ES2908449T3

ES2908449T3 - Polinucleótidos que contienen una región de cola estabilizadora

Info

Publication number: ES2908449T3
Application number: ES16847531T
Authority: ES
Inventors: Gabor Butora; Andrew Fraley; Edward Miracco; Jennifer Nelson; Amy Rhoden-Smith; Matthew Stanton
Original assignee: ModernaTx Inc
Current assignee: ModernaTx Inc
Priority date: 2015-09-17
Filing date: 2016-09-19
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2036-09-19
Also published as: JP2022160454A; DK3350333T3; EP3350333B2; PL3350333T3; SI3350333T1; JP2025061366A; AU2016324463A1; WO2017049275A2; AU2023200136A1; WO2017049275A3; EP3350333B1; CA2998370A1; JP2018527003A; PT3350333T; US20250186624A1; EP3350333A2; EP4101930A1; AU2016324463B2; EP3350333A4; US12109274B2

Abstract

Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la estructura de Fórmula I: A'-L-B ' FórmulaI donde A' comprende: (a) al menos una estructura de capa 5'; (b) una 5'-UTR; (c) una región codificante; y (d) una 3'-UTR; B' comprende una región estabilizadora 3' que comprende de 1 a 500 nucleósidos, en la que dicha región estabilizadora comprende al menos un nucleósido alternativo, en el que dicho nucleósido alternativo es timidina invertida; y L es un enlazador.

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótidos que contienen una región de cola estabilizadora

Antecedentes de la invención

Existen múltiples problemas con las metodologías anteriores de efectuar la expresión de proteínas. Por ejemplo, el ADN heterólogo introducido en una célula puede ser heredado por células hijas (tanto si el ADN heterólogo se ha integrado en el cromosoma como si no) o por descendencia. El ADN introducido puede integrarse en el ADN genómico de la célula huésped con cierta frecuencia, lo que resulta en alteraciones y/o daño al ADN genómico de la célula huésped. Además, deben ocurrir varias etapas antes de que se produzca una proteína. Una vez dentro de la célula, el ADN debe transportarse al núcleo donde se transcribe en ARN. El ARN transcrito a partir del ADN debe introducirse entonces en el citoplasma donde se traduce en proteína. Esta necesidad de múltiples etapas de procesamiento crea tiempos de retraso antes de la generación de una proteína de interés. Además, es difícil obtener expresión de ADN en células; con frecuencia, el ADN entra en las células pero no se expresa o no se expresa a velocidades o concentraciones razonables. Esto puede ser un problema particular cuando se introduce ADN en células como células primarias o líneas celulares modificadas.

Los ARN de origen natural se sintetizan a partir de cuatro ribonucleótidos básicos: ATP, CTP, UTP y GTP, pero pueden contener nucleótidos modificados postranscripcionalmente. Además, se han identificado aproximadamente cien alteraciones de nucleósidos diferentes en el ARN (Rozenski, J, Crain, P y McCloskey, J. (1999). Base de datos de modificación de ARN: actualización de 1999. Res ácidos nucl 27: 196-197).

Existe una necesidad en la técnica de modalidades biológicas para abordar la modulación de la traducción intracelular de ácidos nucleicos. La presente descripción resuelve este problema proporcionando nuevas moléculas de ARNm que incorporan alternativas químicas que imparten propiedades que son ventajosas para el desarrollo terapéutico. La invención se define en las reivindicaciones.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la estructura de Fórmula I:

A'-L-B' Fórmula I

en la que A' comprende: (a) al menos una estructura de capa 5'; (b) una 5'-UTR; (c) una región de codificación; y (d) una 3'-UTR; B' comprende una región estabilizadora 3' que comprende de 1 a 500 nucleósidos, donde dicha región estabilizadora comprende al menos un nucleósido alternativo, donde dicho nucleósido alternativo es timidina invertida; y L es un enlazador. Aspectos adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones.

Descripción general

En algunos aspectos, cuando una región estabilizadora 3' consta de un nucleósido, el nucleósido no es un 2'-desoxinucleósido, un 3'-desoxinucleósido, un 2', 3'-didesoxinucleósido, un 2'-O-metilnucleósido, un 3'-O-metilnucleósido, un 3'-O-etil-nucleósido o 3'-arabinósido. En algunos aspectos, cuando la región estabilizadora 3' consiste en un nucleósido, el nucleósido es un L-nucleósido, alfa-tio-2'-O-metil-adenosina, 2'-fluoro-adenosina, arabino-adenosina, hexitol- adenosina, LNA-adenosina, PNA-adenosina, timidina invertida o 3'-ácido-2',3'-didesoxiadenosina.

En algunos aspectos, A' incluye además (e) una región poli-A.

En algunos aspectos, uno o más nucleósidos en la región estabilizadora 3' incluyen la estructura:

donde B¹es una nucleobase;

cada U y U' es, independientemente, O, S, N (Ru)nu, o C(RU)nu, donde nu es 1 o 2 (por ejemplo, 1 para N (RU)nu y 2 para C(RU)nu) y cada RU es, independientemente, H, halo o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

cada uno de R¹, R¹', R¹", R², R²', R2", R³, R⁴, y R⁵es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6, opcionalmente sustituido con heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido o R³y/o R⁵pueden unirse con uno de R¹, R¹', R¹", R², R²' o R2" para formar junto con los carbonos a los que están unidos un carbociclo C3-C10 opcionalmente sustituido o un heterociclilo C3-C9 opcionalmente sustituido;

cada uno de m y n es independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5.

cada uno de Y¹, Y²e Y³, es, independientemente, O, S, Se, -NRN1-, alquileno ^c1-C6 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; y cada Y⁴es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C⁶opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido o amino opcionalmente sustituido; e

Y⁵es O, S, Se, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido; o una sal del mismo.

En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye una pluralidad de adenosinas. En algunos aspectos, todos los nucleósidos de la región estabilizadora 3' son adenosinas. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye al menos uno (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósido alternativo (por ejemplo, un L-nucleósido tal como L-adenosina, 2'-O-metil-adenosina, alfa-tio-2'-O-metil-adenosina, 2'-fluoro-adenosina, arabino-adenosina, hexitoladenosina, LNA-adenosina, PNA-adenosina o timidina invertida). En algunos aspectos, el nucleósido alternativo es L-adenosina, 2'-O-metil-adenosina o timidina invertida. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye una pluralidad de nucleósidos alternativos. En algunos aspectos, todos los nucleótidos de la región estabilizadora 3' son nucleósidos alternativos. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye al menos dos nucleósidos alternativos diferentes. En algunos aspectos, al menos un nucleósido alternativo es 2'-O-metil-adenosina. En algunos aspectos, al menos un nucleósido alternativo es timidina invertida. En algunos aspectos, al menos un nucleósido alternativo es 2'-O-metil-adenosina, y al menos un nucleósido alternativo es timidina invertida.

En algunos aspectos, la región estabilizadora incluye la estructura:

o una sal del mismo;

donde cada X es, independientemente O o S; y

A representa adenina y T representa timina.

En algunos aspectos, toda la pluralidad de nucleósidos alternativos son iguales (por ejemplo, todos los nucleósidos alternativos son L-adenosina). En algunos aspectos, la región estabilizadora incluye 10 nucleósidos. En algunos aspectos, la región estabilizadora incluye 11 nucleósidos.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, el enlazador tiene la estructura:

(R6)a-(R 7)b-(R8) c -( R V ( R 1V ( R 11) r (R 12)g-f

Fórmula Vil

donde a, b, c, e, f y g son cada uno, independientemente, 0 o 1;

d es 0, 1, 2, o 3;

cada uno de R⁶'R⁸'R1 °y R¹²'es, independientemente, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C⁶opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C6 opcionalmente sustituido o arileno C6-C10 opcionalmente sustituido, o, S, Se, y NR¹³;

R⁷y R¹¹son cada uno, independientemente, carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo o fosforilo, donde, si R⁷es fosforilo, -(R⁹)d- es un enlace, y e, f, y g son 0, entonces al menos uno de R⁶o R⁸no es O; y si R¹¹es fosforilo, -(R⁹)d- es un enlace, y a, b y c son 0, entonces al menos uno de R1 ° o R¹²no es O;

cada R⁹es alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, o un enlace que une (R⁶)a-(R⁷)b-(R⁸)c a (R1 °)e-(R¹¹)f-(R¹²)⁹, donde si -(R⁹)d- es un enlace, entonces al menos uno de a, b, c, e, f o g es 1; y

R¹³es hidrógeno, alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo C6-C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1-C7 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el enlazador comprende:

donde B¹es una nucleobase, hidrógeno, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido , alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, cicloalquilo C3-C10 opcionalmente sustituido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido, heterociclo C2-C9 opcionalmente sustituido; y

R¹⁴y R¹⁵son cada uno, independientemente, hidrógeno o hidroxi.

En algunos aspectos, B¹es una nucleobase o hidrógeno. En algunos aspectos, B¹es una nucleobase.

En algunas realizaciones, el enlazador comprende:

Fórmula IX

donde o es 0, 1, 2, o 3;

Y6 es O, S, Se, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido; cada Y⁷e Y⁸es, independientemente, O, S, Se, -NRN1-, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno Ci -Ca opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Ca opcionalmente sustituido, o arilo Ca-C io opcionalmente sustituido; y cada Y⁹es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo Ci -Ca opcionalmente sustituido, alquenilo C2-Ca opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Ca opcionalmente sustituido, heteroalquilo Ci -Ca opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-Ca opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-Ca opcionalmente sustituido, o amino opcionalmente sustituido; e

Y10° es O, un enlace, alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno Ca-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, Y¹⁰es polietilenglicoleno C2 -C100opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el enlazador comprende:

donde p es 0, 1,2, 3, 4, o 5.

En algunos aspectos, R¹⁴y R¹⁵son ambos hidroxi. En algunos aspectos, o es 1, Ya es metileno, Y⁷e Y⁸son ambos O e Y⁹es hidroxi. En algunos aspectos, p es 3.

En algunos aspectos, Y10° es heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el enlazador comprende:

donde q y r son cada uno, independientemente, 1, 2, 3, 4 o 5. En algunos aspectos, R14 y R15 son ambos hidroxi. En algunos aspectos, q es 5, Ya es metileno, Y7 e Y8 son ambos O, e Y9 es hidroxi. En algunos aspectos, r es 3.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, el enlazador puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par de reacciones químicas de clic.

En algunos aspectos, el enlazador incluye la estructura:

o un enlace amida.

En algunos aspectos, el enlazador incluye la estructura:

En algunos aspectos, el enlazador comprende la estructura:

En algunos aspectos, el enlazador está unido al extremo 3' de A' y al extremo 5' de B'.

En otro aspecto, la descripción presenta un polinucleótido, en el que dicho polinucleótido se prepara por oxidación (por ejemplo, por tratamiento con peryodato de sodio) de un cis-diol (por ejemplo, un cis-diol en el azúcar de un nucleósido tal como el nucleósido en el extremo 3') de un primer polinucleótido para formar un polinucleótido que contiene dialdehído seguido de tratamiento con un segundo polinucleótido que comprende un resto amina reactiva (por ejemplo, un resto alcoxiamino reactivo) en condiciones adecuadas.

En otro aspecto, la descripción presenta un polinucleótido que codifica un polipéptido, en el que el polinucleótido incluye:

(a) al menos una estructura de capa 5';

(b) una 5'-UTR (por ejemplo, una 5'-UTR que incluye una secuencia de Kozak);

(c) una región codificante;

(d) una 3'-UTR; y

e) una región estabilizadora 3' que incluye 1 a 500 (por ejemplo, 1 a 200, 1 a 400, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 , 180, 190 o 200) nucleósidos, donde uno o más de los nucleósidos es un L-nucleósido (por ejemplo, L-adenosina), alfa-tio-2'-O-metil-adenosina, 2'-fluoro-adenosina, hexitol-adenosina, LNA-adenosina, PNA-adenosina, timidina invertida o 3'-azido-2',3'-didesoxiadenosina.

En algunos aspectos, el polinucleótido incluye además (f) una región poli-A.

En algunos aspectos, el L-nucleósido tiene la estructura:

donde B¹es una nucleobase;

U es O, S, N(RU)nu, o C(RU)nu, donde nu es 1 o 2 (por ejemplo, 1 para N(RU)nu y 2 para C(RU)nu) y cada RU es, independientemente, H, halo, o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

cada uno de R¹, R², R³, y R⁵es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; o R³o R⁵pueden unirse juntos con uno de R¹o R²para formar juntos con los carbonos a lo que están unidos un carbociclo C3-C10 opcionalmente sustituido o un heterociclilo C3-C9 opcionalmente sustituido;

cada uno de m y n es independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5.

cada uno de Y¹, Y², e Y³, es, independientemente, O, S, Se, -NRN1‘, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; y

cada Y⁴es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o amino opcionalmente sustituido; e

En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye al menos un L-nucleósido (por ejemplo, L-adenosina).

En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye una pluralidad de nucleósidos alternativos.

En algunos aspectos, toda la pluralidad de nucleósidos alternativos son los mismos (por ejemplo, todos los nucleósidos alternativos son los L-nucleósidos tales como la L-adenosina).

En algunos aspectos, la región estabilizadora incluye 10 nucleósidos. En algunos aspectos, la región estabilizadora incluye 11 nucleósidos.

En algunos aspectos, el extremo 5' de la región estabilizadora 3' está conjugado con el extremo 3' de la 3'-UTR.

En algunos aspectos, el extremo 5' de la región estabilizadora 3' se conjuga con el extremo 3' de la región poli-A.

(a) al menos una estructura de capa 5';

(b) una 5'-UTR (por ejemplo, una 5'-UTR que incluye una secuencia de Kozak);

(c) una región codificante;

(d) una 3'-UTR; y

(e) una región estabilizadora 3' que incluye 1 a 500 (por ejemplo, 1 a 200, 1 a 400, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200) nucleósidos, en los que la región estabilizadora 3' incluye una pluralidad de nucleósidos alternativos.

En algunos aspectos, el polinucleótido incluye además (f) una región poli-A.

En algunos aspectos, uno o más nucleósidos alternativos incluyen la estructura:

Fórmula V

donde B¹es una nucleobase;

cada U y U' es, independientemente, O, S, N(RU)nu, o C(RU)nu, donde nu es 1 o 2 (por ejemplo, 1 para N(RU)nu y 2 para C(RU)nu) y cada RU es, independientemente, H, halo, o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

cada uno de R¹, R¹', R¹", R², R²', R2", R³, R⁴, y R⁵es, independientemente, H, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; o R³y/o R⁵pueden unirse juntos con uno de R¹, R¹', R¹", R², R²', o R²" para formar juntos con los carbonos a los que están unidos, un carbociclo C3-C10 opcionalmente sustituido o heterociclilo C3-C9 opcionalmente sustituido;

cada uno de m y n es independientemente 0, 1, 2, 3, 4 o 5.

cada uno de Y¹, Y², e Y³, es, independientemente, O, S, Se, -NRN1-, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;

ycada Y ⁴⁴es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o amino opcionalmente sustituido; e

En algunos aspectos, los nucleósidos alternativos son 2'-O-metil-adenosinas o arabino-adenosinas. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una pluralidad de nucleósidos alternativos en el extremo 3'. En algunos aspectos, la pluralidad de nucleósidos alternativos incluye al menos dos nucleósidos diferentes. En algunos aspectos, la pluralidad de nucleósidos alternativos son todos el mismo nucleósido. En algunos aspectos, todos los nucleósidos en la región estabilizadora 3' son nucleósidos alternativos.

En algunos aspectos, el extremo 5' de la región estabilizadora 3' se conjuga con el extremo 3' de la 3'-UTR.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, 5'-UTR incluye una secuencia de Kozak.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región estabilizadora 3' incluye el extremo 3' del polinucleótido.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región estabilizadora 3' incluye al menos un no nucleósido. En algunos aspectos, el al menos un no nucleósido está en el extremo 5', el extremo 3' o en una posición interna de la región estabilizadora 3'. En algunos aspectos, el no nucleósido es una ribosa abásica.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, al menos una de la región codificante, la 5'-UTR, la 3'-UTR, y/o la estructura de capa 5' incluye al menos una alternativa (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez) nucleósido (por ejemplo, cualquier nucleósido alternativo descrito en esta invención tal como una uridina 5-sustituida, por ejemplo, 5-metoxi-uridina, una pseudouridina 1-sustituida o una citidina 5-sustituida, por ejemplo, 5-metil-citidina).

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye al menos una alternativa (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósidos (por ejemplo, cualquier nucleósido alternativo descrito en esta invención tal como una uridina 5-sustituida, por ejemplo, 5-metoxi-uridina, una pseudouridina 1-sustituida o una citidina 5-sustituida , por ejemplo, 5-metil-citidina).

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye de aproximadamente 20 a aproximadamente 400 nucleósidos (por ejemplo, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 60 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200). En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye 64 nucleósidos. En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye una señal de poliadenilación.

En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, el polinucleótido incluye además una región poli-C. En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-C, si está presente, incluye nucleósidos de 1 a 500 (por ejemplo, 1 a 200, 1 a 400, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 60 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 , 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200). En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-C, si está presente, incluye 30 nucleósidos. En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-C, si está presente, se conjuga con el extremo 5' de la región estabilizadora 3'. En algunos aspectos de cualquiera de los polinucleótidos anteriores, la región poli-C, si está presente, se conjuga con el extremo 3' de la región poli-A y el extremo 5' de la región estabilizadora 3'.

En algunos aspectos, la descripción proporciona un compuesto, o una sal del mismo, que incluye un primer polinucleótido conjugado con al menos un segundo polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido que incluye 1 a 500 tal como 1 a 200, 1 a 400, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105,90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 nucleósidos), resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero a través de un enlazador que incluye la estructura de Fórmula XIII:

donde B¹es una nucleobase, hidrógeno, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, cicloalquilo C3-C10 opcionalmente sustituido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C9 opcionalmente sustituido;

X¹es O, S, NRuo C(RU)2, en el que cada Ru es, independientemente, H, halo o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

X²es -O-, -NR^N1-, -NR^N1NR^N1-, un enlace, alquilenoC1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C1-C30 opcionalmente sustituido, en el queR^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido;

m es 1, 2, 3, 4, o 5;

cada L es, independientemente, un enlazador ramificado o no ramificado; y

R¹y R²son cada uno independientemente hidrógeno, hidróxilo o alcoxi C1-C6;

donde el primer polinucleótido codifica un polipéptido, y

donde si R¹y R²son hidrógeno y el enlazador conjuga el primer polinucleótido con un segundo polinucleótido, entonces X²-(L)m no es un resto furanilmetilo, un resto piranilmetilo, -P (O) OH- o -P(O)N(Rⁿ)2-, en el que RN es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, B¹es hidrógeno o una nucleobase. En algunos aspectos, B¹es una nucleobase.

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de Fórmula XIV:

en la que A1 es el primer polinucleótido e incluye:

(a) al menos una estructura de capa 5';

(b) una 5'-UTR;

(c) una región codificante; y

(d) una 3'-UTR;

C1 incluye un segundo polinucleótido, tal como una región estabilizadora 3', un aptámero, un ARNip u otro ARN no codificante, un resto de direccionamiento, una molécula pequeña, un polipéptido o un polímero;

L1 es un enlazador no ramificado;

L2 es un enlazador ramificado;

n es 0, 1, 2 o 3;

o es 0 o 1;

p es 1, 2, 3, 4 o 5; y representa el número de restos C1 unidos a L1 o L2, donde p es 1, cuando o es 0.

X2 es— O— , — NRN1— , -NRN1NRN1‘, un enlace, alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C30 opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; Y¹es O, S, Se, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido; cada Y²e Y³es, independientemente, O, S, Se, -NRN1-, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, donde R^N1es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; y cada Y⁴es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o amino opcionalmente sustituido,

donde cuando Y², Y³y X¹son cada uno O, R¹y R²son cada uno hidrógeno, Y¹es CH2, Y⁴es hidroxi, n es 1, o es 0, p es 1 y C¹es un polinucleótido, X²-L¹no es — P(O)OH- o — P(O)N(RN)2-, donde RN es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido,

o una sal del mismo.

En algunos aspectos, cuando L²está presente, hay al menos un C¹en el extremo de cada rama del enlazador ramificado.

En algunos aspectos, X¹es O. En algunos aspectos, R¹y R²son cada uno hidroxi. En algunos aspectos, Y¹es alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido (por ejemplo, metileno). En algunos aspectos, n es 1. En algunos aspectos, Y²es O. En algunos aspectos, Y³es O. En algunos aspectos, Y⁴es hidroxi. En ciertos aspectos, X²es un enlace. En ciertos aspectos, X²es — O— . En ciertos aspectos, X²es -O-alquileno-. En ciertos aspectos, X²es -O-(CH2)q-, donde q es un número entero entre 1 y 30, inclusive; preferiblemente, q es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. En ciertos aspectos, X²es — O— heteroalquileno. En ciertos aspectos, X²es polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido. En ciertos aspectos, X²es heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de Fórmula XV:

Fórmula XV

en la que q es 0, 1, 2, 3, 4 o 5,

o una sal del mismo.

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de Fórmula XVI:

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de Fórmula XVII:

donde r y s son cada uno, independientemente, 1,2, 3, 4 o 5,

o una sal del mismo.

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de Fórmula XXII:

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, L1 incluye la estructura de Fórmula XVIII:

FÓRMULA XVIII

donde a, b, c, e, f y g son cada uno, independientemente, 0 o 1;

d es 0, 1,2, o 3;

cada uno de R³, R⁵, R⁷, and R⁹se selecciona independientemente de entre alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, O , S, Se y NR1° ;

R⁴y R⁸son cada uno, independientemente, carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo o fosforilo;

cada R⁶es alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, o un enlazador (R³)a-(R⁴)b-(R⁵)c to (R⁷M R ⁸M R > ; y

R10° es hidrógeno, alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo C6-C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1-C7 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, L¹es un enlazador que puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par de reacciones químicas de clic, por ejemplo, L¹incluye:

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de la Fórmula XIX:

En algunos aspectos, o es 0.

En algunos aspectos, el compuesto tiene la estructura de la Fórmula XX:

o una sal de la misma.

En algunos aspectos, p es 1.

En algunos aspectos, L1 incluye:

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de la Fórmula XXI:

En algunos aspectos, o es 1.

En algunos aspectos, p es 3.

En algunos aspectos, L2 incluye:

En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de la fórmula XXIII:

o una sal de la misma.

donde t es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10; y

u es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

En algunos aspectos, t es 6. En algunos aspectos, u es 3. En algunos aspectos, o es 0. En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de la fórmula XXIV:

o una sal de la misma.

n es 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

En algunos aspectos, v es 4. En algunos aspectos, o es 0.

En algunos aspectos, L1 es alquileno C1-C10 . En algunos aspectos, el compuesto incluye la estructura de la fórmula XXIII:

En algunos aspectos, o es 0. En algunos aspectos, p es 1.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, C1 incluye el segundo polinucleótido. En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye una pluralidad de adenosinas. En algunos aspectos, todos los nucleósidos del segundo polinucleótido son adenosinas. En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye al menos uno (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósido alternativo (por ejemplo, L-adenosina, 2'-O-metil-adenosina, alfa-tio-2'-O-metil-adenosina, 2'-fluoro-adenosina, adenosina arabinosa, hexitol-adenosina, adenosina LNA, adenosina PNA, o timidina invertida). En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye una pluralidad de nucleósidos alternativos. En algunos aspectos, todos los nucleósidos del segundo polinucleótido son nucleósidos alternativos. En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye al menos dos nucleósidos alternativos diferentes (por ejemplo, al menos un nucleósido alternativo es 2'-O-metil-adenosina, y al menos un nucleósido alternativo es timidina invertida). En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye la estructura:

o una sal del mismo;

donde cada X es, independientemente O o S; y

A representa adenina y t representa la timina.

En algunos aspectos, toda la pluralidad de nucleósidos alternativos son los mismos (por ejemplo, todos los nucleósidos alternativos son la L-adenosina).

En algunos aspectos, el segundo polinucleótido incluye 10 u 11 nucleósidos.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, C1 incluye un resto de direccionamiento (por ejemplo, un carbohidrato tal como W-acetil-galactosamina, un lípido, una vitamina, un ligando de receptor pequeño, una proteína de unión a carbohidratos de la superficie celular o un ligando de la misma, una lectina, una lectina de tipo r, una galectina, un ligando a un antígeno de grupo de diferenciación (CD), CD30, CD40, una citocina tal como una citocina de tipo 1 o una citocina de tipo 2, una quimiocina, un factor estimulante de colonia, un interferón, una interleucina, una linfocina, una monocina o un derivado mutante y/o combinaciones de cualquiera de los mismos).

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, C1 incluye un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de localización nuclear tal como un polipéptido que tiene la secuencia PKKKRKVEDPY[K(Aoa]G-amida (SEQ ID NO:1), un polipéptido de localización de ER tal como un polipéptido que tiene la secuencia Aoa-KDEL-OH (SEQ ID NO:2), un polipéptido de escape endosómico tal como un polipéptido que tiene la secuencia Aoa-HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-amida (SEQ ID NO:3) o el correspondiente polipéptido de todos los D-aminoácidos, o un polipéptido que puede usarse en cromatografía de afinidad tal como una poli-histidina).

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, C1 incluye un polinucleótido (por ejemplo, un aptámero, un riboswitch (ribointerruptor), un asa de purificación, un ácido nucleico bloqueado o una secuencia de afinidad por PABP).

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, C1 incluye un asa de química de clic. En algunos aspectos, el asa de química del clic es un alquino. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una azida. En algunos aspectos, el asa de química de clic es ciclooctano. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un dieno. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un dienófilo. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un terminal alquino. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un alquino tenso. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un alquino activado. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un alquino deficiente en electrones. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un arino. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una tetrazina. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un alqueno. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una fosfina. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un ditioéster. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una alcoxiamina. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un carbonilo alfa, beta insaturado. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una maleimida. En algunos aspectos, el asa de química de clic es un tiol. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una enona. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una hidrazida. En algunos aspectos, el asa de química de clic es una amina. Los expertos en la materia conocen otras asas de química de clic adecuadas.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, A1 incluye además una región poli-A. En algunos aspectos, la región poli-A, cuando está presente, incluye al menos uno (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósidos alternativos.

En algunos aspectos, al menos una de las regiones codificantes, la 5'-UTR, la 3'-UTR y/o la estructura de capa 5' de A 1 incluye al menos una alternativa (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósidos (por ejemplo, una 5-uridina sustituida tal como la 5-metoxi-uridina, una 1- pseudouridina sustituida, o una 5-citidina sustituida, tal como 5-metilcitidina).

En algunos aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para modificar un polinucleótido, incluyendo el procedimiento:

ponerse en contacto con un polinucleótido que incluye la estructura de la Fórmula XXVI:

donde B es una nucleobase, hidrógeno, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, azido, cicloalquilo C3-C10 opcionalmente sustituido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido, heterociclo C2-C9 opcionalmente sustituido; y

con un compuesto, o una sal del mismo, que tiene la estructura de Fórmula XXVII:

h2n- r11

Fórmula XXVII

en la que R11 es alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C10 opcionalmente sustituido, arilo C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicol C2-C100opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C10 opcionalmente sustituido conjugado con un polinucleótido, o heteroalquilo C1-C10 opcionalmente sustituido;

en condiciones adecuadas para producir un polinucleótido que incluya la estructura de Fórmula XIII:

En algunos aspectos, B1 es hidrógeno o una nucleobase. En algunos aspectos, B1 es una nucleobase.

En algunos aspectos, el procedimiento incluye además hacer reaccionar un polinucleótido que incluye la estructura de la Fórmula XXVIII:

Fórm ula XXVIII;

o una sal de la misma.

en condiciones adecuadas (por ejemplo, condiciones que incluyen condiciones oxidativas tales como peryodato) para producir el polinucleótido que incluye la estructura de Fórmula XII.

En algunos aspectos, R11 es heteroalquilo C1-C10 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el compuesto, o una sal del mismo, de Fórmula XIII tiene la estructura de la Fórmula XXIX: h²n- or¹²

Fórm ula XXIX

en la que R12 es polietilenglicol C2-C100 opcionalmente sustituido, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1-C10 opcionalmente sustituido conjugado con un polinucleótido, por ejemplo, C1.

En algunos aspectos, R11 incluye un resto azido, un resto carboxilato, o un tiol.

En algunos aspectos, el compuesto de Fórmula XXIX tiene la estructura:

En algunos aspectos, el procedimiento incluye además hacer reaccionar el polinucleótido que incluye la estructura de Fórmula I con un segundo polinucleótido que incluye un resto alquino en condiciones adecuadas para producir un compuesto que incluye un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido conjugado a través de un enlazador que incluye un resto triazol.

En algunos aspectos, el resto alquino incluye la estructura:

En algunos aspectos, el procedimiento incluye además reaccionar el compuesto de fórmula I con un segundo polinucleótido que incluye un resto maleimido en condiciones adecuadas para producir un compuesto que incluye un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido conjugado a través de un enlazador que incluye la estructura:

En algunos aspectos, el procedimiento incluye además reaccionar el compuesto de fórmula I con un segundo polinucleótido que incluye un resto amino en condiciones adecuadas para producir un compuesto que incluye un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido conjugado a través de un enlazador que incluye un enlace de amida.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero es un agente terapéutico tal como una citotoxina, ión radiactivo, quimioterapéutico u otro agente terapéutico. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p.ej., maitansinol (véase la Pat. EE. UU. N. ° 5.208.020 ), (CC-1065, véase la Pat. EE. UU. N. ° 5.475.092, 5.585.499, y 5.846.545), y análogos u homólogos de las mismas. Los iones radiactivos incluyen, pero no se limitan a, yodo (por ejemplo, yodo 125 o yodo 131), estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, itrio 90, samario 153 y praseodimio. Los agentes terapéuticos incluyen, entre otros, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, CC-1065, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina platino (II) (Dd P) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej. bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC), y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina, vinblastina , taxol y maitansinoides).

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero es una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas moléculas orgánicas pequeñas, compuestos inorgánicos, nanopartículas, enzimas o sustratos de enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales quimioluminiscentes, materiales radiactivos y agentes de contraste. Tales etiquetas ópticamente detectables incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilben-2,2'disulfónico; acridina y derivados: acridina e isotiocianato de acridina; ácido 5- (2'-aminoetil) aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato; N-(4-anilino-l-naftil) maleimida; antranilamida; BODIPY; Amarillo brillante; cumarina y derivados: cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (a Mc , Coumarin 120) y 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumarin 151)); tintes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalolsulfonaftaleína (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilben-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatostilben-2,2'-disulfónico; 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonil cloruro (DNS, dansilcloruro); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados: eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina y derivados; eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados; 5-carboxifluoresceína (FAM), 5- (4,6-diclorotriazin-2-il) aminofluoresceína (DTAF), 2', 7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, (QFITC o XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato malaquitaverde; 4 metilbumbelliferoneortho cresolftaleina; nitrotirosina; pararosanilina; Fenol rojo; B-ficoeritrin; O-ftaldialdehido; pireno y derivados: pireno, pireno butirato, succinimidil 1-pireno; puntos cuánticos del butirato; Red 4 reactivo (Cibacron TM rojo brillante 3B-A) rodamina y derivados: 6 carboxi-x-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), rodamina lisamina B sulfonil cloruro rodarnina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforhodamina B, sulforhodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforhodamine 101 (Texas roja); N,N,N',N'treametil-6-carboxirodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC); riboflavina; ácido rosólico; derivados del quelato de terbio; Cianina-3 (CY3); Cianina-5 (CY5); Cianina-5.5 (CY5.5), cianina-7 (CY7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La jolta azul; ftalo cianina; y naftalo cianina. En algunos aspectos, el marcador detectable es un tinte fluorescente, tal como Cy5 y Cy3. En algunos aspectos, el agente detectable es un precursor no detectable que se vuelve detectable tras la activación. Los ejemplos incluyen construcciones de tetrazina-fluoróforos fluorogénicos (por ejemplo, tetrazina-BODIPY FL, tetrazina-oregon verde488, o tetrazina-BODIPY TMR-X) o agentes fluorológicos activables de enzima (por ejemplo, PROSENSE (VisEn Medical)).

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero es un material luminiscente. Los ejemplos de material luminiscente incluyen luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero incluye un material radiactivo. Ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 18F, 67Ga, 81mKr, 82Rb, 111In, 123I, 133Xe, 2°1Tl, 125I, 35S, 14C, o 3H, 99mTc (p. ej., como pertecnetato (tecnetato (VII), TcO4-) directa o indirectamente, u otro radioisótopo detectable por recuento directo de radioemisión o por recuento de centelleo.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el resto de direccionamiento, molécula pequeña, polipéptido o polímero es un agente de contraste. Además, pueden usarse agentes de contraste, por ejemplo, agentes de contraste para MRI o NMR, para CT de rayos X, formación de imágenes Raman, tomografía de coherencia óptica, formación de imágenes por absorción, formación de imágenes por ultrasonido o formación de imágenes térmicas. Los agentes de contraste ejemplares incluyen oro (p. ej., nanopartículas de oro), gadolinio (p. ej., Gd quelado), óxidos de hierro (p. ej., óxido de hierro superparamagnético (SPIO), nanopartículas de óxido de hierro monocristalino (MION) y óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño (USPIO)), también se pueden usar quelatos de manganeso (p. ej., Mn-DPDP), sulfato de bario, medios de contraste yodados (iohexol), microburbujas o perfluorocarbonos.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, el polímero es un polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, péptido, un polímero catiónico o cualquier macromolécula sintética o natural formada por unidades monoméricas repetidas.

En algunos aspectos, el polímero es un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal opcionalmente sustituido. En algunos aspectos, el polímero es un polímero de polialquileno de cadena ramificada opcionalmente sustituido, polialquenileno o polioxialquileno. En algunos aspectos, el polímero es un polisacárido ramificado opcionalmente sustituido. En algunos aspectos, el polímero es un polisacárido no ramificado opcionalmente sustituido. En algunos aspectos, el polímero es un polietilenglicol, polipropilenglicol o alcohol polivinílico opcionalmente sustituido o un derivado del mismo. En algunos aspectos, el polímero es una cadena ramificada de polietilenglicol, polipropilenglicol o alcohol polivinílico o derivado de la misma.

En algunos aspectos, el polímero es polietilenglicol (PEG). En algunos aspectos, el polímero es una forma derivatizada de PEG (por ejemplo, ésteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS) de PEG tales como propionato de succinimidilo, ésteres activos de benzotriazol y PEG derivatizado con maleimida, vinilsulfonas o grupos tiol). Los polímeros de PEG útiles en la descripción pueden ser moléculas lineales o pueden estar ramificados en los que están presentes múltiples restos de PEG en un solo polímero.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, la molécula pequeña incluye un grupo bencilo (p. ej., la hidroxilamina utilizada en la reacción para formar el morfolino es o-bencilhidroxilamina, O-(2,3,4,5,6-petafluorobencil) hidroxilamina, O-tritilhidroxilamina, O-(4-nitro-bencil) hidroxilamina), En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, la molécula pequeña incluye un grupo alquilo (por ejemplo, la hidroxilamina utilizada en la reacción para formar el morfolino es metoxiamina, O-etilhidroxilamina, O-tercbutilhidroxilamina, O-terc-butildimetilsililhidroxilamina, O- (carboximetil) hidroxilamina). En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos o procedimientos anteriores, la molécula pequeña incluye un heterociclo (por ejemplo, la hidroxilamina usada en la reacción para formar el morfolino es O-(tetra-2H-piran-2-il) hidroxilamina o 10-[2-(aminooxi)etil]-10H-fenotiazina. En algunos aspectos, la molécula pequeña incluye un heteroátomo (por ejemplo, la hidroxilamina usada en la reacción para formar el morfolino es ácido hidroxilamina-O-sulfónico o hidroxilamina).

En algunos aspectos, los compuestos también pueden incluir un resto de direccionamiento que puede ser un resto o agente de penetración celular que mejora la administración intracelular de las composiciones. Por ejemplo, las composiciones pueden incluir una secuencia peptídica penetrante de células que facilita la entrega al espacio intracelular, por ejemplo, péptido de TAT derivado por VIH, penetratinas, transportes, o péptidos de penetración celular derivados de HCT, véase, por ejemplo, Caron y col., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi y col., (2005) Curr Pharm Des.

11(28):3597-611; and Deshayes y col., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. Las composiciones también se pueden formular para incluir un agente de penetración celular, por ejemplo, liposomas, que mejoran el suministro de las composiciones al espacio intracelular.

Los compuestos descritos en esta invención se pueden usar para administrar un agente a cualquier diana biológica para la que exista o pueda generarse un ligando específico. El ligando puede unirse a la diana biológica de forma covalente o no covalente. Los ejemplos de dianas biológicas incluyen biopolímeros, por ejemplo, anticuerpos, ácidos nucleicos tales como ARN y ADN, proteínas, enzimas; Las proteínas ejemplares incluyen enzimas, receptores y canales iónicos. En algunos aspectos, la diana es un marcador específico de tejido o tipo celular, por ejemplo, una proteína que se expresa específicamente en un tejido o tipo celular seleccionado. En algunos aspectos, la diana es un receptor, como, entre otros, receptores de membrana plasmática y receptores nucleares; ejemplos más específicos incluyen receptores acoplados a proteína G, proteínas de poros celulares, proteínas transportadoras, anticuerpos expresados en la superficie, proteínas HLA, proteínas MHC y receptores de factores de crecimiento.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye de aproximadamente 20 a aproximadamente 400 nucleósidos (p. ej., 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 60 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200). En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-A, si está presente, incluye 64 nucleósidos. En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-S, si está presente, incluye una señal de poliadenilación.

En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, el primer polinucleótido incluye además una región poli-C. En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-C, si está presente, incluye de 1 a 500 nucleósidos (p. ej., 1 a 200, 1 a 400, 1 a 10, 5 a 15, 10 a 20, 15 a 25, 20 a 30, 25 a 35, 30 a 40, 35 a 45, 40 a 50, 45 a 65, 50 a 70, 60 a 70, 65 a 85, 70 a 90, 85 a 105, 90 a 110, 105 a 135, 120 a 150, 130 a 170, 150 a 200 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200). En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-C, si está presente, incluye 30 nucleósidos. En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-C, si está presente, se conjuga con el extremo 3' del primer polinucleótido. En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos anteriores, la región poli-C, si está presente, se conjuga con el extremo 3' de la región poli-A del primer polinucleótido.

En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición de nanopartículas lipídicas que incluye cualquiera de los polinucleótidos o compuestos anteriores. En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica incluye un lípido catiónico, un lípido modificado por PEG, un esterol y un lípido no catiónico. El lípido catiónico se puede seleccionar del grupo que consiste en 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), dilinoleil-metil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA) y 9-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanodioato de di((Z)-no-2-en-1-ilo) (L319). La nanopartícula lipídica tiene en otros aspectos una relación molar de alrededor del 20-60 % de lípido catiónico, alrededor del 5-25 % de lípido no catiónico PEG, alrededor del 25-55 % de esterol y alrededor del 0,5-15 % de lípido modificado. En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica comprende una relación molar de alrededor del 50 % de lípido catiónico, alrededor del 1,5 % de lípido modificado por PEG, alrededor del 38,5 % de esterol y alrededor del 10 % de lípido no catiónico. La nanopartícula lipídica tiene un diámetro medio de 50-150 nm, u 80-100 nm en otros aspectos.

En algunos aspectos, la descripción proporciona un compuesto que comprende un polinucleótido que se ha modificado para comprender la estructura de la Fórmula I, en la que el polinucleótido modificado da como resultado una mayor expresión de polipéptido en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para aumentar la expresión de un polipéptido recombinante de interés en una célula que comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido que codifica el polipéptido, en el que el polinucleótido se ha modificado para comprender la estructura de la Fórmula I, y en el que la expresión aumenta en comparación con el polinucleótido no modificado. Por ejemplo, el polinucleótido modificado da como resultado niveles de expresión que aumentan entre aproximadamente un 0,1 % y aproximadamente un 100 % (por ejemplo, aproximadamente 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o aproximadamente el 100 %) en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado da como resultado niveles de expresión que aumentan aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 100 veces (p. ej., aproximadamente 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 12 veces, 14 veces, 16 veces, 18 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, o aproximadamente 100 veces,) en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, el polinucleótido es un ARNm. En algunos aspectos, el polipéptido de interés es un polipéptido terapéutico. En algunos aspectos, la célula es una célula de mamífero. En algunos aspectos, la célula de mamífero es una célula humana.

En algunos aspectos, la descripción proporciona un compuesto que comprende un polinucleótido que se ha modificado para comprender la estructura de la fórmula I, en la que el polinucleótido modificado da como resultado un aumento de la vida media en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, la descripción proporciona un procedimiento para aumentar la vida media de un polinucleótido en una célula que comprende poner en contacto la célula con el polinucleótido, en el que el polinucleótido se ha modificado para comprender la estructura de la Fórmula I, y en el que la vida media aumenta en comparación con el polinucleótido no modificado. Por ejemplo, el polinucleótido modificado tiene una medición de vida media que aumenta entre aproximadamente un 0,1 % y aproximadamente el 100 % (por ejemplo, aproximadamente 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o alrededor del 100 %) en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, el polinucleótido modificado tiene una medición de vida media que aumenta aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 100 veces (p. ej., aproximadamente 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 12 veces, 14 veces, 16 veces, 18 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, o aproximadamente 100 veces,) en comparación con el polinucleótido no modificado. En algunos aspectos, el polinucleótido es un ARNm. En algunos aspectos, el ARNm codifica un polipéptido terapéutico. En algunos aspectos, la célula es una célula de mamífero. En algunos aspectos, la célula de mamífero es una célula humana.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra el AUC durante tres días de la expresión de hEPO de ARNm a 0,05mg/kg. La Figura 2 es un gráfico que ilustra el AUC durante cuatro días de la expresión de hEPO de ARNm a 0,05mg/kg. La Figura 3 es un gráfico que ilustra el AUC durante cuatro días de la expresión de hEPO de ARNm a 0,5 mg/kg. La Figura 4 es un gráfico que ilustra la tasa de desadenilación de oligonucleótidos.

La Figura 5 es un gráfico que ilustra la expresión de mCitrina de ARNm.

Descripción detallada

La presente descripción proporciona, entre otros, polinucleótidos que exhiben propiedades terapéuticas mejoradas que incluyen, pero no se limitan a, mayor estabilidad, mayor expresión, y/o una respuesta inmune innata reducida cuando se introduce en una población de células.

En particular, los inventores han identificado que el ARNm que contiene una región estabilizadora 3' (por ejemplo, una región estabilizadora 3' que incluye una base nuclear alternativa, azúcar, y/o esqueleto) pueden ser particularmente efectivos para su uso en composiciones terapéuticas, porque pueden beneficiarse de una mayor estabilidad, altos niveles de expresión y una inducción limitada de la respuesta inmune innata, como se muestra en los Ejemplos (en particular, se puede observar un alto rendimiento en los ensayos en los ejemplos 6-9).

Preferiblemente, los polinucleótidos alternativos son sustancialmente no tóxicos y no mutagénicos.

Las composiciones y procedimientos descritos en esta invención pueden usarse, in vivo e in vitro, tanto extracelularmente como intracelularmente, así como en ensayos tales como ensayos libres de células.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona composiciones que incluyen un polinucleótido como se describe en esta invención. En algunos aspectos, la composición es una mezcla de reacción. La composición puede ser una composición farmacéutica. En algunos aspectos, la composición es un cultivo celular.

Se aprecia que ciertas características de la presente invención, que, por claridad, se describen en el contexto de aspectos separados, también pueden proporcionarse en combinación en un solo aspecto. Por el contrario, varios rasgos de la descripción que a efectos de brevedad se describen en el contexto de un único aspecto, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada.

Polinucleótidos

Los polinucleótidos de la descripción típicamente incluyen una primera región de nucleósidos enlazados que codifican un polipéptido de interés (por ejemplo, una región codificante), una primera región flanqueante ubicada en el extremo 5' de la primera región (por ejemplo, un 5'- UTR), una segunda región flanqueante ubicada en el extremo 3' de la primera región (por ejemplo, una UTR 3'), al menos una región de la capa 5' y una región estabilizadora 3'. En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción incluyen además una región poli-A. En algunos aspectos, cualquiera de las regiones de los polinucleótidos de la descripción incluye al menos uno (por ejemplo, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, o al menos diez) nucleósidos alternativos. Por ejemplo, la región estabilizadora 3' puede contener un nucleósido alternativo tal como un L-nucleósido, una timidina invertida o un 2'-O-metil nucleósido y/o la región codificante, 5'-UTR, 3'-UTR, o la región de capa puede incluir un nucleósido alternativo tal como una uridina 5-sustituida (p. ej., 5-metoxiuridina), una pseudouridina 1-sustituida (p. ej., 1-metil-pseudouridina), y/o una citidina 5-sustituida (por ejemplo, 5-metil-citidina).

Polinucleótidos alternativos

La presente descripción proporciona polinucleótidos, incluidos los ARN tales como los ARNm que contienen uno o más nucleósidos o nucleótidos alternativos como se describe en esta invención (por ejemplo, en una región estabilizadora 3 ), que tienen propiedades útiles que incluyen una mayor estabilidad y/o la falta de una inducción sustancial de la respuesta inmune innata de una célula en la que se introduce el polinucleótido. Por ejemplo, en algunos aspectos, el polinucleótido alternativo presenta una degradación reducida en una célula en la que se introduce el polinucleótido, en relación con un polinucleótido inalterado correspondiente. Estos polinucleótidos alternativos pueden mejorar la eficiencia de la producción de proteínas, la retención intracelular de los polinucleótidos, y/o la viabilidad de las células en contacto, además de poseer una inmunogenicidad reducida.

El término "polinucleótido" en su sentido más amplio, incluye cualquier compuesto y/o sustancia que encuentre o se pueda incorporar en una cadena de oligonucleótido. Polinucleótidos ejemplares para su uso de acuerdo con la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ADN, ARN que incluye ARNm mensajero (ARNm), híbridos de los mismos, agentes inductores de ARNi, agentes de ARNi, ARNip, ARNhc, miARN, ARN antisentido, ribozimas, ADN catalítico, ARN que inducen la formación de triple hélice, aptámeros, vectores, etc., descritos en detalle en esta invención.

Los polinucleótidos de la descripción pueden o no estar alterados uniformemente a lo largo de toda la longitud de la molécula. Por ejemplo, uno o más o todos los tipos de nucleótidos (p. ej., purina o pirimidina, o uno cualquiera o más o todos de A, G, U, C) pueden modificarse uniformemente o no en un polinucleótido de la descripción, o en una región de secuencia predeterminada dada del mismo. En algunas realizaciones, todos los nucleótidos X de un polinucleótido de la presente descripción (o de una región de secuencia determinada del mismo) son nucleótidos modificados, donde X puede ser cualquiera de los nucleótidos A, G, U, C, o cualquiera de las combinaciones A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C o A+G+C.

Diferentes modificaciones de azúcar, modificaciones de nucleótidos, y/o enlaces internucleosídicos (p. ej., estructuras de cadena principal) pueden existir en varias posiciones en el polinucleótido. Un experto en la técnica entenderá que los análogos de nucleótidos u otra modificación o modificaciones se pueden encontrar en cualquier posición de un polinucleótido de manera que la función del polinucleótido no se vea sustancialmente disminuida. Una alteración también puede ser una alteración terminal 5' o 3'. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye una alteración en el extremo 3'. El polinucleótido puede contener entre alrededor del 1 % y alrededor del 100 % de nucleótidos alternativos (ya sea con relación al contenido de nucleótidos general, o en relación con uno o más tipos de nucleótidos, es decir, uno o más de A, G, U o C) o cualquier porcentaje interviniente (es decir, de 1 % a 20 %, de 1 % a 25 %, de 1 % a 50 %, de 1 % a 60 %, de 1 % a 70 %, de 1 % a 80 %, de 1 % a 90 %, de 1 % a 95 %, de 10 % a 20 %, de 10 % a 25 %, de 10 % a 50 %, de 10 % a 60 %, de 10 % a 70 %, de 10 % a 80 %, de 10 % a 90 %, de 10 % a 95 %, de 10 % a 100 %, de 20 % a 25 %, de 20 % a 50 %, de 20 % a 60 %, de 20 % a 70 %, de 20 % a 80 %, de 20 % a 90 %, de 20 % a 95 %, de 20 % a 100 %, de 50 % a 60 %, de 50 % a 70 %, de 50 % a 80 %, de 50 % a 90 %, de 50 % a 95 %, de 50 % a 100 %, de 70 % a 80 %, de 70 % a 90 %, de 70 % a 95 %, de 70 % a 100 %, de 80 % a 90 %, de 80 % a 95 %, de 80 % a 100 %, de 90 % a 95 %, de 90 % a 100 % y de 95 % a 100 %). Se entenderá que cualquier porcentaje restante está representado por la presencia de A, G, U o C.

Los polinucleótidos pueden contener un mínimo de 1 y un máximo de 100 % de nucleótidos modificados, o cualquier porcentaje intermedio, tal como al menos 5 % de nucleótidos modificados, al menos 10 % de nucleótidos modificados, al menos 25 % de nucleótidos modificados, al menos 50 % de nucleótidos modificados, al menos 80 % de nucleótidos modificados o al menos 90 % de nucleótidos modificados. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden contener una pirimidina modificada, tal como un uracilo o citosina modificados. En algunos aspectos, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 80 %, al menos 90 % o 100 % del uracilo del polinucleótido se reemplaza con un uracilo modificado (por ejemplo, un uracilo 5-sustituido). El uracilo modificado se puede reemplazar por un compuesto que tiene una estructura única simple, o se puede reemplazar por múltiples compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas). En algunos aspectos, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 25 %, al menos el 50 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % de la citosina en el polinucleótido se reemplaza con una citosina modificada (por ejemplo, una citosina 5-sustituida). La citosina modificada puede reemplazarse por un compuesto que tiene una estructura única simple o puede reemplazarse por múltiples compuestos que tienen diferentes estructuras (por ejemplo, 2, 3, 4 o más estructuras únicas).

Otros componentes de un polinucleótido son opcionales y beneficiosos en algunos aspectos. Por ejemplo, se proporciona una región 5' sin traducir (UTR) y/o una 3'-UTR, en la que una o ambas pueden contener independientemente una o más alteraciones de nucleósidos. En algunos aspectos, también pueden estar presentes alteraciones de nucleósidos en la región traducible. También se proporcionan polinucleótidos que contienen una secuencia de Kozak (por ejemplo, en la 5'-UTR). En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción incluyen una región poli-A. En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción incluyen al menos una estructura de capa 5'.

En ciertos aspectos, es deseable degradar intracelularmente un polinucleótido alternativo introducido en la célula, por ejemplo, si se desea una sincronización precisa de la producción de proteínas. Por tanto, en algunos casos, la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico modificada que contiene un dominio de degradación, sobre el que se puede actuar de manera dirigida dentro de una célula.

Además, se proporcionan polinucleótidos que contienen una o más secuencias de nucleótidos intrónicos capaces de escindirse del polinucleótido.

Además, se proporcionan polinucleótidos que contienen un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Un IRES puede actuar como el único sitio de unión al ribosoma, o puede servir como uno de los múltiples sitios de unión al ribosoma de un ARNm. Un polinucleótido que contiene más de un sitio de unión de ribosoma funcional puede codificar varios péptidos o polipéptidos que son traducidos independientemente por los ribosomas (p. ej., ARNm multicistrónico). Cuando se proporcionan polinucleótidos con un IRES, se proporciona además opcionalmente una segunda región traducible. Ejemplos de secuencias de IRES que se pueden usar según la presente descripción incluyen, sin limitación, las de picornavirus (p. ej., FMDV), virus de plagas (CFFV), virus de la polio (PV), virus de encefalomiocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia murina (MLV), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS) o virus de la parálisis del grillo (CrPV).

Generalmente, la longitud más corta de un polinucleótido alternativo de la presente descripción puede ser la longitud de la secuencia de polinucleótidos que es suficiente para codificar un dipéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar un tripéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un tetrapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un pentapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un hexapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un heptapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un octapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un nonapéptido. En otro aspecto, la longitud de la secuencia de polinucleótidos es suficiente para codificar para un decapéptido.

Los ejemplos de dipéptidos que pueden codificar las secuencias polinucleotídicas alternativas incluyen, pero no se limitan a, carnosina y anserina.

En un aspecto adicional, el polinucleótido tiene más de 30 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la molécula de polinucleótido tiene más de 35 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 50 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 4000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 5000 nucleótidos o superior a 5000 nucleótidos.

Estructuras de capa 5'

La estructura de capa 5' de un polinucleótido está involucrada en la exportación nuclear, aumentando la estabilidad del polinucleótido y se une a la proteína de unión a la capa de ARNm (CBP), que es responsable de la estabilidad del polinucleótido en la célula y la capacidad traslacional a través de la asociación de CBP con la proteína de unión poli-A para formar la especie de ARNm cíclico maduro. La capa ayuda además a la eliminación de los intrones proximales 5' durante el empalme del ARNm.

Las moléculas de polinucleótido endógeno pueden estar protegidas en el extremo 5' generando un enlace 5'-ppp-5'-trifosfato entre un residuo terminal de la capa de guanosina y el nucleótido sentido transcrito en el terminal 5' del polinucleótido. Esta capa de 5'-guanilato puede a continuación metilarse para generar un residuo de N7-metilguanilato. Los azúcares ribosa de los nucleótidos transcritos de extremo y/o anteextremos del extremo 5' del nucleótido pueden opcionalmente estar también 2'-O-metilados. El decapado 5' mediante hidrólisis y escisión de la estructura de capa de guanilato puede alcanzar a una molécula de polinucleótido, tal como una molécula de ARNm, para su degradación.

Las modificaciones de los polinucleótidos de la presente descripción pueden generar una estructura de capa no hidrolizable que impide el decapado y, por lo tanto, aumenta la vida media del polinucleótido. Debido a que la hidrólisis de la estructura de la capa requiere la escisión de los enlaces fosforodiéster 5'-ppp-5', se pueden usar nucleótidos modificados durante la reacción de protección. Por ejemplo, se puede usar una enzima de protección contra Vaccinia de New England Biolabs (Ipswich, ^{M a )}con nucleótidos de a-tioguanosina según las instrucciones del fabricante para crear un enlace fosforotioato en la capa 5'-ppp-5'. Pueden usarse nucleótidos de guanosina modificados adicionales tales como nucleótidos de a-metil-fosfonato y selenofosfato.

Las modificaciones adicionales incluyen, pero no se limitan a, 2'-O-metilación de los azúcares ribosa de 5'-terminal y/o 5'-nucleótidos anteterminales del polinucleótido (como se mencionó anteriormente) en el grupo 2'-hidroxilo del azúcar. Se pueden usar múltiples estructuras de capa 5' distintas para generar la capa 5' de un polinucleótido, tal como una molécula de ARNm.

Las estructuras de capa 5' incluyen las descritas en las Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° WO2008/127688, WO 2008/016473 y WO 2011/015347.

Análogos de capa, que en esta invención también se denominan análogos de capa sintética, capas químicas, análogos de capa química o análogos de capas estructurales o funcionales, difieren de las capas 5' naturales (es decir, endógenas, de tipo silvestre o fisiológicas) en su estructura química, manteniendo la función de capa. Análogos de capa pueden sintetizarse químicamente (es decir, no enzimáticamente) o enzimáticamente y/enlazados a un polinucleótido.

Por ejemplo, la capa Análogo de capa anti-reverso (ARCA) contiene dos guaninas unidas por un grupo 5'-5'-trifosfato, donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo (es decir, N7,3'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina (m7G-3'mppp-G; que puede denominarse equivalentemente 3' O-Mem7G(5')ppp(5')G). El átomo 3'-O de la otra guanina, no modificada, se une al nucleótido terminal 5' del polinucleótido protegido (por ejemplo, un ARNm). La guanina N7- y 3'-O-metilizada proporciona el resto terminal del polinucleótido protegido (por ejemplo, ARNm).

Otra capa ejemplar es mCAP, que es similar a ARCA pero tiene un grupo 2'-O-metilo en la guanosina (es decir, N7,2'-O-dimetil-guanosina-5'-trifosfato-5'-guanosina, m7Gm-ppp-G).

En un aspecto, la capa es un análogo de capa de dinucleótido. Como ejemplo no limitante, el análogo de capa de dinucleótidos puede modificarse en diferentes posiciones de fosfato con un grupo boranofosfato o un grupo fosforoselenoato tal como los análogos de capa de dinucleótidos descritos en el documento de Patente de EE.UU. n. ° 8.519.110.

En otro aspecto, el análogo de capa es un análogo de capa de dinucleótido sustituido con N7-(4-clorofenoxietilo) conocido en la técnica y/o descrito en esta invención. Ejemplos no limitantes de análogos de capa de dinucleótidos sustituidos con N7-(4-clorofenoxietil) incluyen un N7-(4-clorofenoxietil) -G (5') ppp (5') G y un análogo de capa N7-(4-clorofenoxietil) -m3'- OG (5') ppp (5') G (véanse, por ejemplo, los diversos análogos de capa y los procedimientos para sintetizar los análogos de capa descritos en Kore y col. Bioorgánica & Química medicinal 2013 21:4570-4574). En otro aspecto, un análogo de capa útil en los polinucleótidos de la presente descripción es un análogo de 4-cloro/bromofenoxietilo.

Mientras los análogos de capa permiten la protección concomitante de un polinucleótido en una reacción de transcripción in vitro, hasta el 20 % de las transcripciones permanecen sin protección. Esto, así como las diferencias estructurales de un análogo de capa de las estructuras endógenas de la capa 5' de los ácidos nucleicos producidas por la maquinaria de transcripción celular endógena, pueden conducir a una competencia traslacional reducida y una estabilidad celular reducida.

Los polinucleótidos alternativos de la descripción también pueden bloquearse postranscripcionalmente, utilizando enzimas, para generar estructuras de capa 5' más auténticas. Tal como se usa en esta invención, la frase "más auténtico" se refiere a una característica que refleja o imita, estructural o funcionalmente, una característica endógena o de tipo silvestre. Es decir, una característica "más auténtica" es mejor representativa de una función y/o estructura celular endógena, de tipo silvestre, natural o fisiológica en comparación con características sintéticas o análogas, etc., de la técnica anterior, o que supera a la característica endógena, de tipo silvestre, natural, o fisiológica correspondiente en uno o más respectos. Ejemplos no limitantes de estructuras de capa 5' más auténticas de la descripción auténtica útiles en polinucleótidos de la presente descripción son aquellas que, entre otras cosas, tienen una unión mejorada de las proteínas de unión a la capa, una vida media aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o decapado 5' reducido, en comparación con las estructuras de capa 5' sintéticas conocidas en la técnica (o con una estructura de capa 5' de tipo silvestre, natural, o fisiológica). Por ejemplo, la enzima recombinante de protección contra el virus Vaccinia y la enzima 2'-O-metiltransferasa recombinante pueden crear un enlace 5'-5'-trifosfato canónico entre el nucleótido 5'-terminal de un polinucleótido y un nucleótido de capa de guanina donde la capa de guanina contiene una metilación de N7 y el nucleótido 5'-terminal del polinucleótido contiene un 2'-O-metilo. Esta estructura se denomina estructura de capa 1. Una estructura de capa 2 también incluye un 2'-O-metilo en el nucleótido adyacente al nucleótido 5'-terminal. Esta capa da como resultado una mayor competencia traslacional y estabilidad celular y una activación reducida de citocinas proinflamatorias celulares, en comparación, por ejemplo, con otras estructuras análogas de capa 5' conocidas en la técnica. Las estructuras de capa ejemplares incluyen 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (Capa 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (Capa 1), 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (Capa 2), y m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (Capa 4).

Debido a que los polinucleótidos modificados pueden estar bloqueados postranscripcionalmente, y debido a que este procedimiento es más eficiente, casi el 100 % de los polinucleótidos modificados pueden estar bloqueados. Esto contrasta con el ~80 % cuando un análogo de capa se une a un polinucleótido en el curso de una reacción de transcripción in vitro.

Según la presente descripción, las capas terminales 5' pueden incluir capas endógenas o análogos de capas. Según la presente descripción, una capa terminal 5' puede comprender un análogo de guanina. Análogos de guanina útiles incluyen inosina, N1-metil-guanosina, 2'fluoro-guanosina, 7-deaza-guanosina, 8-oxo-guanosina, 2-amino-guanosina, LNA-guanosina y 2-azido-guanosina.

En un aspecto, los polinucleótidos descritos en esta invención pueden contener una capa 5' modificada. Una modificación en la capa 5' puede aumentar la estabilidad del polinucleótido, aumentar la vida media del polinucleótido y podría aumentar la eficacia traslacional del polinucleótido. La capa 5' modificada puede incluir, pero no se limita a, una o más de las siguientes modificaciones: modificación en la posición 2'- y/o 3' de un trifosfato de guanosina protegido (GTP), un reemplazo del oxígeno del anillo de azúcar (que produjo el anillo carbocíclico) con un resto metileno (CH2), una modificación en el resto del puente trifosfato de la estructura de capa, o un modificación en el resto nucleobase (G).

5'-UTRs

Se puede proporcionar una 5'-UTR como una región flanqueante de los polinucleótidos alternativos (por ejemplo, ARNm) de la descripción. Una 5'-UTR puede ser homóloga o heteróloga a la región codificante que se encuentra en los polinucleótidos alternativos (ARNm) de la descripción. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.

Se muestra en la Tabla 21 en la Solicitud Provisional de EE. UU. N. ° 61/775,509, y en la Tabla 21 y en la Tabla 22 en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N. ° 61/829,372 , una lista del sitio de inicio y finalización de polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm) de la descripción. En la Tabla 21, cada 5'-UTR (5'-UTR-005 a 5'-UTR 68511) se identifica por su sitio de inicio y finalización en relación con su transcripción nativa o salvaje (homóloga) (ENST; el identificador utilizado en la base de datos ENSEMBL).

Para alterar una o más propiedades de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la descripción, las 5'-UTR que son heterólogas a la región codificante de los polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm) de la descripción pueden modificarse por ingeniería genética en compuestos de la descripción. Los polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm) pueden administrarse a continuación a células, tejidos u organismos y resultados tales como nivel de proteína, localización, y/o vida media se pueden medir para evaluar los efectos beneficiosos que la descripción heteróloga de 5'-UTR puede tener sobre los polinucleótidos alternativos (ARNm) de la descripción. Pueden utilizarse variantes de UTR 5' o 3' donde se añaden o eliminan uno o más nucleótidos en los extremos, incluidos A, T, C o G. 5'-UTRS también pueden optimizarse por codón, o alterarse de cualquier manera descrita en esta invención.

5'-UTR, 3'-UTR y elementos potenciadores traslacional (TEE)

En un aspecto, la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) puede incluir al menos un elemento potenciador de la traducción. El término "elemento potenciador de la traducción" se refiere a secuencias que aumentan la cantidad de polipéptido o proteína producida a partir de un polinucleótido. Como ejemplo no limitante, el TEE puede ubicarse entre el promotor de la transcripción y el codón de inicio. Los polinucleótidos (p. ej., ARNm) con al menos un TEE en la 5'-UTR pueden incluir una capa en la 5'-UTR. Además, al menos un TEE puede estar ubicado en la 5'-UTR de polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que experimentan traducción dependiente o independiente de la capa.

En un aspecto, los TEE son elementos conservados en la UTR que pueden promover la actividad traslativa de un polinucleótido tal como, pero sin limitarse a, traducción dependiente o independiente de la capa. La conservación de estas secuencias ha sido demostrada previamente por Panek y col. (Investigación de ácidos nucleicos, 2013, 1-10) en 14 especies, incluidos los humanos.

En un ejemplo no limitante, los TEE conocidos pueden estar en el líder 5' de la proteína del homeodominio Gtx (Chappell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004).

En otro ejemplo no limitativo, los TEE se describen como SEQ ID NO: 1-35 en la publicación de patente de EE.UU. N. ° 2009/0226470, SEQ ID N. ° 1-35 en laPublicación de patente de EE. UU. N. ° 2013/0177581 , SEQ ID N. ° 1-35 en laPublicación de Patente Internacional N. ° WO2009/075886 , SEQ ID N. ° 1-5 y 7-645 en laPublicación de Patente Internacional N. ° WO2012/009644 , SEQ ID NO: 1 en laPublicación de Patente Internacional N. ° WO1999/024595 , SEQ ID NO: 1 en laPatente de EE.UU. N. ° 6.310.197 , y SEQ ID N. ° 1 en la Patente de EE.UU. N. ° 6.849.405 .

En otro ejemplo no limitante, el TEE puede ser un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), HCV-IRES o un elemento IRES tal como, pero no limitado a, los descritos en la Patente de Estados Unidos N. ° 7.468.275 , las Publicaciones de patente de EE. UU. N. ° 2007/0048776 y2011/0124100 y las Publicaciones de patentes internacionales N. ° W02007/025008 y WO2001/055369 . Los elementos IRES pueden incluir, pero no se limitan a, las secuencias de Gtx (por ejemplo, Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) descritas por Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 102:6273-6278, 2005) y en Publicaciones de patente de EE. UU. Núms. 2007/0048776 y 2011/0124100 y Publicación de patente internacional N. ° W02007/025008.

Los "polinucleótidos de potenciador de traslación" son polinucleótidos que incluyen uno o más del TEE específico ejemplificado en esta invención y/o descrito en la técnica (véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N. ° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273, 7.183.395, Publicación de patente de EE.UU. N. ° 20090/226470, 2007/0048776, 2011/0124100, 2009/0093049, 2013/0177581, Publicaciones de patente internacionales N. ° WO2009/075886, W02007/025008, WO2012/009644, WO2001/055371 WO1999/024595, y Patentes europeas N. ° 2610341 y 2610340) o sus variantes, homólogos o derivados funcionales. Pueden estar presentes una o múltiples copias de un TEE específico en los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm). Los TEE en los polinucleótidos potenciadores de la traducción se pueden organizar en uno o más segmentos de secuencia. Un segmento de secuencia puede albergar uno o más de los TEE específicos ejemplificados en esta invención, estando cada TEE presente en una o más copias. Cuando están presentes múltiples segmentos de secuencia en un polinucleótido potenciador de la traducción, pueden ser homogéneos o heterogéneos. Por tanto, los segmentos de secuencia múltiple en un polinucleótido potenciador de la traducción pueden albergar tipos idénticos o diferentes de los TEE específicos ejemplificados en esta invención, número idéntico o diferente de copias de cada uno de los TEE específicos, y/u organización idéntica o diferente de los TEE dentro de cada segmento de secuencia.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir al menos un TEE que se describe en las publicaciones de patentes internacionales N. ° WO1999/024595 , WO2012/009644 ,WO2009/075886 ,W02007/025008 ,WO1999/024595 ,Publicaciones de patentes europeas N. ° 2610341 y2610340 , Patentes estadounidenses N. ° 6.310.197 ,6.849.405 ,7.456.273 ,7.183.395 yPublicaciones de patente de EE. UU. N. ° 2009/0226470 ,2011/0124100 ,2007/0048776,2009/0093049 y 2013/0177581. El TEE puede estar ubicado en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm).

En otro aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir al menos un TEE que tiene al menos el 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de identidad con los TEE descritos en Publicaciones de Patentes de EE. UU. N. ° 2009/0226470 , 2007/0048776 ,2013/0177581 y2011/0124100 , Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° WO1999/024595 ,WO2012/009644 ,WO2009/075886 yW02007/025008 , Publicaciones de patentes europeas números 2610341 y 2610340 , Patentes estadounidenses números 6.310.197 ,6.849.405 , 7.456.273,7.183.395.

En un aspecto, la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) puede incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias TEE. Las secuencias de TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden ser las mismas o diferentes secuencias de TEE. Las secuencias de Te E pueden tener un patrón tal como A bABAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes de las mismas, repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa un TEE diferente a nivel de nucleótidos.

En un aspecto, la 5'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias de TEE. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitante, la 5'-UTR puede incluir un módulo espaciador de secuencia TEE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, o más de 9 veces en la 5'-UTR.

En otro aspecto, el espaciador que separa dos secuencias de TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción tal como, entre otros, secuencias de miR (p. ej., sitios de unión de miR y semillas de miR). Como ejemplo no limitante, cada espaciador usado para separar dos secuencias de TEE puede incluir una secuencia de miR diferente o un componente de una secuencia de miR (p. ej., una secuencia de semilla de miR).

En un aspecto, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción puede incluir al menos el 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos el 99 % o más del 99 % de las secuencias de TEE descritas en las publicaciones de patente de EE.UU. N. ° 2009/0226470 , 2007/0048776 ,2013/0177581 y2011/0124100 , Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° WO1999/024595 ,WO2012/009644 ,WO2009/075886 yW02007/025008 , Publicaciones de patentes europeas N. ° 2610341 y2610340 , y patentes de EE. UU. N. ° 6.310.197 ,6.849.405,7.456.273 y 7.183.395. En otro aspecto, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5- 15 fragmento de nucleótidos, un fragmento de nucleótidos 5-10 de las secuencias TEE dados a conocer en la publicación de Patente de Estados Unidos N. ° 2009/0226470, 2007/0048776, 2013/0177581 y 2011/0124100, Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° WO1999/024595, WO2012/009644, WO2009/075886 y W02007/025008, Publicaciones de patentes europeas N. °2610341 y 2610340, y patentes de EE.UU. N. ° 6.310.197, 6.849.405, 7.456.273y 7.183.395.

En un aspecto, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción puede incluir al menos el 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o más del 99 % de las secuencias de TEE descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101:9590-9594, 2004 ) y Zhou y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 102:6273-6278, 2005 ), en la Tabla complementaria 1 y en la Tabla complementaria 2 descritas por Wellensiek y col . (Perfiles de todo el genoma de elementos que mejoran la traducción independientes de la capa humana, Procedimientos de naturaleza, 2013; DOI:10.1038/Nm Et H.2522). En otro aspecto, el TEE en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción puede incluir un fragmento de 5-30 nucleótidos, un fragmento de 5-25 nucleótidos, un fragmento de 5-20 nucleótidos, un fragmento de 5-15 nucleótidos, un fragmento de 5-10 nucleótidos de las secuencias de TEE descritas en Chappell y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 101:9590-9594, 2004) y Zhou y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 102:6273-6278, 2005), en la Tabla complementaria 1 y en la Tabla complementaria 2 descritas por Wellensiek y col. (Perfiles de todo el genoma de elementos que mejoran la traducción independientes de la capa humana, Procedimientos de naturaleza, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522).

En un aspecto, el TEE usado en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción es una secuencia IRES tal como, pero sin limitarse a, las descritas en la Patente de EE.UU . N. ° 7.468.275 y Publicación de patente internacional N. ° WO2001/055369.

En un aspecto, los TEE usados en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden identificarse mediante los procedimientos descritos en las Publicaciones de Patentes de EE.UU. N. ° 2007/0048776 y 2011/0124100 y Publicaciones de patentes internacionales N. ° W02007/025008 y WO2012/009644.

En otro aspecto, los TEE usados en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden ser un elemento regulador de la transcripción descrito en las Patentes de Estados Unidos N. ° 7.456.273 y 7.183.395 , Publicación de patente de EE.UU. N. ° 2009/0093049 y Publicación internacional N. °WO2001/055371. Los elementos reguladores de la transcripción pueden identificarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como, entre otros, los procedimientos descritos en las Patentes de EE.UU. N. ° 7.456.273 y 7.183.395, Publicación de patente de EE. UU. N. ° 2009/0093049y Publicación internacional N. ° WO2001/055371.

En otro aspecto más, el TEE usado en la 5'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción es un polinucleótido o una parte del mismo como se describe en las Patentes de EE.UU. N. ° 7.456.273 y 7.183.395 , Publicación de patente de EE.UU. N. ° 2009/0093049 y Publicación internacional N. °WO2001/055371.

La 5'-UTR que incluye al menos un TEE descrito en esta invención puede incorporarse en una secuencia monocistrónica tal como, pero sin limitarse a, un sistema de vector o un vector polinucleotídico. Como ejemplo no limitativo, los sistemas de vectores y los vectores polinucleotídicos pueden incluir los descritos en las Patentes de EE.UU. N. ° 7.456.273 y 7.183.395, Publicaciones de Patentes de EE.UU. 2007/0048776, 2009/0093049 y 2011/0124100y Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° W02007/025008 y WO2001/055371.

En un aspecto, los TEE descritos en esta invención pueden estar ubicados en la 5'-UTR y/o la 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm). Los TEE ubicados en la 3'-UTR pueden ser los mismos y/o diferentes a los TEE ubicados en y/o descrito para su incorporación en la 5'-UTR.

En un aspecto, las 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8 , al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18 al menos 19, al menos 20, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55 o más de 60 secuencias de TEE. Las secuencias de TEE en la 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden ser las mismas o diferentes secuencias de TEE. Las secuencias de Te E pueden tener un patrón tal como A bA bAB, AABBAABBAABB o ABCABCABC, o variantes de las mismas, repetidas una, dos o más de tres veces. En estos patrones, cada letra, A, B o C representa un TEE diferente a nivel de nucleótidos.

En un aspecto, la 3'-UTR puede incluir un espaciador para separar dos secuencias de camisetas. Como ejemplo no limitativo, el espaciador puede ser un espaciador de 15 nucleótidos y/u otros espaciadores conocidos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, la 3'-UTR puede incluir un módulo de secuencia-espaciador TEE repetido al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, o más de 9 veces en la 3'-UTR.

En otro aspecto, el espaciador que separa dos secuencias TEE puede incluir otras secuencias conocidas en la técnica que pueden regular la traducción de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción, pero no se limita a, las secuencias miR descritas en esta invención (por ejemplo, sitios de unión miR y semillas miR). Como ejemplo no limitativo, cada espaciador utilizado para separar dos secuencias TEE puede incluir una secuencia miR diferentes o un componente de una secuencia miR (p. ej., secuencia de semillas miR).

En un aspecto, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región del bucle de horquilla, lo que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (Véase, por ejemplo, Kedde y col. Un cambio de estructura de ARN inducido por Pumilio en p27-3'UTR controla la accesibilidad de miR-221 y miR-22. Biología celular de la naturaleza. 2010).

Secuencias de sensores

En un aspecto, los polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm) de la descripción no solo codificarían un polipéptido sino también una secuencia de sensor. Las secuencias de sensor incluyen, por ejemplo, sitios de unión de miARN, sitios de unión de factores de transcripción, secuencias de ARNm estructuradas, y/o motivos o sitios de unión artificiales diseñados para actuar como pseudo-receptores de moléculas de unión de polinucleótidos endógenos. Se describen ejemplos no limitantes de polinucleótidos que incluyen al menos una secuencia de sensor en las Solicitudes de Patentes Provisionales de EE.UU. 61/753.661, 61/754.159, 61/781.097, 61/829.334, 61/839.893, 61/842.733y 61/857.304.

En un aspecto, el perfil de microARN ("miARN") de las células o tejidos diana se lleva a cabo para determinar la presencia o ausencia de miARN en las células o tejidos.

Los miARN (o miARN) son 19-25 ARN no codificantes de nucleótidos que se unen a las 3'-UTR de polinucleótidos y regulan negativamente la expresión del gen, ya sea reduciendo la estabilidad del polinucleótido o inhibiendo la traducción. Los polinucleótidos alternativos (p. ej., ARNm) de la descripción pueden incluir una o más secuencias diana de miARN, secuencias de miARN o semillas de miARN. Tales secuencias pueden corresponder a cualquier miARN conocido como los mostrados en las publicaciones de EE.UU. N. ° 2005/0261218 y 2005/0059005.

Una secuencia de miARN comprende una región "semilla", es decir, una secuencia en la región de posiciones 2-8 del miARN maduro, cuya secuencia tiene una complementariedad de Watson-Crick perfecta con la secuencia diana de miARN. Una semilla de miARN puede comprender las posiciones 2-8 o 2-7 de un miARN maduro. Una semilla de miARN puede comprender 7 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-8 del miARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el correspondiente miARN diana está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. En algunos aspectos, una semilla de miARN puede incluir 6 nucleótidos (p. ej., nucleótidos 2-7 del miARN maduro), donde el sitio complementario de la semilla en el miARN diana correspondiente está flanqueado por una adenosina (A) opuesta a la posición 1 del miARN. Véase, por ejemplo, Grimson A, Farh KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim ^{l P ,}Bartel DP; Mol Cell. 2007 julio 6;27(1):91-105. Las bases de la semilla de miARN se complementan completamente con la secuencia diana. Mediante ingeniería de secuencias diana de miARN en la UTR 3' de polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la descripción pueden alcanzar a la molécula para degradación o traducción reducida, siempre que el miARN en cuestión esté disponible. Este procedimiento reducirá el riesgo de efectos fuera de diana sobre el suministro de moléculas de polinucleótido. Se ha informado sobre la identificación de miARN, regiones diana de miARN,sus patrones de expresión y su función en biología (Bonauer y col., Curr Drug Targets 2010 11:943-949; Anand y Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras y Rao Leukemia 201226:404-413 (20 de diciembre de 2011 doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf y col., Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner y Naldini, Antígenos tisulares. 2012 80:393-403; y todas las referencias en el mismo).

Por ejemplo, si el polinucleótido no está destinado a ser entregado al hígado pero termina allí, a continuación miR-122, un miARN abundante en el hígado, puede inhibir la expresión del polipéptido de interés si se diseñan uno o múltiples sitios diana de miR-122 en la UTR 3' de los polinucleótidos alternativos. La introducción de uno o múltiples sitios de unión para diferentes miARN se puede diseñar para disminuir aún más la longevidad, estabilidad y traducción de proteínas de polinucleótidos alternativos. Tal como se usa en esta invención, el término "sitio de miARN" se refiere a un sitio diana de miARN o un sitio de reconocimiento de miARN, o cualquier secuencia de nucleótidos a la que un miARN se une o se asocia. Debe entenderse que la "unión" puede seguir las reglas tradicionales de hibridación de Watson-Crick o puede reflejar cualquier asociación estable del miARN con la secuencia diana en o de manera adyacente al sitio de miARN.

A la inversa, para los propósitos de los polinucleótidos de la presente descripción, los sitios de unión de miARN pueden diseñarse a partir de (es decir, eliminarse de) secuencias donde se producen naturalmente para aumentar la expresión de proteínas en tejidos específicos. Por ejemplo, los sitios de unión de miR-122 pueden eliminarse para mejorar la expresión de proteínas en el hígado.

En un aspecto, los polinucleótidos alternativos de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miARN en la 3'-UTR para dirigir agentes terapéuticos polinucleotídicos citotóxicos o citoprotectores a células específicas tales como, pero sin limitarse a, las normales y/o células cancerosas (p. ej., HEP3B o SNU449).

En otro aspecto, los polinucleótidos alternativos de la presente descripción pueden incluir tres sitios de unión a miARN en la 3'-UTr para dirigir la terapéutica de polinucleótidos citotóxicos o citoprotectores a células específicas, pero no limitadas a, células normales y/o cancerosas (p. ej., HEP3B o SNU449).

La regulación de la expresión en múltiples tejidos se puede lograr mediante la introducción y/o eliminación de uno o varios sitios de unión de polinucleótido. La decisión de eliminación y/o inserción de sitios de unión de miARN, o cualquier combinación, depende de los patrones de expresión de miARN y sus perfiles en enfermedades.

Ejemplos de tejidos donde se sabe que los miARN regulan el ARNm y, por tanto, la expresión de proteínas, incluyen, entre otros, hígado (miR-122), músculo (miR-133, miR-206, miR-208), células endoteliales (miR -17-92, miR-126), células mieloides (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), tejido adiposo (let-7, miR-30c), corazón (miR-1d, miR-149), riñón (miR-192, miR-194, miR-204) y células epiteliales del pulmón (let-7, miR-133, miR-126).

Específicamente, se sabe que los miARN se expresan diferencialmente en células inmunes, tales como células presentadoras de antígeno (APC) (p. ej., células dendríticas y macrófagos), macrófagos, monocitos, linfocitos B, linfocitos T, granuocitos y células asesinas naturales. Los miARN específicos de células inmunes están involucrados en la inmunogenicidad, autoinmunidad, la respuesta inmune a la infección, la inflamación, así como la respuesta inmune no deseada después de la terapia génica y trasplante de tejidos/órganos. Los miARN específicos de células inmunes también regulan muchos aspectos del desarrollo, proliferación, diferenciación y apoptosis de las células inmunes. Por ejemplo, miR-142 y miR-146 se expresan exclusivamente en las células inmunes, particularmente abundantes en las células dendríticas mieloides. Se demostró en la técnica que la respuesta inmune a polinucleótidos exógenos se interrumpió añadiendo sitios de unión de miR-142 a la 3'-UTR de la construcción génica administrada, lo que permitió una transferencia génica más estable en tejidos y células. miR-142 degrada eficazmente el polinucleótido exógeno en las células presentadoras de antígeno y suprime la eliminación citotóxica de las células transducidas (p. ej., véase Annoni A y col., Blood, 2009, 114, 5152-5161; Brown BD y col., Nat Med. 2006, 12 (5), 585-591; y Brown BD y col., Blood, 2007, 110 (13): 4144-4152).

Una respuesta inmune mediada por antígenos puede referirse a una respuesta inmune desencadenada por antígenos extraños que, cuando entran en un organismo, son procesados por las células presentadoras de antígenos y mostrados en la superficie de las células presentadoras de antígenos. Las células T pueden reconocer el antígeno presentado e inducir una eliminación citotóxica de las células que expresan el antígeno.

La introducción del sitio de unión de miR-142 en la 3'-UTR de un polinucleótido de la presente descripción puede suprimir selectivamente la expresión génica en las células presentadoras de antígenos a través de la degradación del polinucleótido mediada por miR-142, lo que limita la presentación de antígenos en APC (p. ej., células dendríticas) y previenen de ese modo la respuesta inmune mediada por antígenos después de la administración de los polinucleótidos. Los polinucleótidos se expresan de forma estable en tejidos o células diana sin desencadenar la eliminación citotóxica.

En un aspecto, los sitios de unión de miARN que se sabe que se expresan en células inmunes, en particular, las células presentadoras de antígenos, pueden modificarse en el polinucleótido para suprimir la expresión del polinucleótido de señal del sensor en APC a través de la degradación de polinucleótidos mediada por miARN, sometiendo la respuesta inmune mediada por antígenos, mientras que la expresión del polinucleótido se mantiene en células no inmunes en las que no se expresan los miARN específicos de células inmunes. Por ejemplo, para prevenir la reacción inmunogénica causada por la expresión de una proteína específica del hígado, se puede eliminar el sitio de unión de miR-122 y los sitios de unión miR-142 (y/o miR-146) pueden modificarse por ingeniería en la 3'-UTR del polinucleótido.

Para impulsar aún más la degradación selectiva y la supresión de polinucleótidos en APC y macrófagos, el polinucleótido puede incluir otro elemento regulador negativo en la 3'-UTR, ya sea solo o en combinación con mir-142 y/o los sitios de unión mir-146. Como ejemplo no limitativo, un elemento regulador son los elementos de descomposición constitutivos (CDE).

En un aspecto, los sitios de unión de miARN específicos de células madre embrionarias pueden incluirse o eliminarse de la 3'-UTR del polinucleótido para modular el desarrollo y/o diferenciación de células madre embrionarias, para inhibir la senescencia de células madre en una condición degenerativa (por ejemplo, enfermedades degenerativas), o para estimular la senescencia y apoptosis de células madre en una condición patológica (p.ej., células madre cancerosas).

Como ejemplo no limitativo, los sitios de miARN que están sobreexpresados en ciertos tipos de cáncer y/o las células tumorales se pueden eliminar de la 3'-UTR del polinucleótido que codifica el polipéptido de interés, restaurando la expresión suprimida por los miARN sobreexpresados en las células cancerosas, mejorando así la función biológica co-responsable, por ejemplo, la estimulación de la transcripción y/o represión, detención del ciclo celular, apoptosis y muerte celular. Las células y tejidos normales, en los que la expresión de miARN no está regulada positivamente, no se verán afectados.

El MiARN también puede regular procedimientos biológicos complejos tales como la angiogénesis (miR-132) (Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). En los polinucleótidos alternativos de la descripción, los sitios de unión para miARN que están involucrados en tales procedimientos pueden eliminarse o introducirse, con el fin de adaptar la expresión de los polinucleótidos alternativos a tipos celulares biológicamente relevantes o para el contexto de los procedimientos biológicos relevantes. En este contexto, los polinucleótidos se definen como polinucleótidos auxotróficos.

La regulación del gen de miARN puede verse influenciada por la secuencia que rodea al miARN tal como, entre otros, la especie de la secuencia circundante, el tipo de secuencia (p. ej., heteróloga, homóloga o artificial), elementos reguladores en la secuencia circundante. y/o elementos estructurales en la secuencia circundante. El miARN puede estar influenciado por la 5'-UTR y/o la 3'-UTR. Como ejemplo no limitante, una 3'-UTR no humana puede aumentar el efecto regulador de la secuencia de miARN sobre la expresión de un polipéptido de interés en comparación con una 3'-UTR humana del mismo tipo de secuencia.

En un aspecto, otros elementos regulatorios y/o los elementos estructurales de la 5'-UTR pueden influir en la regulación génica mediada por miARN. Un ejemplo de elemento regulador y/o el elemento estructural es un IRES (sitio de entrada de ribosoma interno) estructurado en la 5'UTR, que es necesario para la unión de factores de elongación traslacional para iniciar la traducción de proteínas. La unión de EIF4A2 a este elemento de estructura secundaria en la 5'-UTR es necesaria para la expresión génica mediada por miARN (p. ej., véase Meijer HA y col., Science, 2013, 340, 82-85). Los polinucleótidos alternativos de la descripción pueden ser además alternativos para incluir esta 5'-UTR estructurada con el fin de mejorar la regulación génica mediada por miARN.

Se puede diseñar al menos un sitio de miARN en la 3'-UTR de los polinucleótidos alternativos de la presente descripción. En este contexto, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o más sitios de miARN pueden diseñarse en las 3 '-UTR de los polinucleótidos de la presente descripción. En un aspecto, los sitios de miARN incorporados en los polinucleótidos alternativos pueden ser los mismos o pueden ser sitios de miARN diferentes. En otro aspecto, los sitios de miARN incorporados en los polinucleótidos alternativos pueden apuntar al mismo tejido o a diferentes tejidos del cuerpo. Como ejemplo no limitante, mediante la introducción de sitios de unión de miARN específicos de tejido, tipo celular o enfermedad en la 3'-UTR de un polinucleótido alternativo (p. ej., ARNm), el grado de expresión en tipos celulares específicos (p. ej., hepatocitos, células mieloides, células endoteliales, células cancerosas) se pueden reducir.

En un aspecto, un sitio miARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'-UTR, aproximadamente a la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'-UTR, y/o cerca del extremo 3' de la 3'-UTR. Como ejemplo no limitante, un sitio de miARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'-UTR y aproximadamente a la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' de la 3'-UTR. Como otro ejemplo no limitativo, un sitio de miARN puede estar diseñado cerca del extremo 3' de las 3'-UTR y aproximadamente la mitad entre el extremo 5' y el extremo 3' de las 3'-UTR. Como otro ejemplo no limitante más, un sitio de miARN puede diseñarse cerca del extremo 5' de la 3'-UTR y cerca del extremo 3' de la 3'-UTR.

En otro aspecto, una 3'-UTR puede incluir cuatro sitios de miARN. Los sitios de miARN pueden ser sitios de unión de miARN completos, secuencias de semillas de miARN, y/o secuencias de sitios de unión de miARN sin la secuencia semilla.

En un aspecto, un polinucleótido de la descripción puede diseñarse para incluir al menos un miARN con el fin de amortiguar la presentación de antígeno por las células presentadoras de antígeno. El miARN puede ser la secuencia de miARN completa, la secuencia semilla de miARN, la secuencia de miARN sin la semilla o una combinación de las mismas. Como ejemplo no limitante, el miARN incorporado en el polinucleótido puede ser específico del sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitante, el miARN incorporado en el polinucleótido de la descripción para amortiguar la presentación del antígeno es miR-142-3p.

En un aspecto, un polinucleótido puede diseñarse para incluir sitios de miARN que se expresan en diferentes tejidos de un sujeto. Como ejemplo no limitante, se puede diseñar un polinucleótido alternativo de la presente descripción para incluir miR-192 y miR-122 para regular la expresión del polinucleótido alternativo en el hígado y los riñones de un sujeto. En otro aspecto, se puede diseñar un polinucleótido alternativo para incluir más de un sitio de miARN para el mismo tejido. Por ejemplo, un polinucleótido alternativo de la presente descripción puede diseñarse para incluir miR17-92 y miR-126 para regular la expresión del polinucleótido alternativo en células endoteliales de un sujeto.

En un aspecto, la ventana terapéutica o la expresión diferencial asociada con el polipéptido diana codificado por el polinucleótido alternativo que codifica una señal (también denominada en esta invención polinucleótido) de la descripción puede alterarse. Por ejemplo, se pueden diseñar polinucleótidos mediante los cuales una señal de muerte se exprese más en células cancerosas (o una señal de supervivencia en una célula normal) en virtud de la firma de miARN de esas células. Cuando una célula cancerosa expresa un nivel más bajo de un miARN particular, el polinucleótido que codifica el sitio de unión para ese miARN (o miARN) se expresaría más. Por tanto, el polipéptido diana codificado por el polinucleótido se selecciona como una proteína que desencadena o induce la muerte celular. Las células vecinas no cancerosas que albergan una mayor expresión del mismo miARN se verían menos afectadas por la señal de muerte codificada, ya que el polinucleótido se expresaría en un nivel más bajo debido a los efectos de la unión del miARN al sitio de unión o al "sensor" codificado en la 3'-UTR. Por el contrario, la supervivencia celular o las señales citoprotectoras pueden enviarse a tejidos que contienen células cancerosas y no cancerosas donde un miARN tiene una expresión más alta en las células cancerosas; siendo el resultado una señal de supervivencia más baja para la célula cancerosa y una firma de supervivencia más grande para la célula normal. Pueden diseñarse y administrarse múltiples polinucleótidos que tengan diferentes señales según el paradigma anterior.

En un aspecto, la expresión de un polinucleótido puede controlarse incorporando al menos una secuencia de sensor en el polinucleótido y formulando el polinucleótido. Como ejemplo no limitante, un polinucleótido puede dirigirse a un tumor ortotópico teniendo un polinucleótido que incorpora un sitio de unión de miR-122 y formulado en una nanopartícula lipídica que incluye el lípido catiónico DLin-KC2-DMA.

Según la presente descripción, los polinucleótidos se pueden alterar para evitar las deficiencias de otras moléculas de la técnica que codifican polipéptidos. Por tanto, en este aspecto, los polinucleótidos se denominan polinucleótidos alternativos.

Mediante la comprensión de los patrones de expresión de miARN en diferentes tipos celulares, se pueden diseñar polinucleótidos alternativos para una expresión más dirigida en tipos celulares específicos o solo bajo condiciones biológicas específicas. Mediante la introducción de sitios de unión de miARN específicos de tejido, podrían diseñarse polinucleótidos alternativos que serían óptimos para la expresión de proteínas en un tejido o en el contexto de una condición biológica.

Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes, utilizando polinucleótidos modificados genéticamente y la producción de proteínas se puede analizar en varios puntos de tiempo después de la transfección. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con diferentes polinucleótidos de ingeniería del sitio de unión de miARN (p. ej., ARNm) y mediante el uso de un kit ELISA para la proteína relevante y la proteína de ensayo producida a las 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y 7 días después de la transfección. También se pueden realizar experimentos in vivo utilizando moléculas diseñadas en el sitio de unión de miARN para examinar cambios en la expresión específica de tejido de polinucleótidos formulados alternativos.

En algunos aspectos, se pueden diseñar polinucleótidos alternativos para incorporar sitios de la región de unión de miARN que tienen el 100 % de identidad con secuencias semilla conocidas o menos del 100 % de identidad con secuencias semilla. La secuencia semilla se puede mutar parcialmente para disminuir la afinidad de unión de miARN y, como tal, dar como resultado una reducción de la modulación de ese transcrito polinucleotídico. En esencia, el grado de coincidencia o desajuste entre el polinucleótido diana y la semilla de miARN puede actuar como un reóstato para sintonizar más finamente la capacidad del miARN para modular la expresión de proteínas. Además, la mutación en la región no semilla de un sitio de unión de miARN también puede afectar a la capacidad de un miARN para modular la expresión de proteínas.

En un aspecto, se puede incorporar una secuencia de miR en el bucle de un bucle de horquilla.

En otro aspecto, se puede incorporar una secuencia de semillas de miR en el bucle de un bucle de horquilla y se puede incorporar un sitio de unión de miR en la horquilla 5' o 3' del bucle de horquilla.

En un aspecto, se puede incorporar un TEE en el extremo 5' de la horquilla de un bucle de horquilla y se puede incorporar una semilla miR en la horquilla del bucle de horquilla. En otro aspecto, se puede incorporar una TEE en el extremo 5' de la horquilla del bucle de horquilla, se puede incorporar una semilla miR en la horquilla del bucle de horquilla, y/o se puede incorporar un sitio de unión de miR en el extremo 3' de la horquilla o en la secuencia después del bucle de horquilla. La semilla de miR y el sitio de unión de miR pueden ser para la misma y/o diferentes secuencias de miR.

En un aspecto, la incorporación de una secuencia miR y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región del bucle de horquilla, lo que puede aumentar y/o disminuir la traducción (véase, por ejemplo, Kedde y col. Biología celular de la naturaleza. 2010).

En un aspecto, la incorporación de una secuencia MIR y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región de bucle de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (véase p. ej., Kedde y col. Biología celular de la naturaleza. 2010).

En un aspecto, la 5'-UTR puede incluir al menos una secuencia de miARN. La secuencia de miARN puede ser, pero no se limita a, una secuencia de 19 o 22 nucleótidos y/o una secuencia de miARN sin la semilla.

En un aspecto, la secuencia de miARN en la 5'-UTR puede usarse para estabilizar el polinucleótido (p. ej., ARNm) descrito en esta invención.

En otro aspecto, se puede usar una secuencia de miARN en la 5'-UTR para disminuir la accesibilidad del sitio de inicio de la traducción tal como, pero sin limitarse a, un codón de inicio. Matsuda y col. (PLoS One. 2010 11(5):e15057) utilizó oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos de unión de exón (EJC) alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) para disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG). Matsuda mostró que al alterar la secuencia alrededor del codón de inicio con un l Na o EJC, la eficiencia, la longitud y la estabilidad estructural del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) se ven afectadas. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden incluir una secuencia de miARN, en lugar de la secuencia LNA o EJC descrita por Matsuda y col., cerca del sitio de inicio de la traducción para disminuir la accesibilidad al sitio de inicio de la traducción. El sitio de inicio de la traducción puede ser antes, después o dentro de la secuencia de miARN. Como ejemplo no limitante, el sitio de inicio de la traducción puede estar ubicado dentro de una secuencia de miARN tal como una secuencia semilla o un sitio de unión. Como otro ejemplo no limitativo, el sitio de inicio de la traducción puede ubicarse dentro de una secuencia miR-122, tal como la secuencia semilla o el sitio de unión mir-122.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un miARN para amortiguar la presentación de antígenos por las células presentadoras de antígenos. El miARN puede ser la secuencia de miARN completa, la secuencia semilla de miARN, la secuencia de miARN sin la semilla o una combinación de las mismas. Como ejemplo no limitativo, el miARN incorporado en los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción puede ser específico para el sistema hematopoyético. Como otro ejemplo no limitativo, el miARN incorporado en los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción para amortiguar la presentación del antígeno es miR-142-3p.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un miARN para amortiguar la expresión del polipéptido codificado en una célula de interés. Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miR-122 para amortiguar la expresión de un polipéptido codificado de interés en el hígado. Como otro ejemplo no limitante, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miR-142-3p, una secuencia semilla de miR-142-3p, un sitio de unión de miR-142-3p sin la semilla, sitio de unión de miR-142-5p, secuencia semilla de miR-142-5p, sitio de unión de miR-142-5p sin la semilla, sitio de unión de miR-146, secuencia semilla de miR-146 y/o sitio de unión de miR-146 sin la secuencia semilla.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un sitio de unión de miARN en la 3'-UTR para degradar selectivamente la terapéutica polinucleotídica en las células inmunes para controlar las reacciones inmunogénicas no deseadas causadas por la administración terapéutica. Como ejemplo no limitante, el sitio de unión de miARN puede ser el polinucleótido alternativo más inestable en las células presentadoras de antígeno. Los ejemplos no limitantes de estos miARN incluyen mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p y mir-146-3p.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción incluyen al menos una secuencia de miARN en una región del polinucleótido (p. ej., ARNm) que puede interactuar con una proteína de unión a ARN.

Motivos de ARN para proteínas de unión a ARN (RBP)

Las proteínas de unión al ARN (RBP) pueden regular numerosos aspectos de la expresión génica de co-transcripción y post-transcripción como, entre otros, empalme, localización, traducción, recambio, poliadenilación, taponamiento, alteración, exportación y localización de ARN. Los dominios de unión a ARN (RBD), tales como, entre otros, motivos de reconocimiento de ARN (RR) y dominios de homología K (KH) de hnRNP, normalmente regulan la asociación de secuencias entre las RBP y sus objetivos de ARN (Ray y col. Naturaleza 2013. 499:172-177). En un aspecto, los RBD canónicos pueden unirse a secuencias de ARN cortas. En otro aspecto, los RBD canónicos pueden reconocer ARN de estructura.

En un aspecto, para aumentar la estabilidad del polinucleótido de interés, se puede cotransfectar o coinyectar un polinucleótido que codifica HuR junto con el polinucleótido de interés en las células o en el tejido. Estas proteínas también pueden unirse al polinucleótido de interés in vitro y, a continuación, administrarse a las células juntas. La proteína de unión poli A, PABP, interactúa con el factor de iniciación de la traducción eucariota elF4G para estimular la iniciación de la traducción. La coadministración de polinucleótidos que codifican estas RBP junto con el fármaco polinucleotídico y/o la unión de estas proteínas al fármaco polinucleotídico in vitro y la administración del polinucleótido unido a la proteína en las células pueden aumentar la eficacia traslacional del polinucleótido. El mismo concepto puede extenderse a la co-administración de polinucleótidos junto con polinucleótidos que codifican varios factores traslacional y facilitadores, así como con las proteínas mismas para influir en la estabilidad de los polinucleótidos y/o eficiencia traslacional.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden incluir al menos un motivo de unión a ARN tal como, pero sin limitarse a, un dominio de unión a ARN (RBD).

En un aspecto, el RBD puede ser cualquiera de los RBD, fragmentos o variantes de los mismos descritos por Ray y col. (Naturaleza 2013. 499:172-177.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir una secuencia para al menos un dominio de unión a ARN (RBD). Cuando los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción incluyen más de un RBD, no es necesario que los RBD sean de la misma especie o incluso de la misma clase estructural.

En un aspecto, al menos una región flanqueante (p. ej., la 5'-UTR y/o la 3'-UTR) puede incluir al menos un RBD. En otro aspecto, la primera región flanqueante y la segunda región flanqueante pueden incluir ambas al menos un RBD. El RBD puede ser el mismo o cada uno de los RBD puede tener al menos un 60 % de identidad de secuencia con el otro RBD. Como ejemplo no limitativo, al menos un RBD puede estar ubicado antes, después, y/o dentro de la 3'-UTR de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción. Como otro ejemplo no limitante, al menos un RBD puede estar ubicado antes o dentro de los primeros 300 nucleósidos de la 3'-UTR.

En otro aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un RBD en la primera región de nucleósidos enlazados. El RBD puede estar ubicado antes, después o dentro de una región de codificación (p. ej., el ORF).

En otro aspecto, la primera región de nucleósidos enlazados y/o al menos una región flanqueante puede incluir al menos un RBD. Como ejemplo no limitante, la primera región de nucleósidos enlazados puede incluir un RBD relacionado con factores de corte y empalme y al menos una región flanqueante puede incluir un RBD para estabilidad y/o factores traslacionales.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción pueden incluir al menos un RBD ubicado en una codificación y/o región no codificante de los polinucleótidos (p. ej., ARNm).

En un aspecto, se puede incorporar al menos un RBD en al menos una región flanqueante para aumentar la estabilidad de los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción.

En un aspecto, se puede usar una secuencia de miARN en un motivo de proteína de unión a ARN para disminuir la accesibilidad del sitio de inicio de la traducción tal como, entre otros, un codón de inicio. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden incluir una secuencia de miARN, en lugar de la secuencia LNA o EJC descrita por Matsuda y col., cerca del sitio de inicio de la traducción para disminuir la accesibilidad al sitio de inicio de la traducción. El sitio de inicio de la traducción puede ser antes, después, o dentro de la secuencia miARN. Como ejemplo no limitante, el sitio de inicio de la traducción puede estar ubicado dentro de una secuencia de miARN tal como una secuencia semilla o un sitio de unión. Como otro ejemplo no limitativo, el sitio de inicio de la traducción puede ubicarse dentro de una secuencia miR-122, tal como la secuencia semilla o el sitio de unión mir-122.

En otro aspecto, se pueden usar oligonucleótidos de ácido nucleico bloqueado antisentido (LNA) y complejos de unión de exón (EJC) en el motivo de la proteína de unión al ARN. El LNA y EJC se pueden utilizar alrededor de un codón de inicio (-4 a 37 donde la A de los codones AUG es 1) para disminuir la accesibilidad al primer codón de inicio (AUG).

3'-UTR y triples hélices

En un aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir una triple hélice en el extremo 3' del polinucleótido alternativo. El extremo 3' de los polinucleótidos de la presente descripción incluye una triple hélice sola o en combinación con una región poli-A.

En un aspecto, el polinucleótido de la presente descripción puede incluir al menos una primera y una segunda región rica en U, una región de bucle de horquilla conservada entre la primera y la segunda región, y/o una región rica en A. La primera y segunda región rica en U y la región rica en A pueden asociarse para formar una triple hélice en el extremo 3' del polinucleótido. Esta triple hélice puede estabilizar el polinucleótido, mejorar la eficiencia traslacional del polinucleótido y/o proteger el extremo 3' de la degradación. Ejemplos de triples hélices incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de triple hélice del transcrito 1 de adenocarcinoma de pulmón asociado a metástasis (MALAT1), MEN-p y ARN nuclear poliadenilado (PAN) (véase Wilusz y col., Genes & Desarrollo 201226:2392-2407.). En un aspecto, el extremo 3' de los polinucleótidos alternativos de la presente descripción incluye una primera región rica en U que incluye TTTTTCTTTT (SEQ ID NO: 1), una segunda región rica en U que incluye TTt Tg CTTTTT (SEQ ID NO: 2) o TTTTGCTTTT (SEQ ID NO: 3), y/o una región rica en A que incluye AAAAAGCAAAA (SEQ ID NO: 4). En otro aspecto, el extremo 3' de los polinucleótidos de la presente descripción incluye una estructura de formación de triple hélice que incluye una primera región rica en U, una región conservada, una segunda región rica en U y una región rica en A.

En un aspecto, la triple hélice puede formarse a partir de la escisión de una secuencia MALAT1 antes de la estructura de la hoja de trébol. Aunque no significa estar ligado a la teoría, MALAT 1 es un ARN largo no codificante que, cuando se escinde, forma una triple hélice y una estructura de hoja de trébol similar a ARNt. La transcripción de MALAT1 se localiza a continuación en motas nucleares y la hoja de trébol similar a ARNt se localiza en el citoplasma (p. ej., véase Wilusz y col. Célula 2008 135 (5): 919-932).

Como ejemplo no limitante, el extremo terminal del polinucleótido de la presente descripción que incluye la secuencia MALAT1 puede formar una estructura de triple hélice, después de la escisión de RNaseP de la estructura de hoja de trébol, que estabiliza el polinucleótido (p. ej ., véase Peart y col. Formación del extremo 3' sin ARNm: cómo vive la otra mitad; WIREs ARN 2013).

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) descritos en esta invención incluyen una secuencia MALAT1. En otro aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) pueden estar poliadenilados. En otro aspecto más, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) no están poliadenilados pero tienen una mayor resistencia a la degradación en comparación con los polinucleótidos inalterados (p. ej., ARNm).

En un aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir una secuencia MALAT1 en la segunda región flanqueante (p. ej., la 3'-UTR). Como ejemplo no limitante, la secuencia de MALAT1 puede ser humana o de ratón.

En otro aspecto, la estructura en forma de hoja de trébol de la secuencia MALAT1 también puede ser procesada por RNaseZ y CCA agregando enzima para formar una estructura similar a tARN llamada mascARN (ARN citoplasmático pequeño asociado a MALAT1). Como ejemplo no limitante, el mascARN puede codificar una proteína o un fragmento de la misma y/o puede incluir una secuencia de miARN. El mascARN puede incluir al menos una alteración química descrita en esta invención.

Bucles de horquilla

En un aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir un bucle de horquilla tal como, pero sin limitarse a, un bucle de horquilla de histona. El bucle de horquilla puede ser una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente 25 o aproximadamente 26 nucleótidos de longitud tal como, pero sin limitarse a, SEQ ID NOs: 7-17 como se describe en la Publicación de Patente Internacional N. ° WO2013/103659. El bucle de horquilla de histona puede estar ubicado en 3' con respecto a la región codificante (por ejemplo, en el extremo 3' de la región codificante). Como ejemplo no limitante, el bucle de horquilla puede ubicarse en el extremo 3' de un polinucleótido descrito en esta invención. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye más de un bucle de horquilla (por ejemplo, dos bucles de horquilla). En algunos aspectos, los polinucleótidos incluyen cualquiera de las secuencias de bucle de horquilla descritas en las Publicaciones de Patentes Internacionales N. ° WO2012/019780 y WO201502667. En algunos aspectos, el polinucleótido incluye la secuencia de bucle de horquilla CAAAGGCTCt Tt TCAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 5). En algunos aspectos, el polinucleótido incluye la secuencia de bucle de horquilla CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA (SEQ ID NO: 6).

En un aspecto, el bucle de horquilla puede estar ubicado en una segunda región terminal. Como ejemplo no limitativo, el bucle de horquilla puede estar ubicado dentro de una región no traducida (p. ej., 3'-UTR) en una segunda región terminal.

En un aspecto, el polinucleótido tal como, entre otros, el ARNm, que incluye el bucle de horquilla de histona, puede estabilizarse mediante la adición de una región estabilizadora 3' (p. ej., una región estabilizadora 3' que incluye al menos una cadena nucleósido de terminación). Sin pretender imponer ninguna teoría, la adición de al menos un nucleósido de terminación de cadena puede ralentizar la degradación de un polinucleótido y, por tanto, puede aumentar la vida media del polinucleótido.

En otro aspecto, el polinucleótido tal como, pero no limitado a ARNm, que incluye el bucle de horquilla de histona puede estabilizarse mediante una alteración en la región 3' del polinucleótido que puede prevenir y/o inhibir la adición de oligio (U) (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional N. ° Wo 2013/103659 ,).

En otro aspecto más, el polinucleótido tal como, pero no limitado a ARNm, que incluye el bucle de horquilla de histona puede estabilizarse mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2',3'-didesoxinucleósido 3'- O-metilnucleósidos, 3'-O-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.

En un aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir un bucle de horquilla de histona, una región poli-A, y/o una estructura de tapa 5'. El bucle de horquilla de histona puede estar antes y/o después de la región poli-A. Los polinucleótidos que incluyen el bucle de horquilla de histona y una secuencia de la región poli-A pueden incluir un nucleósido de terminación de cadena descrito en esta invención.

En otro aspecto, los polinucleótidos de la presente descripción pueden incluir un bucle de horquilla de histona y una estructura de capa 5'. La estructura de capa 5' puede incluir, pero no se limita a, las descritas en esta invención y/o conocidas en la técnica.

En un aspecto, la región de bucle de horquilla conservada puede incluir una secuencia de miR descrita en esta invención. Como ejemplo no limitante, la región del bucle de horquilla puede incluir la secuencia semilla de una secuencia de miR descrita en esta invención. En otro ejemplo no limitante, la región del bucle de horquilla puede incluir una secuencia semilla de miR-122.

En otro aspecto, la región de bucle de horquilla conservada puede incluir una secuencia de miR descrita en esta invención y también puede incluir una secuencia de TEE.

En un aspecto, la incorporación de una secuencia MIR y/o una secuencia de TEE cambia la forma de la región de bucle de horquilla que puede aumentar y/o disminuir la traducción. (véase p. ej., Kedde y col. Un interruptor de estructura de ARN inducido por pumilio en P27-3'UTR controla la accesibilidad miR-221 y miR-22. Biología celular de la naturaleza. 2010.

En un aspecto, los polinucleótidos alternativos descritos en esta invención pueden incluir al menos un bucle de horquilla de histona y una región poli-A o señal de poliadenilación. Se describen ejemplos no limitantes de secuencias de polinucleótidos que codifican al menos un bucle de horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación en la Publicación de Patente Internacional N. ° WO2013/120497, WO2013/120629, WO2013/120500, WO2013/120627, WO2013/120498, WO2013/120626, WO2013/120499 y WO2013/12062. En un aspecto, el polinucleótido que codifica un bucle de horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno patógeno o un fragmento del mismo, tal como las secuencias de polinucleótidos descritas en la publicación de patente internacional N. ° WO2013/120499 y WO2013/120628. En otro aspecto, la codificación de polinucleótidos para un bucle de horquilla de histona y una región poli-A una o una señal de poliadenilación puede codificar una proteína terapéutica, tal como las secuencias de polinucleótidos descritos en la publicación internacional de patente N. ° WO2013/120497 y WO2013/120629. En un aspecto, la codificación de polinucleótidos para un bucle de horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar para un antígeno tumoral o fragmento de la misma, tal como las secuencias de polinucleótidos descritos en la publicación internacional de patente N. ° WO2013/120500 y WO2013/120627. En otro aspecto, la codificación de polinucleótido para un bucle de horquilla de histona y una región poli-A o una señal de poliadenilación puede codificar un antígeno alergénico o un auto-antígeno autoinmune, tal como las secuencias de polinucleótidos descritos en la publicación internacional de patente N. ° WO2013/120498 y WO2013/120626.

Regiones Poli-A

Durante el procesamiento del ARN, normalmente se agrega una cadena larga de nucleótidos de adenosina (región poli-A) a las moléculas de ARN mensajero (ARNm) para aumentar la estabilidad de la molécula. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se puede escindir para liberar un hidroxilo 3'. A continuación, la polimerasa poli-A agrega una cadena de nucleótidos de adenosina al ARN. El procedimiento, llamado poliadenilación, agrega una región poli-A que está entre 100 y 250 residuos de largo.

Las longitudes únicas de la región poli-A pueden proporcionar ciertas ventajas a los polinucleótidos alternativos de la presente descripción.

Generalmente, la longitud de una región poli-A de la presente descripción es de al menos 30 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-A tiene al menos 35 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 70 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1700 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1900 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos.

En un aspecto, la región poli-A puede tener 80 nucleótidos, 120 nucleótidos, 160 nucleótidos de longitud en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en esta invención.

En otro aspecto, la región poli-A puede tener 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos de longitud en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en esta invención.

En un aspecto, la región poli-A se diseña en relación con la longitud del polinucleótido alternativo general. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante del polinucleótido alternativo, la longitud de una característica o región particular del polinucleótido alternativo (tal como ARNm), o basarse en la longitud del producto final expresado a partir del polinucleótido alternativo. Cuando se refiere a cualquier característica del polinucleótido alternativo (p. ej., que no sea la porción de ARNm que incluye la región poli-A), la región poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % mayor en longitud que la característica adicional. La región poli-A también puede diseñarse como una fracción de polinucleótido alternativo al que pertenece. En este contexto, la región poli-A puede ser un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la región poli-A.

En un aspecto, los sitios de unión diseñados y/o la conjugación de polinucleótidos (p. ej., ARNm) para la proteína de unión poli-A se pueden utilizar para mejorar la expresión. Los sitios de unión diseñados pueden ser secuencias sensoras que pueden operar como sitios de unión para ligandos del microambiente local de los polinucleótidos (p. ej., ARNm). Como ejemplo no limitante, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) pueden incluir al menos un sitio de unión diseñado para alterar la afinidad de unión de la proteína de unión poli-A (PABP) y análogos de la misma. La incorporación de al menos un sitio de unión diseñado puede aumentar la afinidad de unión de la PABP y sus análogos.

Además, múltiples polinucleótidos distintos (p. ej., ARNm) se pueden unir a la PABP (proteína de unión Poli-A) a través del extremo 3' usando nucleótidos alternativos en el extremo 3' de la región poli-A. Experimentos de transfección se pueden realizar en líneas celulares relevantes y la producción de proteínas se puede ensayar mediante ELISA a las 12 h, 24 h, 48 h, 72 h y el día 7 después de la transfección. Como ejemplo no limitante, los experimentos de transfección pueden usarse para evaluar el efecto sobre la afinidad de unión de PABP o análogos de la misma como resultado de la adición de al menos un sitio de unión diseñado.

En un aspecto, se puede usar una región poli-A para modular el inicio de la traducción. Aunque no se desea ceñirse a la teoría, la región poli-A recluta PABP que, a su vez, puede interactuar con el complejo de iniciación de la traducción y, por tanto, puede ser esencial para la síntesis de proteínas.

En otro aspecto, también se puede usar una región poli-A en la presente descripción para proteger contra la digestión con 3'-5'-exonucleasa.

En un aspecto, los polinucleótidos (p. ej., ARNm) de la presente descripción están diseñados para incluir un cuarteto poliA-G. El cuarteto G es una matriz cíclica con enlaces de hidrógeno de cuatro nucleótidos de guanina que pueden formarse mediante secuencias ricas en G tanto en el ADN como en el ARN. En este aspecto, el cuarteto G se incorpora al final de la región poli-A. Los polinucleótidos resultantes (p. ej., ARNm) se analiza para determinar la estabilidad, la producción de proteínas y otros parámetros, incluida la vida media en varios puntos de tiempo. Se ha descubierto que el cuarteto poliA-G da como resultado una producción de proteínas equivalente a al menos el 75 % de la observada usando una región poli-A de 120 nucleótidos sola.

En un aspecto, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden incluir una región poli-A y pueden estabilizarse mediante la adición de una región estabilizadora 3'. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) con una región poli-A pueden incluir además una estructura de capa 5 '.

En otro aspecto, los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) de la presente descripción pueden incluir un cuarteto poli-AG. Los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) con un cuarteto poli-A-G pueden incluir además una estructura de capa 5'.

En un aspecto, la región estabilizadora 3' que puede usarse para estabilizar los polinucleótidos (p. ej., ARNm) que incluye una región poli-A o un cuarteto poli-A-G puede ser, pero no se limita a, las descritas en la publicación de patente internacional N. ° WO2013/103659. En otro aspecto, la región estabilizadora 3' que puede usarse con la presente descripción incluye un nucleósido de terminación de cadena tal como 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-desoxiuridina, 3'-desoxicitosina, 3'-desoxiguanosina, 3'-desoxitmina, 2', 3'-didesoxinucleósidos, tales como 2', 3'-didesoxiadenosina, 2', 3'-didesoxiuridina, 2', 3'-didesoxicitosina, 2 ', 3'-didesoxiguanosina, 2', 3 ' -didesoxitmina, un 2'-desoxinucleósido o un O-metilnucleósido.

En otro aspecto, el polinucleótido tal como, pero no se limita al ARNm, que incluye una región poliA o un cuarteto poliA-G se puede estabilizar mediante una alteración a la región 3' del polinucleótido que puede prevenir y/o inhibir la adición. de oligio(U) (véase, por ejemplo, la Publicación Internacional de Patentes N. ° WO2013/103659).

En otro aspecto más, el polinucleótido tal como, pero no limitado al ARNm, que incluye una región poli-A o un cuarteto poli-A-G se puede estabilizar mediante la adición de un oligonucleótido que termina en un 3'-desoxinucleósido, 2', 3'-didesoxinucleósido 3'-o-metilnucleósidos, 3'-o-etilnucleósidos, 3'-arabinósidos, y otros nucleósidos alternativos conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención.

Regiones Poli-C

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción incluyen una región poli-C.

Las longitudes únicas de la región poli-C pueden proporcionar ciertas ventajas a los polinucleótidos alternativos de la presente descripción.

Generalmente, la longitud de una región poli-A de la presente descripción es de al menos 30 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-C es de al menos 15 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-C es de al menos 20 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-C es de al menos 25 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-C es de al menos 30 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la región poli-C es de al menos 35 nucleótidos de longitud. En otro aspecto, la longitud es de al menos 40 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 45 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 55 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 60 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 70 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 80 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 90 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 120 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 140 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 160 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 180 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 250 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 350 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 450 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 700 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 900 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1100 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1200 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1300 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1400 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1600 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1700 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1800 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 1900 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2000 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 2500 nucleótidos. En otro aspecto, la longitud es de al menos 3000 nucleótidos.

En un aspecto, la región poli-C puede ser de 80 nucleótidos, 120 nucleótidos o 160 nucleótidos de longitud en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en esta invención.

En otro aspecto, la región poli-C puede ser de 20, 40, 80, 100, 120, 140 o 160 nucleótidos de longitud en una molécula de polinucleótido alternativa descrita en esta invención.

En un aspecto, la longitud de la región poli-C está diseñada en relación con la longitud del polinucleótido alternativo general. Este diseño puede basarse en la longitud de la región codificante del polinucleótido alternativo, la longitud de una característica o región particular del polinucleótido alternativo (tal como ARNm), o basarse en la longitud del producto final expresado a partir del polinucleótido alternativo. Cuando sea relativo a cualquier característica del polinucleótido alternativo (por ejemplo, aparte de la parte del ARNm que incluye la región poli-C), la región poli-C puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% mayor en longitud que la característica adicional. La región poli-C también puede diseñarse como una fracción del polinucleótido alternativo al que pertenece. En este contexto, la región poli-A puede ser 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % o más de la longitud total de la construcción o la longitud total de la construcción menos la región poli-A.

Polinucleótidos estabilizadores complementarios

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción incluyen además uno o más polinucleótidos estabilizadores complementarios. Un polinucleótido estabilizador complementario es un polinucleótido que incluye de 5 a 20 nucleótidos que es complementario en o cerca de uno de los dos extremos de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm). En algunos aspectos, un polinucleótido estabilizador complementario aumenta la estabilidad (p. ej., estabilidad del plasma) y/o niveles de expresión de un polinucleótido de la descripción. En algunos aspectos, un polinucleótido estabilizador complementario es complementario en o cerca del extremo 5' de un polinucleótido de la descripción. En algunos aspectos, un polinucleótido estabilizador complementario es complementario en o cerca del extremo 3' de un polinucleótido de la descripción. En algunos aspectos, uno o más polinucleótidos estabilizadores complementarios son complementarios tanto de una región 5' como de una región 3' de un polinucleótido de la descripción y cuando se unen al polinucleótido de la descripción forman una construcción circular con el polinucleótido de la descripción. En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición que incluye un polinucleótido de la descripción y uno o más polinucleótidos estabilizadores complementarios que forman una construcción circularizada cuando se unen al polinucleótido de la descripción.

Regiones estabilizadores 3'

En eucariotas, los extremos 3' de la mayoría de los polinucleótidos están poliadenilados. La región de poli-A se agrega al extremo 3' para promover la traducción e inhibir la degradación del polinucleótido por el exosoma y las exonucleasas. La poliadenilación también juega un papel en la terminación de la transcripción, la exportación de polinucleótidos desde el núcleo al citosol y la traducción. La poliadenilación regula las actividades moleculares intracelulares, incluida la estabilidad del ARN y la eficiencia traslacional.

La estabilización de un polinucleótido específico en células eucariotas es de interés porque la proteína codificada por el polinucleótido puede producirse en mayores cantidades debido a una exposición más prolongada del polinucleótido a la maquinaria traslacional.

La presente descripción presenta regiones estabilizadoras 3' que dan como resultado una mayor estabilidad del polinucleótido en comparación con el polinucleótido correspondiente sin la región estabilizadora 3'. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye un nucleósido alternativo. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' se conjuga con el resto del polinucleótido a través de un enlazador (por ejemplo, un enlazador que puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par de reacciones químicas de clic). En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye el extremo 3' del polinucleótido. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' está conjugada con la UTR 3' del polinucleótido. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' está conjugada con la región poli-A.

En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye uno o más no nucleósidos (por ejemplo, una ribosa abásica). En algunos aspectos, el uno o más no nucleósidos están en el extremo 5', el extremo 3' y/o en una posición interna de la región estabilizadora 3'.

En algunos aspectos, el polinucleótido incluye i) una región codificante; ii) una 5'-UTR que incluye opcionalmente una secuencia de Kozak; iii) una 3'-UTR; iv) al menos una estructura de capa 5'; v) una región poli-A; y vi) una región estabilizadora 3', en la que la región estabilizadora 3' está conjugada con la región poli-A a través de un enlazador que puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par de reacciones químicas de clic. En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye L-nucleósidos (por ejemplo, L-adenosina). En algunos aspectos, todos los nucleósidos en la región estabilizadora 3' son L-nucleósidos (por ejemplo, L-adenosina). En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' incluye al menos dos nucleósidos alternativos diferentes (por ejemplo, 2'-O-metil adenosina y una timidina invertida o a-tio-2'-O-metil adenosina y una timidina invertida). En algunos aspectos, la región estabilizadora 3' tiene al menos 5 nucleósidos (por ejemplo, al menos 10 nucleósidos, al menos 2o nucleósidos, al menos 30 nucleósidos, al menos 40 nucleósidos, al menos 50 nucleósidos).

En algunos aspectos, el polinucleótido comprende i) una región codificante que codifica un polipéptido; ii) una 5'-UTR que incluye una secuencia de Kozak; iii) una 3'-UTR; iv) al menos una estructura de capa 5' tal como tapa O, tapa 1, tapa 2 o una tapa ARCA; v) una región poli-A (por ejemplo, una región poli-A que incluye 100 adenosina); y vi) una región estabilizadora 3' (por ejemplo, una región estabilizadora 3' que incluye diez nucleósidos tales como diez L-adenosina o siete adenosinas, dos 2'-O-metil adenosinas y una timidina invertida, en la que dicha región estabilizadora 3' conjugada con la región poli-A a través de un enlazador y en la que el enlazador puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par químico de clic y/o el enlazador incluye un resto morfolino.

Polipéptidos conjugados al polinucleótido

En algunos aspectos, un polipéptido se conjuga con un polinucleótido mediante un enlazador que tiene la estructura de Fórmula XIII. Por ejemplo, un polinucleótido se hace reaccionar con un oxidante (p. ej., peryodato de sodio) dando como resultado la apertura del anillo oxidativo del azúcar en el extremo 3' en un dialdehído, seguido de la condensación con un polipéptido que incluye un grupo aminooxi, p. ej., en el extremo N, en el extremo C, o en una posición interna tal como una lisina modificada. Los polipéptidos que pueden conjugarse con los polinucleótidos de la descripción incluyen péptidos de localización nuclear, péptidos de localización ER, péptidos de escape endosomal, péptidos de estimulación inmunológica, péptidos de localización del aparato de Golgi, péptidos de localización lisosomal, péptidos de localización mitocondrial, y/o péptido que puede usarse en cromatografía de afinidad. Los polipéptidos conjugados con los polinucleótidos de la descripción pueden agregar en la localización del polinucleótido a una ubicación deseada en la célula y/o ayudar en la purificación del polinucleótido. En algunos aspectos, el polipéptido conjugado con los polinucleótidos de la descripción es cualquiera de los polipéptidos enumerados en la Tabla 1:

Tabla 1. Polipéptidos seleccionados

Enlazadores

La región estabilizadora 3' puede conjugarse con el resto del polinucleótido directamente (por ejemplo, a través de un enlace covalente) o mediante un enlazador.

La región estabilizadora 3' y el resto del polinucleótido pueden conjugarse mediante reacciones de grupos sulfhidrilo (-SH), grupos amino (aminas), y/o hidroxilos o cualquier grupo reactivo apropiado. Los reticuladores homobifuncionales y heterobifuncionales (agentes de conjugación) están disponibles en muchas fuentes comerciales. Las regiones disponibles para la reticulación se pueden encontrar en los polinucleótidos y las regiones estabilizadoras 3' de la presente descripción. El reticulador puede incluir un brazo flexible, por ejemplo, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 átomos de carbono. Ejemplos de reticuladores incluyen BS3 ([Bis(sulfosuccinimidil)suberato]; BS3 es un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional que se dirige a las aminas primarias accesibles), NHS/EDC (N-hidroxisuccinimida y N-etil-N '-(dimetilaminopropil) carbodimida; NHS/EDC permite la conjugación de grupos amina primaria con grupos carboxilo), sulfo-EMCS ([N-e-Ácido maleimidocaproico]hidrazida; sulfo-EMCS son grupos reactivos heterobifuncionales (maleimida y éster Nh S) que son reactivos frente a grupos sulfhidrilo y amino), hidrazida y SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato; SATA es reactivo frente a aminas y agrega grupos sulfhidrilos protegidos). Los compuestos de la descripción pueden incluir un enlazador ramificado y/o no ramificado. El término "enlazador", como se usa en esta invención, se refiere a un grupo químico o molécula que une dos moléculas o restos adyacentes, por ejemplo, un grupo morfolino a un polinucleótido. Normalmente, un enlazador no ramificado se coloca entre, o flanqueado por, dos grupos, moléculas u otros restos y se conecta a cada uno a través de un enlace covalente, conectando así los dos. Alternativamente, un enlazador ramificado conecta tres o más grupos, moléculas u otros restos y normalmente funciona como el punto estructural de convergencia para los tres o más grupos, moléculas u otros restos. En algunos aspectos de cualquiera de los compuestos de esta invención, el enlazador no es un enlazador fosfato natural o un enlazador fosforamidita. En algunos aspectos, el enlazador es una molécula orgánica, grupo, polímero o resto químico.

En ciertos aspectos, el grupo enlazador comprende una combinación de uno o más grupos de fórmula:

donde RL es hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido, m es 0 o un número entero entre 1 y 10, inclusive, p. ej., 1, 2 ,3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En ciertos aspectos, m es 3 o 4.

Para formar enlaces covalentes, se puede utilizar como grupo químicamente reactivo una amplia variedad de grupos carboxilo activos (p. ej., ésteres) capaces de reaccionar con un nucleósido. Los agentes particulares incluyen N-hidroxisuccinimida (n Hs ), N-hidroxi-sulfosuccinimida (sulfo-NHS), maleimida-benzoil-succinimida (MBS), éster de gamma-maleimido-butiriloxisuccinimida (GMBS), ácido maleimido propiónico (MPA) ácido maleimido hexanoico (MHA) y ácido maleimido undecanoico (MUA).

Las aminas primarias son los principales objetivos de los ésteres del NHS. Los grupos a-amina accesibles presentes en los extremos N de un polinucleótido o región estabilizadora 3' pueden reaccionar con los ésteres de NHS. Se forma un enlace amida cuando el éster NHS reacciona con aminas primarias liberando N-hidroxisuccinimida. En ciertos aspectos de la descripción, el grupo funcional en el polinucleótido o en la región estabilizadora 3' será un grupo tiol, y el grupo químicamente reactivo será un grupo que contenga maleimido tal como gamma-maleimida-butrilamida (GMBA o MPA).

El grupo maleimido es más selectivo para los grupos sulfhidrilo cuando el pH de la mezcla de reacción es 6.5-7.4. A pH 7.0, la velocidad de reacción de los grupos maleimido con sulfhidrilos es 1000 veces más rápida que con las aminas. Por tanto, se puede formar un enlace tioéter estable entre el grupo maleimido y el sulfhidrilo.

En algunos aspectos, el enlazador tiene la estructura:

Fórmula XXX

donde a, b, c, e, f y g son cada uno, independientemente, 0 o 1;

d es 0, 1,2, o 3;

cada uno de R6, R8, R10°, y R12, es, independientemente, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C6 opcionalmente sustituido, o arileno C6-C10 opcionalmente sustituido, O, S, Se, o NR13;

R7 y R11 son cada uno, independientemente, carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo o fosforilo, donde, si R7 es fosforilo, -(R9)d- es un enlace, y e, f, y g son 0, entonces al menos uno de R6 o R8 no es O; y si R11 es fosforilo, -(R9)d- es un enlace, y a, b y c son 0, entonces al menos uno de R10° o R12 no es O;

cada R9 es alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, o un enlace que une (R6)a-(R7)b-(R8)c a (R1°)e-(R11)f-(R12)9, donde si -(R9)d- es un enlace, entonces al menos uno de a, b, c, e, f o g es 1; y

R13 es hidrógeno, alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo C6-C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1-C7 opcionalmente sustituido.

Enlazadores de química de clics

En aspectos particulares, el enlazador se forma mediante la reacción entre un par de reacciones químicas de clic. Por "par de reacción de química de clic" se entiende un par de grupos reactivos que participan en una reacción modular con alto rendimiento y una alta ganancia termodinámica, produciendo así un enlazador de química de clic. En este aspecto, uno de los grupos reactivos está unido a la región estabilizadora 3' y el otro grupo reactivo está unido al resto del polinucleótido. Ejemplos de reacciones y pares de química de clic incluyen una reacción de cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen entre un grupo alquinilo y un grupo azido para formar un enlazador que contiene triazol; una reacción de Diels-Alder entre un dieno que tiene un sistema de electrones 4n (por ejemplo, un compuesto de 1,3-insaturado opcionalmente sustituido, tal como 1,3-butadieno, 1-metoxi-3-trimetilsililoxi-1,3-butadieno opcionalmente sustituido, ciclopentadieno, ciclohexadieno, o furano) y un dienófilo o heterodienófilo que tiene un sistema de electrones 2n (por ejemplo, un grupo alquenilo opcionalmente sustituido o un grupo alquinilo opcionalmente sustituido); una reacción de apertura de anillo con un nucleófilo y un electrófilo heterociclilo tensado; una reacción de ligadura en férula con un grupo fosforotioato y un grupo yodo; y una reacción de aminación reductora con un grupo aldehido y un grupo amino (Kolb y col., Angew. Chem. Int. Ed., 40:2004-2021 (2001); Van der Eycken y col., QSAR Comb. Sci., 26:1115-1326 (2007)).

En aspectos particulares de la descripción, la región estabilizadora 3' está unida al resto del polinucleótido por medio de un enlazador que contiene triazol formado por la reacción entre un grupo alquinilo y un par de química de clic del grupo azido. En tales casos, el grupo azido puede unirse al extremo 3' del polinucleótido y el grupo alquinilo puede unirse al extremo 5' de la región estabilizadora 3'. Alternativamente, el grupo azido se puede unir al terminal 5' de la región estabilizadora 3' y el grupo alquinilo se puede unir al extremo 3' del polinucleótido. En ciertos aspectos, la reacción entre un grupo azido y el grupo alquinilo no está catalizada, y en otros aspectos la reacción es catalizada por un catalizador de cobre (I) (por ejemplo, yoduro de cobre (I)), un catalizador de cobre (II) en la presencia de un agente reductor (p. ej., sulfato de cobre (II) o acetato de cobre (II) con ascorbato de sodio), o un catalizador que contenga rutenio (p. ej., Cp*RuCl(PPh3)2 o Cp*RuCl(COD)).

Ejemplos de enlazadores incluyen enlazadores que contienen monofluorociclooctina (MFCO), difluorociclooctina (DFCO), ciclooctina (OCT), dibenzociclooctina (DIBO), biarilazaciclooctina (BARAC), difluorobenzociclooctina (DIFBO) y biciclo[6.1.0]nonino (BCN).

Los enlazadores pueden conjugarse mediante la reacción de pares de asa de química de clic. El término "asa de química de clic", como se usa en esta invención, se refiere a un reactivo, o un grupo reactivo, que puede participar en una reacción de química de clic. Por ejemplo, un alquino deformado, por ejemplo, una ciclooctina, es un asa de química de clic, ya que puede participar en una cicloadición promovida por deformación. En general, las reacciones de química de clic requieren al menos dos moléculas que comprenden asas de química de clic que puedan reaccionar entre sí. Por ejemplo, una azida es un asa de química de clic asociada a un ciclooctino o cualquier otro alquino. Ejemplos adicionales de pares de asa de química de clic asociada incluyen un dieno y un dienófilo, una azida y un alquino terminal, una azida y un alquino filtrado, una azida y un alquino activado, una azida y un alquino deficiente en electrones, una azida y un arino, una tetrazina y un alqueno, un tetrazol y un alqueno, un ditioéster y un dieno, un antraceno y una maleimida, un tiol y un alqueno, un tiol y una enona, un tiol y una maleimida, un tiol y parafluoro, y una amina y parafluoro. Los expertos en la materia conocen otras asas de química de clic adecuadas.

Las asas de química de clic adicionales adecuadas para su uso en los procedimientos descritos en esta invención son bien conocidos por los expertos en la técnica, y tales asas de química de clic incluyen, pero no se limitan a, los socios, grupos y asas de reacción de química de clic descritos en [1] HC Kolb, MG Finn, KB Sharpless, Angew. Chem. 2001, 113,2056 - 2075; Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004 - 2021. [2] a) C. J. Hawker, K. L. Wooley, Science 2005, 309, 1200 - 1205; b) D. Fournier, R. Hoogenboom,U. S. Schubert, Chem. Soc. Rev. 2007, 36, 1369 - 1380; c) W. H. Binder, R. Sachsenhofer, Macromol. Rapid Commun. 2007, 28, 15-54; d)H.C. Kolb, K.B. Sharpless, Drug Discovery Today 2003, 8, 1128 - 1137; e) V. D. Bock, H. Hiemstra, J. H. van Maarseveen, Eur. J. Org. Chem. 2006, 51 - 68. [3] a) V. O. Rodionov, V. V. Fokin, M. G. Finn, Angew. Chem. 2005, 117, 2250 - 2255; Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2210 -2215; b) P. L. Golas, N. V. Tsarevsky, B. S. Sumerlin, K. Matyjaszewski, Macromolecules 2006, 39, 6451 — 6457; c) C. N. Urbani, C. A. Bell, M. R.Whittaker,M. J. Monteiro, Macromolecules 2008, 41, 1057 — 1060; d) S. Chassaing, A. S. S. Sido, A. Alix, M. Kumarraja, P. Pale, J. Sommer, Chem. Eur. J. 2008, 14, 6713 — 6721; e) B. C. Boren, S. Narayan, L. K. Rasmussen, L. zhang,H. Zhao, Z. Lin, G. Jia, V. V. Fokin, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 8923 — 8930; f) B. Saba, S. Sharma, D. Sawant, B. Kundu, Synlett 2007, 1591 — 1594. [4] J. F. Lutz, Angew. Chem. 2008, 120, 2212 — 2214; Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 2182 — 2184. [5] a) Q. Wang, T. R. Chan, R. Hilgraf, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, M. G. Finn, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 3192 — 3193; b) J. Gierlich, G. A. Burley, P. M. E. Gramlich, D. M. Hammond, T. Carell, Org. Lett. 2006, 8, 3639 — 3642. [6] a) J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo, J. A. Codelli, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104, 16793 — 16797; b) S. T. Laughlin, J. M. Baskin, S. L. Amacher, C. R. Bertozzi, Science 2008, 320, 664 — 667; c) J. A. Johnson, J. M. Baskin, C. R. Bertozzi, J. F. Koberstein, N. J. Turro, Chem. Commun. 2008, 3064 — 3066; d) J. A. Codelli, J. M. Baskin, N. J. Agard, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486 — 11493; e) E. M. Sletten, C. R. Bertozzi, Org. Lett. 2008, 10, 3097 — 3099; f) J. M. Baskin, C. R. Bertozzi, QSAR Comb. Sci. 2007, 26, 1211 — 1219. [7] a) G. Wittig, A. Krebs, Chem. Ber. Recl. 1961, 94, 3260 — 3275; b) A. T. Blomquist, L. H. Liu, J. Am. Chem. Soc. 1953, 75, 2153 — 2154. [8] D. H. Ess, G. O. Jones, K. N. Houk, Org. Lett. 2008, 10, 1633 — 1636. [9] W. D. Sharpless, P. Wu, T. V. Hansen, J. G. Lindberg, J. Chem. Educ. 2005, 82, 1833 — 1836. [10] Y. Zou, J. Yin, Bioorg. Med. Chem. Lett.

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Enlazadores morfolino

En aspectos particulares, el enlazador puede incluir un resto morfolino. El enlazador morfolino puede formarse por oxidación (por ejemplo, por tratamiento con peryodato de sodio) de un cis-diol del azúcar de un nucleósido tal como el nucleósido del terminal 3' en el polinucleótido seguido de condensación del dialdehído resultante con un resto amino reactivo tal como un resto alcoxiamino como se muestra a continuación.

B1 = nucleobase

En algunos aspectos, el enlazador incluye la estructura:

donde B1 es una nucleobase, hidrógeno, halo, hidroxi, tiol, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, amino, azido opcionalmente sustituido, cicloalquilo C3-C10 opcionalmente sustituido, arilo C6-C10 opcionalmente sustituido, heterociclo C2-C9 opcionalmente sustituido; y

R14 y R15 son cada uno independientemente hidrógeno o hidroxi.

En algunos aspectos, el enlazador incluye la estructura:

Fórmula IX

donde o es 0, 1, 2, o 3;

Y6 es O, S, Se, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido; cada Y7 e Y8 es, independientemente, O, S, Se, -NRN1-, alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, donde RN1 es H, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o arilo C6-C10 opcionalmente sustituido; y cada Y9 es, independientemente, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquenilo C2-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquinilo C2-C6 opcionalmente sustituido, o amino opcionalmente sustituido; e

Y10° es O, un enlace, alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, Y10° es polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido.

En algunos aspectos, el resto amino reactivo es una PEG-alcoxi amina, y el enlazador incluye la estructura:

Fórmula X

en la que p es 0, 1, 2, 3, 4 o 5.

En algunos aspectos, R14 y R15 son ambos hidroxi. En algunos aspectos, o es 1, Y6 es metileno, Y7 e Y8 son ambos O e Y9 es hidroxi. En algunos aspectos, p es 3.

En algunos aspectos, la PEG-alcoxi amina incluye una azida que además se hace reaccionar en una reacción de química de clic con un alquino y el enlazador incluye la estructura:

En algunos aspectos, Y1° es heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido. En algunos aspectos, el resto amino reactivo es una carbamido alcoxiamina, y el enlazador incluye la estructura:

en la que y r son cada uno, independientemente, 1,2, 3, 4 o 5.

En algunos aspectos, R14 y R15 son ambos hidroxi. En algunos aspectos, q es 5, Y6 es metileno, Y7 e Y8 son ambos O, e Y9 es hidroxi. En algunos aspectos, r es 3.

En algunos aspectos, el enlazador incluye la estructura:

equilibrio con otras estructuras como se muestra a continuación.

La presente descripción pretende abarcar todas las estructuras potenciales en equilibrio con la estructura morfolino.

Enlaces de fosfato

En algunos aspectos, la cola estabilizadora 3' se conjuga con el resto del polinucleótido, por ejemplo, en el extremo 3' de la región 3'-UTR o poli-A mediante un enlace fosfato. En algunos aspectos, el enlace fosfato es un enlace fosfato natural. En algunos aspectos, la conjugación de la cola estabilizadora 3' y el resto del polinucleótido se produce mediante ligadura enzimática o en férula.

Optimización de codones

Los polinucleótidos de la descripción, sus regiones, partes o subregiones pueden tener codones optimizados. Los procedimientos de optimización de codones se conocen en la técnica y pueden ser útiles en los esfuerzos por lograr uno o más de varios objetivos. Estos objetivos incluyen hacer coincidir las frecuencias de los codones en los organismos diana y hospedadores para garantizar un plegamiento adecuado, sesgar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm o reducir las estructuras secundarias, minimizar los codones repetidos en tándem o los recorridos de bases que pueden afectar a la construcción o expresión de genes, personalizar las regiones de control de la transcripción y la traducción, insertar o eliminar secuencias de tráfico de proteínas, eliminar/agregar sitios de modificación postraducción en proteínas codificadas (por ejemplo, sitios de glicosilación), agregar, eliminar o mezclar dominios de proteínas, insertar o eliminar sitios de restricción, modificar sitios de unión de ribosomas y sitios de degradación de ARNm, para ajustar las tasas traslacional para permitir que los diversos dominios de la proteína se plieguen adecuadamente, o reducir o eliminar las estructuras secundarias problemáticas dentro del polinucleótido. Las herramientas, algoritmos y servicios de optimización por codones son conocidos en la técnica, y los ejemplos no limitantes incluyen los servicios de GeneArt (Life Technologies), DNA2.0 (Menlo Park CA) y/o procedimientos propietarios. En un aspecto, se optimiza la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) con algoritmos de optimización. Las opciones de codones para cada aminoácido se dan en la Tabla 2.

Tabla 2. Opciones de codones

"Codón optimizado" se refiere a la modificación de una secuencia de nucleótidos de partida reemplazando al menos un codón de la secuencia de nucleótidos de partida con otro codón que codifica el mismo aminoácido (por ejemplo, para aumentar la expresión in vivo). La Tabla 3 contiene la frecuencia de uso de codones para humanos (base de datos de uso de codones: [[www.]]kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=9606&aa=1&style=N).

Tabla 3: Tabla de frecuencia de uso de codones ara humanos.

En la Tabla 3, el número entre paréntesis después del código de aminoácido de una letra indica la frecuencia de ese codón en relación con otros codones que codifican el mismo aminoácido, donde "1" es la frecuencia más alta y los números enteros más altos indican codones menos frecuentes.

Un codón maximizado de guanina es un codón que tiene el mayor número posible de guaninas para un aminoácido específico. Un codón maximizado de citosina es un codón que tiene el mayor número posible de citosinas para un aminoácido especificado. Un codón maximizado de guanina y/o el codón maximizado de citosina se refiere a un codón que tiene el mayor número de guaninas, citosinas o combinación de guaninas y citosinas para un aminoácido específico. Cuando dos o más codones tienen el mismo número de guaninas, citosinas o combinación de los mismos para un aminoácido especificado, un codón maximizado de baja frecuencia es un codón que tiene un valor entero más alto que otro codón maximizado en la Tabla 3.

En un aspecto, una vez que se ha optimizado el codón de una secuencia de nucleótido, se puede evaluar además para las regiones que contienen sitios de restricción. Al menos un nucleótido dentro de las regiones del sitio de restricción puede reemplazarse con otro nucleótido para eliminar el sitio de restricción de la secuencia, pero el reemplazo de nucleótidos sí altera la secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de nucleótidos con codón optimizado.

Las características, que pueden considerarse beneficiosas en algunos aspectos de la presente descripción, pueden estar codificadas por regiones del polinucleótido y tales regiones pueden estar aguas arriba (5') o aguas abajo (3') de una región que codifica un polipéptido. Estas regiones pueden incorporarse al polinucleótido antes y/o después de la optimización del codón de la región que codifica la proteína o del marco de lectura abierto (ORF). No es necesario que un polinucleótido contenga una región flanqueante tanto 5' como 3'. Los ejemplos de tales características incluyen, pero no se limitan a, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, una secuencia de oligo (dT) y etiquetas detectables y pueden incluir múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento Xbal.

En algunos aspectos, una región 5'-UTR y/o 3'-UTR se puede proporcionar una región como regiones flanqueantes. Pueden incluirse múltiples UTR 5' o 3' en las regiones flanqueantes y pueden ser las mismas o de secuencias diferentes. Cualquier porción de las regiones flanqueantes, incluida ninguna, puede tener codones optimizados y cualquiera puede contener independientemente una o más modificaciones estructurales o químicas diferentes, antes y/o después de la optimización de codones.

Después de la optimización (si se desea), los componentes de polinucleótidos se reconstituyen y se transforman en un vector tal como, entre otros, plásmidos, virus, cósmidos y cromosomas artificiales. Por ejemplo, el polinucleótido se puede reconstituir y transformar en E. coli químicamente competente, levadura, neurospora, maíz, drosofila, etc., donde se producen estructuras cromosómicas o similares a plásmidos de alto número de copias mediante los procedimientos descritos en esta invención.

Nucleótidos, nucleósidos y polinucleótidos alternativos de la descripción

En esta invención, en un nucleótido, nucleósido o polinucleótido (tal como los polinucleótidos de la descripción, p. ej., la molécula de ARNm), los términos "alteración" o, según corresponda, "alternativa" se refieren a la alteración con respecto a los ribonucleótidos A, G, U o C. En general, en esta invención, estas expresiones no hacen referencia a las modificaciones de ribonucleótidos en restos de capa de ARNm de extremo 5' de origen natural.

Las alteraciones pueden ser varias alteraciones distintas. En algunos aspectos, donde el polinucleótido es un ARNm, la región codificante, las regiones flanqueantes y/o las regiones de extremo (p. ej., una región estabilizadora 3') pueden contener una, dos o más modificaciones de nucleósidos o nucleótidos (opcionalmente diferentes). En algunos aspectos, un polinucleótido alternativo introducido en una célula puede presentar una degradación reducida en la célula, en comparación con un polinucleótido inalterado.

Los polinucleótidos de la descripción pueden incluir cualquier modificación útil tal como un enlace entre nucleósidos, un azúcar o una nucleobase (por ejemplo, a un fosfato enlazador, a un enlace fosfodiéster o a la estructura principal de fosfodiéster). En ciertos aspectos, están presentes modificaciones (por ejemplo, una o más modificaciones) en cada uno de los enlaces de azúcar y entre nucleósidos. Las modificaciones según la presente descripción pueden ser modificaciones de ácidos ribonucleicos (ARN) a ácidos desoxirribonucleicos (ADN), p. ej., la sustitución del 2'-OH del anillo de ribofuranosil a 2'-H, ácidos nucleicos treósicos (TNA), ácidos nucleicos de glicol (GNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o híbridos de los mismos). En esta invención se describen modificaciones adicionales.

Como se describe en esta invención, en algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción no inducen sustancialmente una respuesta inmune innata de una célula donde se introduce el polinucleótido (p. ej. ARNm). Las características de una respuesta inmune innata inducida incluyen 1) aumento de la expresión de citocinas proinflamatorias, 2) activación de PRR intracelulares (RIG-I, MDA5, etc. y/o 3) terminación o reducción de la traducción de proteínas.

En algunos aspectos, los polinucleótidos pueden incluir uno o más ARN mensajeros (ARNm) que tienen uno o más nucleósidos o nucleótidos alternativos (es decir, moléculas de ARNm alternativas). A continuación los detalles de estos polinucleótidos.

Alternativas de nucleobase

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden incluir una nucleobase alternativa. Los ejemplos de nucleobases que se encuentran en el ARN incluyen, pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina y uracilo. Los ejemplos de nucleobases que se encuentran en el a Dn incluyen, pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina y timina. Estas nucleobases se pueden alterar o reemplazar completamente para proporcionar moléculas de polinucleótidos que tienen propiedades mejoradas, por ejemplo, mayor estabilidad tal como resistencia a nucleasas.

La formación de pares de bases del nucleótido modificado abarca no sólo los pares de bases estándar adenina-timina, adenina-uracilo o guanina-citosina, sino también a los pares de bases formados entre nucleótidos y/o nucleótidos modificados que incluyen bases modificadas o no estándares, donde la disposición de donantes de enlaces de hidrógeno y los aceptores de enlaces de hidrógeno permiten la unión de hidrógenos entre una base no estándar y una base estándar, o entre dos estructuras complementarias de bases no estándar. Un ejemplo de tal formación de pares de bases no estándar es la formación de pares de bases entre la inosina y adenina, citosina o uracilo del nucleótido modificado.

En algunos aspectos, la nucleobase es un uracilo alternativo. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen un uracilo modificado incluyen pseudouridina (y ), piridin-4-ona ribonucleósido, 5-aza-uracilo, 6-aza-uracilo, 2-tio-5-azauracilo, 2-tio-uracilo(s2U), 4-tio-uracilo(s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uracilo (ho5U), 5-aminoallil-uracilo, 5-halo-uracilo (p.ej., 5-yodo-uracilo o 5-bromo-uracilo), 3-metil-uracilo (m3U), 5-metoxi-uracilo (mo5U), 5-ácido oxiacético uracilo (cmo5U), éster metil 5-ácido oxiacético uracilo (mcmo5U), 5-carboximetil-uracilo (cm5u), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uracilo (chm5U), éster de metilo 5-carboxihidroximetiluracilo (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uracilo (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uracilo (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uracilo (nm5s2U), 5-metilaminometil-uracilo (mnm5U), 5-metilaminometil-2-tio-uracilo (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uracilo (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uracilo (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uracilo (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo (cmnm5s2U), 5-propinil-uracil, 1-propinil-pseudouracilo, 5-taurinometil-uracilo (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uracilo(Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 5-metil-uracilo (m5U, es decir, que tiene la desoxitimina de nucleobase), 1-metil-pseudouridina (m1^ ), 5-metil-2-tio-uracilo (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^ ), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3V), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouracilo (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metil-dihidrouracilo (m5D), 2-tio-dihidrouracilo, 2-tiodihidropseudouridina, 2-metoxi-uracilo, 2-metoxi-4-tio-uracilo, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracilo (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 V), 5-(isopentenilaminometil)uracilo (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uracilo (inm5s2U), 5,2'-O-dimetiluridina (m5Um), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), and 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uracilo, desoxitimidina, 5-(2-carbometoxivinil)-uracilo, 5-(carbamoilhidroximetil)-uracilo, 5-carbamoilmetil-2-tio-uracilo, 5-carboximetil-2-tio-uracilo, 5-cianometil-uracilo, 5-metoxi-2-tio-uracilo, y5-[3-(1-E-propenilamino)]uracilo.

En algunos aspectos, la nucleobase es una citosina alternativa. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una citosina modificada incluyen 5-aza-citosina, 6-aza-citosina, pseudoisocitidina, 3-metil-citosina (m3C), N4-acetilcitosina (ac4C), 5-formil-citosina (f5C), N4-metil-citosina (m4C), 5-metil-citosina (m5C), 5-halo-citosina (p.ej., 5-yodocitosina), 5-hidroximetil-citosina (hm5C), 1-metil-pseudoisocitidina, pirrolo-citosina, pirrolo-pseudoisocitidina, 2-tiocitosina(s2C), 2-tio-5-metil-citosina, 4-tio-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-pseudoisocitidina, 4-tio-1-metil-1-deazapseudoisocitidina, 1-metil-1-deaza-pseudoisocitidina, zebularina, 5-aza-zebularina, 5-metil-zebularina, 5-aza-2-tiozebularina, 2-tio-zebularina, 2-metoxi-citosina, 2-metoxi-5-metil-citosina, 4-metoxi-pseudoisocitidina, 4-metoxi-1-metilpseudoisocitidina, lisidina (k2C), 5,2'-O-dimetil-citidina (m5Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidina (ac4Cm), N4,2'-O-dimetilcitidina (m4Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidina (f5Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidina (m42Cm), 1 -tio-citosina, 5-hidroxicitosina, 5-(3-azidopropil)-citosina, y 5-(2-azidoetil)-citosina.

En algunos aspectos, la nucleobase es una adenina alternativa. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una adenina modificada incluyen 2-amino-purina, 2, 6-diaminopurina, 2-amino-6-halo-purina (por ejemplo, 2-amino-6-cloro-purina), 6-halo-purina (por ejemplo, 6-cloro-purina), 2-amino-6-metil-purina, 8-azido-adenina, 7-deaza-adenina, 7-deaza-8-aza-adenina, 7-deaza-2-amino-purina, 7-deaza-8-aza-2-amino-purina, 7-deaza-2,6-diaminopurina, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurina, 1-metil-adenina (m1A), 2-metil-adenina (m2A), N6-metil-adenina (m6A), 2-metiltio-N6-metil-adenina (ms2m6A), N6-isopentenil-adenina (i6A), 2-metiltio-N6-isopentenil-adenina (ms2i6A), N6-(cishidroxiisopentenil)adenina (io6A), 2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenina (ms2io6A), N6-glicinilcarbamoiladenina (g6A), N6-treonilcarbamoil-adenina (t6A), N6-metil-N6-treonilcarbamoil-adenina (m6t6A), 2-metiltio-N6-treonilcarbamoil-adenina (ms2g6A), N6,N6-dimetil-adenina (m62A), N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenina (hn6A), 2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoil-adenina (ms2hn6A), N6-acetil-adenina (ac6A), 7-metil-adenina, 2-metiltioadenina, 2-metoxi-adenina, N6,2'-O-dimetil-adenosina (m6Am), N6,N6,2'-O-trimetil-adenosina (m62Am), 1,2'-O-dimetil-adenosina (m1Am), 2-amino-N6-metil-purina, 1-tio-adenina, 8-azido-adenina, N6-(19-aminopentaoxanonadecil)-adenina, 2,8-dimetil-adenina, N6-formil-adenina, y N6-hidroximetil-adenina.

En algunos aspectos, la nucleobase es una guanina alternativa. Nucleobases y nucleósidos ejemplares que tienen una guanina modificada incluyen inosina (I), 1-metil-inosina (m1I), wiosina (imG), metilwiosina (mimG), 4-demetilwiosina (imG-14), isowiosina (imG2), wibutosina (yW), peroxiwibutosina (o2yW), hidroxiwibutosina (OHyW), hidroxiwibutosina submodificada (OHyW*), 7-deaza-guanosina, queuosina (Q), epoxiqueuosina (oQ), galactosilqueuosina (galQ), mannosil-queuosina (manQ), 7-ciano-7-deaza-guanina (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanina (preQI), arcaeosina (G+), 7-deaza-8-aza-guanina, 6-tio-guanina, 6-tio-7-deaza-guanina, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanina, 7- metil-guanina (m7G), 6-tio-7-metil-guanina, 7-metil-inosina, 6-metoxi-guanina, 1-metil-guanina(m1G), N2-metilguanina (m2G), N2,N2-dimetil-guanina (m22G), N2,7-dimetil-guanina (m2,7G), N2, N2,7-dimetil-guanina (m2,2,7G), 8- oxo-guanina, 7-metil-8-oxo-guanina, 1-metil-6-tio-guanina, N2-metil-6-tio-guanina, N2,N2-dimetil-6-tio-guanina, N2-metil-2'-O-metil-guanosina (m2Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m22Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanosina (m1Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanosina (m2,7Gm), 2'-O-metil-inosina (Im), 1,2'-O-dimetil-inosina (m1Im), 1-tioguanina y O-6-metil-guanina.

La nucleobase del nucleótido puede seleccionarse independientemente de entre una purina, una pirimidina, una purina o un análogo de pirimidina. Por ejemplo, cada nucleobase puede seleccionarse independientemente de entre adenina, citosina, guanina, uracilo o hipoxantina. La nucleobase también puede incluir, por ejemplo, derivados naturales y sintéticos de una base, incluidas pirazolo[3,4-d] pirimidinas, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-propil y otros alquil derivados de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo (p. ej., 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas 8-sustituidas y guaninas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil y otros uracilos y citosinas 5-sustituidas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, deazaguanina, 7-deazaguanina, 3-deazaguanina, deazaadenina, 7-deazaadenina, 3-deazaadenina, pirazolo [3,4-d] pirimidina, imidazo [1,5-a] 1,3,5 triazinonas, 9-deazapurinas, imidazo [4,5-d] pirazinas, tiazolo [4, 5-d] pirimidinas, pirazin-2-onas, 1,2,4-triazina, piridazina; y 1,3,5 triazina. Cuando los nucleótidos se representan usando la abreviatura A, G, C, T o U, cada letra se refiere a la base representativa y/o derivados de las mismas, por ejemplo, A incluye adenina o análogos de adenina, por ejemplo, 7-deaza adenina).

Alteraciones en el Azúcar

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos, que pueden incorporarse en un polinucleótido de la descripción (por ejemplo, ARN o ARNm, como se describe en esta invención), se pueden alterar en el azúcar del nucleósido o nucleótido. En algunos aspectos, los nucleósidos o nucleótidos alternativos incluyen la estructura:

o

Fórmula V

En algunos aspectos, el grupo 2'-hidroxi (OH) se puede modificar o reemplazar con varios sustituyentes diferentes. Las sustituciones ejemplares en la posición 2' incluyen, pero no están limitados a, H, azido, halo (por ejemplo, fluoro), alquilo C1-6 opcionalmente sustituido (p. ej., metilo); alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido (p. ej., metoxi o etoxi); ariloxi C6-10 opcionalmente sustituido; cicloalquilo C3-8 opcionalmente sustituido; alcoxi C6-10 aril-C1-6 opcionalmente sustituido, (heterociclil)oxi C1-12 opcionalmente sustituido; un azúcar (p. ej., ribosa, pentosa, o cualquiera descrito en esta invención); un polietilenglicol (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, donde R es H o alquilo opcionalmente sustituido, y n es un número entero de 0 a 20 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 al 8, del 0 al 10, del 0 al 16, del 1 al 4, del 1 al 8, del 1 al 10, del 1 al 16, del 1 al 20, del 2 al 4, del 2 al 8, del 2 al 10, del 2 al 16, del 2 al 20, del 4 al 8, del 4 al 10, del 4 al 16, y del 4 al 20); ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) en los que el 2'-hidroxi está conectado por un puente alquileno C1-6 p heteroalquileno C1-6 a 4' de carbono del mismo azúcar ribosa, donde los puentes ejemplares incluyen metileno, propileno, puentes de éter o amino; aminoalquilo, como se define en esta invención; aminoalcoxi, como se define en esta invención; amino como se define en esta invención; y aminoácido, como se define en esta invención.

Generalmente, el ARN incluye el grupo de azúcar ribosa, que es un anillo de 5 miembros que tiene oxígeno. Los ejemplos de nucleótidos alternativos no limitantes incluyen la sustitución del oxígeno en la ribosa (por ejemplo, con S, Se o alquileno, como metileno o etileno); adición de un doble enlace (por ejemplo, para reemplazar la ribosa con ciclopentenilo o ciclohexenilo); contracción del anillo de la ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 4 miembros de ciclobutano u oxetano); expansión de anillo de ribosa (por ejemplo, para formar un anillo de 6 o 7 miembros que tiene un carbono o heteroátomo adicional, tal como anhidrohexitol, altritol, manitol, ciclohexanilo, ciclohexenilo y morfolino (que también tiene una cadena principal de fosforamidato)); formas multicíclicas (p. ej., triciclo y formas "desbloqueadas", tales como ácido nucleico de glicol (GNA) (p. ej., R-GNA o S-GNA, donde la ribosa se reemplaza por unidades de glicol unidas a enlaces fosfodiéster), ácido nucleico treosa (TNA, donde la ribosa se reemplaza con a-L-treofuranosil- (3 '^ 2')) y ácido nucleico peptídico (PNA, donde los enlaces 2-amino-etil-glicina reemplazan la cadena principal de ribosa y fosfodiéster).

En algunos aspectos, el grupo de azúcar contiene uno o más carbonos que poseen la configuración estereoquímica opuesta del carbono correspondiente en la ribosa. Por tanto, una molécula de polinucleótido puede incluir nucleótidos que contienen, por ejemplo, arabinosa o L-ribosa, como azúcar.

En algunos aspectos, el polinucleótido de la descripción incluye al menos un nucleósido en el que el azúcar es L-ribosa, 2'-O-metil-ribosa, 2'-fluoro-ribosa, arabinosa, hexitol, un LNA o un PNA.

Alteraciones en el enlace internucleosídico

Los nucleótidos alternativos, que se pueden incorporar en un polinucleótido de la descripción, se pueden alterar en el enlace internucleosídico (por ejemplo, la cadena principal de fosfato). En esta invención, en el contexto de la cadena principal de polinucleótidos, las frases "fosfato" y "fosfodiéster" se usan indistintamente. Los grupos fosfato de la cadena principal se pueden alterar reemplazando uno o más de los átomos de oxígeno con un sustituyente diferente.

Los nucleótidos alternativos pueden incluir el reemplazo total de un resto fosfato inalterado con otro enlace internucleosídico como se describe en esta invención. Los ejemplos de grupos fosfato alternativos incluyen, pero no se limitan a, fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, hidrogenofosfonatos, fosforamidatos, fosforodiamidatos, alquil o arilfosfonatos y fosfotriésteres. Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos no enlazantes reemplazados por azufre. El enlazador de fosfato también se puede alterar mediante la sustitución de un oxígeno de enlace con nitrógeno (fosforamidatos con puentes), azufre (fosforotioatos con puentes) y carbono (metilenfosfonatos con puentes).

Los nucleósidos y nucleótidos alternativos pueden incluir el reemplazo de uno o más de los oxígenos no puente con un resto borano (BH3), azufre (tio), metilo, etilo, y/o metoxi. Como ejemplo no limitante, dos oxígenos que no forman puentes en la misma posición (por ejemplo, la posición alfa (a), beta (p) o gamma (^y)) se pueden reemplazar con un azufre (tio) y un metoxi.

El reemplazo de uno o más de los átomos de oxígeno en la posición a del resto de fosfato (p. ej., A-tio fosfato) se proporciona para conferir estabilidad (tal como contra exonucleasas y endonucleasas) al ARN y al ADN a través de los enlaces de la cadena principal de fosforotioato no natural. El ADN y ARN de fosforotioato tienen una mayor resistencia a las nucleasas y, posteriormente, una vida media más larga en un entorno celular.

Otros enlaces internucleosídicos que pueden emplearse de acuerdo con la presente descripción, incluidos enlaces internucleosídicos que no contienen un átomo de fósforo, se describen en esta invención.

Síntesis de moléculas de polinucleótidos

Las moléculas de polinucleótidos para su uso de acuerdo con la descripción se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica útil conocida en la técnica. Los nucleósidos y nucleótidos alternativos usados en la síntesis de moléculas de polinucleótidos descritos en esta invención pueden prepararse a partir de materiales de partida fácilmente disponibles usando los siguientes métodos y procedimientos generales. Cuando se proporcionan condiciones de proceso típicas o preferidas (por ejemplo, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de reactivos, disolventes, presiones, etc.), un experto en la materia podrá optimizar y desarrollar condiciones de proceso adicionales. Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos particulares o el disolvente utilizado, pero un experto en la técnica puede determinar tales condiciones mediante procedimientos de optimización de rutina.

Los procesos descritos en esta invención se pueden monitorear según cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, la formación de producto se puede monitorear por medios espectroscópicos, tal como espectroscopía de resonancia magnética nuclear (por ejemplo, 1H o 13C), espectroscopía infrarroja, espectrofotometría (por ejemplo, UV visible) o espectrometría de masas, o por cromatografía tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía de capa fina.

La preparación de moléculas de polinucleótido de la presente descripción puede implicar la protección y desprotección de varios grupos químicos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la necesidad de protección y desprotección y la selección de grupos protectores apropiados. La química de los grupos protectores se puede encontrar, por ejemplo, en Greene, y col., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Hijos, 1991.

Las reacciones de los procesos descritos en esta invención se pueden desarrollar en solventes adecuados que un experto en la técnica de síntesis orgánica puede seleccionar. Los solventes adecuados pueden ser sustancialmente no reactivos con los materiales de partida (reactivos), los intermedios o los productos a las temperaturas a las que se desarrollan las reacciones, es decir, temperaturas que varían entre la temperatura de congelamiento del solvente y la temperatura de ebullición del solvente. Se puede realizar determinada reacción en un solvente o en una mezcla de más de un solvente. Dependiendo de la etapa de reacción particular, se pueden seleccionar solventes adecuados para una etapa de reacción particular.

La resolución de mezclas racémicas de polinucleótidos alternativos (por ejemplo, moléculas de ARNm alternativas) se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento de ejemplo incluye la recristalización fraccionada usando un "ácido de resolución quiral" que es un ácido orgánico formador de sal, ópticamente activo. Los agentes de resolución adecuados para los procedimientos de recristalización fraccionada son ácidos ópticamente activos, tales como las formas D y L de ácido tartárico, ácido diacetiltartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido mandélico, ácido málico, ácido láctico o los diversos ácidos camforsulfónicos ópticamente activos. La resolución de mezclas racémicas también puede llevarse a cabo mediante la elución en una columna con un agente de resolución ópticamente activado (por ejemplo, dinitrobenzoilfenilglicina). Un experto en la técnica puede determinar la composición solvente de elución adecuada.

Síntesis de polinucleótidos alternativos

Los polinucleótidos para su uso de acuerdo con la presente descripción se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica disponible que incluye, pero no se limita a, síntesis química, síntesis enzimática, que generalmente se denomina transcripción in vitro, escisión enzimática o química de un precursor más largo. Se pueden preparar nucleósidos y nucleótidos modificados por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, según los procedimientos sintéticos descritos en Ogata y col., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal y col., Nucl. Acids Res. 22(1): 72-78, (1994); Fukuhara y col., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); and Xu y col., Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992). En la técnica se conocen otros procedimientos de síntesis de ARN (véase, por ejemplo, Gait, MJ (ed.) Oligonucleotide Synthesis: un enfoque práctico, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Síntesis de oligonucleótidos: procedimientos y aplicaciones, Procedimientos en la biología molecular, v. 288 (Clifton, NJ) Totowa, NJ: Humana Press, 2005).

En ciertos aspectos, un procedimiento para producir un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés incluye poner en contacto un ADNc que codifica la proteína de interés con una ARN polimerasa en presencia de una mezcla de nucleótidos trifosfato, por ejemplo, en el que al menos el 90 % (por ejemplo, al menos 95 % o 100%) de los uracilos son 5-metoxiuracilo. La descripción también proporciona polinucleótidos producidos mediante tales procedimientos. Los procedimientos pueden incluir etapas adicionales tales como el taponamiento (p. ej., la adición de una estructura de tapa 5'), la adición de una región poli-A, y/o la formulación en una composición farmacéutica. La ARN polimerasa puede ser ARN polimerasa T7. La mezcla de reacción de transcripción in vitro puede incluir un tampón de transcripción (tal como Tris-HCl 400 mM pH 8.0, o un equivalente) y puede incluir MgCb, DTT, y/o espermidina o equivalentes. Puede incluirse un inhibidor de RNasa. El volumen de reacción restante se completa generalmente con dH2O. La reacción se puede incubar a aproximadamente 37 °C (tal como entre 30 y 40 °C) y se puede incubar durante 3 horas-5 horas (tal como 3 A horas - 4 'A horas, o aproximadamente 4 horas). A continuación, el polinucleótido puede purificarse usando DNasa y un kit de purificación.

Por ejemplo, los polinucleótidos alternativos descritos en esta invención se pueden preparar usando procedimientos que son conocidos por los expertos en la técnica de la síntesis de polinucleótidos.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona procedimientos para sintetizar un polinucleótido farmacéutico, que incluyen las etapas de:

a) proporcionar un ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) que codifica una proteína farmacéutica de interés;

b) seleccionar un nucleótido y

c) poner en contacto el ADNc proporcionado y el nucleótido seleccionado con una ARN polimerasa, en condiciones tales que se sintetice el polinucleótido farmacéutico.

En aspectos adicionales, el polinucleótido farmacéutico es un ácido ribonucleico (ARN).

En otro aspecto más de la presente descripción, los polinucleótidos alternativos se pueden preparar usando procedimientos de síntesis en fase sólida.

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción se producen a) sintetizando un polinucleótido que incluye i) una región codificante; ii) una 5'-UTR que incluye opcionalmente una secuencia de Kozak; iii) una 3'-UTR; iv) al menos una estructura de capa 5'; y v) una región poli-A; b) incorporación de un nucleósido que contiene azido 3'; y c) conjugación de una región estabilizadora 3' que contiene un grupo funcional alquino (por ejemplo, un grupo funcional que contiene ciclooctino) en el extremo 5'.

Prevención o reducción de la respuesta inmune celular innata

El término "respuesta inmune innata" incluye una respuesta celular a polinucleótidos monocatenarios exógenos, generalmente de origen viral o bacteriano, que implica la inducción de la expresión y liberación de citocinas, particularmente los interferones, y la muerte celular. La síntesis de proteínas también se reduce durante la respuesta inmune celular innata. Aunque es ventajoso eliminar la respuesta inmune innata en una célula que se desencadena por la introducción de polinucleótidos exógenos, la presente descripción proporciona polinucleótidos alternativos tales como ARNm que reducen sustancialmente la respuesta inmune, incluida la señalización por interferón, sin eliminar por completo tal respuesta. En algunos aspectos, la respuesta inmune se reduce en el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, 99,9 %, o más del 99,9 % en comparación con la respuesta inmune inducida por un polinucleótido inalterado correspondiente. Tal reducción puede medirse mediante la expresión o el nivel de actividad de los interferones de tipo 1 o la expresión de genes regulados por interferón, como los receptores de tipo toll (por ejemplo, TLR7 y TLR8). La reducción o la falta de inducción de la respuesta inmune innata también se puede medir mediante la disminución de la muerte celular después de una o más administraciones de ARN alternativos a una población celular; por ejemplo, la muerte celular es 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más del 95 % menos que la frecuencia de muerte celular observada con un polinucleótido inalterado correspondiente. Además, la muerte celular puede afectar a menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 % o menos del 0,01 % de las células se pusieron en contacto con los polinucleótidos alternativos.

En algunos aspectos, los polinucleótidos alternativos, incluidas las moléculas de ARNm, son alternativos de tal manera que no inducen, o inducen solo mínimamente, una respuesta inmune por parte de la célula u organismo receptor. Tal evasión o evitación de un desencadenante o activación de una respuesta inmune es una característica novedosa de los polinucleótidos alternativos de la presente descripción.

La presente descripción proporciona la introducción repetida (por ejemplo, transfección) de polinucleótidos alternativos en una población de células diana, por ejemplo, in vitro, ex vivo o in vivo. La etapa de ponerse en contacto con la población celular puede repetirse una o más veces (tal como dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco veces). En algunos aspectos, la etapa de poner en contacto la población celular con los polinucleótidos alternativos se repite un número de veces suficiente para que se logre una eficiencia predeterminada traslacional de proteínas en la población celular. Dada la citotoxicidad reducida de la población de células diana proporcionada por las alteraciones de nucleótidos, tales transfecciones repetidas se pueden lograr en una variedad diversa de tipos de células in vitro y/o in vivo.

Los procedimientos para determinar la eficacia de un polinucleótido alternativo en comparación con el tipo salvaje pueden implicar la medición y análisis de una o más citocinas cuya expresión se desencadena por la administración del polinucleótido exógeno de la descripción. Estos valores se comparan con la administración de un polinucleótido inalterado o con una métrica estándar como la respuesta de citocinas, o PolylC, R-848. Un ejemplo de una métrica estándar es la medida de la relación entre el nivel o la cantidad de polipéptido (proteína) codificado producido en la célula, tejido u organismo al nivel o cantidad de una o más (o un panel) de citocinas cuya expresión se activa en la célula, tejido u organismo como resultado de la administración o contacto con el polinucleótido alternativo. Tales proporciones se denominan en esta invención Relación Proteina:Citocina o relación "PC". Cuanto mayor sea la relación de PC, más eficaz será el polinucleótido alternativo (polinucleótido que codifica la proteína medida). Las relaciones de PC preferidas, por citocinas, de la presente descripción pueden ser más de 1, más de 10, más de 100, más de 1000, más de 10.000 o más. Se prefieren polinucleótidos alternativos que tienen relaciones de PC más altas que un polinucleótido alternativo de una construcción diferente o inalterada. La proporción de PC puede calificarse adicionalmente por el porcentaje de alteración presente en el polinucleótido. Por ejemplo, normalizado a un polinucleótido alternativo al 100 %, se puede determinar la producción de proteína en función de la citocina (o el riesgo) o el perfil de citocina.

Polipéptidos

Los polipéptidos de interés expresados por los polinucleótidos de la descripción, se pueden seleccionar de cualquier polipéptido conocido en la técnica, por ejemplo, los descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos N. ° 2013/0259924 y 2013/0259923 , Publicaciones internacionales N. ° WO 2013/151663 ,WO 2013/151669 ,WO 2013/151670 ,WO 2013/151664 ,WO 2013/151665 ,WO 2013/151736 ,Solicitudes de patente provisionales de EE. UU. N. ° 61/618.862 ,61/681.645 ,61/618.873 ,61/681.650 ,61/618.878 ,61/681.654 ,61/618.885 ,61/681.658 ,61/618.911 ,61/681.667 ,61/618.922 ,61/681.675 ,61/618.935 ,61/681.687 ,61/618.945 ,61/681.696 , 61/618.953 y 61/681.704.

La eritropoyetina (EPO) y el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF) son polipéptidos ejemplares.

Variantes de polipéptidos

T ambién se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos variantes, que tienen una cierta identidad con una secuencia polipeptídica de referencia. El término "identidad" como se conoce en la técnica hace referencia a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos determinada mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" también hace referencia al grado de relación de secuencia entre péptidos, según se determina por la cantidad de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hubiera) conforme a un modelo matemático o programa informático particular (es decir, "algoritmos"). Es posible calcular la identidad de péptidos relacionados mediante procedimientos conocidos. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo y col., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

En algunos aspectos, la variante de polipéptido puede tener la misma actividad o similar que el polipéptido de referencia. Alternativamente, la variante tiene una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) con respecto a un polipéptido de referencia. En general, las variantes de un polinucleótido o polipéptido particular de la presente descripción tendrán al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más identidad de secuencia con dicho polinucleótido o polipéptido de referencia particular, según se determina mediante parámetros y programas de alineación de secuencia descritos en esta invención y conocidos por los expertos en la técnica.

Como reconocerán los expertos en la técnica, los fragmentos de proteína, dominios de proteína funcional y proteínas homólogas, también se consideran dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, se proporciona en esta invención cualquier fragmento de proteína de una proteína de referencia (que significa una secuencia de polipéptidos que en su longitud tiene un residuo de aminoácidos menor que una secuencia de polipéptidos de referencia, pero idéntica en los demás aspectos) con una longitud de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mayor que 100 aminoácidos. En otro ejemplo, puede utilizarse según la presente descripción cualquier proteína que incluya una extensión de 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, o aproximadamente 100 aminoácidos que sea de aproximadamente el 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o aproximadamente 100 % idéntica a las secuencias descritas en esta descripción. En ciertos aspectos, un polipéptido que será utilizado de acuerdo con la presente descripción incluye 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más mutaciones, según se muestra en cualquiera de las secuencias que se proporcionan o se mencionan en esta invención.

Bibliotecas de polinucleótidos

También se proporcionan bibliotecas de polinucleótidos que contienen alteraciones de nucleósidos, en las que los polinucleótidos contienen individualmente una primera secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, tal como un anticuerpo, pareja de unión a proteínas, proteína de andamiaje y otros polipéptidos conocidos en la técnica. Preferiblemente, los polinucleótidos son ARNm en una forma adecuada para la introducción directa en una célula huésped diana, que a su vez sintetiza el polipéptido codificado.

En ciertos aspectos, se producen y prueban múltiples variantes de una proteína, cada una con diferentes alteraciones de aminoácidos, para determinar la mejor variante en términos de farmacocinética, estabilidad, biocompatibilidad, y/o actividad biológica o una propiedad biofísica como el nivel de expresión. Tal biblioteca puede contener 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109o más de 109 variantes posibles (incluidas sustituciones, deleciones de uno o más residuos e inserción de uno o más residuos).

Complejos de polipéptido-polinucleótido

La traducción adecuada de proteínas implica la agregación física de varios polipéptidos y polinucleótidos asociados con el ARNm. La presente descripción proporciona complejos proteína-polinucleótido, que contienen un ARNm traducible que tiene una o más alteraciones de nucleósidos (por ejemplo, al menos dos alteraciones de nucleósidos diferentes) y uno o más polipéptidos unidos al ARNm. Generalmente, las proteínas se proporcionan en una cantidad eficaz para prevenir o reducir una respuesta inmune innata de una célula en la que se introduce el complejo.

Usos de polinucleótidos alternativos

Agentes terapéuticos

Los polinucleótidos alternativos descritos en esta invención pueden usarse como agentes terapéuticos. Por ejemplo, un polinucleótido alternativo descrito en esta invención puede administrarse a un animal o sujeto, en el que el polinucleótido alternativo se traduce in vivo para producir un péptido terapéutico en el animal o sujeto. Se proporcionan en esta invención composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas), procedimientos, kits y reactivos para prevenir y/o tratar enfermedades o afecciones en seres humanos y otros mamíferos. Los agentes terapéuticos activos de la presente descripción incluyen polinucleótidos alternativos, células que contienen polinucleótidos o polipéptidos alternativos traducidos de los polinucleótidos alternativos, polipéptidos traducidos de polinucleótidos alternativos, células en contacto con células que contienen polinucleótidos alternativos o polipéptidos traducidos de polinucleótidos alternativos, tejidos que contienen células que contienen polinucleótidos alternativos y órganos que contienen tejidos que contienen células que contienen polinucleótidos alternativos.

Se proporcionan procedimientos para inducir la traducción de un polinucleótido sintético o recombinante para producir un polipéptido en una población celular utilizando los polinucleótidos alternativos descritos en esta invención. Esta traducción puede ser in vivo, ex vivo, en cultivo, o in vitro. La población celular se pone en contacto con una cantidad efectiva de una composición que contiene un ácido nucleico que tiene al menos una modificación de nucleósido y una región traducible que codifica el polipéptido. La población se pone en contacto en condiciones tales que el ácido nucleico se localiza en una o más células de la población celular y el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del polinucleótido.

Se proporciona una "cantidad efectiva" de la composición basada, al menos en parte, en el tejido diana, el tipo celular diana, los medios de administración, las características físicas del polinucleótido (por ejemplo, el tamaño y la extensión de los nucleósidos modificados) y otros determinantes. En general, una cantidad efectiva de la composición proporciona una producción efectiva de proteínas en la célula, preferiblemente más efectiva que una composición que contiene el correspondiente polinucleótido no modificado. El aumento de la eficiencia puede demostrarse mediante un aumento de la transfección celular (es decir, el porcentaje de células transfectadas con el polinucleótido), un aumento de la traducción de la proteína del polinucleótido, una disminución de la degradación del polinucleótido (como se demuestra, por ejemplo, por un aumento de la duración de la traducción de la proteína de un polinucleótido modificado), o respuesta inmune innata reducida de la célula huésped o mejorar la utilidad terapéutica.

Los aspectos de la presente descripción están dirigidos a procedimientos para inducir la traducción in vivo de un polipéptido recombinante en un sujeto mamífero que lo necesite. Allí, se administra al sujeto una cantidad eficaz de una composición que contiene un polinucleótido que tiene al menos una alteración de nucleósido y una región traducible que codifica el polipéptido usando los procedimientos de administración descritos en esta invención. El polinucleótido se proporciona en una cantidad y en otras condiciones tales que el polinucleótido se localiza en una célula o células del sujeto y el polipéptido recombinante se traduce en la célula a partir del polinucleótido. La célula en la que se localiza un polinucleótido, o el tejido en el que está presente la célula, puede ser alcanzada con una o más rondas de administración de polinucleótido.

Otros aspectos de la presente descripción se refieren al trasplante de células que contienen polinucleótido alternativo a un sujeto mamífero. La administración de células a mamíferos es conocida por los expertos en la técnica, tal como la implantación local (por ejemplo, administración tópica o subcutánea), administración de órganos o inyección sistémica (por ejemplo, inyección intravenosa o inhalación), como la formulación de células en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones que contienen polinucleótidos alternativos pueden formularse para la administración intramuscular, transarterial, intraperitoneal, intravenosa, intranasal, subcutánea, endoscópica, transdérmica o intratecal. La composición se puede formular para una liberación prolongada.

El sujeto al que se le puede administrar el agente terapéutico padece o puede tener riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección deletérea. Se proporcionan procedimientos para identificar, diagnosticar y clasificar sujetos, que pueden incluir diagnóstico clínico, niveles de biomarcadores, estudios de asociación de todo el genoma (GWAS) y otros procedimientos conocidos en la técnica.

En ciertos aspectos, el polinucleótido alternativo administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que proporciona una actividad funcional que está sustancialmente ausente en la célula en la que se traduce el polipéptido recombinante. Por ejemplo, la actividad funcional que falta puede ser de naturaleza enzimática, estructural o reguladora de genes.

En otros aspectos, el polinucleótido alternativo administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes que reemplazan un polipéptido (o polipéptidos múltiples) que están sustancialmente ausentes en la celda en la que se traduce el polipéptido recombinante. Tal ausencia puede deberse a una mutación genética del gen codificante o vía reguladora del mismo. En otros aspectos, el polinucleótido alternativo administrado dirige la producción de uno o más polipéptidos recombinantes para complementar la cantidad de polipéptido (o polipéptidos múltiples) que está presente en la célula en la que se traduce el polipéptido recombinante. Alternativamente, el polipéptido recombinante funciona para antagonizar la actividad de una proteína endógena presente en, sobre la superficie o secretada de la célula. Normalmente, la actividad de la proteína endógena es perjudicial para el sujeto, por ejemplo, debido a la mutación de la proteína endógena que da como resultado una actividad o localización alterada. Además, el polipéptido recombinante antagoniza, directa o indirectamente, la actividad de un resto biológico presente en, sobre la superficie o secretado de la célula. Los ejemplos de restos biológicos antagonizados incluyen lípidos (por ejemplo, colesterol), una lipoproteína (por ejemplo, lipoproteína de baja densidad), un polinucleótido, un carbohidrato o una toxina de molécula pequeña.

Las proteínas recombinantes descritas en esta invención están diseñadas para la localización dentro de la célula, potencialmente dentro de un compartimento específico tal como el núcleo, o están diseñados para la secreción de la célula o la translocación a la membrana plasmática de la célula.

Como se describe en esta invención, una característica útil de los polinucleótidos alternativos de la presente descripción es la capacidad de reducir, evadir, evitar o eliminar la respuesta inmune innata de una célula a un polinucleótido exógeno. Se proporcionan procedimientos para realizar la titulación, reducción o eliminación de la respuesta inmune en una célula o una población de células. En algunos aspectos, la célula se pone en contacto con una primera composición que contiene una primera dosis de un primer polinucleótido exógeno que incluye una región traducible y al menos una alteración de nucleósido, y se determina el nivel de la respuesta inmune innata de la célula al primer polinucleótido exógeno. Posteriormente, la célula se pone en contacto con una segunda composición, que incluye una segunda dosis del primer polinucleótido exógeno, conteniendo la segunda dosis una cantidad menor del primer polinucleótido exógeno en comparación con la primera dosis. Alternativamente, la célula se pone en contacto con una primera dosis de un segundo polinucleótido exógeno. El segundo polinucleótido exógeno puede contener uno o más nucleósidos alternativos, que pueden ser iguales o diferentes del primer polinucleótido exógeno o, alternativamente, el segundo polinucleótido exógeno puede no contener nucleósidos alternativos. Las etapas para poner en contacto la célula con la primera composición y/o la segunda composición se puede repetir una o más veces. Además, la eficiencia de la producción de proteínas (p. ej., traducción de proteínas) en la célula se determina opcionalmente, y la célula puede volver a transfectarse con la primera y/o segunda composición repetidamente hasta que se logre una eficiencia de producción de proteína objetivo.

Terapéutica para enfermedades y afecciones.

Se proporcionan procedimientos para tratar o prevenir un síntoma de enfermedades caracterizadas por una actividad de la proteína ausente o aberrante, reemplazando la actividad de la proteína que falta o superando la actividad de la proteína aberrante. Debido al rápido inicio de la producción de proteínas después de la introducción de ARNm alternativos, en comparación con los vectores de ADN viral, los compuestos de la presente descripción son particularmente ventajosos en el tratamiento de enfermedades agudas tales como sepsis, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. Además, la falta de regulación transcripcional de los ARNm alternativos de la presente descripción es ventajosa porque se puede lograr una titulación precisa de la producción de proteínas. Múltiples enfermedades se caracterizan por falta de actividad proteica (o sustancialmente disminuida de manera que no se produce la función proteica adecuada). Estas proteínas pueden no estar presentes, estar presentes en cantidades muy bajas o son esencialmente no funcionales. La presente descripción proporciona un procedimiento para tratar tales afecciones o enfermedades en un sujeto mediante la introducción de polinucleótidos o agentes terapéuticos basados en células que contienen los polinucleótidos alternativos proporcionados en esta invención, en el que los polinucleótidos alternativos codifican una proteína que reemplaza la actividad de la proteína que falta en las células diana del sujeto.

Las enfermedades caracterizadas por una actividad proteica disfuncional o aberrante incluyen, pero no se limitan a, cáncer y otras enfermedades proliferativas, enfermedades genéticas (por ejemplo, fibrosis quística), enfermedades autoinmunes, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares y enfermedades metabólicas. La presente descripción proporciona un procedimiento para tratar tales afecciones o enfermedades en un sujeto mediante la introducción de polinucleótidos o agentes terapéuticos basados en células que contienen los polinucleótidos alternativos proporcionados en esta invención, en el que los polinucleótidos alternativos codifican una proteína que antagoniza o supera de otro modo la actividad proteica aberrante presente en la célula del sujeto.

Ejemplos específicos de una proteína disfuncional son las variantes de mutación sin sentido o sin sentido del gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), que produce una variante de proteína disfuncional o no funcional, respectivamente, de la proteína CFTR, que causa fibrosis quística.

Por tanto, se proporcionan procedimientos para tratar la fibrosis quística en un sujeto mamífero mediante el contacto de una célula del sujeto con un polinucleótido alternativo que tiene una región traducible que codifica un polipéptido CFTR funcional, en condiciones tales que esté presente una cantidad eficaz del polipéptido CTFR en la célula. Las células diana preferidas son células epiteliales tales como el pulmón, y los procedimientos de administración se determinan a la vista del tejido diana; es decir, para la administración pulmonar, los polinucleótidos se formulan para su administración por inhalación. Por lo tanto, en ciertos aspectos, el polipéptido de interés codificado por el polinucleótido de la descripción es el polipéptido CTFR y el polinucleótido o composición farmacéutica de la descripción es para uso en el tratamiento de la fibrosis quística.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar la hiperlipidemia en un sujeto, introduciendo en una población celular del sujeto una molécula de polinucleótido alternativa que codifica sortilina, una proteína caracterizada recientemente por estudios genómicos, mejorando así la hiperlipidemia en un sujeto. El gen SORT1 codifica una proteína transmembrana de la red trans-Golgi (TGN) llamada Sortilina. Los estudios genéticos han demostrado que uno de cada cinco individuos tiene un polimorfismo de un solo nucleótido, rs12740374, en el locus 1p13 del gen SORT1 que los predispone a tener niveles bajos de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Cada copia del alelo menor, presente en aproximadamente el 30 % de las personas, altera el colesterol LDL en 8 mg/dL, mientras que dos copias del alelo menor, presente en aproximadamente el 5 % de la población, reduce el colesterol LDL 16 mg/dL. También se ha demostrado que los portadores del alelo menor tienen un 40 % menos de riesgo de infarto de miocardio. Los estudios funcionales in vivo en ratones describen que la sobreexpresión de SORT1 en tejido hepático de ratón condujo a niveles de colesterol LDL significativamente más bajos, hasta en un 80 % más bajos, y que silenciar SORT1 aumentó el colesterol LDL aproximadamente en un 200 % (Musunuru K y col. De variante no codificante del fenotipo a través de SORT1 en el locus de colesterol 1p13. Nature 2010; 466: 714-721). Por lo tanto, en ciertos aspectos, el polipéptido de interés codificado por el ARNm de la descripción es sortilina y el polinucleótido o composición farmacéutica de la descripción es para uso en el tratamiento de la hiperlipidemia.

En ciertos aspectos, el polipéptido de interés codificado por el polinucleótido de la descripción es el factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), y el polinucleótido o composición farmacéutica de la descripción se utiliza en el tratamiento de una enfermedad neurológica tal como la isquemia cerebral o el tratamiento de la neutropenia, o para su uso en el aumento del número de células madre hematopoyéticas en la sangre (p. ej., antes de la recolección mediante leucocitaféresis para su uso en el trasplante de células madre hematopoyéticas).

En ciertos aspectos, el polipéptido de interés codificado por el polinucleótido de la descripción es eritropoyetina (EPO), y el polinucleótido o composición farmacéutica de la descripción se utiliza en el tratamiento de anemia, enfermedad inflamatoria intestinal (tal como la enfermedad de Crohn) y/o colitis ulcerosa) o mielodisplasia.

Procedimientos de administración de polinucleótidos celulares

Los procedimientos de la presente descripción mejoran el suministro de polinucleótidos en una población celular, in vivo, ex vivo o en cultivo. Por ejemplo, un cultivo celular que contiene una pluralidad de células huésped (por ejemplo, células eucariotas tales como células de levadura o de mamífero) se pone en contacto con una composición que contiene un polinucleótido alternativo que tiene al menos una alteración de nucleósido y, opcionalmente, una región traducible. La composición también contiene generalmente un reactivo de transfección u otro compuesto que aumenta la eficacia de la absorción de polinucleótidos alternativos en las células huésped. El polinucleótido alternativo exhibe una retención mejorada en la población celular, en relación con un polinucleótido inalterado correspondiente. La retención del polinucleótido alternativo es mayor que la retención del polinucleótido inalterado. En algunos aspectos, se trata al menos del 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 100 %, 150 %, 200 %, o más del 200 % mayor que la retención del polinucleótido inalterado. Tal ventaja de retención puede lograrse mediante una ronda de transfección con el polinucleótido alternativo, o puede obtenerse después de repetidas rondas de transfección.

En algunos aspectos, el polinucleótido alternativo se administra a una población de células diana con uno o más polinucleótidos adicionales. Tal suministro puede ser al mismo tiempo, o el polinucleótido alternativo se administra antes del suministro de uno o más polinucleótidos adicionales. El uno o más polinucleótidos adicionales pueden ser polinucleótidos alternativos o polinucleótidos inalterados. Se entiende que la presencia inicial de los polinucleótidos alternativos no induce sustancialmente una respuesta inmune innata de la población celular y, además, que la respuesta inmune innata no será activada por la presencia posterior de los polinucleótidos inalterados. A este respecto, el polinucleótido alternativo puede no contener por sí mismo una región traducible, si la proteína que se desea que esté presente en la población de células diana se traduce a partir de los polinucleótidos inalterados.

Restos de direccionamiento

En aspectos de la presente descripción, se proporcionan polinucleótidos alternativos para expresar un socio de unión a proteínas o un receptor en la superficie de la célula, que funciona para dirigir la célula a un espacio de tejido específico o para interactuar con un resto específico, ya sea in vivo o in vitro. Los socios de unión a proteínas incluyen anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, proteínas de andamio o péptidos. Además, se pueden emplear polinucleótidos alternativos para dirigir la síntesis y localización extracelular de lípidos, carbohidratos u otros restos biológicos.

Silenciamiento permanente de la expresión genética

Un procedimiento para silenciar epigenéticamente la expresión génica en un sujeto mamífero, que incluye un polinucleótido donde la región traducible codifica un polipéptido o polipéptidos capaces de dirigir la metilación de la histona H3 específica de secuencia para iniciar la formación de heterocromatina y reducir la transcripción génica alrededor de genes específicos con el fin de silenciar el gen. Por ejemplo, una mutación de ganancia de función en el gen Janus Kinase 2 es responsable de la familia de Enfermedades Mieloproliferativas.

Nanopartículas lipídicas

En algunos aspectos, los polinucleótidos de la descripción están encapsulados en nanopartículas lipídicas. Por consiguiente, en algunos aspectos, la descripción proporciona composiciones de nanopartículas que incluyen un polinucleótido de la descripción encapsulado en una nanopartícula lipídica. Las composiciones de nanopartículas incluyen, por ejemplo, nanopartículas de lípidos (LNP), liposomas, vesículas de lípidos y lipoplejos. En algunos aspectos, las composiciones de nanopartículas son vesículas que incluyen una o más bicapas lipídicas. En ciertos aspectos, una composición de nanopartículas incluye dos o más bicapas concéntricas separadas por compartimentos acuosos. Las bicapas lipídicas pueden funcionalizarse y/o reticularse entre sí. Las bicapas lipídicas pueden incluir uno o más ligandos, proteínas o canales.

Lípidos ionizables/catiónicos

Las composiciones de nanopartículas de la descripción comprenden un componente lipídico además de un polinucleótido de la descripción. El componente lipídico de una composición de nanopartículas puede incluir uno o más lípidos. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede incluir uno o más catiónicos y/o lípidos ionizables. Los lípidos ionizables y/o catiónicos pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en 3-(didodecilamino)-N1,N1,4-tridodecil-1-piperazinetanamina (KL10), 14,25-ditridecil-15,18,21,24-tetraaza- octatriacontano (KL25), 1,2-dilinoleiloxi-N, N-dimetilaminopropano (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 4-(dimetilamino) butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (DLin-MC3-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), 1,2-dioleiloxi-N, N-dimetilaminopropano (DODMA), 2-({8-[(3p)-cholest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]propan-1 -amina (Octil-cLinDMA), (2R)-2-({8-[(3p)-cholest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]pro pan-1-amina (Octil-CLinDMA (2R)), y (2S)-2-({8-[(3p)-cholest-5-en-3-iloxi]octil}oxi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi]prop an-1-amina (Octil-CLinDMA (2S)). Además de estos, un lípido catiónico también puede ser un lípido que incluye una amina cíclica.

Lípidos PEG

El componente lipídico de una composición de nanopartículas de la descripción puede incluir uno o más PEG o lípidos modificados con PEG. Tales especies pueden denominarse alternativamente lípidos PEGilados. Un lípido PEG es un lípido modificado con polietilenglicol.

El componente lipídico puede incluir uno o más lípidos PEG. Un lípido de PEG puede seleccionarse del grupo no limitante que consiste en fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, ácidos fosfatídicos modificados con PEG, ceramidas modificadas con PEG, dialquilaminas modificadas con PEG, diacilgliceroles modificados con PEG y dialquilgliceroles modificados con PEG. Por ejemplo, un lípido PEG puede ser PEG-c-DOMG, PEG-DMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC o un lípido PEG-DSPE.

Lípidos estructurales

El componente lipídico de una composición de nanopartículas puede incluir uno o más lípidos estructurales (por ejemplo, colesterol fecosterol, sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, ergosterol, tomatidina, tomatina, ácido ursólico o alfa-tocoferol).

Fosfolípidos

El componente lipídico de una composición de nanopartículas puede incluir uno o más fosfolípidos, tales como uno o más lípidos (poli) insaturados. En general, tales lípidos pueden incluir un resto fosfolípido y uno o más restos de ácido graso. Por ejemplo, un fosfolípido puede ser un lípido según la fórmula:

en la que Rp representa un resto fosfolípido y Rip y R2p representan restos de ácido graso con o sin saturación que pueden ser iguales o diferentes. Puede seleccionarse un resto fosfolípido del grupo no limitante que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidil etanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, 2-lisofosfatidilcolina y una esfingomielina. El resto de ácido graso puede seleccionarse de entre el grupo no limitante que consiste en ácido láurico, ácido mirístico, ácido miristoleico, ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido alfa-linolénico, ácido erúcico, ácido fitanoico, ácido araquídico, ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido behénico, ácido docosapentaenoico y ácido docosahexaenoico. También se contemplan especies no naturales que incluyen especies naturales con modificaciones y sustituciones que incluyen ramificación, oxidación, ciclación y alquinos.

En algunos aspectos, una composición de nanopartículas puede incluir 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), o tanto DSPC como DOPE. Los fosfolípidos útiles en las composiciones y procedimientos de la descripción pueden seleccionarse del grupo no limitante que consiste en DSPC, DOPE, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DLPC), 1,2-dimiristoil-sn- glicerofosfocolina (DMPC), 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diundecanoil-sn-glicero -fosfocolina (DUPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-di-O-octadecenil-sn-glicero-3-fosfocolina (18:0 Dieter PC), 1-oleoil-2-colesterilhemisuccinoil-sn-glicero-3-fosfocolina (OChemsPC), 1-hexadecil-sn-glicero-3-fosfocolina (C16 Lyso PC), 1,2-dilinolenoil-sn-glicero- 3-fosfocolina, 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 1,2-difitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ME 16.0 PE) 1,2-diestearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dilinolenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-diaraquidonoil-sn -glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-didocosahexaenoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-(1-glicerol) sal sódica (DOPG) y esfingomielina.

Otros componentes

Una composición de nanopartículas puede incluir uno o más componentes además de los descritos en las secciones anteriores. Por ejemplo, una composición de nanopartículas puede incluir una o más moléculas hidrófobas pequeñas tal como una vitamina (por ejemplo, vitamina A o vitamina E) o un esterol.

Las composiciones de nanopartículas también pueden incluir una o más moléculas potenciadoras de la permeabilidad, carbohidratos, polímeros, agentes terapéuticos, agentes que alteran la superficie u otros componentes. Una molécula potenciadora de la permeabilidad puede ser una molécula descrita por la publicación de solicitud de patente de EE.UU.

2005/0222064, por ejemplo. Los carbohidratos pueden incluir azúcares simples (por ejemplo, glucosa) y polisacáridos (por ejemplo, glucógeno y derivados y análogos de los mismos).

Se puede incluir un polímero en y/o utilizar para encapsular o encapsular parcialmente una composición de nanopartículas. Un polímero puede ser biodegradable y/o biocompatible. Un polímero puede incluir, pero sin estar limitado a, poliaminas, poliéteres, poliamidas, poliésteres, policarbamatos, poliureas, policarbonatos, poli(estirenos), poliimidas, polisulfonas, poliuretanos, poliacetilenos, polietilenos, polietileniminas, poliisocianatos, poliacrilatos, polimeacrilatos, poliacrilonitrilos y poliarilatos. Por ejemplo, un polímero puede incluir poli(caprolactona) (PCL), polímero de acetato de etilenvinilo (EVA), ácido (poli)láctico (PLA), ácido (poli)(L-láctico (PLA), ácido (poli)glicólico (PGA), ácido (poli)láctico-co-glicólico (PLGA), ácido (poli)L-láctico-co-glicólico (PLLGA), poli(D,L-láctido) (PDLA), poli(L-láctido) (PLLA), poli(D,L-láctido-co-caprolactona), poli(D,L-láctido-co-caprolactona-co-glicólido), poli(D,L-láctido-co-PEO-co-D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-PPO-co-D,L-láctido), cianoacrilato de polialquilo, poliuretano, poli-L-lisina (PL), hidroxipropil metacrilato (HPMA), polietilenglicol, ácido poli-L-glutámico, ácidos (poli)hidroxi, polianhídridos, poliortoésteres, amidas de (poli)éster, poliamidas, éteres de (poli)éster, policarbonatos, polialquilenos, tales como polietileno y polipropileno, polialquilenglicoles, tales como poli(etilenglicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tales como tereftalato de (poli)etileno, alcoholes polivinílicos (PVA), éteres de polivinilo, ésteres de polivinilo, tales como acetato de (poli)vinilo, haluros de polivinilo, tales como cloruro de (poli)vinilo (PVC), polivinilpirrolidona, polisiloxanos, poliestireno (Ps ), poliuretanos, celulosas derivadas, tales como alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, nitro celulosas, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, polímeros of ácidos acrílicos, tales como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli(butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) y copolímeros y mezclas de los mismos, polidioxanona y sus copolímeros, polihidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno, polioximetileno, poloxámeros, poli(orto)ésteres, ácido (poli)butírico, ácido (poli)valérico, poli(láctido-co-caprolactona, y carbonato de trimetileno.

Los agentes terapéuticos pueden incluir, sin limitarse a, agentes citotóxicos, quimioterapéuticos y otros agentes terapéuticos. Los agentes citotóxicos pueden incluir, por ejemplo, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, teniposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracinediona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitosinoides, raquelmicina y análogos de los mismos. Los iones radiactivos también pueden usarse como agentes terapéuticos y pueden incluir, por ejemplo, yodo radiactivo, estroncio, fósforo, paladio, cesio, iridio, cobalto, itrio, samario y praseodimio. Otros agentes terapéuticos pueden incluir, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil y descarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tiotepa clorambucilo, raquelmicina, melfalán, carmustina, lomustina, ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) y cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina y doxorrubicina antibióticos (p. ej., dactinomicina, bleomicina, mitramicina y antramicina) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides).

Los agentes alteradores de la superficie pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas aniónicas (por ejemplo, albúmina de suero bovino), tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos catiónicos tales como bromuro de dimetildioctadecil-amonio), azúcares o derivados de azúcar (por ejemplo, ciclodextrina), ácidos nucleicos, polímeros (por ejemplo, heparina, polietilenglicol y poloxámero), agentes mucolíticos (por ejemplo, acetilcisteína, mugwort, bromelain, papain, cleroderendro, bromhexina, carbocisteína, eprazinona, mesna, ambroxol, sobrerol, domiodol, letosteina, stepronina, tiopronina, gelsolina, timosina p4, dornase alfa, neltenexina y erdosteina), y DNasas (por ejemplo, rhDNasa). Se puede disponer un agente alterador de la superficie dentro de una nanopartícula y/o en la superficie de una composición de nanopartículas (por ejemplo, por recubrimiento, adsorción, enlace covalente u otro proceso).

Además de estos componentes, las composiciones de nanopartículas de la descripción pueden incluir cualquier sustancia útil en composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la composición de nanopartículas puede incluir uno o más excipientes o ingredientes accesorios farmacéuticamente aceptables tales como, entre otros, uno o más disolventes, medios de dispersión, diluyentes, adyuvantes de dispersión, adyuvantes de suspensión, adyuvantes de granulación, desintegrantes, rellenos, deslizantes, vehículos líquidos, aglutinantes, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, agentes tamponantes, agentes lubricantes, aceites, conservantes y otras especies. También se pueden incluir excipientes tales como ceras, mantequillas, agentes colorantes, agentes de revestimiento, aromatizantes y agentes perfumantes. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro; Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006).

Diluyentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos. Los ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón no soluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, y/o combinaciones de estos.

Los agentes activos de superficie y/o los emulsionantes pueden incluir, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®20], polioxietileno de sorbitán [TWEENn®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [TWEEN®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [Span®60], tri estearato de sorbitán [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, PLUORINC®F 68, POLOXAMER®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc. y/o combinaciones de los mismos.

Un agente aglutinante puede ser almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,); gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (VEEGUM®), y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos, o cualquier otro agente de unión adecuado.

Los conservantes incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los ejemplos de conservantes de alcohol incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, alcohol bencílico, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los ejemplos de conservantes ácidos incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, pero no se limitan a, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (b Ha ), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON™, y/o EUXYL®.

Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido d-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato cálcico, calcio lactobionato, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato potásico, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, tampones de amino-sulfonato (p. ej., HEPES), hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico y/o combinaciones de los mismos. Los agentes lubricantes pueden seleccionarse del grupo no limitativo que consiste en estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, y combinaciones de estos.

Ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, aceites de almendra, de semilla de albaricoque, aguacate, babasu, de bergamota, de semilla de grosella negra, de borraja, de enebro, de manzanilla, de canola, de alcaravea, de carnauba, de ricino, de canela, de manteca de cacao, de coco, de hígado de bacalao, de café, de maíz, de semilla de algodón, de emu, de eucalipto, de hierba del asno, de pescado, de semilla de lino, de geranio, de calabaza, de semilla de uva, de avellana, de hisopo, de miristato de isopropilo, de jojoba, de nuez de kukui, de lavandina, de lavanda, de limón, de litsea cubeba, de nuez de macadamia, de malva, de semilla de mango, de semilla de Limnanthes alba, de visón, de nuez moscada, de oliva, de naranja, de pez naranjo, de palma, de almendra de palma, de semilla de durazno, de maní, de semilla de amapola, de semilla de calabaza, de colza, de arroz, de romero, de cártamo, de sándalo, de sasquana, gustoso, de espino negro marino, de sésamo, de manteca de karité, de silicona, de soja, de girasol, de té, de cardo, de camelia, de vetiver, de nuez y de germen de trigo, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato dietílico, dimeticona 360, simeticona, miristato isopropílico, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/ combinaciones de estos.

Composiciones

Una composición de nanopartículas puede incluir un polinucleótido de la descripción, un lípido ionizable/catiónico, un fosfolípido (tal como un lípido insaturado, por ejemplo, DOPE), un lípido PEG y un lípido estructural, como sigue.

En algunos aspectos, el componente lipídico incluye un lípido ionizable/catiónico, un fosfolípido, un lípido PEG y un lípido estructural. El componente lipídico puede incluir aproximadamente 35% en moles a aproximadamente 45 % en mol un lipido ionizable/catiónico, aproximadamente 10 % en moles a aproximadamente 20 % en moles de fosfolípido, aproximadamente 38,5 % en moles a aproximadamente 48,5 % en moles de lípidos estructurales, y aproximadamente 1,5 % en moles de lipido PEG, siempre que el % total en moles no supere el 100 %. Por ejemplo, el componente lipídico puede incluir aproximadamente 40 % en moles un lípido ionizable/catiónico, aproximadamente el 20 % en moles de fosfolípido, aproximadamente el 38,5 % en moles de lípido estructural, y aproximadamente el 1,5 % en moles de lípido PEG. En algunos aspectos, el fosfolípido puede ser DOPE y/o el lípido estructural puede ser colesterol.

En algunos aspectos, el componente de lípidos puede incluir aproximadamente el 40 % en moles un lípido ionizable/catiónico, aproximadamente el 15 % en moles de fosfolípido, aproximadamente el 43,5 % en moles de lípidos estructurales y aproximadamente el 1,5 % en moles de lípido PEG. En algunos casos, el fosfolípido puede ser DOPE. En otros aspectos, el lípido puede ser DSPC. En ciertos aspectos, el lípido estructural puede ser el colesterol.

En otros aspectos, el componente de lípido puede incluir aproximadamente el 45 % en moles a aproximadamente el 55 % en moles un lípido ionizable/catiónico, aproximadamente el 15 % en moles a aproximadamente el 25 % en moles de fosfolípido, aproximadamente el 23,5 % en moles a aproximadamente el 33,5 % en moles de lípido estructural y aproximadamente el 1,5 % en moles de lípido PEG, siempre que el % total en moles no exceda el 100 %. Por ejemplo, el componente puede incluir aproximadamente el 50 % en moles un lípido ionizable/catiónico, aproximadamente el 20 % en moles de fosfolípido, aproximadamente el 28,5 % en moles de lípido estructural y aproximadamente el 1,5 % en moles de lípido PEG. En algunos aspectos, el fosfolípido puede ser DOPE. En otros casos, el fosfolípido puede ser DSPC. En ciertos aspectos, el lípido estructural puede ser colesterol.

Una composición de nanopartículas puede diseñarse para una o más aplicaciones u objetivos específicos. Por ejemplo, se puede diseñar una composición de nanopartículas para administrar un polinucleótido de la descripción a una célula, tejido, órgano o sistema particular o grupo de los mismos en el cuerpo de un mamífero, tal como el sistema renal. Las propiedades fisicoquímicas de las composiciones de nanopartículas se pueden alterar para aumentar la selectividad para objetivos corporales particulares. Por ejemplo, el tamaño de las partículas se puede ajustar en función de los tamaños de las ventanas de diferentes órganos. El polinucleótido de la descripción incluido en una composición de nanopartículas también puede depender de la diana o las dianas de administración deseadas. Por ejemplo, un polinucleótido de la descripción puede seleccionarse para una indicación, afección, enfermedad o trastorno particular y/o para el suministro a una célula, tejido, órgano o sistema particular o grupo de los mismos (por ejemplo, suministro localizado o específico). Una composición de nanopartículas puede incluir uno o más polinucleótidos de la descripción que codifican uno o más polipéptidos de interés.

La cantidad de polinucleótido de la descripción en una composición de nanopartículas puede depender del tamaño, secuencia y otras características del polinucleótido de la descripción. La cantidad de polinucleótido de la descripción en una composición de nanopartículas también puede depender del tamaño, composición, diana deseada y otras características de la composición de nanopartículas. Las cantidades relativas de polinucleótido de la descripción y otros elementos (por ejemplo, lípidos) también pueden variar. En algunos aspectos, la relación de porcentaje en peso del componente lipídico a un polinucleótido de la descripción en una composición de nanopartículas puede ser de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 50:1, tal como 5:1,6:1, 7:1,8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, y 50:1. Por ejemplo, en la relación de porcentaje en peso del componente lipídico a un polinucleótido de la descripción puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 40:1. La cantidad de un polinucleótido de la descripción en una composición de nanopartículas se puede medir, por ejemplo, usando espectroscopía de absorción (por ejemplo, espectroscopía ultravioleta-visible).

En algunos aspectos, el uno o más polinucleótidos de la descripción, lípidos y cantidades de los mismos pueden seleccionarse para proporcionar una relación N:P específica. La relación N:P de la composición se refiere a la relación molar de átomos de nitrógeno en uno o más lípidos al número de grupos fosfato en un polinucleótido de la descripción. En general, se prefiere una relación N:P inferior. El uno o más polinucleótidos de la descripción, lípidos y cantidades de los mismos pueden seleccionarse para proporcionar una relación N:P de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, tal como 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, y 8:1. En ciertos aspectos, la relación N:P puede ser de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1. En aspectos preferidos, la relación N:P puede ser de aproximadamente 4:1. En otros aspectos, la relación N:P es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 8:1. Por ejemplo, la relación N:P puede ser de aproximadamente 5.0:1, aproximadamente 5.5:1, aproximadamente 5.67:1, aproximadamente 6.0:1, aproximadamente 6.5:1, o aproximadamente 7.0:1.

Propiedades físicas

Las características de una composición de nanopartículas dependerán de los componentes de la misma. Las características también pueden variar según el procedimiento y las condiciones de preparación de la composición de nanopartículas.

El tamaño medio de una composición de nanopartículas de la descripción puede estar entre 10 s de nm y 100 s de nm. Por ejemplo, el tamaño medio puede ser de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, tal como aproximadamente 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, o 150 nm. En algunos aspectos, el tamaño medio de una composición de nanopartícula puede ser de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 120 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 110 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 120 nm, o de aproximadamente 110 nm a aproximadamente 120 nm. En un aspecto particular, el tamaño medio puede ser de aproximadamente 90 nm. En otro aspecto particular, el tamaño medio puede ser de aproximadamente 100 nm.

Una composición de nanopartículas de la descripción puede ser relativamente homogénea. Puede usarse un índice de polidispersidad para indicar la homogeneidad de una composición de nanopartículas, por ejemplo, la distribución del tamaño de partículas de las composiciones de nanopartículas. Un índice de polidispersidad pequeño (por ejemplo, menos de 0,3) generalmente indica una distribución de tamaño de partícula estrecha. Una composición de nanopartículas de la descripción puede tener un índice de polidispersidad de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,18, tal como 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 o 0,18. En algunos aspectos, el índice de polidispersidad de una composición de nanopartículas puede ser de aproximadamente 0,13 a aproximadamente 0,17.

El potencial zeta de una composición de nanopartículas puede usarse para indicar el potencial electrocinético de la composición. Las composiciones de nanopartículas con cargas relativamente bajas, positivas o negativas, son generalmente deseables, ya que las especies más cargadas pueden interactuar indeseablemente con células, tejidos y otros elementos del cuerpo. En algunos aspectos, el potencial zeta de una composición de nanopartículas de la descripción puede ser de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 20 mV, desde aproximadamente -10 mV hasta aproximadamente 15 mV, desde aproximadamente - 10 mV hasta aproximadamente 10 mV, desde aproximadamente -10 mV hasta aproximadamente 5 mV, de aproximadamente -10 mV a aproximadamente 0 mV, desde aproximadamente -10 mV a aproximadamente -5 mV, desde aproximadamente -5 mV a aproximadamente 20 mV, desde aproximadamente -5 mV a aproximadamente 15 mV, desde aproximadamente -5 mV a aproximadamente 10 mV, desde aproximadamente -5 mV a aproximadamente 5 mV, desde aproximadamente -5 mV a aproximadamente 0 mV, desde aproximadamente 0 mV a aproximadamente 20 mV, desde aproximadamente 0 mV a aproximadamente 15 mV, desde aproximadamente 0 mV a aproximadamente 10 mV, desde aproximadamente 0 mV a aproximadamente 5 mV, desde aproximadamente 5 mV a aproximadamente 20 mV, desde aproximadamente 5 mV a aproximadamente 15 mV, o de aproximadamente 5 mV a aproximadamente 10 mV.

La eficacia de encapsulación de un polinucleótido de la descripción describe la cantidad de polinucleótido de la descripción que está encapsulado o asociado de otra manera con una composición de nanopartículas después de la preparación, en relación con la cantidad inicial proporcionada. La eficiencia de encapsulación es deseablemente alta (p. Ej., cercana al 100 %). Para las composiciones de nanopartículas de la descripción, la eficacia de encapsulación de un polinucleótido de la descripción puede ser al menos del 50 %, por ejemplo 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %. En algunos aspectos, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos del 80 %. En ciertos aspectos, la eficiencia de encapsulación puede ser al menos del 90%.

Una composición de nanopartículas de la descripción puede comprender opcionalmente uno o más revestimientos. Por ejemplo, se puede formular una composición de nanopartículas en una cápsula, película o comprimido que tenga un recubrimiento. Una cápsula, película o comprimido que incluya una composición de la descripción puede tener cualquier tamaño, resistencia a la tracción, dureza o densidad útiles.

Composiciones farmacéuticas

La presente descripción proporciona polinucleótidos alternativos capaces de expresar proteínas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir opcionalmente una o más sustancias activas adicionales terapéuticamente activas. De acuerdo con algunos aspectos, se proporciona un procedimiento para administrar composiciones farmacéuticas que incluyen un polinucleótido alternativo que codifica una o más proteínas para administrar a un sujeto que lo necesite. En algunos aspectos, las composiciones se administran a seres humanos. Para los propósitos de la presente descripción, la frase “ ingrediente activo” generalmente se refiere a una proteína, un complejo que codifica una proteína o que contiene una proteína como se describe en esta invención. Las composiciones de nanopartículas de la descripción también se pueden formular en su totalidad o en parte como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden incluir una o más composiciones de nanopartículas. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede incluir una o más composiciones de nanopartículas que incluyen uno o más polinucleótidos diferentes.

Aunque las descripciones de las composiciones farmacéuticas proporcionadas en esta invención se dirigen principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su administración a seres humanos, los expertos en la técnica entenderán que tales composiciones son generalmente adecuadas para su administración a animales de todo tipo. La modificación de las composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos con el fin de hacer las composiciones adecuadas para su administración a diversos animales se entiende bien y el farmacólogo veterinario normalmente experto puede diseñar y/o realizar tal modificación con experimentación meramente habitual, si la hubiera. Los sujetos para los cuales se contempla la administración de las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y/o primates; mamíferos, incluyendo mamíferos pertinentes en términos comerciales, tales como ganado, cerdos, caballos, ovejas, gatos, perros, ratones y/o ratas; y/o aves, incluyendo aves pertinentes en términos comerciales, tales como pollos, patos, gansos y/o pavos.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento conocido o que se desarrolle posteriormente en la técnica de la farmacología. En general, tales procedimientos de preparación incluyen la etapa de proporcionar el ingrediente activo en asociación con un excipiente y/o más ingredientes adicionales y, a continuación, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Una composición farmacéutica según la presente descripción puede prepararse, empaquetarse y/o venderse a granel, como una dosis unitaria individual y/o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Como se usa en esta invención, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que incluye una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la invención variarán conforme a la identidad, el tamaño y/o la condición del sujeto tratado y adicionalmente según la vía de administración de la composición. A modo de ejemplo, la composición puede incluir entre el 0,1 % y el 100 % (p/p) de ingrediente activo.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden incluir adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, el cual, tal como se utiliza en esta invención, incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares para la dispersión o suspensión, agentes activos de superficie, agentes isotónicos, agentes emulsificantes o espesantes, conservantes, aglutinantes sólidos y lubricantes, según se adapte a la dosificación particular deseada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) describe varios excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de los mismos. Salvo en la medida que cualquier medio vehículo convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como en la producción de cualquier efecto biológico no deseado o en la interacción de forma nociva con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, se pretende que su uso sea dentro del alcance de la presente descripción.

En algunos aspectos, un excipiente farmacéuticamente aceptable es al menos del 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % puro. En algunos aspectos, un excipiente se aprueba para su uso en humanos o para uso veterinario. En algunos aspectos, un excipiente es aprobado por la administración de alimentos y medicamentos de EE. UU.. En algunos aspectos, un excipiente tiene un grado farmacéutico. En algunos aspectos, un excipiente cumple con los estándares de la Farmacopea de EE. UU. (USP), la Farmacopea europea (EP), la Farmacopea británica y/o la Farmacopea internacional.

Excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, entre otros, diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tamponadores, agentes lubricantes, y/o aceites. Tales excipientes pueden incluirse opcionalmente en composiciones farmacéuticas. Los excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, saborizantes y/o perfumantes pueden encontrarse presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador.

Diluyentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, lactosa fosfato de sodio, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Ejemplos de agentes de granulación y/o dispersión incluyen, pero no se limitan a, almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, glicolato de almidón de sodio, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio de cationes, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), almidón de carboximetilo de sodio (glicolato de almidón de sodio), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón no soluble en agua, carboximetilcelulosa de calcio, aluminosilicato de magnesio (Veegum), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de agentes activos de superficie y/o emulsionantes incluyen, pero no se limitan a, emulsionantes naturales (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, alginato de sodio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y Veegum® [aluminosilicato de magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de peso molecular alto (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, alcohol polivinílico), carbómeros (por ejemplo, carboxi polimetileno, ácido poliacrílico, polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenano, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietileno [Tween®20], sorbitán polioxietileno [Tween®60], monooleato de sorbitán polioxietileno [Tween®80], monopalmitato de sorbitán [Span®40], monoestearato de sorbitán [Span®60], triestearato de sorbitán [Span®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [Span®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [Myrj®45], aceite de ricino hidrogenado de polioxietileno, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y Solutol®), ésteres de ácido graso de sacarosa, ésteres de ácido graso de polietilenglicol (por ejemplo, Cremophor®), éteres de polioxietileno (por ejemplo, lauril éter de polioxietileno [Brij®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, lauril sulfato de sodio, Pluronic®F 68, Poloxamer®188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, y/o combinaciones de estos.

Agentes aglutinantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón), gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melaza, lactosa, lactitol, manitol,), gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, acacia, alginato de sodio, extracto de musgo irlandés, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscara de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), aluminosilicato de magnesio (Veegum®), y arabogalactano de alerce); alginatos; óxido de polietileno; polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácidos silícicos; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y combinaciones de los mismos.

Los conservantes ejemplares pueden incluir, entre otros, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de alcohol, conservantes ácidos y/u otros conservantes. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y/o sulfito de sodio. Los agentes quelantes ejemplares incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato sódico, ácido tartárico y/o edetato trisódico. Los conservantes antimicrobianos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, fenetidina, fenetidina, imidureaxidinio, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y/o timerosal. Conservantes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y/o ácido sórbico. Los conservantes de alcohol ejemplares incluyen, pero no se limitan a, etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y/o alcohol feniletílico. Los conservantes ácidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitamina C, vitamina E, betacaroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y/o ácido fítico. Otros conservantes incluyen, entre otros, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitoluenado butilado (BHT), etilendiamina, lauril sulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato de sodio (SLES), bisulfito, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, Glydant Plus®, Phenonip®, metilparabeno, Germall®115, Germaben®II, Neolone™, Kathon™, y/o Euxyl®.

Los ejemplos de agentes tamponadores incluyen, pero no se limitan a, soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido d-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato cálcico, ácido propanoico, levulinato cálcico, ácido pentanoico, fosfato cálcico dibásico, ácido fosfórico, fosfato cálcico tribásico, hidróxido fosfato cálcico, acetato potásico, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y/o combinaciones de los mismos.

Los agentes lubricantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, betanato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, leucina, lauril sulfato de magnesio, lauril sulfato de sodio, etc., y combinaciones de los mismos.

Los aceites ejemplares incluyen, pero no se limitan a, almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de corriente negra, borraja, cade, manzanilla, canola, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez kukui, lavandina, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macademia, malva, semilla de mango, semilla de espuma de prado, visón, nuez moscada, aceituna, naranja, reloj anaranjado, palma, almendra de palma, almendra de melocotón, maní, semilla de amapola, semilla de calabaza, colza, salvado de arroz, romero, cártamo, sándalo, sasquana, sabroso, espino amarillo, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol de té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y aceites de germen de trigo. Los ejemplos de aceites incluyen, pero no se limitan a, estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleílico, aceite de silicona y/o combinaciones de los mismos.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral y parenteral incluyen, pero no se limitan a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y/o elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los ingredientes activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, etil acetato, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en concreto aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes de suspensión y emulsionantes, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes. En determinados casos para administración parenteral, las composiciones se mezclan con agentes solubilizantes tales como Cremophor®, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y/o combinaciones de los mismos.

Es posible formular las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, según la técnica conocida con agentes humectantes, dispersantes y/o de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión y/o emulsión inyectable estéril en un diluyente y/o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución de 1,3-butanodiol. Entre los solventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución isotónica de cloruro de sodio. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un solvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias y/o mediante la incorporación de agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se puedan disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Para prolongar el efecto de un ingrediente activo, a menudo es deseable disminuir la absorción del ingrediente activo por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. Entonces, la velocidad de absorción del fármaco depende de su velocidad de disolución, la que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se logra al disolver o suspender el fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices de microcápsulas de los fármacos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. En función de la relación del fármaco respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular utilizado se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones de depósito inyectables se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.

Las composiciones para la administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que pueden prepararse mezclando las composiciones con excipientes no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio, los cuales son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a temperatura corporal y, por lo tanto, se derriten en el recto o cavidad vaginal y liberan el ingrediente activo.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, pastillas, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólida, un ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable inerte, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o rellenos o extensores (por ejemplo, almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido salicílico) ligantes, (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sucrosa y acacia) humectantes (por ejemplo, glicerol) agentes desintegrantes (por ejemplo, agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico) agentes retardantes de la disolución (por ejemplo, parafina) acelerantes de la absorción (por ejemplo, compuestos de amonio cuaternario) agentes humectantes (por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol) absorbentes (por ejemplo, caolín y arcilla de bentonita) y lubricantes (por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio) y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, comprimidos y pastillas, la forma de dosificación puede incluir agentes tamponadores.

Las composiciones sólidas de un tipo similar se pueden empelar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden incluir agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el ingrediente o ingredientes activos solo, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. Las composiciones sólidas de un tipo similar se pueden empelar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular.

Las formas de dosificación para administración tópica y/o transdérmica de una composición incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, atomizadores, inhaladores y/o parches. Generalmente, el ingrediente activo se combina en condiciones estériles con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier conservante y/o amortiguador necesario, según se requiera. De manera adicional, la presente descripción contempla el uso de parches transdérmicos, que presentan la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas de dosificación pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo y/o dispersando el compuesto en el medio apropiado. Alternativa o adicionalmente, la relación se puede controlar ya sea proporcionando una membrana de control de la relación y/o mediante la dispersión del compuesto en un gel y/o una matriz polimérica.

Los dispositivos adecuados para su uso en la administración intradérmica de composiciones farmacéuticas descritas en esta invención incluyen dispositivos de aguja corta, tales como los que se describen en las patentes de EE. UU. N. ° 4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537; 5.015.235; 5.141.496; y 5.417.662. Las composiciones intradérmicas se pueden administrar mediante dispositivos que limitan la extensión de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los que se describen en la publicación PCT WO 99/34850 y equivalentes funcionales de estos. Son adecuados los dispositivos para inyección a chorro que administran las composiciones líquidas a la dermis mediante un inyector a chorro de líquidos y/o mediante una aguja que perfora la capa córnea y que produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos para inyección a chorro que se describen, por ejemplo, en los documentos de patente de EE. UU. N. ° 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220; 5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; PCT publicaciones N. ° WO 97/37705 y WO 97/13537. Los dispositivos de suministro de polvo balístico/de partículas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas exteriores de la piel a la dermis son adecuadas. Alternativa o adicionalmente, se pueden usar jeringas convencionales en el método mantoux clásico de administración intradérmica.

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen, pero no se limitan a, preparaciones líquidas y/o semilíquidas tal como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua y/o de agua en aceite tales como cremas, ungüentos y/o pastas y/o soluciones y/o suspensiones. Las formulaciones administrables tópicamente pueden comprender, por ejemplo, de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración de ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el solvente. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.

Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede incluir partículas secas que incluyen el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 7 nm o de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 6 nm. De manera conveniente, tales composiciones se encuentran en forma de polvos secos para su administración con un dispositivo que incluye un depósito de polvo seco al que es posible dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o utilizar un recipiente de distribución de polvo/solvente autopropulsor tal como un dispositivo que incluye el ingrediente activo disuelto y/o suspendido en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente sellado. Tales polvos incluyen partículas donde al menos el 98 % de las partículas en peso tienen un diámetro superior a 0,5 nm y al menos el 95 % de las partículas en número tienen un diámetro inferior a 7 nm. Alternativamente, al menos el 95 % de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 1 nm y al menos el 90 % de las partículas en número tienen un diámetro menor de 6 nm. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente de polvo fino sólido tal como azúcar y se proporcionan convenientemente en forma de dosis unitaria.

Los propulsores de bajo punto de ebullición generalmente incluyen propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición por debajo de los 65 °F a presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50 % al 99,9 % (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir del 0,1 % al 20 % (p/p) de la composición. Un propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o aniónico sólido y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partícula del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).

Las composiciones farmacéuticas formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar un ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Tales formulaciones pueden prepararse, empaquetarse y/o venderse como soluciones y/o suspensiones acuosas y/o alcohólicas diluidas, opcionalmente estériles, que incluyen ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Tales formulaciones pueden incluir además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, un agente aromatizante tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tamponador, un agente tensioactivo y/o un conservante tal como metilhidroxibenzoato. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro medio en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm.

Las formulaciones descritas en esta invención como útiles para la administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica. Otra formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de aproximadamente 0,2 pm a 500 pm. Tal formulación se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden, por ejemplo, incluir desde aproximadamente un 0,1 % (p/p) hasta un 100 % (p/p) de ingrediente activo, y pueden incluir uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración bucal. Tales formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas preparadas usando procedimientos convencionales, y pueden, por ejemplo, de 0,1 % a 20 % (p/p) de ingrediente activo, incluyendo el resto una composición que se disuelve por vía oral y/o degradable y, opcionalmente, uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión aerosolizada y/o atomizada que comprende un ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo, aerosolizadas y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o gotas en el intervalo de aproximadamente 0,1 nm a aproximadamente 200 nm, y pueden comprender además uno o más de los ingredientes adicionales descritos en esta invención.

Se puede preparar, empaquetar y/o vender una composición farmacéutica en una formulación adecuada para administración oftálmica. Tales formulaciones pueden estar, por ejemplo, en forma de gotas para los ojos que incluyen, por ejemplo, una solución y/o suspensión al 0,1/1,0 % (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso o aceitoso. Tales gotas pueden incluir además agentes tamponantes, sales y/o uno o más de cualquier ingrediente adicional descrito en esta invención. Otras formulaciones que se pueden administrar de forma oftálmica útiles pueden incluir aquellas que incluyen el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación liposomal. Se contempla que las gotas para los oídos y/o las gotas oftálmicas quedan comprendidas en el alcance de la presente invención.

Es posible encontrar consideraciones generales de la formulación y/o fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006.

Adm inistración

La presente descripción proporciona procedimientos que incluyen la administración de polinucleótidos de acuerdo con la presente descripción a un sujeto que lo necesite. Los polinucleótidos, o composiciones farmacéuticas, de imágenes, diagnóstico o profilácticos de los mismos, pueden administrarse a un sujeto utilizando cualquier cantidad y cualquier ruta de administración efectiva para prevenir, tratar, diagnosticar o visualizar por imágenes una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, una enfermedad, trastorno y/o afección relacionados con los déficits de memoria de trabajo). La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y la condición general del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la composición particular, su modo de administración y su modo de actividad. Las composiciones de acuerdo con la presente descripción se formulan típicamente en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. Sin embargo, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de la presente descripción será decidido por el médico responsable dentro del alcance del buen criterio médico. El nivel específico de dosis terapéuticamente eficaz, efectiva profilácticamente o de imagen adecuada para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos usados en combinación con, o simultáneamente al compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

Polinucleótidos que se administrarán y/o sus composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes pueden administrarse a animales, tales como mamíferos (por ejemplo, seres humanos, animales domésticos, gatos, perros, ratones, ratas, etc.). En algunos aspectos, sus composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes se administran a seres humanos.

Polinucleótidos que se administrarán y/o sus composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes de acuerdo con la presente descripción pueden administrarse por cualquier vía. En algunos aspectos, los polinucleótidos y/o las composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes de los mismos se administran mediante una o más de una variedad de rutas, que incluyen oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópico (p. Ej., mediante polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones, y/o gotas), mucosas, nasales, bucales, enterales, vítreas, intratumorales, sublinguales; por instilación intratraqueal, instilación bronquial, y/o inhalación; como aerosol oral, aerosol nasal, y/o aerosol, y/o a través de un catéter en la vena porta. En algunos aspectos, polinucleótidos, y/o sus composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes se administran mediante inyección intravenosa sistémica. En aspectos específicos, polinucleótidos y/o sus composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes pueden administrarse por vía intravenosa y/u oralmente. En aspectos específicos, polinucleótidos, y/o las composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes de los mismos pueden administrarse de una manera que permita que el polinucleótido cruce la barrera hematoencefálica, la barrera vascular u otra barrera epitelial.

La presente descripción abarca la administración de polinucleótidos y/o composiciones farmacéuticas, profilácticas, diagnósticas o de formación de imágenes de los mismos, por cualquier ruta apropiada teniendo en cuenta los avances probables en las ciencias de la prestación de fármacos.

En general, la vía de administración más apropiada dependerá de una variedad de factores, incluida la naturaleza del polinucleótido, incluidos los polinucleótidos asociados con al menos un agente que se va a administrar (por ejemplo, su estabilidad en el entorno del tracto gastrointestinal, el torrente sanguíneo, etc.), la condición del paciente (p. Ej., si el paciente es capaz de tolerar vías de administración particulares), etc. La presente descripción abarca la administración de las composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes por cualquier vía apropiada teniendo en cuenta los posibles avances en las ciencias de la administración de fármacos.

En ciertos aspectos, las composiciones de acuerdo con la presente descripción se pueden administrar en niveles de dosificación suficientes para administrar de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, del peso corporal del sujeto por día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico, diagnóstico, profiláctico o de formación de imágenes deseado. La dosificación deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tercer día, semanalmente, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. En ciertos aspectos, la dosificación deseada puede administrarse utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).

Los polinucleótidos pueden usarse en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, profilácticos, de diagnóstico o de formación de imágenes. Por “en combinación con”, no pretende implicar que los agentes deben administrarse al mismo tiempo y/o que deben formularse para su administración conjunta, aunque estos procedimientos de administración están dentro del alcance de la presente descripción. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente con, antes o después de, uno o más de otros procedimientos terapéuticos o médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o según un calendario determinado para ese agente. En algunos aspectos, la presente descripción abarca la administración de composiciones farmacéuticas, profilácticas, de diagnóstico o de formación de imágenes en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo.

Se apreciará además que los agentes activos terapéutica, profiláctica, diagnóstica o de formación de imágenes utilizados en combinación pueden administrarse juntos en una sola composición o administrarse por separado en diferentes composiciones. En general, se espera que los agentes adicionales en combinación se utilicen a niveles que no excedan los niveles en los que se utilizan individualmente. En algunos aspectos, los niveles utilizados en combinación serán inferiores a los utilizados individualmente.

La combinación particular de terapias (productos terapéuticos o procedimientos) para emplear en un régimen de combinación deberá tomar en cuenta la compatibilidad de los productos terapéuticos y/o los procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se va a conseguir. También se reconocerá que las terapias empleadas pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, una composición útil para tratar el cáncer de acuerdo con la presente descripción puede administrarse simultáneamente con un agente quimioterapéutico), o pueden lograr diferentes efectos (por ejemplo, control de cualquier efecto adverso).

Kits

La presente descripción proporciona una variedad de kits para llevar a cabo de manera conveniente y/o efectiva los procedimientos de la presente descripción. Comúnmente, los kits incluirán números y/o cantidades suficientes de componentes para permitir que un usuario realice múltiples tratamientos de un sujeto o sujetos y/o para llevar a cabo múltiples experimentos.

En un aspecto, la descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que incluyen un primer polinucleótido aislado que incluye una región traducible y una alteración de nucleótidos, donde el polinucleótido es capaz de evadir 0 evitar la inducción de una respuesta inmune innata de una célula en la que el primer polinucleótido aislado se presenta, embalaje e instrucciones.

En un aspecto, la descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que incluyen: un primer polinucleótido alternativo aislado que incluye una región traducible, proporcionado en una cantidad eficaz para producir una cantidad deseada de una proteína codificada por la región traducible cuando se introduce en una célula diana; un segundo polinucleótido que incluye un polinucleótido inhibidor, proporcionado en una cantidad eficaz para inhibir sustancialmente la respuesta inmune innata de la célula; y embalaje e instrucciones.

En un aspecto, la descripción proporciona kits para la producción de proteínas, que incluyen un primer polinucleótido aislado que incluye una región traducible y una alteración de nucleósido, en los que el polinucleótido presenta una degradación reducida por una nucleasa celular, y embalaje e instrucciones.

En un aspecto, la descripción proporciona kits para la producción de proteínas, incluido un primer polinucleótido aislado, incluida una región traducible y al menos dos alteraciones de nucleósidos diferentes, donde el polinucleótido exhibe la degradación reducida por una nucleasa celular, y embalaje e instrucciones.

En un aspecto, la descripción proporciona kits para la producción de proteínas, incluido un primer polinucleótido aislado, incluida una región traducible y al menos una alteración de nucleósidos, en la que el polinucleótido exhibe la degradación reducida por una nucleasa celular; un segundo polinucleótido que incluye un polinucleótido inhibitorio; y embalaje e instrucciones.

En otro aspecto, la descripción proporciona composiciones para la producción de proteínas, que incluyen un primer polinucleótido aislado que incluye una región traducible y una alteración de nucleósido, donde el polinucleótido exhibe una degradación reducida por una nucleasa celular, y una célula de mamífero adecuada para la traducción de la región traducible del primer polinucleótido.

Definiciones

Términos químicos: A continuación se proporciona la definición de varios términos químicos desde “acilo” hasta “tiol”.

El término “acilo”, tal como se usa en esta invención, representa un grupo hidrógeno o alquilo (por ejemplo, un grupo haloalquilo), tal como se definen en esta invención, que está acoplado al grupo molecular original a través de un grupo carbonilo, tal como se define en esta invención, y un ejemplo de este es formilo (es decir, un grupo carboxialdehído), acetilo, propionilo, y butanoilo. Los ejemplos de grupos acilo no sustituidos incluyen de 1 a 7, de 1 a 11, o de 1 a 21 carbonos. En algunos aspectos, el grupo alquilo se sustituye aún más con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “acilamino”, como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular parental a través de un grupo amino, como se define en esta invención (es decir, — N(RN1)-C(O)-R, donde R es H o C1-6, C1-10 opcionalmente sustituido, o un grupo alquilo C1-20 (por ejemplo, haloalquilo) y RN1 es como se define en esta invención). Los ejemplos de grupos acilamino no sustituidos incluyen de 1 a 41 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7, de 1 a 13, de 1 a 21, de 2 a 7, de 2 a 13, de 2 a 21 o de 2 a 41 carbonos) . En algunos aspectos, el grupo alquilo está además sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención y/o el grupo amino es — NH2 o — NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, arilo, acilo (por ejemplo, acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención), o alcoxicarbonilalquilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo, o arilo.

El término “acilaminoalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido a un grupo amino que está unido a su vez al grupo molecular principal a través de un grupo alquilo, como se define en esta invención (es decir, — alquilo-N(RN1)-C(O)-R, donde R es H o un C1-6 opcionalmente sustituido, C1-10, o un grupo alquilo C1-20 (por ejemplo, haloalquilo) y RN1 es como se define en esta invención). Los ejemplos de grupos acilamino no sustituidos incluyen de 1 a 41 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7, de 1 a 13, de 1 a 21, de 2 a 7, de 2 a 13, de 2 a 21 o de 2 a 41 carbonos) . En algunos aspectos, el grupo alquilo está además sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención y/o el grupo amino es — NH2 o — NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, arilo, acilo (por ejemplo, acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención), o alcoxicarbonilalquilo, y cada RN2 puede ser H, alquilo, o arilo.

El término “aciloxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de oxígeno (es decir, — OC (O) -R, donde R es H o un C 1 -6 opcionalmente sustituido, grupo alquilo C 1-10 o alquilo C1-20. Los grupos aciloxi no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7 o de 1 a 11 carbonos). En algunos aspectos, el grupo alquilo se sustituye aún más con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “aciloxialalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, unido a un átomo de oxígeno que a su vez está unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquilo (es decir, -alquilo-O-C(O)-R, donde R es H o un C1-6 opcionalmente sustituido, C1-10, o un grupo alquilo C1-20). Los grupos aciloxialquilo no sustituidos ejemplares incluyen de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 7 o de 1 a 11 carbonos). En algunos aspectos, el grupo alquilo está, de forma independiente, sustituido además con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “alcarilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo arilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Grupos alcarilo no sustituidos ejemplares son de 7 a 30 átomos de carbono (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tales como arilo C6-10 alquilo C1-6, arilo C6-10 alquilo C1-10, o arilo alquilo C1-20 C6-10). En algunos aspectos, el alquileno y el arilo se pueden sustituir aún más con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se definen en esta invención para los grupos respectivos.

El término “alcicloalquilo” representa un grupo cicloalquilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención (por ejemplo, un grupo alquileno de 1 a 4, de 1 a 6, de 1 a 10, o de 1 a 20 carbonos). En algunos aspectos, el alquileno y el cicloalquilo se pueden sustituir aún más con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituidos como se definen en esta invención para el grupo respectivo.

El término “alquenilo”, como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de, a menos que se especifique lo contrario, de 2 a 20 carbonos (por ejemplo, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen uno o más enlaces dobles de carbono-carbono y se ejemplifica por etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-butenilo y 2-butenilo. Los alquenilos incluyen isómeros tanto cis como trans. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes que se seleccionan, independientemente, de amino, arilo, cicloalquilo o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los grupos sustituyentes alquilo ejemplares descrito en esta invención.

El término “alquenileno”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo divalente derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno, y está ejemplificado por etenileno e isopropenileno. El término «Cx-y alquileno» representa grupos alquileno que tienen entre x e y carbonos. Los valores ejemplares para x son 2, 3, 4, 5 y 6, y los valores ejemplares para son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 ( por ejemplo, C2-6, C2-10, o alquenileno C2-20). En algunos aspectos, el alquenileno se puede sustituir aún más con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se define en esta invención para un grupo alquenilo. El término “alquenileno ramificado”, como se usa en esta invención, se refiere a un grupo alquenilo multivalente derivado de la eliminación de más de dos átomos de hidrógeno.

El término “alqueniloxi” representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo alquenilo C2-20 (por ejemplo, C2-6 o alquenilo C2-10, a menos que se especifique lo contrario. Los ejemplos de grupos alqueniloxi incluyen eteniloxi y propeniloxi. En algunos aspectos, el grupo alquenilo se puede sustituir aún más con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “alqueteroarilo” se refiere a un grupo heteroarilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Ejemplos de grupos alqueteroarilo no sustituidos son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13 o de 2 a 12 carbonos, tales como heteroarilo C1-12 alquilo C1-6, heteroarilo C1-12 alquilo C1-10, o heteroarilo C1-12 alquilo C1-20). En algunos aspectos, el alquileno y el heteroarilo se pueden sustituir aún más con los grupos sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se definen en esta invención para el grupo respectivo. Los grupos alqueteroarilo son un subconjunto de grupos alqueterociclilo.

El término “alqueterociclilo” representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo alquileno, como se define en esta invención. Los grupos de alqueterociclilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 32 carbonos (por ejemplo, de 2 a 22, de 2 a 18, de 2 a 17, de 2 a 16, de 3 a 15, de 2 a 14, de 2 a 13, o de 2 a 12 carbonos, tales como heterociclilo C1-12 alquilo C1-6, heterociclilo C1-12 alquilo C1-10, o heterociclilo C1-12 alquilo C1-20). En algunos aspectos, el alquileno y el heterociclilo se pueden sustituir aún más con los grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se definen en esta invención para el grupo respectivo.

El término “alcoxi” representa un sustituyente químico de la fórmula -OR, donde R es un grupo alquilo C1-20 (por ejemplo, C1-6 o alquilo C1-10), a menos que se especifique lo contrario. Los grupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, etoxi, propoxi (p. Ej., n-propoxi e isopropoxi) y t-butoxi. En algunos aspectos, el grupo alquilo se puede sustituir aún más con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (por ejemplo, hidroxi o alcoxi).

El término “alcoxialcoxi” representa un grupo alcoxi que está sustituido con un grupo alcoxi. Grupos alcoxialcoxi no sustituidos ejemplares incluyen entre 2 a 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, tales como alcoxi C1-6 alcoxi-C1-6, alcoxi C1-10 alcoxi-C1-10, o alcoxi C1-20 alcoxi-C1-20). En algunos aspectos, cada grupo alcoxi se puede sustituir aún más con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se definen en esta invención.

El término “alcoxialquilo” representa un grupo alquilo que está sustituido con un grupo alcoxi. Los grupos alcoxialquilo no sustituido ejemplar incluyen entre 2 a 40 carbonos (por ejemplo, de 2 a 12 o de 2 a 20 carbonos, tales como alquilo C1-6 alcoxi-C1-6, alquilo C1-10 alcoxi-C1-10, o alquilo C1-20 alcoxi-C1-20). En algunos aspectos, el alquilo y la alcoxi se pueden sustituir aún más con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se definen en esta invención para el grupo respectivo.

El término “alcoxicarbonilo”, como se usa en esta invención, representa un alcoxi, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de carbonilo (por ejemplo, -C(O)-OR, donde R es H o un C1-6, C1-10 opcionalmente sustituido, o un grupo alquilo C1-20). El alcoxicarbonilo no sustituido ejemplar incluye de 1 a 21 carbonos (por ejemplo, de 1 a 11 o de 1 a 7 carbonos). En algunos aspectos, el grupo alcoxi está sustituido además con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención.

El término “alcoxicarbonilacilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo acilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -C(O) -alquilo-C(O)-OR, donde R es un C1-6 opcionalmente sustituido, C1-10, o un grupo alquilo C1-20). El alcoxicarbonilacilo no sustituido ejemplar incluye de 3 a 41 carbonos (por ejemplo, de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 17, de 3 a 21, o de 3 a 31 carbonos, tales como acilo C1-6 alcoxicarbonil-C1-6, acilo C1-10 alcoxicarbonil-C1-10, o acilo C1-20 alcoxicarbonil-C1-20). En algunos aspectos, cada grupo alcoxi y alquilo está además sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi) para cada grupo.

El término “alcoxicarbonilalcoxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -O-alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-6, C1-10, o C1-20 opcionalmente sustituido). El alcoxicarbonilalcoxi no sustituido ejemplar incluye de 3 a 41 carbonos (por ejemplo, de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 21, o de 3 a 31 carbonos, tales como alcoxi C1-6 alcoxicarbonil-C1-6, alcoxi C1-10 alcoxicarbonil-C1-10, o alcoxi C1-20 alcoxicarbonil-C1-20). En algunos aspectos, cada grupo alcoxi está aún más sustituido independientemente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes, como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “alcoxicarbonilalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituido). El alcoxicarbonilalquilo no sustituido ejemplar incluye de 3 a 41 carbonos (por ejemplo, de 3 a 10, de 3 a 13, de 3 a 17, de 3 a 17, de 3 a 21, o de 3 a 31 carbonos, tales como alquilo C1-6 alcoxicarbonil-C1-6, alquilo C1-10 alcoxicarbonil-C1-10, o alquilo C1-20 alcoxicarbonil-C1-20). En algunos aspectos, cada grupo alquilo y alcoxi se sustituye además de forma independiente con sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “alcoxicarbonilalquenilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquenilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituido). El alcoxicarbonilalquenilo no sustituido ejemplar incluye de 4 a 41 carbonos (por ejemplo, de 4 a 10, de 4 a 13, de 4 a 17, de 4 a 21, o de 4 a 31 carbonos, tales como alquenilo C1-6 alcoxicarbonil-C2-6, alquenilo C1-10 alcoxicarbonil-C2-10, o alquenilo C1-20 alcoxicarbonil-C2-20). En algunos aspectos, cada grupo alquilo, alquenilo y alcoxi se sustituye además de manera independiente con sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “alcoxicarbonilalquinilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, que está sustituido con un grupo alcoxicarbonilo, como se define en esta invención (por ejemplo, -alquinilo-C(O)-OR, donde R es un grupo alquilo C1-20, C1-10, o C1-6 opcionalmente sustituido). El alcoxicarbonilalquinilo no sustituido ejemplar incluye de 4 a 41 carbonos (por ejemplo, de 4 a 10, de 4 a 13, de 4 a 17, de 4 a 21, o de 4 a 31 carbonos, tales como alquinilo C1-6 alcoxicarbonil-C2-6, alquinilo C1-10 alcoxicarbonil-C2-10, o alquinilo C1-20 alcoxicarbonil-C2-20). En algunos aspectos, cada grupo alquilo, alquinilo y alcoxi se sustituye adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se describe en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “alquilo”, como se usa en esta invención, incluye grupos saturados tanto de cadena lineal como de cadena ramificada de 1 a 20 carbonos (por ejemplo, de 1 a 10 o de 1 a 6), a menos que se especifique lo contrario. Los grupos alquilo se ejemplifican por metilo, etilo, n- e iso-propilo, n-, sec-, iso- y tert-butilo y neopentilo, y pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) C1-6 alcoxi; (2) C1-6 alquilsulfinil; (3) amino, como se define en esta invención (por ejemplo, amino no sustituido (es decir, -NH2) o un amino sustituido (es decir, -N(RN1)2, donde RN1 es como se define para amino); (4) C6-10 arilo-C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi, opcionalmente sustituido con un grupo de protección O; (9) nitro; (10) oxo (por ejemplo, carboxialdehído o acilo); (11) C1-7 espirociclil; (12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) -CO2RA', opcionalmente sustituido con un grupo de protección O-y donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) C1-20 alquilo (por ejemplo, C1-6 alquilo), (b) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6 ), (c) arilo C6-10 , (d) hidrógeno, (e) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f) alquilo amino-C1-20 , (g) polietilenglicol de (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', en el que s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y S3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o alquilo C1-20 , y (h) amino-polietilenglicol de -NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)si(CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero del 1 al 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero del 0 al 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno u opcionalmente alquilo C1-6 sustituido; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada uno de RB' y RC' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6 , (c) arilo C6-10 , y (d) C6-10 arilo C1-6 alquilo; (16) -SO2RD', donde se selecciona RD' del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6 , (b) arilo C6-10 , (c) C6-10 arilo C1-6 alquilo, y (d) hidroxi; (17) -SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6 , (c) arilo C6-10 y (d) C6-10 arilo C1-6 alquilo; (18) -C(O)RG', donde RG' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6 ), (b) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6 ), (c) arilo C6-10 , (d) hidrógeno, (e) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f) alquilo aminoC1-20 , (g) polietilenglicol de - (CH2)s2(OCH2CH2)s1 (CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o alquilo C1-20 , y (h) aminopolietilenglicol de - Nr N1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (19) -NRH'C(O)RI', en el que RH' se selecciona del grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) alquilo C1-6 , y R1 se selecciona del grupo que consiste en (a2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6 ), (b2) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6 ), (c2) arilo C6-10 , (d2) hidrógeno, (e2) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f2) alquilo amino-C1-20 , (g2) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10 ), y R' es H o alquilo C1-20 , y (h2) amino-polietilenglicol de - n RN1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona del grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) alquilo C1-6 , y RK' se selecciona del grupo que consiste en (a2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6 ), (b2) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6 ), (c2) arilo C6-10 , (d2) hidrógeno, (e2) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f2) alquilo amino-C1-20 , (g2) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10 ), y R' es H o alquilo C1-20 , y (h2) amino-polietilenglicol de - n RN1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y (21) amidina. En algunos aspectos, cada uno de estos grupos se puede sustituir además como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un alcarilo C1 puede sustituirse adicionalmente con un grupo oxo para proporcionar el sustituyente ariloilo respectivo.

El término “alquileno”, como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarbono divalente saturado derivado de un hidrocarbono saturado de cadena lineal o ramificada mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno, y se ejemplifica por metileno, etileno e isopropileno. El término «Cx-y alquileno» representa grupos alquileno que tienen entre x e y carbonos. Los valores ejemplares para x son 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y valores ejemplares para y son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, alquileno C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, o C2-20). En algunos aspectos, el alquileno se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se definen en esta invención para un grupo alquilo.

El término “alquinileno”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo divalente derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno. El término «Cx-y alquinileno» representa grupos alquinileno que tienen entre x e y carbonos. Los valores ejemplares para x son 2, 3, 4, 5 y 6, y valores ejemplares para y son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, alquinileno C2-6, C2-10, o C2-20). En algunos aspectos, el alquinileno se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se definen en esta invención para un grupo alquinilo. El término “alquinileno ramificado” como se usa en esta invención, se refiere a un grupo alquinilo multivalente derivado de la eliminación de más de dos átomos de hidrógeno.

El término “alquilsulfinilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo unido al grupo molecular de origen a través de un grupo -S (O) -. Los ejemplos de grupos acilo no sustituidos incluyen de 1 a 6, de 1 a 10, o de 1 a 20 carbonos. En algunos aspectos, el grupo alquilo se puede sustituir además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.

El término “alquilsulfinilalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo alquilsulfinilo. Los grupos alquilsulfinilalquilo no sustituidos ejemplares son de 2 a 12, de 2 a 20 o de 2 a 40 carbonos. En algunos aspectos, cada grupo alquilo se puede sustituir además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.

El término “alquinilo”, como se usa en esta invención, representa grupos monovalentes de cadena lineal o ramificada de 2 a 20 átomos de carbono (por ejemplo, de 2 a 4, de 2 a 6 o de 2 a 10 carbonos) que contienen un triple enlace carbono-carbono y está ejemplificado por etinilo y 1-propinilo. Los grupos alquinílicos pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes seleccionados, independientemente, desde arilo, cicloalquilo o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo), como se define en esta invención, o cualquiera de los grupos de sustituyentes alquilo ejemplares descritos en esta invención.

El término “alquiniloxi” representa un sustituyente químico de la fórmula -OR, donde R es un grupo alquinilo C2-20 (por ejemplo, alquinilo C2-6 o C2-10), a menos que se especifique lo contrario. Los ejemplos de grupos alquiniloxi incluyen etiniloxi y propiniloxi. En algunos aspectos, el grupo alquinilo se puede sustituir además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención (por ejemplo, un grupo hidroxi).

El término “amidina”, como se usa en esta invención, representa un grupo — C(=NH)NH2.

El término “amino”, como se usa en esta invención, representa — N(RN1)2, donde cada RN1 es, independientemente, H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2 , SO2RN2, SORN2, un grupo de protección N, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, alcarilo, cicloalquilo, alcicloalquilo, carboxialquilo (p. Ej., opcionalmente sustituido con un grupo de protección O, tal como grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos o cualquiera de los descritos en esta invención), sulfoalquilo, acilo (p. Ej., acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención), alcoxicarbonilalquilo (p. Ej., opcionalmente sustituido con un grupo de protección O, tal como grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos o cualquiera de los descritos en esta invención), heterociclilo (p. Ej., heteroarilo), o alqueterociclilo (p. Ej., alqueteroarilo), en el que cada uno de estos grupos RN1 enumerados puede estar opcionalmente sustituido, como se define en esta invención para cada grupo; o dos RN1 se combinan para formar un heterociclilo o un grupo protector de N, y en el que cada R N2 es, independientemente, H, alquilo o arilo. Los grupos amino de la descripción pueden ser un amino no sustituido (es decir, -NH2)o un amino sustituido (es decir, - N (RN1)2). En un aspecto preferido, amino es — NH2 o — NHRN1, donde RN1 es, independientemente, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, alquilo, carboxialquilo, sulfoalquilo, acilo (p. Ej., acetilo, trifluoroacetilo u otros descritos en esta invención), alcoxicarbonilalquilo (p. Ej., t-butoxicarbonilalquilo) o arilo, y cada RN2 puede ser H,alquilo C 1-20 (p. Ej., alquiloc 1-6) o ariloC6-10.

El término “aminoácido”, como se describe en esta invención, se refiere a una molécula que tiene una cadena lateral, un grupo amino y un grupo ácido (por ejemplo, un grupo carboxi de — CO2H o un grupo sulfo de — SO3H), en el que el aminoácido está unido al grupo molecular principal mediante la cadena lateral, el grupo amino o el grupo ácido (por ejemplo, la cadena lateral). En algunos aspectos, el aminoácido está unido al grupo molecular principal mediante un grupo carbonilo, donde la cadena lateral o el grupo amino está unido al grupo carbonilo. Las cadenas laterales ejemplares incluyen un alquilo, arilo, heterociclilo, alcarilo, alqueterociclilo, aminoalquilo, carbamoilalquilo y carboxialquilo. Los aminoácidos ejemplares incluyen alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, hidroxinorvalina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, norvalina, ornitina, fenilalanina, prolina, pirrolisina, selenocisteína, serina, taurina, treonina, triptófano, tirosina, y valina. Los grupos de aminoácidos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno, dos, tres o, en el caso de grupos de aminoácidos de dos carbonos o más, cuatro sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) alcoxi C1-6; (2) alquilsulfinilo C1-6; (3) amino, como se define en esta invención (por ejemplo, amino no sustituido (es decir, -NH2) 0 un amino sustituido (es decir, -N (RN1)2, donde RN1 es como se define para amino); (4) C6-10 aril- C1-6 alcoxi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9 heterociclil)oxi; (8) hidroxi; (9) nitro; (10) oxo (por ejemplo, carboxialdehído o acilo); (11) C1-7 espirociclilo; (12) tioalcoxi; (13) tiol; (14) -CO2RA', donde se selecciona RA' del grupo que consiste en (a) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6), (b) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6), (c) arilo C6-10, (d) hidrógeno, (e) alquilo C6-10 arilo C1-6, (f) alquilo amino-C1-20, (g) polietilenglicol de -(C H 2)s2(OCH2CH2)s1 (CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es H o alquilo C1-20, y (h) aminopolietilenglicol de - Nr N1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (15) -C(O)NRB'RC', donde cada uno de RB' y RC' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6, (c) arilo C6-10, y (d) alquilo C1-6 arilo C6-10; (16) -SO2RD', donde RD' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6 (b) arilo C6-10, (c) alquilo C6-10 arilo C1-6, y (d) hidroxi; (17) - SO2NRE'RF', donde cada uno de RE' y RF' se selecciona, de forma independiente, del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6, (c) arilo C6-10 y (d) alquilo C1-6 aril C6-10; (18) -C(O)RG', donde RG' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6), (b) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6), (c) arilo C6-10, (d) hidrógeno, (e) alquilo C1-6 aril C6-10, (f) alquilo amino-C1-20, (g) polietilenglicol de (CH2)s2(OCH2CH2)s1 (CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y R' es el alquilo H o C1-20, y (h) aminopolietilenglicol de - Nr N1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (19) -NRH'C(O)RI', donde RH' se selecciona del grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) alquilo C1-6, y R1 se selecciona del grupo que consiste en (a2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6), (b2) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6), (c2) arilo C6-10, (d2) hidrógeno, (e2) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f2) alquilo aminoC1-20, (g2) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10 ), y R' es alquilo H o C1-20, y (h2) amino-polietilenglicol de - n RN1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; (20) -NRJ'C(O)ORK', donde RJ' se selecciona del grupo que consiste en (a1) hidrógeno y (b1) alquilo C1-6, y RK' se selecciona del grupo que consiste en (a2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6), (b2) alquenilo C2-20 (por ejemplo, alquenilo C2-6), (c2) arilo C6-10, (d2) hidrógeno, (e2) C6-10 arilo C1-6 alquilo, (f2) alquilo amino-C1-20, (g2) polietilenglicol de -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10 ), y R' es alquilo H o C1-20, y (h2) amino-polietilenglicol de - n RN1 (CH2)s2(CH2CH2O)s1 (CH2)s3NRN1, donde s1 es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, de 1 a 6 o de 1 a 4), cada uno de los s2 y s3, independientemente, es un número entero de 0 a 10 (por ejemplo, de 0 a 4, de 0 a 6, de 1 a 4, de 1 a 6, o de 1 a 10), y cada RN1 es, independientemente, hidrógeno o alquilo C1-6 opcionalmente sustituido; y (21) amidina. En algunos aspectos, cada uno de estos grupos se puede sustituir además como se describe en esta invención.

El término “aminoalcoxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y el amino pueden estar sustituidos cada uno adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6, por ejemplo, carboxi).

El término “aminoalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquilo y amino se pueden sustituir además con 1,2, 3 o 4 grupos sustituidos como se describe en este documento para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona del grupo que consiste en alquilo (a) C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6, por ejemplo, carboxi, y/o un grupo de protección N).

El término “aminoalquenilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquenilo y amino se pueden sustituir además con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6, por ejemplo, carboxi, y/o un grupo de protección N).

El término “aminoalquinilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo amino, como se define en esta invención. El alquinilo y amino se pueden sustituir además con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6, por ejemplo, carboxi, y/o un grupo de protección N).

El término “arilo”, como se usa en esta invención, representa un sistema de anillo carbocíclico mono, bicíclico o multicíclico que tiene uno o más anillos aromáticos y está ejemplificado por fenilo, naftilo, 1,2-dihidronaftilo, 1,2,3,4-tetrahidronaftilo, antracenilo, fenantrenilo, fluorenilo, indanilo e indenilo, y pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) acilo C1-7 (por ejemplo, carboxialdehído ); (2) alquiloC1-20 (por ejemplo, alquiloC1-6, alcoxiC1-6-alquiloC1-6,C1-6 alquilsulfinilo-alquiloC1-6, aminoalquiloC1-6, azido -alquiloC1-6, (carboxialdehído) -alquiloC1-6, halo-alquiloC1-6 (por ejemplo, perfluoroalquilo), hidroxialquiloC1-6, nitro-alquiloC1-6, o C1- 6 tioalcoxi-alquilo C 1-6 ); (3)alcoxi C1-20 (por ejemplo,alcoxi C 1-6 , tal como perfluoroalcoxi); (4) alquilsulfinilo C1-6; (5) ariloC 6-10; (6) amino; (7) aril C6-10alquilo C 1-6; (8) azido; (9) C3 -scicloalquilo; (10) C3 -8cicloalquiloC1-6 alquilo; (11) halo; (12) C1 -12heterociclilo (por ejemplo, C1 -12heteroarilo); (13) (C1 -12heterociclil) oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16)tioalcoxi C 1-20 (por ejemplo, tioalcoxi C1-6); (17) - (CH2 )qCO2RA donde q es un número entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona del grupo que consiste en (a)alquilo C 1-6 , (b) C6- 10 arilo, (c) hidrógeno y (d) arilo C6-10alquilo C 1-6; (18) - (CH2 )qCONRB'RC', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RB'y RC' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquiloC1-6, (c) ariloC6-10, y (d) ariloC6-10 alquiloC1-6; (19) - (CH2 )qSO2RD'donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo, (b)arilo C 6-10 , y (c) aril alquiloC 6-10; (20) - (CH2 )qSO2NRE'RF', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE'y RF' se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquiloC1-6, (c) ariloC6-10, y (d) ariloC6-10 alquiloC1-6; (21) tiol; (22) ariloxi C6-10; (23) cicloalcoxi C3-8; (24)aril C 6-10 - alcoxi C1-6; (25) C1-12 heterociclilo alquiloC1-6 (por ejemplo,C1-12 heteroarilo alquiloC1-6); (26)alquenilo C 2-20 ; y (27)alquinilo C2-20. En algunos aspectos, cada uno de estos grupos se puede sustituir además como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un alcarilo C1 o un alqueterociclilo C1 se puede sustituir adicionalmente con un grupo oxo para producir el respectivo grupo sustituyente ariloílo y (heterociclil)oil.

El término “arilalcoxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo alcarilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de oxígeno. Grupos arilalcoxi no sustituidos ejemplares incluyen de 7 a 30 carbonos (por ejemplo, de 7 a 16 o de 7 a 20 carbonos, tal como alcoxi C6-10 arilo-C1-6, alcoxi C6-10 arilo-C1-10, o alcoxi C6-10 arilo-C1-20). En algunos aspectos, el grupo arilalcoxi se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención.

El término “arilalcoxicarbonilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo arilalcoxi, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un carbonilo (por ejemplo, -C (O) -O-alquil-arilo). Los ejemplos de grupos arilalcoxi no sustituidos incluyen de 8 a 31 carbonos (por ejemplo, de 8 a 17 o de 8 a 21 carbonos, tales como alcoxi-carbonilo C6-10 arilo-C1-6, alcoxi-carbonilo C6-10 arilo-C-i-10, o alcoxi-carbonilo C6-10 arilo-C1-20). En algunos aspectos, el grupo arilalcoxicarbonilo puede ser sustituido con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se define en esta invención.

El término “arileno” como se usa en esta invención, representa un grupo arilo divalente derivado por la eliminación de dos átomos de hidrógeno. El término “Cx-y arileno” representa grupos arileno que tienen entre x e y carbonos. Valores ejemplares para x son 6 y 10, y los valores ejemplares para y son 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, arileno C6-10 o C6-20). En algunos aspectos, el arileno se puede sustituir adicionalmente con grupos sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se definen en esta invención para un grupo arilo. El término “arileno ramificado” como se usa en esta invención, se refiere a un grupo arilo multivalente derivado de la eliminación de más de dos átomos de hidrógeno.

El término “ariloxi” representa un sustituyente químico de fórmula -OR ', donde R' es un grupo arilo de 6 a 18 carbonos, a menos que se especifique lo contrario. En algunos aspectos, el grupo arilo se puede sustituir con sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se define en esta invención.

El término “ariloilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo arilo, como se define en esta invención, que está unido al grupo molecular principal a través de un grupo carbonilo. Los grupos ariloílo no sustituidos ejemplares son de 7 a 11 carbonos. En algunos aspectos, el grupo arilo se puede sustituir con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se define en esta invención.

El término “azido” representa un grupo — N3, que se puede representar también como -N=N=N.

El término “bicíclico”, como se usa en esta invención, se refiere a una estructura que tiene dos anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos. Las estructuras bicíclicas incluyen grupos espirociclilo, como se define en esta invención, y dos anillos que comparten uno o más puentes, donde tales puentes pueden incluir un átomo o una cadena que incluye dos, tres o más átomos. Los grupos bicíclicos ejemplares incluyen un grupo carbociclilo bicíclico, donde el primer y segundo anillos son grupos carbociclilo, como se define en esta invención; grupos arilo bicíclicos, donde el primer y segundo anillos son grupos arilo, como se define en esta invención; grupos heterociclilo bicíclicos, donde el primer anillo es un grupo heterociclilo y el segundo anillo es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo); y grupos heteroarilo bicíclicos, donde el primer anillo es un grupo heteroarilo y el segundo anillo es un grupo carbociclilo (por ejemplo, arilo) o heterociclilo (por ejemplo, heteroarilo). En algunos aspectos, el grupo bicíclico puede estar sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes como se define en esta invención para los grupos cicloalquilo, heterociclilo y arilo.

El término “boranilo”, como se usa en esta invención, representa -B (R B1)3, donde cadaR B1 se selecciona, independientemente, del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido. En algunos aspectos, el grupo boranilo se puede sustituir con sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se define en esta invención para alquilo.

Los términos “carbocíclico” y “carbociclilo”, como se usa en esta invención, se refieren a una estructura monocíclica, bicíclica o tricíclica C3-12 opcionalmente sustituida en la que los anillos, que pueden ser aromáticos o no aromáticos, están formados por átomos de carbono. Las estructuras carbocíclicas incluyen grupos cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo.

El término “carbamoilo”, como se usa en esta invención, representa -C (O) -N (R N1 )2, donde el significado de cada RN1se encuentra en la definición de “amino” proporcionada en esta invención.

El término “carbamoilalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carbamoilo, como se define en esta invención. El grupo alquilo puede estar sustituido además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención.

Como se usa en esta invención, el término “carbamilo” se refiere a un grupo carbamato que tiene la estructura -NRN1C(=O)OR o -OC(=O)N(RN1)2, donde el significado de cadaRN1 se encuentra en la definición de “amino” proporcionada en esta invención, y R es alquilo, cicloalquilo, alcicloalquilo, arilo, alcarilo, heterociclilo (p. Ej., heteroarilo) o alcaterociclilo (p. Ej., alqueteroarilo), como se define en esta invención.

El término “carbonilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo C(O), que también puede representarse como C=O.

El término “carboxialdehído” representa un grupo acilo que tiene la estructura -CHO.

El término “carboxi”, como se usa en esta invención, hace referencia a -CO2H.

El término “carboxialcoxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alcoxi puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo alquilo, y el grupo carboxi puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos de protección de O.

El término “carboxialquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido por un grupo carboxi, como se define en esta invención. El grupo alquilo se puede sustituir adicionalmente con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención, y el grupo carboxi puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos de protección de O.

El término “carboxiaminoalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo aminoalquilo, como se define en esta invención, sustituido por un carboxi, como se define en esta invención. El carboxi, alquilo y amino, cada uno se puede sustituir además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para el grupo respectivo (por ejemplo, CO2RA', donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6, por ejemplo, carboxi y/o un grupo de protección de N y/o un grupo de protección de O).

El término “ciano”, como se usa en esta invención, representa un grupo -CN.

El término “cicloalcoxi” representa un sustituyente químico de fórmula -OR, donde R es un grupo cicloalquilo C 3 -8 ,tal como se define en esta invención, a menos que se especifique lo contrario. El grupo cicloalquilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1,2, 3 o 4 como se describe en esta invención. Los grupos cicloalcoxi no sustituidos ejemplares son de 3 a 8 carbonos. En algún aspecto, el grupo cicloalquilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “cicloalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo hidrocarburo cíclico no aromático saturado o insaturado monovalente de tres a ocho carbonos, a menos que se especifique lo contrario, y está ejemplificado por ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y biciclo heptilo. Cuando el grupo cicloalquilo incluye un doble enlace carbono-carbono, el grupo cicloalquilo puede denominarse grupo “cicloalquenilo”. Los ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo. Los grupos cicloalquilo de esta descripción pueden estar opcionalmente sustituidos con: (1) acilo C1-7 (por ejemplo, carboxialdehído); (2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6 , alquilo C1-6 alcoxi-C1-6 , alquilo C1-6 alquilsulfinil-C1-6 , alquilo amino-C1-6 , alquilo azido-C1-6 , alquilo (carboxialdehído)-C1-6 , alquilo halo-C1-6 (por ejemplo, perfluoroalquilo), alquilo hidroxi-C1-6 , alquilo nitro-C1-6 , o alquilo C1-6tioalcoxi-C1-6 ); (3) alcoxi C1-20 (por ejemplo, alcoxi C1-6 , tal como perfluoroalcoxi); (4) C1-6 alquilsulfinilo; (5) arilo C6-10 ; (6) amino; (7) arilo C6-10 alquilo C1-6 ; (8) azido; (9) cicloalquilo C3-8 ; (10) cicloalquilo C3-8 C1-6 alquilo; (11) halo; (12) heterociclilo C1-12 (por ejemplo, heteroarilo C1-12 ); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) C1-20 tioalcoxi (por ejemplo, C1-6 tioalcoxi); (17) - (CH2)qCO2RA', donde q es un número entero de cero a cuatro, y RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6 , (b) arilo C6-10 , (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6 ; (18) — (CH2)qCONRB'RC', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C6-10 , (c) arilo C6-10 , y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6 ; (19) — (CH2)qSO2RD', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C6-10 , (b) arilo C6-10 , y (c) ariloC6-10 alquilo C1-6 ; (20) — (CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' se selecciona independientemente del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C6-10 , (c) arilo C6-10 , y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6 ; (21) tiol; (22) ariloxi C6-10 ; (23) cicloalcoxi C3-8 ; (24) alcoxi C6-10 aril-C1-6 ; (25) alquilo C1-12 heterociclilo C1-6 (por ejemplo, heteroarilo C1-12 alquilo C1-6 ); (26) oxo; (27) alquenilo C2-20 ; y alquinilo (28) C2-20 . En algunos aspectos, cada uno de estos grupos se puede sustituir además como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un alcarilo C1- o un alqueterociclilo C1 se puede sustituir además con un grupo oxo para proporcionar el respectivo ariloilo y grupo sustituyente (heterociclil)oil.

El término “diastereoisómero”, como se usa en esta invención, significa estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí y no se pueden superponer entre sí.

El término “cantidad efectiva” de un agente, como se usa en esta invención, es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, por ejemplo, resultados clínicos y, como tal, una “cantidad efectiva” depende del contexto en el que se está aplicando. Por ejemplo, en el contexto de la administración de un agente que trata el cáncer, una cantidad efectiva de un agente es, por ejemplo, una cantidad suficiente para lograr el tratamiento, como se define en esta invención, del cáncer, en comparación con la respuesta obtenida sin la administración del agente.

El término “enantiómero”, como se usa en esta invención, significa cada forma ópticamente activa individual de un compuesto de la descripción, que tiene una pureza óptica o exceso enantiomérico (según se determina mediante procedimientos estándar en la técnica) de al menos el 80 % (es decir, al menos el 90 % de un enantiómero y como máximo el 10 % del otro enantiómero), preferiblemente al menos el 90 % y más preferiblemente al menos el 98 %.

El término “halo”, como se usa en esta invención, representa un halógeno seleccionado de bromo, cloro, yodo o flúor.

El término “haloalcoxi”, tal como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalcoxi puede estar sustituido con uno, dos o tres, o en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalcoxi incluyen perfluoroalcoxis (por ejemplo, -OCFa), -OCHF2, -OCH2F, -OCCla, -OCH2CH2Br, -OCH2CH(CH2CH2Br)CHa, y -OCHlCH3. En algunos aspectos, el grupo haloalcoxi se puede sustituir además con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención para grupos alquilo.

[0522]El término “haloalquilo”, tal como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, tal como se define en esta invención, sustituido con un grupo halógeno (es decir, F, Cl, Br o I). Un haloalquilo puede estar sustituido con uno, dos o tres, o en el caso de grupos alquilo de dos carbonos o más, cuatro halógenos. Los grupos haloalquilo incluyen perfluoroalquilos (por ejemplo, - CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3, y -CHICH3. En algunos aspectos, el grupo haloalquilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención para grupos alquilo.

El término “heteroalquileno”, como se usa en esta invención, se refiere a un grupo alquileno, como se define en esta invención, en el que uno o dos de los átomos de carbono constituyentes han sido reemplazados por nitrógeno, oxígeno 0 azufre. En algunos aspectos, el grupo heteroalquileno se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención para grupos alquileno.

El término “heteroarilo”, como se usa en esta invención, representa ese subconjunto de heterociclilos, como se define en esta invención, que son aromáticos: es decir, contienen 4n+2 electrones pi dentro del sistema de anillo mono o multicíclico. Los ejemplos de grupos heterociclilo no sustituidos tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 o 2 a 9) carbonos. En algún aspecto, el heteroarilo está sustituido con grupos de sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se define para un grupo heterociclilo.

El término “heterociclilo”, como se usa en esta invención, representa un anillo de 5, 6, o 7 miembros, a menos que se especifique lo contrario, que contiene uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre. El anillo de 5 miembros tiene de cero a dos dobles enlaces, y los anillos de 6 y 7 miembros tienen de cero a tres dobles enlaces. Los ejemplos de grupos heterociclilo no sustituidos tienen de 1 a 12 (por ejemplo, 1 a 11, 1 a 10, 1 a 9, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10 o 2 a 9) carbonos. El término «heterociclilo» también representa un compuesto heterocíclico que tiene una estructura multicíclica puenteada en la que uno o más carbonos y/o heteroátomos conectan dos miembros no adyacentes de un anillo monocíclico, por ejemplo, un grupo quinuclidinilo. El término “heterociclilo” incluye grupos bicíclicos, tricíclicos y tetracíclicos en los cuales cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriormente mencionados está fusionado a uno, dos o tres anillos carbocíclicos, por ejemplo, un anillo de arilo, un anillo de ciclohexano, un anillo de ciclohexeno, un anillo de ciclopentano, un anillo de ciclopenteno, y otro anillo heterocíclico monocíclico, tal como indolilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrahidroquinolilo, benzofurilo y benzotienilo. Los ejemplos de heterociclilos fusionados incluyen tropanos y 1,2,3,5,8,8a-hexahidroindolizina. Los heterocíclicos incluyen pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piridilo, piperidinilo, homopiperidinilo, pirazinilo, piperazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolidiniilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, indolilo, indazolilo, quinolilo, isoquinolilo, quinoxalinilo, dihidroquinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, benzimidazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, benzotiadiazolilo, furilo, tienilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-oxadiazolilo), purinilo, tiadiazolilo (por ejemplo, 1,2,3-tiadiazolilo), tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, dihidrotienilo, dihidroindolilo, dihidroquinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, dihidroisoquinolilo, piranilo, dihidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, isobenzofuranilo y benzotienilo, inclusive formas dihidro y tetrahidro de estos, donde uno o más enlaces dobles se reducen y reemplazan con hidrógenos. Otros heterociclilos ejemplares incluyen: 2,3,4,5-tetrahidro-2-oxo-oxazolilo; 2,3-dihidro-2-oxo-1H-imidazolilo; 2,3,4,5-tetrahidro-5-oxo-1H-pirazolilo (por ejemplo, 2,3,4,5-tetrahidro-2-fenil-5-oxo-1H-pirazolilo); 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-1H-imidazolilo (por ejemplo, 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-dioxo-5-metil-5-fenil-1H-imidazolilo); 2,3-dihidro-2-tioxo-1,3,4-oxadiazolilo (por ejemplo, 2,3-dihidro-2-tioxo-5-fenil-1,3,4-oxadiazolilo); 4,5-dihidro-5-oxo-1H-triazolilo (por ejemplo, 4,5-dihidro-3-metil-4-amino 5-oxo-1H-triazolilo); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopiridinilo (por ejemplo, 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3,3-dietilpiridinilo); 2,6-dioxo-piperidinilo (por ejemplo, 2,6-dioxo-3-etil-3-fenilpiperidinilo); 1,6-dihidro-6-oxopiridiminilo; 1,6-dihidro-4-oxopirimidinilo (por ejemplo, 2-(metiltio)-1,6-dihidro-4-oxo-5-metilpirimidin-1-ilo); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxopirimidinilo (por ejemplo, 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3-etilpirimidinilo); 1,6-dihidro-6-oxopiridazinilo (por ejemplo, 1,6-di hidro-6-oxo-3-etilpiridazin ilo); 1,6-dihidro-6-oxo-1,2,4-triazinilo (por ejemplo, 1,6-dihidro-5-isopropil-6-oxo-1,2,4-triazinilo); 2,3-dihidro-2-oxo-1H-indolilo (por ejemplo, 3,3-dimetil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-indolilo y 2,3-dihidro-2-oxo-3,3'-espiropropano-1H-indol-1-ilo); 1,3-dihidro-1-oxo-2H-iso-indolilo; 1,3-dihidro-1,3-dioxo-2H-isoindolilo; 1H-benzopirazolilo (por ejemplo, 1-(etoxicarbonil)- 1H-benzopirazolilo); 2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolilo (por ejemplo, 3-etil-2,3-dihidro-2-oxo-1H-benzimidazolilo); 2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolilo (por ejemplo, 5-cloro-2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolilo); 2,3-dihidro-2-oxo-benzoxazolilo; 2-oxo-2H-benzopiranilo; 1,4-benzodioxanilo; 1,3-benzodioxanilo; 2,3-dihidro-3-oxo,4H-1,3-benzotiazinilo; 3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinilo (por ejemplo, 2-metil-3,4-dihidro-4-oxo-3H-quinazolinilo); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolilo (por ejemplo, 1-etil-1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioxo-3H-quinazolilo); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-7H-purinilo (por ejemplo, 1,2,3,6-tetrahidro-1,3-dimetil-2,6-dioxo-7 H -purinilo); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-dioxo-1 H -purinilo (por ejemplo, 1,2,3,6-tetrahidro-3,7-dimetil-2,6-dioxo-1 H-purinilo); 2-oxobenz[c,d]indolilo; 1,1-dioxo-2H-naft[1,8-c,d]isotiazolilo; y 1,8-naftilendicarboxamido. Los heterocíclicos adicionales incluyen 3,3a,4,5,6,6a-hexahidro-pirrolo[3,4-b]pirrol-(2H)-ilo, y 2,5-diazabiciclo[2.2.1]heptan-2-ilo, homopiperazinilo (o diazepanil), tetrahidropiranilo, ditiazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, oxepanilo, tiepanilo, azocanilo, oxecanilo y tiocanilo. Los grupos heterocíclicos también incluyen grupos de fórmula

donde

E 'se selecciona del grupo que consiste en -N- y -CH-; F 'se selecciona del grupo que consiste en -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, -CH2-, -CH2CH2-, - CH2O-, -OCH2-, -O-, y -S-; y G' se selecciona del grupo que consiste en -CH- y -N-. Cualquiera de los grupos heterociclilos mencionados en esta invención puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en: (1) acilo C1-7 (por ejemplo, carboxialdehído); (2) alquilo C1-20 (por ejemplo, alquilo C1-6, alquilo C1-6 alcoxi-Ci-6, alquilo C1-6 alquilsulfinil-Ci-6, alquilo amino-Ci-6, alquilo azido-Ci-6, alquilo (carboxialdehído)-Ci-6, alquilo halo-C1-6 (por ejemplo, perfluoroalquilo), alquilo hidroxi-C1-6, alquilo nitro-C1-6, o alquilo C1-6 tioalcoxi-Ci-6); (3) alcoxi C1-20 (por ejemplo, alcoxi C1-6, tal como perfluoroalcoxi); (4) alquilsulfinil C1-6; (5) arilo C6-10; (6) amino; (7) arilo C6-10 alquilo C1-6; (8) azido; (9) cicloalquilo C3-8; (10) cicloalquilo C3-8C1-6 alquilo; (11) halo; (12) heterociclilo C1-12 (por ejemplo, heteroarilo C2-12); (13) (C1-12 heterociclil)oxi; (14) hidroxi; (15) nitro; (16) tioalcoxi C1-20 (por ejemplo, tioalcoxi C1-6); (17) -(CH2)qCO2RA', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RA' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, (c) hidrógeno, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6; (18) -(CH2)qCONRB'RC', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RB' y RC' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6, (c) arilo C6-10, y (d) arilo C6-10 alquilo Ci-6; (19) -(CH2)qSO2RD', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde RD' se selecciona del grupo que consiste en (a) alquilo C1-6, (b) arilo C6-10, y (c) arilo C6-10 alquilo C1-6; (20) -(CH2)qSO2NRE'RF', donde q es un número entero de cero a cuatro y donde cada uno de RE' y RF' se selecciona independientemente del grupo que consiste en (a) hidrógeno, (b) alquilo C1-6, (c) arilo C6-10, y (d) arilo C6-10 alquilo C1-6; (21) tiol; (22) ariloxi C6-10; (23) cicloalcoxi C3-8; (24) arilalcoxi; (25) heterociclilo C1-12 C1-6 alquilo (por ejemplo, heteroarilo C1-12 alquilo C1-6); (26) oxo; (27) (C1-12 heterociclil)imino; (28) alquenilo C2-20; y (29) alquinilo C2-20. En algunos aspectos, cada uno de estos grupos se puede sustituir además como se describe en esta invención. Por ejemplo, el grupo alquileno de un alcarilo Ci- o un alqueterociclilo Ci se puede sustituir además con un grupo oxo para proporcionar el respectivo ariloilo y grupo sustituyente (heterociclil)oil.

El término “heterociclileno”, como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo divalente derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno. El término “heterociclileno Cx-y” representa grupos heterociclileno que tienen entre x e y carbonos. Los valores ejemplares para x son 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y valores ejemplares para y son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 (por ejemplo, alquileno C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, o C2-20). En algunos aspectos, el heterociclileno se sustituye además con los grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se definen en esta invención para un grupo alquilo. El término “heterociclileno” “ramificado”, tal como se usa en esta invención, se refiere a un heterociclileno multivalente derivado de la eliminación de más de dos átomos de hidrógeno.

El término “(heterociclil)imino”, como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo imino. En algunos aspectos, el grupo heterociclilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.

El término “(heterociclil)oxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un átomo de oxígeno. En algunos aspectos, el grupo heterociclilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.

El término “(heterociclil)oil”, como se usa en esta invención, representa un grupo heterociclilo, como se define en esta invención, unido al grupo molecular principal a través de un grupo carbonilo. En algunos aspectos, el grupo heterociclilo se puede sustituir con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes como se define en esta invención.

El término “hidrocarburo”, como se usa en esta invención, representa un grupo que consta únicamente de átomos de carbono e hidrógeno.

El término “hidroxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo -OH. En algunos aspectos, el grupo hidroxi se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, grupos de protección de O) como se define en esta invención para un alquilo.

El término “hidroxialquenilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquenilo, como se define en esta invención, sustituido por uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no más de un grupo hidroxi pueda estar unido a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y está ejemplificado por dihidroxipropenilo e hidroxiisopentenilo. En algunos aspectos, el grupo hidroxialquenilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, grupos de protección de O) como se define en esta invención para un alquilo.

El término “hidroxialquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no se pueda unir más de un grupo hidroxi a un solo átomo de carbono del grupo alquilo, y se ejemplifica por hidroximetilo y dihidroxipropilo. En algunos aspectos, el grupo hidroxialquilo se puede sustituir con 1,2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, grupos de protección de O) como se define en esta invención para un alquilo.

El término “hidroxialquinilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquinilo, como se define en esta invención, sustituido con uno a tres grupos hidroxi, con la condición de que no se pueda unir más de un grupo hidroxi a un solo átomo de carbono del grupo alquilo. En algunos aspectos, el grupo hidroxialquinilo se puede sustituir con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituyentes (por ejemplo, grupos de protección de O) como se define en esta invención para un alquilo.

El término “isómero”, como se usa en esta invención, significa cualquier tautómero, estereoisómero, enantiómero o diastereómero de cualquier compuesto de la descripción. Se reconoce que los compuestos de la descripción pueden tener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por lo tanto, existen como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos E/Z) o diastereómeros (p. Ej., enantiómeros (es decir, (+) o (-)) o isómeros cis/trans). Según la descripción, las estructuras químicas representadas en esta invención, y por lo tanto los compuestos de la descripción, abarcan todos los estereoisómeros correspondientes, es decir, tanto la forma estereoméricamente pura (por ejemplo, geométricamente pura, enantioméricamente pura o diastereoméricamente pura) como enantiomérica y mezclas estereoisoméricas, por ejemplo, racematos. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas de compuestos de la descripción pueden resolverse típicamente en sus componentes enantiómeros o estereoisómeros mediante procedimientos bien conocidos, tales como cromatografía de gases en fase quiral, cromatografía líquida de alta resolución en fase quiral, cristalización del compuesto como un complejo de sal quiral, o cristalización del compuesto en un disolvente quiral. Los enantiómeros y estereoisómeros también se pueden obtener a partir de intermedios, reactivos y catalizadores estereomérica o enantioméricamente puros mediante procedimientos sintéticos asimétricos bien conocidos.

El término “amino protegido de N”, como se usa en esta invención, se refiere a un grupo amino, como se define en esta invención, al que se une a uno o dos grupos de protección de N, tal como se define en esta invención.

El término “grupo de protección de N” como se usa en esta invención, representa aquellos grupos destinados a proteger a un grupo amino contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Los grupos de protección de N comúnmente utilizados se describen en Greene, “Grupos de protección en síntesis orgánica,” 3a edición (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999). Grupos de protección N incluyen grupos acilo, ariloilo o carbamilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutilo, benzoilo, 4-clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoilo y auxiliares quirales tales como D, L o D, L-aminoácidos protegidos o no, tales como alanina, leucina y fenilalanina; grupos que contienen sulfonilo tales como bencenosulfonilo y p-toluenosulfonilo; grupos de formación de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, l-(p-bifenilil) -1-metiletoxicarbonilo, a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenilo-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo, grupos alcarilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y grupos sililo tales como trimetilsililo. Grupos N-protectores preferidos son formilo, acetilo, benzoilo, pivaloilo, t-butilacetilo, alanilo, fenilsulfonilo, bencilo, t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz).

El término “nitro”, como se usa en esta invención, representa un grupo -NO2.

El término “grupo de protección de O”, como se usa en esta invención, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo que contiene oxígeno (por ejemplo, fenol, hidroxi o carbonilo) contra reacciones indeseables durante los procedimientos sintéticos. Los grupos de protección de O comúnmente utilizados se describen en Greene, “Grupos de protección en síntesis orgánica,” 3a edición (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999). Los grupos de protección de Oejemplares incluyen grupos acilo, ariloilo o carbamilo, tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutririlo, benzoílo, 4-clorobenzoílo, 4-bromobenzoílo, t-butildimetilsililo, tri-isopropilsililoximetilo, 4,4'-dimetoxitritilo, isobutirilo, fenoxiacetilo, 4-isopropilpeenoxiacetilo, dimetilformamidino y 4-nitrobenzoilo; grupos alquilcarbonilo, tales como acilo, acetilo, propionilo y pivaloilo; grupos arilcarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como benzoílo; grupos sililo, tales como trimetilsililo (TMS), terc-butildimetilsililo (TBDMS), tri-isopropilsililoximetilo (TOM) y triisopropilsililo (TIPS); grupos formadores de éter con el hidroxi, tales como metilo, metoximetilo, tetrahidropiranilo, bencilo, p-metoxibencilo y tritilo; alcoxicarbonilos, tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, n-isopropoxicarbonilo, nbutiloxicarbonilo, isobutiloxicarbonilo, sec-butiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, 2-etilhexiloxicarbonilo, ciclobonilhexicarbonilo y metoxicarbonilo; grupos alcoxialcoxicarbonilo, tales como metoximetoxicarbonilo, etoximetoxicarbonilo, 2-metoxietoxicarbonilo, 2-etoxietoxicarbonilo, 2-butoxietoxicarbonilo, 2-metoxietoximetoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, propargiloxicarbonilo, 2-butenoxicarbonilo y 3-metil-2-butenoxicarbonilo; haloalcoxicarbonilos, tales como 2-cloroetoxicarbonilo, 2-cloroetoxicarbonilo y 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo; grupos arilalcoxicarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como benciloxicarbonilo, p-metilbenciloxicarbonilo, pmetoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dinitrobenciloxicarbonilo, 3,5-dimetilbenciloxicarbonilo, pclorobenciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo y fluorenilmetiloxicarbonilo; y grupos ariloxicarbonilo opcionalmente sustituidos, tales como fenoxicarbonilo, p-nitrofenoxicarbonilo, o-nitrofenoxicarbonilo, 2,4-dinitrofenoxicarbonilo, pmetil-fenoxicarbonilo, m-metilfenoxicarbonilo, o-bromofenoxicarbonilo, 3,5-dimetilfenoxicarbonilo, p -clorofenoxicarbonilo y 2-cloro-4-nitroxifenoxi-carbonilo); éteres de alquilo, arilo y alcarilo sustituidos (por ejemplo, tritilo; metiltiometilo; metoximetilo; benciloximetilo; siloximetilo; 2,2,2 tricloroetoximetilo; tetrahidropiranilo; tetrahidrofuranilo; etoxietilo; 1-[2-(trimetilsilil)etoxi]etilo; 2-trimetilsililetilo; éter t-butílico; p-clorofenilo, p-metoxifenilo, p-nitrofenilo, bencilo, p-metoxibencilo y nitrobencilo); éteres de sililo (por ejemplo, trimetilsililo; trietilsililo; triisopropilsililo; dimetilisopropilsililo; t-butildimetilsililo; t-butildifenilsililo; tribencilsililo; trifenilsililo; y difenimetilsililo); carbonatos (por ejemplo, metilo, metoximetilo, 9-fluorenilmetilo; etilo; 2,2,2-tricloroetilo; 2- (trimetilsilil) etilo; vinilo, alilo, nitrofenilo; bencilo; metoxibencilo; 3,4-dimetoxibencilo; y nitrobencilo); grupos protectores de carbonilo (por ejemplo, grupos acetal y cetal, tales como dimetilacetal y 1,3-dioxolano; grupos acilal; y grupos ditiano, tales como 1,3-ditianos y 1,3-ditiolano); grupos protectores de ácido carboxílico (por ejemplo, grupos éster, tales como éster metílico, éster bencílico, éster t-butílico y ortoésteres; y grupos oxazolina.

El término “oxo” como se usa en esta invención representa =O.

El término “perfluoroalquilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, donde cada radical hidrógeno unido al grupo alquilo ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalquilo están ejemplificados por trifluorometilo y pentafluoroetilo.

El término “perfluoroalcoxi”, como se usa en esta invención, representa un grupo alcoxi, como se define en esta invención, donde cada radical de hidrógeno unido al grupo alcoxi ha sido reemplazado por un radical fluoruro. Los grupos perfluoroalcoxi se ejemplifican por trifluorometoxi y pentafluoroetoxi.

El término “fosforilo”, como se usa en esta invención, se refiere a un grupo divalente:

donde R ^P1es cualquier sustituyente adecuado, por ejemplo, H, hidroxi, hidroxi protegido, halo, tiol, boranilo, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heteroalquilo opcionalmente sustituido, heteroalquenilo opcionalmente sustituido, heteroalquinilo opcionalmente sustituido o amino opcionalmente sustituido o una sal del mismo; y R^P2es O, S, Se, -NR^N1-, alquinileno opcionalmente sustituido o heteroalquileno opcionalmente sustituido, en dondeR^N1es H, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinileno opcionalmente sustituido o arileno opcionalmente sustituido.

El término “polietilenglicoleno”, como se usa en esta invención, representa un grupo polietilenglicol divalente derivado de la eliminación de dos átomos de hidrógeno. El término “polietilenglicoleno C2-C100” representan grupos de polietilenglicoleno que tienen entre x e y carbonos. Los valores ejemplares para x son 2, 4, 6, 8, 10 y 20, y los valores ejemplares para y son 10, 20, 40, 60 u 80 (por ejemplo, polietilenglicoleno ^c2-10 o C6-20). En algunos aspectos, se puede sustituir además una unidad monomérica del polietilenglicoleno con 1, 2, 3 o 4 grupos sustituidos según se define en esta invención para un grupo heteroalquileno. El término “polietilenglicoleno ramificado” como se usa en esta invención, se refiere a un grupo polietilenglicol multivalente derivado de la eliminación de más de dos átomos de hidrógeno.

El término “espirociclilo”, como se usa en esta invención, representa un dirradical alquileno C 2 -7, ambos extremos de los cuales están unidos al mismo átomo de carbono del grupo principal para formar un grupo espirocíclico, y también un dirradical heteroalquileno C1-6 ambos extremos de los cuales están unidos al mismo átomo. El radical heteroalquileno que forma el grupo espirociclilo puede contener uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. En algunos aspectos, el grupo espirociclilo incluye de uno a siete carbonos, excluyendo el átomo de carbono al que está unido el dirradical. Los grupos espirociclilo de la descripción pueden estar opcionalmente sustituidos con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes proporcionados en esta invención como sustituyentes opcionales para cicloalquilo y/o grupos heterociclilo.

El término “estereoisómero”, como se usa en esta invención, se refiere a todas las posibles formas isoméricas y conformacionales diferentes que puede poseer un compuesto (por ejemplo, un compuesto de cualquier fórmula descrita en esta invención), en particular todas las formas estereoquímicas y conformacionalmente isoméricas posibles, todos los diastereómeros, enantiómeros y/o confórmeros de estructura molecular básica. Algunos compuestos de la presente descripción pueden existir en diferentes formas tautoméricas, todas las últimas incluidas dentro del alcance de la presente descripción.

El término “sulfoalquil”, como se usa en esta invención, representa un grupo alquilo, como se define en esta invención, sustituido con un grupo sulfo de -SO 3 H. En algunos aspectos, el grupo alquilo puede estar sustituido adicionalmente con 1, 2, 3, o 4 grupos sustituyentes como se describe en esta invención, y el grupo sulfo se puede sustituir adicionalmente con uno o más gruposde protección deü(por ejemplo, como se describe en esta invención).

El término “sulfonilo”, como se usa en esta invención, representa un grupo -S(O)2.

El término “tioalcarilo”, como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alcarilo. En algunos aspectos, el grupo alcarilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “tioalqueterociclilo”, como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de la fórmula -SR, donde R es un grupo de alqueterociclilo. En algunos aspectos, el grupo alqueterociclilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

El término “tioalcoxi”, como se usa en esta invención, representa un sustituyente químico de fórmula -SR, donde R es un grupo alquilo, como se define en esta invención. En algunos aspectos, el grupo alquilo se puede sustituir además con grupos sustituyentes 1, 2, 3 o 4 como se describe en esta invención.

En varios lugares en la presente memoria descriptiva, los sustituyentes de los compuestos de la presente descripción se describen en grupos o en intervalos. Se pretende específicamente que la presente descripción incluya todas y cada una de las subcombinaciones individuales de los miembros de tales grupos e intervalos. Por ejemplo, el término “alquilo C1-6” está destinado específicamente a describir individualmente metilo, etilo, alquilo C3, alquilo C4, alquilo C5, y alquilo C6.

Acerca de: Como se usa en esta invención, el término “acerca de” cuando se usa en el contexto de la cantidad de una nucleobase alternativa o nucleósido en un polinucleótido significa /- 10 % del valor recitado. Por ejemplo, un polinucleótido que contiene aproximadamente el 25 % de un uracilo alternativo incluye entre el 22,5 y el 27,5 % del uracilo alternativo.

Adm inistrado en combinación: Tal como se usa en esta invención, el término “administrado en combinación” o “administración combinada” significa que dos o más agentes se administran a un sujeto al mismo tiempo o dentro de un intervalo de tal forma que puede haber una superposición de un efecto de cada agente en el paciente. En algunos casos, se administran con aproximadamente 60, 30, 15, 10, 5 o 1 minuto entre sí. En algunos casos, las administraciones de los agentes se espacian lo suficientemente cerca unas de otras para que se logre un efecto combinatorio (por ejemplo, sinérgico).

Modificado: Tal como se usa en esta invención, “modificado” se refiere a un estado o estructura cambiada de una molécula de la descripción. Las moléculas pueden modificarse de muchas maneras, incluso química, estructural y funcionalmente. Las moléculas de ARNm de la presente descripción pueden modificarse mediante la introducción de nucleósidos y/o nucleótidos no naturales, por ejemplo, en lo que se refiere a los ribonucleótidos naturales A, U, G y C. Los nucleótidos no canónicos tales como las estructuras de capa no son considerados “modificados” aunque difieren de la estructura química de los ribonucleótidos A, C, G, U.

Animal: Tal como se usa en esta invención, el término “animal” se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunos casos, “animal” se refiere a seres humanos en cualquier etapa de desarrollo. En algunos casos, “animal” se refiere a animales no-humanos en cualquier etapa de desarrollo. En ciertos aspectos, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate o un cerdo). En algunos casos, los animales incluyen, entre otros, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces y gusanos. En algunos aspectos, el animal es un animal transgénico, un animal modificado genéticamente o un clon.

Antígenos de interés o antígenos deseados: como se usa en esta invención, los términos "antígenos de interés" o "antígenos deseados" incluyen aquellas proteínas y otras biomoléculas proporcionadas en esta invención que están unidas inmunoespecíficamente por los anticuerpos y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de los mismos descritos en esta invención. Los ejemplos de antígenos de interés incluyen, pero no se limitan a, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina, hGH, tPA, citocinas, tales como interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN) alfa, IFN beta, IFN gamma, IFN omega o IFN tau, factor de necrosis tumoral (TNF), tal como TNF alfa y TNF beta, TNF gamma, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF.

Aproximadamente: Tal como se usa en esta invención, la expresión “aproximadamente” o “alrededor de”, según se aplica a uno o más valores de interés distintos de la cantidad de un nucleobase o nucleósido alternativo en un polinucleótido, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertos aspectos, el término “aproximadamente” o “alrededor de” se refiere a un intervalo de valores que se encuentra dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor) del valor de referencia indicado, a menos que se indique lo contrario, o resulte evidente lo contrario a partir del contexto (salvo que dicho número supere el 100 % de un valor posible).

Asociado con: Tal como se usa en esta invención, los términos "asociado con", "conjugado", "enlazado", "unido" y "anclado", cuando se usan con respecto a dos o más restos, significa que los restos están físicamente asociados o conectados entre sí, ya sea directamente o mediante uno o más restos adicionales que sirven como agente de enlace, para formar una estructura que sea suficientemente estable de modo que los restos permanezcan físicamente asociados en las condiciones en las que se usa la estructura, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Una "asociación" no tiene por qué ser estrictamente mediante un enlace químico covalente directo. También pueden sugerir enlaces iónicos o de hidrógeno o una conectividad basada en hibridación suficientemente estable de modo que las entidades "asociadas" permanezcan físicamente asociadas.

Biocompatible: Tal como se usa en esta invención, el término "biocompatible" significa compatible con células, tejidos, órganos o sistemas vivos que presentan poco o ningún riesgo de lesión, toxicidad o rechazo por parte del sistema inmunológico.

Biodegradable: Tal como se usa en esta invención, el término "biodegradable" significa que puede descomponerse en productos inocuos por la acción de seres vivos.

Biológicamente activo: Tal como se usa en esta invención, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema y/u organismo biológico. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activa. En casos particulares, un polinucleótido de la presente descripción puede considerarse biológicamente activo si incluso una porción del polinucleótido es biológicamente activa o imita una actividad considerada biológicamente relevante.

Compuesto: Tal como se usa en esta invención, el término "compuesto" pretende incluir todos los estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros e isótopos de las estructuras representadas.

Los compuestos descritos en esta invención pueden ser asimétricos (por ejemplo, tener uno o más estereocentros). Todos los estereoisómeros, tales como enantiómeros y diastereómeros, están destinados a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la presente divulgación que contienen átomos de carbono sustituidos asimétricamente pueden aislarse en formas ópticamente activas o racémicas. Se conocen en la técnica procedimientos sobre cómo preparar formas ópticamente activas a partir de materiales de partida ópticamente activos, tales como por resolución de mezclas racémicas o por síntesis estereoselectiva. Muchos isómeros geométricos de olefinas y dobles enlaces C=N también pueden estar presentes en los compuestos descritos en esta invención, y todos estos isómeros estables se contemplan en la presente descripción. Los isómeros geométricos cis y trans de los compuestos de la presente descripción se describen y pueden aislarse como una mezcla de isómeros o como formas isoméricas separadas.

Los compuestos de la presente divulgación también incluyen formas tautoméricas. Las formas tautoméricas resultan del intercambio de un enlace simple con un enlace doble adyacente y la migración concomitante de un protón. Las formas tautoméricas incluyen tautómeros prototrópicos que son estados de protonación isoméricos que tienen la misma fórmula empírica y carga total. Ejemplos de tautómeros prototrópicos incluyen pares cetona-enol, pares amidaácido imídico, pares lactama-lactima, pares amida-ácido imídico, pares enamina-imina y formas anulares donde un protón puede ocupar dos o más posiciones de un sistema heterocíclico, tales como, 1H- y 3H-imidazol, 1H-, 2H- y 4H-1,2,4-triazol, 1H- y 2H- isoindol y 1H- y 2H-pirazol. Las formas tautoméricas pueden estar en equilibrio o bloqueadas estéricamente en una forma mediante una sustitución apropiada.

Los compuestos de la presente divulgación también incluyen todos los isótopos de los átomos que se encuentran en los compuestos intermedios o finales. "Isótopos" se refiere a átomos que tienen el mismo número atómico pero diferentes números de masa resultantes de un número diferente de neutrones en los núcleos. Por ejemplo, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio.

Los compuestos y sales de la presente descripción se pueden preparar en combinación con moléculas de agua o disolvente para formar solvatos e hidratos mediante procedimientos rutinarios.

Conservado: Tal como se usa en esta invención, el término "conservado" se refiere a nucleótidos o residuos de aminoácidos de una secuencia de polinucleótidos o secuencia de polipéptidos, respectivamente, que son los que se producen inalterados en la misma posición de dos o más secuencias que se comparan. Los nucleótidos o aminoácidos que están relativamente conservados son aquellos que se conservan entre más secuencias relacionadas que los nucleótidos o aminoácidos que aparecen en otras partes de las secuencias.

En algunos aspectos, se dice que dos o más secuencias están "completamente conservadas" si son 100 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son al menos en un 70 % idénticas, al menos en un 80 % idénticas, al menos en un 90 % idénticas o al menos en un 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "altamente conservadas" si son aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son al menos en un 30 % idénticas, al menos en un 40 % idénticas, al menos en un 50 % idénticas, al menos en un 60 % idénticas, al menos en un 70 % idénticas, al menos en un 80 % idénticas, al menos en un 90 % idénticas o al menos en un 95 % idénticas entre sí. En algunos casos, se dice que dos o más secuencias están "conservadas" si son aproximadamente en un 30 % idénticas, aproximadamente un 40 % idénticas, aproximadamente un 50 % idénticas, aproximadamente un 60 % idénticas, aproximadamente un 70 % idénticas, aproximadamente un 80 % idénticas, aproximadamente un 90 % idénticas, aproximadamente un 95 % idénticas, aproximadamente un 98 % idénticas o aproximadamente un 99 % idénticas entre sí. La conservación de la secuencia puede aplicarse a la longitud completa de un oligonucleótido o polipéptido o puede aplicarse a una porción, región o característica del mismo.

Cíclico o ciclado: Tal como se usa en esta invención, el término "cíclico" se refiere a la presencia de un bucle continuo. Las moléculas cíclicas no necesitan ser circulares, solo unidas para formar una cadena ininterrumpida de subconjuntos. Las moléculas cíclicas tales como el ARNm de la presente descripción pueden ser conjuntos únicos o multímeros o incluir uno o más componentes de una estructura compleja o de orden superior.

Citostático: Tal como se usa en esta invención, "citostático" se refiere a inhibir, reducir, suprimir el crecimiento, la división o la multiplicación de una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.

Citotóxico: Tal como se usa en esta invención, "citotóxico" se refiere a matar o causar un efecto nocivo, tóxico o mortal en una célula (p.ej., una célula de mamífero (p.ej., una célula humana)), bacteria, virus, hongo, protozoo, parásito, prión, o una combinación de los mismos.

Entrega: Tal como se usa en esta invención, "administración" se refiere al acto o la manera de administrar un compuesto, sustancia, entidad, fracción, carga o carga útil.

Agente de administración: Tal como se usa en esta invención, "agente de entrega" se refiere a cualquier sustancia que facilite, al menos en parte, la administración in vivo de un polinucleótido a células diana.

Desestabilizado: Como se usa en esta invención, el término "inestable", "desestabilizar" o "región desestabilizadora" significa una región o molécula que es menos estable que una forma inicial, de tipo silvestre o nativa de la misma región o molécula.

Etiqueta detectable: Como se usa en esta invención, "etiqueta detectable" se refiere a uno o más marcadores, señales o restos que están unidos, incorporados o asociados con otra entidad que se detecta fácilmente mediante procedimientos conocidos en la técnica que incluyen radiografía, fluorescencia, quimioluminiscencia, actividad enzimática y absorbancia. Etiquetas detectables incluyen radioisótopos, fluoróforos, cromóforos, enzimas, colorantes, iones metálicos, ligandos tales como biotina, avidina, estreptavidina y haptenos y puntos cuánticos. Etiquetas detectables se pueden ubicar en cualquier posición en los péptidos o proteínas descritos en esta invención. Pueden estar dentro de los aminoácidos, péptidos o proteínas, o localizados en los extremos N- o C-.

Digerir: Como se usa en esta invención, el término "digerir" significa romper en piezas o componentes más pequeños. Cuando se hace referencia a polipéptidos o proteínas, la digestión da como resultado la producción de péptidos.

Distal: Como se usa en esta invención, el término "distal" significa situado lejos del centro o lejos de un punto o región de interés.

Señal de escisión de proteína codificada: Como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteína codificada" se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica una señal de escisión de proteína.

Diseño: Como se usa en esta invención, los aspectos de la descripción están "diseñados" cuando están ideados para tener una característica o propiedad, ya sea estructural o química, que varía de un punto de partida, tipo salvaje o molécula nativa.

Expresión: Como se usa en esta invención, la "expresión" de una secuencia de polinucleótido se refiere a uno o más de los eventos siguientes: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (p.ej., mediante transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (p.ej., mediante corte, edición, formación de capa 5' y/o procesamiento de extremo 3'); (3) traducción de un ARN a un polipéptido o proteína; y (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.

Rasgo: Tal como se usa en esta invención, una "característica" se refiere a una característica, una propiedad o un elemento distintivo.

Formulación: Como se usa en esta invención, una "formulación" incluye al menos un polinucleótido y un agente de administración.

Fragmento: Un "fragmento", como se usa en esta invención, se refiere a una porción. Por ejemplo, los fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteínas de longitud completa aisladas de células cultivadas.

Funcional: Como se usa en esta invención, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.

Homología: Como se usa en esta invención, el término “homología” se refiere al vínculo general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de polinucleótido (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunos aspectos, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos en un 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % idénticas o similares. El término "homólogo" se refiere necesariamente a una comparación entre al menos dos secuencias (secuencias de polinucleótidos o polipéptidos). De acuerdo con la descripción, dos secuencias de polinucleótidos se consideran homólogas si los polipéptidos que codifican son al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso 99 % para al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos. En algunos aspectos, las secuencias de polinucleótidos homólogas se caracterizan por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. Para secuencias de polinucleótidos de menos de 60 nucleótidos de longitud, la homología se determina por la capacidad de codificar un tramo de al menos 4-5 aminoácidos especificados de forma única. De acuerdo con la descripción, dos secuencias de proteínas se consideran homólogas si las proteínas son al menos aproximadamente en un 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % idénticas para al menos un tramo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos.

Identidad: Como se usa en esta invención, el término "identidad" se refiere al vínculo general entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de ácido nucleico (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de polinucleótido se puede efectuar, por ejemplo, alineando las dos secuencias para una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de polinucleótido para una alineación óptima, y se pueden ignorar las secuencias no idénticas a los efectos de la comparación). En ciertos aspectos, la longitud de una secuencia alineada a efectos comparativos es al menos un 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos el 100 % de la longitud de una secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, a continuación, las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta la cantidad de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de identidad de porcentaje entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, la identidad de porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar usando procedimientos tales como los que se describen en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991. Por ejemplo, es posible determinar la identidad de porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) mediante el uso de una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. La identidad de porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse, de manera alternativa, usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP. Los procedimientos comúnmente empleados para determinar la identidad de porcentaje entre secuencias incluyen, entre otros, aquellos descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Las técnicas para determinar la identidad se codifican en programas informáticos disponibles al público. Software informático ejemplar para determinar la homología entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programa GCG, Devereux y col., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTAn altschul, S. F. y col., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)).

Inhibir la expresión de un gen: Como se usa en esta invención, la frase "inhibir la expresión de un gen" significa provocar una reducción en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un ARN transcrito del gen (por ejemplo, un ARNm) o un polipéptido traducido de un ARNm transcrito del gen. Normalmente, una reducción en el nivel de un ARNm da como resultado una reducción en el nivel de un polipéptido traducido del mismo. El nivel de expresión se puede determinar usando técnicas estándar para medir ARNm o proteína.

In vitro: Como se usa en esta invención, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, por ejemplo,., en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en un cultivo celular, en una placa de Petri, etc., en lugar de dentro de un organismo (p.ej., animal, planta, o microbio).

In vivo: Como se usa en esta invención, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo (por ejemplo, animal, planta o microbio o célula o tejido del mismo).

Aislado: Como se usa en esta invención, el término "aislado" hace referencia a una sustancia o entidad que ha sido separada de al menos algunos de los componentes con los cuales estuvo asociada (ya sea naturalmente o en condiciones experimentales). Las sustancias aisladas pueden tener niveles variables de pureza en referencia a las sustancias desde las cuales han sido asociadas. Sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de al menos alrededor del 10, alrededor del 20, alrededor del 30, alrededor del 40, alrededor del 50, alrededor del 60, alrededor del 70, alrededor del 80, alrededor del 90 % o más de otros componentes a los cuales estuvieron inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, los agentes aislados son más de alrededor del 80, alrededor del 85, alrededor del 90, alrededor del 91, alrededor del 92, alrededor del 93, alrededor del 94, alrededor del 95, alrededor del 96, alrededor del 97, alrededor del 98, alrededor del 99 % o más de alrededor del 99 % puros. Como se usa en esta invención, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Sustancialmente aislado: Por "sustancialmente aislado" se entiende que el compuesto está sustancialmente separado del entorno en el que se formó o detectó. La separación parcial puede incluir, por ejemplo, una composición enriquecida en el compuesto de la presente descripción. La separación sustancial puede incluir composiciones que contienen al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente el 99 % en peso del compuesto de la presente divulgación, o una sal del mismo. Los procedimientos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la técnica.

L-nucleósido: Como se usa en esta invención, un L-nucleósido se refiere a un nucleósido que incluye L-ribosa.

Códigos maximizados: Como se usa en esta invención, el término "codón maximizado" se refiere a un codón con el número más alto de nucleótidos. Por ejemplo, un "codón maximizado de guanina" es el codón de un aminoácido particular que tiene el mayor número de guaninas.

De origen natural: Como se usa en esta invención, "de origen natural" significa que existe en la naturaleza sin ayuda artificial.

Vertebrado no humano: Como se usa en esta invención, un "vertebrado no humano" incluye todos los vertebrados excepto el Homo sapiens, incluidas las especies silvestres y domesticadas. Ejemplos de vertebrados no humanos incluyen, entre otros, mamíferos, tales como alpaca, banteng, bisonte, camello, gato, ganado, venado, perro, burro, gayal, cabra, cobaya, caballo, llama, mula, cerdo, conejo, reno, búfalo de agua, oveja y yak.

Fuera de diana: Como se usa en esta invención, "fuera de diana" se refiere a cualquier efecto no intencionado sobre una o más dianas, genes o transcripciones celulares.

Marco de lectura abierto: Como se usa en esta invención, "marco de lectura abierto" u "ORF (Open reading frame)" se refiere a una secuencia que no contiene un codón de parada en un marco de lectura dado.

Unido operativamente: Como se usa en esta invención, la frase "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre dos o más moléculas, construcciones, transcripciones, entidades, restos o similares.

Paratopo: Como se usa en esta invención, un "paratopo" se refiere al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo.

Paciente: Como se usa en esta invención, "paciente" se refiere a un sujeto que puede buscar o necesitar tratamiento, que requiere tratamiento, está recibiendo tratamiento, recibirá tratamiento o un sujeto que está bajo el cuidado de un profesional capacitado para una enfermedad o afección particular.

Opcionalmente sustituido: En esta invención, una frase de la forma "X opcionalmente sustituido" (por ejemplo, alquilo opcionalmente sustituido) pretende ser equivalente a "X, donde X está opcionalmente sustituido" (por ejemplo, "alquilo, donde dicho alquilo está opcionalmente sustituido"). No se pretende que signifique que la característica "X" (p.ej., alquilo) per se sea opcional.

Péptido: Tal como se usa en esta invención, "péptido" tiene una longitud menor o igual a 50 aminoácidos, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.

Farmacéuticamente aceptable: La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en esta invención para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, según el alcance del criterio médico sensato, son adecuados para su uso en contacto con tejidos humanos y animales sin provocar una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, con una relación beneficio/riesgo acorde razonable.

Excipientes farmacéuticamente aceptables: La frase "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en esta invención, se refiere a cualquier ingrediente distinto de los compuestos descritos en esta invención (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de no ser tóxico ni inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, auxiliares de compresión, desintegrantes, colorantes (colores), emolientes, emulsionantes, rellenos (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, sabores, fragancias, deslizantes (potenciadores de flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersantes, edulcorantes y aguas de hidratación. Ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinil pirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metil parabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, laca, dióxido de silicio, carboximetil celulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato almidón de sodio, sorbitol, almidón (maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol.

Sales farmacéuticamente aceptables: La presente descripción también incluye sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención. Tal como se usa en esta invención, "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a derivados de los compuestos descritos donde se modifica el compuesto principal al convertir un resto básico o ácido existente en su forma de sal (por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo de base libre con un ácido orgánico adecuado). Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos. Las sales de adición ácida representativas incluyen sales de acetato, adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroxibromuro, hidroxicloruro, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurilo, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, toluenosulfonato, undecanoato y valerato. Sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio y magnesio, así como amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes amina, que incluyen, entre otros, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina y etilamina. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención incluyen las sales no tóxicas convencionales del compuesto principal, por ejemplo, formado a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente descripción se pueden sintetizar a partir del compuesto principal que contiene un resto ácido o básico mediante procedimientos químicos convencionales. Generalmente, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos; generalmente, se usan medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, y Berge y col., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977).

Farmacocinética: Como se usa en esta invención, "farmacocinética" se refiere a una o más propiedades de una molécula o compuesto en lo que se refiere a la determinación del destino de las sustancias administradas a un organismo vivo. La farmacocinética se divide en varias áreas que incluyen el grado y la velocidad de absorción, distribución, metabolismo y excreción. Esto se conoce comúnmente como ADME donde: (A) Absorción es el procedimiento de una sustancia que ingresa a la circulación sanguínea; (D) Distribución es la dispersión o diseminación de sustancias por los fluidos y tejidos del cuerpo; (M) Metabolismo (o biotransformación) es la transformación irreversible de compuestos parentales en metabolitos hijos; y (E) Excreción (o eliminación) se refiere a la eliminación de las sustancias del cuerpo. En casos raros, algunos fármacos se acumulan irreversiblemente en el tejido corporal.

Solvato farmacéuticamente aceptable: El término "solvato farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en esta invención, significa un compuesto de la descripción donde se incorporan moléculas de un disolvente adecuado en la red cristalina. Un disolvente adecuado es fisiológicamente tolerable a la dosis administrada. Por ejemplo, los solvatos se pueden preparar mediante cristalización, recristalización o precipitación a partir de una solución que incluye disolventes orgánicos, agua o una mezcla de los mismos. Ejemplos de disolventes adecuados son etanol, agua (por ejemplo, mono, di y trihidratos), /V-metilpirrolidinona (NMP), dimetil sulfóxido (DMSO), W,W-dimetilformamida (DMF), W,W-dimetilacetamida (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1 h )-pirimidinona (DMPU), acetonitrilo (ACN), propilenglicol, acetato de etilo, alcohol bencílico, 2-pirrolidona y benzoato de bencilo. Cuando el agua es el disolvente, el solvato se denomina "hidrato".

Fisicoquímica: Como se usa en esta invención, "fisicoquímica" significa o se relaciona con una propiedad física y/o química.

Polímero: Como se usa en esta invención, un "polímero" es una molécula o compuesto que tiene dos o más unidades monoméricas diferentes, e incluye copolímeros que tienen dos unidades monoméricas, terpolímeros que tienen tres unidades monoméricas, tetrapolímeros que tienen cuatro unidades monoméricas, pentapolímeros que tienen cinco unidades monoméricas, etc. También se apreciará que los copolímeros pueden ser copolímeros aleatorios, copolímeros de bloques, copolímeros alternos o una combinación que incluye dos o más de estos motivos. El polímero también puede tener un gradiente de composición.

Prevención: Como se usa en esta invención, el término "prevención" se refiere a retrasar parcial o completamente la aparición de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones clínicas de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la aparición de uno o más síntomas, características o manifestaciones de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular; retrasar parcial o completamente la progresión de una infección, una enfermedad, trastorno y/o afección particular; y/o disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la infección, la enfermedad, trastorno y/o afección.

Profármaco: La presente descripción también incluye profármacos de los compuestos descritos en esta invención. Como se usa en esta invención, "profármacos" se refiere a cualquier sustancia, molécula o entidad que se encuentra en una forma predicada para que esa sustancia, molécula o entidad actúe como terapéutica tras una alteración química o física. Los profármacos pueden unirse covalentemente o secuestrarse de alguna manera y liberan o se convierten en el resto de fármaco activo antes, durante o después de su administración a un sujeto mamífero. Los profármacos se pueden preparar modificando grupos funcionales presentes en el compuesto de la descripción de tal forma que las modificaciones se escindan, bien con su manipulación rutinaria o bien in vivo, del compuesto principal. Los profármacos incluyen compuestos en los que los grupos hidroxi, amino, sulfhidrilo o carboxilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxi, amino, sulfhidrilo o carboxilo libre, respectivamente. La preparación y uso de profármacos se aborda en T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 se la serie del Simposio A.C.S., y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, Asociación farmacéutica americana y Pergamon Press, 1987.

Proliferar: Como se usa en esta invención, el término "proliferar" significa crecer, expandirse o aumentar o hacer crecer, expandirse o aumentar rápidamente. "Proliferativo" significa tener la capacidad de proliferar. "Antiproliferativo" significa que tiene propiedades contrarias o inapropiadas a las propiedades proliferativas.

Sitio de escisión de proteínas: Como se usa en esta invención, "sitio de escisión de proteínas" se refiere a un sitio donde se puede lograr la escisión controlada de la cadena de aminoácidos por medios químicos, enzimáticos o fotoquímicos.

Señal de escisión de proteínas: Como se usa en esta invención, "señal de escisión de proteínas" se refiere al menos a un aminoácido que marca o señala un polipéptido para la escisión.

Proteína de interés: Como se usa en esta invención, los términos "proteínas de interés" o "proteínas deseadas" incluyen los proporcionados en esta invención y fragmentos, mutantes, variantes y alteraciones de los mismos.

Proximal: Como se usa en esta invención, el término "proximal" significa situado más cerca del centro o a un punto o región de interés.

Purificado: Como se usa en esta invención, "purificar", "purificado", "purificación" significa hacer sustancialmente puro o claro a partir de componentes no deseados, contaminación del material, mezcla o imperfección.

Muestra: Como se usa en esta invención, el término "muestra" o "muestra biológica" se refiere a un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, fluidos corporales, que incluyen, entre otros, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). Una muestra puede incluir además un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos, tumores, órganos. Una muestra se refiere además a un medio, tal como un caldo o gel nutritivo, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o polinucleótido.

Secuencias señal: Como se usa en esta invención, la frase "secuencias señal" se refiere a una secuencia que puede dirigir el transporte o la localización de una proteína.

Significativo o Significativamente: Como se usa en este documento, los términos "significativo" o "significativamente" se usan como sinónimos del término "sustancialmente".

Dosis unitaria única: Como se usa en esta invención, una "dosis unitaria única" es una dosis de cualquier terapéutico administrado en una dosis/en un momento/vía única/punto único de contacto, es decir, evento de administración única.

Similaridad: Como se usa en la presente, el término "simNaridad" se refiere al vínculo general entre moléculas poliméricas, p. ej., entre moléculas de polinucleótido (p. ej., moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de similitud de moléculas poliméricas entre sí se puede realizar de la misma manera que el cálculo del porcentaje de identidad, excepto que el cálculo del porcentaje de similitud tiene en cuenta las sustituciones conservadoras como se entiende en la técnica.

Molécula pequeña: como se usa en esta invención, "molécula pequeña" se refiere a un compuesto orgánico no peptídico, no oligomérico, sintetizado en el laboratorio o encontrado en la naturaleza. Las moléculas pequeñas, como se usan en esta invención, pueden referirse a compuestos que son "similares a productos naturales", sin embargo, el término "molécula pequeña" no se limita a compuestos "similares a productos naturales". Más bien, una molécula pequeña se caracteriza típicamente porque posee una o más de las siguientes características, que incluyen tener varios enlaces carbono-carbono, tener múltiples estereocentros, tener múltiples grupos funcionales, tener al menos dos tipos diferentes de grupos funcionales y tener un peso molecular de menos de 1500 Da, aunque esta caracterización no pretende ser limitante para los propósitos de la descripción.

Dosis dividida: Como se usa en esta invención, una "dosis dividida" es la división de la dosis unitaria única o la dosis diaria total en dos o más dosis.

Estable: Como se usa en esta invención, "estable" se refiere a un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza de una mezcla de reacción, y preferiblemente capaz de formularse en un agente terapéutico eficaz.

Estabilizado: Como se usa en esta invención, el término "estabilizar", "estabilizado", "región estabilizada" significa hacer o volverse estable.

Sujeto: Como se usa en esta invención, el término “sujeto” o "paciente" hace referencia a cualquier organismo al que se pueda administrar una composición según la descripción, por ejemplo, con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos, y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y humanos) y/o plantas.

Sustancialmente: Como se usa en esta invención, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total, o casi total, de una característica o propiedad de interés. Un experto en la materia biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos en raras ocasiones, si es que ocurre, se completan y/o llegan a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa en esta invención, por lo tanto, para capturar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Sustancialmente igual: Como se usa en esta invención en relación con las diferencias de tiempo entre dosis, el término significa más/menos 2 %.

Sustancialmente simultáneamente: Como se usa en esta invención y en lo que se refiere a una pluralidad de dosis, el término significa dentro de 2 segundos.

Que padece: Un individuo "que padece" una enfermedad, trastorno y/o afección ha sido diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.

Susceptible a: Una persona que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o afección no ha sido diagnosticada o puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección, pero tiene una propensión a desarrollar una enfermedad o sus síntomas. En algunos aspectos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, cáncer) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentada y/o disminuida de una proteína y/o ácido nucleico asociado con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (5) antecedentes familiares de la enfermedad, trastorno y/o afección; y (6) exposición y/o infección con un microbio asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos aspectos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunos casos, un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.

Sintético: El término "sintético" significa producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. La síntesis de polinucleótidos o polipéptidos u otras moléculas de la presente descripción puede ser química o enzimática.

Células diana: Como se usa en esta invención, "células diana" se refiere a una o más células de interés. Las células se pueden encontrar in vitro, in vivo, in situ o en el tejido u órgano de un organismo. El organismo puede ser un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano y lo más preferiblemente un paciente.

Mínimo teórico: El término "mínimo teórico" se refiere a una secuencia de nucleótidos con todos los codones en el marco de lectura abierto reemplazados para minimizar el número de uracilos en la secuencia.

Agente terapéutico: El término "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, tras ser administrado a un sujeto, tiene un efecto terapéutico, diagnóstico y/o profiláctico, y/o produce un efecto farmacológico y/o biológico deseado.

Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se usa en esta invención, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que se va a administrar (por ejemplo, polinucleótido, fármaco, agente terapéutico, agente de diagnóstico, agente profiláctico, etc.) que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Resultado terapéuticamente eficaz: Como se usa en esta invención, el término "resultado terapéuticamente eficaz" significa un resultado que es suficiente en un sujeto que padece o es susceptible a una infección, enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, mejorar los síntomas de, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de la infección, enfermedad, trastorno y/o afección.

Dosis diaria total: Como se usa en esta invención, una "dosis diaria total" es una cantidad administrada o prescrita en un período de 24 horas. Puede administrarse como una dosis unitaria única.

Factor de transcripción: Como se usa en esta invención, el término "factor de transcripción" se refiere a una proteína de unión al ADN que regula la transcripción del ADN en ARN, por ejemplo, mediante la activación o represión de la transcripción. Algunos factores de transcripción efectúan la regulación de la transcripción por sí solos, mientras que otros actúan en conjunto con otras proteínas. Algún factor de transcripción puede activar y reprimir la transcripción bajo ciertas condiciones. En general, los factores de transcripción se unen a una secuencia o secuencias diana específicas muy similares a una secuencia consenso específica en una región reguladora de un gen diana. Los factores de transcripción pueden regular la transcripción de un gen diana solo o en un complejo con otras moléculas.

Tratar: Como se usa en esta invención, el término "tratar'' se refiere a aliviar, mejorar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio de, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de una infección, enfermedad, trastorno y/o afección particular. Por ejemplo, "tratar" el cáncer puede referirse a inhibir la supervivencia, el crecimiento, y/o diseminación de un tumor. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección, y/o a un sujeto que muestra únicamente síntomas iniciales de la enfermedad, trastorno y/o afección, con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar patologías asociadas con la enfermedad, trastorno y/o afección.

Sin modificar: Como se usa en esta invención, "sin modificar" se refiere a cualquier sustancia, compuesto o molécula antes de ser cambiado de alguna manera. Sin modificar puede, pero no siempre, referirse al tipo salvaje o la forma nativa de una biomolécula. Las moléculas pueden sufrir una serie de modificaciones mediante las cuales cada molécula modificada puede servir como la molécula de partida "no modificada" para una modificación posterior.

Secuencia de tipo salvaje: Como se usa en esta invención, una "secuencia de tipo salvaje" es la secuencia del ARNm de origen natural que codifica el polipéptido de interés.

EJEMPLOS

La presente descripción se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1. PCR para la producción de ADNc

Los procedimientos de PCR para la preparación de ADNc se realizan usando 2x KAPA HIFI™ HotStart ReadyMix de Kapa Biosystems (Woburn, Ma ). Este sistema incluye 2x KAPA ReadyMix 12,5 jl; cebador directo (10 j M) 0,75 jl; cebador indirecto (10 j M) 0,75 jl; ADNc plantilla -l0o ng y dH2O diluido hasta 25,0 jl. Las condiciones de reacción son a 95 °C durante 5 min. y 25 ciclos de 98 °C durante 20 segundos, a continuación 58 °C durante 15 segundos, a continuación 72 °C durante 45 segundos, a continuación 72 °C durante 5 min, a continuación 4 °C hasta la terminación.

El cebador inverso de la presente descripción incorpora un poli-T120 para un poli-A120 en el ARNm. Se pueden usar otros cebadores inversos con tractos poli(T) más largos o más cortos para ajustar la longitud de la cola poli(A) en el ARNm.

La reacción se purifica con el micro kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante (hasta 5 jg). Después de la purificación, el ADNc se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ADNc tiene el tamaño esperado. A continuación, el ADNc se envía para análisis de secuenciación antes de proceder a la reacción de transcripción in vitro.

Ejemplo 2. Transcripción In vitro (IVT)

A. Materiales y procedimientos

Los ARNm alternativos según la descripción se elaboran utilizando procedimientos y materiales de laboratorio estándar para la transcripción in vitro, con la excepción de que la mezcla de nucleótidos contiene nucleótidos alternativos. El marco de lectura abierto (ORF) del gen de interés puede estar flanqueado por una región 5' sin traducir (UTR) que contiene una fuerte señal de iniciación de la traducción de Kozak y una alfa-globina 3'-UTR que termina con una secuencia de oligo (dT) para adición de plantilla de una cola poliA para ARNm que no incorporan análogos de adenosina. Los ARNm que contienen adenosina se sintetizan sin una secuencia de oligo (dT) para permitir la formación de colas de poli (A) polimerasa poli (A) postranscripción.

El ORF también puede incluir varias adiciones ascendentes o descendentes (tal como, entre otras, p-globina, etiquetas, etc.) que se pueden solicitar a un servicio de optimización tal como, entre otros, DNA2.0 (Menlo Park, CA ) y puede contener múltiples sitios de clonación que pueden tener reconocimiento de Xbal. Tras la recepción de la construcción, se puede reconstituir y transformar en E. coli químicamente competente.

Para la presente descripción, se utiliza E . coli competente NEB DH5-alfa. Las transformaciones se realizan según las instrucciones de NEB usando 100 ng de plásmido. El protocolo es el siguiente:

Descongelar un tubo de células de E. coli competentes NEB 5-alfa en hielo durante 10 minutos.

Añadir 1-5 pl que contengan 1 pg-100 ng de ADN plasmídico a la mezcla de células. Mover con cuidado el tubo de 4 a 5 veces para mezclar las células y el ADN. No agitar.

Colocar la mezcla en hielo durante 30 minutos. No mezclar.

Choque de calor a 42 °C durante exactamente 30 segundos. No mezclar.

Colocar en hielo durante 5 minutos. No mezclar.

Pipetear 950 pl de SOC a temperatura ambiente en la mezcla.

Colocar a 37 °C durante 60 minutos. Agitar vigorosamente (250 rpm) o girar.

Calentar las placas de selección a 37 ° C.

Mezclar bien las células moviendo el tubo e invirtiéndolo.

Extienda 50-100 pl de cada dilución en una placa de selección e incube durante la noche a 37 ° C. Alternativamente, incubar a 30 °C durante 24-36 horas o 25 °C durante 48 horas.

A continuación se usa una sola colonia para inocular 5 ml de medio de crecimiento LB usando el antibiótico apropiado y, a continuación, se deja crecer (250 RPM, 37 °C) durante 5 horas. A continuación, se utiliza para inocular un medio de cultivo de 200 ml y se deja crecer durante la noche en las mismas condiciones.

Para aislar el plásmido (hasta 850 pg), se realiza una preparación máxima utilizando el kit Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep (Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para generar ADNc para la transcripción in vitro (IVT), el plásmido se linealiza primero usando una enzima de restricción tal como Xbal. Una digestión de restricción típica con Xbal incluirá lo siguiente: Plásmido 1,0 pg; 10 x tampón 1,0 pl; Xbal 1,5 pl; dH 2 O hasta 10 pl; incubados a 37 ° C durante 1 hora. Si se realiza a escala de laboratorio (<5 pg), la reacción se limpia con el Micro Kit PURELINK™ PCR de Invitrogen (Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario realizar una purificación a gran escala con un producto que tenga una mayor capacidad de carga, como el kit de PCR estándar PURELINK™ de Invitrogen (Carlsbad, CA). Después de la limpieza, el vector linealizado se cuantifica usando el NanoDrop y se analiza para confirmar la linealización usando electroforesis en gel de agarosa. Reacción IVT

La reacción de transcripción in vitro genera ARNm que contiene nucleótidos alternativos o ARN alternativo. La mezcla de trifosfato de nucleótidos de entrada (NTP) se fabrica internamente utilizando NTP naturales y no naturales.

Una reacción de transcri ción in vitro tí ica inclu e lo si uiente:

Incubación a 37 °C durante 3 horas-5 horas.

La mezcla IVT bruta se puede almacenar a 4 °C durante la noche para su limpieza al día siguiente. A continuación, se utiliza 1 U de DNasa libre de RNasa para digerir la plantilla original. Después de 15 minutos de incubación a 37 °C, el ARNm se purifica usando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit puede purificar hasta 500 |jg de ARN. Después de la limpieza, el ARN se cuantifica utilizando el NanoDrop y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN tiene el tamaño adecuado y que no se ha producido degradación del ARN.

La ARN polimerasa de T7 puede seleccionarse entre la ARN polimerasa de T7, la ARN polimerasa de T3 y las polimerasas mutantes tales como, entre otras, las nuevas polimerasas capaces de incorporar NTP alternativos así como las polimerasas descritas por Liu ( Esvelt y col. (Naturaleza (2011) 472(7344):499-503 y Publicación de EE. UU. núm. 20110177495) que reconocen promotores alternativos, Ellington ( Chelliserrykattil y Ellington, Nature Biotechnology (2004) 22(9):1155-1160 ) que describe una variante de ARN polimerasa de T7 para transcribir ARN 2'-O-metilo y Sousa (Padilla y Sousa, Nucleic Acids Research (2002) 30 (24): e128) que describe un doble mutante de ARN polimerasa de T7.

B. Electroforesis en gel de agarosa de ARNm alternativo

Los ARN alternativos individuales (200-400 ng en un volumen de 20 j l) se cargan en un pocillo en un 1,2 % agarosa E-Gel no desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se ejecutan durante 12-15 minutos, según el protocolo del fabricante.

C. Electroforesis en gel de agarosa de productos PCR de RT

Los productos de PCR de transcripción inversa (200-400 ng) se cargan en un pocillo en un 1,2 % agarosa E-Gel no desnaturalizante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se ejecutan durante 12-15 minutos, según el protocolo del fabricante.

D. Datos espectrales UV y cuantificación de ARNm modificado con Nanodrop

Se utilizan ARNm alternativos en tampón TE (1 j l ) para las lecturas de absorbancia UV de Nanodrop para cuantificar el rendimiento de cada ARNm alternativo de una reacción de transcripción in vitro (no se muestran las trazas de absorbancia UV).

Ejemplo 3. Captación enzimática de ARNm

El taponamiento del ARNm se realiza como sigue cuando la mezcla incluye: ARN IVT 60 jg-180 jg y dH2O hasta 72 jl. La mezcla se incuba a 65 °C durante 5 minutos para desnaturalizar el ARN y, a continuación, se transfiere inmediatamente a hielo.

A continuación, el protocolo implica la mezcla de tampón de protección 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8.0), KCl 60 mM, 12,5 mM MgCl2 (10,0 jl); 20 mM GTP (5,0 jl); S-adenosil metionina 20 mM (2,5 jl); Inhibidor de ARNasa (100 U); 2'-O-metiltransferasa (400 U); Enzima de protección contra Vaccinia (Guanilil transferasa) (40 U); dH2O (hasta 28 jl); e incubación a 37 °C durante 30 minutos para 60 jg de ARN o hasta 2 horas para 180 jg de ARN.

El ARNm puede purificarse a continuación utilizando el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la limpieza, se cuantificar el ARN se cuantifica usando NANODROP™ (ThermoFisher, Waltham, MA) y se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar que el ARN es del tamaño adecuado y que no ocurrió degradación alguna del ARN. El producto de ARN también se puede secuenciar ejecutando una PCR de transcripción inversa para generar el ADNc para la secuenciación.

Ejemplo 4. Recubrimiento de 5'-guanosina

A. Materiales y procedimientos

La clonación, la síntesis de genes y la secuenciación de vectores pueden ser realizadas por DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA). El ORF se digiere por restricción usando Xbal y se usa para la síntesis de ADNc usando PCR con cola o sin cola. El producto de ADNc de PCR con cola se utiliza como plantilla para la reacción de síntesis de ARNm alternativa utilizando 25 mM de cada mezcla de nucleótidos alternativa (todos los nucleótidos alternativos se pueden sintetizar de forma personalizada o se pueden comprar en TriLink Biotech, San Diego, CA, excepto el trifosfato de pirrolo-C, que puede adquirirse de Glen Research, Sterling VA; los nucleótidos no modificados se compran de Epicenter Biotechnologies, Madison, Wl) y el kit completo de síntesis de ARNm CellScript MEGASc RiPT ™ (Epicenter Biotechnologies, Madison, Wl).

La reacción de transcripción in vitro se realiza durante 4 horas a 37 ° C. Los ARNm alternativos que incorporan análogos de adenosina tienen cola de poli (A) usando Polimerasa de Poli (A) de levadura (Affymetrix, Santa Clara, CA). La reacción de PCR utiliza HiFi PCR 2X MASTER MIX ™ (Kapa Biosystems, Woburn, MA). Los ARNm alternativos se protegen postranscripcionalmente usando la enzima de protección del virus vaccinia recombinante (New England BioLabs, Ipswich, MA) y una 2'-O-metiltransferasa recombinante (Epicenter Biotechnologies, Madison, Wl) para generar la estructura de capa 1 de 5'-guanosina. La estructura capa 2 y las estructuras de capa 2 se pueden generar usando 2'-O-metiltransferasas adicionales. El producto de ARNm transcrito in vitro se procesa en un gel de agarosa y se visualiza. El ARNm alternativo se puede purificar con Ambion/Applied Biosystems (Austin, TX) Kit de purificación MEGAClear ARN ™. La PCR utiliza el kit de purificación de PCR PURELINK ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). El producto se cuantifica en absorbancia UV NANODROP ™ (ThermoFisher, Waltham, MA). La calidad, la calidad de la absorbancia UV y la visualización del producto se realizaron en un gel de agarosa al 1,2 %. El producto se resuspende en tampón TE.

B. Estructura de polinucleótido alternativo (ARNm) de capa 5'

La protección 5' del ARNm alternativo se puede completar de forma concomitante durante la reacción de transcripción in vitroutilizando los siguientes análogos químicos de la capa de ARN para generar la estructura de capa 5'-guanosina según los protocolos del fabricante: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (la capa ARCA); G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La protección 5' del ARNm alternativo se puede completar post-transcripcionalmente utilizando una enzima de protección de virus Vaccinia para generar la estructura "Tapa 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). La estructura Capa 1 puede generarse usando tanto la Enzima de Protección del Virus Vaccinia como una 2'-O metil-transferasa para generar: m7G (5') ppp (5') G-2'-O-metilo. La estructura Capa 2 puede generarse a partir de la estructura Capa 1 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. La estructura Capa 3 puede generarse a partir de la estructura Capa 2 seguida de la 2'-O-metilación del nucleótido 5'-antepenúltimo usando una 2'-O metiltransferasa. Las enzimas se derivan preferentemente de una fuente recombinante.

Cuando se transfectan en células de mamífero, los ARNm modificados tienen una estabilidad de entre 12-18 horas, o mayor que 18 horas, por ejemplo, 24, 36, 48, 60, 72, o mayor que 72 horas.

Ejemplo 5. Reacción de adición de región poli-A

Sin una poli-T en el ADNc, una reacción de adición de la región poli-A se debe realizar antes de limpiar el producto final. Esto se hace mezclando ARN de IVT protegido (100 pl); Inhibidor de ARNasa (20 U); Tampón de cola 10x (Tris-HCl 0,5 M (pH 8.0), NaCl 2,5 M, MgCb100 mM)(12,0 pl); 20 mM ATP (6,0 pl); Poli-A Polimerasa (20 U); dH2O hasta 123,5 pl e incubación a 37 °C durante 30 min. Si la cola de poli-A ya está en la transcripción, entonces la reacción de cola puede omitirse y proceder directamente a la limpieza con el kit MEGACLEAR™ de Ambion (Austin, TX) (hasta 500 pg). La polimerasa poli-A es preferiblemente una enzima recombinante expresada en levadura.

Para los estudios realizados y descritos en esta invención, la región poli-A está codificada en la plantilla IVT para incluir 160 nucleótidos de longitud. Sin embargo, debe entenderse que la procesividad o la integridad de la reacción de cola de poli-A no siempre pueden dar como resultado exactamente 160 nucleótidos. Por tanto, regiones poli-A de aproximadamente 160 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 o 165, están dentro del alcance de la descripción.

Ejemplo 6. Procedimiento de detección de la expresión de proteínas

A. Ionización por electropulverización

Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por ARN alternativo administrado al sujeto se prepara y analiza según el protocolo del fabricante para ionización por electropulverización (ESI) usando 1, 2, 3 o 4 analizadores de masa. También se puede analizar una muestra biológica utilizando un sistema de espectrometría de masas ESI en tándem.

Los patrones de fragmentos de proteína, o proteínas completas, se comparan con controles conocidos para una proteína dada y la identidad se determina por comparación.

B. Desorción/ionización láser asistida por matriz

Una muestra biológica que puede contener proteínas codificadas por ARN alternativo administrado al sujeto se prepara y analiza según el protocolo del fabricante para la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

C. Cromatografía líquida-Espectrometría de masas-Espectrometría de masas

Una muestra biológica, que puede contener proteínas codificadas por ARN alternativo, puede tratarse con una enzima tripsina para digerir las proteínas que contiene. Los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquidaespectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS). Los péptidos se fragmentan en el espectrómetro de masas para producir patrones de diagnóstico que pueden compararse con las bases de datos de secuencias de proteínas mediante algoritmos informáticos. La muestra digerida se puede diluir para lograr 1 ng o menos de material de partida para una proteína dada. Las muestras biológicas que contienen un fondo de tampón simple (por ejemplo, agua o sales volátiles) son susceptibles de digestión directa en solución; fondos más complejos (por ejemplo, detergente, sales no volátiles, glicerol) requieren una etapa de limpieza adicional para facilitar el análisis de la muestra.

Ejemplo 7. Transfección

A. Transfección inversa

Para los experimentos llevados a cabo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos recubiertas de colágeno, los queratinocitos u otras células se siembran a una densidad celular de 1 * 105. Para experimentos realizados en una placa de cultivo de tejido con recubrimiento de colágeno de 96 pocillos, los queratinocitos se siembran a una densidad celular de 0,5 * 105. Para cada ARNm alternativo que se va a transfectar, se preparan ARNm alternativo: RNAIMAX™ como se describe y se mezcla con las células en la placa de pocillos múltiples dentro de las 6 horas posteriores a la siembra celular antes de que las células se hayan adherido a la placa de cultivo de tejidos.

B. Transfección hacia delante

En una placa de cultivo de tejidos recubierta de colágeno de 24 pocillos, las células se siembran a una densidad celular de 0,7 * 105. Para experimentos realizados en una placa de cultivo de tejido revestidos por colágeno de 96 pocillos, los queratinocitos, si se usan, se siembran a una densidad celular de 0,3 * 105. A continuación, las células se cultivan hasta una confluencia de >70 % durante más de 24 horas. Para cada ARNm alternativo que se va a transfectar, se prepara ARNm alternativo: RNAIMAX™ como se describe y transfecta en las células en la placa de pocillos múltiples durante 24 horas después de la siembra celular y la adherencia a la placa de cultivo de tejidos.

C. Pantalla traslacional: ELISA

Las células se cultivan en medio EpiLife con el Suplemento S7 de Invitrogen en una confluencia de >70 %. Las células se someten a transfección inversa con 300 ng del ARNm químicamente alternativo indicado complejado con RNAIMAX™ de Invitrogen. Alternativamente, las células se transfectan hacia delante con 300 ng de ARNm alternativo complejado con RNAIMAX™ de Invitrogen. El complejo ARN: RNAIMAX™ se forma incubando primero el ARN con medio EPILIFE® sin suplementos en una dilución volumétrica 5X durante 10 minutos a temperatura ambiente.

En un segundo vial, el reactivo RNAIMAX™ se incuba con medio EPILIFE® sin suplementos en una dilución volumétrica 10X durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, el vial de ARN se mezcla con el vial de RNAIMAX™ y se incuba durante 20-30 a temperatura ambiente antes de agregarlo a las células gota a gota. La concentración de polipéptido secretado en el medio de cultivo se mide 18 horas después de la transfección para cada uno de los ARNm químicamente alternativos por triplicado. La secreción del polipéptido de interés de las células humanas transfectadas se cuantifica utilizando un kit ELISA de Invitrogen o R&D Systems (Minneapolis, MN) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante.

D. Dosis y duración: ELISA

Las células se cultivan en medio EPILIFE® con suplemento S7 de Invitrogen a una confluencia de > 70 %. Las células están transfectadas inversas con ARNm alternativo de 0ng, 46,875ng, 93,75ng, 187,5ng, 375ng, 750ng, o 1500ng complejadas con RNAIMAX™ de Invitrogen. El complejo ARNm: RNAIMAX™ alternativo se forma como se describe. La concentración de polipéptido secretado en el medio de cultivo se mide a las 0, 6, 12, 24 y 48 horas después de la transfección para cada concentración de cada ARNm alternativo por triplicado. La secreción del polipéptido de interés de las células humanas transfectadas se cuantifica utilizando un kit ELISA de los sistemas Invitrogen o R&D siguiendo las instrucciones recomendadas por los fabricantes.

emp o . espuesta nmun tar a nnata ce u ar: e - eta y e -a a

Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para el factor de necrosis tumoral humano-a (TNF-a), el interferón-p humano (IFN-p) y el factor estimulante de colonias de granulocitos humanos (G-CSF) secretado de células de queratinocitos humanas transfectadas in vitrose prueban para la detección de una respuesta inmune innata celular.

Las células se cultivan en medio EPILIFE® con Suplemento de crecimiento humano en ausencia de hidrocortisona de Invitrogen en una confluencia de >70 %. Las células se someten a transfección inversa con 0 ng, 93,75 ng, 187,5 ng, 375 ng, 750 ng, 1500 ng o 3000 ng del ARNm químicamente alternativo indicado complejado con RNAIMAX™ de Invitrogen como se describe por triplicado. El TNF-a secretado en el medio de cultivo se mide 24 horas después de la transfección para cada uno de los ARNm químicamente alternativos utilizando un kit ELISA de Invitrogen según los protocolos del fabricante.

El IFN-p secretado se mide 24 horas después de la transfección para cada uno de los ARNm alternativos utilizando un kit ELISA de Invitrogen según los protocolos del fabricante. La concentración de hu-G-CSF secretada se mide 24 horas después de la transfección para cada uno de los ARNm alternativos. La secreción del polipéptido de interés de las células humanas transfectadas se cuantifica utilizando un kit ELISA de los sistemas Invitrogen o R&D (Minneapolis, MN) siguiendo las instrucciones recomendadas por los fabricantes. Estos datos indican qué ARNm alternativo es capaz de provocar una respuesta inmune innata celular reducida en comparación con los polinucleótidos naturales y otros polinucleótidos alternativos o compuestos de referencia midiendo citocinas de tipo 1 ejemplares tales como TNF-alfa e IFN-beta.

Ejemplo 9. Citotoxicidad y apoptosis

Este experimento demuestra la viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis para distintas células de queratinocitos humanos transfectadas in vitro con ARNm alternativo. Los queratinocitos se cultivan en medio EPILIFE® con suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos en ausencia de hidrocortisona de Invitrogen a una confluencia de > 70 %. Los queratinocitos están transfectados inversos con 0ng, 46,875ng, 93,75ng, 187,5ng, 375ng, 750ng, 1500ng, 3000ng, o 6000ng de ARNm alternativo complejado con RNAIMAX™ de Invitrogen. El ARNm alternativo: se forma el complejo RNAIMAX™. La concentración secretada de huG-CSF en el medio de cultivo se mide 0, 6, 12, 24 y 48 horas después de la transfección para cada concentración de cada ARNm alternativo por triplicado. La secreción del polipéptido de interés de los queratinocitos humanos transfectados se cuantifica utilizando un kit ELISA de los sistemas Invitrogen o R&D después de las instrucciones recomendadas de los fabricantes. La viabilidad celular, la citotoxicidad y la apoptosis se miden 0, 12, 48, 96 y 192 horas después de la transfección utilizando el kit APOTOX-GLO™ de Promega (Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 10. Ensayos in vivo con EPO humana que contiene nucleótidos alternativos

Formulación

Se formularon ARNm de hEPO alternativos en nanopartículas lipídicas (LNP) que comprenden DLin-KC2-DMA, DSPC, colesterol y PEG-DMG en 50:10:38,5:1,5 % en moles respectivamente (Tabla 4). Los LNP se prepararon mediante inyección directa utilizando nanoprecipitación de lípidos solubilizados en etanol en una solución de ARNm de citrato 50 mM de pH 4.0. Las distribuciones de tamaño de partícula de EPO LNP se caracterizaron por DLS. La eficiencia de encapsulación (EE) se determinó usando un ensayo basado en fluorescencia Ribogreen™ para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos.

Tabla 4: Condiciones de formulación

Procedimientos y datos

Mujer Balb/c ratones (n=5) se administraron 0,05 mg/kg IM (50 pl en el cuádriceps) o IV (100 pl en la vena de la cola) de ARNm de EPO humana. A las 8 horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y se recogió sangre en tubos separadores de suero. Las muestras se centrifugaron y, a continuación, las muestras de suero se procesaron en un ELISA de EPO siguiendo el protocolo del kit (Catálogo de tecnologías de células madre #01630).

Ejemplo 11. Incorporación de 3'-azido-2',3'-didesoxiadenosina-5'-trifosfato (3'-azido-ddATP)

Se incorporó 3'-azido-ddATP en el extremo 3' del ARN 1-3 sin cola (Tabla 4) usando polimerasa poli-A de levadura como se muestra en el Esquema 1. En reacciones de 100 pL, transcripción de ARN (0,2 pM), 3'-azido-ddATP (500 pM), inhibidor de la ARNasa murina (NEB) (1U/pL), 1 * tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM, pH 7.0, MnCh0,6 mM, EDTA 20 |j M, DTT 0,2 mM, 100 jg/m L BSA acetilada, glicerol al 10 %) y polimerasa poli-A de levadura (2400 U, Affymetrix) se incubaron a 37 °C durante 1 hora, seguido de precipitación con etanol. El ARN se disolvió en 100 j L tratado con DEPC H2O y se purificó adicionalmente por filtración en gel utilizando una columna NICK ilustra o ilustra columna MicroSpin G-25 (GE Healthcare). El ARN se concentró, si era necesario, mediante ultrafiltración utilizando un dispositivo centrífugo Amicon Ultra-0,5 (100K NMWL), se cuantificó mediante absorbancia UV y se analizó mediante electroforesis capilar (CE) (Agilent 2100 Bioanalyzer). El ARN obtenido en este punto era una mezcla de ARN sin modificar y 3'-azido que no se puede distinguir por CE, y esta mezcla se usó sin purificación adicional en reacciones posteriores.

ARN

3'-azido ddATP

Esquema 1. Síntesis general de 3'-azido ARN en comparación con 3’-azido ddATP sobre el

extremo 3' de ARN usando polimerasa poli(A) de levadura.

Las colas 1-6 de poli-A 5'-biciclo[6.1.0]nonino (BCN) se sintetizaron para generar conjugados de cola de ARN-poli-A usando la química de cicloadición azida-alquino promovida por cepas (SPAAC). Mientras que las colas 1 y 4 podrían sintetizarse directamente mediante la tecnología de oligomerización de fosforamidita en fase sólida, las colas 2, 3, 5 y 6 se sintetizaron primero como los derivados 5'-amino (colas 2a, 3a, 5a y 6a) que se acoplaron a continuación al grupo BCN reactivo a través de la química NHS (Esquema 2).

eóla 6a R - - T i t

Esquema 2. La síntesis de colas 2, 3, 5 y 6 se alcanza mediante el acoplamiento de los

oligoribonucleotidos 5'-am¡no correspondientes al BCN N-ester hldroxlsuccinlmida I.

Las colas 1, 2a, 3a, 4, 5a y 6a se ensamblaron en un Expedite 8909 ADN/ARN sintetizador (Perseptive) que emplea tecnología de oligomerización de fosforamidita en fase sólida. Las síntesis se iniciaron en un soporte sólido hecho de vidrio de poro controlado (CPG, 1000Á) con 3'-O-dimetoxitritil-timidina inmovilizada a una carga de 31 pmol/g (obtenido de Prime Synthesis, Aston, PA, EE. UU.) que genera un enlace 3'-3 'en el extremo 3' o 5'-O-dimetoxitritil-adenosina inmovilizada cargada a 32 pmol/g (Chemgenes, Wilmington, MA; EE. UU.). Para la síntesis de las secuencias deseadas se utilizaron las siguientes fosforamiditas: (5'-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil) -2'-O-t-butildimetilsilil-adenosina-3'-O-(2-cianoetil-N, N- diisopropilamino) fosforamidita, (5'-O-dimetoxitritil-N6-(benzoil) -2'-O-metil-adenosina-3'-O-(2-cianoetil-N, N-diisopropilamino) fosforamidita (SAFC Proligo, Hamburgo, Alemania) y 5'-Click-easy® BCN CEP II (Berry & Associates, Inc., Dexter; MI, EE. UU.). Para introducir un enlazador amino en el extremo 5' se empleó una aminohexilfosforamidita protegida con trifluoracetilo (TFA) (SAFC Proligo, Hamburgo, Alemania) o el correspondiente derivado propílico de Glen Research (Sterling, Virginia, EE. UU.). Todas las amiditas se disolvieron en acetonitrilo anhidro (100 mM) y se añadieron tamices moleculares (3Á). Se usó 5-etiltiotetrazol (ETT, 500 mM en acetonitrilo) como solución activadora. Los tiempos de acoplamiento fueron de 5 minutos para las fosforamiditas de nucleósidos y de 12 minutos para las amiditas enlazadoras. Los reactivos auxiliares para la síntesis de ARN se adquirieron de SAFC Proligo (Hamburgo, Alemania). Una vez completada la síntesis en fase sólida, el soporte sólido seco se transfirió a un tubo de polipropileno de 15 ml y el ARN se escindió del soporte sólido y se desprotegió mediante procedimientos conocidos en el campo (Wincott F., y col., Nucleic Acid Res., 1995, 23, 2677-84). Los oligómeros brutos se purificaron mediante RP HPLC usando una columna XBridge C18 19x 50 mm (Waters, Eschborn, Alemania) en un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare, Freiburg, Alemania). El tampón A era acetato de trietilamonio 100 mM (Biosolve, Valkenswaard, Países Bajos) y el tampón B contenía acetonitrilo al 95 % en el tampón A. Se empleó un caudal de 15 mL/min. Se registraron trazas de UV a 260 y 280. Se empleó un gradiente del 5 % B al 45 % B dentro de 57 volúmenes de columna. Se combinaron las fracciones apropiadas y se precipitaron con NaOAc 3 M, pH=5.2 y etanol al 70 %. El sedimento se aisló por centrifugación y se disolvió en agua, y la concentración de la solución se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm en un fotómetro UV (Eppendorf, Alemania).

Para que la etapa de acoplamiento produzca las colas 2, 3, 5 y 6 mediante la química del NHS como se muestra en el Esquema 2, el oligoribonucleótido modificado con amina respectivo se disolvió en sodio 100 mM borato/KCI tampón (pH 8.5) para producir una concentración de 500 pM. Click-easy® BCN N-hidroxisuccinimida éster I (5 mg, Berry & Associates, Inc., Dexter; MI, EE.UU.) se disolvió en 50 pl de DMSO. La reacción se inició mediante la adición de aproximadamente 3 equivalentes de derivado de BCN a la solución de ARN. El progreso de la reacción se controló mediante el cambio del tiempo de retención en una columna de HPLC de intercambio aniónico (Dionex DNA Pac PA200, 4x250 mm, Dionex, Idstein, Alemania). Una vez completada la reacción, el conjugado de oligoribonucleótido se precipitó usando NaOAc 3 M (pH 5.2)/EtOH y se purificó en una columna de HPLC de fase inversa C18 XBridge (Waters, Eschborn, Alemania). El análisis de todos los oligoribonucleótidos se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. ESI-MS y análisis de pureza de las colas 1-6

Ejemplo 12. Conjugación de la región poli-A mediante cicloadición azida-alquino promovida por cepas (SPAAC)

Las transcripciones de ARN modificadas en el extremo 3 ' con 3'-azido-ddATP se ligaron a colas poli-A de 5'-BCN de 80 nt usando SPAAC para dar conjugados de cola ARN-poli-A de la forma general que se muestra en el Esquema 3.

3'-azido ARN 1-3 y la cola 1 se mezclaron en al menos una relación molar 1:50, respectivamente, en agua y diluida con etanol hasta una concentración final de etanol al 70 %. Generalmente, la concentración de ARN 3'-azido estaba entre 150-400 nM en la mezcla de reacción. Las reacciones se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora, se diluyeron con agua hasta 200 pl si era necesario, se precipitaron con etanol y se disolvieron en agua tratada con DEpC. Alternativamente, las reacciones se purificaron con el kit MEGAclear (Ambion) y se eluyeron en agua. La mezcla de reacción de ARN se analizó mediante CE (Agilent 2100 Bioanalyzer). Las bandas desplazadas en los carriles 3, 5 y 7 representan conjugados ARN 1 — cola 1, ARN 2-cola 1 y ARN 3-cola 1, respectivamente, de la forma representada en el Esquema 3. Rendimientos de conversión de conjugados de ARN-cola 1 determinadas a partir de c E fueron del 71 % para ARN 1, 80 % para ARN 2 y 75 % para ARN 3.

También se hicieron conjugados de esta manera con ARN 4 y ARN 5, que ya contenían una cola poli-A mediante la transcripción por la ARN polimerasa T7, y las colas 1 y 4. Los rendimientos de conversión para estas reacciones (CE) fueron del 92 % para el A r N 4-cola 1, 91 % para ARN 4-cola 4, 99 % para ARN 5-cola 1 y 97% para ARN 5-cola 4. Para eliminar el exceso de cola 5'-BCN sin reaccionar, se hizo reaccionar la mezcla de reacción con azida de biotina (500 pM) en DMSO al 10 % agitando durante 1 hora a ta, seguido de una purificación MEGAclear. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a captura de estreptavidina con M-280 Streptavidin Dynabeads (Life Technologies). Las perlas (200 pL, 2 mg) se lavaron con un tampón con alto contenido de sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 0,5 M y EDTA 1 mM) tres veces y se resuspendieron en 200 pL de tampón con alto contenido de sal. La mezcla de reacción, que contenía aproximadamente 1,3 nmol de cola de 5'-BCN, se diluyó a 200 pl para obtener una concentración final de tampón con alto contenido de sal 1X, y se añadió a las perlas. La muestra y las perlas se mezclaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Este sobrenadante se guardó y se precipitó con etanol. Se usó CE para confirmar que las colas de 5'-biotina se eliminaron de las mezclas de reacción. La pureza de las construcciones en las que se hizo clic después de este procedimiento fue del 82 % para ARN 4-cola 1, 76 % para ARN 5-cola 1, 92 % para A r N 4-cola 4 y 87 % para ARN 5-cola 4.

5'- BCN Cola poli(A)

Esquema 3. Síntesis general de conjugados de cola poli-A ARN por SPAAC con 3’-azido ARN y cola 5 -BCN poli-A

Ejemplo 13. Conjugación de la región poli-A con plantilla de férula de ADN utilizando SPAAC

Se usó una férula de ADN (5'-TGCCGCCCACTCAGACTTTAT-3 ') complementaria al extremo 3' del ARN 1-3 (Tabla 6) y a la cola poli-A para moldear la reacción de SPAAC. Los conjugados de cola de ARN-poli-A se sintetizaron mezclando ARN 3'-azido, cola poli-A de 5'-BCN y férula en una proporción molar de 1: 3: 3 con concentraciones finales de 100 nM: 300 nM: 300 nM, respectivamente, en una reacción de 100 pL que contiene NaCl 1 M. La mezcla de férulas de ARN y ADN se calentó a 70 °C durante 5 min, se enfrió a 1 °C/min hasta alcanzar los 25 °C, y se mantuvo a 25 °C durante la noche. Las sales se eliminaron mediante ultrafiltración (dispositivo centrífugo Amicon Ultra-0,5 100K NMWL). La férula de ADN se eliminó mediante digestión con TURBO DNasa (Ambion) en reacciones de 50 pL que contenían no más de 200 ng/pL de la mezcla de reacción, 1x tampón de reacción y TURBO DNasa (2 U). Estas reacciones se incubaron durante 30 min a 37 °C y se terminaron mediante la adición de 2 pl de EDTA 0,5 M. Los componentes del tampón se eliminaron de nuevo mediante ultrafiltración. Los conjugados de cola de ARN-poli-A se purificaron a partir de ARN 3'-azido sin modificar y sin reaccionar usando oligo (T) Dynabeads (Ambion). La purificación de oligo (T) se realizó según las indicaciones del protocolo del fabricante, excepto que las perlas se lavaron y la muestra de ARN se preparó en un tampón con alto contenido de sal que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 0,5 M y EDTA 1 mM, la las perlas se lavaron después de unirse con un tampón bajo en sal que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, NaCl 0,1 M y e Dt A 1 mM, y los conjugados de cola de ARN-poli-A se eluyeron en Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, y EDTA 1 mM. Todas las etapas en la reacción de clic y purificación fueron analizados por CE (Agilent 2100 Bioanalyzer), con la reacción y purificación del ARN 1 con cola 1 para dar el conjugado ARN 1-cola 1. El porcentaje de rendimiento y pureza de estos conjugados se dan en la Tabla 7.

Tabla 6. Secuencias de construcciones de ARNm 1-7 donde U = 1-metil- seudouridina C = 5-metil-citidina.

Tabla 7. Rendimien r z n l AR l rifi i n oligo (T)

Ejemplo 14. Análisis de incorporación de 3'-azido-ddATP

Después de las reacciones de SPAAC en etanol al 70 %, se produce una mezcla de especies de ARN que presumiblemente incluye ARN no modificado, ARN 3'-azido sin reaccionar y el conjugado de ARN-cola 1 deseado. Sin embargo, esto solo corresponde a dos picos distintos en el electroferograma de CE, ya que el ARN no modificado y el ARN 3'-azido son indistinguibles. Dado que los conjugados 3'-azido ARN y ARN-cola 1 están bloqueados en el extremo 3' para la extensión de poli-A por la poli-A polimerasa, solo el ARN no modificado es un sustrato para la cola enzimática. El porcentaje de ARN no modificado, y por lo tanto ARN 3'-azido, se puede determinar calculando la diferencia de % en el área del pico correspondiente al ARN no modificado y la mezcla de ARN 3'-azido después de la eliminación del ARN no modificado y la normalización al área del pico conjugado del ARN-cola 1. En muchos casos, la reacción de clic se completa en las condiciones descritas, lo que permite una determinación de la incorporación de azida simplemente determinando el % de rendimiento del conjugado ARN-cola 1.

En 10 |jL, la mezcla de ARN después de la reacción de SPAAC en etanol al 70 % se trató con polimerasa de E. coli poliA (NEB) (5 U) en una reacción que contenía la mezcla de reacción de ARN (300 - 400 ng/jL), tampón de reacción ATP (1 mM), y 1x (50 mM Tris-HCl, pH 7.9, NaCl 250 mM, 10 mM MgCl 2). También se utilizaron reacciones que no contenían enzima para controles comparativos. También se realizaron controles en los que se mezcló ARN sin modificar con la cola 1 y se trató con poli-A polimerasa para garantizar que todo el ARN sin modificar se convirtiera en una cola. Las sales se eliminaron de las reacciones mediante ultrafiltración y las reacciones se analizaron mediante CE. En las reacciones de control, todo el ARN no modificado se alargó mediante el tratamiento con PAP. En todos estos casos, después de la reacción de SPAAC y el tratamiento con PAP, no queda ARN en el pico que representa la mezcla putativa de ARN sin modificar y ARN 3'-azido, lo que indica que las reacciones de clic se completaron y la incorporación de azida se pudo determinar a partir del % de rendimiento del conjugado ARN-cola. Para estos ejemplos, la incorporación de azida fue del 60 % para el ARN 1, del 60 % para el ARN 2 y del 75 % para el ARN 3.

Ejemplo 15. Área total bajo la curva de fluorescencia de mCherry

El ARNm indicado (50 ng) se transfectó usando Lipofectamine2000 ™ en células HeLa. Las células se colocaron en el sistema de imágenes cinéticas Incucyte (Essen Bioscience) donde se midió la fluorescencia de mCherry cada 2 horas durante 142 horas. Cada transfección se llevó a cabo por triplicado. El área total bajo la curva se integró usando GraphPad Prism. Las tablas 7 y 8 dan el AUC para la fluorescencia de mCherry de conjugados de cola 1 de ARN y controles apropiados, donde el ARN 4 y el ARN 5 son construcciones transcritas con ARN polimerasa T7 que contienen colas de poli-A de 80-mer y 140-mer, respectivamente. La Tabla 10 proporciona el AUC para conjugados de ARN de 4 colas y ARN de 5 colas.

Tabla 8. AUC r l fl r n i m h rr r n AR 1 l

Tabla 9. AUC ara la fluorescencia mCherr ara con u ados de ARN de 1 cola

Tabl 1 A r l fl r n i m h rr r n AR 4 l AR l

Ejemplo 16. Actividad de nanoluciferasa en células HeLa

El ARNm indicado (25 ng) se transfectó por triplicado usando Lipofectamine2000 ™ en células HeLa. Después de la incubación durante la noche, las células se lisaron en tampón de lisis GLO (Promega). Se añadió sustrato NanoGlo y se cuantificó la señal luminiscente utilizando Synergy MicroPlate Reader (BioTek). La Tabla 11 muestra la actividad de nanoLuciferasa para conjugados de ARN de 2 colas y controles apropiados, donde el ARN 6 es una construcción transcrita por ARN polimerasa de T7 que contiene una cola de poli-A de 140-mer.

Tabla 11. Activida n n l if r r n AR 2 l

Ejemplo 17. Expresión de GCSF humano en células HeLa

El ARNm indicado (250 ng) se transfectó por triplicado utilizando Lipofectamine2000™ en células Hela. Después de la incubación durante la noche, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir los niveles de GCSF humano (Sistemas R&D). La Tabla 12 proporciona los niveles de expresión de GCSF para conjugados de ARN de 3 colas y controles apropiados, donde el ARN 7 es una construcción transcrita por ARN polimerasa de T7 que contiene una cola de poli-A de 140-mer.

Tabla 12. Expresión F h m n r n AR l

Ejemplo 18. Niveles de IFNp en el sobrenadante de fibroblastos de BJ transfectados con ARNm

El ARNm indicado (500 ng) se transfectó por triplicado usando Lipofectamine2000™ en fibroblastos BJ. Después de la incubación durante 48 horas, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir los niveles de interferón-p humano (Sistemas R&D). La Tabla 13 proporciona la cantidad de IFNp detectado para conjugados de ARN de 2 colas y controles apropiados, donde el ARN 6 es una construcción transcrita con ARN polimerasa de T7 que contiene una cola de poli-A de 140-mer y el ARN 6 de tipo salvaje se transcribe sin nucleótidos modificados.

Tabla 13. Expresión inducida or INF ara con u ados de ARN de 2 colas

Ejemplo 19. Síntesis de ARNm que incluye una región estabilizadora 3' de 10-mer

De manera similar al Ejemplo 11 anterior, se incorporó 3'-azido-ddATP en el extremo 3' del ARNm que ya contenía una cola de poli(A) de 100 nt usando poli(A) polimerasa de levadura como se muestra en el Esquema 4. Antes de la reacción, el ARNm se desnaturalizó calentando a 65 °C durante 15 min seguido de enfriamiento en hielo. La reacción se realizó de la siguiente manera: transcrito de ARN (1 |j M), 3'-azido-ddATP (100 j M), inhibidor de la ARNasa murina (NEB) (1 U/j L), 1x tampón de reacción (Tris-HCl 20 mM, pH 7.0, MnCh 0,6 mM, EDTA 20 j M, DTT 0,2 mM, 100 jg/mL BSA acetilada, 10 % de glicerol) y polimerasa de poli(A) de levadura (75U/uL, Affymetrix) se mezclaron y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. El ARN se aisló usando una columna giratoria de membrana de sílice (EconoSpin, EPOCH Life Sciences), se eluyó en agua y la solución de ARN se desaló adicionalmente mediante ultrafiltración (30K NMWL, Amicon). El ARN se cuantificó mediante absorbancia UV y se analizó mediante electroforesis capilar (CE) (Agilent 2100 Bioanalyzer) y HPLC (Figura 1 y 2). El ARN obtenido en este punto fue una mezcla de ARN no modificado y 3'-azido, y esta mezcla se usó sin purificación adicional en reacciones posteriores.

A continuación, se sintetizaron varios ARNm con colas estabilizadas en 3' usando cicloadición azida-alquino promovida por cepa de manera similar al Ejemplo 12. Las transcripciones de ARN modificadas en el extremo 3' con 3'-azidoddATP se ligaron a oligos 5'-BCN usando cicloadición azida-alquino promovida por cepa (SPAAC) para dar conjugados de ARN de la forma general mostrada en el Esquema 5. 3' -azido ARN y 5'-BCN oligo 1 se mezclaron en al menos una relación molar 1:50, respectivamente, en agua y etanol precipitado añadiendo 1/10 volumen de NaOAc (3 M, pH 5.5) y 3 veces el volumen de EtOH frío al 100 %. Generalmente, la concentración de ARN 3'-azido estaba entre 1 y 125 ng/uL en la mezcla de reacción. Las reacciones se mezclaron bien, se pusieron en hielo seco durante 15 min o a -20° durante la noche y se centrifugaron a 13,2 rpm durante 25 min para sedimentar el ARN. Se eliminó el sobrenadante y se lavó la pastilla con EtOH frío al 70 %. La pastilla seca se disolvió en agua. Las reacciones de ARN se purificaron con el kit MEGAclear (Ambion) para eliminar el exceso de oligo 5'-BCN, se eluyó en agua y la solución de ARN se desaló adicionalmente mediante ultrafiltración (30K NMWL, Amicon). El ARN se cuantificó mediante absorbancia UV y se analizó mediante CE (Agilent 2100 Bioanalyzer) y HPLC (Water Aquity UPLC).

]Un ejemplo de un oligo modificado con 5'-BCN usado es el oligo que incluye diez L-adenosinas que se muestran a continuación.

En la Tabla 14 se muestra ARNm alternativo con colas estabilizadas que se sintetizaron utilizando el procedimiento anterior.

Tabla 14. ARNm sintetizado con cola estabilizada en 3'

La secuencia de ARNm de partida para experimentos de expresión hEPO fue: N7mGpppmGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGAGUGCA CGAGUGUCCCGCGUGGUUGUGGUUGCUGCUGUCGCUCUUGAGCCUCCCACUGGGACUGCCUGU GCUGGGGGCACCACCCAGAUUGAUCUGCGACUCACGGGUACUUGAGAGGUACCUUCUUGAAGCC AAAGAAGCCGAAAACAUCACAACCGGAUGCGCCGAGCACUGCUCCCUCAAUGAGAACAUUACUGU ACCGGAUACAAAGGUCAAUUUCUAUGCAUGGAAGAGAAUGGAAGUAGGACAGCAGGCCGUCGAAG UGUGGCAGGGGCUCGCGCUUUUGUCGGAGGCGGUGUUGCGGGGUCAGGCCCUCCUCGUCAACU CAUCACAGCCGUGGGAGCCCCUCCAACUUCAUGUCGAUAAAGCGGUGUCGGGGCUCCGCAGCUU GACGACGUUGCUUCGGGCUCUGGGCGCACAAAAGGAGGCUAUUUCGCCGCCUGACGCGGCCUC CGCGGCACCCCUCCGAACGAUCACCGCGGACACGUUUAGGAAGCUUUUUAGAGUGUACAGCAAU UUCCUCCGCGGAAAGCUGAAAUUGUAUACUGGUGAAGCGUGUAGGACAGGGGAUCGCUGAUAAU AGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCU UCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA, donde cada U es 5-metoxi-uridina.

Ejemplo 19. Expresión in vitro de ARNm de hEPO estabilizado

El ARNm se transfectó por triplicado usando Lipofectamine2000 ™ en células HeLa. Después de la incubación durante la noche, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir los niveles de GCSF humano (Sistemas R&D). Se encontró que el ARNm con colas estabilizadas en 3' tenía una expresión comparable de hEPO en células HeLa en comparación con el ARNm de control sin colas estabilizadas en 3'.

Ejemplo 20. Inducción de INFp in vitro en fibroblastos de BJ

El ARNm se transfectó por triplicado usando Lipofectamine2000™ en fibroblastos BJ. Después de la incubación durante 48 horas, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir los niveles de interferón-p humano (Sistemas R&D). Se encontró que el ARNm con colas estabilizadas en 3' tenía una inducción comparable de INFp en fibroblastos BJ en comparación con el ARNm de control sin colas estabilizadas en 3'.

Ejemplo 21. Expresión in vivo de ARNm de hEPO estabilizado en ratones CD-1 (estudio de 1 día)

Utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, se comparó la expresión del ARNm alternativo del Ejemplo 24 con un ARNm de control que carecía de una cola estabilizada en 3'. A cinco ratones hembra CD-1 se les administró el ARNm por vía intravenosa a 0,05 mg/kg. Como se muestra en la Tabla 15 a continuación, a las 24 horas, el ARNm que contenía las colas estabilizadas en 3' tenía mayor expresión que el ARNm de control.

Tabla 15. Ex resión in vivo de hEPO a artir de ARNm con colas estabilizadas en 3'

Ejemplo 22. Expresión in vivo de ARNm de hEPO estabilizado en ratones CD-1 (estudio de 3 día)

Usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, se comparó la expresión del ARNm alternativo del Ejemplo 24 con un ARNm de control que carece de una cola estabilizada en 3'. A cinco ratones hembra CD-1 se les administró el ARNm por vía intravenosa a 0,05 mg/kg. Como se muestra en la Tabla 16 a continuación, a las 72 horas, el ARNm que contiene las colas estabilizadas en 3' tenían una mayor expresión que el ARNm de control. Como se muestra en la Figura 1, el ARNm con colas estabilizadas en 3' tiene un AUC mayor durante 72 horas en comparación con los controles que carecen de la cola estabilizada en 3'.

T l 1 Ex r i n in i hEP AR m n l iliz '

Ejemplo 23. Expresión in vivo de ARNm hEPO estabilizado en ratones CD-1 (estudio de 4 días)

Usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, se comparó la expresión del ARNm alternativo del Ejemplo 24 con un ARNm de control que carece de una cola estabilizada en 3'. Se administraron a cinco ratones CD-1 hembra los ARNMS por vía intravenosa a 0,05 mg/kg o 0,5 mg/kg. Como se muestra en las Tablas 16 y 17 a continuación, a las 96 horas, el ARNm que contenía las colas estabilizadas en 3' tenía mayor expresión que el ARNm de control en ambos 0,05 mg/kg y 0,5 mg/kg. Como se muestra en las figuras 2 y 3, el ARNm con colas estabilizadas en 3' tiene un AUC más grande durante 72 horas en comparación con los controles que carecen de la cola estabilizada en 3'.

T l 1 Ex r i n in i HEP AR m n l iliz n ' n m k

Tabla 18. Ex resión in vivo de hEPO de ARNm con colas estabilizadas 3' a 05 m /k .

Ejemplo 24. Síntesis de ARNm alternativo con cola estabilizada en 3' unida a través de un enlazador m orfolino

Se disolvió un ARNm con una cola A100 en HEPES-Na 50 mM, pH 8, que contenía DMSO al 33 %, y se incubó con un exceso molar de 1000 veces de NalO4 en presencia de un exceso molar de 1000 veces de una molécula reactiva con aldehído. En este caso, el grupo reactivo era un aminooxi, pero también se pueden usar hidrazidas, tiosemicarbazidas y aminas seguidas de reducción con cianoborohidruro de sodio para unir covalentemente un grupo al extremo 3' de un ARNm.

La reacción se realiza en la oscuridad durante 30 minutos en hielo. Una vez finalizada la reacción, se añade glicerol como inactivación en un exceso molar de 100 veces a NalO4 y se mezcla bien. La purificación del ARNm modificado fuera de la reacción por los productos se puede lograr mediante cualquiera de varios procedimientos que incluyen exclusión de tamaño, intercambio aniónico, fase inversa, interacción hidrófoba y captura de ligando.

Para la unión de la cola de BCN-LA10, primero se unió aminooxi-TEG-azida al ARNm como se muestra en el Esquema 6, y el ARNm sin reaccionar se purificó del ARNm reaccionado mediante HPLC de fase inversa hasta una pureza elevada.

Esquema 6. Formación de eniazador morfolino

Después del tratamiento con peryodato, se realizó una reacción de taponamiento en el ARNm usando vaccinia, 2'-O-metiltransferasa, GTP y SAM para tapar el ARNm con Capa 1.

A continuación, se añadió al ARNm un exceso molar de 10 veces de BCN-LA10 y la reacción se llevó a sequedad al vacío con calentamiento suave. El exceso de BCN-LA10 se eliminó del ARNm modificado mediante cromatografía de exclusión por tamaño proporcionando un ARNm que contenía 10 L-ribosa adenosinas unidas a su extremo 3'(3'-ATA-BCNLA10) como se muestra en el Esquema 7 a continuación.

Esquema 7. Síntesis de cola estabilizada 3 que contiene ARNm

La secuencia de ARNm inicial para los experimentos de expresión de HEPO fue: N7mGpppmGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGAGUGCA CGAGUGUCCCGCGUGGUUGUGGUUGCUGCUGUCGCUCUUGAGCCUCCCACUGGGACUGCCUGU GCUGGGGGCACCACCCAGAUUGAUCUGCGACUCACGGGUACUUGAGAGGUACCUUCUUGAAGCC AAAGAAGCCGAAAACAUCACAACCGGAUGCGCCGAGCACUGCUCCCUCAAUGAGAACAUUACUGU ACCGGAUACAAAGGUCAAUUUCUAUGCAUGGAAGAGAAUGGAAGUAGGACAGCAGGCCGUCGAAG UGUGGCAGGGGCUCGCGCUUUUGUCGGAGGCGGUGUUGCGGGGUCAGGCCCUCCUCGUCAACU CAUCACAGCCGUGGGAGCCCCUCCAACUUCAUGUCGAUAAAGCGGUGUCGGGGCUCCGCAGCUU GACGACGUUGCUUCGGGCUCUGGGCGCACAAAAGGAGGCUAUUUCGCCGCCUGACGCGGCCUC CGCGGCACCCCUCCGAACGAUCACCGCGGACACGUUUAGGAAGCUUUUUAGAGUGUACAGCAAU UUCCUCCGCGGAAAGCUGAAAUUGUAUACUGGUGAAGCGUGUAGGACAGGGGAUCGCUGAUAAU AGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCU UCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA, donde cada U es 5-metoxi-uridina.

Ejemplo 25. Expresión in vitro de hEPO en fibroblastos BJ con ARNm alternativo con cola estabilizada en 3' unida a través de un enlazador morfolino

Usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, se comparó la expresión del ARNm alternativo del Ejemplo 24 con un ARNm de control que carece de una cola estabilizada en 3'. Como se muestra en la Tabla 19 a continuación, a las 48 horas, el ARNm que contiene la cola estabilizada en 3' tiene una mayor expresión que el ARNm de control.

Tabla 19. Expresión in vitro de hEPO en fibroblastos BJ a las 48 horas

Ejemplo 26. Inducción de INFp in vitro en fibroblastos de BJ

El ARNm indicado se transfectó por triplicado utilizando Lipofectamine2000™ en fibroblastos BJ. Después de la incubación durante 48 horas, se recogió el sobrenadante y se utilizó para medir los niveles de interferón-p humano (Sistemas R&D). La Tabla 20 da la cantidad de IFNp detectado para conjugados y controles apropiados.

Tabla 20. Inducción de INF en fibroblastos de BJ a artir de ARNm con colas estabilizadas en 3'

Ejemplo 27. Estabilidad in vitro de oligonucleótidos de 25-mer y ARNm con colas estabilizadas en 3'

Se ensayó la estabilidad de varios oligonucleótidos 25-mer (Tabla 21).

Tabla 21. O li onucleótidos 25-mer ara estudio de estabilidad

Cada reacción contenía las siguientes concentraciones: (a) oligonucleótido 0,2 pM; (b) Kit IVT de ADN acoplado humano de 1 etapa de Thermo Scientific (88882), cuya mezcla se ensambló según las instrucciones del fabricante, con la excepción de que la cantidad final de lisado utilizada en las reacciones se diluyó 300 veces; (c) concentración final de NaCl de 50 mM; (d) concentración final de MgCb de 2 mM; (e) concentración final de Tris-HCl, pH 7.5 de 20 mM; y (f) concentración final de BME de 1 mM. A continuación, las reacciones se incubaron a 37 °C y la reacción se resolvió en un 15 %/7M gel de urea TBE. Las bandas se visualizaron y cuantificaron utilizando el software ChemiDoc e Image Lab de BioRad.

Como se muestra en la Figura 4, los oligonucleótidos con dos 2'-O-metoxi-adenosinas y una timidina invertida en el extremo 3 '(264-40-2, 264-40-3 y 264-40-5) habían aumentado estabilidad sobre el oligonucleótido con solo adenosinas en el extremo 3' (no modificado).

Ejemplo 28. Expresión in vitro de mCitrine en células HeLa

Se prepararon varias construcciones (Tabla 22) con ARN que contenía una cola de T80 a través de la transcripción de T7 con un oligonucleótido poliA de 10-mer pulsado en el extremo como se describió anteriormente.

Cada construcción tiene la estructura:

donde la "Cola" para cada construcción se enumera en la Tabla 22 a continuación.

Tabla 22. Construcciones de mCitrina con colas estabilizadas en 3'

Protocolo:

Las células HeLa se sembraron a 7500 células/pociMo en una placa de 96 pocilios. Al día siguiente, los ARNm se transfectaron usando Lipofectamine 2000 a una concentración final de 50 ng por pocillo. El medio se reemplazó con medio fresco cuatro horas después de la transfección. La fluorescencia de la placa se leyó cada hora durante 72 horas a 37 °C en un lector de placas IncuCyte ZOOM.

Resultados:

Como se muestra en la Figura 5, las construcciones con colas estabilizadas en 3' tenían una expresión similar a las construcciones no modificadas in vitro.

Ejemplo 29. Análisis in vivo de la inducción de IL-6 por ARNm con y sin colas estabilizadas en 3'

Protocolo:

Se usó un ensayo multiplex quimiocina/citocina Luminex (eBioscience; cat # EPX360-26092-901) según las instrucciones del fabricante, excepto que se usaron 10 pl de suero y se colocaron en una placa Curiox DropArray de 96 pocillos y los lavados se realizaron con TBST al 0,01 %. El análisis de la intensidad de la fluorescencia se realizó con el software Biorad BioPlex Results Generator y todas las concentraciones mostradas se derivan en base a una curva estándar para cada analito.

Resultados:

Como se muestra en la Tabla 23, no hubo diferencias significativas en la inducción de IL-6 por el ARNm con colas estabilizadas en 3' en comparación con el ARNm sin modificar. Cada construcción de ARNm incluye la secuencia HEPO de ARNm (T7 T100): N7mGpppmGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACCAUGGGAGUGCA CGAGUGUCCCGCGUGGUUGUGGUUGCUGCUGUCGCUCUUGAGCCUCCCACUGGGACUGCCUGU GCUGGGGGCACCACCCAGAUUGAUCUGCGACUCACGGGUACUUGAGAGGUACCUUCUUGAAGCC AAAGAAGCCGAAAACAUCACAACCGGAUGCGCCGAGCACUGCUCCCUCAAUGAGAACAUUACUGU ACCGGAUACAAAGGUCAAUUUCUAUGCAUGGAAGAGAAUGGAAGUAGGACAGCAGGCCGUCGAAG UGUGGCAGGGGCUCGCGCUUUUGUCGGAGGCGGUGUUGCGGGGUCAGGCCCUCCUCGUCAACU CAUCACAGCCGUGGGAGCCCCUCCAACUUCAUGUCGAUAAAGCGGUGUCGGGGCUCCGCAGCUU GACGACGUUGCUUCGGGCUCUGGGCGCACAAAAGGAGGCUAUUUCGCCGCCUGACGCGGCCUC CGCGGCACCCCUCCGAACGAUCACCGCGGACACGUUUAGGAAGCUUUUUAGAGUGUACAGCAAU UUCCUCCGCGGAAAGCUGAAAUUGUAUACUGGUGAAGCGUGUAGGACAGGGGAUCGCUGAUAAU AGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCU UCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAA, donde cada U es 5-metoxi-uridina.

T100 264-10-10 y T100 264-10-7 se han modificado mediante la adición de un nucleósido que contiene azida en el extremo 3' y la reacción de clic como se describe anteriormente y tienen la estructura:

en la que la "cola" es 10 L-adenosinas consecutivas para T100 264-10-10 y 7 adenosinas consecutivas seguidas de dos 2'-O-metoxi-adenosinas y una timidina invertida para T100 264-10-7. El control de proceso T100 hEPO es la misma construcción que T7 T100, pero se ha sometido a las mismas condiciones que las construcciones modificadas con la excepción del azido-nucleósido; por lo tanto, no se produjo ninguna reacción de química de clic.

Tabla 23. Inducción de IL-6 in vivo por ARNm seleccionado a las 3 horas y a las 6 horas

3hr

promedio Desv. Est.

T7 1003hr 0,05mg/kg 6,106 1,367362 T100 264-10-10 (LA) 3 horas 0,05mg/kg 7,1 0

T100 264-10-7 (2, 2'OMe A, T inv.) 3 horas 0,05mg/kg 6,254 1,891714 Control de proceso T100 hEPO 3 horas 0,05mg/kg 7,1 0

Control de proceso T100 hEPO 3 horas 0,5mg/kg 88,36 27,7893

PBS 3hr 5,55 2,684679

6hr

T7 1006 horas 0,05mg/kg 62,616 77,09579 T100+ 264-10-10 (10-L-A) 6 horas 0,05mg/kg 66,024 43,22882 T100 264-10-7 (7rA-2, 2'OMe A, T inv.) 6 horas 0,05mg/kg 260,566 414,9281 Control de proceso T100 hEPO 6 horas 0,05mg/kg 145,206 135,9057 Control de proceso T100 hEPO 6 horas 0,5mg/kg 61,32 64,56854

PBS 6hr 256,7067 312,9453

Ejemplo 30. Expresión in vivo de hEPO por ARNm con y sin colas estabilizadas en 3'

Usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 6, se comparó la expresión del ARNm alternativo seleccionado con un ARNm de control que carece de una cola estabilizada en 3'. A cinco ratones hembra CD-1 se les administró el ARNm por vía intravenosa a 0,05 mg/kg. Como se muestra en las Tablas 23 y 24, por debajo del ARNm que contiene las colas estabilizadas en 3' tenían una mayor expresión que el ARNm de control.

Las construcciones probadas incluyen T7 T100 hEPO, T 100264-10-10, T100264-10-7, 3'-ATA-BCNLA-10 y el control de proceso descrito anteriormente.

Se prepararon 10 LA BCN1 y C6 y 10 LA BCN1 y C3 como se describe para T100264-10-10, T100264-10-7, donde el enlazador BCN en la reacción de química del clic tenía la estructura:

Tabla 25. Expresión in vivo de hEPO

Cada uno de T100 264-10-10, T100 264-10-7 (7rA-2, 2'OMe A, T inv.), 5rA-5 LA, 8rA-2 LA, 9rA-1 LA, 20 LA y 5 LA tiene la estructura:

donde la "Cola "para cada construcción se enumera en la Tabla 26 a continuación.

Tabla 26. Construcciones mCitrina con colas estabilizadas en 3'

5rA-5 LA, 8rA-2 LA y 9rA-1 LA se prepararon con un procedimiento similar al de la preparación para T100+ 264-10-10 descrito anteriormente.

Tio- PEG-Biotina int. se preparó usando el procedimiento para preparar 3'-ATA-BCNLA-10 descrito en el Ejemplo 24, en el que se usó alcoxiamina-PEG4-SS-PEG4-Biotina en lugar de aminooxi-TEG-azida.

Se preparó mal-tio LA10 utilizando el procedimiento que se describe a continuación:

se disolvió un ARNm con una cola A100 en HEPES-Na 50 mM, pH 8, que contenía DMSO al 33 %, y se incubó con un exceso molar de 1000 veces de NalO4 en presencia de un exceso molar de 500 veces de una molécula reactiva con aldehído que contiene un enlace disulfuro. En este caso, el grupo reactivo era un aminooxi, pero también se pueden usar hidrazidas, tiosemicarbazidas y aminas seguidas de reducción con cianoborohidruro de sodio para unir covalentemente un grupo al extremo 3' de un ARNm.

La reacción se realiza en la oscuridad durante una hora sobre hielo. Una vez finalizada la reacción, se añade glicerol como inactivación en un exceso molar de 100 veces a NalO4 y se mezcla bien. La purificación del ARNm modificado fuera de la reacción por productos se puede lograr mediante cualquiera de una serie de procedimientos, incluida la exclusión de tamaño, el intercambio de aniones, la fase inversa, la interacción hidrófoba, la captura del ligando, etc. Para la unión de la cola de LA10, se unió aminooxi-PEG-SS-PEG-biotina (APSSPB) al ARNm y se realizó una purificación por captura de oligo afinidad para eliminar el exceso de APSSPB del ARNm. El oligo reactivo se preparó haciendo reaccionar LA10 terminado en 5' amino con éster de N-Y-maleimidobutiril-oxisulfosuccinimida (sulfo-GMBS) en PBS en el banco durante 30 minutos antes de usar la ultrafiltración para eliminar el exceso de sulfo-GMBS. El ARNm terminado en APSSPB se activó escindiendo el enlace disulfuro al reaccionar con un exceso molar de 5000 veces de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) en HEPES-Na 50 mM, pH 6.5 en el banco durante 1 hora. La biotina PEG que contiene tio libre se eliminó del ARNm mediante ultrafiltración.

Se mezcló ARNm que contenía el tiol 3' libre con un exceso molar de 12 veces del oligo LA10 que contenía una maleimida 5' y se llevó a sequedad al vacío con calentamiento suave. El exceso de maleimida-LAl0 se eliminó del ARNm modificado mediante purificación por captura de oligo afinidad.

La estructura de Mal-tio-LA10 es:

donde "Cola" son 10 L-adenosinas consecutivas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la estructura de Fórmula I:

A'-L-B ' FórmulaI

donde A' comprende:

(a) al menos una estructura de capa 5';

(b) una 5'-UTR;

(c) una región codificante; y

(d) una 3'-UTR;

B' comprende una región estabilizadora 3' que comprende de 1 a 500 nucleósidos, en la que dicha región estabilizadora comprende al menos un nucleósido alternativo, en el que dicho nucleósido alternativo es timidina invertida; y

L es un enlazador.

2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en el que dicha región estabilizadora comprende una pluralidad de nucleósidos alternativos, preferiblemente

donde dicha región estabilizadora comprende al menos dos nucleósidos alternativos diferentes, preferiblemente donde al menos un nucleósido alternativo es 2-O-metil-adenosina, y al menos un nucleósido alternativo es timidina invertida, más preferiblemente

donde dicha región estabilizadora comprende la estructura:

o una sal del mismo;

donde cada X es, independientemente O o S; y

A representa adenina y t representa la timina.

3. El polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicha región estabilizadora comprende 10 nucleósidos.

4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho enlazador tiene la estructura:

donde a, b, c, e, f y g son cada uno, independientemente, 0 o 1;

d es 0, 1, 2, o 3;

cada uno de R6 R8' R10 y R12 se seleccionan, independientemente, de alquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente sustituido, O, S, Se, y NR13;

R7 y R11 son cada uno, independientemente, carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo o fosforilo, donde si R7 es fosforilo, -(R9)d- es un enlace, y e, f, y g son 0, a continuación al menos uno de R6 o R8 no es O; y si R11 es fosforilo, -(R9)des un enlace, y a, b, y c son 0, a continuación al menos uno de R10° o R12 no es O;

cada uno de R9 es alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, o un enlazador de enlace (R6)a-(R7)b-(R8)c a (R10°)e-(R11)f-(R12)9, donde si -(R9)d- es un enlace, a continuación al menos uno de a, b, c, d, e, o f es 1; y

R13 es hidrógeno, alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C4 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C4 opcionalmente sustituido, heterociclilo C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo C6-C12 opcionalmente sustituido, o heteroalquilo C1-C7 opcionalmente sustituido, preferiblemente

donde dicho enlazador comprende:

donde B1 es una nucleobase; y

R14 y R15 son cada uno independientemente hidrógeno o hidroxi.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en el que dicho enlazador comprende:

donde o es 0, 1, 2, o 3;

Y1° es O, un enlace, alquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenileno C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinileno C2-C10 opcionalmente sustituido, heterociclileno C2-C10 opcionalmente sustituido, arileno C6-C12 opcionalmente sustituido, polietilenglicoleno C2-C100 opcionalmente sustituido, o heteroalquileno C1-C10 opcionalmente sustituido, preferiblemente

donde (a) dicho enlazador comprende

donde p es 0, 1, 2, 3, 4, o 5; o

(b) dicho enlazador comprende:

donde q y r son cada uno, independientemente, 1,2, 3, 4, o 5.

6. El polinudeótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho enlazador puede formarse mediante una reacción de química de clic entre un par de reacciones químicas de clic, preferiblemente en el que dicho enlazador comprende:

o un enlace amida, más preferiblemente en el que dicho enlazador comprende la estructura:

más preferiblemente en el que dicho enlazador comprende la estructura:

7. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho enlazador está unido al extremo 3' de A' y al extremo 5' de B'.

8. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde

(a) dicha 5'-UTR comprende una secuencia de Kozak;

(b) dicha región estabilizadora en 3' comprende el extremo 3' de dicho polinucleótido; y/o

(c) al menos una de dicha región de codificación, dicha 5'-UTR, dicha 3'-UTR, y/o dicha estructura de capa 5' comprende al menos un nucleósido alternativo, preferiblemente

en el que dicho nucleósido alternativo es una uridina sustituida en 5, una pseudouridina sustituida en 1 o una citidina sustituida en 5, más preferiblemente

en el que dicho nucleósido alternativo es 5-metoxi-uridina o 5-metil-citidina.

9. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que A' comprende además una región poli-A que comprende al menos un nucleósido alternativo.

10. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un procedimiento para aumentar la expresión de un polipéptido recombinante, preferiblemente un polipéptido terapéutico, de interés en una célula, preferiblemente una célula de mamífero tal como una célula humana, que comprende poner en contacto el célula con un polinucleótido, preferiblemente un ARNm, que codifica dicho polipéptido, y donde la expresión aumenta en comparación con el polinucleótido no modificado.

11. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un procedimiento para aumentar la vida media de un polinucleótido, preferiblemente un ARNm que codifica un polipéptido terapéutico, en una célula, preferiblemente una célula de mamífero tal como una célula humana, que comprende poner en contacto la célula con dicho polinucleótido, en el que la vida media aumenta en comparación con el polinucleótido no modificado.