結合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を含むが、これらに限定されない。
本明細書における「モノクローナル抗体」という用語は、基本的に均質な抗体集団から取得した抗体を指し、即ち、可能な変異体（例えば、天然に存在する変異を含むか、又は製剤の生産中に生じた、少量で存在する変異体）を除いて、上記集団を含む各抗体は同じであり、及び／又は、同じエピトープに結合する。一般的に異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤中の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。本明細書における「モノクローナル」という修飾語は、何らかの特定の方法による上記抗体又は抗原結合分子の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ方法、ファージライブラリーディスプレイ技術、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含む遺伝子組み換え動物を使用する方法、並びに当該分野で既知の他の方法を含む（がこれらに限定されない）、様々な技術によって製造することができる。
本明細書における「単一特異性」という用語は、１つ又は複数の結合部位を有することを指し、そのうち、各結合部位は、同じ抗原の同じエピトープと結合する。
本明細書における「多重特異性」という用語は、少なくとも２つの抗原結合部位を有することを指し、上記少なくとも２つの抗原結合部位の各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープと結合する。従って、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」などの用語は、抗体／抗原結合分子が結合できる異なるエピトープの数を指す。
本明細書における「価」という用語は、抗体／抗原結合分子における所定数の結合部位の存在を示す。従って、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、抗体／抗原結合分子中の１つの結合部位、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在をそれぞれ示す。
本明細書における「完全長抗体」、「無傷抗体」及び「完全抗体」は、本明細書において互換的に使用され、基本的に天然抗体の構造と類似する構造を有することを意味する。
本明細書における「抗原結合断片」及び「抗体断片」は、本明細書において互換的に使用され、完全抗体の全体構造を備えず、完全抗体の一部又は一部の変異体のみを含み、上記一部又は一部の変異体は抗原に結合する能力を有する。本明細書における「抗原結合断片」又は「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）及び単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。
完全抗体のパパイン消化により、重鎖及び軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）をそれぞれ含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。このようにして、本明細書における「Ｆａｂ断片」という用語は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、並びに重鎖のＶＨドメイン及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含み、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少量の残基が付加されるため、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片を生成する。
本明細書における「Ｆｄ」という用語は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる抗体を指す。本明細書における「Ｆｖ」という用語は、単一アームＶＬ及びＶＨドメインからなる抗体断片を指す。Ｆｖ断片は一般的に、完全な抗原結合部位を形成することができる最小の抗体断片であると考えられる。一般的には、６つのＣＤＲは抗体の抗原結合特異性を付与すると考えられる。しかし、１つの可変領域（例えばＦｄ断片、３つの抗原特異的ＣＤＲのみを含む）であっても、その親和性が完全な結合部位より低い可能性があるが、抗原を認識し、結合することができる。
本明細書における「ｓｃＦｖ」（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）という用語は、ＶＬ及びＶＨドメインを含む単一ポリペプチド鎖を指し、そのうち、上記ＶＬ及びＶＨはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９～３１５頁（１９９４）を参照）。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨといった一般的な構造を有することができる。適切な従来技術のリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーを使用してもよいが、その変異体（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８）を使用してもよい。本発明に使用できる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４－１０６、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６及びＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．に記載される。幾つかの場合において、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合が存在し、ジスルフィド結合によって連結されたＦｖ（ｄｓＦｖ）を形成してもよい。
本明細書における「二重抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」という用語は、そのＶＨ及びＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現されるが、短すぎるリンカーを使用することで同じ鎖の２つのドメイン間でペアリングできないため、ドメインが別の鎖の候補ドメインとペアリングして２つの抗原結合部位を生じる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）、及びＰｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照）。
本明細書における「裸抗体」という用語は、治療剤又はトレーサーと複合しない抗体を指し、「結合抗体」という用語は、治療剤又はトレーサーと複合する抗体を指し、好ましくは、上記治療剤は、薬物、毒素、放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ得、上記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選ばれる。
本明細書における「キメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、その軽鎖又は／及び重鎖の一部が１つの抗体に由来し（ある特定の種に由来するか、又はある特定の抗体クラス又はサブクラスに属してもよい）、且つ軽鎖又は／及び重鎖の別の部分が別の抗体に由来するが（同じ若しくは異なる種に由来するか、又は同じ若しくは異なる抗体クラス又はサブクラスに属してもよい）、何れの場合であっても、標的抗原に対する結合活性を維持する抗体を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ ４、８１６、５６７ ｔｏ Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１ ６８５５（１９８４））。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が第１抗体（例えばマウス抗体）に由来するが、抗体の重鎖及び軽鎖定常領域が第２抗体（例えばヒト抗体）に由来する抗体（例えばヒトマウスキメラ抗体）を含んでもよい。
本明細書における「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体との配列相同性を高めるためにアミノ酸配列が修飾された、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。一般的に言えば、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部又は一部は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域の全部又は一部（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は通常、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞活性を増強する能力、免疫応答を増強する能力などを含むが、これらに限定されないドナー抗体の予想される特性を保持するか、又は部分的に保持する。
本明細書における「完全ヒト抗体」という用語は、ＦＲ及びＣＤＲの両方がヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。更に、抗体が定常領域を含む場合、その定常領域もヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する。本明細書における完全ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位の特異的変異によって誘発されるか、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでもよい。しかし、本明細書における「完全ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まない。
本明細書における「可変領域」という用語は、抗体を抗原に結合させる領域に関する抗体の重鎖又は軽鎖の領域を指し、「重鎖可変領域」は「ＶＨ」、「ＨＣＶＲ」と互換的に使用され、「軽鎖可変領域」は「ＶＬ」、「ＬＣＶＲ」と互換的に使用される。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬである）は一般的には、類似する構造を有し、それぞれのドメインは４つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ｐ．９１（２００７）を参照する。単一ＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分である。本明細書における「相補性決定領域」及び「ＣＤＲ」という用語は互換的に使用され、一般的には、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）の超可変領域（ＨＶＲ）を指し、当該部位は、その空間構造により抗原エピトープと精密な相補を形成することができるため、相補性決定領域とも呼ばれ、そのうち、重鎖可変領域ＣＤＲはＨＣＤＲと略記され、軽鎖可変領域ＣＤＲはＬＣＤＲと略記される。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」という用語は互換的に使用され、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域におけるＣＤＲ以外のアミノ酸残基を指す。一般的には、典型的な抗体可変領域は、４つのＦＲ領域及び３つのＣＤＲ領域がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で構成される。
ＣＤＲに対する更なる説明は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、アメリカ衛生及び公共サービス部門、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ 」（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３：９２７－９４８（１９９７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ及びＭａｒｔｉｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４５：３８３２－３８３９（２００８）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：５５－７７（２００３）、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３０９：６５７－６７０（２００１）を参照する。本明細書における「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム又はＩＭＧＴ番号付けシステムを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の方法によって記され、定義することができ、使用されるツールサイトは、ＡｂＲＳＡサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃａｏ．ｌａｂｓｈａｒｅ．ｃｎ／ＡｂＲＳＡ／ｃｄｒｓ．ｐｈｐ）、ａｂＹｓｉｓサイト（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）及びＩＭＧＴサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ＃ｒｅｓｕｌｔｓ）を含むが、これらに限定されない。本明細書におけるＣＤＲは、異なる方法で定義されるアミノ酸残基の重複（ｏｖｅｒｌａｐ）及びサブセットを含む。
本明細書における「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」という用語は、一般的には、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔによって提案された免疫グロブリンアラインメント及び番号付けシステムを指す（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１を参照）。
本明細書における「ＩＭＧＴ番号付けシステム」という用語は、一般的には、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．によって開始される国際免疫遺伝学情報システム（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ））に基づく番号付けシステムを指し、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７、２００３を参照することができる。
本明細書における「重鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などのエフェクター機能を示す、抗体重鎖のカルボキシ末端部分を指し、抗体の可変ドメインと比較して、より保存的アミノ酸配列を持っていることを意味する。「重鎖定常領域」は、少なくともＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はそれらの変異体若しくは断片を含む。「重鎖定常領域」には「全長重鎖定常領域」と「重鎖定常領域断片」が含まれ、前者は天然抗体定常領域と基本的に類似した構造を有し、後者は「全長重鎖定常領域の一部」のみを含む。例示的に、典型的な「完全長抗体重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン－ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインからなり、抗体がＩｇＥである場合、またＣＨ４ドメインも含み、抗体が重鎖抗体である場合、ＣＨ１ドメインは含まない。例示的に、典型的な「重鎖定常領域断片」は、ＣＨ１、Ｆｃ、又はＣＨ３ドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「軽鎖定常領域」という用語は、抗体と抗原の結合に直接関与しない、抗体軽鎖のカルボキシ末端部分を指し、上記軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定数λドメインから選ばれてもよい。
本明細書における「Ｆｃ」という用語は、完全な抗体のパパイン加水分解によって得られる抗体のカルボキシ末端部分を指し、典型的には抗体のＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む。Ｆｃ領域は、例えば天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変化することができるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６でのアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシ末端まで延びるように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｋａｂａｔ番号付けシステムの残基４４７に基づくもの）は、例えば抗体の生産又は精製期間、又は抗体重鎖をコードする核酸に対して組換え操作を行うことによって除去することができるから、Ｆｃ領域はＬｙｓ４４７を含んでも含まなくてもよい。
本明細書における「保存的アミノ酸」という用語は、一般に同じクラスに属するアミノ酸、又は類似する特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性、親水性、主鎖の配座や剛性など）を有するアミノ酸を指す。例示的に、以下の各グループ内のアミノ酸は互いの保存的アミノ酸残基に属し、グループ内のアミノ酸残基の置換は保存的アミノ酸置換に属する。
例示的に、以下の６つのグループは互いに保存的置換されているアミノ酸の実例と考えられる。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
本明細書における「同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の「同一性」百分率を決定するために、最適な比較を目的として上記配列をアライメントすることによって、計算して得ることができる（例えば、最適なアライメントのために、第１と第２アミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入するか、又は比較を目的として非相同配列を破棄してもよい）。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置でのアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１配列内の位置が、第２配列内の対応する位置での同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められる場合、上記分子はこの位置で同一である。
２つの配列を最適にアライメントするために、導入を必要とするギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、２つの配列間の同一性百分率は、上記配列が共有する同一の位置によって変化される。
数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列間の配列比較及び同一性百分率の計算を行うことができる。例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージＧＡＰプログラムに統合されたＮｅｅｄｌｅｍａ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入て可能）により、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性百分率を決定する。別の例として、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）により、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重み４０、５０、６０、７０又は８０及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、２つのヌクレオチド配列間の同一性百分率を決定する。特に好ましいパラメータセット（別途説明しない限り、使用する必要があるパラメータセット）は、ギャップペナルティポイント１２、ギャップ延長ペナルティポイント４及び移符号化ギャップペナルティポイント５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２のスコアマトリックスである。
また、ＰＡＭ１２０重み付け余数テーブル、ギャップ長さペナルティポイント１２、ギャップペナルティポイント４を使用し、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１－１７）により、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間の同一性百分率を決定することもできる。
追加的又は代替的に、例えば、他のファミリーメンバー配列又は関連する配列を同定するために、共通のデータベースに対する検索を実行するための「クエリ配列」として本発明に記載される核酸配列及びタンパク質配列を更に使用することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して、このような検索を実行することができる。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を取得するために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長さ＝１２を使用して実行することができる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を取得するために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を使用して実行することができる。比較を目的としてギャップを有するアライメント結果を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されるように、ギャップＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照する。
本明細書における「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現するように操作され、抗原に特異的に結合する人工細胞表面受容体を指し、少なくとも（１）抗体の可変重鎖又は軽鎖などの細胞外抗原結合ドメイン、（２）ＣＡＲを免疫エフェクター細胞にアンカリングする膜貫通ドメイン、及び（３）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを使用して、ＭＨＣ非制限様式で、Ｔ細胞及び他の免疫エフェクター細胞を癌細胞などの選択された標的にリダイレクトすることができる。
本明細書における「免疫刺激性抗体」という用語は、１）抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ（イピリムマブ、トレメリムマブなど）、抗ＰＤ－１（ニボルマブＢＭＳ－９３６５５８／ＭＤＸ－１１０６／ＯＮＯ－４５３８、ＣＴ－０１１、ｌａｍｂｒｏｚｉｌｕｍａｂ ＭＫ－３４７５、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ－１０８）、抗ＰＤＬ－１拮抗薬（ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ－７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０）、抗ＬＡＧ－３（ＩＭＰ－３２１など）、抗ＴＩＭ－３、抗ＢＴＬＡ、抗Ｂ７－Ｈ４、抗Ｂ７－Ｈ３、抗ＶＩＳＴＡを含む阻害性免疫チェックポイントを標的とするアンタゴニスト抗体と、２）抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ＣＰ－８７０、８９３、ルカツムマブ、ダシズマブなど）、抗ＣＤ１３７ｍＡｂ（ＢＭＳ－６６３５１３ウレルマブ、ＰＦ－０５０８２５６６）、抗ＯＸ４０ｍＡｂ（抗ＯＸ４０など）、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＴＲＸ５１８など）、抗ＣＤ２７ｍＡｂ（ＣＤＸ－１１２７など）及び抗ＩＣＯＳ ｍＡｂを含む免疫刺激性タンパク質を増強するアゴニスト抗体と、を含む。「免疫刺激性抗体」は、免疫機能を直接調節することによって、即ち他の阻害標的をブロックするか又は免疫刺激性タンパク質を増強することによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。
本明細書における「免疫調節薬」という用語は、例えばチモシンα１であってもよい。原理：チモシンα１（Ｔα１）は天然に生成されたチモペプチドであり、先天性及び適応性免疫系の内因性調節因子として作用する。これは、Ｂ型及びＣ型肝炎などのウィルス感染症、特定のがんを含む免疫機能不全に関連する疾患の治療やワクチンの強化のために、世界中で使用されている。特に、免疫調節研究の最近の進歩は、敗血症患者におけるＴａ１処理の有益な作用を示している（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．『危急ケア』２０１３、１７：Ｒ８）。
本明細書における「核酸」という用語には、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質が含まれる。各ヌクレオチドは塩基、特にプリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ち、デオキシリボース又はリボース）及びリン酸基で構成される。一般的には、核酸分子は塩基の配列によって表され、それにより上記塩基は核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は一般的には、５′～３′で表される。本明細書において、核酸分子という用語は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡなどを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、並びに２種類以上のこれらの分子を混合したポリマーをカバーする。核酸分子は、直鎖状または環状であってもよい。更に、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに一本鎖及び二本鎖形態の両方を含む。そして、本明細書に記載の核酸分子は、天然に存在するか、又は天然に存在しないヌクレオチドを含んでもよい。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導された糖又はリン酸骨格結合又は化学的修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が含まれる。核酸分子は、インビトロ及び／又はインビボ、例えば宿主又は患者において、本発明の抗体を直接発現させるためのベクターとして好適なＤＮＡ及びＲＮＡ分子を更にカバーする。このようなＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されなくてもよく、修飾されてもよい。例えば、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされる分子の発現を強化するために、ｍＲＮＡを化学的に修飾し、それにより、インビボで抗体を生成するためにｍＲＮＡを対象に注入することができる（例えばＳｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１７年６月１２日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１を参照）。本明細書における「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、一般的に当該核酸分子を含有するが、当該核酸分子が染色体外に存在するか、又はその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する細胞に含有される核酸分子を含む。
本明細書における「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を増幅することができる核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び当該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらに作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書における「宿主細胞」という用語は、細胞に外来性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫が含まれる。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、継代の回数を考慮せず、初代の形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸内容物が完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。本明細書において、初期形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能或いは生物学的活性を有する変異体の子孫を含む。
本明細書における「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性を可能にする有効な形態で存在し、上記医薬組成物が投与される対象に対する許容できない毒性を有する更なる成分を含まない製剤を指す。
本明細書における「治療」という用語は、がんの進行などの、対象における望ましくない生理的変化又は病変を予防、緩和（低減）することを目的とする、外科手術又は薬物処置（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指す。有益又は望ましい臨床結果には、症状の軽減、疾患程度の低下、安定した疾患状態（即ち、悪化しないこと）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的寛解でも全体的寛解でも）を含むが、これらに限定されず、検出可能か検出不能かを問わない。治療を必要とする対象には、すでに病症又は疾患を患っている対象、及び病症又は疾患を患いやすい対象、或いは病症又は疾患を予防すべき対象が含まれる。減速、軽減、低下、緩和、寛解などの用語に言及する場合、解消、消失、非発生などの状況も意味として含まれる。
本明細書における「対象」という用語は、本発明に記載される特定の疾患又は病状の治療を受ける生体を指す。対象及び患者の例は、ヒト、霊長類動物（例えばサル）又は非霊長類哺乳動物などの、疾患又は病状の治療を受ける哺乳動物を含む。
本明細書における「有効量」という用語は、細胞、組織又は対象に単独で、又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合に、疾患の病症又は当該疾患の進行を予防又は寛解するのに有効な治療剤の量を指す。「有効量」はまた、症状を寛解する、例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、防止若しくは寛解する、又はそのような状態の速度増加を治療、治癒、防止若しくは寛解するのに十分な化合物の量を指す。活性成分を単独で個体に投与する場合、治療有効用量とは当該成分の量だけである。組み合わせが使用される場合、治療有効用量とは、組み合わせ投与、連続投与又は同時投与に関係なく、治療効果を生じさせる活性成分の組み合わせ用量を指す。
本明細書における「がん」という用語は、典型的に無調節細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記述する。この定義には、良性及び悪性のがんが含まれる。本明細書における「腫瘍」又は「瘍」という用語は、悪性か良性かを問わず、全ての新生物（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん性（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及びがん性細胞と組織を指す。「がん」及び「腫瘍」という用語は、本明細書において言及される場合、互いに排他的ではない。
本明細書における「ＥＣ５０」という用語は、指定された曝露時間後にベースラインと最大値との間の途中応答を誘導する抗体濃度を含む、半最大有効濃度を指す。ＥＣ５０は、本質的に、最大作用が観察される抗体濃度の５０％を表し、当該分野で既知の方によって測定することができる。
本明細書における「Ｇ４Ｓリンカーペプチド」という用語は、複数のタンパク質を連結して融合タンパク質を形成するために使用される、グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）とのＧＳ組み合わせを指す。よく使用されるＧＳ組み合わせは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎの大きさを変えることでリンカー配列の長さを変える。同時に、グリシン及びセリンは、他の組み合わせを通じて異なるリンカー配列を生成することもでき、例えば、本発明で使用される（Ｇ４Ｓ）４ Ｌｉｎｋｅｒは、ＧＳ組み合わせがＧＧＧＧＳである。
ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 カニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ高発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ中程度発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ低発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の結合活性を示す。 抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体のＢｉｏ－ＣＤ１５５－ＨｉｓとＣＨＯ－Ｋ１ ＴＩＧＩＴとの相互作用をブロックする効果を示す。 抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体のＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５との相互作用をブロックする効果を示す。 異なる供与体（ｄｏｎｏｒ－０１０及びｄｏｎｏｒ－０５０）に由来するＮＫ細胞表面ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ並びに腫瘍細胞株ＷＩＤＲ細胞表面ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現レベルの、ＦＡＣＳによる検出である。Ａは、黒色中空ピーク図はＮＫ細胞表面ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴの発現であり、灰色中実ピーク図は２つの検出抗体に対応するアイソタイプ対照である。Ｂは、黒色中空ピーク図はＷＩＤＲ細胞表面ＰＶＲ／ＰＶＲＬ２の発現であり、灰色中実ピーク図は２つの検出抗体に対応するアイソタイプ対照である。 ＮＫ細胞脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）作用に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体とＷＩＤＲ細胞及びＮＫ細胞の共インキュベーションの影響を示す。横座標は試験抗体濃度、縦座標はＣＤ１０７ａの陽性細胞の割合である。そのうち、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体、ａｎｔｉ－ＨＥＬ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＷＩＤＲ標的細胞へのＮＫ細胞の殺傷作用に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の影響を示す。横座標は試験抗体の濃度、縦座標は標的細胞の死亡率であり、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体、ａｎｔｉ－ＨＥＬ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞機能活性に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト－マウスキメラ抗体の影響の、ＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。Ａは、ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒ １２８ ＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）によって１１日誘導された後のＰＢＭＣにおけるＣＤ８Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合及びＦＭＯ対照であり、Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１の発現であり、Ｃは、Ｃｏｌｏ２０５におけるＰＶＲＬ２及びＰＶＲの発現であり、Ｄは、１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。陽性対照はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）、棒グラフ上の百分率はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比較した試験抗体のＩＦＮ－γ分泌の上昇の百分率である。 ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 カニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ高発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ中程度発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ低発現株細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 ＣＨＯ－Ｋ１ カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体のＢｉｏ－ＣＤ１５５－ＨｉｓとＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴとの相互作用をブロックする効果を示す。 抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体のＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５との相互作用をブロックする効果を示す。 抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体のＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１１２との相互作用をブロックする効果を示す。 人ＰＢＭＣに対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の結合活性を示す。 ＷＩＤＲ標的細胞へのＮＫ細胞の殺傷作用に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の影響を示す。図において、横座標は試験抗体の濃度、縦座標は標的細胞の死亡率であり、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００５、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００６及びＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－０７０はヒト化前のキメラ抗体であり、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞機能活性に対する抗ＴＩＧＩＴのヒト化抗体の影響の、ＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。Ａは、ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒ ６２２ ＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）によって１１日誘導された後のＰＢＭＣにおけるＣＤ８ Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合、ＦＭＯ対照であり、Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＤ２２６の発現であり、Ｃは、１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。陽性対照はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）である。棒グラフ上の百分率はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比較した試験抗体のＩＦＮ－γ分泌の上昇の百分率である。 ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞株ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴのＦＡＣＳによる検出である。 ヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質に対するＰＶＲＩＧ試験抗体の結合能力である。図において、ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ３５、Ａ４３、Ａ５０、Ａ６０、Ａ７５、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の結合能力を示す。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は当該実験の陽性対照であり、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 カニクイザルＰＶＲＩＧ組換えタンパク質に対するＰＶＲＩＧ試験抗体の結合能力である。図において、カニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ３５、Ａ４３、Ａ５０、Ａ６０、Ａ７５、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の結合能力を示す。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は当該実験の陽性対照であり、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 Ｆｌｐｉｎ ＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧ試験抗体の結合活性である。図において、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ３５、Ａ４３、Ａ５０、Ａ６０、Ａ７５、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の結合能力を示す。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞表面カニクイザルＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧ試験抗体の結合活性である。図において、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞表面カニクイザルＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ５０、Ａ６０、Ａ１０５、Ａ１１７、Ａ１１８の結合能力を示す。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＰＶＲＩＧ試験抗体によるヒトＰＶＲＩＧとヒトＰＶＲＬ２組換えタンパク質との間の相互作用のブロックである。図において、試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ３５、Ａ４３、Ａ５０、Ａ６０、Ａ７５、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の、ＰＶＲＬ２へのＰＶＲＩＧの結合をブロックする作用を示し、そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は当該実験の陽性対照であり、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 ＰＶＲＩＧ試験抗体によるＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞のヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質への結合のブロックである。図において、試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ３５、Ａ４３、Ａ５０、Ａ６０、Ａ７５、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞がヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に結合する競合能力を示す。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 腫瘍細胞株Ｒｅｈ細胞表面ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２発現レベルである。図において、黒色中空ピーク図はＲｅｈ細胞表面ＰＶＲ／ＰＶＲＬ２の発現であり、灰色中実ピーク図は検出抗体に対応するアイソタイプ対照である。 ＮＫ細胞脱顆粒作用に対するＰＶＲＩＧ試験抗体の影響である。図Ａは、ＮＫ細胞（ｄｏｎｏｒ－０１０）及び標的細胞Ｒｅｈをインキュベートする時、ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現に対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０の影響であり、図Ｂは、ＮＫ（ｄｏｎｏｒ－０１０）及び標的細胞ＷＩＤＲをインキュベートする時、ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現に対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ６０、Ａ７５、Ａ４３、Ａ３５の影響であり、図Ｃは、ＮＫ細胞（ｄｏｎｏｒ－０５０）及び標的細胞ＷＩＤＲをインキュベートする時、ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現に対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１８、Ａ１１３、Ａ１１７の影響であり、横座標は試験抗体の濃度、縦座標はＣＤ１０７ａの強陽性細胞の割合であり、そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＮＫ細胞の標的細胞への殺傷作用に対するＰＶＲＩＧ試験抗体の影響である。図Ａは、濃度が６．８７ｎＭの場合、ＮＫ細胞（ｄｏｎｏｒ－０１０）が標的細胞ＷＩＤＲを殺傷する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０の促進作用である。各試験抗体は、陰性アイソタイプ対照ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１と比べて、統計学的差異を有し（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、図Ｂは、異なる濃度で、ＮＫ細胞（ｄｏｎｏｒ－０１０）が標的細胞ＷＩＤＲを殺傷する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０の促進作用であり、図Ｃは、異なる濃度で、ＮＫ細胞（ｄｏｎｏｒ－０５０）が標的細胞ＷＩＤＲを殺傷する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ６０、Ａ７５、Ａ３５、Ａ４３、Ａ１０４、Ａ１０５、Ａ１１３、Ａ１１７、Ａ１１８の促進作用である。図Ｂ及びＣの横座標は試験抗体の濃度、縦座標は標的細胞の死亡率であり、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＰＶＲＩＧ抗体の機能改善作用の、ＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。図Ａは、ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒ ０２１ ＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）により１１日誘導された後のＰＢＭＣにおけるＣＤ８の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８の割合であり、図Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８（ｄｏｎｏｒ ０２１）におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、ＣＤ２２６の発現であり、図Ｃは、ｃｏｌｏ２０５におけるＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＨＬＡ－Ａ２の発現である。図Ｄは、１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。この実験系における陽性対照はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４、ＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）であり、抗体が作用する最終濃度は何れも７０ｎＭである。ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比べて、抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１５、Ａ３０、Ａ６０、７５、１０５、１１７及び１１８の作用後、細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌が顕著に増加する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。 ヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の結合能力である。図において、それぞれヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８の結合活性であり、そのうち、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 カニクイザルＰＶＲＩＧ組換えタンパク質に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の結合能力である。図において、それぞれカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８の結合活性であり、そのうち、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の結合活性である。図において、それぞれＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧに対する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８の結合能力である。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞表面カニクイザルＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の結合である。図において、それぞれＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞表面カニクイザルＰＶＲＩＧに対する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８の結合能力である。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ヒトＰＶＲＬ２に対するヒトＰＶＲＩＧの結合へのＰＶＲＩＧヒト化抗体によるブロックである。図において、それぞれヒトＰＶＲＩＧタンパク質及びヒトＰＶＲＬ２タンパク質に結合する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８のブロック作用であり、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は当該実験の陰性対照である。 ヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に対するＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞の結合へのＰＶＲＩＧヒト化抗体によるブロックである。図において、それぞれ試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５、Ａ１１８の、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞がヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に結合する競合能力である。そのうち、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体であり、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＮＫ細胞への殺傷作用に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の影響である。異なる濃度で、ＮＫ（ｄｏｎｏｒ－０５０）が標的細胞ＷＩＤＲを殺傷する試験ヒト化分子及びその対照ｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０（Ａ）、Ａ１１８（Ｂ）、Ａ１０５（Ｃ）の促進作用である。図において、横座標は試験抗体の濃度、縦座標は標的細胞の死亡率であり、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１は陽性対照抗体、ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１は陰性アイソタイプ対照抗体である。 ＰＶＲＩＧヒト化抗体が抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の機能を改善する作用に対するＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。この実験系における陽性対照はヒト化前のＰＶＲＩＧ ｐａｒｅｎｔａｌ抗体、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）であり、抗体が作用する最終濃度は何れも７０ｎＭである。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ｖｓ．ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓである。ＰＶＲＩＧ－Ａ５０の４つのヒト化抗体（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ａ、Ｈ１ｂ、Ｈ１ｄ、Ｈ２ａ）の作用効果はＰＶＲＩＧ－Ａ５０と比べて有意差がなく（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８の２つのヒト化抗体（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ３、Ｈ５）はＰＶＲＩＧ－Ａ１１８と有意差がなく、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ２の作用効果はＰＶＲＩＧ－Ａ１０５より顕著に低く（＊ｐ＜０．０５、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、残りの２つのヒト化抗体（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１、Ｈ３）はＰＶＲＩＧ－Ａ１０５と有意差がない（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。 ４つのヒト化二重特異性抗体の組成及び構成図である。 ヒトＰＶＲＩＧ－ＥＣＤ－ｍＦｃタンパク質に対する４つのヒト化二重抗体の結合へのＥＬＩＳＡによる検出である。 カニクイザルＰＶＲＩＧ－ＥＣＤ－ｍＦｃタンパク質に対する４つのヒト化二重抗体の結合へのＥＬＩＳＡによる検出である。 ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ｍＦｃタンパク質に対する４つのヒト化二重抗体の結合へのＥＬＩＳＡによる検出である。 カニクイザルＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ｍＦｃタンパク質に対する４つのヒト化二重抗体の結合へのＥＬＩＳＡによる検出である。 ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ヒトＰＶＲＩＧ細胞に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＦｌｐｉｎＣＨＯ－カニクイザルＰＶＲＩＧ細胞に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ高発現細胞株に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ中程度発現細胞株に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ低発現細胞株に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞株に対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ４つのヒト化二重抗体が、ＰＶＲＬ２タンパク質に対するＰＶＲＩＧタンパク質の結合をブロックすることに対するＨＴＲＦによる検出である。 ４つのヒト化二重抗体が、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２に対するＰＶＲＩＧ－ＥＣＤ－ｍＦｃの結合活性をブロックすることに対するＦＡＣＳによる検出である。 ４つのヒト化二重抗体が、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５に対するＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ｍＦｃの結合活性をブロックすることに対するＥＬＩＳＡによる検出である。 ４つのヒト化二重抗体が、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴに対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓタンパク質の結合活性をブロックすることに対するＦＡＣＳによる検出である。 ヒトＰＢＭＣに対する４つのヒト化二重抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出である。 ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴに対するヒト化二重特異性抗体の共結合へのＢＩＡｃｏｒｅによる検出である。ヒトＴＩＧＩＴタンパク質、ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対するＬＣ－ＢｓＡｂ－００２ヒト化二重抗体（Ａ）及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６ヒト化二重抗体（Ｂ）の結合曲線、並びにヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＰＶＲＩＧタンパク質をそれぞれ連続注射した抗体抗原結合曲線であり、黒三角印は対応するタンパク質の注射時点を表す。 ＮＫ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の機能促進作用へのＮＫ細胞脱顆粒実験による検出である。ＮＫ細胞脱顆粒実験プロトコル（Ａ）、ＮＫ細胞ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ及びＷＩＤＲ細胞ＰＶＲ、ＰＶＲＬ２の発現レベルへのＦＡＣＳによる検出（Ｂ）、ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現レベルに対するヒト化二重特異性抗体ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の影響（ＥＣ５０、ＡＵＣ、標的細胞ＷＩＤＲ、Ｃ）、ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現レベルに対するヒト化二重特異性抗体ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２の影響（標的細胞ＴＦ－１、Ｄ）。 ＷＩＤＲ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体媒介性ＮＫ細胞の殺傷作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出である。異なる供与体（Ｄｏｎｏｒ－０５０、８３１、７１５）ＮＫ細胞ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴの発現レベル（Ａ）、標的細胞ＷＩＤＲにおけるＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現レベル（Ｂ）、ＮＫ細胞毒性実験プロトコル（Ｃ）、３つの異なる供与体ＮＫ細胞媒介性ＷＩＤＲ細胞へのＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の殺傷（ＥＣ５０、ＡＵＣ、Ｄ）、ＮＫ細胞媒介性ＴＦ－１細胞へのＬＣ－ＢｓＡｂ－００２の殺傷（Ｅ） 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体により媒介された、ヒトＴｒｅｇ細胞に対する直接殺傷作用へのＮＫ細胞ＡＤＣＣ実験による検出である。ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ殺傷実験プロトコル（Ａ）、ヒトＴｒｅｇ細胞ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴの発現レベル（Ｂ）、ヒトＴｒｅｇへの異なるＩｇＧ ＦｃのＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６のＡＤＣＣ殺傷の比較（ＥＣ５０、ＡＵＣ、Ｃ） 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体により媒介された、ヒトＴｒｅｇ細胞に対するＡＤＣＰ活性である。 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の機能促進作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。ＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ実験プロトコル（Ａ）、ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現レベル及びＩＦＮ－γ前処理後のＣｏｌｏ２０５細胞ＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の発現レベル（Ｂ）、１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。この実験系における対照は、抗ＴＩＧＩＴ抗体であるＲＧ６０５８、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、抗ＰＶＲＩＧ抗体であるＣＯＭ７０１、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂであり、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）（Ｃ）であり、ヒト化二重抗体、単剤併用及びそのそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用した１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。この実験系における対照は、抗ＴＩＧＩＴ抗体であるＲＧ６０５８、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、抗ＰＶＲＩＧ抗体であるＣＯＭ７０１、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体であるＴｅｃｅｎｔｒｉｑであり、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（如何なる薬物による処理せず）（Ｄ）である。 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとの併用後の抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する機能促進作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出である。ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞ＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現レベル、並びにＩＦＮ－γ前処理後のＣｏｌｏ２０５細胞ＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の発現レベル（Ａ）、ヒト化二重抗体、単剤及びそのそれぞれ抗ＰＤ－Ｌ１抗体と併用した１８時間のプレート共インキュベーション後の細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌レベルである。この実験系における対照は、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＲＧ６０５８、抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＯＭ７０１、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（Ｂ）である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける各試験群の腫瘍成長曲線である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける各試験群の単一マウスの腫瘍成長曲線である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける各試験群の投与後のマウスの体重変化状況である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける異なる用量の二重特異性抗体単剤及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑと併用した各試験群の腫瘍成長曲線である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける異なる用量の二重特異性抗体単剤及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑと併用した各試験群の単一マウスの腫瘍成長曲線である。 Ａ３７５ ｈＰＢＭＣヒト化動物モデルにおける異なる用量の二重特異性抗体単剤及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑと併用した各試験群の投与後のマウス体重変化状況である。
以下、具体的な実施例を参照しながら本発明を更に説明するが、本発明の利点及び特徴は説明と共により明らかになるであろう。実施例において具体的な条件が明記されていない場合、一般的な条件又はメーカーが推奨する条件を用いる。使用される試薬又は機器は、生産メーカーが明記されていない場合、何れも市販されている一般的な製品であってもよい。
本発明の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術案の詳細と形態を修正又は置換することができるが、これらの修正及び置換はすべて本発明の保護範囲内にあることを当業者は理解すべきである。
実施例１ ＴＩＧＩＴ抗原の製造
ヒトＴＩＧＩＴタンパク質（ＮＣＢＩ配列番号：ＸＰ＿０２４３０９１５６．１）、カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質（ＮＣＢＩ：ＸＰ＿０１５３００９１１．１）を本開示のＴＩＧＩＴのテンプレートとして、本開示に関する抗原及び検出用タンパク質のアミノ酸配列を設計し、選択的にＴＩＧＩＴタンパク質に基づいて異なるタグを融合し、ＰＴＴ５ベクター上（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にそれぞれクローニングし、２９３細胞での一過性発現又はＣＨＯ細胞での安定発現により精製され、本開示をコードする抗原及び検出用タンパク質を取得した。
実施例２ ＣＨＯ－Ｋ１操作された細胞株の構築
ヒトＴＩＧＩＴ全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＸＰ＿０２４３０９１５６．１）、カニクイザルＴＩＧＩＴ全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＸＰ＿０１５３００９１１．１）、ヒトＣＤ１５５全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００６４９６．４）、ヒトＣＤ１１２全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００１０３６１８９．１）をコードするヌクレオチド配列は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングされ、プラスミドが製造された。ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＡＴＣＣから購入）に対してプラスミドトランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、カタログ番号：Ｌ３０００－０１５）を行った後、１０μｇ／ｍＬのｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含有する１０％（ｗ／ｗ）のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２週間選択的に培養した後、モノクローナル細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２に置いて培養し、約２週間後に一部のモノクローナルウェルを選択して増幅させた。増幅後のクローニングはフローサイトメトリーによりスクリーニングされた。成長状態が良好で、蛍光強度が高く、モノクローナルの細胞株を選択し、引き続き拡大培養し、液体窒素で凍結保存させた。
実施例３ 抗ヒトＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の生成
抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体はハイブリドーマ技術により得られ、ヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ－ｍＦｃ融合タンパク質でマウスを免疫し、免疫マウスの脾細胞を単離し、電気融合法によりマウス骨髄腫瘍細胞と細胞融合し、ＨＡＴ選択培地において培養し、培養上清を取って同定し、標的抗体を分泌するクローニングを選択してサブクローニングし、最終的に生産・精製によりマウスモノクローナル抗体を取得した。詳細な説明は以下の通りである。
Ａ．動物免疫
実験には、ＳＪＬ白マウス、雌、６～８週齢（上海スラック実験動物有限責任公司、動物生産許可番号：ＳＣＸＫ（滬）２０１７－０００５）を用いた。飼育環境：ＳＰＦグレード。マウス購入後、実験用動物室（和元生物技術（上海）股フン有限公司）において、１２／１２時間明／暗サイクル調節、温度２０～２５℃、湿度４０～６０％の実験室環境で１週間適応飼育した。環境に順応したマウスを以下のプロトコールに従って免疫した。
抗原ｍＦｃタグ付きのヒトＴＩＧＩＴ－ＥＣＤ（Ａｃｒｏ Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＩＴ－Ｈ５２５３）を免疫した。免疫プロトコール：ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標） Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ２６８４）及びＴｈｅｒｍｏ ｍｊｅｃｔ（登録商標） Ａｌｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｃａｔ Ｎｏ．７７１６１）アジュバントで交差免疫した。抗原とアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標） Ｇｏｌｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ）の割合は１：１、抗原とアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標） Ａｌｕｍ）の割合は２：１であり、５０μｇ／匹／回（初回免疫）、２５μｇ／匹／回（免疫強化）であった。抗原乳化後、第１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０の時点で接種した。１日目に乳化後抗原を５０μｇ／匹で腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）した。８日目に２５μｇ／匹で皮下多点注射（Ｓ．Ｃ．、一般的に背部及び鼠径部の４点）した。腹腔内注射と皮下注射を隔週で交互に行い、２０日目、２７日目、３４日目、４８日目に採血し、ＥＬＩＳＡ法によりマウス血清の抗体Ｔｉｔｅｒを決定した。６～８回目の免疫後、血清中抗体Ｔｉｔｅｒが高いマウスの脾臓及びリンパ節細胞を選択して融合し、融合前３日にショック免疫を行い、５０μｇ／匹の生理食塩水により調製された抗原溶液を腹腔内注射（Ｉ．Ｐ．）した。
Ｂ．Ｂ細胞融合
最適化された電気融合（ＢＴＸ ＥＣＭ２００１＋）手順で脾臓及びリンパ節細胞を骨髓腫瘍細胞ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１５８１）に融合してハイブリドーマ細胞を得た。融合後のハイブリドーマ細胞を、５×１０５／ｍＬの密度で、２０％のＦＢＳ（Ｅｘｃｅｌｌ Ｃａｔ Ｎｏ．ＦＮＤ５００）、１×ΗΑΤ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ０２６２－１０ＶＬ、１×ＮＥＡＡを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ Ｎｏ．１０５６９０４４）完全培地に再懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルの平底プレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６～７日インキュベートした後、上清を除去し、ΗΤを含む、１０％のＦＢＳ、ｌ×ＨＴ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ０１３７～１０ＶＬ）、１×ＮＥＡＡを含むＤＭＥＭ完全培地に２００μＬ／ウェルで加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養し後、ＥＬＩＳＡ検出を行った。
Ｃ．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
７～１０日融合した後、ハイブリドーマ細胞上清液を取り、ＥＬＩＳＡ法によりヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ（内部生成）への結合活性を検出し、陽性クローニングをスクリーニングし、２日目に陽性クローニング上清液の、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ（内部構築）への結合活性、ＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴ（内部構築）への結合活性、及びＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５（内部構築）に対するヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃの結合へのブロック効果を検出し、標的クローニングをスクリーニングしてサブクローニングを行った。
サブクローン細胞を７～１０日間培養した後、ＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、標的ハイブリドーマモノクローナル細胞をスクリーニングして２４ウェルに拡大培養し、２～３日後、培養上清の、ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃへの結合活性、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ（内部構築）への結合活性、ＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴ（内部構築）への結合活性、カニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ（内部生成）への結合活性、Ｂｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ（義翹神州、１０１０９－Ｈ０８Ｈ）とＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ（内部構築）との相互作用へのブロック効果、及びヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５（内部構築）との相互作用へのブロック効果を検出し、標的クローンを選択して生成して精製し、１１６株のモノクローナル抗体を取得した。
Ｄ．マウスモノクローナル抗体の同定
上記で取得した１１６株のモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＢＩＡｃｏｒｅなどで同定し、それぞれＴＩＧＩＴ－Ｆ２－００２、ＴＩＧＩＴ－Ｆ２－００５、ＴＩＧＩＴ－Ｆ２－００６、ＴＩＧＩＴ－Ｆ２－０１１、ＴＩＧＩＴ－Ｆ３－０３４、ＴＩＧＩＴ－Ｆ４－０４４、ＴＩＧＩＴ－Ｆ５－０５７、ＴＩＧＩＴ－Ｆ５－０６７、ＴＩＧＩＴ－Ｆ５－０７０、ＴＩＧＩＴ－Ｆ５－０７２、ＴＩＧＩＴ－Ｆ６－０８４、ＴＩＧＩＴ－Ｆ６－０８８、ＴＩＧＩＴ－Ｆ６－１０４である１３株の候補抗体を取得した。
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃに対する抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の結合活性の検出
ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）でヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ：１０９－００６－０９８）を４μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃９０１８）に加え、４℃で一晩放置し、コーティング液を振り落とし、２５０μＬ／ウェルで５％の脱脂粉乳（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ６００６６９－０２５０）－ＰＢＳを加え、３７℃で２～４時間インキュベートし、プレート洗浄機（Ｂｉｏｔｅｋ、ＣＡＴ＃４０５ＴＵＳ）において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ１００７７７－０５００、Ｂ５４８１１７－０５００）で３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ（内部構築、作業濃度３０ｎｇ／ｍＬ）及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ（内部構築、作業濃度３０ｎｇ／ｍＬ）を加え、４℃で一晩インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルで精製されたマウスモノクローナル抗体（１％のＢＳＡで１３ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈した）を加え、３７℃で１．５～２時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０００の希釈比率で１％のＢＳＡ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ５０００２３－０１００）－ＰＢＳでＨＲＰ酵素標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１１５－０３５－００３）を希釈し、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでＴＭＢ発色溶液（ＫＰＬ、ＣＡＴ＃５２－００－０３）を加え、室温で７～１０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルで１ＭのＨＣＬを加え、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴ）でＯＤ４５０ｎｍを読み取った。実験結果は、対照抗ＴＩＧＩＴ抗体ロッシュＲＧ６０５８と比べて、抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体がヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃに効果的に結合できることを示した。
ＲＧ６０５８に対応するアミノ酸配列は以下に示される通りである。
ＲＧ６０５８ ＶＨ配列番号２３４：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＳＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＫＴＹＹＲＦＫＷＹＳＤＹＡＶＳＶＫＧＲＩＴＩＮＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＦＹＣＴＲＥＳＴＴＹＤＬＬＡＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＲＧ６０５８ ＶＬ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２３５：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＴＶＬＹＳＳＮＮＫＫＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＮＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＥＩＫ
（ｂ）ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ及びＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体の結合活性へのＥＬＩＳＡ法による検出
細胞を収集し、１０％のＦＢＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｅｘｃｅｌｌ、ＣＡＴ＃ＦＳＰ５００、Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１１３３０）で濃度を５×１０５／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３５９９）に加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養し、培養上清を振り落とし、５０μＬ／ウェルで細胞固定液（碧雲天、ＣＡＴ＃Ｐ００９８）を加え、室温で１時間固定し、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで１回洗浄し、２５０μＬ／ウェルで５％の脱脂粉乳－ＰＢＳを加え、３７℃で２～４時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、精製されたマウスモノクローナル抗体希釈液を加えて１％のＢＳＡで１３ｎＭに希釈し、５０μＬ／ウェルで３倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、３７℃で１．５～２時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０００の希釈比率で１％のＢＳＡ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ５０００２３－０１００）－ＰＢＳでＨＲＰ酵素標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１１５－０３５－００３）を希釈し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでＴＭＢ発色溶液（ＫＰＬ、ＣＡＴ＃５２－００－０３）を加え、３７℃で１０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルで１ＭのＨＣＬを加え、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴ）でＯＤ４５０ｎｍを読み取った。実験結果は、対照抗ＴＩＧＩＴ抗体ロッシュＲＧ６０５８と比べて、精製されたマウス抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体がＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ高発現細胞株、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ中程度発現細胞株、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ低発現細胞株及びＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞株に効果的に結合できることを示した。
（ｃ）抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体がＢｉｏ－ＣＤ１５５－ＨｉｓとＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴとの相互作用をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／４０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで抗体を２１０ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ（義翹神州、１０１０９－Ｈ０８Ｈ）を３μｇ／ｍＬに希釈し、次に４０μＬの細胞と４０μＬの抗体希釈液及び４０μＬのＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＡＰＣで標識されたストレプトアビジン（作業希釈比率１：１７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２４３）を加え、細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。実験結果は、精製されたマウスモノクローナル抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方がＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ高発現細胞株に対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓタンパク質の結合を効果的にブロックできることを示した。
（ｄ）抗ＴＩＧＩＴマウスモノクローナル抗体がヒトＴＩＧＩＴとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５との相互作用を阻害することに対するＥＬＩＳＡ法による検出
ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５細胞を収集し、１０％のＦＢＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｅｘｃｅｌｌ、ＣＡＴ＃ＦＳＰ５００、Ｇｉｂｃｏ、ＣＡＴ＃１１３３０）で濃度を５×１０５／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃３５９９）に加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養し、培養上清を振り落とし、５０μＬ／ウェルで細胞固定液（碧雲天、ＣＡＴ＃Ｐ００９８）を加え、室温で１時間固定し、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで１回洗浄し、２５０μＬ／ウェルで５％の脱脂粉乳－ＰＢＳを加え、３７℃で２～４時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、マウスモノクローナル抗体とヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｈＦｃ（作業濃度３０ｎｇ／ｍＬ）とを混合し、０．５時間インキュベートし、次に５０μＬ／ウェルで抗原抗体混合液を細胞プレートに加え、３７℃で１．５～２時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０００の希釈比率で１％のＢＳＡ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ５０００２３－０１００）－ＰＢＳでＨＲＰ酵素標識抗体（Ｍｅｒｃｋ、ＣＡＴ＃ＡＰ１１３Ｐ）を希釈し、５０μＬ／ウェルで細胞プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでＴＭＢ発色溶液（ＫＰＬ、ＣＡＴ＃５２－００－０３）を加え、３７℃で１０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルで１ＭのＨＣＬを加え、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴ）でＯＤ４５０ｎｍを読み取った。実験結果は、精製されたマウスモノクローナル抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方がＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５細胞に対するヒトＴＩＧＩＴタンパク質の結合を効果的にブロックできることを示した。
下記の表１は、１３株の抗体が何れも良好なＴＩＧＩＴ結合能力、及びＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との相互作用へのブロック効果が示され、且つ抗ＴＩＧＩＴ対照抗体ロッシュＲＧ６０５８に達するか、又はそれを上回ることを示した。
実施例４ 抗ヒトＴＩＧＩＴキメラ抗体の同定
上記マウス抗体は、ヒト－マウスキメラ抗体の構築により同定され、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００５、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００６及びＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－０７０という４株のキメラ抗体が確認された。表２はキメラ抗体のＶＨ／ＶＬ配列を示し、表３はキメラ抗体のＫＡＢＡＴ分析結果を示し、表４はキメラ抗体のＩＭＧＴ分析結果を示した。
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃに対する抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体の結合活性の検出
ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）でヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ：１１５－００６－０７１）を４μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡＴ＃９０１８）に加え、４℃で一晩放置し、コーティング液を振り落とし、２５０μＬ／ウェルで５％の脱脂粉乳（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ６００６６９－０２５０）－ＰＢＳを加え、３７℃で２～４時間インキュベートし、プレート洗浄機（Ｂｉｏｔｅｋ、ＣＡＴ＃４０５ＴＵＳ）において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ１００７７７－０５００、Ｂ５４８１１７－０５００）で３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（内部構築、作業濃度３０ｎｇ／ｍＬ）及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（内部構築、作業濃度３０ｎｇ／ｍＬ）を加え、４℃で一晩インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルで試験待ち抗体（１％のＢＳＡで１３ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈した）を加え、３７℃で１．５～２時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０００希釈比率で１％のＢＳＡ（生工生物、ＣＡＴ＃Ａ５０００２３－０１００）－ＰＢＳでＨＲＰ酵素標識抗体（Ｍｅｒｃｋ、ＣＡＴ＃ＡＰ１１３Ｐ）を希釈し、５０μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬ／ウェルでＴＭＢ発色溶液（ＫＰＬ、ＣＡＴ＃５２－００－０３）を加え、室温で７～１０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルで１ＭのＨＣＬを加え、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴ）でＯＤ４５０ｎｍを読み取った。実験結果は、対照抗体ロッシュＲＧ６０５８と一致し、抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体がヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（図１）及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（図２）に結合できることを示した。
（ｂ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ高中低発現レベルの細胞及びＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／５０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで抗体を８０ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、５０μＬの細胞と５０μＬの試験待ち抗体希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（１：８００）（Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１０９－６０５－０８８）を加え、細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。実験結果は、対照抗体ロッシュＲＧ６０５８と一致し、抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体がＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ高発現細胞株（図３）、ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ中程度発現細胞株（図４）、ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ低発現細胞株（図５）及びＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞株（図６）に効果的に結合できることを示した。
（ｃ）抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体がＢｉｏ－ＣＤ１５５－ＨｉｓとＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ高発現株との相互作用をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／４０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで抗体を２１０ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ（義翹神州、１０１０９－Ｈ０８Ｈ）を３μｇ／ｍＬに希釈し、次に４０μＬの細胞と４０μＬの抗体希釈液及び４０μＬのＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＡＰＣで標識されたストレプトアビジン（作業希釈比率１：１７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２４３）を加え、細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図７に示すように、抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方はＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ細胞に対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓタンパク質の結合を効果的にブロックできる。
（ｄ）抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体がＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５との相互作用をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／４０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで試験待ち抗体を６００ｎＭに希釈し、２．５倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃを６μｇ／ｍＬに希釈し、次に４０μＬ細胞と４０μＬの抗体希釈液及び４０μＬのＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬ／ウェルでＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（作業希釈比率１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１１５－６０５－００３）を加え、細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図８に示すように、抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方はＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５細胞に対するヒトＴＩＧＩＴタンパク質の結合を効果的にブロックできる。
表５はＴＩＧＩＴキメラ抗体同定のまとめを示した。
（ｅ）ＮＫ細胞表面ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴの発現及びＷＩＤＲ細胞表面ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現の検出
ＦＡＣＳによりＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴの発現を検出した。まず、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）を用いてＮＫ細胞をカウントし、３つのフローチューブを取り、各フローチューブに１Ｅ＋５個のＮＫ細胞を加え、ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、１つのチューブに３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて未染色チューブとして使用に備え、別の２本の各チューブに染色液１００μＬ（ＰＢＳ＋１＊のＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４））を加えて均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。次にＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、各チューブにＦｃ阻害剤５０μＬ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋Ｆｃｘ ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２））を加えて均一に混合した後、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、各チューブに染色液をそれぞれ加え、１本目のチューブに５０μＬの２＊染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰＥ－Ｃｙ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ３検出抗体＋ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ５６検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＴＩＧＩＴ検出抗体＋ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲＩＧ検出抗体、ＣＤ３検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００３１６、ＣＤ５６検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１８３０６、ＴＩＧＩＴ検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７０６、ＰＶＲＩＧ検出抗体ＲＤ ＦＡＢ９３６５１Ｇ）を加え、２本目のチューブに５０μＬの２＊アイソタイプ対照染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰＥ－Ｃｙ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ３検出抗体＋ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ５６検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ κアイソタイプ対照抗体＋ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ κアイソタイプ対照抗体、ＡＰＣ ｍＩｇＧ２ａ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００２２２、ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ κアイソタイプ対照抗体ＲＤ ＩＣ１０５１Ｇ）を加えて均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、遠心分離後、３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて均一に混合した。次にオンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群におけるＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞群の割合及びＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群におけるＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞群のＡＰＣ、ＡＦ４８８シグナルを読み取った。図９のＡは、異なる供与体ｄｏｎｏｒ－０１０とｄｏｎｏｒ－０５０のＮＫ細胞表面の両方でＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴが発現されることを示した。
ＦＡＣＳを使用してＷＩＤＲ細胞におけるＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現を検出した。まず、ＷＩＤＲ細胞をトリプシンで消化して細胞懸濁液とし、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）を用いて細胞をカウントし、３つのフローチューブを取り、各フローチューブに１Ｅ＋５個の細胞を加え、ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄した。遠心分離後、上清を除去し、１つのチューブに３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて未染色チューブとして使用に備え、別の２本の各チューブに染色液１００μＬ（ＰＢＳ＋１＊のＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４））を加えて均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。次にＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、各チューブに染色液をそれぞれ加え、１本目のチューブに１００μＬの染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲ検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲＬ２検出抗体、ＰＶＲ検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３３７６１２、ＰＶＲＬ２検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３３７４１２）を加え、２本目のチューブに１００μＬのアイソタイプ対照染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体＋ＡＰＣ κ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ ｍＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００１５０、ＡＰＣ ｍＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００１２２）を加えて均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、遠心分離後、３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて均一に混合した。次にオンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群のＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＡＰＣシグナルを読み取った。図９のＢは、ＷＩＤＲ細胞表面でＰＶＲ及びＰＶＲＬ２が高発現されることを示した。
（ｆ）ＮＫ細胞機能に対する抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体の促進作用へのＮＫ細胞脱顆粒実験による検出
ＦＡＣＳによりＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）のＣＤ１０７ａシグナルを検出することで、ＮＫ細胞脱顆粒プロセスに対する試験抗体の影響を示した。前日にＰＢＭＣを蘇生し、ＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５５）を選別し、２００ＩＵ／ｍＬのｈ－ＩＬ２（ＲＤ、２０２－ＩＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＩＬ１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－１２－５０ＵＧ）を加えて一晩刺激し、２日目に播種実験を行った。まず、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％のＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ）で抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）に希釈し、次にａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで１０倍勾配で希釈を開始し、希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで超低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、７００７）に加え、使用に備えた。次に、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でＮＫ細胞をカウントし、一定の数のＮＫ細胞を取り、３５０ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで０．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、細胞懸濁液にタンパク質輸送阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００４９８０９３）及びＡＰＣ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ検出抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２８６２０）を加えた。処理したＮＫ細胞懸濁液を、５０μＬ／ウェルで薬剤で覆われた９６ウェルＵ底プレートに加え、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。インキュベートの間、標的細胞ＷＩＤＲをトリプシンで消化して細胞懸濁液とし、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）で標的細胞をカウントし、適切な量の細胞を取り出し、２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで細胞を０．２５Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。インキュベート終了後、１００μＬ／ウェルでウェルプレートに標的細胞懸濁液を加え、この場合、各ウェルに２５０００個のＮＫ細胞、２５０００個の標的細胞及び様々な濃度の試験抗体を含有し、ＮＫ細胞のみを含有するウェルは休止対照とし、ＮＫ細胞及び標的細胞を含有するウェルは薬物無し対照とした。各ウェルを均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに入れて１６ｈインキュベートした。ＣＤ１０７ａの変化状態に対するＦＡＣＳ染色による検出：ウェルプレートにおける細胞９６ウェルＶ底プレートに平行に移し、ＰＢＳで２回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに染色液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋１＊濃度のｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）＋ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＣＤ５６検出抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８３０６））を加えて均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに１５０μＬのｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁させ、オンマシンで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。最終的にＣＤ５６陽性細胞におけるＣＤ１０７ａ強陽性細胞群の割合を読み取り、ＣＤ１０７ａ強陽性細胞の割合が高いほど、ＮＫ細胞の脱粒作用が強く、ＮＫ細胞の活性化程度が高いことを示した。図１０は、陰性対照ａｎｔｉ－ＨＥＬ－ｈＩｇＧ１がＮＫ表面のＣＤ１０７ａに影響を与えず、３つの試験抗体が何れも異なる程度でＮＫ細胞ＣＤ１０７ａの発現を向上できることを示し、これは、３つの試験抗体が何れもＮＫの活性化を効果的に促進できることを示した。
（ｇ）標的細胞に対する抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体のＮＫ細胞の殺傷促進作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出
ＦＡＣＳにより標的細胞（ＷＩＤＲ）の分解レベルを検出することで、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）細胞殺傷機能に対する試験抗体の影響を推定した。前日にＰＢＭＣを蘇生し、ＮＫ細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５５）を選別し、２００ＩＵ／ｍＬのｈ－ＩＬ２（ＲＤ、２０２－ＩＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＩＬ１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－１２－５０ＵＧ）を加えて一晩刺激し、２日目に播種実験を行った。まず、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％のＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ）で抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）に希釈し、次にａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで１０倍勾配で希釈を開始し、希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで超低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、７００７）に加え、使用に備えた。標的細胞ＷＩＤＲをトリプシンで消化して細胞懸濁液とし、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でＷＩＤＲ細胞をカウントし、適切な量の細胞を取り出し、遠心分離機に置いて２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、適量のＰＢＳで再懸濁させた後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの最終濃度を５μＭとするように、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５７Ａ）染色液を加えた。染色液を加えたＷＩＤＲ懸濁液を均一に混合し、３７℃のインキュベーターに置いて１０分間インキュベートし、その間で振とうしながら混合した。これと同時に、細胞カウンターでＮＫ細胞をカウントし、一定の数のＮＫ細胞を取り、３５０ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで０．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。処理したＮＫ細胞懸濁液を、５０μＬ／ウェルで薬剤で覆われた９６ウェルＵ底プレートに加え、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。ＷＩＤＲ細胞染色が終了した後、細胞懸濁液に５倍体積の完全培地（ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１＊Ｐ／Ｓ＋１＊非必須アミノ酸＋１＊グルタミン酸ナトリウム）を加えて反応を停止させ、２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで細胞を０．２５Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。ＮＫ及び薬物のインキュベートが終了した後、１００μＬ／ウェルでウェルプレートにＷＩＤＲ細胞懸濁液を加え、この場合、各ウェルに２５０００個のＮＫ細胞、２５０００個のＷＩＤＲ細胞及び様々な濃度の試験抗体を含有し、ＷＩＤＲ細胞のみを含有するウェルは休止対照とし、ＮＫ及びＷＩＤＲを含有するウェルは薬物無し対照とした。各ウェルを均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに入れて４ｈインキュベートした。ＷＩＤＲ細胞分解レベルに対するＦＡＣＳ染色による検出：各ウェルに染色液（ＰＢＳ＋ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３５６６））を加えて均一に混合した後、室温で２０分間インキュベートした。時間経過後、オンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＣＴＶ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞群の割合を読み取り、ＰＩ陽性細胞の割合が多いほど、ＮＫ細胞の殺傷作用が強いことを示した。図１１は、陰性対照ａｎｔｉ－ＨＥＬ－ｈＩｇＧ１がＮＫ殺傷に顕著な影響を与えず、試験される４個のキメラ抗体が何れもＮＫ細胞の標的細胞ＷＩＤＲへの殺傷を効果的に促進でき、そしてＮＫ細胞に対する４個のキメラ抗体の殺傷促進作用が陽性対照ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１以上であることを示した。
（ｈ）抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴキメラ抗体の機能改善作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出
Ａｎｔｉ－ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒのＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチドにより誘導されたＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔをエフェクター細胞とし、ｐｐ６５ ｐｕｌｓｅｄ後のｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞株を標的細胞とした実験系において、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＴＩＧＩＴ抗体の機能改善作用を検出した。
ＰＢＭＣ蘇生後、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ－２８３２８）、２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＩＬ－２０２）、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％のＡＢ ｓｅｒｕｍ＋１％のＰ／Ｓ＋（１×）２－βメルカプトエタノール）で２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６日間培養した。６日目に、全ての細胞を収集し、培地中のｐｐ６５及びＩＬ－７を除去し、細胞を二分し、そして１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、培養を２日間続けた。８日目に、全ての細胞を収集し、１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、そして細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、培養を続けた。１１日目に、全ての細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣにおけるＣＤ８ Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８Ｔの割合（図１２のＡ）及び当該細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現（図１２のＢ）を検出した。フローサイトメトリー検出抗体は、Ｌｉｖｅｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）、ＣＤ８－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（ＢＤ、カタログ番号５６５３１０）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１６）、Ｔ－ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＣＭＶ ｐｐ６５ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１０－１Ｃ）、ＰＶＲＩＧ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ９３６５１Ｇ－１００ＵＧ）、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２７０６）、ＰＤ－１－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６２５１６）であった。
上記誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８ Ｔ選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８ Ｔはエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖで再懸濁させて細胞密度を０．４×１０６／ｍＬに調整した。Ｃｏｌｏ２０５は標的細胞とし、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、５０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させ、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で１～２時間処理し、次に２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞をＡＩＭ－Ｖで０．２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、Ｃｏｌｏ２０５細胞でのＰＶＲＬ２、ＰＶＲ高発現のフローサイトメトリーによる検出は図１２のＣに示される通りである。ＴＩＧＩＴ抗体又は陽性対照をＡＩＭ－Ｖで２８０ｎＭに希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８ Ｔ、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５を順に加え、そしてピペットで軽く均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした。この系における薬物最終濃度は７０ｎＭ、ＣＤ８ Ｔは２００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５は２００００／ウェルであった。インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。この系における陽性対照はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔであった。図１２のＤに示すように、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１と比べて、３個のＴＩＧＩＴ試験抗体が作用した後、細胞上清中のＩＦＮ－γ分泌は統計学的に有意差がなかったが、何れもｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群よりも顕著に高く、各棒グラフ上の百分率は、ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比べて、ＩＦＮ－γ分泌が向上した百分率を意味する。
Ｃｏｌｏ２０５でのＰＶＲＬ２、ＰＶＲ発現のフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＰＶＲＬ２－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７４１２）、ＰＶＲ－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７６１２）、ＰＤ－Ｌ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ番号５５８０１７）であった。
実施例５ 抗ヒトＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のヒト化
ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重軽鎖可変領域生殖系遺伝子データベースをアライメントすることによって、マウス抗体との相同性が高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖系遺伝子をテンプレートとしてそれぞれスクリーニングし、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれ移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という順番の可変領域配列を形成した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、フレームワーク配列における主要アミノ酸を、マウス抗体に対応するアミノ酸に回復変異させて、ヒト化抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体を得た。そのうち、抗体のＣＤＲアミノ酸残基は、一般的にＫａｂａｔ番号付けシステムによって決定され、注釈が付けられた。
１、ＴＩＧＩＴ－００２のヒト化
マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００２のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ２－２９＊０２／ＩＧＫＶ４－１＊０１及びＩＧＫＪ４＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ４－３８～２＊０１及びＩＧＨＪ６＊０１であり、マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００２のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＴＩＧＩＴ－００２のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をマウス抗体に対応するアミノ酸に回復変異させ、具体的な回復変異の設計は表６に示される通りである。
ＴＩＧＩＴ－００２ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号６６に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＡＳＱＮＶＲＴＡＶＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＭＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＹＹＴＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＬ２アミノ酸配列は配列番号６７に示される通りである。
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ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＬ３アミノ酸配列は配列番号６８に示される通りである。
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ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＨ１アミノ酸配列は配列番号６９に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＴＳＤＳＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＦＳＮＹＧＧＡＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号７０に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＴＳＤＳＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＦＳＮＹＧＧＡＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＨ３アミノ酸配列は配列番号７１に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＴＳＤＳＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＦＳＮＹＧＧＡＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００２．ＶＨ４アミノ酸配列は配列番号７２に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＴＳＤＳＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＹＩＧＹＩＳＹＳＧＮＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＤＦＳＮＹＧＧＡＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ２－２９＊０２アミノ酸配列は配列番号７３に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＫＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＥＶＳＳＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＩＨＬＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４－１＊０１アミノ酸配列は配列番号７４に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＪ４＊０１アミノ酸配列は配列番号７５に示される通りである。
ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ４－３８～２＊０１アミノ酸配列は配列番号７６に示される通りである。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＳＳＧＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ６＊０１アミノ酸配列は配列番号７７に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
本発明は、それぞれ上記００２のヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域の回復変異の設計から、異なる軽鎖及び重鎖配列を選択して交差組み合わせて、最終的に複数の００２ヒト化抗体を取得し、各抗体の可変領域アミノ酸配列は以下の通りである。
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、上記１２個のヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ配列の分析結果は表８に示される通りである。
２、ＴＩＧＩＴ－００６のヒト化
マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００６のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ２－２９＊０２／ＩＧＫＶ４－１＊０１及びＩＧＫＪ４＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ４－３８～２＊０１及びＩＧＨＪ６＊０１であり、マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００６のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＴＩＧＩＴ－００６のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をマウス抗体に対応するアミノ酸に回復変異させ、具体的な回復変異の設計は表９に示される通りである。
ＴＩＧＩＴ－００６ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号７８に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＧＶＳＴＴＩＡＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＹＹＳＳＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＬ２アミノ酸配列は配列番号７９に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＡＳＱＧＶＳＴＴＩＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＱＱＹＹＳＳＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＬ３アミノ酸配列は配列番号８０に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＡＳＱＧＶＳＴＴＩＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＳＰＦＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＨ１アミノ酸配列は配列番号８１に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＴＳＤＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＲＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＳＮＹＧＧＡＭＹＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号８２に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＭＴＳＤＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＲＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＳＮＹＧＧＡＭＹＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＨ３アミノ酸配列は配列番号８３に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＭＴＳＤＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＷＩＧＹＩＳＹＳＧＲＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＳＮＹＧＧＡＭＹＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＨ４アミノ酸配列は配列番号８４に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＭＴＳＤＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＲＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＳＮＹＧＧＡＭＹＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００６．ＶＨ５アミノ酸配列は配列番号８５に示される通りである。
ＥＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＭＴＳＤＹＷＮＷＩＲＱＰＰＧＫＫＬＥＹＩＧＹＩＳＹＳＧＲＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＳＮＹＧＧＡＭＹＤＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ２－２９＊０２アミノ酸配列は配列番号７３に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＨＳＤＧＫＴＹＬＹＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＥＶＳＳＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＩＨＬＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４－１＊０１アミノ酸配列は配列番号７４に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＪ４＊０１アミノ酸配列は配列番号７５に示される通りである。
ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ４－３８～２＊０１アミノ酸配列は配列番号７６に示される通りである。
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＹＳＩＳＳＧＹＹＷＧＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＳＩＹＨＳＧＳＴＹＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ６＊０１アミノ酸配列は配列番号７７に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
本発明は、それぞれ上記ＴＩＧＩＴ－００６のヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域の回復変異の設計から、異なる軽鎖及び重鎖配列を選択して交差組み合わせて、最終的に複数のＴＩＧＩＴ－００６ヒト化抗体を取得し、各抗体の可変領域アミノ酸配列は以下の通りである。
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、上記１５個のヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ配列の分析結果は表１１に示される通りである。
３、ＴＩＧＩＴ－００５のヒト化
マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００５のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ４－１＊０１及びＩＧＫＪ４＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ６＊０１であり、マウス抗体ＴＩＧＩＴ－００５のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＴＩＧＩＴ－００５のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をマウス抗体に対応するアミノ酸に回復変異させ、具体的な回復変異の設計は表１２に示される通りである。
ＴＩＧＩＴ－００５ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
ＴＩＧＩＴ－００５．ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号８６に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＡＳＱＨＶＳＮＧＶＡＷＹＱＨＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＨＹＮＴＰＨＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ＴＩＧＩＴ－００５．ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号８７に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＫＥＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＥＹＦＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４－１＊０１アミノ酸配列は配列番号７４に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＪ４＊０１アミノ酸配列は配列番号７５に示される通りである。
ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－３＊０１アミノ酸配列は配列番号１０６に示される通りである。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ６＊０１アミノ酸配列は配列番号７７に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－００５抗体には化学修飾を受けやすい部位ＮＧが存在し、発明者らは、修飾のリスクを排除するためにＮＧを点変異させた。５つの実施例において、発明者らは、それぞれ００５．ＶＬ１のＮＧを変異させ、変異部位が太線で示され、変異後の配列は以下の通りである。
本発明は、それぞれ上記ＴＩＧＩＴ－００５のヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域の回復変異の設計から、異なる軽鎖及び重鎖配列を選択して交差組み合わせて、最終的に６つのＴＩＧＩＴ－００５ヒト化抗体を取得し、各抗体の可変領域アミノ酸配列は以下の通りである。
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、上記６個のヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ配列の分析結果は表１４に示される通りである。
４、ＴＩＧＩＴ－０７０のヒト化
マウス抗体ＴＩＧＩＴ－０７０のヒト化軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＩＧＫＶ４－１＊０１及びＩＧＫＪ３＊０１、ヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ１－３＊０１及びＩＧＨＪ６＊０１であり、マウス抗体ＴＩＧＩＴ－０７０のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＴＩＧＩＴ－０７０のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をマウス抗体に対応するアミノ酸に回復変異させ、具体的な回復変異の設計は表１５に示される通りである。
ＴＩＧＩＴ－０７０ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＬ１アミノ酸配列は配列番号９８に示される通りである。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＨＹＧＮＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＬ２アミノ酸配列は配列番号９９に示される通りである。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＨＹＧＮＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＬ３アミノ酸配列は配列番号１００に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＲＶＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＨＨＹＧＮＰＬＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＨ１アミノ酸配列は配列番号１０１に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＲＩＤＰＤＳＧＧＳＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＨＹＧＦＹＳＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＨ２アミノ酸配列は配列番号１０２に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＲＩＤＰＤＳＧＧＳＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＶＤＫＬＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＨＹＧＦＹＳＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ＴＩＧＩＴ－０７０．ＶＨ３アミノ酸配列は配列番号１０３に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＤＰＤＳＧＧＳＫＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＩＴＶＤＫＬＳＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＨＹＧＦＹＳＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ１－３９＊０１アミノ酸配列は配列番号１０４に示される通りである。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＶ４－１＊０１アミノ酸配列は配列番号７４に示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ
ヒト化軽鎖テンプレートＩＧＫＪ４＊０１アミノ酸配列は配列番号１０５に示される通りである。
ＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ１－３＊０１アミノ酸配列は配列番号１０６に示される通りである。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＮＴＫＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ６＊０１アミノ酸配列は配列番号７７に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
本発明は、それぞれ上記ＴＩＧＩＴ－０７０のヒト化抗体軽鎖及び重鎖可変領域の回復変異の設計から、異なる軽鎖及び重鎖配列を選択して交差組み合わせて、最終的に複数のＴＩＧＩＴ－０７０ヒト化抗体を取得し、各抗体の可変領域アミノ酸配列は以下の通りである。
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、上記９個のヒト化抗体ＶＨ及びＶＬ配列の分析結果は表１７に示される通りである。
５、抗ヒトＴＩＧＩＴモノクローナル抗体のヒト化変異体の同定
ＢＩＡｃｏｒｅにより、ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－Ｈｉｓに対する上記ヒト化抗体の親和性を検出し、また実施例４（ａ）、（ｂ）、（ｄ）の方法を参照し、上記ヒト化抗体の、ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃに対する結合活性、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴに対する結合活性、ＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴに対する結合活性、カニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃに対する結合活性、及びＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５に対するヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃの結合へのブロック効果を検出し、結果は表１８に示される通りである。
ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、ＴＩＧＩＴ－００６－Ｈ５Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－０７０－Ｈ１Ｌ１という４つのヒト化抗体は、キメラ抗体に相当する親和性、結合活性及びブロック効果を維持し、ヒト化に顕著な影響を受けず、且つ、全体的にＲＧ６０５８よりも優れることが分かった。
実施例６ 抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の同定
（ａ）ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃに対する抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の結合活性の検出
実験方法は実施例４（ａ）を参照した。実験結果は、対照抗体ロッシュＲＧ６０５８と一致し、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体がヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（図１３）及びカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（図１４）に効果的に結合できることを示した。
（ｂ）ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ高中低発現レベルの細胞及びＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の結合活性へのＦＡＣＳによる検出
実験方法は実施例４（ｂ）を参照した。実験結果は、対照抗体ロッシュＲＧ６０５８と一致し、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体がＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ高発現細胞株（図１５）、ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ中程度発現細胞株（図１６）、ＣＨＯ－Ｋ１－ＴＩＧＩＴ低発現細胞株（図１７）及びＣＨＯ－Ｋ１－カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞株（図１８）に効果的に結合できることを示した。
（ｃ）抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体がＢｉｏ－ＣＤ１５５－ＨｉｓとＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴとの相互作用をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
実験方法は実施例４（ｃ）を参照した。図１９に示すように、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方は、ＣＨＯ－Ｋ１－ヒトＴＩＧＩＴ細胞に対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓタンパク質の結合を効果的にブロックできる。
（ｄ）抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体がＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５との相互作用をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
実験方法は実施例４（ｄ）を参照した。図２０に示すように、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方は、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５細胞に対するヒトＴＩＧＩＴタンパク質の結合を効果的にブロックできる。
（ｅ）抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体がＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃとＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１１２との相互作用をブロックする効果へのＦＡＣＳ法による検出
ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１１２細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／４０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでヒト化抗体を６００ｎＭに希釈し、２．５倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃを６μｇ／ｍＬに希釈し、次に４０μＬの細胞と４０μＬの抗体希釈液及び４０μＬのＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（作業希釈比率１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１１５－６０５－００３）を加え、１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図２１に示すように、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体と対照抗体ＲＧ６０５８の両方は、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞に対するヒトＴＩＧＩＴタンパク質の結合を効果的にブロックできる。
（ｆ）ヒトＰＢＭＣに対する抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の結合活性へのＦＡＣＳ法による検出
新鮮なヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＰＢ００４－Ｃ）を取り、細胞を５×１０５／ｍＬに調整し、同時にＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＣＡＴ：ＡＴ１０１）を１００ｎｇ／ｍＬになるまで加え、３７℃、５％のＣＯ２で３日間培養し、３日後に細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＣＡＴ＃ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ、５６４２２０）を加え、４℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／５０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでヒト化抗体を８０ｎＭに希釈し、３倍連続勾配で１２濃度点に希釈し、５０μＬの細胞と５０μＬの抗体希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（作業希釈比率１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ、ＣＡＴ＃１０９－６０５－０８８）を加え、１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図２２に示すように、対照抗体ロッシュＲＧ６０５８と一致し、抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体は、ＳＥＡ刺激後のヒトＰＢＭＣに効果的に結合できる。
表１９は、この４つのヒト化抗体の特性をまとめた。ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、ＴＩＧＩＴ－００６－Ｈ５Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－０７０－Ｈ１Ｌ１という４つのヒト化抗体は、ＰＢＭＣ及びヒトＴＩＧＩＴ高中低発現レベルの安定した形質転換株細胞に対する結合傾向が一致し、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３及びＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄはＴＩＧＩＴ－００６－Ｈ５Ｌ３及びＴＩＧＩＴ－０７０－Ｈ１Ｌ１より強く、両方ともＲＧ６０５８より強く、ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－Ｈｉｓに対する一価親和性は、順に０．０９９４ｎＭ、０．０８５２ｎＭ、０．１１４５ｎＭ、０．２５０５ｎＭであり、ＲＧ６０５８は０．１５６０ｎＭであり、且つ、何れもカニクイザルＴＩＧＩＴと強い交差反応性があり、インビトロブロック特性評価において、４つのヒト化抗体は何れも、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５とＴＩＧＩＴ－ＣＤ１１２との相互作用に対する顕著なブロック能力を示した。
（ｇ）ＮＫ殺傷標的細胞に対する抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の促進作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出
実験方法は実施例４（ｇ）を参照した。図２３は、陰性対照ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１がＮＫ殺傷に顕著な影響を与えず、４つのヒト化抗体ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、ＴＩＧＩＴ－００６－Ｈ５Ｌ３及びＴＩＧＩＴ－０７０－Ｈ１Ｌ１が異なる程度でＮＫの標的細胞への殺傷を促進することができ、そのうち、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄは、そのヒト化前のキメラ抗体ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２、ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００５のＮＫ殺傷促進能力に同等であることを示した。
（ｈ）抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体の機能改善作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出
ＰＢＭＣ蘇生後、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ－２８３２８）、２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＩＬ－２０２）、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％のＡＢ ｓｅｒｕｍ＋１％のＰ／Ｓ＋１×２－βメルカプトエタノール）で２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６日間培養した。６日目に、全ての細胞を収集し、培地中のｐｐ６５及びＩＬ－７を除去し、細胞を二分し、そして１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、培養を２日間続けた。８日目に、全ての細胞を収集し、１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、そして細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、培養を続けた。１１日目に、全ての細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣにおけるＣＤ８Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８Ｔの割合（図２４のＡ）及び当該細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びＣＤ２２６の発現（図２４のＢ）を検出した。フローサイトメトリー検出抗体は、Ｌｉｖｅｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）、ＣＤ８－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（ＢＤ、カタログ番号５６５３１０）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１６）、Ｔ－ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＣＭＶ ｐｐ６５ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１０－１Ｃ）、ＰＶＲＩＧ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ９３６５１Ｇ－１００ＵＧ）、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２７０６）、ＰＤ－１－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６２５１６）であった。
上記誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８ Ｔ選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８ Ｔはエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖで再懸濁させて細胞密度を０．４×１０６／ｍＬに調整した。選別後のＣＤ８について、純度及びＣＤ２２６の発現を検出した。Ｃｏｌｏ２０５は標的細胞とし、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、２０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させ、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間処理し、次に２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞をＡＩＭ－Ｖで０．５×１０６／ｍＬに再懸濁させた。抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体又は陽性対照をＡＩＭ－Ｖで２８０ｎＭに希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８ Ｔ、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５を順に加え、そしてピペットで軽く均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした。この系における薬物最終濃度は７０ｎＭ、ＣＤ８ Ｔは２００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５は５００００／ウェルであった。インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。この系におけるの陽性対照はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＴＩＧＩＴヒト化前の抗体（ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２）、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔであった。図２４のＣに示すように、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１と比べて、４個のＴＩＧＩＴヒト化抗体（ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、ＴＩＧＩＴ－００６－Ｈ５Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－０７０－Ｈ１Ｌ１）が作用した後、細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌は統計学的に有意差がなく（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＴＩＧＩＴヒト化前のキメラ抗体（ＴＩＧＩＴ－ＣＨＩ－００２）と比べて、４個の抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体が作用した後、細胞上清中のＩＦＮ－γの分泌は統計学的に有意差がなかったが（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、何れもｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群よりも顕著に高く、各棒グラフ上の百分率は、ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比べて、ＩＦＮ－γ分泌が向上した百分率を意味する。
選別後、ＣＤ８ Ｔの純度及びそれにおけるＣＤ２２６発現に対するフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５３６６）、ＣＤ２２６－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３８３１６）であった。Ｃｏｌｏ２０５におけるＰＶＲＬ２、ＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ２発現に対するフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＰＶＲＬ２－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７４１２）、ＰＶＲ－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７６１２）、ＰＤ－Ｌ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ番号５５８０１７）、ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４３３０６）であった。
実施例７ ＰＶＲＩＧアルパカＶＨＨ抗体の製造
２匹の健康な成体アルパカ（Ａｌｐａｃａ）（成都アパック社に購入を委託する）を選択し、初回免疫注射にはヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＰＶＧ Ｈ５２５７）を混合した完全フロイントアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｒｅｕｎｄ’ｓａｄｊｕｖａｎｔ、ＣＦＡ、ＳＩＧＭＡから購入、カタログ番号：Ｆ５８８１）が使用され、その後の３回免疫注射のアジュバントには初回と同じのヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質と混合した不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＩＦＡ、ＳＩＧＭＡから購入、カタログ番号：Ｆ５５０６）が使用され、４回の免疫は何れも皮下注射を使用した。免疫前に血液１０ｍＬを採取して陰性血清対照として残し、２回目免疫後に血液１０ｍＬを採取して血清抗体価を検出し、３回目及び４回目免疫後に末梢血５０ｍＬをそれぞれ採取してリンパ球を分離し、リンパ球量に応じて５ｍＬのＲＮＡ ｉｓｏ Ｐｌｕｓ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：９１０９）を加え、１．５ｍＬのＥＰ管に分注して－８０℃で保存した。凍結保存したリンパ球から全ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写し、次にｃＤＮＡをテンプレートとしてそれぞれＶＨＨ ＰＣＲで２回増幅した。２回目のＰＣＲで増幅されたＶＨＨ産物を酵素切断してファージライブラリーを構築した。確立された細菌ライブラリーを収集し、そしてライブラリーの挿入率及び多様性を配列決定して分析した。
ファージに対して２回のアフィニティーパニングを行い、標的タンパク質であるヒトＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）に特異的に結合するファージクローンを同定した。パニング中にヒトＰＶＲＩＧ－Ｈｉｓタンパク質によく結合する最適なクローンに対して配列決定を行った後、相同組換えによって発現ベクターにクローニングし、そのうちＣＨ２及びＣＨ３定常領域は何れもヒトＩｇＧ１に由来し、完全発現配列はシグナルペプチド－ＶＨＨ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３であった。一連の物理的と化学的及び機能的スクリーニングの後、合計１３個の陽性候補抗体分子が得られ、その配列のＣＤＲｓはそれぞれＩＭＧＴ及びＫＡＢＡＴソフトウェアで分析し、対応する配列情報は下記の表２０～２２に示され、そのうち、表２０は候補抗体分子のＶＨＨ配列を示し、表２１は候補抗体分子のＩＭＧＴ分析結果を示し、表２２は候補抗体分子のＫＡＢＡＴ分析結果を示した。
実施例８ ヒト及びカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の特異的結合のＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートに０．５μｇ／ｍＬのヒトＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）又はカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ０９Ｂ）が１００μＬ／ウェルで予めコーティングされ、試験抗ＰＶＲＩＧ抗体（実施例７に記載されたＶＨＨにヒトＩｇＧ１－Ｆｃが結合して構成）を勾配希釈し（開始濃度２０ｎＭ、３．３３倍勾配希釈又は３ｎＭ、３倍勾配希釈）、１００μＬ／ウェルでサンプルを加え、室温で振とうしながら１．５時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、マウス抗ヒト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号２０９－０３５－０９８）作動液（１：１００００希釈）を加え、１００μＬ／ウェルでサンプルを加え、室温で振とうしながら１．０時間インキュベートし、更にプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２９）を加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させた後にマイクロプレートリーダー（ＭＤ ｉ３ｘ）で吸光値を読み取った。抗体濃度を横座標、対応するＯＤ値を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト／カニクイザルＰＶＲＩＧに結合する能力が強い。陽性対照抗体はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１（Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．：ＵＳ２０１８０２４４７７４Ａ１）、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４（ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．：ＵＳ２０１８０２４４７７４Ａ１）及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１（Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．：ＵＳ２０２０００４００８１Ａ１）であり、陰性対照抗体はａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１（成都アパック、カタログ番号ＮＢＲ０２２）、ａｎｔｉ－ＣＤ３８ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）及びａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）である。
ＣＯＭ７０１に対応するアミノ酸配列は以下に示される通りである。
ＣＯＭ７０１ＶＨ配列番号２３６。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＰＹＩＧＧＳＧＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＤＫＴＡＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＯＭ７０１ ＶＬ配列番号２３７。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＶＳＥＮＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＴＮＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＨＦＷＧＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＲＦ８１３ ＶＨ配列番号２３８。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＡＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＮＩＩＰＩＶＧＩＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＧＲＧＹＴＲＨＦＷＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＲＦ８１３ ＶＬ配列番号２３９。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＤＩＬＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対する１３個の抗ＰＶＲＩＧ抗体の結合結果は図２６Ａ及び表２３に示され、カニクイザルＰＶＲＩＧに対する結合結果は図２６Ｂ及び表２３に示された。データは、全ての試験抗体がヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に特異的に結合できることを示した。
実施例９ ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞及びＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の結合のＦＡＣＳ検出
ヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧ高発現プラスミドがトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（それぞれＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧとして命名される）を取り、ヒトＰＶＲＩＧ全長プラスミド（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＮＰ＿０７６９７５）、及びカニクイザルＰＶＲＩＧ全長プラスミド（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＸＰ＿０１４９８９９４１）は何れも、一般的生物から合成され、細胞密度が８０％未満である場合に実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄して１ｍＬのＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｉｃｏ、１５０４０－０６６）を加えて８～１０分間消化し、１０％のＦＢＳを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｉｃｏ、２１１２７－０２２）完全培地で消化を停止した後、細胞懸濁液とした。細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でカウントした後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、死生細胞染料Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）で染色し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート終了後、染色緩衝液（２％のＦＢＳ＋ＰＢＳ）で染色を停止し、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、使用に備えた。染色緩衝液を使用して抗体を最大濃度４６ｎＭ（２倍濃度）から３．３倍勾配希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬの細胞懸濁液を含むウェルに加え、マイクロウェルプレートシェーカーに置いて４００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体と細胞とを十分に混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色緩衝液２００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。ＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２－４９９８－８２）を染色緩衝液で２５０倍希釈し、洗浄した細胞ウェルに１００μＬ／ウェルの体積で加え、均一に混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色緩衝液で２回洗浄し、最後に２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターによりオンマシンでシグナルを検出した（ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ）。蛍光シグナルが強いほど、ＰＶＲＩＧに対する抗体の結合能が強いことを示した。抗体濃度を横座標、対応する平均蛍光強度ＭＦＩの倍数を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＡＵＣ値を算出した。ＡＵＣ値が大きいほど、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞に対する試験抗体の結合能力が強い。図２７Ａ、図２７Ｂに示すように、全ての試験抗体は何れも、過剰発現細胞表面ヒト／カニクイザルＰＶＲＩＧに結合できる。抗体の結合活性は、陽性分子ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１抗体に対する百分率で正規化され、百分率値が高いほど、抗体の結合活性が強いことを示した。表２４の結果は、ヒトＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ３５、Ａ４３、Ａ１０５、Ａ１１７、Ａ１１８の結合活性がＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１よりも強いことを示した。そのうち、カニクイザルＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧ－Ａ１０５、Ａ１１７の結合活性もＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１よりも強かった。
実施例１０ ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の親和性のＢＩＡｃｏｒｅ検出
Ｂｉａｃｏｒｅにより試験抗ＰＶＲＩＧ抗体とヒトＰＶＲＩＧタンパク質との間の特異的結合を検出した。この実験は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップを使用し、飽和結合抗原Ｒｍａｘが５０ＲＵとなるように、チップが希釈された抗体を捕捉するのに必要な時間をマニュアル操作（ｍａｎｕａｌ ｒｕｎ）で測定した。ヒトＰＶＲＩＧタンパク質（Ｈｕｍａｎ ＰＶＲＩＧ－Ｈｉｓ、Ａｃｒｏ Ｃ２２７Ｐ１－９ＡＲＦ１－Ｔ４）を２０、１０、５、２．５、１．２５ｎＭに勾配希釈した。抗原に対する抗体の親和性は、マルチサイクル速度論を使用して測定された。各サイクルで、抗体を注入した後、ＰＶＲＩＧタンパク質を勾配濃度で注入し、抗原と抗体の結合及び解離プロセスを生じさせた。各サイクルの後、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５を使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップの再生（チップ上のタンパク質を除去する）を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアを使用して、抗体抗原の親和性ＫＤをフィッティングした。表２５の結果から、全ての試験抗ＰＶＲＩＧ抗体とヒトＰＶＲＩＧタンパク質との間に特異的結合があり、且つ親和性レベルが比較的高いことが分かった。
実施例１１ 抗ＰＶＲＩＧ抗体がＰＶＲＬ２に対するＰＶＲＩＧの結合をブロックすることに対するＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートに０．５μｇ／ｍＬのヒトＰＶＲＩＧ－ｈｉｓタンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）が１００μＬ／ウェルで予めコーティングされ、全ての試験抗ＰＶＲＩＧ抗体を最大濃度１６ｎＭから２倍勾配希釈し、希釈後の抗体と１８ｎｇ／ｍＬのヒトＰＶＲＬ２－ｍＦｃ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＣＤ２－Ｈ５２５７）とをそれぞれ等体積で混合し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で振とうしながら２．０時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５－０３５－０７１）作動液（１：１００００希釈）を加え、１００μＬ／ウェルで室温で振とうしながら１．０時間インキュベートし、更にプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２９）を加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させた後にマイクロプレートリーダー（ＭＤ ｉ３Ｘ）で吸光値を読み取った。抗体濃度を横座標、対応するＯＤ値を縦座標として抗体の阻害曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値が小さいほど、抗体がヒトＰＶＲＬ２に対するヒトＰＶＲＩＧの結合を阻害する能力が強かった。陽性対照抗体及び陰性対照抗体は実施例８と同じであった。１３個の試験抗体のブロック曲線は図２８に示され、阻害活性は表２６に示された。図２８及び表２６から、全ての試験抗体は何れも、ヒトＰＶＲＬ２タンパク質に対するヒトＰＶＲＩＧの結合を顕著に阻害できることが分かった。
実施例１２ 抗ＰＶＲＩＧ抗体がヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に対するＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞の結合をブロックすることに対するＦＡＣＳによる検出
ヒトＣＤ１１２高発現プラスミドがトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２として命名される）を取り、ヒトＣＤ１１２全長プラスミドは、一般的生物から合成され（ＮＰ＿００１０３６１８９．１／ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：Ｑ９２６９２）、細胞密度が８０％未満である場合に実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄して１ｍＬのトリプシン（Ｇｉｂｉｃｏ、２５２００－７２）を加えて２分間消化し、１０％のＦＢＳを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｉｃｏ、２１１２７－０２２）完全培地で消化を停止した後、細胞懸濁液とした。細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でカウントした後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、死生細胞染料Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）で染色し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート終了後、染色緩衝液（２％のＦＢＳ＋ＰＢＳ）で染色を停止し、３５０×ｇで遠心分離上清を除去し、細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、使用に備えた。９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、使用に備えた。染色緩衝液を使用して、濃度を１μｇ／ｍＬ（４倍濃度）とするようにヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質（Ａｃｒｏ、ＰＶＧ－Ｈ５２５３）作動液を調製し、５０μＬ／ウェルでＰＶＲＩＧ－ｍＦｃ作動液を９６ウェルプレートに加えた。染色緩衝液を使用して抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）から３倍勾配希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬのＰＶＲＩＧ－ｍＦｃを含むウェルに加え、マイクロウェルプレートシェーカーにおいて４００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体とＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質とを十分に混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、１００μＬ／ウェルで上記の準備した細胞懸濁液を直接加え、ピペットヘッドで軽く均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色緩衝液２００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。染色緩衝液でＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５３３７）を２５０倍希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で洗浄した細胞ウェルに加え、均一に混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色緩衝液で２回洗浄し、最後に２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターによりオンマシンでシグナルを検出した（ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ）。蛍光シグナルが弱いほど、抗体の、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞がＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に結合する競合能力が強いことを示した。抗体濃度を横座標、対応する平均蛍光強度ＭＦＩの倍数を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、抗体のＩＣ５０値及び結合曲線ＡＵＣ値を算出した。ＩＣ５０値及びＡＵＣ値が小さいほど、抗体の、ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞がＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に結合する競合能力が強く、即ち抗体のブロック効果が高いことを示した。図２９に示すように、全ての試験抗体は何れも、ヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に対するＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞の結合をブロックすることができる。試験抗体の競合ブロック活性は、対照分子ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１抗体に対する百分率で正規化され、百分率値が小さいほど、抗体のブロック活性が強いことを示した。表２７の結果は、試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１、Ａ１５、Ａ３０、Ａ５０のブロック活性が何れもＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１より強いことを示した。
実施例１３ ＮＫ細胞表面ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴ、腫瘍細胞株Ｒｅｈ並びにＷＩＤＲ細胞表面ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現の検出
ＦＡＣＳによりＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）でのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴの発現を検出した。実験方法は実施例４（ｅ）を参照し、結果は図９Ａに示され、異なる供与体ｄｏｎｏｒ－０１０及びｄｏｎｏｒ－０５０のＮＫ細胞表面に何れもＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＴＩが発現された。
ＦＡＣＳによりＲｅｈ／ＷＩＤＲ細胞でのＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現を検出した。実験方法は実施例４（ｅ）を参照し、そのうちＲｅｈを均一に直接吹きかけて細胞懸濁液とした。ＷＩＤＲ細胞表面のＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現は図９Ｂに示された。図３０は、Ｒｅｈ細胞表面のＰＶＲ発現が陰性、ＰＶＲＬ２発現が陽性であることを示した。
実施例１４ ＮＫ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の機能促進作用へのＮＫ細胞脱顆粒実験による検出
ＦＡＣＳによりＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）ＣＤ１０７ａのシグナルを検出することで、ＮＫ細胞脱顆粒プロセスに対する試験抗体の影響を示した。実験方法は実施例４（ｆ）を参照し、そのうち、Ｒｅｈ細胞を均一に直接混合し、細胞懸濁液とした。図３１は、陰性対照ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１がＮＫ細胞のＣＤ１０７ａに影響を与えず、１２個のＰＶＲＩＧ試験抗体並びに対照抗体ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１が何れも、異なる程度でＮＫ細胞ＣＤ１０７ａの発現を向上できることを示し、これは、試験抗体と対照抗体の両方がＮＫ細胞の活性化を効果的に促進できることを示した。
実施例１５ 腫瘍細胞株に対するＰＶＲＩＧ抗体媒介性ＮＫ細胞の殺傷作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出
ＦＡＣＳにより標的細胞（ＷＩＤＲ）の分解レベルを検出することで、ＮＫ細胞殺傷機能に対する試験抗体の影響を反映した。実験方法は実施例４（ｇ）を参照した。図３２は、陰性対照ａｎｔｉ－ＨＡ ＨｃＡｂ－ｈＩｇＧ１がＮＫ殺傷に影響を与えず、１３個の試験抗体が何れも、標的細胞ＷＩＤＲに対するＮＫの殺傷を効果的に促進でき、そしてＰＶＲＩＧ－Ａ３５及びＡ４３に加えて、ＷＩＤＲ細胞に対する残りの１１個の試験抗体の殺傷促進機能が何れも対照抗体ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１よりも高く、又はそれと同等であることを示した。
実施例１６ 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の機能改善作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙによる検出
Ａｎｔｉ－ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒのＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチドにより誘導されたＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８Ｔをエフェクター細胞とし、ｐｐ６５ ｐｕｌｓｅｄ後のｃｏｌｏ２０５腫瘍細胞株を標的細胞とした実験系において、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ抗体の機能改善作用を検出した。
ＣＭＶ ＩｇＧ＋ＰＢＭＣを蘇生し、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ－２８３２８）、２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＩＬ－２０２）、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％のＡＢ ｓｅｒｕｍ＋１％のＰ／Ｓ＋（１×）２－βメルカプトエタノール）で２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６日間培養した。６日目に、全ての細胞を収集し、培地中のｐｐ６５ポリペプチド及びＩＬ－７を除去し、細胞を二分し、そして１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、培養を２日間続けた。８日目に、全ての細胞を収集し、１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、そして細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、培養を続けた。１１日目に、全ての細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣにおけるＣＤ８ Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８ Ｔの割合及び当該細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現を検出した。図３３のＡ、Ｂに示すように、ｐｐ６５誘導後、ＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８ Ｔの割合が８０％を超え、図３３のＢに示すように、ｐｐ６５＋ＣＤ８＋Ｔ（ｄｏｎｏｒ０２１）が異なるレベルのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びＣＤ２２６を発現した。フローサイトメトリー検出抗体は、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）、ＣＤ８－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（ＢＤ、カタログ番号５６５３１０）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１６）、Ｔ－ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＣＭＶ ｐｐ６５ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１０－１Ｃ）、ＰＶＲＩＧ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ９３６５１Ｇ－１００ＵＧ）、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２７０６）、ＰＤ－１－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６２５１６）であった。
上記誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８ Ｔ選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８ Ｔはエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖで再懸濁させて細胞密度を０．４×１０６／ｍＬに調整した。選別後のＣＤ８ Ｔ純度及びＣＤ２２６の発現を検出した。Ｃｏｌｏ２０５は標的細胞とし、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、２０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させ、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間処理し、次に２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞をＡＩＭ－Ｖで０．５×１０６／ｍＬに再懸濁させ、Ｃｏｌｏ２０５細胞でのＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＨＬＡ－Ａ２高発現のフローサイトメトリーによる検出は図３３のＣに示される通りである。抗ＰＶＲＩＧ抗体又は陰性対照をＡＩＭ－Ｖで２８０ｎＭに希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８ Ｔ、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５細胞を順に加え、そしてピペットで軽く均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした。この系における薬物最終濃度は７０ｎＭ、ＣＤ８ Ｔは２００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５細胞は５００００／ウェルであった。インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。この系における陽性対照はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４、ＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔであった。図３３のＤに示すように、ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比べて、大部分の試験ＰＶＲＩＧ抗体が作用した後、細胞上清中のＩＦＮ－γ分泌が顕著に増加した。
選別後、ＣＤ８ Ｔの純度及びそのＣＤ２２６で発現したフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５３６６）、ＣＤ２２６－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３８３１６）であった。Ｃｏｌｏ２０５細胞ＰＶＲＬ２、ＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ２発現のフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＰＶＲＬ２－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７４１２）、ＰＶＲ－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７６１２）、ＰＤ－Ｌ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ番号５５８０１７）、ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４３３０６）であった。
実施例１７ アルパカ抗ヒトＰＶＲＩＧ抗体のヒト化
ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重軽鎖可変領域生殖系遺伝子データベースをアライメントすることによって、アルパカ抗体との相同性が高い重鎖可変領域生殖系遺伝子をテンプレートとしてそれぞれスクリーニングし、アルパカ抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれ移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という順番の可変領域配列を形成した。必要に応じて、元の親和性を確保するために、フレームワーク配列における主要アミノ酸を、アルパカ抗体に対応するアミノ酸に回復変異させて、ヒト化抗ＰＶＲＩＧモノクローナル抗体を得た。
１、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０のヒト化
アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０のヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－２３＊０４及びＩＧＨＪ３＊０１であり、アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得し、そのうち、抗体ＣＤＲアミノ酸は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定され、注釈が付けられた。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をアルパカ抗体に対応するアミノ酸に回復変異させた。ＰＶＲＩＧ－Ａ５０抗体に存在する化学修飾を受けやすい部位ＮＧ及びグリコシル化部位ＮＬＳに対して、発明者らは、修飾のリスクを排除するためにＮＧ／ＮＬＳを点変異させた。具体的な設計は表２８に示される通りである。
ＰＶＲＩＧ－Ａ５０ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
Ａ５０．ＶＨ１（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１）アミノ酸配列は配列番号１９８に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＮＧＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＮＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ１ａ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ａ）アミノ酸配列は配列番号１９９に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＤＧＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＮＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ１ｂ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ）アミノ酸配列は配列番号２００に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＤＧＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＳＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ１ｃ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｃ）アミノ酸配列は配列番号２０１に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＤＧＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＮＬＡＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ１ｄ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｄ）アミノ酸配列は配列番号２０２に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＮＧＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＳＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ１ｅ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｅ）アミノ酸配列は配列番号２０３に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＮＡＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＳＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ５０．ＶＨ２ａ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ２ａ）アミノ酸配列は配列番号２０４に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＹＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＮＳＮＡＧＲＴＳＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＴＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＥＧＤＰＨＮＦＧＬＥＳＬＳＬＲＤＦＧＳＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ３－２３＊０４アミノ酸配列は配列番号２０５に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ３＊０１アミノ酸配列は配列番号２０６に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、上記７個のヒト化抗体ＶＨ配列の分析結果は表２９に示される通りである。
２、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５のヒト化
アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５のヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－７＊０１及びＩＧＨＪ３＊０１であり、アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得し、そのうち、抗体ＣＤＲアミノ酸はＩＭＧＴ番号付けシステムによって決定され、注釈が付けられた。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をアルパカ抗体に対応するアミノ酸に回復変異させた。ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５抗体には２つの遊離システインが存在し、抗体の安定性を向上させるために、発明者らはＣｙｓを点変異させた。具体的な設計は表３０に示される通りである。
ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
Ａ１０５．ＶＨ１（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１）アミノ酸配列は配列番号２１１に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＣＳＥＶＤＣＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１０５．ＶＨ２（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ２）アミノ酸配列は配列番号２１２に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＣＳＥＶＤＣＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１０５．ＶＨ３（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ３）アミノ酸配列は配列番号２１３に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＣＳＥＶＤＣＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１０５．ＶＨ４（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ４）アミノ酸配列は配列番号２１４に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＳＨＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＣＳＥＶＤＣＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１０５．ＶＨ５（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ５）アミノ酸配列は配列番号２１５に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＣＳＥＶＤＣＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＩＱＶＴＶＳＳ
Ａ１０５．ＶＨ３ａ（ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ３ａ）アミノ酸配列は配列番号２１６に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＤＲＨＴＭＴＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＡＳＲＩＰＧＤＴＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＴＳＡＹＳＳＥＶＤＳＹＥＫＧＳＷＹＤＮＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ３－７＊０１アミノ酸配列は配列番号２１７に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ３＊０１アミノ酸配列は配列番号２０６に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って、上記６個のヒト化抗体ＶＨ配列の分析結果は表３１に示される通りである。
３、ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８のヒト化
アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８のヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－７＊０１及びＩＧＨＪ３＊０１であり、アルパカ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８のＣＤＲをそのヒトテンプレートにそれぞれ移植し、対応するヒト化バージョンを取得し、そのうち、抗体ＣＤＲアミノ酸はＩＭＧＴ番号付けシステムによって決定され、注釈が付けられた。必要に応じて、元の親和性を確保するために、ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８のヒト化抗体のＦＲ領域配列における主要アミノ酸をアルパカ抗体に対応するアミノ酸に回復変異させた。具体的な設計は表３２に示される通りである。
ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８ヒト化抗体可変領域の具体的な配列は以下の通りである。
Ａ１１８．ＶＨ１（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ１）アミノ酸配列は配列番号２１９に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ２（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ２）アミノ酸配列は配列番号２２０に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ３（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ３）アミノ酸配列は配列番号２２１に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ４（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ４）アミノ酸配列は配列番号２２２に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＤＡＫＮＳＬＳＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ５（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ５）アミノ酸配列は配列番号２２３に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＤＡＫＮＳＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ６（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ６）アミノ酸配列は配列番号２２４に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＩＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
Ａ１１８．ＶＨ７（ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ７）アミノ酸配列は配列番号２２５に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＥＴＹＦＤＬＹＶＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＤＲＥＬＶＡＴＩＴＹＴＧＳＩＫＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＧＤＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＦＣＮＡＤＰＳＧＬＧＲＫＶＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ３－７＊０１アミノ酸配列は配列番号２１７に示される通りである。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＷＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＫＱＤＧＳＥＫＹＹＶＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ３＊０１アミノ酸配列は配列番号２０６に示される通りである。
ＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って、上記７個のヒト化抗体ＶＨ配列の分析結果は表３３に示される通りである。
実施例１８ ヒト及びカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の特異的結合のＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートに０．５μｇ／ｍＬのヒトＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）又はカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ０９Ｂ）が１００μＬ／ウェルで予めコーティングされ、試験抗ＰＶＲＩＧヒト化抗体を勾配希釈し（開始濃度３ｎＭ、３倍勾配希釈）、１００μＬ／ウェルでサンプルを加え、室温で振とうしながら１．５時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、マウス抗ヒト（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号２０９－０３５－０９８）作動液（１：１００００希釈）を加え、１００μＬ／ウェルでサンプルを加え、室温で振とうしながら１．０時間インキュベートし、更にプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２９）を加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させた後にマイクロプレートリーダー（ＭＤ ｉ３ｘ）で吸光値を読み取った。抗体濃度を横座標、対応するＯＤ値を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト／カニクイザルＰＶＲＩＧに結合する能力が強い。ヒト化抗体の結合効果は何れも、その対応するヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体で正規化され、百分率値が１００％より高い場合、ヒト化抗体の結合効果がｐａｒｅｎｔａｌ抗体より優れることを示した。図３４Ａ、図３４Ｂ及び表３４に示すように、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５、及びＰＶＲＩＧ－Ａ１１８の大部分のヒト化抗体は何れも、ヒト／カニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に特異的に結合する。
実施例１９ ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧ、及びＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞表面カニクイザルＰＶＲＩＧに対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の結合のＦＡＣＳ検出
実験方法は実施例９を参照した。算出したＡＵＣ値が大きいほど、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｈｕｍａｎ／ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ細胞に対するヒト化抗体の結合能力が強いことを示した。図３５Ａに示すように、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ＰＶＲＩＧ細胞表面ヒトＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５及びＡ１１８の大部分のヒト化分子の結合は、そのｐａｒｅｎｔａｌ抗体に対する結合能力と同等である。図３５Ｂは、カニクイザルＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８ヒト化分子の結合が対応するｐａｒｅｎｔａｌ抗体より顕著に低いことを除いて、カニクイザルＰＶＲＩＧに対する試験抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、Ａ１０５の大部分のヒト化分子の結合が比較的良好であり、且つそのｐａｒｅｎｔａｌ抗体に対する結合能力と同等であることを示した。ヒト化抗体の結合活性は、対照分子ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１抗体に対する百分率に正規化され、表３５に示すように、百分率値が高いほど、抗体結合の活性が強いことを示した。
実施例２０ ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体の親和性へのＢＩＡｃｏｒｅ検出
実験方法は実施例１０を参照した。表３６の結果から、全ての試験ＰＶＲＩＧヒト化抗体とヒトＰＶＲＩＧタンパク質との間に特異的結合が存在し、且つ親和性レベルが比較的高いことが分かった。
実施例２１ 抗ＰＶＲＩＧヒト化抗体がＰＶＲＩＧのＰＶＲＬ２への結合をブロックすることに対するＥＬＩＳＡ検出
実験方法は実施例１１を参照した。ヒト化抗体の阻害効果は何れも、その対応するヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体で正規化され、百分率値が１００％より高い場合、ヒト化抗体阻害の効果がｐａｒｅｎｔａｌ抗体より優れることを示した。ヒト化抗体のブロック曲線は図３６に示され、阻害活性は表３７に示された。図３６及び表３７に示すように、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５及びＰＶＲＩＧ－Ａ１１８の大部分のヒト化抗体は何れも、ヒトＰＶＲＬ２に対するヒトＰＶＲＩＧの結合を顕著に阻害できる。
実施例２２ ＰＶＲＩＧヒト化抗体がＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞のヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質への結合をブロックすることに対するＦＡＣＳ検出
実験方法は実施例１２を参照した。実験結果は図３７に示され、大部分のヒト化抗体はＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２細胞のヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質への結合をブロックすることができる。ヒト化抗体のブロック活性は、対照分子ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１及びＳＲＦ８１３－ｈＩｇＧ１抗体に対する百分率で正規化され、百分率値が小さいほど、抗体のブロック効果が高いことを示した。
実施例２３ 腫瘍細胞株に対するＰＶＲＩＧヒト化抗体媒介性ＮＫ細胞の殺傷作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出
実験方法は実施例４（ｇ）を参照した。実験結果は、図３８における全てのヒト化抗体が何れも、異なる程度で標的細胞に対するＮＫ細胞の殺傷を促進できることを示した。そのうち、図３８のＡは、７個のヒト化抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ２ａの、ＮＫ細胞の標的細胞への殺傷促進作用がヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０と同等であることを示し、図３８のＢは、７個のヒト化抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８－Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６の、ＮＫ細胞の標的細胞への殺傷促進作用がヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１１８と同等であることを示し、図３８のＣは、５個のヒト化抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３の、ＮＫ細胞の標的細胞への殺傷促進作用がヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５と同等であることを示した。
実施例２４ 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧヒト化抗体の機能改善作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙ検出
ＰＢＭＣを蘇生し、１ｍｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ－２８３２８）、２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＩＬ－２０２）、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）を用含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％のＡＢ ｓｅｒｕｍ＋１％のＰ／Ｓ＋１×２－βメルカプトエタノール）で２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６日間培養した。６日目に、全ての細胞を収集し、培地中のｐｐ６５及びＩＬ－７を除去し、細胞を二分し、そして１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、培養を２日間続けた。８日目に、全ての細胞を収集し、１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、そして細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整した。１１日目に、全ての細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＰＢＭＣにおけるＣＤ８ Ｔ細胞の割合、ＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８ Ｔの割合（図２４のＡ）及び当該細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現レベル（図２４のＢ）を検出した。フローサイトメトリー検出抗体は、Ｌｉｖｅｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）、ＣＤ８－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（ＢＤ、カタログ番号５６５３１０）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１６）、Ｔ－ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＣＭＶ ｐｐ６５ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１０－１Ｃ）、ＰＶＲＩＧ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ９３６５１Ｇ－１００ＵＧ）、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２７０６）、ＰＤ－１－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６２５１６）であった。
上記誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８ Ｔ細胞選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８ Ｔ細胞はエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖで再懸濁させて細胞密度を０．４×１０６／ｍＬに調整した。選別後のＣＤ８ Ｔ細胞純度及びＣＤ２２６の発現を検出した。Ｃｏｌｏ２０５は標的細胞とし、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、２０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させ、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間処理し、２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。細胞をＡＩＭ－Ｖ培地で０．５×１０６／ｍＬに再懸濁させた。ＰＶＲＩＧヒト化抗体又は陰性対照抗体をＡＩＭ－Ｖ培地で２８０ｎＭに希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８ Ｔ、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５細胞を順に加え、均一に混合した後、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした。この系における薬物最終濃度は７０ｎＭ、ＣＤ８ Ｔは２００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５は５００００／ウェルであった。インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。この系におけるの陽性対照はＰＶＲＩＧヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔであった。図３９に示すように、ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ群と比べて、ＰＶＲＩＧヒト化抗体は、細胞上清中のＩＦＮ－γのレベルを顕著に増加できる。試験抗体において、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ２の作用効果がＰＶＲＩＧ－Ａ１０５より顕著に低い（＊ｐ＜０．０５、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）ことを除いて、残りのヒト化抗体はそれぞれのヒト化前のｐａｒｅｎｔａｌ抗体と統計学的に有意差がなかった（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ）。選別後のＣＤ８ Ｔ純度及びＣＤ２２６発現のフローサイトメトリー検出抗体情報は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５３６６）、ＣＤ２２６－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３８３１６）であった。Ｃｏｌｏ２０５におけるＰＶＲＬ２、ＰＶＲ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ａ２発現のフローサイトメトリー検出抗体情報は、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＰＶＲＬ２－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７４１２）、ＰＶＲ－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３３７６１２）、ＰＤ－Ｌ１－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ、カタログ番号５５８０１７）、ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３４３３０６）であった。
実施例２５ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体構築体の設計
２つの抗ＰＶＲＩＧヒト化ＶＨＨ抗体（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１）及び２つの抗ＴＩＧＩＴヒト化モノクローナル抗体（ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３、ＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ）に対して、Ｇ４Ｓリンカーペプチドで抗ＰＶＲＩＧヒト化ＶＨＨ抗体を抗ＴＩＧＩＴヒト化抗体重鎖のＮ末端に連結し、それぞれＬＣ－ＢｓＡｂ－００２、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００９及びＬＣ－ＢｓＡｂ－０１０と命名された抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体（図４０）を生成した。表３９は、４種類の二重特異性抗体重鎖融合ポリペプチド（ＨＣ）及び軽鎖ポリペプチド（ＬＣ）の配列を示した。
二重抗体を構築すると同時に、陽性対照抗体を構築し、そのうち、抗ＴＩＧＩＴ陽性対照抗体はロッシュのＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１、抗ＰＶＲＩＧ陽性対照抗体はＣｏｍｐｕｇｅｎのＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４であり、対応するアミノ酸配列は上記を参照した。
実施例２６ ヒト及びカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の特異的結合のＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートに１．０μｇ／ｍＬのヒトＰＶＲＩＧ（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）又は０．５μｇ／ｍＬのカニクイザルＰＶＲＩＧ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、カタログ番号Ｃ０９Ｂ）が５０μＬ／ウェルで予めコーティングされ、試験抗体を勾配希釈し（開始濃度１３ｎＭ、３倍勾配希釈、１２濃度点）、５０μＬ／ウェルでサンプルを加え、３７℃で２．０時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ヒツジ抗ヒト（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＡＰ１１３Ｐ））作動液（１：５０００希釈）を加え、５０μＬ／ウェルでサンプルを加え、３７℃で１．０時間インキュベートし、更にプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（ＫＰＬ、カタログ番号５１２０－００７７）を加えて３７℃で１０ｍｉｎ発色させ、停止液を加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＰＥ、Ｅｎｓｉｇｈｔ－ＨＨ３４００）で吸光値を読み取った。抗体モル濃度を横座標、対応するＯＤ値を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧに結合する能力が強いことを示した。陽性対照抗体はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１であり、陰性対照抗体はａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１（ｉｎｈｏｕｓｅ）であった。ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対する４個のヒト化二重抗体の結合結果は図４１及び表４０、４１に示され、カニクイザルＰＶＲＩＧに対する結合結果は図４２及び表４０、４１に示された。データは、４個のヒト化二重抗体が何れも、ヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に特異的に結合できることを示した。ヒトＰＶＲＩＧタンパク質に対するＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の結合は、その対応するモノクローナルＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ及び陽性対照ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１と比べて僅かに弱く、ヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧタンパク質に対するＬＣ－ＢｓＡｂ－００９及びＬＣ－ＢｓＡｂ－０１０の結合は何れも、そのモノクローナルＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１と基本的に同等であり、そして陽性対照ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１より優れた。
実施例２７ ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の特異的結合のＥＬＩＳＡ検出
ＥＬＩＳＡプレートに４．０μｇ／ｍＬのヒツジ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１１５－００６－０７１）が５０μＬ／ウェルで予めコーティングされ、密封洗浄後、３０ｎｇ／ｍＬのヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）又はカニクイザルＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）を５０μＬ／ウェルで加え、３７℃で２時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、５０μＬ／ウェルで勾配希釈した試験抗体（開始濃度１３ｎＭ、３倍勾配希釈、１２濃度点）を加え、３７℃で２．０時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号ＡＰ１１３Ｐ））作動液（１：５０００希釈）を加え、５０μＬ／ウェルでサンプルを加え、３７℃で１．０時間インキュベートし、更にプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質ＴＭＢ（ＫＰＬ、カタログ番号５１２０－００７７）を加えて発色させ、停止液を加えて反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＰＥ、Ｅｎｓｉｇｈｔ－ＨＨ３４００）で吸光値を読み取った。抗体モル濃度を横座標、対応するＯＤ値を縦座標として抗体の結合曲線をプロットし、４パラメータフィッティング（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９）を行い、ＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が小さいほど、抗体がヒト又はカニクイザルＴＩＧＩＴに結合する能力が強いことを示した。陽性対照抗体はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３及びＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ、陰性対照抗体はａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）であった。ヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対する４個のヒト化二重抗体の結合結果は図４３及び表４２、４３に示され、カニクイザルＴＩＧＩＴに対する結合結果は図４４及び表４２、４３に示された。データは、４個のヒト化二重抗体が何れも、ヒト又はカニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に特異的に結合できることを示した。そのうち、ヒトＴＩＧＩＴタンパク質に対するＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及び００９の結合は陽性対照ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１より優れ、その対応するモノクローナルＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３と同等であり、カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対する結合において、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００９は、その対応するモノクローナルＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３及び陽性対照ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１と基本的に同等であり、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２は、対応するモノクローナル及び陽性対照より僅かに弱かった。ヒトＴＩＧＩＴタンパク質／カニクイザルＴＩＧＩＴタンパク質に対するＬＣ－ＢｓＡｂ－００６及び０１０の結合は何れも、その対応するモノクローナルＴＩＧＩＴ－００５－Ｈ２Ｌ１ｄ及び陽性対照ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１より優れた。
実施例２８ ＦｌｐｉｎＣＨＯヒトＰＶＲＩＧ及びＦｌｐｉｎＣＨＯカニクイザルＰＶＲＩＧに対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳ検出
ヒト又はカニクイザルＰＶＲＩＧ高発現プラスミドがトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－６１ＴＭ）を取り、それぞれＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｈＰＶＲＩＧ、ＦｌｐｉｎＣＨＯ－ｃｙｎｏ ＰＶＲＩＧ、ヒトＰＶＲＩＧ全長プラスミド（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＮＰ＿０７６９７５）、及びカニクイザルＰＶＲＩＧ全長プラスミド（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：ＸＰ＿０１４９８９９４１）として命名され、何れも一般的生物から合成され、細胞密度が８０％未満である場合に実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄して１ｍＬのＶｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｉｃｏ、１５０４０－０６６）を加えて８～１０分間消化し、１０％のＦＢＳを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｉｃｏ、２１１２７－０２２）完全培地で消化を停止した後、細胞懸濁液とした。カウント後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、死生細胞染料Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）で染色し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート終了後、染色緩衝液（２％のＦＢＳ＋ＰＢＳ）で染色を停止し、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で細胞を２×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、使用に備えた。染色緩衝液を使用して抗体を最大濃度４６ｎＭ（２倍濃度）から３．３倍勾配希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬの細胞懸濁液を含むウェルに加え、マイクロウェルプレートシェーカーに置いて４００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体と細胞とを十分に混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色緩衝液２００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。ＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２－４９９８－８２）を染色緩衝液で２５０倍希釈し、洗浄した細胞ウェルに１００μＬ／ウェルの体積で加え、均一に混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色緩衝液で２回洗浄し、最後に２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターによりオンマシンでシグナルを検出し（ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ）、シグナルが強いほど、ＰＶＲＩＧに対する抗体の結合能力が強いことを示した。図４５は、４個のヒト化二重抗体が何れも、優れたヒトＰＶＲＩＧ結合活性を有し、カニクイザルＰＶＲＩＧに良好に結合することもでき（図４６）、且つ何れもその対応する抗ＰＶＲＩＧヒト化モノクローナルより優れたことを示した。
実施例２９ ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴ（高／中／低発現株）及びＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳ検出
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／５０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで抗体を８０ｎＭに希釈し、１２濃度点に３倍連続勾配希釈し、５０μＬの細胞と５０μＬの抗体希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（１：８００）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０８８）を加え、１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。４個のヒト化二重抗体は、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴ（高／中／低発現株、図４７、４８、４９）及びＣＨＯ－Ｋ１カニクイザルＴＩＧＩＴ細胞に対して、何れも良好な結合活性を有した（図５０）。
実施例３０ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体がＰＶＲＩＧタンパク質とＰＶＲＬ２タンパク質との相互作用をブロックすることに対するＨＴＲＦ法による検出
ＰＶＲＩＧ－ｍＦｃ（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＰＶＧ－Ｈ５２５３）及びＢｉｏ－ＣＤ１１２－Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０００５－Ｈ０８Ｈ）を０．５μｇ／ｍＬにそれぞれ希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｔｂ ｃｒｙｐｔａｔｅ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号）及びＰＡｂ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号）を２０μｇ／ｍＬ及び０．８μｇ／ｍＬにそれぞれ希釈した。試験待ち抗体の開始濃度は１２０ｎＭ、３倍勾配希釈し、合計１２濃度点であった。上記希釈したＰＶＲＩＧ－ｍＦｃ、Ｂｉｏ－ＣＤ１１２－Ｈｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｔｂ Ｃｒｙｔａｔｅ及びＰＡｂ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ－ＸＬ６６５を１：１：１：１で混合し、１０μＬ／ウェルで３８４ウェルプレート（ＰＥ、カタログ番号６００７２９９）に加え、その後、１０μＬ／ウェルで勾配希釈した試験待ち抗体を加え、１５００ｒｐｍで３０ｓ遠心分離し、３７℃で１ｈインキュベートし、マイクロプレートリーダー（ＰＥ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）で、波長６６５ｎｍ及び６２０ｎｍで読み取った。式Ｒａｔｉｏ＝Ｓｉｇｎａｌ ６６５ｎｍ／Ｓｉｇｎａｌ ６２０ｎｍ×１０４に従ってデータ換算を行った。抗体のモル濃度を横座標、Ｒａｔｉｏを縦座標として４パラメータフィッティングを行い、ＩＣ５０を算出した。ＩＣ５０が小さいほど、ＰＶＲＬ２に対するＰＶＲＩＧの結合への抗体のブロック効果が高いことを示した。この実験における陽性対照はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、ＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１、陰性対照抗体はａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１（ｉｎ ｈｏｕｓｅ）であった。ＰＶＲＩＧ－ＰＶＲＬ２結合に対する４個のヒト化二重抗体のブロック効果は図５１及び表４４、４５に示される通りである。データは、４個のヒト化二重抗体が何れも、ＰＶＲＬ２タンパク質に対するヒトＰＶＲＩＧの結合をブロックできることを示した。そのうち、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２のブロック効果は何れも、その対応するモノクローナルＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ及び陽性対照ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１より優れ、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６のブロック効果は、その対応するモノクローナルＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂより優れているが、陽性対照ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１より僅かに低く、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００９及びＬＣ－ＢｓＡｂ－０１０のブロック効果は何れも、その対応するモノクローナルＰＶＲＩＧ－Ａ１０５－Ｈ１及び陽性対照ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ１より低かった。
実施例３１ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体がＣＨＯ－Ｋ１ヒトＣＤ１１２細胞のヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質への結合をブロックすることに対するＦＡＣＳ検出
ヒトＣＤ１１２高発現プラスミドがトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｋ１安定細胞（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２として命名される）を取り、ヒトＣＤ１１２全長プラスミドは、一般的生物から合成され（ＮＰ＿００１０３６１８９．１／ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ：Ｑ９２６９２）、細胞密度が８０％未満である場合に実験を行った。細胞培地を捨て、ＰＢＳで洗浄して１ｍＬのトリプシン（Ｇｉｂｉｃｏ、２５２００－７２）を加えて２分間消化し、１０％のＦＢＳを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｉｃｏ、２１１２７－０２２）完全培地で消化を停止した後、細胞懸濁液とした。細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でカウントした後、適量の細胞懸濁液を取り、３５０×ｇで遠心分離して上清を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、死生細胞染料Ｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）で染色し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート終了後、染色緩衝液（２％のＦＢＳ＋ＰＢＳ）で染色を停止し、３５０×ｇで遠心分離上清を除去し、細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で細胞を１×１０６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、使用に備えた。９６ウェルプレートに播種し、各ウェルに５０μＬの細胞懸濁液を加え、使用に備えた。染色緩衝液を使用して、濃度を１μｇ／ｍＬ（４倍濃度）とするようにヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質（Ａｃｒｏ、ＰＶＧ－Ｈ５２５３）作動液を調製し、５０μＬ／ウェルでＰＶＲＩＧ－ｍＦｃ作動液を９６ウェルプレートに加えた。染色緩衝液を使用して抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）から３倍勾配希釈し、希釈した抗体を既に５０μＬのＰＶＲＩＧ－ｍＦｃを含むウェルに加え、マイクロウェルプレートシェーカーにおいて４００ｒｐｍで１分間振とうし、抗体とＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質とを十分に混合し、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、１００μＬ／ウェルで上記の準備した細胞懸濁液を直接加え、ピペットヘッドで軽く均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞を染色緩衝液２００μＬ／ウェルで２回洗浄し、３５０×ｇで５分間遠心分離して上清を捨てた。染色緩衝液でＰＥ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５３３７）を２５０倍希釈し、１００μＬ／ウェルの体積で洗浄した細胞ウェルに加え、均一に混合し、４℃で３０分間染色した。染色終了後、同様に染色緩衝液で２回洗浄し、最後に２００μＬの染色緩衝液で細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターによりオンマシンでシグナルを検出した（ＢＤ ＣａｎｔｏＩＩ）。蛍光シグナルが弱いほど、抗体がＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質に対するＣＨＯ－Ｋ１ヒトＣＤ１１２細胞の結合をブロックする能力が強いことを示した。図５２は、４個のヒト化二重抗体が何れも、ＣＨＯ－Ｋ１ヒトＣＤ１１２細胞のヒトＰＶＲＩＧ－ｍＦｃタンパク質への結合をブロックできることを示した。
実施例３２ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体がＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５に対するヒトＴＩＧＩＴの結合活性をブロックすることに対するＥＬＩＳＡ法による検出
実施例２で構築されたＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５細胞を収集し、１０％のＦＢＳ－ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｅｘｃｅｌｌ、ＦＳＰ５００； Ｇｉｂｃｏ、１１３３０）で濃度を５×１０５／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）に加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養し、培養上清を振り落とし、細胞固定液（碧雲天、Ｐ００９８）を加え、５０μＬ／ウェルで室温で１時間固定し、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで１回洗浄し、５％の脱脂粉乳－ＰＢＳを加え、２５０μＬ／ウェルで３７℃で２～４時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、ヒトＴＩＧＩＴ ＥＣＤ－ｍＦｃ（作業濃度１００ｎｇ／ｍＬ）とサンプルとを混合し、０．５時間インキュベートし、次に抗原抗体混合液を細胞プレートに加え、５０μＬ／ウェルで３７℃で１．５～２時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、１：５０００の希釈比率で１％のＢＳＡ（生工生物、Ａ５０００２３－０１００）－ＰＢＳでＨＲＰ酵素標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－００３）を希釈し、細胞プレートに加え、５０μＬ／ウェルで３７℃で１時間インキュベートし、プレート洗浄機において０．０５％のＴｗｅｅｎ２０－ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ発色溶液（ＫＰＬ、５２－００－０３）を加え、５０μＬ／ウェルで３７℃で１０分間インキュベートし、５０μＬ／ウェルで１ＭのＨＣＬを加え、反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ ＨＴ）でＯＤ４５０ｎｍを読み取った。図５３は、４個のヒト化二重抗体が何れも、ＣＨＯ－Ｋ１ ＣＤ１５５に対するヒトＴＩＧＩＴＮの結合をブロックできることを示した。
実施例３３ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体がＣＨＯ－Ｋ１ヒトＴＩＧＩＴに対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓの結合活性をブロックすることに対するＦＡＣＳ法による検出
細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／４０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで抗体を２１０ｎＭに希釈し、１２濃度点に３倍連続勾配希釈し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ（義翹神州、１０１０９－Ｈ０８Ｈ）を３μｇ／ｍＬに希釈し、次に４０μＬの細胞と４０μＬの抗体希釈液及び４０μＬのＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓ希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、ＡＰＣで標識されたストレプトアビジン（作業希釈比率１：１７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５２４３）を加え、１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、４℃で４０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図５４は、４個のヒト化二重抗体が何れも、ＣＨＯ－Ｋ１ ヒトＴＩＧＩＴに対するＢｉｏ－ＣＤ１５５－Ｈｉｓの結合をブロックできることを示した。
実施例３４ ヒトＰＢＭＣに対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の結合活性のＦＡＣＳ法による検出
新鮮なヒトＰＢＭＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、ＰＢ００４－Ｃ）を取り、細胞を５×１０５／ｍＬに調整し、同時にＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、ＡＴ１０１）を１００ｎｇ／ｍＬに加え、３７℃、５％のＣＯ２で３日間培養し、３日後に細胞を収集し、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６）で１回洗浄し、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ、５６４２２０）を加え、４℃で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳで２×１０５／５０μＬに再懸濁させ、１％のＢＳＡ－ＰＢＳでヒト化抗体を８０ｎＭに希釈し、１２濃度点に３倍連続勾配希釈し、５０μＬの細胞と５０μＬの抗体希釈液とを混合し、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７フルオレセインで標識された二次抗体（作業希釈比率１：８００、Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０８８）を加え、１００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、４℃で６０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡ－ＰＢＳ、１００μＬ／ウェルで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃａｎｔｏ ＩＩ）で細胞サンプルを分析した。図５５は、４個のヒト化二重抗体がヒトＰＢＭＣに対して、何れも良好な結合活性を有することを示した。
実施例３５ ヒト、カニクイザル及びマウスＴＩＧＩＴ並びにＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の親和性へのＢＩＡｃｏｒｅ検出
この実験は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップを使用し、飽和結合抗原Ｒｍａｘが５０ＲＵとなるように、チップが希釈された抗体を捕捉するのに必要な時間をマニュアル操作（ｍａｎｕａｌ ｒｕｎ）で測定した。ヒト、カニクイザル及びマウスＴＩＧＩＴ並びにＰＶＲＩＧタンパク質を２０、１０、５、２．５、１．２５ｎＭに勾配希釈した。抗原に対する抗体の親和性は、マルチサイクル速度論を使用して測定された。各サイクルで、抗体を注入した後、ヒト、カニクイザル及びマウスＴＩＧＩＴ並びにＰＶＲＩＧタンパク質を勾配濃度で注入し、抗原と抗体の結合及び解離プロセスを生じさせた。各サイクルの後、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５を使用してＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップの再生（チップ上のタンパク質を除去する）を行った。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００解析ソフトウェアを使用して、抗体抗原の親和性ＫＤをフィッティングした。表４６の結果から、２個のヒト化二重抗体とヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴ並びにＰＶＲＩＧタンパク質との間に特異的結合が存在し、且つ親和性レベルが比較的高いが、マウスＴＩＧＩＴ並びにＰＶＲＩＧタンパク質に結合しないことが分かった。
実施例３６ ヒトＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧタンパク質に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の共結合のＢＩＡｃｏｒｅ検出
ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、２つの抗原との二重特異性抗体の同時結合特性を特徴付けした。まず、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップで抗体ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６を捕捉し、次にＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧ ｈｉｓタグタンパク質をそれぞれ注入し、更にＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＩＧ、ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴをそれぞれ連続注入し、抗体及び抗原の結合シグナルを記録し、最後にＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５でチップを再生させ、そのうち、移動相はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）、流速は３０μＬ／ｍｉｎであり、異なる抗原との結合時間は何れも３００ｓ、再生時間は３０ｓ、検出温度は２５℃、ｈＴＩＧＩＴ分析濃度は２０ｎＭ、ｈＰＶＲＩＧ分析濃度は５０ｎＭであった。ＢＩＡｃｏｒｅ ８Ｋ分析ソフトウェア（バージョン番号２．０）を用いてデータを分析し、抗体捕捉レベルＣａｐｔｕｒｅ Ｌｅｖｅｌ、異なる抗原の結合シグナルＢｉｎｄｉｎｇ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ（ＲＵ）を記録し、そして抗原抗体分子量に基づいて抗原抗体分子の化学量論比を計算し、抗体分子に結合できる抗原の数を予備的推定した。抗体ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２と抗原ＴＩＧＩＴ＆ＰＶＲＩＧとの相互作用関係を確認するために、各抗原が何れも飽和状態に達するように、ｈＴＩＧＩＴ単一抗原のみに結合すること、ｈＰＶＲＩＧ単一抗原のみに結合すること、まずｈＴＩＧＩＴに結合した後にｈＰＶＲＩＧに結合すること、まずｈＰＶＲＩＧに結合した後にｈＴＩＧＩＴに結合すること、という４ステップの検出を行った。抗体抗原の結合曲線を収集し、２個の二重特異性抗体の捕捉レベル、及び各試験におけるＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＩＧの結合シグナルを記録し、そして、これによって抗原抗体分子の化学量論比を算出し、表４７に示すように、図５６のＡ、Ｂはそれぞれ、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６がＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＧにそれぞれ結合し、並びにＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧをそれぞれ連続注入した抗体抗原結合曲線であった。表４７、図５６Ａ及び５６Ｂに示すように、ＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＧを連続注入して生成された結合シグナルは、ＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＧを単独で注入して生成された結合シグナルとほぼ一致し、そしてＴＩＧＩＴ及びＰＶＩＲＧの正逆連続によって生成された結合シグナルもほぼ一致し、これは、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６がｈＴＩＧＩＴ及びｈＰＶＲＩＧに同時に結合でき、そして、２つの抗原間に相互影響がないことを示し、抗体及び抗原の分子量、並びに抗体の捕捉レベル及び抗原の結合レベルを総合的に考慮すると、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２に対するＴＩＧＩＴの化学量論比が１．７６、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６に対するＴＩＧＩＴの化学量論比が１．８６、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２に対するＰＶＩＲＩＧの化学量論比が２．１４、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６に対するＰＶＩＲＩＧの化学量論比が２．１８であると予備的推定し、２つの抗原抗体の化学量論比は何れも２に近く、検出方法により引き起こされた誤差を考慮すると、発明者らは、１つのＬＣ－ＢｓＡｂ－００２又は１つのＬＣ－ＢｓＡｂ－００６二重抗体分子が２つのＴＩＧＩＴ分子及び２つのＰＶＲＩＧ分子に同時に結合できると推定した。
実施例３７ ＮＫ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の機能促進作用へのＮＫ細胞脱顆粒実験による検出
ＦＡＣＳによりＮＫ細胞ＣＤ１０７ａの発現レベルを検出し、ＮＫ細胞活性化に対する試験抗体の影響を示した（図５７のＡは実験プロトコルを示した）。
Ａ．ＦＡＣＳによりＮＫ細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ及びＷＩＤＲ細胞表面ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現を検出した。
まず、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）を用いてＮＫ細胞をカウントし、３つのフローチューブを取り、各フローチューブに１ｅ＋５個のＮＫ細胞を加え、ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、１つのチューブに３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて未染色チューブとして使用に備え、別の２本の各チューブに染色液１００μＬ（ＰＢＳ＋１＊のＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４））を加えて均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。次にＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、各チューブにＦｃ阻害剤５０μＬ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋Ｆｃｘ ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２））を加えて均一に混合した後、４℃で１５分間インキュベートした。次いで、各チューブに染色液をそれぞれ加え、１本目のチューブに５０μＬの２＊染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰＥ－Ｃｙ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ３検出抗体＋ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ５６検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＴＩＧＩＴ検出抗体＋ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲＩＧ検出抗体、ＣＤ３検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００３１６、ＣＤ５６検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１８３０６、ＴＩＧＩＴ検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３７２７０６、ＰＶＲＩＧ検出抗体ＲＤ ＦＡＢ９３６５１Ｇ）を加え、２本目のチューブに５０μＬの２＊アイソタイプ対照染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰＥ－Ｃｙ７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ３検出抗体＋ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＣＤ５６検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ κアイソタイプ対照抗体＋ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ κアイソタイプ対照抗体、ＡＰＣ ｍＩｇＧ２ａ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００２２２、ＡＦ４８８ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ κアイソタイプ対照抗体ＲＤ ＩＣ１０５１Ｇ）を加え、均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、遠心分離後、３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて均一に混合した。次にオンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群におけるＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞群の割合及びＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群におけるＣＤ５６陽性ＣＤ３陰性の細胞群のＡＰＣ、ＡＦ４８８シグナルを読み取った。
ＷＩＤＲ細胞をトリプシンで消化して細胞懸濁液とし、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）を用いて細胞をカウントし、３つのフローチューブを取り、各フローチューブに１ｅ＋５細胞を加え、ＰＢＳを加えて細胞を２回洗浄した。遠心分離後、上清を除去し、１つのチューブに３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）を加えて未染色チューブとして使用に備え、別の２本の各チューブに染色液１００μＬ（ＰＢＳ＋１＊のＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４））を加えて均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。次にＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞を２回洗浄し、上清を除去し、各チューブに染色液をそれぞれ加え、１本目のチューブに１００μＬの染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲ検出抗体＋ＡＰＣ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈＰＶＲＬ２検出抗体、ＰＶＲ検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３３７６１２、ＰＶＲＬ２検出抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３３７４１２）を加え、２本目のチューブに１００μＬのアイソタイプ対照染色液（Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ＋ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体＋ＡＰＣ κ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ ｍＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００１５０、ＡＰＣ ｍＩｇＧ１ κアイソタイプ対照抗体Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ４００１２２）を加えて均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、遠心分離後、３００μＬのＳｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて均一に混合した。次にオンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ陰性細胞群のＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＡＰＣシグナルを読み取った。図５７のＢは、実験に使用されるＮＫ細胞が一定のレベルのＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴを発現し、同時に標的細胞ＷＩＤＲがリガンドＰＶＲ及びＰＶＲＬ２を高発現することを示した。
Ｂ．ＮＫ細胞脱顆粒実験（ＷＩＤＲを標的細胞とする）。
実験の前日にヒトＰＢＭＣを蘇生し、選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５５）を用いてヒトＮＫ細胞を選別し、２００ＩＵ／ｍＬのｈ－ＩＬ２（Ｒ＆Ｄ、２０２－ＩＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＩＬ１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－１２－５０ＵＧ）を加えて一晩刺激し、翌日に播種実験を行った。まず、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％のＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ）で抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）に希釈し、次に引き続きａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで１０倍勾配希釈し、５０μＬ／ウェルで希釈した抗体を超低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、７００７）に加え、使用に備えた。次に、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でＮＫ細胞をカウントし、一定の数のＮＫ細胞を取り、３５０ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで０．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させ、細胞懸濁液にタンパク質輸送阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、００４９８０９３）及びＡＰＣ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ検出抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２８６２０）を加えた。処理したＮＫ細胞懸濁液を、５０μＬ／ウェルで薬剤で覆われた９６ウェルＵ底プレートに加え、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。インキュベートの間、標的細胞ＷＩＤＲをトリプシンで消化して細胞懸濁液とし（Ｒｅｈ細胞と均一に直接混合する）、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）で標的細胞の細胞数をカウントし、適切な量の細胞を取り出し、２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで細胞を０．２５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。インキュベート終了後、１００μＬ／ウェルでウェルプレートに標的細胞懸濁液を加え、この場合、各ウェルに２５０００個のＮＫ細胞、２５０００個の標的細胞及び様々な濃度の試験抗体を含有し、ＮＫ細胞のみを含有するウェルは休止対照とし、ＮＫ及びＷＩＤＲのみを含むウェルは薬物無し対照とした。各ウェルを均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに入れて１６ｈインキュベートした。最後にＦＡＣＳ染色を行い、ウェルプレートにおける細胞を９６ウェルＶ底プレートに平行に移し、ＰＢＳで２回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに染色液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋１＊濃度のｚｏｍｂｉｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）＋ＰＥ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＣＤ５６検出抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８３０６））を加えて均一に混合した後、４℃で３０分間インキュベートした。時間経過後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、上清を捨て、各ウェルに１５０μＬのｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁させ、オンマシンで検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。最終的にＣＤ５６陽性細胞におけるＣＤ１０７ａ強陽性細胞群の割合を読み取り、ＣＤ１０７ａ強陽性細胞の割合が高いほど、ＮＫの脱粒作用が強く、ＮＫの活性化程度が高いことを示した。図５７のＣは、陰性対照ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１がＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現に影響を与えず、候補ヒト化二重抗体が何れも、異なる程度でＮＫ細胞ＣＤ１０７ａの発現を向上できることを示し、これは、試験抗体がＮＫ細胞の活性化を効果的に促進できることを示した。
Ｃ．ＮＫ細胞脱顆粒実験（ＴＦ－１を標的細胞とする）。
実験方法は実施例３７Ｂを参照し、実験結果は図５７のＤに示され、ヒト化二重抗体のＮＫ細胞脱顆粒の作用は、ＰＶＲＩＧ陽性対照抗体ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＴＩＧＩＴ陽性対照抗体ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１より優れ、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４とＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１との併用群に同等であることを示した。同時に、ＮＫ細胞脱顆粒に対するヒト化二重抗体の促進作用も、そのＰＶＲＩＧアーム抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ及びＴＩＧＩＴアーム抗体ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３より優れ、ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂとＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３との併用群に同等である。
実施例３８ 腫瘍細胞株に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体媒介性ＮＫ細胞の殺傷作用へのＮＫ細胞殺傷実験による検出
ＦＡＣＳにより標的細胞（ＷＩＤＲ）の分解レベルを検出することで、ＮＫ細胞の標的細胞への殺傷機能に対する試験抗体の影響を示した。
実験の前日にＰＢＭＣを蘇生し、選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５５）でＮＫ細胞を選別し、２００ＩＵ／ｍＬのｈ－ＩＬ２（ＲＤ、２０２－ＩＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＩＬ１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－１２－５０ＵＧ）を加えて一晩刺激し、翌日に播種実験を行った。実施例１３に記載される方法により３個のＮＫ供与体（Ｄｏｎｏｒ－０５０、Ｄｏｎｏｒ－８３１、Ｄｏｎｏｒ－７１５）におけるＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴの発現レベルを検出し、同時にａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％のＦＢＳ＋１×Ｐ／Ｓ）で試験待ち抗体を最大濃度２７５ｎＭ（４倍濃度）に希釈し、次にａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで１０倍勾配希釈し、５０μＬ／ウェルで希釈した抗体を超低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、７００７）に加え、使用に備えた。次に、標的細胞ＷＩＤＲをトリプシンで消化して細胞懸濁液とし、細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉ－ＣＥＬＬ）でＷＩＤＲ細胞をカウントし、適切な量の細胞を取り、遠心分離機に置いて２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨て、適量のＰＢＳで再懸濁させた後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの最終濃度が５μＭになるように、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５７Ａ）染色液を加えた。染色液を加えたＷＩＤＲ懸濁液を均一に混合し、３７℃のインキュベーターに置いて１０分間インキュベートし、その間に振とうしながら混合し、一部のＷＩＤＲ細胞を取り出して実施例１３に記載される方法によりＷＩＤＲにおけるＰＶＲ及びＰＶＲＬ２の発現レベルを検出した。これと同時に、細胞カウンターでＮＫ細胞をカウントし、一定の数のＮＫ細胞を取り、３５０ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで０．５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。処理したＮＫ細胞懸濁液を、５０μＬ／ウェルで薬剤で覆われた９６ウェルＵ底プレートに加え、均一に混合した後、室温で１５分間インキュベートした。ＷＩＤＲ細胞の染色が終了した後、細胞懸濁液に５倍体積の完全培地（ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１＊Ｐ／Ｓ＋１＊非必須アミノ酸＋１＊グルタミン酸ナトリウム）を加えて反応を停止させ、２００ｇの速度で５分間遠心分離し、上清を捨てた後、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで細胞を０．２５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に再懸濁させた。ＮＫ及び薬物のインキュベートが終了した後、１００μＬ／ウェルでウェルプレートにＷＩＤＲ細胞懸濁液を加え、この場合、各ウェルに２５０００個のＮＫ細胞、２５０００個のＷＩＤＲ細胞及び様々な濃度の試験抗体を含有し、ＷＩＤＲ細胞のみを含有するウェルは休止対照とし、ＮＫ細胞及びＷＩＤＲを含有するウェルは薬物無し対照とした。各ウェルを均一に混合した後、３７℃のインキュベーターに入れて４ｈインキュベートした。最後にＦＡＣＳ染色を行い、各ウェルに染色液（ＰＢＳ＋ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３５６６））を加えて均一に混合した後、室温で２０分間インキュベートした。時間経過後、オンマシンで検出し（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）、最終的にＣＴＶ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞群の割合を読み取り、ＰＩ陽性細胞の割合が多いほど、ＮＫの殺傷作用が強いことを示した。図５８のＡは、３個のＮＫ供与体（Ｄｏｎｏｒ－０５０、Ｄｏｎｏｒ－８３１、Ｄｏｎｏｒ－７１５）が何れも、一定のレベルのＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴを発現することを示し、図５８のＢは、標的細胞ＷＩＤＲにおいてＰＶＲ及びＰＶＲＬ２を高発現することを示し、図５８のＣはＷＩＤＲ細胞に対するＮＫ細胞の殺傷実験の概要の実験プロトコルであり、図５８のＤは、陰性対照ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１がＮＫ殺傷に顕著な影響を与えず、試験される２個のヒト化二重抗体が何れも標的細胞ＷＩＤＲに対するＮＫ（３個のｄｏｎｏｒに由来する）の殺傷を効果的に促進できることを示し、表においてＷＩＤＲ細胞に対する異なるＮＫ供与体での２つのヒト化二重抗体の殺傷のＥＣ５０及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示した。
ＴＦ－１を標的細胞とし、ＴＦ－１に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体媒介性ＮＫ細胞の殺傷作用を検出し、結果は図５８のＥに示され、ヒト化二重抗体が腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷を促進でき、活性がＰＶＲＩＧ陽性対照抗体ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４、ＴＩＧＩＴ陽性対照抗体ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４とＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１との併用群より優れることを示した。同時に、ヒト化二重抗体の活性もそのＰＶＲＩＧアーム抗体ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ、ＴＩＧＩＴアーム抗体ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３及びＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂとＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３との併用群より優れる。
実施例３９ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体媒介されたヒトＴｒｅｇ細胞に対する直接殺傷作用へのＮＫ細胞ＡＤＣＣ実験による検出
ＦＡＣＳにより標的細胞（Ｔｒｅｇ）の分解レベルを検出することで、ＮＫ細胞の標的細胞への試験抗体の直接ＡＤＣＣ殺傷効果を示した（図５９のＡ）。
実験の前日にＰＢＭＣを蘇生し、選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５５）でＮＫ細胞を選別してエフェクター細胞とし、２００ＩＵ／ｍＬのｈ－ＩＬ２（ＲＤ、２０２－ＩＬ）及び１０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＩＬ１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－１２－５０ＵＧ）を加えて一晩刺激し、翌日に播種実験を行った。ＰＢＭＣにおける単離Ｔｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）を標的細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１８０６３）として、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、１１１２９Ｄ）を使用してインビトロで１２日間増幅した後、増幅したＴｒｅｇ細胞を取得して実験に使用され、実験前に、実施例１３に記載される方法及び試薬を用いてＴｒｅｇ細胞におけるＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧの発現を検出した。エフェクター細胞及び標的細胞を５：１の割合で共インキュベートし、そして一連の勾配希釈した試験ヒト化二重特異性抗体又はアイソタイプ対照ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１、ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ４抗体を加え、３７℃のインキュベーターに置いて４時間インキュベートした後、ＰＩを加えて染色し、最終的にＰＩ陽性のＴｒｅｇ細胞の割合を読み取り、これによって標的細胞Ｔｒｅｇに対する試験二重特異性抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞毒性作用）殺傷効果を評価した。結果は、単離及び増幅したヒトＴｒｅｇ細胞がＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧ（図５９のＢ）を高発現し、試験ヒト化二重抗体がｈＩｇＧ１のＦｃでのみＴｒｅｇ細胞に対する濃度依存性ＡＤＣＣ殺傷が示され、対応するｈＩｇＧ４ Ｆｃ形態がＴｒｅｇ細胞に対して明らかなＡＤＣＣ効果を示さず、２つの陰性対照抗体ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ１、ａｎｔｉ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｈＩｇＧ４と同等である（図５９のＣ）ことを示し、表において、ｈＩｇＧ１ Ｆｃ形態でのＴｒｅｇ細胞に対する２つの試験ヒト化抗体のＡＤＣＣ殺傷効果のＥＣ５０及びＡＵＣを示した。
実施例４０ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体のＡＤＣＰ活性
供与体のＰＢＭＣから単球を単離し、そして７５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦで７日間誘導してマクロファージに分化され、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した後、エフェクター細胞とした。調節性Ｔ細胞単離試薬キットによってヒトＰＢＭＣから選別されたヒトＴｒｅｇ細胞は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒを用いてインビトロで増幅して１３日間活性化されて標的細胞とし、次にＣＦＳＥ染料で標的細胞を標識した。エフェクター細胞及び標的細胞を４：１の割合で共インキュベートした。連続勾配希釈した試験待ち抗体、陰性対照Ｈｅｌ ｈＩｇＧ１抗体、その単一アーム抗体（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ及びＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３）又は２つのモノクローナル併用の組み合わせを加え、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞染料ＰＩを加え、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ陽性Ｔｒｅｇ細胞におけるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞の割合を検出し、試験待ち抗体のＡＤＣＰ作用を評価した。
図６０のＡに示すように、試験待ち抗体は用量依存的な形態でＴｒｅｇ細胞のＡＤＣＰ作用を活性化した。ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ又はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４は、ほとんどＡＤＣＰ活性がなかった。ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３又はＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１は、用量依存的なＡＤＣＰ活性を示した。ＡＤＣＰ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）によると、試験待ち抗体のＡＤＣＰ活性は、ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３及び２つの単一アーム抗体の組み合わせ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ＋ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３）より僅かに弱かった。試験待ち抗体のＡＤＣＰ効果は、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及び２つの陽性抗体の組み合わせ（ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４＋ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１）と同等である。ＡＤＣＰ曲線のＥｍａｘによると、試験待ち抗体のＡＤＣＰ活性は、２つの単一アーム抗体の組み合わせ（ＰＶＲＩＧ－Ａ５０－Ｈ１ｂ＋ＴＩＧＩＴ－００２－Ｈ４Ｌ３）及び２つの陽性抗体の組み合わせ（ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４＋ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１）と同等である（図６０のＢ）。
実施例４１ 健常な供与体からのヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン放出に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の影響
この実験では、健常者の非刺激ＰＢＭＣ中のサイトカイン分泌に対する試験待ち抗体の影響を調べた。３名の健常ボランティアのＰＢＭＣを用いて液相又は固相条件で試験待ち抗体と共に２４時間インキュベートし、次にフローサイトメトリー法によりＰＢＭＣ上清中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αという５種類のサイトカインの分泌レベルを検出した。リポ多糖及びＣＤ３モノクローナル抗体は陽性対照とし、Ａｎｔｉ－Ｈｅｌ ｈＩｇＧ１抗体は陰性対照とし、同時にＲＧ６０５８－ｈｌｇＧ１及びＣＯＭ７０１－ｈｌｇＧ４は、それぞれＴＩＧＩＴ末端及びＰＶＲＩＧ末端のモノクローナル対照とした。
結果は、陽性対照ＣＤ３モノクローナル抗体が液相又は固相条件で、ＬＰＳが液相条件で、３名の健常ボランティアの非刺激ＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートした後、ＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αという５種類のサイトカインの分泌レベルが異なる程度で上昇することを示した。液相条件で、様々な濃度の試験待ち抗体が非刺激ＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートした後、ＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αの分泌レベルは、陰性対照と同等であるか、又は検出限以下であった。固相条件で、様々な濃度の試験待ち抗体が非刺激ＰＢＭＣと共に２４時間インキュベートした後、ＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＩＬ－１０の分泌レベルが陰性対照と同等であるか、又は検出限以下であり、固相条件で高濃度点（２８５０ｎＭ）の試験待ち抗体の作用後、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６の分泌レベルは陰性対照よりも顕著に高いか、又は陰性対照と同等であるが、同じ条件でのＲＧ６０５８－ｈｌｇＧ１及びＣＯＭ７０１－ｈｌｇＧ４と比べて、試験待ち抗体は、インビトロで健常者の非刺激ＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αという５種類のサイトカインの分泌を更に増加させることはない。
以上から、ＴＩＧＩＴ末端モノクローナルＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＰＶＲＩＧ末端モノクローナルＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４と比べて、同じ条件での試験待ち抗体は、インビトロで健常者の非刺激ＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＴＮＦ－αという５種類のサイトカインの分泌を更に増加させることはない。
実施例４２ 抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体の機能促進作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙ検出
この実験の原理：ＣＭＶ ＩｇＧ陽性ｄｏｎｏｒのＰＢＭＣがＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチドにより誘導されたＣＭＶ ｐｐ６５特異的ＣＤ８Ｔをエフェクター細胞とし、ｐｐ６５ ｐｕｌｓｅｄ後のｃｏｌｏ２０５を標的細胞とした実験系において、ｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する抗ＰＶＲＩＧ ＆ ＴＩＧＩＴ二重抗体の機能促進作用を調べた（図６１のＡ）。
ＰＢＭＣ蘇生後、１μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）ポリペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ、カタログ番号ＡＳ－２８３２８）、２ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＩＬ－２０２）、１０ｎｇ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００－０７）を含有する完全培地（ＲＰＭＩ１６４０－Ｇｌｕｔａｍａｘ＋５％のＡＢ ｓｅｒｕｍ＋１％のＰ／Ｓ＋（１×）２－βメルカプトエタノール）で２×１０６／ｍＬに再懸濁させ、５ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％のＣＯ２で６日間培養した。６日目に、全ての細胞を収集し、培地中のｐｐ６５及びＩＬ－７を除去し、細胞を二分し、そして１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、培養を２日間続けた。８日目に、全ての細胞を収集し、１００ＩＵ／ｍＬのｈｕｍａｎ ＩＬ－２を含有する完全培地に再懸濁させ、そして細胞密度を２×１０６／ｍＬに調整し、培養を続けた。１１日目に、全ての細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＣＭＶ ｐｐ６５（４９５－５０３）特異的ＣＤ８ Ｔの割合及び当該細胞におけるＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１の発現を検出した（図６１のＢ）。フローサイトメトリー検出抗体は、Ｌｉｖｅｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９７６）、ＣＤ８－ＰｅｒＣｐ Ｃｙ５．５（ＢＤ、カタログ番号５６５３１０）、ＣＤ３－ＰＥ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３１６）、Ｔ－ｓｅｌｅｃｔ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ ＣＭＶ ｐｐ６５ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥ（ＭＢＬ、カタログ番号ＴＳ－００１０－１Ｃ）、ＰＶＲＩＧ－ＡＦ４８８（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＦＡＢ９３６５１Ｇ－１００ＵＧ）、ＴＩＧＩＴ－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３７２７０６）、ＰＤ－１－ＢＶ４２１（ＢＤ、カタログ番号５６２５１６）であった。
上記誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８はエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖ培地で再懸濁させて細胞密度を０．４×１０６／ｍＬに調整した（ＣＤ８誘導後に凍結保存する場合、細胞の数を０．７×１０６／ｍＬに増加する必要がある）。選別後のＣＤ８について、純度及びＣＤ２２６の発現を検出した。Ｃｏｌｏ２０５は標的細胞とし、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、２０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させ、細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間処理し、次に２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞をＡＩＭ－Ｖで０．５×１０６／ｍＬに再懸濁させ、そしてフローサイトメトリーによりそのＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の発現を検出した（図６１のＢ）。試験待ち抗体（ヒト化二重抗体及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ）をＡＩＭ－Ｖ培地で２８０ｎＭに希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５を順に加え、そしてピペットで軽く均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間インキュベートした。この系における薬物最終濃度は７０ｎＭ、ＣＤ８は２００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５は５００００／ウェルであった。インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。この系におけるの陽性対照はＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１、陰性対照はｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔであった。選別後のＣＤ８Ｔ純度についてのフローサイトメトリー検出抗体は、ｌｉｖｅｄｅａｄ－ＢＶ４２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３４９６４）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ（ＢＤ、カタログ番号５５５３６６）であった。
図６１のＣ及び表４８に示すように、２つの二重抗体分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の各濃度点において、ＩＦＮ－γの放出レベルは統計学的に有意差がなく、二重抗体分子の高濃度で（ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２が７０ｎＭで、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６が７０及び７ｎＭで）の因子放出は、同じ条件での併用の組み合わせより顕著に高く、２つの候補分子に対応する併用の組み合わせ及び陽性対照抗体ＲＧ６０５－ｈＩｇＧ１とＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４との併用の組み合わせは各濃度点で有意差がなく、全体的な傾向から、２つの二重抗体分子は陽性対照抗体ＲＧ６０５－ｈＩｇＧ１とＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４との併用と比べて、ＣＤ８ ＴからのＩＦＮ－γの放出を促進するより良好な作用を有することが分かった。
図６１のＤに示すように、２つの二重抗体分子、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２とＬＣ－ＢｓＡｂ－００６とＴｅｎｃｅｎｔｒｉｑとの併用後、二重抗体自体Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γの分泌と比べて、何れも顕著に増加し（ｔ－ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１）、ＰＶＲＩＧモノクローナル、ＴＩＧＩＴモノクローナル及びＰＤ－Ｌ１モノクローナルという３つの薬物の併用は、ＰＶＲＩＧモノクローナル及びＴＩＧＩＴモノクローナルの２つの薬物の併用と比べて、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γの分泌は何れも顕著に増加し（ｔ－ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５）、図中の棒グラフ上の百分率は抗ＴＩＧＩＴ陽性対照抗体ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１ ＩＦＮ－γと比較して増加した百分率であった。
実施例４３ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとの併用後に抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対する機能促進作用へのＣＭＶ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｃａｌｌ ａｓｓａｙ検出
実験原理：実施例４０と同様（図６１のＡ）。
抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導：実施例４０と同様であった。播種当日にフローサイトメトリーによりそのＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１の発現を検出した（図６２のＡ）。
誘導後のＰＢＭＣがＣＤ８ Ｔ選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号１７９５３）により単離されたＣＤ８ Ｔはエフェクター細胞とし、ＡＩＭ－Ｖ培地で再懸濁させて細胞密度を０．８×１０６／ｍＬに調整した（抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の割合によって、マイクロウェルプレート中のＣＤ８ Ｔ細胞の数を調整した）。完全培地に最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γで一晩前処理したＣｏｌｏ２０５を標的細胞として添加し、ＴｒｙｐＬＥＴＭＥｘｐｒｅｓｓ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１２６０５０１０）で消化し、２回洗浄した後、２０ｎｇ／ｍＬのｐｐ６５を含有するＡＩＭ－Ｖ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１０３５－０２５）に再懸濁させて細胞密度を１×１０６／ｍＬに調整し、３７℃、５％のＣＯ２で３時間処理し、次に２５０ｇで５分間遠心分離し、上清を捨てた。その後、細胞をＡＩＭ－Ｖで０．５×１０６／ｍＬに再懸濁させ、そしてフローサイトメトリーによりそのＰＶＲＬ２、ＰＶＲ及びＰＤ－Ｌ１の発現を検出した（図６２のＡ）。試験待ち抗体（ヒト化二重抗体、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、二重抗体とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとの併用、２つの陽性対照モノクローナル（ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１）の併用、３つのモノクローナル（ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ）の併用）をＡＩＭ－Ｖ培地で２８０ｎＭ（４×）に希釈して開始濃度とし、続いて合計６濃度点で１０倍勾配希釈した。低吸着９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号７００７）に５０μＬの抗体、５０μＬのＣＤ８、１００μＬのｐｐ６５で処理したｃｏｌｏ２０５を順に加え、そしてピペットで軽く均一に混合し、３７℃、５％のＣＯ２で１８時間共インキュベートした。この系における薬物の最終濃度は、それぞれ７０ｎＭ、７ｎＭ、０．７ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．００７ｎＭ及び０．０００７ｎＭであり、ＣＤ８は４００００／ウェル、ｃｏｌｏ２０５は５００００／ウェルであった。共インキュベート終了後、４００ｇで遠心分離して上清を取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（達科為、カタログ番号１１１０００３）で上清中のｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γのレベルを検出した。
図６２のＢ及び表４９に示すように、ＩＦＮ－γフィッテイング曲線のＡＵＣに従って並べ替えると、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２＋Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＞ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４＋Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＞ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２＞ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４＞Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑであった。ＡＵＣが大きいほど、効力が強いことを示し、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２とＴｅｎｃｅｎｔｒｉｑとを併用した後、二重抗体ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２自体Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γの分泌と比べて明らかに増加し、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑという３つの薬物の併用は、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４及びＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１という２つの薬物の併用と比べて、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γの分泌が明らかに増加した。
実施例４４ 抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体のマウスインビボでの薬効評価
Ａ３７５細胞を５×１０６個／０．１ｍＬの濃度で５～６週齢の雌ＮＰＧマウス（種系：ＮＰＧ、北京維通達生物技術有限公司）の皮下右側に接種した。Ａ３７５細胞接種後の翌日に、Ｈｕ ＰＢＭＣ細胞を５×１０６個／０．２ｍＬの濃度でマウスのインビボに尾静脈注射し、腫瘍が約８２ｍｍ３に成長すると、腫瘍体積に応じて５６匹をスクリーニングし、各群８匹、それぞれＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ）、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（５ｍｇ／ｋｇ、ｌｏｔＮＯ．ＨＫ６５５６７、Ｒｏｃｈｅ）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（１１．７ｍｇ／ｋｇ）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６（１１．７ｍｇ／ｋｇ）とするように合計７群でランダムに群分けした。全ての群の投与経路は腹腔内注射とし、週２回投与、連続４回投与し、最後の投与３日間後に実験を終了した。投与及び観察期間、マウスの体重及び腫瘍体積を週３回測定し、そして測定値を記録し、腫瘍体積（長径×短径２／２）及び成長阻害率（ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－（Ｔｎ－Ｔ０）／（Ｖｎ－Ｖ０））×１００％を計算した。
薬効結果：図６３に示すように、試験候補分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の投与後、Ａ３７５腫瘍成長に明らかな阻害作用を有し、阻害レベルは陽性分子ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４の併用、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑと同じレベルであった。群分け投与の１３日目に、各試験薬物群及び陰性対照ＰＢＳ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）及び差異を分析すると（表１１）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６のＴＧＩはそれぞれ８２．１６％及び７８．５９％であり、且つＰＢＳと比べて有意であり（Ｐ＜０．００５）、ＴＧＩレベルはＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１（ＴＧＩ＝４２．５５）、ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４（ＴＧＩ＝０．２３％）単剤よりも高く、ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４の併用（ＴＧＩ＝８３．３２％）と同等であった。単一マウス腫瘍の成長曲線は図６４に示され、図６３と同じの傾向を示した。
体重結果：図６５及び表５１に示すように、対照分子Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑに顕著な体重減少を示し、毒性と副作用を示した以外、残りの対照及び候補分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００６の投与体重変化傾向はＰＢＳと基本的に一致し、その後の体重減少はＰＢＭＣ再構築によるＧＶＨＤ現象であった。
最終的な結果は、抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００６がＡ３７５皮下移植腫瘍の成長に顕著な阻害作用を有し、腫瘍阻害効果が陽性薬ＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１及びＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４単剤より優れ、陽性対照抗体ＴｅｃｅｎｔｒｉｑとＲＧ６０５８－ｈＩｇＧ１＋ＣＯＭ７０１－ｈＩｇＧ４との併用と同等であることを示した。同時に、投与及び観察中に候補分子の毒性と副作用が観察されず、このモデルでは候補分子は安全性と耐性を示した。
実施例４５ Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑと併用した抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体のマウスインビボでの薬効評価
Ａ３７５細胞を５×１０６個／０．１ｍＬの濃度で５～６週齢の雌ＮＰＧマウス（種系：ＮＰＧ、北京維通達生物技術有限公司）の皮下右側に接種した。Ａ３７５細胞接種の翌日に、Ｈｕ ＰＢＭＣ細胞を５．５×１０６個／０．２ｍＬの濃度でマウスのインビボに尾静脉注射し、腫瘍が約８２．７８ｍｍ３に成長すると、腫瘍体積に応じて４５匹をスクリーニングし、それぞれＶｅｈｉｃｌｅ（ＰＢＳ、９匹）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（１１．７ｍｇ／ｋｇ、９匹）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（５．９ｍｇ／ｋｇ、９匹）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（３ｍｇ／ｋｇ、１０匹、ｌｏｔＮＯ．ＨＫ６５５６７、Ｒｏｃｈｅ）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２＋Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（５．９ｍｇ／ｋｇ＋３ｍｇ／ｋｇ、８匹）とするように合計５群でランダムに群分けした。全ての群の投与経路は腹腔内注射とし、週２回投与、連続５回投与し、最後の投与３日間後に実験を終了した。投与及び観察期間、マウスの体重及び腫瘍体積を週３回測定し、そして測定値を記録し、腫瘍体積（長径×短径２／２）及び成長阻害率（ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－（Ｔｎ－Ｔ０）／（Ｖｎ－Ｖ０））×１００％を計算した。
薬効結果：図６６に示すように、試験候補分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２の投与後、Ａ３７５腫瘍成長に明らかな阻害作用を有し、且つ投与量が高いほど、Ａ３７５腫瘍成長に対する阻害作用が強かった。一方、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとの併用は、Ａ３７５腫瘍成長に対する阻害レベルがＬＣ－ＢｓＡｂ－００２及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ単剤より顕著に優れた。群分け投与の１７日目に、各試験薬物群及び陰性対照ＰＢＳ群の腫瘍阻害率（ＴＧＩ）及び差異を分析すると（表５２）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（１１．７ｍｇ／ｋｇ）、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（５．９ｍｇ／ｋｇ）及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（３ｍｐｋ）のＴＧＩがそれぞれ６６．５６％、６０．５１％及び４１．５３であり、ＰＢＳ群と比べて有意差（Ｐ＜０．０００１、Ｐ＝０．０００３及びＰ＝０．００１５）を示し、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとの併用群のＴＧＩは８０．４４％であり、ＰＢＳ群と比べて有意差（Ｐ＜０．０００１）を示し、且つＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（５．９ｍｇ／ｋｇ）及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（３ｍｐｋ）単剤ＴＧＩより優れることが分かった。単一マウス腫瘍の成長曲線は図６７に示され、各群の腫瘍の成長傾向は図６６と同じであった。
体重結果：図６８及び表５３に示すように、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２＋Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ併用群のマウス体重に一定の減少を示したが、明らかな毒性と副作用を示さなかった。Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ群、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（１１．７ｍｐｋ）及びＬＣ－ＢｓＡｂ－００２（５．９ｍｐｋ）投与群のマウスの体重変化傾向はＰＢＳ群と基本的に一致した。
最終的な結果は、抗ＰＶＲＩＧ×ＴＩＧＩＴヒト化二重特異性抗体分子ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２がＡ３７５皮下移植腫瘍の成長に顕著な阻害作用を有し、且つ投与量の増加に伴って、阻害作用が明らかな用量依存的関係を呈することを示した。一方、ＬＣ－ＢｓＡｂ－００２とＴｅｃｅｎｔｒｉｑとを併用した腫瘍阻害効果は、それぞれの単剤より顕著に優れ、顕著な併用効果を示すと同時に、投与及び観察中に候補分子の毒性と副作用が観察されず、このモデルでは候補分子は安全性と耐性を示した。

Claims (13)

  1. 抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体であって、
    （ａ）抗ＴＩＧＩＴの抗体であり、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む第１抗原結合部分であって、
    その重鎖可変領域（ＶＨ）において、
    ＨＣＤＲ１は配列番号２１に示される配列であり、
    ＨＣＤＲ２は配列番号２２に示される配列であり、
    ＨＣＤＲ３は配列番号２３に示される配列であり、
    その軽鎖可変領域（ＶＬ）において、
    ＬＣＤＲ１は配列番号１８に示される配列であり、
    ＬＣＤＲ２は配列番号１９に示される配列であり、
    ＬＣＤＲ３は配列番号２０に示される配列である、第１抗原結合部分と、
    （ｂ）ＰＶＲＩＧに特異的に結合するＶＨＨを含む第２抗原結合部分であって、
    前記ＶＨＨのＣＤＲ１は配列番号１６８に示される配列であり、
    ＣＤＲ２は配列番号２０７に示される配列であり、
    ＣＤＲ３は配列番号２０８に示される配列である、第２抗原結合部分と、を含む、
    二重特異性抗体。
  2. 前記第１抗原結合部分のＶＨは配列番号７２に示される配列を含み、
    前記第１抗原結合部分のＶＬは配列番号６８に示される配列を含み、
    前記第２抗原結合部分は配列番号２００に示される配列を含む、
    請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 前記第１抗原結合部分は完全長抗体であり、
    前記第２抗原結合部分のＣ末端は第１抗原結合部分の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される、
    請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. 重鎖融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までＰＶＲＩＧ ＶＨＨ－（Ｇ４Ｓ）４ Ｌｉｎｋｅｒ－ＴＩＧＩＴ ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、
    軽鎖ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端までＴＩＧＩＴ ＶＬ－ＣＬを含む、
    請求項３に記載の二重特異性抗体。
  5. 前記重鎖融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２２７に示され、
    前記軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２２６に示される、
    請求項４に記載の二重特異性抗体。
  6. ヒト化抗体である、
    請求項１～５の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
  7. ヒト、サルＰＲＶＩＧ又はＴＩＧＩＴタンパク質に特異的に結合し、ヒト、サルＴＩＧＩＴに結合するＫＤが１．００Ｅ－７Ｍよりも高く、ヒト、サルＰＲＶＩＧに結合するＫＤが１．００Ｅ－８Ｍよりも高く、ＴＩＧＩＴ及びＰＶＲＩＧに同時に結合できる、
    請求項１～５の何れか１項に記載の二重特異性抗体。
  8. 治療剤又はトレーサーに更に結合され、
    前記治療剤は薬物、毒素、放射性同位体、化学療法剤又は免疫調節剤から選ばれ、
    前記トレーサーは放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選ばれる、
    請求項１～５の何れか１項に記載の抗ＰＶＲＩＧ／抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体。
  9. 請求項１～５の何れか１項に記載の二重特異性抗体をコードする、
    単離された核酸断片。
  10. 医薬組成物であって、
    請求項１～５の何れか１項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容されるベクターと、を含む、
    医薬組成物。
  11. 医薬組成物であって、
    請求項９に記載の核酸断片と、薬学的に許容されるベクターと、を含む、
    医薬組成物。
  12. 更なる治療剤を更に含み、前記更なる治療剤はＰＤ－１結合拮抗薬であり、
    前記ＰＤ－１結合拮抗薬はＰＤ－１結合拮抗薬、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬、又はＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬から選ばれ、
    前記ＰＤ－１結合拮抗薬はＭＤＸ １１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＴ－０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、又はＢＧＢ－１０８から選ばれ、
    前記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬はＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、又はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ａｖｅｌｕｍａｂ）から選ばれ、
    前記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ２抗体又はイムノアドヘシンから選ばれる、
    請求項１０に記載の医薬組成物。
  13. 更なる治療剤を更に含み、前記更なる治療剤はＰＤ－１結合拮抗薬であり、
    前記ＰＤ－１結合拮抗薬はＰＤ－１結合拮抗薬、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬、又はＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬から選ばれ、
    前記ＰＤ－１結合拮抗薬はＭＤＸ １１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＭＫ－３４７５（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＣＴ－０１１（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、又はＢＧＢ－１０８から選ばれ、
    前記ＰＤ－Ｌ１結合拮抗薬はＭＰＤＬ３２８０Ａ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、又はＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ａｖｅｌｕｍａｂ）から選ばれ、
    前記ＰＤ－Ｌ２結合拮抗薬は抗ＰＤ－Ｌ２抗体又はイムノアドヘシンから選ばれる、
    請求項１１に記載の医薬組成物。
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