FR2611367A1

FR2611367A1 - Procede pour preparer la pectine

Info

Publication number: FR2611367A1
Application number: FR8802369A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-02-28
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1988-09-02
Anticipated expiration: 2008-02-26
Also published as: DE3806423A1; GB2201684B; DK93188A; JPH068322B2; US4835262A; FR2611367B1; JPS63213501A; DK93188D0; DE3806423C2; GB8804407D0; GB2201684A

Abstract

CE PROCEDE SE CARACTERISE EN CE QUE L'ON SOUMET UN TISSU VEGETAL CONTENANT DES SUBSTANCES PECTIQUES, A L'ACTION D'UN MICROORGANISME QUI APPARTIENT AU GENRE BACILLUS ET POSSEDE UNE ACTIVITE DE LIBERATION DE LA PECTINE D'UN TISSU VEGETAL, MAIS NE POSSEDE PAS NOTABLEMENT D'ACTIVITE DE DECOMPOSITION DE LA PECTINE, OU D'UN BOUILLON DE CULTURE OU D'UNE MATIERE TRAITEE DE CELUI-CI, POUR LIBERER LA PECTINE DU TISSU VEGETAL ET EN CE QUE L'ON RECUPERE LA PECTINE.

Description

La présente invention est relative à un procédé pour isoler la pectine

d'une plante contenant de la pectine comme constituant, à l'aide d'un microorganisme appartenant au genre Bacillus. La pectine est un polysaccharide utile industriellement employé en tant que matière première pour des aliments, des médicaments ou des cosmétiques et qui est contenue en grande

quantité dans les plantes supérieures. -

Jusqu'à maintenant, la production de pectine a été effectuée par extraction à chaud d'un tissu végétal contenant de la pectine comme constituant en présence d'un agent chélatant, d'un acide ou similaire. Cependant, I'isolation de la pectine était difficile selon cette méthode, qui impliquait aussi divers problèmes dans l'appareil mis en oeuvre et le traitement des résidus. Pour résoudre les problèmes ci-dessus, on a trouvé des microorganismes qui produisaient une enzyme ayant une activité de libération de la pectine des tissus végétaux contenant de la pectine comme constituant, et Il'on a proposé des procédés pour libérer la pectine en soumettant les tissus végétaux mentionnés plus haut à l'action de ces microorganismes ou d'un bouillon de culture ou d'une matière Issue du traitement de celui-ci et en récupérant la pectine (brevet U.S.A. No. 4 686 187 et publication de brevet japonais No. 46157/1980). Cependant, les protopectinases, les enzymes libérant la pectine produites par les microorganismes utilisés dans ces procédés, étalent toutes des enzymes qui non seulement libéraient la pectine des tissus végétaux, mais provoquaient aussi une décomposition limitée de la pectine une fois libérée (cf. un journal japonais *Fermentation & Industries Uol. 37/1979, pages 928-938). R savoir, elles avalent une activité de décomposition de la pectine libérée (activité polygalacturonase) ainsi qu'une activité de libération de la pectine (activité protopectinase). On avait donc des problèmes en ce que la décomposition de la pectine libérée avait lieu en méme temps que la libération de la pectine, si bien que la qualité de la pectine obtenue était détériorée en raison de la décomposition lorsque la réaction enzymatique était réalisée compl1tement pour

augmenter le rendement en pectine.

La Demanderesse a effectué des études importantes pour résoudre les problèmes indiqués plus haut et elle a trouvé un groupe de microorganismes produisant une enzyme qui agit sur une plante contenant de la pectine comme constituant et libère la pectine, mais ne décompose pas notablement la pectine libérée, et elle a mis au point la présente invention. Ainsi, la présente invention fournit un procédé pour préparer de la pectine selon lequel on soumet un tissu végétal contenant des substances pectiques comme constituant de celui-ci, à l'action d'un microorganisme qui appartient au genre Bacillus et possède une activité de libération de la pectine d'un tissu végétal, mais ne possède pas notablement d'activité de décomposition de la pectine, ou d'un bouillon de culture ou d'une matière traitée de celui-ci, pour libérer la pectine du tissu végétal et l'on récupère la pectine. Conformément à la présente invention, on peut obtenir des pectines ayant un haut poids moléculaire à partir de tissus végétaux contenant de la pectine comme constituant, de façon simple

et avec un bon rendement.

La Figure I est une courbe montrant l'évolution avec le temps de la quantité de pectine libérée et de l'activité de décomposition de la pectine, alors que de la protopectine et de la pectine sont soumises à l'action d'un surnageant de culture contenant de la protopectinase d'un exemple de la présente invention, et la Figure 2 est une courbe montrant l'évolution avec le temps de la quantité de pectine libérée et du poids moléculaire de la pectine libérée, alors que de la protopectine est soumise à I'action d'un surnageant de culture contenant de la protopectinase

d'un exemple de la présente invention.

Les microorganismes utilisés dans la présente invention appartiennent au genre Bacillus. Des exemples de ceux-ci sont les suivants: Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus cereus Bacillus circulans Bacillus coagulans. Bocillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus Dumilus, Dacillus

macerans, et des souches analogues à ces souches et leurs mutants.

Le terme de souches analogues à ces souches' mentionné plus haut, se rapporte à celles des souches qui possèdent une activlté de libération de la pectine, mals pratiquement pas d'activité de décomposition de la pectine, et qui ont des propriétés bactériologiques analogues à celles de ces souches. Le terme de "mutants de celles-ci' comprend l'un quelconque des mutants des souches données spécifiquement en exemple et des souches analogues à celles-ci, qui sont induits artificiellement

par des moyens chimiques ou physiques ou sont induits spontanément.

Des moyens artificiels utilisables pour la mutation sont ceux qui

sont connus dans l'art.

De plus, des microorganismes appartenant au genre Bacillus, qui produisent une enzyme libérant la pectine mais ne décomposent pratiquement pas la pectine, sont inclus dans la présente invention dans la mesure o Ils produisent une telle

enzyme, méme s'il s'agit de nouvelles souches.

Des microorganismes préférables utilisés dans la présente invention sont les microorganismes connus suivants qui sont tous déposés à l'lnstitute for Fermentation, Osaka, (les nombres suivant IFO représentent le numéro de dépot): 1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117 et 14140, 2) Bacillus amyloliquefaclens IFO 14141 3) Bacillus cereus IFO 3002 et 3132 4) Bacillus circulans IFO 13632 ) Bacillus coagulans IFO 12583 6) Bacillus firmus IFO 3330 7) Bacillus licheniformis IFO 14206 8) Bacillus Dumilus IFO 12087

9) Bacillus macerans IFO 3490.

Parmi ces microorganismes, on préfère en particulier

Bacillus subtilis IFO 12113 et Bacillus subtilis IFO 13719.

Pour effectuer l'isolation de la pectine à partir d'un tissu végétal selon le procédé de la présente invention, on peut directement inoculer le microorganisme ci-dessus dans un tissu végétal à traiter et le cultiver dans des conditions statiques, agitées ou secouées selon des méthodes classiques, ou bien on peut mettre en contact avec le tissu végétal, un bouillon de culture obtenu par culture du microorganisme ci- dessus ou une matière

traitée de celui-ci.

Des milieux utilisée pour la culture du microorganisme, c'est-à-dire la culture de la semence, ne sont pas particulièrement limités et peuvent être un quelconque milieu qui contient les divers nutrients normalement utilisés dans la culture classique des microorganismes du genre Bacillus. Les milieux usuels peuvent convenablement contenir de la pectone, de I'hydrolysat de caséine, de l'extrait de levure et du glucose et, si les circonstances le requièrent, des sels inorganiques comme des phosphates, des sels de magnésium, des sels de potassium, etc. Certaines sortes de tissus végétaux peuvent être aussi utilisées en tant que milieu de culture de semence, sans addition de quelconques nutrients, mais après stérilisation à chaud. La peau ou l'enveloppe

des agrumes est un milieu particulièrement avantageux.

Les conditions de culture pour le microorganisme dans le milieu mentionné plus haut, sont convenablement déterminées pour augmenter au maximum la quantité produite de l'enzyme prévue, des conditions usuelle étant 20 à 37 C pendant 10 - 50 heures. La culture peut être effectuée avec secousses, repos ou aération-agitation, ou dans un état solide. Le mycélium se développe au cours d'une telle culture et des enzymes sont produites par le mycélium. Le bouillon de culture peut être utilisé tel que ou en tant que matière traitée, comme un concentrat ou une solution d'enzyme purifiée. Le concentrat peut être obtenu par soumission du bouillon de culture éventuellement filtré, à un traitement dans des conditions douces, par exemple à une évaporation à basse température et sous faible pression ou à une concentration au moyen d'une membrane d'ultrafiltration. L'enzyme purifiée peut être obtenue à partir de ce bouillon, par filtration du bouillon, concentration du filtrat et soumission du concentrat à des précipitations fractionnées répétées par addition de sulfate d'ammonium, ou par filtration du bouillon et soumission du filtrat à une chromatographie sur colonne CM-Sephadex et filtration sur gel Sephadex G-75. On considère que le mécanisme impliqué dans le procédé de la présente invention est tel qu'une enzyme produite à partir du microorganisme mentionné plus haut pénètre dans un tissu végétal, agit sur les substances pectiques, en particulier la protopectine insoluble dans l'eau pour former une pectine soluble dans l'eau et

libérer la pectine soluble dans l'eau du tissu végétal.

La pectine libérée à partir des tissus végétaux par le procédé de la présente invention peur être isolée selon des méthodes classiques. Par exemple, la solution traitée de la façon indiquée plus haut, est filtrée pour être débarassée des résidus et le filtrat est mélangé avec trois fois son volume d'un solvant organique miscible ô l'eau, par exemple du méthanol, pour faire précipiter la pectine. La pectine est collectée, louavée avec un solvant analogue au solvant organique ci-dessus, par exemple de l'éthanol et séchée pour donner une pectine de haute pureté. La pectine ainsi obtenue a un poids moléculaire supérieur à environ 000, quelle que soit la nature du microorganisme mis en oeuvre pour l'isolation et elle est différente de celle qui est obtenue par les méthodes chimiques classiques en ce qu'elle a une distribution de poids moléculaire étroite et est très proche de la pectine naturelle. De plus, la pectine peut être utilisée conmme aliment ou médicament, puisqu'elle ne contient pas de substances chimiques contaminantes. Les propriétés des pectines obtenues varient plus ou moins, en fonction de la nature des matières de

départ utilisées.

Bien que la présente invention concerne un procédé pour obtenir de façon simple et avec un rendement élevé, une pectine de haute pureté à partir de tissus végétaux, en utilisant des microorganismes du genre Bacillus comme cela est décrit plus haut, ce procédé caractéristique de l'invention peut être aussi utilisé pour éliminer la pectine de tissus végétaux ou pour

produire un extrait d'une plante contenant de la pectine.

De plus, les tissus végétaux utilisés dans le traitement de l'invention sont de préférence ceux qui sont disponibles d un faible prix et qui ont une teneur en pectine aussi élevée que possible, bien qu'ils ne soient pas particulièrement limités à ceux-ci. On peut citer par exemple des agrumes, comme le Citrus unshiu, le Citrus natsu-daidai, le citron, le pamplemousse, l'orange navetl, I'orange et similalres. On peut utiliser une quelconque peau et enveloppe de ces agrumes comme matière de départ. Il est aussi possible d'utiliser le résidu provenant de la pression des agrumes pour l'obtention du jus. Ce résidu est bien sûr bon marché et son utilisation sert aussi à employer les déchets. En plus de celles qui précèdent, la peau de légumes portant des fruits, comme la pulpe de betterave, du melon d'eau, des melons, etc, et la queue de légumes comme la carotte, la

bardane, le radis, etc, sont préférables comme matière de départ.

Selon la présente invention, I'enzyme qui est contenue dans le microorganisme laissé réagir sur un tissu végétal contenant de la pectine en tant que constituant, dans le bouillon de culture de ce microorganisme, ou dans la matIère traitée de ce bouillon de culture, ne décompose pas notablement la pectine, étant différente des enzymes connues libérant la pectine qui décomposent la pectine elle-mème, et il est donc possible, en laissant l'enzyme réagir complètement sur le tissu végétal, de libérer au maximum la pectine et d'obtenir des pectines ayant un poids moléculaire élevé avec un

fort rendement.

La présente invention est davantage illustrée par les exemples suivants. L'invention n'est cependant pas limitée à ces

exemples.

EXEMPLE 1

On a cultivé chacune des souches énumérées dans le tableau 1, dans un milieu (pH 6,5) contenant 0,5% d'amidon soluble, 5% de poudre de soja dégraissée, 1% de (NH4)2PO4, 0,01% de CaCI2.2H20 et O,01% d'extrait de levure, en secouant à 37 C pendant heures. Le surnageant obtenu par élimination du mycélium a été laissé réagir, en tant que source d'enzyme, avec une protopectine préparée à partir de la peau et de l'enveloppe de citron (selon la méthode décrite dans Rgric. Blol. Chez., Vol. 46/1982, page 667), comme substrat, à 37'C pour libérer la pectine et l'activité protopectinase a été déterminée. Les' résultats obtenus sont

rassemblés dans le tableau 1.

A propos, l'activité protopectinase a été déterminée selon la méthode décrite dans Rgric. Biol. Chem., Vol. 46/1982, page 667) et l'activité qui libérait la pectine correspondant à 1 pmole d'acide galacturonique, par mI pendant une durée de réaction

prescrite, a été définie comme étant 1 unité de protopectinase.

Il est évident ô partir des résultats fournis dans le Tableau 1 que des microorganismes d'une large gamme, qui appartiennent au genre Bacillus, ont une activité de libération de

la pectine.

Tableau 1

Rctivités protopectinase de divers microorganismes du genre Bacillus Activité protopectinase (unité/ml) Souche Culture ô 30 C Culture à 37 C Bacillus subtilis

IFO 3108 0,5 -

IFO 3134 3,1 -

IFO 3336 1,3 2,4

IFO 3513 2,8 -

IFO 12112 0,4 0,2

IFO 12113 6,1 8,5

IFO 12210 1,8 5,2

IFO 13719 7,2 -

IFO 13721 3,4 -

IFO 14117 2,6 2,0

IFO 14140 0,1 0,4

Bacillus amyloliquefaciens

IFO 14141 1,0 1,2

Bacillus cereus

IFO 3002 0,4 -

IFO 3132 3,0 -

Bacillus circulans

IFO 13632 0,2 -

Bacillus coagulons

IFO 12583 0,5 2,5

Bacillus firmus

IFO 3330 3,0 -

Bacillus licheniformis

IFO 14206 1,2 1,0

Bacillus pumilus

IFO 12087 5,0 -

Bacillus macerans

IFO 3490 0,4 0,2

g Note: - indique que la souche ne se développait pas à cette température. Le surnageant mentionné plus haut a été ensuite laissé réagir sur la protopectine et la pectine et l'évolution a été suivie en fonction du temps. (i) Protopectine Une solution de tampon acétate (pH 5,0) contenant le surnageant de la culture ayant une activité protopectinase de 15 unités a été laissée réagir avec 1 mi de solution aqueuse contenant 20 mg de la protopectine mentionnée plus haut à 37 C et l'évolution en fonction du temps de la quantité de pectine libérée

a été déterminée et représentée dans la Figure 1.

(ii) Pectine Une solution de tampon acétate (pH 5,0) contenant le même surnageant que celui du point (i) ci-dessus a été laissée réagir avec une solution aqueuse à 0,5X de pectine préparée à partir de citron (un produit de Uako Pure Chemical Co., Ltd.) à 37 C et l'évolution en fonction du temps de l'activité de décomposition de la pectine a été déterminée et représentée dans la Figure 1. L'activité de décomposition de la pectine a été

déterminée selon la méthode décrite dans Rgric. Biol. Chem., Uoi.

46/1982, page 667).

Il est évident d'après les résultats montrés dans la Figure 1, que la protopectinase contenue dans le surnageant mentionné plus haut a une activité de libération de la pectine,

mais qu'elle n'a pas d'activité de décomposition de la pectine.

De plus, il a été confirmé que chaque protopectinase produite à partir des microorganismes énumérés dans le Tableau 1

n'a aucune activité de décomposition de la pectine.

EXEMPLE 2

On a cultivé Bacillus subtilis IFO 12113 et Bacillus subtilis IFO 13719 dans un milieu (pH 6,5) contenant 0,5% d'amidon soluble, 1% de (NH4)2PO4, 0,01%X de CaC12.2H20 et 0,01X d'extrait de levure, à 30 C pendant 24 heures, et on a mélangé 100 mi du filtrat de culture avec 2,5 g de peau séchée de Citrus unshiu et laissé réagir à 60'C pendant 24 heures. Le surnageant obtenu par filtration a été mélangé avec trois fois son volume d'éthanol et la pectine formée a été collectée et séchée. Les rendements et les propriét6s des échantillons de pectine ainsl obtenus sont donnés dans le Tableau 2. On a obtenu des pectines ayant un poids moléculaire élevé avec un fort rendement, par la réaction complète

a cette température si élevée comme cela est décrit plus haut.

Tableau 2 Propriétés de la pectine obtenue à partir de la peau de Citrus unshiu Souche utilisée Propriétés Bacillus subtilis Bacillus subtilis

IFO 12113 IFO 13719

Rendement 250 mg 245 mg Groupe carboxy méthoxylé 65 % 64,3X Rcide galacturonique 75,8 73,1 Sucre neutre 24,2 26,9 Uiscosité relative* 1,37 1,41 pH (solution à 0,5%) 3,4 3,4 Poids moléculaire ** 110000 108000 Uialeurs trouvées par C: 40,50 C: 41,31 analyse élementaire H: 5,83 H: 5, 76

N: 0,53 H: 0,48

* Mesurée sur une solution d'hexamétaphosphate de sodium à 1% contenant 0, 11X de peptine dissoute * Déterminé par la méthode de Smit et Bryant (J. Food

Science, Uol. 32/1967, page 197).

1 1

EXEMPLE 3

On a cultivé Bacillus subtilis IFO 12113 dans un milieu identique au milieu de culture utilisé dans l'exemple 1, mais qui contenait de la dextrine à la place de l'amidon soluble, à 30 C pendant 40 heures. Le filtrat de culture, en tant que solution d'enzyme, a été ajouté ô raison de 40 unités à 50 mi d'une solution (pH 5,0) contenant 1 g de protopectine de diverses origines telles qu'elles sont énumérées dans le Tableau 3. La réaction a été laissée se dérouler à 37 C pendant une heure. Les quantités de

pectine ainsi libérées sont indiquées dans le Tableau 3.

Tableau 3

Rctivité de la protopectinase-B* sur diverses protopectines Origine de la protopectine Pectine libérée Rctivité** (nom botanique de l'agrume) (mg/g de protopectine) relative (%) Peau de citron (Citrus limon) 19,5 100 Peau de BUNTRAN l0 (C. grandis) 39,2 191 Peau de PONKRN (C. reticulata) 34,2 167 Peau de YUKU (C. Junos) 27,8 136 Peau de KRRRTRCHI (C. trifoliata) 22, 2 108 Peau de lime (C. aurantifolla) 23,0 112 Peau de valence (C. sinensis) 27,8 136 Peau de BUSSHUKRH (C. medica) 38,9 190 Peau de NRGRniKINKRN (Fortunella margrigata) 13,2 64 Peau de TOUKINKRAN (C. microcarpa) 18,6 91 Peau d'orange mandarine Satsuma (C. unshiu) 19,0 93 Carotte 13,0 63 Bardane (GOBOU) 23,4 114 Radis 23,4 114 Betterave à sucre 23,2 113

* La définition de ce terme est donnée plus loin.

** Taux d'activité représenté en %, lorsqu'on attribue une valeur de 100% l'activité obtenue dans le cas de la peau de citron.

EXEMPLE 4

On a cultivé Bacillus subtilis IFO 12113 dans un milleu identique au milieu de culture utilisé dans l'exemple 1, mais qui contenait 0,5X de peptone à la place de l'amidon solubles, à 30 C pendant 36 heures. Le filtrat de culture, en tant que solution d'enzyme, a été ajouté à 100 ml d'une solution (pH 5,0) contenant 10 g de protopectine préparée à partir de citron. La réaction a été laissée se dérouler à 37 C pendant une heure. La quantité et le poids moléculaire de la pectine ainsi libérée sont déterminés périodiquement. Les résultats sont montrés dans la

Figure 2.

Il est évident d'après les résultats illustrés dans la

Figure 2, que la pectine libérée n'est pas décomposée.

Ensuite, la protopectinase produite par Bacillus subtills IFO 12113 a été purifiée et ses propriétés ont été déterminées. Méthode de purification La souche a été cultivée dans le milieu de l'exemple 1 à 37 C pendant 20 heures et le filtrat de culture (20 I) a été concentré à 2 1. Le concentrat a été dialysé contre un tampon acétate 20 ma et ensuite appliqué à une colonne CM-Sephadex C-50 (5 x 46 cm) équilibrée avec le émme tampon. L'enzyme a été éluée avec des gradients de concentration de NaCI (0 à 500 mn). La solution d'enzyme a été envoyée à travers une colonne DERE-Toyopearl 650 (2,1 x 15 cm) et la solution qui a traversé la colonne a été collectée. La solution d'enzyme a été ensuite concentrée à 4 mi et

chromatographiée sur une colonne Toyopearl HU 55S (2,5 x 75 cm).

Les fractions de protopectinase ont été collectées et concentrées et, après addition de sulfate d'ammonium pulvérulent, laissées reposer pendant une semaine dans un réfrigérateur, ce qui a donné 42 mg d'aiguilles. L'enzyme ainsi obtenue est une nouvelle

protopectinass, qui est dénommée "protopectinase-B.

Les propriétés de la protopectinase-B sont indiquées dans le Tableau t et les résultats de l'analyse des aminoacides de

cette enzume sont fournis dons le Tableau 5.

Tableau 4

Propriétés de la protopectinase-B Poids moléculaire (kDa) par électrophorèse sur gel de polyacrylamlde-SDS 29,0 par filtration sur gel 28,0 par ultracentrifugation 28,0 Constante de sédimentation (S20, p) s 3, 045 Point Isoélectrique 9,4 Coefficient d'extinction 15,1 (solution aqueuse à 1X, 280 nm) pH optimum 7,0-8,0 (37 C)

4,5-5,5 (60 C)

Température optimale ('C) 37-60 Inhibiteur Ba, Ca, Ni Forme cristalline aiguilles

Tableau 5

Analyse des aminoacides de la protopectinase-B provenant de Bacillus subtilis IFO 12113 RAminoacidemol* Thréonine 14 Praline 3-6 Glycine 22 Phénylalanine 5 Rcide aspartique + asparagine 32-44 Ralnine 14 Tyrosine 14 Rcide glutamique + glutamine 14 Ualine 10 Tryptophane 12 Leucine 10 Cystine Histidine 6 + cystéine trace Isoleucine 13 ARtrgine ine 6 Méthionine 1 Sérine 23 Lysine 13 Somme 212-227 (poids moléculaire de 24000 à 26000) * en supposant que la protéine a un poids moléculaire

de 29 kDa.

Les méthodes de détermination des propriétés de la protopectinase-B et les méthodes d'analyse des aminoacides de la

protopectinase sont les suivantes.

Poids moléculaire: Electrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS

(On a utilisé la méthode de Ueber & Osborn décrite dans J. Biol.

Chem., Uol. 244/1969, page 4406), Filtration sur gel (Les conditions étalent les memes que celles de la filtration sur

gel utilisée dans la purification des enzymes décrites plus haut.

On a utilisé comme protéines de référence la cytochrome C. lysozyme, l'achymotrypsinogène R, I'ovalbumine et l'albumine de sérum bovin), Ultracentrifugation

(On a utilisé la méthode d'Yphantis décrite dans Biochemistry, Uol.

3/1964, page 29?).

Constante de sédimentation (On a dissous l'enzyme dans du tampon acétate 20 mM de pH 6,0 contenant 100 mM de NaCI pour donner une solution d'enzyme contenant 5 mg d'enzyme par ml et effectué la centrifugation avec

une ultracentrifugeuse analytique Hitachl modèle 232 à 60 000 tpm).

Point iso6électrique Le pH optimum et la température optimale ont été

déterminés selon la méthode de l'exemple 1.

Rnalyse des aminoacides L'enzyme purifiée (18 mg) a été dissoute dans de l'acide chlorhydrique 6N et enfermée dans un tube. La décomposition a été effectuée à 110 C pendant 30, 48 et 72 heures et l'analyse réalisée au moyen d'un analyseur d'aminoacides automatique de

Hitachi, modèle LR-5.

Le mécanisme d'action de la protopectinase-B décrite ci-dessus a été étudié et il a été confirmé que l'enzyme coupait les liaisons glycosidiques au site endo de l'arabinogalactane préparé à partir de soja. Les autres microorganismes utilisés dans cette Invention produisaient la meme sorte d'enzyme. L'homologie immunologique entre des protopectinases produites par les microorganismes utilisés dans cette invention et la protopectinase-B a été étudiée et les résultats rapportés dans le Tableau 6. Les tests immunologiques ont été faits avec de I'antisérum préparé chez un lapin vis-à-vis de la protopectinase-B purifiée par la méthode de l'immuno-diffusion double de Ouchterlony (0. Ouchterlony, Acta Pathol. Microbiol. Scand., Uol. 26, p. 507, 1940). Les enzymes brutes de B. coagulans IFO 12583, B. licheniformis IFO 14206 et B. macerans IFO 3490 formaient des précipités avec l'antisérum de la protopectinase-B, mais ces enzymes n'étaient pas identiques à la protopectinase-B en ce qui concernait le profil de précipitation et les autres ne faisaient

pas de précipitation.

L'activité de dégradation de l'arabinogalactane a été déterminée de la façon suivante: un mélange de réaction contenant 3 el d'arabinogalactane à 1%, I ml de solution d'enzyme, 0,5 mIl de tampon 0,2M d'acide acétique/acétate de sodium (pH 6,0), a été incubé à 37 C pendant 30 minutes. Le sucre réducteur libéré par l'action de la protopectinase-B a été déterminé en tant que

galactose par la méthode de Nelson-Somogyi (M. Somogyi, J. Biol.

Chem., Uol. 195, p. 19, 1952).

Tableau 6

Homologie immunologique entre des protopectinases produites à partir des microorganismes utilisés dans cette invention et la protopectinase-B Activité de l'enzyme Réponse Activité de Souche (U/ml) imsuno- dégradation

Teempérature de culture logique de I'arabino-

'C 37 C galactane B. subtilis

IFU 13719 - 9,8 - +

IFO 13721 - 4,2 - +

B. amyloliquefaciens

_ 0,8-

IFO 14141 - 0_8 -

B. cereus

IFO 3132 26 - 2,6+

B. coagulans

IFO 12583 - 2,6 +* +

B. firmus

IFO 3330 1,2 +

B. licheniforais

IFO 14206 - 2,5 ** +

B. macerans

IFO 3490 - 0,1 +

B. pumi lus

IFO 12087 4,1 - -

O. circulans

IFO 12632 - 0,2 +

* Deux lignes de sédimentation apparaissent.

*I* 1 apparait une ramification.

REUENDICRTIONS

1. Procédé pour préparer une pectine, caractérisé en ce qu'on soumet un tissu végétal contenant des substances pectiques, à l'action d'un microorganisme qui appartient au genre Bacillus et possède une activité de libération de la pectine d'un tissu végétal, mais ne possède pas notablement d'activité de décomposition de la pectine, ou d'un bouillon de culture ou d'une matière traitée de celui-ci, pour libérer la pectine du tissu

végétal et en ce que l'on récupère la pectine.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est Bacillus subtilis, Bacillus amuloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus Dumilus, Bacillus macerans, des souches analogues à ces souches ou

leurs mutants.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est choisi dans le groupe qui comprend: 1) Bacillus subtilis IFO 3108, 3134, 3336, 3513, 12112, 12113, 12210, 13719, 13721, 14117 et 14140, 2) Bacillus amyloliauefaclens, IFO 14141, 3) Bacillus cereus. IFO 3002 et 3132, 4) Bacillus circulans, IFO 13632, ) Bacillus coagulans, IFO 12583, 6) Bacillus firmus, IFO 3330, 7) Bacillus licheniformis, IFO 14206, 8) Bacillus Dumilus, IF0 12087, et

9) Bacillus macerans, IFO 3490.

1. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est Bacillus subtilis IFO 12113 ou

Bacillus subtilis IFO 13719.

5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'une peau ou une enveloppe d'agrumes est utillsée comme tissu

végétal contenant des substances pectiques.