FR2848847A1

FR2848847A1 - Composition cosmetique ou dermopharmaceutique comprenant une enzyme insoluble en milieu aqueux, ainsi que ses utilisations

Info

Publication number: FR2848847A1
Application number: FR0216134A
Authority: FR
Inventors: Isabelle Bonnet; Delphine Rival; Eric Perrier
Original assignee: Coletica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2004-06-25
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: DE10312259B4; FR2848847B1; KR20040054464A; JP2007070366A; US20100080787A1; GB2396297B; DE10312259A1; GB0309765D0; JP2004196763A; GB2396297A; US20040120917A1

Abstract

L'invention concerne une composition cosmétique ou dermopharmaceutique, ainsi que ces utilisations.L'invention concerne principalement une composition cosmétique ou dermopharmaceutique, notamment anti-ride, comprenant une enzyme insoluble en milieu aqueux, en mélange avec au moins un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable.Cette composition est principalement utilisée pour limiter les réactions d'irritation et/ou d'allergie lors de l'utilisation topique de celle-ci.

Description

L'invention concerne une composition cosmétique ou dermopharmaceutique comprenant une enzyme insoluble en milieu aqueux, en mélange avec au moins un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable, ainsi que leurs utilisations.

L'invention concerne principalement l'utilisation d'une composition, telle que décrite précédemment, pour limiter les réactions d'irritation et/ou d'allergie lors de son utilisation topique.

ETAT DE L'ART :
Au cours des dernières années, les acides alpha hydroxylés (AHAs) ont été majoritairement utilisés comme agent anti-rides dans l'industrie cosmétique. De nombreuses études ont démontré qu'en raison de leur pouvoir hydratant, les AHAs permettaient aux couches supérieures de l'épiderme de se gorger d'eau, ce qui entraînait une diminution des forces de cohésion inter-cornéocytaires (Van Scott et al. 1984, J. Am.

Acad. Dermat. 11,867-879 ; Zoe Draelos 2000, Cosmetic Dermatology, 10, 51-57).

Malgré une très forte efficacité, les AHAs, tout comme d'autres produits présentant une activité kératolytique intense (acide salicylique, acides de fruits), sont susceptibles de déclencher de violentes réactions d'irritation qui peuvent se manifester pour des doses parfois inférieures à celles nécessaires pour obtenir un effet kératolytique (Slavin 1998, Clin.

Plast. Surg. 25, 45-52).

Une autre voie d'approche pour le développement d'un actif kératolytique consiste à utiliser des enzymes comme des protéases ou des lipases. En effet, sur la peau humaine normale, deux enzymes à activité protéolytique sont majoritairement responsables du processus de desquamation, la Stratum corneum chymotrypsin enzyme (SCCE) et la

stratum corneum tryptic enzyme (SCTE) (Lundstrôm et al. 1991, Acta Derm. Veneol., 41,471-474 ; Ekholm et al. 2000, J. Invest. Dermatol., 114,56-63). Il apparaît donc naturel d'utiliser des enzymes comme des protéases pour accélérer les phénomènes de desquamation puisque ces enzymes sont présentes physiologiquement à la surface de la peau, ou comme des lipases ou des glycosidases de façon à détruire l'organisation lipidique ou glucidique, ce qui permet d'augmenter les effets de desquamation, ce qui au final, induit une intensification des mécanismes de multiplication des kératinocytes et induit un effet anti-ride.

Cependant l'utilisation d'enzymes est presque impossible en cosmétique : toutes les enzymes sont instables en milieu aqueux aux températures des tests de vieillissements généralement utilisées (45 C), et toutes les enzymes sont généralement mal tolérées par la peau humaine (irritation et allergies sont les signes cliniques évidents de cette intolérance). Ainsi par exemple, les protéases sont particulièrement instables en milieux aqueux puisque, de part leur structure protéique, elles s'autolysent (s'hydrolysent elles-mêmes) en présence d'eau. Certains auteurs ont alors proposé de modifier par mutagenèse dirigée les sites peptidiques autolysés (Varallyay 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 4, 243,56-60 ; Van den Burg 1998, Biotechnol. Appl. Biochem., 27,125- 132), d'immobiliser l'enzyme en la couplant de manière covalente avec un polymère soluble (Lee et al. 1998, Biotechnol. Prog., 14,3, 508-516) ou encore de suspendre l'enzyme dans une phase hydrophobe afin de la séparer de la phase aqueuse de l'émulsion (Brevet 97US-866916).

Le deuxième problème est la très forte allergénicité provoquée par l'application d'enzymes, en particulier de protéases à la surface de la peau (Pepsy et al. 1985, Clin. Allergy, 15,101-115 ; Soto-Mera et al. 2000, Allergy, 55,983-984). Les phénomènes d'intolérance observés sont probablement liés à la pénétration importante des peptides solubles

présents dans les solutions enzymatiques utilisées, soit qu'ils proviennent d'une purification incomplète des enzymes, soit qu'ils proviennent de fragments produits par hydrolyse ou autolyse des enzymes utilisées, les peptides ayant ensuite une forte propriété immunogène.

BUTS DE L'INVENTION
L'invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique pouvant être utilisée sans aucun problème d'irritation ou d'allergie, lorsqu'elle comprend une enzyme.

L'invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique à effet anti-ride, comprenant une enzyme.

L'invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique favorisant une intensification des mécanismes de multiplication des kératinocytes, et un éclaircissement de la peau.

L'invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique favorisant la reconstruction de la barrière cutanée et comprenant une enzyme.

D'autre part, l'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique permettant le traitement des peaux sèches ou grasses, comprenant une enzyme.

DESCRIPTION DE L'INVENTION L'ensemble de ces problèmes techniques est résolu pour la première fois simultanément par la présente invention.

Ainsi, dans le cadre de l'invention, il a été découvert de manière particulièrement inattendue que les enzymes sous forme insoluble en milieu aqueux peuvent être utilisées dans des compositions cosmétiques ou dermopharmaceutiques, notamment sans problème d'irritation ou d'allergie.

Ainsi, selon un premier aspect, l'invention concerne une composition cosmétique ou dermopharmaceutique comprenant au moins une enzyme insoluble en milieu aqueux, en mélange avec au moins un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable.

Les inventeurs entendent par "excipient" l'ensemble des composants autres que le principe actif, qui est l'enzyme sous forme insoluble.

Avantageusement, cette enzyme est choisie parmi le groupe consistant en les lipases, les oxydoréductases, les carbohydrases et les protéases.

Avantageusement, cette enzyme est choisie parmi le groupe consistant en une protéase telle que la subtilisine ou la trypsine ou la chymotrypsine ou la thermolysine, une lipase, une phospholipase, une amylase telle que l'alpha-amylase ou la beta-amylase ou la glucoamylase, la beta D-Glucosidase, la cérébrosidase, une superoxyde dismutase, une peroxydase, une lipoxygénase.

Parmi l'ensemble des modes de réalisation que recouvre cette invention, les inventeurs préconisent trois modes particuliers de réalisation de cette invention :

- un premier mode de réalisation avantageux consiste en ce que l'enzyme est cristallisée de façon à former des cristaux protéiques insolubles, puis ces cristaux sont réticulés chimiquement par exemple par du glutaraldéhyde de façon à insolubiliser ces particules et à les rendre insolubles en milieux aqueux ; - un second mode de réalisation avantageux consiste en ce que l'enzyme est greffée sur un polymère choisi de telle façon qu'il soit insoluble en milieu aqueux ; - un troisième mode de réalisation avantageux consiste en ce que l'enzyme est greffée sur des particules, de préférence micrométriques ou nanométriques, de préférence les particules étant des sphères, des capsules ou des éponges, toutes insolubles en milieu aqueux.

Avantageusement ces polymères ou ces particules, qui sont insolubles en milieu aqueux présentent à leur surface au moins une fonction chimique modifiable, capable d'être utilisée pour former une liaison covalente avec l'enzyme, par exemple ces polymères ou ces particules comprennent au moins : une cellulose, un polystyrène, un alkylcyanoacrylate, une silice, un nylon, un polyamide (synthétique ou issu d'un polyamide naturel), un polyester (synthétique ou issu d'un polyester naturel), ou un de leurs mélanges.

Dans le cadre de cette invention, les sphères peuvent être des sphères telles que décrites dans les brevets US 5,395,620 ; 2,683,159 (US 6,303,150) ; 94/04261 (US 5,691,060) ; US5,912,016 ; FR 2,780,901 (US 6, 197,757) ; FR 2,703,927 (US 5,635,609).

Selon le premier mode de réalisation, l'enzyme cristallisée et réticulée se présente sous forme de cristaux. Ces cristaux ont une taille comprise entre 0,2 et 50 microns, de préférence entre 1 et 5 microns. Ces cristaux ont notamment une forme aiguille ou ovoïde et la taille donnée correspond à leur plus grande dimension.

Ces cristaux sont notamment formés par la technique d'insolubilisation de cristaux d'enzymes par réticulation telle que décrite par ailleurs ( Cross-link enzyme crystal , TIBTECH, 1996,14, 7 (150), 219-259).

Ces cristaux sont de préférence dilués dans un gel, notamment un gel acceptable pour la peau et/ou le cuir chevelu, et/ou les cheveux, afin de préparer une composition cosmétique ou dermopharmaceutique.

Avantageusement, l'excipient contient au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en le butylène glycol, l'eau, le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryl éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparaben, l'éthylparaben, le propylparaben, le butylparaben, le butylène glycol, les tocopherols naturels, la glycérine, le sodium dihydroxycétyle, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, le triisononaoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparafine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, un parfum, le PEG 30dipolyhydroxystérate, les caprique/caprylique triglycérides, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépin de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipelargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8 Beewax, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, les glycérides d'huile de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de Sésame, le cétyl Lactate, le lanolin alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de Titane, les colorants et les pigments.

Avantageusement, la composition précitée est formulée sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en

pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huiledans-eau ou eau-dans-huile ou multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un savon liquide ; un pain dermatologique ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre.

Avantageusement, l'enzyme est greffée par liaison covalente sur une particule ou sur un polymère insoluble en phase aqueuse.

Avantageusement, l'enzyme est greffée sur une sphère, la sphère est préparée à réagir avec l'enzyme à greffer par activation avec un agent bifonctionnel, tel qu'un carbodiimide.

De manière générale, les polymères ou les particules utilisées lors du greffage d'enzyme sur ces particules, peuvent être activées par un agent d'activation. Cette activation consiste principalement en l'activation des fonctions chimiques présentes sur la surface extérieure du polymère ou de la particule.

Avantageusement, l'enzyme cristallisée et réticulée est réticulée par le glutaraldehyde.

De manière générale, et de façon inattendue, les inventeurs, lors de la réalisation de cette invention, ont également montré qu'au cours des étapes d'insolubilisation de l'enzyme, une étape de purification a été obtenue et que des enzymes allergènes utilisées sous forme soluble, devenaient totalement hypoallergéniques une fois utilisées sous leur forme insoluble.

Par ailleurs, l'utilisation d'enzyme sous forme insoluble permet de stabiliser les activités enzymatiques des enzymes ainsi modifiées, ce qui

permet d'envisager leur utilisation dans des applications cosmétiques et dermopharmaceutiques.

L'enzyme rendue insoluble en milieu aqueux permet une amélioration systématique de la tolérance cutanée et la possibilité d'utiliser ces enzymes dans des formulations cosmétiques ou dermopharmaceutiques, notamment hypoallergéniques, alors qu'elles ne peuvent pas être utilisées habituellement.

De manière inattendue, lorsque la composition cosmétique ou dermopharmaceutique décrite précédemment comprend au moins un principe actif (autre que l'enzyme sous forme insoluble), l'enzyme permet l'amélioration de la pénétration trans-cutanée d'au moins ce principe actif.

Ainsi, l'invention concerne selon un second aspect, l'utilisation d'une enzyme insoluble en milieu aqueux, de préférence en mélange avec un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable de manière à former une composition cosmétique ou dermopharmaceutique telle que définie précédemment, pour la réalisation d'un soin cosmétique ou dermopharmaceutique.

Avantageusement, cette enzyme, de préférence en mélange pour former une composition cosmétique ou dermopharmaceutique, peut être utilisée pour limiter les réactions d'irritation et/ou d'allergie lors de son utilisation topique.

Avantageusement, l'utilisation de cette enzyme ou d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique la renfermant, permet de réaliser une intensification des mécanismes de multiplication des kératinocytes, notamment au niveau de la kératine de la peau et/ou des cheveux, notamment permettant un éclaircissement de la peau, de préférence cette enzyme est une protéase.

Avantageusement, cette enzyme ou une composition cosmétique ou dermopharmaceutique la renfermant, peut être utilisée pour réaliser un effet anti-ride.

Avantageusement, cette enzyme ou une composition cosmétique ou dermopharmaceutique la renfermant, peut être utilisée pour la reconstruction de la barrière cutanée de manière à obtenir un effet barrière, de préférence cette enzyme est une lipase ou une amylase.

Avantageusement, cette enzyme ou une composition cosmétique ou dermopharmaceutique la renfermant, permet l'élimination de l'excès de sébum et la disparition de l'effet brillant de la peau, par application topique sur une peau grasse, de préférence cette enzyme est une lipase.

Avantageusement, cette enzyme ou une composition cosmétique ou dermopharmaceutique la renfermant, permet la disparition des squames, et le retour à un état normal par application topique sur une peau sèche, de préférence cette enzyme est une protéase ou une amylase.

Avantageusement, une composition cosmétique ou dermopharmaceutique renfermant cette enzyme et au moins un principe actif (autre que l'enzyme sous forme insoluble), permet d'augmenter la pénétration trans-cutanée d'au moins ce principe actif contenu dans cette composition.

Selon un troisième aspect, l'invention concerne une méthode de soin cosmétique comprenant l'application topique d'une enzyme ou d'une composition cosmétique telle que définie précédemment.

Selon un quatrième aspect, l'invention concerne une méthode soin dermopharmaceutique comprenant l'application topique d'une enzyme, ou d'une composition dermopharmaceutique telle que définie précédemment.

En particulier, pour tous les aspects de l'invention, cette application topique concerne une application externe notamment sur la peau, et/ou le cuir chevelu, et/ou les cheveux.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne seraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.

Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieur quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.

Ainsi, chaque exemple a une portée générale.

D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont données en poids, sauf indication contraire, la température ambiante est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.

EXEMPLES Exemple 1 : Protéase sous forme cristallisée insoluble,
La subtilisine est tout d'abord cristallisée ce qui permet d'éliminer les impuretés, puis la forme cristalline est stabilisée grâce à une réticulation des protéines au glutaraldéhyde. La technique utilisée est celle décrite dans différentes publications telles que TIBTECH, 1996,14, 7(150), 219-259.

Les cristaux protéiques ainsi obtenus sont parfaitement insolubles en milieu aqueux. Par ce procédé, les interactions des molécules d'enzymes entre elles sont diminuées et le nombre de sites de coupure reconnus par le site actif des enzymes est diminué. L'autolyse des

protéases est ainsi réduite, ce qui permet ainsi d'obtenir une très bonne stabilité enzymatique en milieu aqueux.

Les cristaux ainsi obtenus ont une taille comprise entre 0,2 et 50 m, et sont donc incapables de pénétrer au sein des couches profondes du tissu cutané ce qui limite ou élimine les réactions d'intolérance classiquement observées lorsque des enzymes libres sont utilisées.

Un gel est formé en diluant les cristaux à une concentration de 10% dans un gel de xanthane à 0,5% préalablement tamponné à pH=5,8 (tampon acétate de sodium 100 mM, CaCl2 20 mM). L'ensemble est laissé sous agitation mécanique pendant 10 minutes puis 2 % de conservateur sont ajoutés afin de stabiliser bactériologiquement le produit.

L'efficacité de l'invention a été tout d'abord estimée par l'intermédiaire d'un test à la DHA et en comparaison avec un acide #- hydroxylé couramment utilisé, l'acide glycolique. Brièvement, le principe du test est le suivant : 4 zones de l'avant bras de 20 volontaires sont traitées à l'aide d'une préparation cosmétique contenant 5% de DHA, 2 fois par jour pendant 3 jours. Une coloration intense résultant de la réaction de la DHA avec les protéines cutanées est induite ; sous l'application quotidienne de différentes formulations kératolytiques, cette coloration qui disparaît peut être suivie et comparée, en utilisant une méthode chromamétrique (Chromamètre Minolta).

L'utilisation d'une formulation contenant 2% du gel décrit ci-dessus permet de diminuer l'indice mélanique de 16% par rapport à une zone témoin. Cette diminution est 183% supérieure à celle observée après traitement par une crème placebo et 128% supérieure à celle observée après traitement par une crème contenant 3% d'acide glycolique. Une formulation contenant l'invention est donc deux fois plus efficace qu'une formulation contenant 3% d'acide glycolique, actif kératolytique bien connu pour ses propriétés exfoliantes.

L'effet anti-ride qui doit ainsi logiquement découler de l'effet kératolytique décrit ci-dessus a été évalué dans une deuxième série d'expérience. Après application sur 20 volontaires pendant 28 jours d'une formulation contenant 2% de gel préparé selon l'exemple 1, l'apparition et l'évolution des rides, étudiées par empreintes de silicones au niveau de la patte d'oie, ont été largement réduites comparativement à une zone témoin ayant reçu une formulation placebo (-30% après 15 jours de traitement).

Evaluation du potentiel de sensibilisation cutanée chez le cobaye :
Le gel décrit ci-dessus est soumis au test de maximisation décrit par Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE.

Utilisé tel quel (100%), le gel est classé comme non sensibilisant par contact avec la peau (hypoallergénique, classe I) alors que la même enzyme utilisée sous forme telle quelle (c'est-à-dire sous forme non insolubilisée), selon ce test, est classée comme très sensibilisante .

Exemple 2 : Détermination de l'activité protéasique des cristaux insolubles @près incorporation dans un gel cosmétique
2.1. Afin de reproduire le plus fidèlement possible la situation rencontrée in vivo, l'inventeur utilise un dosage d'activité protéasique faisant appel à un substrat de haut poids moléculaire, la caséine.

En pratique, une solution de caséine de concentration 0,66% (p/v) diluée dans un tampon phosphate de potassium 50mM, pH=7,5, est mise en présence des cristaux réticulés insolubles de l'exemple 1 de l'invention, ou d'une protéase commercialement disponible, suspendus dans un gel (tel

que décrit dans l'exemple 1) (dilution dans un tampon acétate de sodium lOmM / acétate de calcium 5 mM, pH=7,5).

Après incubation de 10 minutes à 37 C, les acides aminés libérés dans le milieu réactionnel au cours de la réaction enzymatique sont récupérés par filtration puis dosés à l'aide du réactif de Folin. Ce réactif absorbe à 660 nm lorsqu'il est réduit notamment par la tyrosine, le tryptophane, la cystéine et l'histidine. L'activité enzymatique est alors directement proportionnelle à l'absorbance à 660 nm du milieu réactionnel (Folin et al.

1929, J. Biol. Chem, 73,627 ; Anson et al. 1938, J. Gen. Physiol., 22,79- 89). Les résultats sont indiqués dans le tableau 1.

Composition <SEP> de <SEP> Activité <SEP> en <SEP> U/g
<tb> l'échantillon
<tb> Cristaux <SEP> de <SEP> subtilisine
<tb> réticulés <SEP> de <SEP> l'exemple <SEP> 1 <SEP> 1,33 <SEP> U/g
<tb> Subtilisine <SEP> libre <SEP> (Bacillus
<tb> licheniformis) <SEP> 0,62 <SEP> U/g
<tb> [C]= <SEP> 0,0061% <SEP> 0,62 <SEP> U/g
<tb>

Tableau 1
2.2 Un gel réalisé selon l'exemple 1, contenant la subtilisine cristallisée réticulée insoluble (dite ci-après "cristaux de subtilisine"), et un gel contenant la subtilisine commercialement disponible (extraite de Bacillus licheniformis) sont placés à 4 C, 20 C et 45 C. Le dosage de l'activité protéasique s'effectue selon la technique décrite ci-dessus.

Les résultats, donnés en % d'activité retrouvée versus l'activité initiale à T=0, sont indiqués dans les tableaux ci-dessous.

T=1 <SEP> mois <SEP> Cristaux <SEP> de <SEP> subtilisine <SEP> Subtilisine <SEP> libre
<tb> 4 C <SEP> 104,5 <SEP> 98,5
<tb> 20 C <SEP> 103,6 <SEP> 93
<tb> 45 C <SEP> 98,4 <SEP> 51,5
<tb> T=6 <SEP> mois <SEP> Cristaux <SEP> de <SEP> subtilisine <SEP> Subtilisine <SEP> libre
<tb> 4 C <SEP> 135,3 <SEP> 79,8
<tb> 20 C <SEP> 126,8 <SEP> 53,2
<tb> 45 C <SEP> 90,5 <SEP> 4,9
<tb> T=12 <SEP> mois <SEP> Cristaux <SEP> de <SEP> subtilisine <SEP> Subtilisine <SEP> libre
<tb> 4 C <SEP> 130 <SEP> 72
<tb> 20 C <SEP> 139 <SEP> 34,6
<tb> 45 C <SEP> 47,5 <SEP> 0
<tb>
L'invention présente donc une très forte stabilité enzymatique, quelle que soit la température de stockage.

Exemple 3 : Autres enzymes cristallisées et réticulées
Lipases et glucosidases peuvent également être purifiées puis cristallisées, puis être réticulées de façon chimique pour obtenir des particules insolubles.

Ainsi, des lipases ou des amylases fabriquées par fermentations, ont pu être insolubilisées sous forme de cristaux puis utilisées pour des applications cosmétiques.

Les effets cosmétiques obtenus ont été évalués sur des séries de 15 volontaires. Les cotations étaient effectuées par un expert dermatologue entraîné à une cotation des résultats anti-ride, peaux grasses, et peaux normalisées après une agression à l'aide de 10% de

lauryle sulfate de sodium. La cotation est la suivante : de non efficace (-) très efficace (+++) ; nuh : non utilisable sur humain pour des problèmes d'allergies :

<tb>
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> Effet <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> barrière <SEP> grasses
<tb> Lipase <SEP> libre <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb> Lipase <SEP> Parfaitement <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> Effet <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> barrière <SEP> grasses
<tb> Phospholipase <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb> libre
<tb> Phospholipase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> Effet <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> barrière <SEP> sèches
<tb> Alpha <SEP> Amylase <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb> libre
<tb> Alpha <SEP> Amylase <SEP> Parfaitement <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Bêta <SEP> Amylase <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb> libre
<tb> Beta <SEP> Amylase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Glucoamylase <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb>

<tb>
<tb> libre
<tb> Glucoamylase <SEP> Parfaitement <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Cérébrosidase <SEP> Allergies <SEP> sévères <SEP> nuh <SEP> nuh <SEP> nuh
<tb> libre
<tb> Cérébrosidase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb>
Exemple 4 : Greffage d'enzymes sur des particules insolubles en phase aqueuse La cérébrosidase peut être greffée sur des particules de la façon suivante : 10g de sphères fabriquées tel que décrit dans les brevets COLETICA US 5,395,620 ; FR 2,683,159 (US 6,303,150) ; 94/04261 (US 5,691,060) ; US 5,912,016 ; 2,780,901 (US 6,197,757), FR 2,703,927 (US 5,635,609) sont placées à réagir avec du carboxydiimide (de 1 à 30g pour 10g de sphères) dans une solution aqueuse maintenue à un pH compris entre 4 et 8 de façon à activer la formation de groupes carboxyliques réactifs . Les enzymes que l'on souhaite greffer sont alors placées en contact du produit de réaction et après greffage pendant 1 à 24h, à une température comprise entre 4 et 60 C, le produit de réaction est rincé par simple filtration ou décantation puis séparé de son milieu réactionnel, avant d'être suspendu dans un gel pour faciliter sa commercialisation.

De la même façon, des lipases, des protéases et des amylases fabriquées par fermentations, ont pu être insolubilisées sous forme de particules insolubles puis utilisées pour des applications cosmétiques.

Les effets cosmétiques obtenus ont été évalués sur des séries de 15 volontaires. Les cotations étaient effectuées par un expert dermatologue entraîné à une cotation des résultats anti-ride, peaux

grasses, et peaux normalisées après une agression à l'aide de 10% de lauryle sulfate de sodium. La cotation est la suivante : de non efficace(-) à très efficace (+++) ; nuh : non utilisable sur humain pour des problèmes d'allergies :

<tb>
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> Effet <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> barrière <SEP> grasses
<tb> Lipase <SEP> libre <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh
<tb> sévères
<tb> Lipase <SEP> Parfaitement <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP>
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> Effet <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> barrière <SEP> grasses
<tb> Phospholipase <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh <SEP>
<tb> libre <SEP> sévères
<tb> Phospholipase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Tolérance <SEP> Anti-ride <SEP> ffet <SEP> barrière <SEP> Effet <SEP> Peaux
<tb> sèches
<tb> Alpha <SEP> Amylase <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh
<tb> libre <SEP> sévères
<tb> Alpha <SEP> Amylase <SEP> Parfaitement <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Beta <SEP> Amylase <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh
<tb> libre <SEP> sévères
<tb> Beta <SEP> Amylase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +
<tb>

<tb>
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Glucoamylase <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh
<tb> libre <SEP> sévères
<tb> Glucoamylase <SEP> Parfaitement <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb> Cérébrosidase <SEP> Allergies <SEP> nuh <SEP> Nuh <SEP> nuh
<tb> libre <SEP> Sévères
<tb> Cérébrosidase <SEP> Parfaitement <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> insolubilisée <SEP> toléré
<tb>
Exemple 5 : Greffage de beta-D glucosidase sur des particules insolubles en phase aqueuse Exemple 5a : La beta-D glucosidase extraite d'amande douce (Sigma) est greffée sur des particules insolubles selon un protocole comprenant 3 phases : - Une phase d'activation des fonctions carboxyliques des protéines utilisées pour la fabrication de particules insolubles fabriquées selon le brevet COLETICA US 5,395,620. Cette étape est réalisée par ajout à
100 gr de microsphères en culot, de 0,4g de 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide (Sigma) solubilisé dans du tampon
Hepes lOmM, pH7,5. Cette solution est agitée pendant 1 heure à température ambiante puis les sphères sont récupérées après centrifugation à 2300 tours/minute pendant 3 minutes. Le culot est rincé 3 fois au tampon Hepes lOmM, pH7,5.

- Une phase de couplage avec l'enzyme où la beta-D glucosidase est ajoutée en solution à une teneur de 0,04% dans du tampon carbonate
0,1M, pH8,5.

- La solution est agitée pendant 1 heure à température ambiante.

- Une phase de rinçage, pour éliminer l'enzyme libre : la solution est centrifugée à 2300 tours/minutes pendant 3 minutes puis le surnageant est éliminé. Les sphères greffées avec l'enzyme sont rincées 3 fois avec du tampon acétate 0,1M, pH 6,2.

Les sphères greffées rincées sont mises en solution à une teneur de
20% dans un milieu tampon acétate 0,1M, pH 6,2.

Mise en évidence de la stabilisation de l'enzyme par greffage :
Le produit issu de l'exemple 5a est dosé en terme d'activité beta DGlucosidase puis placé à 20 C et 45 C pour une étude de stabilité de l'activité enzymatique au cours du temps à ces 2 températures. Un échantillon constitué par l'enzyme libre, la beta D-Glucosidase d'amande douce mise en solution dans le tampon acétate 0,1M, pH 6,2 à la même concentration, est réalisé afin de tester la stabilité à 20 C et 45 C.

Principe du dosage :
La mesure de l'activité beta D-Glucosidase est réalisée par une technique fluorimétrique utilisant une sonde, la 4-Methylumbelliferyl B-DGlucopyranoside (Molecular Probes), qui hydrolysée par l'enzyme permet la libération de l'oligosaccharide et du 4-Methylumbelliferone, un composé qui est fluorescent à des longueurs d'onde d'excitation et d'émission respectivement de 360/460 nm.

Les résultats sont exprimés en % d'activité par rapport à l'activité mesurée à t=0.

Enzyme greffée (exemple 5a)

<tb>
<tb> Temps <SEP> Activité <SEP> à <SEP> 20 C <SEP> Activités <SEP> à <SEP> 45 C
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb>

<tb>
<tb> 5 <SEP> 100 <SEP> 88,5
<tb> 12 <SEP> 100 <SEP> 24 <SEP>
<tb> 19 <SEP> 100 <SEP> 11,5 <SEP>
<tb>
Enzyme libre dans tampon acétate :

<tb>
<tb> Temps <SEP> Activité <SEP> à <SEP> 20 C <SEP> Activités <SEP> à <SEP> 45 C
<tb> (jours) <SEP> (%) <SEP> (%)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> 72 <SEP> 28
<tb> 12 <SEP> 59 <SEP> 6
<tb> 19 <SEP> 52,5 <SEP> 4
<tb>
@
Le greffage de l'enzyme sur les sphères a permis de stabiliser l'activité enzymatique à 20 C, puisque 100% d'activité est obtenue après 1 mois à 20 C, et de ralentir la chute de l'activité à 45 C par rapport à celle observée pour l'enzyme libre.

Stabilité des échantillons après incorporation dans une formulation :
La crème utilisée est composée de :
Phase aqueuse : Butylène Glycol 4%
Water qsp 100
Phase huileuse : Steareth-2 3%
Steareth-21 2%
Glycol-15 Stearyl Ether 9%
Cetearyl Alcohol 2,5%
Ajout ensuite de : Phenoxyethanol,Methylparaben, Ethylparaben
Propylparaben, Butylparaben 0,5%

Butylène Glycol 0,5%
D Mixed tocopherols 0,2%
Produit de l'invention 5%
La mesure de l'activité beta D-Glucosidase des échantillons incorporés dans une crème est réalisée directement sur la phase aqueuse, obtenue après séparation des phases aqueuse et huileuse selon le protocole suivant : la crème est diluée 5 fois dans un tampon acide citrique O,lM/di-Nahydrogenophosphate 0,2M, pH5. 10% de NaCI sont alors ajoutés et le mélange est soumis à une agitation très forte pendant 5 minutes puis centrifugée à 5000 tours/minutes pendant 25 minutes. La mesure de l'activité est réalisée directement sur la phase aqueuse obtenue.

Stabilité de la crème contenant l'échantillon obtenu selon l'exemple 5a ou l'enzyme libre :

<tb>
<tb> Temps <SEP> Exemple <SEP> 5a <SEP> Enzyme <SEP> libre
<tb> (jours) <SEP> Activité <SEP> à <SEP> 20 C <SEP> Activité <SEP> à <SEP> 20 C
<tb> (%) <SEP> (%)
<tb> 0 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 97 <SEP> 10
<tb> 15 <SEP> 43,5 <SEP> 2 <SEP>
<tb> 22 <SEP> 99,5 <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> 88 <SEP> 0 <SEP>
<tb>

L'activité enzymatique mesurée dans les formulations à 20 C reste stable car près de 90% d'activité est conservée après 1 mois à 20 C pour l'enzyme greffée sur les sphères.

Exemple 5b : La beta D-glucosidase ou toute autre enzyme commercialement disponible est greffée sur des particules insolubles selon le protocole de l'exemple 5a ci-dessus, mais en utilisant des particules insolubles de type billes de cellulose, bille de polystyrènes, bille d'alkylcyanoacrylate, billes de nylon, de silice, de polyamides, de polyesters, ou toute bille présentant à sa surface une fonction chimique modifiable capable d'être utilisée pour former une liaison covalente avec une fonction chimique d'une enzyme, en utilisant de préférence un agent soit capable d'activer ces fonctions chimiques, soit un agent bifonctionnel permettant la réaction entre les fonctions chimiques décrites ci-dessus.

Exemple 6: Utilisation des produits de l'invention dans des formulations cosmétiques ou pharmaceutiques de type émulsion huile dans eau Formulation 6a : A Eau qsp 100
Butylène Glycol 2
Glycérine 3
Sodium Dihydroxycetyl 2
Phosphate,
Isopropyl Hydroxycetyl Ether B Glycol Stearate SE 14 Triisononaoin 5
Octyl Cocoate 6

C Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben, pH ajusté à 5,5 D Produits de l'invention 0,0001 - 10 % Formulation 6b : A Eau qsp 100
Butylene Glycol 2
Glycerine 3
Polyacrylamide, Isoparafin, 2,8
Laureth-7 B Butylene Glycol, 2
Methylparaben,
Ethylparaben, Propylparaben ;
Phenoxyethanol, 2
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben
Butylene Glycol 0,5 D Produits de l'invention 0,0001 - 10 %

Formulation 6c :
A Carbomer 0,50
Propylene Glycol 3
Glycerol 5
Eau qsp 100
B Octyl Cocoate 5
Bisabolol 0,30
Dimethicone 0,30
C Sodium Hydroxide 1,60
D Phenoxyethanol, 0,50
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben E Parfum 0,30 F Produits de l'invention 0,0001 - 10 % Exemple 7de l'invention Utilisation desProduits de l'invention dans une formulationde type eau danshuile A PEG 30 - 3 dipolyhydroxystearate
Capric Triglycerides 3
Cetearyl Octanoate 4

Dibutyl Adipate 3
Grape Seed Oil 1,5
Jojoba Oil 1,5
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben
B Glycerine 3
Butylene Glycol 3
Magnesium Sulfate 0,5
EDTA 0,05
Eau qsp 100 C Cyclomethicone 1
Dimethicone 1 D Parfum 0,3 E Produits de l'invention 0,0001 - 10 %

8 de l'invention: Utilisation des oroduits de l'invention dans une formulation de tvoe shamooina ou ael douche A Xantham Gum 0,8
Eau qsp 100 B Butylene Glycol, 0,5
Methylparaben,

Ethylparaben, Propylparaben
Phenoxyethanol, 0,5
Methylparaben,
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben C Citric acid 0,8 D Sodium Laureth Sulfate 40,0 E Produit de l'invention 0,0001 - 10 % Exemple 9 de l'invention: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de type rouge à lèvres et autres produite anhydres A Mineral Wax 17,0 Isostea ryl Isostea rate 31,5
Propylene Glycol Dipelargonate 2,6
Propylene Glycol Isostearate 1,7
PEG 8 Beewax 3,0
Hydrogenated Palm Kernel Oil 3,4
Glycerides,
Hydrogenated Palm Glycerides
Lanoline Oil 3,4
Sesame Oil 1,7
Cetyl Lactate 1,7
Mineral Oil, Lanolin Alcohol 3,0

B Castor Oil Qsp 100
Titanium Dioxide 3,9
CI 15850 :1 0,616
CI 45410:1 0,256
CI 19140 :1 0,048
CI 77491 2,048 C Produits de l'invention 0,0001- 5 % Exemple 10 de l'invention: Utilisation des produits de l'invention dans une formulation de gels aqueux (contours de l'#il, amincissants, etc..

A Eau Qsp 100
Carbomer 0,5
Butylene Glycol 15
Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,5
Propylparaben, Butylparaben,
Ethylparaben B Produits de l'invention 0,0001 - 10 % Exemple 11 : Evaluation de l'acceptation cosmétique d'une 1 ration contenant une enzyme insoluble de l'invention
Les essais de toxicologie ont été réalisés sur le composé obtenu selon l'exemple 1 par une évaluation oculaire chez le lapin, par l'étude de l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat et par l'étude du pouvoir sensibilisant sur le cobaye. Une étude d'hypoallergénicité sur volontaires humains a ensuite été effectuée avec

une préparation comprenant le composé décrit dans l'exemple 1 dilué à 10% dans un gel de carbopol à 0,45%, pH=5,8.

Evaluation de l'irritation primaire cutanée chez le lapin :
La préparation décrite ci-dessus est appliquée sans dilution à la dose de 0,5 ml sur la peau de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive OCDE concernant l'étude de l'effet irritant/corrosif aigu sur la peau .

Les produits sont classés selon les critères définis dans l'arrêté du 20/04/99 pris en application de la directive de base 67/548/CEE et ses amendements successifs.

La préparation ainsi testée n'est pas classée parmi les produits irritants pour la peau.

Evaluation de l'irritation oculaire chez le lapin
La préparation décrite ci-dessus a été instillée pure en une seule fois, à raison de 0,1 ml, dans l'oeil de 3 lapins selon la méthode préconisée par la directive de base 67/548/CEE et ses amendements successifs.

Les résultats de ce test permettent de conclure que la préparation n'est pas classée parmi les produits irritants pour les yeux.

Essai sur l'absence de toxicité anormale par administration orale unique chez le rat :
Les préparations décrites ont été administrées en une fois par voie orale à la dose de 5g/Kg de poids corporel, à 5 rats mâles et 5 rats femelles selon un protocole inspiré de la directive de l'OCDE n 401 du 24 février 1987 et adapté aux produits cosmétiques.

Les DLO et DL50 sont trouvées supérieures à 5000 mg/Kg. La préparation testée n'est donc pas classée parmi les préparations dangereuses par ingestion.

Evaluation du potentiel de sensibilisation cutanée chez le cobaye:
La préparation décrite est soumise au test de maximisation décrit par Magnusson et Kligmann, protocole en accord avec la ligne directrice n 406 de l'OCDE.

La préparation est classée comme non sensibilisante par contact avec la peau.

Test d'hvpoalleraénicité sur volontaires humains
L'hypoallergénicité du produit a été testée sur le produit décrit dans l'exemple 1 et dilué à 10 % dans un gel. Le test a été effectué sur un panel de 100 volontaires sains.

Le produit est appliqué sous patch occlusif pendant 24h,, puis réappliqué sous patch pendant 2 jours pour un total de 9 applications (phase d'induction). Après une période de 2 semaines, d'autres patchs contenant le produit sont appliqués sur la peau des volontaires et laissés en contact pendant 24h. Les signes cliniques de l'irritation et de la sensibilisation cutanée sont évalués 24,48 et 72 heures après le retrait du patch (phase challenge).

Dans ces conditions expérimentales, le produit a été montré comme étant dépourvu de potentiel allergisant.

Exemple 12 : Augmentation de la pénétration de l'acide ascorbique contenu dans une formulation cosmétique, en présence du produit de l'invention.

Les essais ont été réalisés sur la formulation 6a, dans laquelle on a remplacé le produit de l'invention (D) par : # Formule A : 2% du produit de l'invention tel que décrit dans l'exemple
1, et 2% d'acide ascorbique # Formule B : 2% d'acide ascorbique seulement.

Les deux formulations ont été déposées (50 pg/cm2) sur une biopsie humaine montée sur cellules de diffusion. La quantité d'acide ascorbique capable de traverser la biopsie est quantifiée dans le compartiment receveur de la cellule de diffusion, et est quantifiée par HPLC.

Après 24 heures de diffusion, la quantité d'acide ascorbique capable d'être retrouvée dans le compartiment receveur est 4 fois plus importante pour la formulation A que pour la formulation B. Le produit de l'invention permet donc une meilleure pénétration de l'acide ascorbique présent dans la formulation ; il est donc un agent promoteur de pénétration des principes actifs.

Exemple 13 : Augmentation de la pénétration de caféine contenue dans une formulation cosmétique, en présence du produit de l'invention.

Les essais ont été réalisés sur la formulation 6a, dans laquelle on a remplacé le produit de l'invention (D) par : # Formule A : 2% du produit de l'invention tel que décrit dans l'exemple
1, et 3% de caféine, # Formule B : 3% de caféine seulement.

Les deux formulations ont été déposées (50 g/cm2) sur une biopsie humaine montée sur cellules de diffusion. La quantité de caféine capable de traverser la biopsie est quantifiée dans le compartiment receveur de la cellule de diffusion, et est quantifiée par HPLC.

Après 24 heures de diffusion, la quantité de caféine capable d'être retrouvée dans le compartiment receveur est 47% plus importante pour la formulation A que pour la formulation B. Le produit de l'invention permet donc une meilleure pénétration de la caféine présente dans la formulation ; il est donc un agent promoteur de pénétration des principes actifs.

Claims

REVENDICATIONS 1. Composition cosmétique ou dermopharmaceutique comprenant au moins une enzyme insoluble en milieu aqueux, en mélange avec au moins un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable.
2. Composition, selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'enzyme est choisie parmi le groupe consistant en les lipases, les oxydoréductases, les carbohydrases, et les protéases.
3. Composition, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'enzyme est choisie parmi le groupe consistant en une protéase telle que la subtilisine ou la trypsine ou la chymotrypsine ou la thermolysine, une lipase, une phospholipase, une amylase telle que l'alpha-amylase ou la beta-amylase ou la glucoamylase, la beta D-Glucosidase, la cérébrosidase, une superoxyde dismutase, une peroxydase, une lipoxygénase.
4. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'enzyme est une enzyme cristallisée et réticulée ; ou greffée sur un polymère insoluble ; ou greffée sur des particules, de préférence micrométriques ou nanométriques, les particules étant de préférence des sphères, des capsules ou des éponges.
5. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les polymères ou les particules insolubles présentent à leur surface au moins une fonction chimique modifiable capable d'être utilisée pour former une liaison covalente avec l'enzyme, par exemple ces particules comprennent au moins : une cellulose, un polystyrène, un alkylcyanoacrylate, une silice, un nylon, un polyamide (synthétique ou issu d'un polyamide naturel), un polyester (synthétique ou issu d'un polyester naturel), ou un de leurs mélanges.

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6. Composition, selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'enzyme cristallisée et réticulée forme des cristaux ayant une taille comprise entre 0,2 et 50 p,m, de préférence entre 1 et 5 m.
7. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'excipient contient au moins un composé choisi parmi le groupe consistant en le butylène glycol, l'eau, le stéareth-2, le stéareth-21, le glycol-15 stéaryl éther, le cétéaryl alcool, le phénoxyéthanol, le méthylparaben, l'éthylparaben, le propylparaben, le butylparaben, le butylène glycol, les tocopherols naturels, la glycérine, le sodium dihydroxycétyle, l'isopropyl hydroxycétyl éther, le glycol stéarate, le triisononaoine, l'octyl cocoate, le polyacrylamide, l'isoparafine, le laureth-7, un carbomer, le propylène glycol, le glycérol, le bisabolol, une diméthicone, l'hydroxyde de sodium, un parfum, le PEG 30dipolyhydroxystérate, les caprique/caprylique triglycérides, le cétéaryl octanoate, le dibutyl adipate, l'huile de pépin de raisin, l'huile de jojoba, le sulfate de magnésium, l'EDTA, une cyclométhicone, la gomme de xanthane, l'acide citrique, le lauryl sulfate de sodium, les cires et les huiles minérales, l'isostéaryl isostéarate, le dipelargonate de propylène glycol, l'isostéarate de propylène glycol, le PEG 8 Beewax, les glycérides d'huile de coeur de palme hydrogénée, les glycérides d'huile de palme hydrogénée, l'huile de lanoline, l'huile de Sésame, le cétyl Lactate, le lanolin alcool, l'huile de ricin, le dioxyde de Titane, les colorants et les pigments.
8. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle est formulée sous une forme choisie parmi le groupe consistant en une solution, aqueuse ou huileuse, une crème ou un gel aqueux ou un gel huileux, notamment en pot ou en tube, notamment un gel douche, un shampoing ; un lait ; une émulsion, une microémulsion ou une nanoémulsion, notamment huile-dans-eau ou eau-dans-huile ou

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multiple ou siliconée ; une lotion, notamment en flacon de verre, de plastique ou en flacon doseur ou en aérosol ; une ampoule ; un savon liquide ; un pain dermatologique ; une pommade ; une mousse ; un produit anhydre, de préférence liquide, pâteux ou solide, par exemple sous forme de bâtonnet, notamment sous forme de rouge à lèvre.
9. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que l'enzyme est greffée par liaison covalente sur une particule ou sur un polymère insoluble en phase aqueuse.
10. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que l'enzyme est greffée sur une sphère, la sphère est préparée à réagir avec l'enzyme à greffer par activation avec un agent bifonctionnel, tel qu'un carbodiimide.
11. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'enzyme cristallisée et réticulée est réticulée par le glutaraldéhyde.
12. Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la composition renferme également au moins un principe actif (autre que l'enzyme sous forme insoluble), la présence de l'enzyme favorisant la pénétration trans-cutanée d'au moins ce principe actif.
13. Utilisation d'une enzyme insoluble en milieu aqueux pour la fabrication d'une composition, de préférence en mélange avec un excipient cosmétiquement ou dermopharmaceutiquement acceptable, de manière à former une composition cosmétique ou dermopharmaceutique telle que définie aux revendications 1 à 12, pour la réalisation d'un soin cosmétique ou dermopharmaceutique.
14. Utilisation, selon la revendication 13 pour limiter les réactions d'irritations et/ou d'allergies lors de l'utilisation topique de cette enzyme.

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15. Utilisation, selon la revendication 13 ou 14 pour réaliser une intensification des mécanismes de multiplication des kératinocytes, notamment au niveau de la kératine de la peau et/ou des cheveux, notamment afin d'obtenir un effet éclaircissant, de préférence cette enzyme est une protéase.
16. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 13 à 15 pour réaliser un effet anti-ride.
17. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, pour favoriser la reconstruction de la barrière cutanée de manière à obtenir un effet barrière, de préférence cette enzyme est une lipase ou une amylase.
18. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14, permet l'élimination de l'excès de sébum et la disparition de l'effet brillant de la peau, par application topique sur une peau grasse, de préférence cette enzyme est une lipase.
19. Utilisation, selon l'une quelconque des revendications 13 ou 14 pour favoriser le traitement des peaux sèches, de préférence cette enzyme est une protéase ou une amylase.
20. Utilisation d'une enzyme insoluble en miieu aqueux pour la fabrication d'une composition cosmétique ou dermopharmaceutique, selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13, et contenant au moins un principe actif (autre que l'enzyme sous forme insoluble), pour augmenter la pénétration trans-cutanée au moins ce principe actif contenu dans cette composition.
21. Méthode de soin cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend une application par voie topique d'une composition cosmétique telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 12.