JP6296776B2 - バイオ肥料の製造方法 - Google Patents

Description

この発明は、微生物資材を利用しているバイオ肥料に関し、特に、保存性に優れ、作物定着性の高い微生物肥料に関する。

従来から、コスト的に優位で、速効的、かつ高い肥効効率という観点から主に化学肥料が一般的な作物生産に使用され、作物増産に貢献してきた。

しかしながら、様々な食品の品質、安全性に関する問題や、肥料成分の溶脱、等による環境負荷問題の発生などから、近年、化学肥料や農薬、等の化学物質に依存した栽培体型が見直される傾向にある。そして、消費者が希望する、安心、安全、かつ良食味な作物生産に対応し、環境保全型農業を追及する傾向が強まっている。これに伴って、微生物を含んだ資材の施用が増加する傾向にある。

微生物を含んだ資材の施用に供すべく、これまで市販されていた微生物資材には、冷蔵条件で保管したり、スキムミルク等による単一の菌ペーストを調製しなければ、長期間（例えば、３カ月）、菌数や、その効果を維持することが難しいという問題があった。

このような問題への対策として、紫外線の照射や、植物残渣、等を添加すること、等によって資材に含まれる菌を単一化すること（雑菌を除く）や、対象菌のみの活性を増加させることなどが一般的に行われていた。

このような微生物資材において、菌数や、その効果を維持することを目的とした提案もいくつか行われている。例えば、特許文献１には、肥料や多孔質体に微生物培養液あるいは微生物培養液上澄みを加え、造粒した微生物資材が提案されている。また、特許文献２には、Bacillus属細菌を芽胞化することにより、高い生残性を保ち、菌濃度の高い飼料にできることが提案されている。

特開２００２−３６３５６１号公報 特開２０００−２１７５６７号公報

この発明は、常温（２５℃前後）で６ケ月以上、菌数や、その効果を維持可能なバイオ肥料を提案することを目的にしている。

本願発明は、Bacillus属細菌を培養した後、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理してなる芽胞率１００％のバイオ肥料である。

この発明によれば、常温（２５℃前後）で６ケ月以上、菌数や、その効果を維持可能なバイオ肥料を提供することができる。

また、Bacillus属細菌に従来から認められていた生育促進、等の特性を一層効果的に発現させ、特に、施用した作物（例えば、イネ）の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果を向上させることのできるバイオ肥料を提供することができる。

Bacillus pumilus ＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）を用いた１／５０００ａポット試験における各処理区の乾物蓄積量を表す図。 Bacillus pumillus ＴＵＡＴ１ 株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）の栄養型、芽胞型の違いがイネの根伸長に与える影響を比較した検討結果を表す参考写真であって、参考写真中、左側が芽胞型、右側が栄養型。

従来からBacillus pumilusは、生育促進、病害抑制、臭気低減、蛋白分解性、等の特性を有する有用菌であることが知られていた。

本願の発明者等は、このBacillus pumilusの中から、Bacillus pumilus ＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）を選抜し、イネに施用した場合の根域拡大、栄養吸収促進効果に関して次のように検討を行った。

なお、Bacillus pumillus ＴＵＡＴ１株は、特許微生物寄託センターに国際寄託しており、受託番号はＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６である。

（供試菌株および接種剤の調整）
Bacillus pumilus ＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）（以下、「ＴＵＡＴ１株」と表すことがある）を１ｇ／リットルの塩化アンモニウムを含む５リットルのNFb液体培地で一週間、２５℃で振とう培養し、４℃、６０００ｒｐｍ、３０分の遠心分離で集菌した。

次に２ｍｍのふるいを通過させた東京農工大学付属農場の黒ボク土壌１ｋｇを１２１℃、４０分のオートクレーブで滅菌し、１００ｍＬの滅菌蒸留水に前記集菌菌体を混和し、２８℃、最大圃場容水量下で１週間静置し、熟成させた。また接種材の菌密度は希釈平板法により測定し、１０^７〜１０^８cfu／g に調整した。

（接種法）
ＴＵＡＴ１株の「リーフスター」等への接種は、ポット試験での場合、苗移植時に上記接種剤２００ｇで苗の根部を包むようにして接種した。また圃場試験においては、接種材１００ｇをバット上で水に懸濁させ懸濁液とし、そこに移植苗の根を１時間浸すことで接種した。

接種法の検討で、イネの場合は、播種時に上記接種剤を接種し、その後、複数回同様な接種を行うと、安定的な効果が得られることが分かった。

また、移植時の接種は、移植苗を一夜、接種剤に浸漬することで安定的な接種は確立される。

（ポット試験）
１／５０００ａの磁製ポットに篩別した東京農工大学付属広域都市圏フィールドサイエンス研究センターＦＭ本町水田の灰色低地土に肥料を混和して充填し、２０日育苗したリーフスター苗を移植した。ポットは３つの施肥段階を設けた。すなわち、慣行区（５ｋｇ／１０ａ）、慣行の６０％の窒素減肥をした減肥区（２ｋｇ／１０ａ）、無施肥区（０ｋｇ／１０ａ）である。

さらにそれぞれの接種区・無接種区を設け、計６処理区とした。リン酸およびカリウムについては慣行区および減肥区で５ｋｇ／１０ａとなるように施用し、無施肥区にはどちらも与えなかった。ポットは東京農工大学農学部ガラス室内にて、各処理区３連で室内に無作為に配置し、自然光下で栽培した。栽培を開始して１０６日後に植物体を根ごと採取し、穂、茎葉部および根部の部位別に分けた。通風乾燥機内で４８時間、７０℃で乾燥後、乾物重を測定した。また化学分析項目として、乾燥植物体を以下に記すように植物体養分分析、^１５Ｎ自然存在比の測定に供した。

（圃場試験）
圃場における接種試験は、２カ所の水田で行った。

一箇所は、東京農工大学付属広域都市圏フィールドサイエンス研究センターＦＭ本町水田（多摩川沖積土壌）である。ここでは３つの施肥段階、すなわち慣行区（１０ｋｇ／１０ａ）、慣行の３０％の窒素減肥をした減肥区（７ｋｇ／１０ａ）、無施肥区（０ｋｇ／１０ａ）とし、ポット試験と同様にそれぞれ接種区・無接種区を設け、計６処理区とした。リン酸およびカリウムについては慣行区および減肥区で１０ｋｇ／１０ａとなるように施用し、無施肥区にはどちらも与えなかった。

２０日間育苗したイネ「リーフスター」苗を、栽植密度が２２．２株／ｍ^２となるように、一株当たり３本で移植した。

調査項目は、以下の１）、２）、３）とした。

１）生育調査項目として、各処理区の群落内から連続する５つの株を生育調査株として選び、１週間ごとに、草丈、茎数、葉色（ＳＰＡＤ値）の測定を行った。葉色の測定には、ＳＰＡＤメーター（ＭＩＮＯＬＴＡ、 ＳＰＡＤ−５０２）を使用した。

２）成長解析項目として、登熟期である移植後１２７日目に各処理区から２条８株（計１６株）の地上部を採取し、地上部新鮮重を測定した。その内平均的な新鮮重をもつ４株を、穂、葉身（葉とする）、茎及び葉鞘および枯死部（茎とする）の部位別に分け、乾物重を測定した。

３）化学分析項目として、乾物を以下に記す植物体養分分析、^１５Ｎ自然存在比の測定に供した。

もう一箇所は、秋田県大潟村の水田である。ここでは、機械移植前に苗箱を接種剤を懸濁した溶液に浸漬し、その後、移植機で移植した。測定項目は、草丈、茎数、葉色（ＳＰＡＤ）、及び収量構成要素とした。

（植物体養分分析）
植物体の窒素、リン酸、カリウムの吸収について評価するために、植物体中のそれぞれの濃度、および集積量を求めた。まずポット試験及び圃場試験において得られた乾燥植物体を粉砕機で粉砕し、その植物粉を濃硫酸−過酸化水素法により湿式分解した。その後分解液中の窒素濃度をインドフェノール法、リン濃度をバナドモリブデン酸法によって比色し、分光光度計（Shimadzu,UV-160）を用いて定量した。またカリウム濃度は試料溶液を５倍または１０倍に希釈し、炎光光度計（英弘精機産業,FLA型）を用いて測定した。これらから、植物体に含まれる窒素、リン、カリウムの濃度を求め、さらに乾物重の値を乗ずることにより、植物体中のこれらの要素の集積量を計算した。

（^１５Ｎ自然存在比の測定）
接種菌が固定した窒素がリーフスターへと移行しているかを確かめるために、ポット試験および圃場試験において得られた上記乾燥植物体粉末のさらに一部を超微細粉砕機によって処理し、^１５Ｎ自然存在比の測定に供した。測定はカリフォルニア大学デービス校安定同位体施設に依頼分析した。

（結果）
（１／５０００ａポット試験）
（乾物重）
出穂期におけるリーフスターの部位別乾物重の測定値を表１に示した。根部では、慣行区の無接種区を指数表示で１００とすると接種区は２０５となり、接種により根量の乾物重が約２倍に増加していた。

また、減肥区でも、慣行無接種区に比べて１３７の指数を示し、根乾物重が増加する傾向がみられ、ＴＵＡＴ１株の接種は根部の生育を促進することが分かった。

また無施肥区では根部への影響は見られず、施肥段階と接種との間に危険率５％で交互作用の効果が認められたことから、根の生育に関して、施肥量により接種の効果がより発現することが示された。
全乾物重の値は窒素の施肥量および接種により有意な増加を示し（Ｐ ＝ ０．０１）、対照（無接種）区との比較では減肥区および慣行区で有意な乾物蓄積の増加が認められた。また減肥接種区の全乾物重の値は慣行無接種区のそれと類似し、減肥した窒素分を接種により補償できる可能性が示唆された。さらに図1に施肥段階と乾物重の相関を示した。この結果施肥段階と乾物重に高い相関が認められ、接種によって乾物蓄積量が上積みされるように増加していた。

（養分分析）
１ポットあたりのリーフスターへの窒素集積量に関して、分散分析の結果、施肥の段階および接種それぞれの効果において有意な差が認められ（Ｐ ＝ ０．０５、Ｐ ＝ ０．０１）、施肥および接種によって窒素吸収が促進されていることが示された（表1）。

リンおよびカリウム集積量に関しては窒素と同様に、施肥の段階および菌接種それぞれの効果において有意な差が認められ（表１）、施肥および接種によってリンおよびカリウムの吸収が促進されていることが示された。

（δ¹⁵Ｎ値に基づく蓄積窒素の由来）
¹⁵Ｎの自然存在比は、土壌では¹⁵Ｎの割合が高く、窒素の原子量は重くなる。一方空気中の窒素の原子量は¹⁵Ｎの割合が低く、その原子量は軽くなる。この原理に基づくと、化学肥料の窒素や微生物の生物窒素固定作用で固定された窒素は、土壌中に存在する土壌由来の窒素原子より原子量が軽くなる。そのため、化学窒素肥料や生物窒素固定の窒素を主に蓄積した植物体の窒素の原子量は軽くなる。一方、土壌由来の窒素を吸収した植物体の窒素の原子量は高くなる。

表２にポット試験の根と茎葉部の接種及び無接種区のδ¹⁵Ｎ値を示した。その結果、化学肥料の施用が増えると、無施肥区に比べて無接種区ではδ¹⁵Ｎ値が減少し、軽くなっていることが分かった。これは、化学窒素肥料がδ¹⁵Ｎ値に直接的に影響していることを示している。

一方、接種区では、無接種区に比べて、その値は若干増加する傾向を示していた。この結果から、ＴＵＡＴ１株を接種したイネは、発根により化学窒素肥料と共に、土壌中の窒素を、無接種区に比べて多く吸収していることが分かった。

（圃場試験１（農工大水田圃場））
（乾物重）
登熟期におけるリーフスターの地上部部位別乾物重の測定値を表３に示した。分散分析の結果、地上部の全乾物重では施肥および菌接種それぞれの因子について有意差が認められた（Ｐ ＝ ０．０１）。各施肥段階での比較では、慣行区および減肥区において、接種区が対照（無接種）区を有意に上回り、接種効果が認められた。また無施肥区では菌接種の効果は認められなかった。また全体として施肥レベルと接種の有無の両因子間に交互作用が認められ（Ｐ ＝ ０．０５）、施肥段階が上がるにつれ接種効果が表れることが示唆された。地上部部位別にみると、慣行区ではすべての部位で、減肥区では葉と茎で乾物重の有意な増加が認められた。

６処理区のすべての間の多重比較では、減肥接種区と慣行無接種区との間に有意差は認められなかったことから、ポット試験と同様に窒素肥料の減肥が接種により補償できる可能性が示唆された。

（養分分析）
表３に登熟期のリーフスターの窒素、リンおよびカリウムの集積量の値を示した。各栄養素において、施肥および接種の有無両因子の有意な効果が、地上部全体および部位別で認められた（Ｐ ＜０．０５）。さらに地上部全体では乾物重の値と同様に両因子間の交互作用が認められた。

すべての施肥段階にていて、接種により地上部の窒素集積量が増加することが示され、その増加量は無施肥区では１７％、減肥区では３４％、慣行区では３７％であった。ポット試験では植物体中の窒素濃度に菌接種の影響は表れていなかったが、圃場試験では、窒素濃度への菌接種の明瞭な影響が認められ、さらに窒素濃度と施肥の段階には極めて高い相関（Ｒ２＞０．９９）がみられた。すなわちポット試験の結果とは異なり、圃場試験での接種による植物体中への窒素の集積の促進は、施肥の量にさらに上積みをする形で、植物体中の窒素濃度を高めることによって起こっていた。

またリンおよびカリウムの集積に関して、窒素と同様に施肥量および接種により有意な効果が認められ、植物体全体では、リンでは減肥区と慣行区、カリウムでは慣行区において接種による有意な集積量の増加が認められた（表３）。植物体中のリンおよびカリウム濃度は窒素の施肥量と相関する傾向があり、窒素施肥量に伴ってリンやカリウムの吸収も促進されていた。

(圃場試験２（秋田県大潟村水田圃場）)
秋田県大潟村では、「環境創造型農業」を実践し、ＪＡＳ有機栽培や、減農薬無化学肥料栽培が積極的に行われており、また、イネ栽培は大規模な機械化栽培である。そこで、そのような大規模な機械化栽培に、Bacillus属細菌バイオ肥料の接種が適応可能か検証した。

表４に、農家圃場における、生育状況を示した。

草丈に関しては、Ｆ及びＴ圃場のイネに関して、対照（無接種）区と接種区に大きな違いは無かった。

葉のＳＰＡＤ値に関しては、Ｔ圃場が、Ｆ圃場より若干高めに推移し、Ｔ圃場の土壌中の窒素供給力がＦ圃場のそれより高いことを示していた。茎数に関しては、両圃場のイネ共、最高分けつ期（７月２３日）に於いては、接種区の茎数が対照（無接種）区を上回り、８月１４日の出穂期以降に於いても、茎数は接種区が対照（無接種）区を上回った。以下にはデータを示していないが、他の圃場試験でも同様な効果が示されていた。

表５に、秋田県大潟村農家圃場でのＴＵＡＴ１下部接種がイネ品種「こまち」の収量および収量構成要素へ与えた効果を記載した。

Ｆ圃場では、対照区（ＴＵＡＴ１株無接種）および接種区間で、千粒重、登熟歩合に大きな違いは無く、一穂粒数はむしろ低下した。しかし、接種区の穂数が対照区のそれより２２．４％増加し、その結果、接種区の収量も３２．８％増加した。また、Ｔ圃場では、千粒重、登熟歩合、一穂粒数は、対照区と接種区間で大きな違いは無かったが、接種区の穂数が対照区のそれに比べて１４．６%増加し、その結果、接種区の収量が対照区のそれに比べて１７．９％増加した。

このように、慣行施肥区にＴＵＡＴ１株を接種すると、穂数の増加に伴い、イネの子実収量も増加することが分かった。

本願の発明者等は、上述したBacillus pumilus ＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）による根域の拡大や栄養吸収促進効果、特に、イネに施用した場合の優れた根域の拡大、栄養吸収促進効果に着目し、同様の傾向が示されるBacillus pumilusについて、更に、研究を進めることで本願発明を完成させたものである。

本願の発明者等は、引き続き、接種源として使用するＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）の生育ステージの違いがイネの生育や接種菌株の根部定着性に及ぼす影響を検討した。

イネ根部における定着菌数調査のため、ＴＵＡＴ１株のストレプトマイシン１００ｐｐｍ・リファンピシン１００ｐｐｍ二重薬剤耐性変異株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）を接種試験に供した。

品種は、ヒノヒカリを用いた。

試験区は、接種源として使用する菌の生育ステージを比較するために、栄養型細胞接種区および芽胞接種区を設けた。

栄養型細胞は、Trypticase Soy broth培地を用い、３０℃、暗条件、１０５ｒｐｍ、２４時間振とう培養後に集菌し、滅菌水に再懸濁して接種源とした。

芽胞は、Trypticase Soy broth培地を用い、３０℃、暗条件、１０５ｒｐｍ、１０日間振とう培養後に集菌し、生理食塩水に懸濁後、６５℃で３０分間２回湯煎により栄養型細胞を死滅させた後、芽胞を滅菌水に再懸濁して接種源とした。

種籾は、塩水選、６０℃で１０分間温湯消毒、１５℃で７日間浸種後、２５℃で１６時間催芽後に播種し、２０日間育苗した。

接種は、育苗した苗の根部に付着した土壌を除去し、２５℃、暗条件下において、１本あたり１ｍｌの接種源に２４時間根部を浸漬した。

対照（無接種）区は滅菌水に同様に浸漬した。接種苗は、０．５ｇの燐加安１４号を添加した４００ｍｌの無肥料培土を充填した半透明ポットに１株３本植で移植し、ガラス温室において、最低夜温１５℃で３３日間管理した。

調査項目は、イネ生育量、イネ根部におけるＴＵＡＴ１ＳＲ８株の定着性とした。

定着性調査では、根部に付着した土壌を水道水で洗浄した後、生理食塩水中で１０分間振とうした液を根面試料とした。さらに、同生理食塩水中から、根を取出して、細断・磨砕、生理食塩水で希釈した液を根内試料とした。

なお、菌数計測は、培地はリファンピシン１００ｐｐｍ、ストレプトマイシン１００ｐｐｍ、シクロヘキシミド２００ｐｐｍ含有Trypticase Soy agarを使用し、希釈平板法で計測した。

生育量調査の結果、栄養型細胞接種区では４２％、芽胞接種区では８０％%、根重が有意に増加した。

定着性調査の結果、栄養型細胞接種区では、接種２４時間処理直後である移植時の定着菌数は１０^４（cfu／groot）、７日後には検出されなくなったが、芽胞接種区では、移植時の定着菌数は１０^７（cfu／groot） 、移植２５日後でも１０^４〜５（cfu／groot）と安定してイネ根部に定着することが明らかになった。

根部に定着する菌の芽胞割合を調査するため、根面および根内試料を調整後、６５℃で１時間湯煎して栄養型細胞を死滅させたところ、およそ半分程度に減少していたことより、栄養型細胞と芽胞は同程度の割合で混在していると考えられた。

このことは、芽胞は休眠状態にあるのではなく、根部において本菌株の増殖環の１ステージとして存在していると考えられた。

この検討より、接種源を芽胞にすることで、イネ根部での定着性が高まり、根重増加効果が安定化する可能性が示唆され、安定した接種効果を得るための条件として接種源を芽胞にすることが有用であるとの可能性を確認できた。

これらの検討に基づく本願発明は、Bacillus属細菌を培養した後、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理してなる芽胞率１００％の バイオ肥料（微生物肥料）である。

本発明の微生物肥料はBacillus属細菌を培養し、芽胞率１００％としたものであるので、常温（２５℃前後）での長期間の保存が可能になり、菌数およびその効果を長期間（６カ月以上）にわたって維持できるものになる。また、施用したときに作物（特にイネ）の根への定着性が向上したものになる。

発明者等の検討によれば、芽胞することによって、作物（特にイネ）の生育量の増加が、無接種ないし栄養型の接種と比較して高くなることを確認できた。

芽胞を形成することにより温度、水分などのストレス耐性が高められることは従来から知られていたことである。本願の発明者等は、上述した条件で芽胞率１００％とすることによって、Bacillus属細菌に従来から認められていた生育促進、等の特性を一層効果的に発現させ、特に、施用した作物（例えば、イネ）の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果が向上することを見つけ出して本願発明を完成させたものである。

上述したように、Bacillus属細菌を培養した後、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理することにより栄養型を完全に死滅させ、芽胞率１００％とすることができる。

発明者等の検討によれば、栄養型を完全に死滅させて芽胞率１００％とし、その上で、施用した作物の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果などを効果的に向上させる上で、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理を行うことが望ましかった。

なお、６０分間以上の加熱処理時間分間は、複数回に分けて行い、トータルでの加熱処理時間が６０分間以上になるものでもよい。

また、芽胞率１００％とし、その上で、施用した作物の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果などを効果的に向上させると共に、製造コスト・効率なども考慮して、６５℃〜８０℃の温度範囲での加熱処理はトータルで７０分間は越えないことが望ましい。

芽胞率１００％とする芽胞化の条件は、６５℃〜８０℃の温度範囲で、６０分間以上加熱処理する条件を満たすものであればよく、培地に限定は無い。例えば、 Trypticase soy plate（２０ｍｌ培地、９ｃｍ直径シャーレ）で、２８℃にて１０日間〜１４日間培養する。ここから集菌して生理食塩水で洗浄（３回）し、再度、集菌して生理食塩水で懸濁した後、６５℃で３０分間加熱処理する、前記の工程を２回繰り返すことで、６５℃での加熱時間を６０分にする。こうして得た本発明のバイオ肥料（芽胞液）は４℃で冷蔵保存し、保存したバイオ肥料（芽胞液）を滅菌水で希釈して接種源として使用する。

上述した本発明のバイオ肥料は、施用した作物の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果などを効果的に向上させるという観点から、菌濃度が１．０×１０^７〜９．０×１０^７ｃｆｕ／ｇであることが望ましい。

上述した本発明のバイオ肥料において、前記Bacillus属細菌は、Bacillus pumillus ＴＵＡＴ１株とすることができる。Bacillus pumillus ＴＵＡＴ１株は、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６で国際寄託されている菌であって、発明者等の検討によれば、芽胞率１００％とすることで、施用した作物の根域拡大、根部への定着性向上、根の重量増加効果、栄養吸収促進効果などを効果的に向上させることができた。

次に、本発明が提案する粒状バイオ肥料（粒状微生物肥料）は、粒状の肥料用資材を上述した本発明のバイオ肥料に浸漬した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理してなるものである。あるいは、肥料用資材に上述した本発明のバイオ肥料を添加・混合して造粒した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理してなるものである。

ここでの乾燥処理は水分調整を目的として行うものである。

本発明の粒状バイオ肥料における菌濃度を上述した１．０×１０^７〜９．０×１０^７ｃｆｕ／ｇにする上で、乾燥処理は水分２％になるまでにしておくことが望ましく、一方、水分が１５％を超えている状態で乾燥処理を終えた場合、製造時点の粒状バイオ肥料の菌濃度が１．０×１０^７〜９．０×１０^７ｃｆｕ／ｇの範囲にあっても、その後の保存時に菌数が１０^７ｃｆｕ／ｇを下回るようになるので、好ましくない。

なお、乾燥処理後の粒状バイオ肥料の菌濃度を１．０×１０^７〜９．０×１０^７ｃｆｕ／ｇとする上で、水分調整の目的で行う乾燥工程には、高温の火力乾燥ではなく、通風乾燥方式や、流動層方式の乾燥を行うことが望ましい。例えば、通風乾燥機を用いて４時間以内の乾燥により、水分１２％〜２％とすることができる。

上述した本発明の微生物肥料をこのようにして粒状バイオ肥料とすることで、菌数およびその効果を更に長期間にわたって維持できる（１年以上にわたる常温での長期保存可能）ものになる。また、ハンドリング性が向上し、粒状肥料として施用する（例えば、育苗時に培土に混合施用する）ことで、作物の根への定着性を一層向上させ、肥効を向上させることができる。

前記の肥料用資材はケイソウ土、ゼオライト、シリカゲルの中のいずれか一種又は複数種の組み合わせにすることができる。

ケイ酸資材はイネの耐倒伏性向上や健苗効果を有している、そこで、シリカゲルを肥料用資材に用いる、あるいは、シリカゲルを肥料用資材の一部に用いることで、イネ生産における増収・減肥効果を向上させることができる。

これらの肥料用資材を造粒して粒状の肥料用資材とし、これを上述した本発明のバイオ肥料に浸漬した後、乾燥、篩分けを行って平均粒径２〜４ｍｍの粒状バイオ肥料とする。

あるいは、これらの肥料用資材に上述した本発明のバイオ肥料を添加・混合して造粒した後、乾燥、篩分けを行って平均粒径２〜４ｍｍの粒状バイオ肥料とする。

造粒は、転動造粒（ドラム、皿）、押出成形（ペレット）、圧縮成型（ブリケット）など、造粒形式を問わず、種々の造粒形式で行うことができる。

上述したいずれの形式で製造する粒状バイオ肥料であっても、ハンドリング性の観点から、硬度１ｋｇｆ以上であることが望ましい。

前述した本発明の粒状バイオ肥料における前記肥料用資材には、μｍ以上の孔径を有する多孔質資材が含まれることが望ましい。本発明のバイオ肥料において微生物の大きさは１μｍ以上である。そこで、μｍ以上の孔径を有する多孔質資材が用いられていると、μｍ以上の孔の中に微生物を封入できることになるので有利である。

例えば、ケイソウ土（焼成処理していないもの）は、μｍ以上の孔径を有する多孔質資材であるので、Bacillus属菌を封入する多孔質資材として有用である。

上述した複数種の肥料用資材を組み合わせて使用する場合、例えば、シリカゲルとケイソウ土（焼成処理していないもの）とを重量で７：３の割合で用い、これに、総重量の１．２〜３％のバインダー（例えば、デンプン）を加えて、混合、成型（造粒）する。一方で、Bacillus属細菌を培養した後、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理して芽胞率１００％とした本発明のバイオ肥料の溶液を準備する。そして、前記のように準備した粒状の肥料用資材と等量の前記バイオ肥料溶液を添加し、１時間浸漬する。その後、バイオ肥料溶液をデカンテ―ションで除去し、通風乾燥（７０℃、４時間）して水分２〜１２％の本発明の粒状バイオ肥料を得ることができる。

なお、前記において、ケイソウ土、ゼオライト、シリカゲルの中のいずれか一種又は複数種の組み合わせからなる肥料用資材の総重量に対して、１．２〜３％の重量割合で添加するバインダー（例えば、デンプン）は、施用された本発明の粒状バイオ肥料が直ちには崩壊しないが、施用後１週間程度で崩壊するようになる目的で添加するものである。このような目的で使用される肥料用バインダーであればこの技術分野で公知の種々の物を使用できる。

以下、本発明の好ましい実施例について説明するが、本発明は、上述した実施の形態及び、以下に説明する実施例に限られることなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。

Bacillus属であるBacillus pumillus ＴＵＡＴ１株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）は、そのライフサイクルのなかに芽胞と呼ばれる形態をとることができ、温度や水分等の環境条件に対して強い耐性を持つことが可能である。また、ＴＵＡＴ１株はイネにおいて、その根伸長を促進する機能を持ち、養分吸収獲得の増加に貢献することにより、収量を増加させることが可能である。

しかしながら、従来、栄養型、芽胞型の違いがこれらの効果にどの程度、影響するかについては明らかではなかった。そこで、この実施例では、イネへの異なる形態のＴＵＡＴ１株の接種が、イネの生育に対して影響を与えるかについて明らかにした。

なお、この実施例では、イネの根の定着性を適切に評価する目的で、ＴＵＡＴ１株の他に、ＴＵＡＴ１にリファンプシンとストレプトマイシン耐性を付与した抗生物質耐性株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）を用いた。

接種源の調整
栄養型および芽胞の接種源の調整は以下のように行った。

栄養型の接種源の調整は、５０%グリセロール溶液で保管した２種類のＴＵＡＴ１株[ＴＵＡＴ１株と上述したファンプシンとストレプトマイシン耐性を付与した抗性物質耐性株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）]を、５００ｍｌ容三角フラスコを用いて２００ｍｌのTrypticase Soy Broth (ＢＤ社製)に接種した。接種後、２８℃・１１０ｒｐｍの条件で２４時間培養を行った。２４時間の培養後、遠心分離機(ＢＥＣＭＡＮ製 Centrifuge Avanti TM25)により集菌し、同量の生理食塩水を用いて、３回洗浄を行った。洗浄後、１０^７cfu/mlの濃度に滅菌水で調整したものを接種源とした。また、接種源は使用まで４℃の条件で冷蔵保存した。

芽胞の接種源の調整は、２種類のＴＵＡＴ１株（ＴＵＡＴ１株と上述したＴＵＡＴ１ＳＲ８株）をそれぞれ９ｃｍ直径シャーレを用いて作成した２０ｍｌ Trypticase Soy Agarに接種した。接種後、２８℃の条件で培養を行った。培養後、遠心分離機により集菌し、同量の生理食塩水を用いて、３回洗浄を行った。洗浄後、６５℃、３０分間の条件で加熱処理を行い、栄養型細胞を死滅させた。その後、洗浄と加熱処理をもう一度行い、１０^７cfu/mlの濃度に滅菌水で調整したものを接種源とした。また、接種源は使用まで４℃の条件で冷蔵保存した。

栽培試験
供試植物 イネ(Oryza sative) cv. ヒノヒカリ
栽培概要
ヒノヒカリの種子は塩水選、温湯消毒後、１５℃の条件で８日間浸種した。浸種後、半日催芽処理したもみを育苗培土(無肥料育苗培土：肥料入育苗培土＝２：１)に播種した。２０日間育苗した苗の根を水道水で洗浄後、１０^７cfu/mlの濃度に調整したＴＵＡＴ１株とＴＵＡＴ１ＳＲ８株の菌液を、それぞれを異なる試験区に1本あたり１ｍｌ接種した。接種２４時間後、苗を無肥料育苗培土４００ｍｌにリンカアン１４号０．５ｇ添加した土壌を充填した５００ｍｌ容ポットに移植した。移植は１ポットあたり３本とした。移植後、ガラスハウスで栽培し、３３日後にＴＵＡＴ１株とＴＵＡＴ１ＳＲ８株を接種したイネの地上部と根部の重量を測定した。

定着菌数のモニタリング
定着菌数のモニタリングには根面、根内の定着菌数を計数するためにＴＵＡＴ１ＳＲ８株を接種したイネのみを使用した。

1） 根面試料
ガラスハウスで栽培したイネを０、４、７、１４日後にサンプリングした。サンプリングした根に付着した土壌を除去し、サンプルを根重量の約５０倍量の生理食塩水で３０分間振とうした液を根面試料とした
2） 根内試料
根面試料を調整後、根の適量を生理食塩水で摩砕した。摩砕後、根重量の約１０倍量の生理食塩水を添加して得た懸濁液を根内試料とした
３）菌数の測定
リファンピシン１００ｐｐｍ、ストレプトマイシン１００ｐｐｍ、シクロヘキシミド２００ｐｐｍ含有 Trypticase soy plateを用いて希釈平板法で菌数を測定した。

芽胞率の調査
調整した接種源、根面および根内試料を６５℃、１時間の加熱処理を行った。処理前を生菌数、処理後を芽胞数として、割合を算出した。

結果
図２は、この実施例での検討結果を表す参考写真であって、参考写真中、左側が芽胞型、右側が栄養型である。

Bacillus pumilus ＴＵＡＴ１株の栄養型、芽胞の接種源の違いが、イネ根部における定着性に与える影響を検討した結果、栄養型の菌数は根内において、接種直後に４．６×１０^４ cfu/ml検出されていたものが、７日後には検出されないことが示された。根面においても同様な結果であった。

一方、芽胞の菌数は根内において、接種直後に６．３×１０^７cfu/g検出されており、２５日後であっても、５．４×１０^５cfu/gとわずかに減少しているものの、菌数が維持されることが示された(表６)。

２種類のＴＵＡＴ１株接種の栄養型、芽胞の接種源の違いが、イネの生育に対する影響を検討した結果、栄養型の接種と比較して、芽胞型では根重が危険率０．１％で有意に増加していることが認められた（ｔ検定）。

また、ＴＵＡＴ１ ＳＲ８株では、根重および分げつ数が有意に増加していることが認められた(表６)。これらの結果から、ＴＵＡＴ１株の接種源の違いは芽胞の方が、イネへの定着性および生育への効果が高いことが明らかになった。

この実施例での検討により、根部への定着性向上、根の重量増加効果というイネの生育に対する影響の観点で、ＴＵＡＴ１株と、抗生物質耐性株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）とは、栄養型に比較して同様に優れた効果を発揮しているものであることを確認できた。そこで、本発明のバイオ肥料によって発現される作用・効果、機序に関しては、ＴＵＡＴ１株、ＴＵＡＴ１ＳＲ８株のどちらを用いて検討を行っても、この実施例で確認できたように、同様の結果が示されると認められる。

ＴＵＡＴ１株にリファンプシンとストレプトマイシン耐性を付与した抗生物質耐性株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）を Trypticase soy broth液体培地２００ｍｌに接種し、３０℃、１１０ｒｐｍの条件で１１日間培養した。培養後、６５℃、３０分間の条件で２度加熱処理を行い、５．４―５．５×１０^８cfu/mlの芽胞を調製した。

熱処理は湯煎、処理後はサンプルを氷冷することにより行った。加熱処理後、希釈平板法により、菌数の計数を行った。菌数計数用の培地はストレプトマイシン、リファンプシン１００ｐｐｍを含むTrypticase soy plateで行った。菌数の計数は２サンプル２連の平均値で算出した。

結果
検討の結果を以下の表７に示す。

ＴＵＡＴ１ＳＲ８株の芽胞は７０℃の加熱処理では１８０分の処理条件であっても初期の菌数の減少がほとんど認められなかったが、８０℃の処理条件では初期の菌数と比較して１／１０００の菌数濃度まで減少することが示された。このことから、ＴＵＡＴＳＲ８株の耐熱性は７０℃の条件であることが明らかになった。

粒状肥料にＴＵＡＴ１株を封入した資材の効果を検討した。

粒状肥料
シリカゲルとケイソウ土（焼成していないケイソウ土）を重量比７：３の割合で混合し、粒状成型した肥料(造粒促進剤（バインダー）として総重量３％のでんぷんを添加)。

粉状肥料
シリカゲルとケイソウ土重量比７：３の割合で混合(造粒促進剤（バインダー）として総重量３％のでんぷんを添加)した肥料
ＴＵＡＴ１株封入資材の調製
菌液の調製
ＴＵＡＴ１株にリファンプシンとストレプトマイシン耐性を付与した抗生物質耐性株（ＴＵＡＴ１ＳＲ８株）を２００ｍｌ Trypticase soy broth液体培地を含む三角フラスコ１０本に接種し、２８℃、１１０ｒｐｍの条件で１１日間培養を行った。培養後、６５℃、１時間の条件で加熱処理を行い、室温、８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った。遠心後、生理食塩水で３回洗浄し、２リットルの生理食塩水に懸濁し、８．７×１０^８cfu /mlの菌濃度に調整した。

製剤の調製
粒状肥料および粉状肥料２００ｇを７０％エタノールで殺菌したステンレスバットにいれ、調製した菌液２００ｍｌを添加し、１時間の浸漬処理を行った。処理後、通風乾燥器を用いて、７０℃、４時間以内の条件で乾燥を行った。乾燥後、各試験に用いるまで４℃の条件で冷蔵保存した。

接種試験の概要
ヒノヒカリの種子は塩水選、温湯消毒後、１５℃の条件で８日間浸種した。浸種後、半日催芽処理したもみを育苗培土(ラブリ−：春風培土：２：１)に播種した。２８℃、暗所、２日間の条件で発芽させ、２３℃の条件でGroth Cabinetで育苗を行った。育苗の条件については１／４サイズの育苗バットを用い、１バットあたり土壌９００ｍｌを充填後、水３００ｇを灌水し、催芽したもみを２５ｇ、土壌（無肥料）２００ｍｌを覆土した。苗を無肥料育苗培土400mlに燐加安１４号０．５ｇ添加した土壌を充填した５００ｍｌ容ディスポカップに移植した。移植は１ポットあたり３本とした。移植後、検定温室で栽培し、移植時の地上部と根部の乾物重および２ヵ月後の草丈、分げつ、地上部と根部の乾物重量を測定した。移植時の数値は１００本あたりの平均、２ヶ月後は1区６ポット、４連、数値は１ポット当りの平均を示した。

結果を表８に示した。

実施例３では製剤に菌液浸漬方式（粒状の肥料用資材を本発明の微生物肥料に浸漬した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理）を採用していた。この実施例では、効率的な製造方法を検討するため異なる製造方式（肥料用資材に本発明の微生物肥料を添加・混合して造粒した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理）で調製した製剤の菌数を検討した。

実施例３と同様にして８．７×１０^８cfu /mlの菌濃度の菌液を調製した。

実施例３と同様の肥料用資材（シリカゲルとケイソウ土（焼成していないケイソウ土）を重量比７：３の割合で混合し、粒状成型した肥料(造粒促進剤（バインダー）として総重量３％のでんぷんを添加)）を用い、これに等量の菌液（８．７×１０^８cfu /ml）を添加・混合して造粒した。

造粒後、通風乾燥機を用いて７０℃、２時間３０分の条件で乾燥した。

得られた製剤を乳鉢で摩砕した後、約５gに滅菌水４５ｍｌを添加し１０分間振とう後、希釈平板法により菌数を計数した。

結果は表９の通りであった。

この実施例で得た製剤においても、実施例３の場合と同様の菌数を得ることができることが示された。

以上、本発明の好ましい実施形態、実施例を説明したが、本発明は上述した実施の形態、実施例に限られるものではなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。

Claims (6)

1. Bacillus属細菌であるBacillus pumillusＴＵＡＴ１ 株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１３５６）を培養した後、６５℃〜８０℃の温度範囲で６０分間以上加熱処理してなる芽胞率１００％のバイオ肥料を製造する方法。
2. 菌濃度が１．０×１０^７〜９．０×１０^７ｃｆｕ／ｇであることを特徴とする請求項１記載のバイオ肥料の製造方法。
3. 粒状の肥料用資材を請求項１又は２記載のバイオ肥料の製造方法で製造したバイオ肥料に浸漬した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理してなる粒状バイオ肥料を製造する方法。
4. 肥料用資材に請求項１又は２記載のバイオ肥料の製造方法で製造したバイオ肥料を添加・混合して造粒した後、水分１２％〜２％になるまで乾燥処理してなる粒状バイオ肥料を製造する方法。
5. 前記肥料用資材はケイソウ土、ゼオライト、シリカゲルの中のいずれか一種又は複数種の組み合わせからなることを特徴とする請求項３又は４記載の粒状バイオ肥料の製造方法。
6. 前記肥料用資材には、μｍ以上の孔径を有する多孔質資材が含まれることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか一項記載の粒状バイオ肥料の製造方法。