FI96641C - Biospesifinen määritysmenetelmä - Google Patents

Description

96641 BIOSPESIFINEN MÄÄRITYSMENETELMÄ - BIOSPECIFIK BESTÄMNINGSMETOD 5

Immunomääritys on vakiintunut biospesifinen määritysmenetelmä ja sen eri sovellutuksia käytetään laajalti rutiini-diagnostiikassa ja tutkimuslaboratorioissa.

10 Toinen biospesifisten määritysten ryhmä, joskin vielä kehityksen alaisena oleva, on DNA- ja RNA-hybridisaatiomääritys. Biospesifisissä määrityksissä käytetään yleensä kahta biospesifistä reagenssia, primäärireagenssia ja sekundäärireagenssia (esim. vasta-15 ainetta, DNA- tai RNA-koetinta) , jotka kumpikin sitoutuvat analyyttimolekyylin spesifisiin determinantteihin muodostaen kolmen molekyylin kompleksin (kerrosra-kenteen) ja normaalisti toinen näistä reagensseista on leimattu. Nykyisin käytettyjä leimoja ovat 20 radioisotoopit, entsyymit, luminoivat leimat ja fluoresoivat leimat.

«

Rutiinidiagnostiikassa on jatkuvasti kasvava moniparametrisen analytiikan tarve. Valitettavasti ?5 nykyiset menetelmät eivät salli useamman kuin kahden tai kolmen samanaikaisesti mitattavan leiman käyttöä, koska näiden eri leimojen antamien signaalien spektrometrinen '- erottelu ei ole mahdollista riittävällä tarkkuudella. Eri radioisotooppien tai fluoresoivien leimojen ?o emissiospektrit peittävät huomattavasti toisiaan ja sen seurauksena eri analyyttien erottelu samasta näytteestä on huonoa vaaditulla pitoisuusalueella.

Tämän keksinnön tarkoituksena on esittää parempi ,-.5 menetelmä moniparametrisiin biospesif isiin määrityksiin.

Tämän keksinnön mukainen moniparametrinen - määritys suoritetaan käyttämällä kiinteänä kantajana keinotekoisesti valmistettuja mikropartikkeleita, jotka edustavat eri analyyttejä. Jokaiseen eri luokkaan 96641 kuuluvat mikropartikkelit päällystetään ensin spesifisellä primäärireagenssillä (vasta-aine, DNA, RNA) eli mikropartikkelit toimivat näiden reagenssien ja biospesifisen reaktion kiinteänä alustana. Tälle 5 keksinnölle on luonteenomaista erityisesti se, että eri luokkia edustavat mikropartikkelit on valmistettu erilaisten monomeerikomponenttien seoksesta tai sisältävät erilaisia indikaattoreita (D), että ne voidaan tunnistaa ja erottaa toisistaan Raman-spektrien I0 perusteella. Analyytin pitoisuuden määrittäminen suoritetaan mikropartikkelien pinnalla tapahtuvan biospesifisen reaktion perusteella, jolloin mikropartikkelien pintaan sitoutuneen leiman F määrä mitataan sen antaman signaalin perusteella.

15 Jäljempänä olevassa tekstissä nimitetään biospesi fisen reaktion leimana F käytettävää ainetta :;toiuminoivaks: leimaksi, ja sillä tarkoitetaan fluoresoivia, fosforoivia tai elektroluminesenssia (= elektrokemiluminesenssia) , 20 kerniluminesenssia tai bioluminesenssia synnyttäviä leirnoja.

Keksinnön tunnusmerkit ilmenevät patenttivaatimuksesta 1.

25 Keksinnön mukaiselle menetelmälle ovat 11: n n t e e n oma i s *. a seuraavat vaiheet:

Valmistetaan etukäteen mikropartikkeleita, jotka on jaettu eri luokkiin siten, että nämä eri luokkien 50 mikropartikkelit sisältävät yhtä tai useampaa erilaista komponenttia Di, D2, D3, ... Γ.. , jotka on tunnistettavissa niiden antaman l· aman-spek tr: :· perusteella ja joiden läsnäolo tai joiden yhdistelmä ilmaisee kyseessä olevan mikropartikkeim luokan.

Nämä eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit päällystetään kysymykseen tulevia analyyt tej ä sitovilla biospesifisiilä primäärireagenssei1la ja sen jälkeen 35 96641 3 mikropartikkelit sekoitetaan keskenään.

Eri analyyttejä sitovat biospesifiset sekundäärireagenssit leimataan fotoluminoivalla mole-5 kyylillä F, ja nämä reagenssit sekoitetaan keskenään.

- Mikropartikkelien joukkoon lisätään määritettävä näyte ja biospesi f ister. sekundäärireagenssien sekoitus, jonka jälkeen alkaa bioaffiniteetin vaikutuksesta mikro-10 partikkelien pinnalla oleviin reagenssimolekyyleihin sitoutua eri analyyttimolekyylien ja leimattujen biospesifisten reagenssien muodostamia komplekseja.

- Sitoutumisreaktio lopetetaan lisäämällä laimenninta ja 15 samalla laimennetaan mikropartikkeleihin sitoutumattomien leimattujen biospesifisten reagenssien pitoisuus.

- Mikropartikkeleiden sisältämien komponettien D Raman-emissio herätetään valonsäteellä ja tunnistetaan ko.

20 mikropartikkelin luokka Raman-spektrin yksityiskohtien perusteella .

Mikropartikkeleiden pinnalla olevaa väriainetta F viritetään valonsäteellä, kemiallisen tai sähköisen 25 aktivoinnin avulla ja mitataan sen emission voimakkuus fotoni-ilmaisimella, jonka antama sähköinen signaali voimakkuus on verrannollinen ko. analyytir. pitoisuuteen.

Mikropartikkelien käyttöön perustuvien biospesifisten K) määritysmenetelmien herkkyyden kannalta on olennaista se, ettei m.ikropartikkelien luokan tunnistamiseen käytetyn indikaattorin antama signaali häiritse foto lumi no i .van leiman antaman signaalin mittausta.

15 Moniparametristen biospesifisten määrityksien periaatteita on julkaistu aikaisemminkin. Useimmissa tapauksissa moniparametrinen menetelmä on kuitenkin perustunut sellaisten kiinteiden reakticalustojen 96641 4 käyttöön, joissa biospesifiset reagenssit voidaan kiinnittää toisistaan erillään oleviksi ja optisesti erotettaviksi alueiksi (esim. PCT W0 84/01031).

5 Tasakokoisten mikropartikkelien käyttö biospesifisen määrityksen kiinteänä kantajana tarjoaa monia etuja edellä esittyyn menetelmään verrattuna. Tasakokoisia mikropartikkeleita läpimitaltaan 1-200 pm voidaan valmistaa sopivasta polymeeristä niin, että ne sopivat 10 hyvin vesisuspensioon. Biospesifiset primäärireagenssit sidotaan mikropartikkelien pintaan fysikaalisen adsorption tai kovalentin sidoksen välityksellä. Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä näytettä, jossa ovat siis kaikki kyseeseen tulevat analyytit, inkuboidaan 15 sekundäärireagenssien ja mikropartikkelien seoksen kanssa mahdollisimman pienessä ;esim. 1 - 100 nikrolitran) tilavuudessa, jotta saavutettaisi, i n mahdollisimman täydellinen reaktio lyhyessä ajassa. Koska mikropartikkelien pinnalla tapahtuvassa reaktiossa 20 analyyttimolekyylien ja leimattujen reagenssien keskimääräinen etäisyys on hyvin pieni, voidaan reaktiotasapaino saavuttaa nopeasti ja sen seurauksena syntyy mikropartikkeleiden pinnalla olevien reagenssien yhteyteen leimatusta reagenssistä ja analyytistä 25 muodostuvia komplekseja. Tällaista rakennetta kutsunaan kirjallisuudessa yleisesti kerrostakenteeksi. Jos inkubaatioajät voidaan säätää tarkasti, ei ole tarvetta ajaa reaktiota päätepisteeseen. inkubaation jälkeen reaktioliuos laimennetaan riittävästi vapaan leimatun 3() sekundäärireagenssin pitoisuuden alentamiseksi ja yksittäisten mikropartikkeleiden pinnalla olevien leimattujen kompleksien määrä r: . sataan fotoni -ilmaisimella emission F perusteella. Tessa menetelmässä riittää yhden-kahden kertaluvun suuruinen laimennus 55 riittävän tehokkaaseen sitoutuneen ja vapaan leimatun reagenssifraktion antamien signaalien erottamiseksi toisistaan, koska tässä menetelmässä käytetty mikrofotometrinen ilmaisin pystyy optisesti erottamaan 96641 mittauskammion fokuspisteessä olevan mikropartikkelin lähettämän valoemission sen ympäristössä olevan vapaan leimatun reagenssin antamasta signaalista.

Mikropartikkeleita analysoidaan tilastollisesti riittävä 5 määrä ja kunkin partikkelin emission F signaalin voimakkuus rekisteröidään tietokoneelle.

Aikaisemmin on julkaistu useita keinotekoisesti valmistettujen mikropartikkeleiden käyttöön perustuvia 10 moniparametrisiä biospesifisiä määritysmenetelmiä: 1. Menetelmä, jossa analyyttiluokan tunnistus perustuu mikropartikkeleiden sisältämän väriin ja tunnistus tapahtuu mittaamalla optisesti analysoitavana olevan 15 partikkelin absorptio (J. G. Streefkerk & ai.: Protides

Biol . Fluids 24(1976)811-4).

2. Menetelmä, jossa analyyttiluokan tunnistus perustuu erikokoisten mikropartikkeleiden käyttöön ja tunnistus 20 tapahtuu mittaamalla optisesti analysoitavana olevan partikkelin halkaisija (T. M. McHugh & ai.: Journal of

Immunological Methods 95 (1986) 57-61).

3. Menetelmä, jossa mikropartikkelien tunnistus tapahtuu 25 niihin sekoitettujen fluoresoivien väriaineiden avulla ja biospesifisen signaalin mittaus tapahtuu jonkun muun fluoresoivan väriaineen kuten esim. FITC:n avulla (EP-hakemusjulkaisu 126 450, GOIN 33/58) 50 4. Menetelmä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia (purkautumisaika nanosekunteja) lähettävää väriainetta mikropartikkeleiden tunnistamiseen ja pitkäikäistä fluoresenssia lähettävää väriainetta (purkautumisaika 10 mikrosekuntia - 2 millisekuntia) analyyttien pitoisuuk-35 sien mittaamiseen ja jossa lyhytikäisen ja pitkäikäisen fluoresenssin erottamiseksi toisistaan käytetään aikaerotteista fluorometriä (US-patentti no 5,028,545).

96641 5. Menetelmä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia (purkautumisaika nanosekunteja) lähettävää väriainetta mikropartikkeleiden tunnistamiseen ja kemi- tai biolumi-nesenssia synnyttävää molekyyliä (purkautumisaika useita 5 sekunteja) analyyttien pitoisuuksien mittaamiseen ja jossa fluoresenssisignaali ja luminesenssisignaali voidaan erottaa toisistaan tehokkaasti, koska ne herätetään ja syntyvät eri aikoina (SF-patentti no. 89837) .

10 6. Menetelmä, jossa käytetään lyhytikäistä fluoresenssia (purkautumisaika nanosekunteja) lähettävää väriainetta mikropartikkeleiden tunnistamiseen ja fosforesenssia synnyttävää molekyyliä (purkautumisaika 10 mikrosekuntia 15 - 2 millisekuntia) analyyttien pitoisuuksien mittaa miseen, ja jossa lyhytikäisen fluoresenssin ja pitkäikäisen fosforesenssin erottamiseksi toisistaan käytetään aikaerotteista fluorometriä (SF-patentti 90695).

20 7. Menetelmä, jossa käytetään pitkäikäistä fluoresenssia lähettäviä väriaineita kuten lantanidi-ionien Tb, Dy, Eu ja Sm fluoresoivia kelaatteja mikropartikkeleiden tunnistamiseen j a biospesi fisen signaalin mittaamiseen 25 (SF-hakemusjui kai su no. 931198) .

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan biospesifisen reaktion mittaamiseen käyttää bio- tai kemiluminoivia leimoja (F) ja niiden mittaus voidaan 50 suorittaa luminometrisesti fotonilaskurilla. Samoin voidaan käyttää elektroluminoivia tai elektro-kemiluminoivia leimoja, joiden emissio aktivoidaan . sähköisesti ja signaali F mitataan fotonilaskurilla.

Raman-emissioon perustuva mikropartikkelin tunnistus 55 vaatii näissä menetelmissä lasersäteen ja eri mittausvaiheen, jolloin tunnistuksella ei ole vaikutusta signaalin F mittauksen herkkyyteen.

il . mu lii» i i .

96641 7 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan biospesifisen reaktion mittaamiseen käyttää myös kaikkia pitkäikäisen fotoniemission antavia fluoresoivia tai fosforoivia leimoja (F) ja niiden mittaus voidaan 5 suorittaa aikaerotteisella mittauksella. Fluoresenssin ja fosforesenssin viritys sekä Raman-viritys voivat tapahtua samalla tai erillisellä lasersäteellä. Tässä menetelmässä saavutetaan se etu, että leiman F ja Raman-emission D virittämiseen käytetyn valon sironta ja sen aiheuttama 10 taustafluoresenssi eivät häiritse leiman F mittausta ja näin saavutetaan hyvä mittausherkkyys.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan biospesifisen reagenssin fotoluminoivana leimana F 15 käyttää myös tavanomaisia orgaanisia fluoresoivia väriaineita. Tavanomaisten orgaanisten fluoresoivien väriaineiden etuna on korkea viritysvalon absorptio ja fluoresenssin kvanttitehokkuus, mutta niiden käyttöä haittaa kuitenkin sironnasta ja autofluoresenssista 20 syntyvä taustasignaali, joka rajoittaa mittaus- herkkyyttä. Käyttämällä näiden fotoluminoivien leimojen signaalien mittaamisessa konfokaalista optiikkaa ja riittävän hyvää spektrometristä erottelua voidaan saavuttaa hyviäkin mittausherkkyyksiä (S. Nie &al.

25 Science 226 (1994) 1018-1021).

Oleellista tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä on kuitenkin havainto, että sironnasta ja autofluo-resenssista aiheutuva ongelma voidaan poistaa, jos 50 virityksessä käytetään kaksoisfotoniviritystä.

Kaksoisfotoniviritys voi syntyä, kun voimakkaan viritysvalon kohdennuksella saadaan fotonien tiheys , tilavuusyksikköa ja aikayksikköä kohti niin suureksi, että kahden fotonin energia absorboituu samaan 55 kromoforiin. Tällöin myös absorboituva energia on kahden fotonin energia summa. Fluoresoivien ' aineiden kaksoisfotoniviritys on tunnettu tekniikka mm. spektroskopian ja mikroskopian alalla (U.S Pat.

96641 β 5.034.613). Yksittäisen fotonin absorptio väriaineeseen on todennäköisyyslaskennan käsitteiden mukaisesti riippumaton tapahtuma ja useiden fotonien absorboituminen on joukko yksittäisiä, riippumattomia tapahtumia.

5 Yksittäisen fotonin absorboitumisen todennäköisyyttä voidaan kuvata lineaarisella funktiolla, niin kauan kuin viritettävät energiatilat eivät ole kyllästyneet. Kahden fotonin absorptio on epälineaarinen prosessi. Kaksoisfotonivirityksessä väriainemolekyylin virittyminen 10 tapahtuu ainoastaan, kun kumpikin fotoni absorboituu samanaikaisesti. Kahden fotonin absorption todennäköisyys on yksittäisten fotonien absorptiotodennäköisyyksien tulo. Kahden fotonin aiheuttama emissio on siis neliöllinen prosessi.

15

Mikropartikkelin virittämiseen tarkoitetun optisen järjestelmän ominaisuuksia voidaan kuvata järjestelmän vasteella pistemäiseen valolähteeseen. Pistemäinen valolähde muodostaa diffraktion vaikutuksesta optiselle 20 järjestelmälle ominaisen intensiteettijakauman tarkennus- pisteessä (pistevaste). Normalisoituna tämä intensiteetti jakauma on todennäköisyysjakauma sille, kuinka pistemäisestä valolähteestä lähteneet, fotonit saapuvat tarkennusalueelle . Kaksoisfotonitekniikai la virityksen 25 todennäköisyysjakauma ensimmäisen fotonin ; a toisen fotonin intensiteettijakaumien normalisoitu tulo. Näin saatu todennäköisyysjakauma on 3-ulotteisessa avaruudessa, eritoten syvyyssuunnassa, selvästi yksittäisen fotonin todennäköisyysjakaumaa rajautuneempi. 50 Kaksoisfotonivirityksellä herätetään näin ollen ainoastaan se fluoresenssi, joka syntyy valonsäteen tarkennuspisteen selvästi rajatussa 3-u-ctteisessa lähiympäristössä.

t 55 Kun väriaine viritetään kaksoisfotonivirityksellä, vähenee valon sironta kohdennuspisteen ympäristöstä ja optisista komponenteista huomattavasti verrattuna normaaliin viritykseen. Edelleen kaksoisfctoniviritys il ftS’i Itlii iiUAl , i i 96641 s vähentää taustatluoresenssin syntymistä näytteessä kohdennuspisteen ulkopuolella, näytteen ympäristössä ja optiikassa. Koska virittävä valonsäde on fokusoitava mahdollisimman pieneksi pisteeksi, kaksoisfotoniviritys 5 sopii parhaiten pienien näytetilavuuksien tai rakenteiden tarkasteluun, mistä on kysymys myös tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Kaksoisfotonivirityksen etu on myös sima, että esim. 10 ultraviolettialueella tai sinisellä alueella tapahtuvaan viritykseen voidaan käyttää näkyvää tai lähi-infrapuna-alueen (NIR) valoa. Samoin voidaan näkyvällä alueella tapahtuva viritys tehdä NIR-alueella olevalla valonsäteellä. Koska valolähteen aallonpituus on 15 huomattavasti pidempi kuin väriaineen emission aallonpituus, voidaan valolähteen aallonpituudella ja sen ympäristössä syntyvä sironta ja mahdollinen autofluoresenssi vaimentaa alipäästösuodattimia käyttämällä tehokkaasti (vähintään 10 kertalukua) ja 2« estää pääsemästä fluoresenssiemission ilmaisimelle.

Useimmiten kaksoisfotoniviritys vaatii korkeatehoisten ultralyhyitä pulsseja tuottavien laserlaitteiden käyttöä.

On kuitenkin todettu, että myös jatkuvalla laservalolla 25 voidaan havaita kaksoisfotonivir ityks: a (DE- patenttihakemus P 44 14 0940.9-42 ja P. Hänninen SaJ,

Proceedings for Three-Dimensional Microscopy, SPIE-The

International Society for Optical Engineering, 1994, Vol.

2184, 66-71). Suorittamissamme kokeissa olemme 50 havainneet, että kaksoisfotoniviritykseilä ja lyhytikäisillä fluoresoivilla leimoilla voidaan saavuttaa erittäin hyvä signaal i-tausta-suhde ja herkkyys.

, Esimerkkeinä lyhytikäisistä kaksoisfotonlviritykseen » sopivista fluoresoivista väriaineista voidaan mainita 35 coumariinin ja rodamiinin johdannaiset.

Pitkäikäisten (Tw=l millisekunti) fluoresoivien ja fosforoivien leimojen ongelma on niiden vaatima pitkä 96641 10 mittausaika, joka johtuu siitä, että leimojen viritystilojen kyllästyminen rajoittaa vintysvalon intensiteetin niin alhaiselle tasolle, että yhtä mikropartikkelia on mitattava jopa yhden sekunnin ajan. 5 Myös kemiluminesenssiin, bioluminesenssiin ja elektroluminesenssiin perustuvien leimojen signaalien mittaus vaatii vähintäinkin yhden sekunnin ajan. Koska kaksoisfotoniviritykseen perustuvassa menetelmässä voidaan käyttää lyhytikäisiä (T.= i r.anosekunt 1) 10 fluoresoivia leimoja, voi viritysvalon intensiteetti olla jopa 106 kertaa voimakkaampi kuin pitkäikäisten fluoresoivien leimojen viritysmtensiteetti.

Lyhytikäisistä leimoista saadaan voimakkaampi signaali ja se pystytään mittaamaan vastaavasti lyhyemmässä ajassa. 15 Tästä seuraa se etu, että käytettävissä olevassa ajassa pystytään yhtä määritystä varten mittaamaan suurempi määrä mikropartikkeleita, joiden antamista tuloksista voidaan laskea keskiarvo. Näin päästään suurempaan mittaustarkkuuteen, eikä mikropartikkeleiden kokojakau-20 tumalta vaadita niin suurta tarkkuutta. Voimakkaampi signaali mahdollistaa myös mikropartikkeleihin sitoutuneen leiman fluoresenssin mittaamisen nopeassa liikkeessä olevasta virtauksesta.

25 Kaksoisfotonivirityksen käyttö tämän keksi n.nor. mukaisessa menetelmässä on erityisen edullista sen. vittusi, että partikkelin tunnistamiseen käytettävä Raman-viritys ja analyytin määrää osoittavan leiman F kaksoisfotoniviritys voidaan suorittaa samalla lasersäteellä, jonka 50 aallonpituus on punaisella tai NIR-alueella. Punaisen tai NIR-alueen valon käyttö on edullista Raman-vintyksessä, koska tällä aallonpituusalueella Ramar.-mittausta häiritsevää taustafluoresenssia syntyy vähemmän.

35 Raman-sironta on molekyylirakenteisiin liittyvää epäelastista valon sirontaa, jossa molekyylirakenteiden ominaisvärähtelyjä vastaavat energiakvantit sekoittuvat sirontaa herättävään valoon. Raman-spekri ilmenee :! *IM UV I * -M* ' · · 11 96641 sironneen valon aallcnpituusmuutoksena herätevalon aallonpituuden kummallakin puolella. Raman-spektri sisältää samanlaista molekyylirakenteen informaatiota kuin infrapunaspektri (IR) . Raman-spektri voidaan saada 5 myös hyvin pienistä kohteista kuten mikropartikkeleista (P. Dhamelincourt & ai. Spectroscopy Europe 5/2(1993) 16- 26) . Sen vuoksi Raman-spektrin avulla voidaan tunnistaa ja erottaa toisistaan erilaisia molekyylirakenteita, joita on käytetty mikropartikkelien valmistukseen.

10

Eri luokkiin kuuluvia mikropartikkeleita voidaan valmistaa tunnetuilla pclymerisaatiomenetelmillä siten, että eri partikkeliluckkien synteeseihin käytetyt monomeeriseokset poikkeavat toisistaan kemiallisen 15 koostumuksensa perusteella. Partikkeliluokkien valmistukseen käytetyt monomeeriseokset voivat poiketa toisistaan paitsi sisältämiensä monomeerilaatujen tai määrien perusteella niin myös muiden lisäindikaattoriaineiden laadun tai määrän perusteella. 20 Esimerkkinä monomeereista, jotka ovat keskenään yhteen polymerisoitavissa, ja jciden Raman-spektrit poikkeavat merkittävästi toisistaan mainitaan styreeni, deuteroitu styreeni (=styreeni-D6), metyylimetakrylaatti, sekä akryylinitriili. Mor.omeeriseokseen lisättäviä 25 indikaattoreita voivat olla esimerkiksi edellä mainittujen monomeerien oligo- ja polymeerit tai alifaattiset ja aromaattiset halogeeniyhdisteet.

Mikropartikkeleiden tunnistamiseen käytettäviä yhdisteitä 30 voidaan lisätä eri luokkiin kuuluvien mikropartikkelien valmistuseriin erilaisina kombinaatioina siten, että muodostuu mikropartikkeleita, joiden sisältämien eri , indikaattorien Raman-signaali ilmaisee partikkelin luokan binäärilukuna tai jonkin muun lukujärjestelmän lukuna. 35 Binääriluku 0 ilmaistaan esim. indikaattoripitoisuutena 0 ja binääriluku 1 ilmaistaan jollakin - nollasta poikkeavalla pitoisuudella.

96641 12

Esimerkiksi, styreenin ollessa partikkelisynteesi in käytetyn monomeeriseoksen pääkomponentt1 ja kolmen muun edellä mainitun monomeerin partikkelisynteesissä käytettyjä indikaattoreita, voidaan binääriluku-5 järjestelmän mukaan toimittaessa valmistaa kyseisistä monomeereista 23 eli 8 eri luokkaa edustavia partikkeleja. Mainituista monomeereista valmistettujen eri luokkaan kuuluvien polymeeripartikkelien Raman-spektrit voidaan erottaa toisistaan joko vertailemalla H) partikkeliluokkien spektrejä kokonaisuuksina US-· patentissa 5,313,406 esitetyllä menetelmällä tai vertailemalla spektrien yksittäisten piikien intensiteettejä. Kuvissa 1 on esitetty mainittujen yhdisteiden ja niiden rakenneanalogien Raman-spektrejä, 15 joita tarkastelemalla voidaan havaita, että kunkin yhdisteen Raman-spektrissä on karaktäärisiä, muiden mainittujen yhdisteiden spektreistä puuttuvia piikkejä.

Kuvassa 1 on esitetty polystyreenin (la), bentseenm (Ib) 20 ja deuteroidun d6-bentseenin (le) Ramanspektrit. Vertailtaessa näitä spektrejä keskenään havaitaan, että korvaamalla bentseenirenkaan vetyatomit deuteriumatomeilla siirtyy aaltoluvuilla 3000-3100 sijaitseva Ramanpiikki aaltoluvui1le 2260-2300. Samalla 25 perusteella D6-styreenin (tai D6-polystyreenin) Ramanspektri poikkeaa H6 styreenin (tai H6-polystyree:u n) spektristä, ja näin ollen deuteroitua styreeniä (polystyreeniä) voidaan käyttää partikkeliluokkaa määräävänä indikaattorina H6-styreenipolymeerissä.

30

Kuvassa 1 on esitetty myös polymetyylimetakrylaatin (Id) Raman-spektri. Tässä spektrissä havaitaan : karbonyyliryhmälle tyypillinen piikki aaltoluvuilla 1700- 1750 1/cm. Tällä aaltolukualueella ei polystyreeni 1 la 35 (la), eikä muilla tarkastelun alaisilla indikaattoriyhdisteillä ole piikkejä Raman-spetrissään. Näinollen metyylimetakrylaattipolymeeri sopiin polystyreenipartikkelien luokkaa määrääväksi 96641 is indikaattoriksi yhdessä muiden yllämainittujen indikaattorien kanssa.

Polyakryylinitriilin Raman-spektrissä on nitriili- 5 ryhmästä aiheutuva piikki aaltoluvuilla 2200-2250 1/cm.

Tällä aaltolukualueella ei polystyreenillä eikä tarkastelun alaisilla indikaattoriyhdisteillä ole piikkejä Raman spektreissään. Näinollen akryyli-nitriilipolymeeri soveltuu käytettäväksi polystyreeni-10 partikkeliluokan indikaattoriksi yhdessä muiden tarkastelunalaisten indikaattoriyhdisteiden kanssa.

Vastaavia esimerkkejä muista indikaattoriyhdisteistä, joiden Raman-spektri eroaa polystyreenin ja muiden Li mainittujen indikaattorien Raman spektreistä, voidaan esittää suuri määrä.

Mikropartikkelin luokan tunnistus sen antaman Raman-spektrin perusteella voi tapahtua useilla tunnetuilla 20 menetelmillä. Raman-emissio herätetään parhaiten lasersäteellä. Raman-taajuusspektrin rekisteröintiin voidaan käyttää esimerkiksi tavanomaista hilaspektrometriä, jossa on CCD-rivi-ilmaisin ja josta saadaan koko spektri samanaikaisesti. Raman 25 interferogrammi (joka on taajuusspektrin Fourier-muunnos) voidaan rekisteröidä käyttämällä esimerkiksi yksinkertaista inter ferometriä, joka on kytketty CCD-‘ ' rivi-ilmaisimeen. Taajuusspektri ja interferogrammi pystytään rekisteröimään kummassakin tapauksessa hyvin 30 lyhyessä ajassa, koska Raman-indikaattorien osuus mikropartikkelien kokonaismassasta voi olla jopa 1% ja käytetyn laserin intensiteetti voi olla niin suuri, että se tuottaa voimakkaan signaalin hyvin lyhyessä, alle 1 millisekunnin mittausajassa. Mikropartikkelien tunnistus 35 voi tapahtua yksittäisten taajusspektrin piikkien perusteella tai vertaamalla rekisteröityä taajuusspektriä tai interferogrammia eri luokkia vastaaviin referenssispektreihin. Vertaaminen tapahtuu nopeimmin ja 96641 i4 yksinkertaisimmin US-patentista 5,313,406 tunnetulla ristikorrelaatiomenetelmällä. Laskennan suoritus nykyaikaisella mikrotietokonetekniikalla voi tapahtua jopa 1 millisekunnissa.

5

Mikropartikkeleiden mittaus voidaan suorittaa objektilasin tai muun sellaisen alustan päällä, johon mikropartikkelit on asettu ja kiinnitetty kemiallisesti tai fysikaalisesti, tai nestesuspensiossa 10 reaktiokammiossa, nestekanavassa tai erillisessä mittauskyvetissä. Mittaus voi perustua pyyhkäisymikroskopiaan tai mittausoptiikka kohdistetaan jollakin muulla tavalla mikropartikkeleihin tai se voi olla kuvantava. Mittaus voi tapahtua myös 15 virtauskyvetissä, johon laimennettu mikropartikke- lisuspensio johdetaan. Mikropartikkelisuspension virtaus voidaan joko pysäyttää tai virtaus voi olla käynnissä mittauksen tapahtuessa. Mittaus voi tapahtua myös virtaussytometreille tavanomaiseen tapaan kyvetissä tai 20 vapaassa ilmassa. Mittauskyvetin apertuuri valitaan käytetyn mikropartikkelin suuruuden mukaan ja fotoluminesenssiemissio mitataan valomonistinputkella tai muulla herkällä fotoni-ilmaisimella tai sopivalla kuvailmaisimella. Ilmaisimena voidaan käyttää - myös 25 mikrokanavakuvavahvistinta ja puolijohdekuvailmaisinta (CCD). Riittävä lukumäärä mikropartikkeleita tunnistetaan ja analysoidaan tilastollisesti riittävän tarkan tuloksen saamiseksi jokaiselle analyytille. Mittaustulokset suhteutetaan standardinäytteillä suoritettuihin 50 mittauksiin, joiden perusteella lopputulokset lasketaan.

Tälle keksinnölle on myös luonteenomaista, että tässä : esitetty mikrofotometrinen mittausjärjestelmä pystyy optisesti erottamaan mikropartikkeleiden pinnasta 55 lähtevän valoemission mikropartikkelien ympäristössä olevasta liuoksesta lähtevästä valoemissioSta. Tämä erottelukyky perustuu siihen, että kun reaktioliuosta laimennetaan huomattavasti, sopii fotoni-ilmaisimen 96641 15 fokusalueeseen kerrallaan vain yksi mikropartikkeli ja liuoksessa olevien vapaiden leimattujen reacenssien aiheuttama taustasignaali on vähäinen.

Kaksoisfotoniviritystä käytettäessä virityksen tehokkuus 5 on verrannollinen viritysvalon tehon neliöön. Tämä kaksoisfotonivirityksen ominaisuus vahvistaa oleellisesti mikropartikkeleiden pinnasta lähtevän valoemission erottelua mikropartikkelien ympäristössä olevasta liuoksesta ja optisista osista lähtevästä valoemis siosta. 10 Optisella erottelulla saavutetaan riittävä vapaan ja sidotun fraktion erottelukyky ilman kemiallisia tai fysikaalista erotusta, mutta mikäli on vält tärr.ätöntä, erottelua voidaan tehostaa millä tahansa tunnetulla erotusmenetelmällä kuten pesulla, suodatuksella tai 15 sentrifugoinnilla.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä ia siihen tarvittava laitteisto voidaan toteuttaa käytännössä monella eri tavalla. Keksinnössä on kuitenkin oleellista, se, että 20 jokainen erillinen mikropartikkeli, joka edustaa en analyyttiluokkaa, tunnistetaan Raman-spektrometrisesti. Biospesifisen reaktion voimakkuus mitataan samaan aikaan tai erikseen ja näin voidaan suorittaa monipararr.etrinen biospesifinen määritys samasta näytteestä.

25 Aikaerotteisuuteen ja/tai kaksoisfotoniviritykseen perustuvalla mittausjärjestelyllä voidaan fctolumi-nesenssiemissio F erottaa tausta fluoresenssista ]a sironnasta.

30 Alan ammattimiehelle on selvää, että keksinnön erilaiset sovellutusmuodot voivat vaihdella jäljempänä esitettävien patenttivaatimusten puitteissa.

»

Claims (6)

16 96641

1. Biospesifinen moniparametrinen määritysmenetelmä, jossa käytetään ennakolta valmistettuja, eri luokkiin jaettuja ja eri analyyttejä edustavia mikropartikkeleita, jossa eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit on päällystetty eri 5 analyyttejä sitovilla biospesifisillä reagensseillä, jossa - eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sekoitetaan yhteen ja analysoitava näyte lisätään niiden sekaan, lisätään fotoluminoivalla molekyylillä leimattujen biospesifisten sekundäärireagenssien seos, jolloin alkaa 10 bioaffiniteetin johdosta sitoutumisreaktio analyytti-molekyylien, leimattujen sekundäärireagenssien ja mikropar-tikkeleihin liitettyjen reagenssien välillä, - reaktioliuos laimennetaan vapaiden leimattujen reagenssien pitoisuuden alentamiseksi, 15. kunkin mikropartikkelin fotoluminesenssiemissio mitataan fotoni-ilmaisimen avulla ja ilmaisimelta saadun sähköisen signaalin voimakkuuden perusteella analysoidaan jokaiseen mikropartikkeliin liittyneen analyytti-molekyylin määrä, » tunnettu siitä, että 20 eri luokkiin kuuluvat mikropartikkelit sisältävät sellaisia erilaisia molekyylirakenteita tai erilaisia indikaattoreita, joiden perusteella ne tunnistetaan ja erotetaan toisistaan Raman-spektrien avulla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 25 tunnettu siitä, että fotoluminoiva leima on fluoresoiva molekyyli ja sen viritys suoritetaan kaksoisfotonivirityksenä. 96641 π

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että fotoluminoiva leima on fluoresoiva tai fosforoiva molekyyli, ja sen viritys 5 suoritetaan yksifotonivirityksenä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että fotoluminoiva leima on kemiluminoiva, bioluminoiva tai elektroluminoiva 10 molekyyli.

5. Patenttivaatimuksien 2 tai 3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mikropartikkeleiden Raman-viritys ja fotoluminoivan leiman viritys suoritetaan 15 samalla valonsäteellä.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että fotoluminoivan leiman viritys ja detektio on konfokaalinen. 18 96641