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ES2991621T3 - Separación de oligosacáridos de caldo de fermentación - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para separar oligosacáridos sialilados de un caldo de fermentación en el que son producidos por un microorganismo genéticamente modificado. La separación comprende las etapas de: i) ultrafiltración; ii) nanofiltración; iii) opcionalmente, tratamiento con carbón activado; y iv) tratamiento con resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Separación de oligosacáridos de caldo de fermentación
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para separar un oligosacárido sialilado de un caldo de fermentación obtenido cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido sialilado a partir de un precursor de carbohidrato internalizado.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Durante las últimas décadas, el interés en la preparación y comercialización de oligosacáridos de leche humana (HMO) ha estado aumentando constantemente. La importancia de los oligosacáridos de leche humana está vinculada directamente a sus actividades biológicas únicas. Los oligosacáridos de leche humana sialilados tales como disialillacto-N-tetraosa, 3’-O-sialil-3-O-fucosil-lactosa, 6’-O-sialil-lactosa, 3’-O-sialil-lactosa, 6’-O-sialilado-lacto-N-neotetraosa y 3’-O-sialilado-lacto-N-tetraosa están entre los componentes principales de la leche humana. En estos oligosacáridos de leche humana sialilados, el residuo ácido siálico está siempre enlazado a la posición 3-O- y/o 6-O-de una D-galactosa terminal o a la posición 6-O- de un residuo GlcNAc no terminal por medio de enlaces a-glicosídicos. Se cree que los HMO sialilados tienen beneficios para la salud significativos para el neonato, debido a sus papeles en respaldar la resistencia a patógenos, la maduración del intestino, la función inmune y el desarrollo cognitivo (ten Bruggencateet al. Nutr. Rev.72, 377 (2014)).
Los esfuerzos por desarrollar procesos para sintetizar HMO, incluyendo HMO sialilados, han aumentado significativamente en los últimos diez años debido a sus papeles en numerosos procesos biológicos humanos. A este respecto, se han desarrollado procesos para producirlos mediante fermentaciones microbianas, procesos enzimáticos, síntesis químicas o combinaciones de estas tecnologías. Con respecto a la productividad, los procesos de fermentación, a escala de laboratorio, para producir 3’-SL y 6’-SL han demostrado ser prometedores.
Sin embargo, para aislar lactosas sialiladas u oligosacáridos sialilados a partir de una matriz compleja tal como un caldo de fermentación es una tarea difícil. Antoineet al. Angew. Chem. Int. Ed.44, 1350 (2005) y el documento US 2007/0020736 han dado a conocer la producción de 3’-SL y lactosas di- y trisialiladas acompañantes mediante unaE. colimodificada genéticamente; el caldo que contenía aproximadamente 0,8 mM de 3’-SL se trató tal como sigue: adsorción de los productos del sobrenadante centrifugado sobre carbón/Celite, eliminación mediante lavado de las sales solubles en agua con agua destilada, elución de los compuestos mediante etanol acuoso en gradiente, separación de los productos sialilados en una columna Biogel y desalación, conduciendo a 49 mg de 3’-SL a partir de 1 litro de caldo. El documento WO 01/04341 y Priemet al. Glycobiology12, 235 (2002) han dado a conocer la producción de 3’-SL mediante unaE. colimodificada genéticamente; se aisló 3’-SL mediante la siguiente secuencia de operaciones: permeabilización con calor de las células productoras seguido de centrifugación, adsorción del producto del sobrenadante sobre carbón/Celite, eliminación mediante lavado de las sales solubles en agua con agua destilada, elución del compuesto mediante etanol acuoso en gradiente, unión del compuesto a un intercambiador aniónico fuerte en forma de HCO<3>-, elución del compuesto con una disolución de NaHCO3 de gradiente lineal, entonces eliminación del bicarbonato de sodio con un intercambiador catiónico (en forma de H+), dando como resultado 3’-SL aislada con un rendimiento de purificación del 49%. El documento WO 2007/101862 y Fierfortet al. J. Biotechnol.134, 261 (2008) han dado a conocer un procedimiento de tratamiento final alternativo de un caldo de fermentación de 3’-SL, comprendiendo el procedimiento las etapas de permeabilización con calor de la célula productora, centrifugación, ajuste del pH del extracelular a 3,0 mediante la adición de una resina de intercambio catiónico fuerte en forma de ácido, eliminación de las proteínas precipitadas mediante centrifugación, ajuste del pH del sobrenadante a 6,0 mediante la adición de un intercambiador aniónico débil en forma de base, unión de la sialil-lactosa a un intercambiador aniónico en forma de HCO<3>-, tras el lavado con agua destilada, elución del compuesto con una disolución de NaHCO3 de gradiente continuo, eliminación de la bicarbonato de sodio con un intercambiador catiónico (en forma de H+) hasta que se alcanzó pH 3,0, entonces ajuste del pH a 6,0 con NaOH. La purificación anterior permitió aislar 15 g de 3’-SL de 1 litro de caldo que contenía 25,5 g de 3’-SL. Drouillardet al. Carbohydr. Res.345, 1394 (2010)) aplicaron el procedimiento Fierfort anterior a un caldo de fermentación que contenía 6’-SL (11 g/l) y algo de 6,6’-disialil-lactosa (DSL), y por tanto se aislaron 3,34 g de 6’-SL DSL en una relación de 155/86.
El documento WO 2006/034225 describe dos purificaciones alternativas de 3’-SL a partir de un caldo de fermentación productor. Según el primer procedimiento, el lisado del cultivo se diluyó con agua destilada y se agitó con carbón activado/Celite. La suspensión se lavó con agua, entonces el producto se eluyó del carbón/Celite con etanol ac. Según el segundo método, las células de cultivo se trataron con calor y los sólidos precipitados se separaron del sobrenadante mediante centrifugación. El sobrenadante resultante se procesó a través de un microfiltro, el permeado se hizo pasar a través de una membrana de 10 kDa, entonces se nanofiltró. El retenido resultante se diafiltró entonces para recoger la muestra final. Ambos métodos de purificación proporcionaron 90-100 mg de 3’-SL a partir de 1 litro de caldo de fermentación.
El documento CN102154163 A describe la producción de 3’-SL mediante fermentación de un microorganismo(E. coli),conduciendo de ese modo a la formación de un caldo de fermentación. Un sobrenadante que se deriva de la centrifugación y el tratamiento con calor del caldo de fermentación se trata posteriormente con una primera membrana que tiene un punto de corte de peso molecular (MWCO) de 1000 Da, seguida de un segundo tratamiento de membrana con una membrana que tiene un MWCO de 500 Da y un tratamiento con una resina de intercambio catiónico.
El inconveniente de los procesos de purificación de sialil-lactosa anteriores a partir de un cultivo de fermentación es el rendimiento de purificación de pobre a moderado. Por tanto, se han buscado modos más simples y/o más efectivos para aislar y purificar estos productos a partir de caldos de fermentación a escala industrial.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a un método de separación de un oligosacárido sialilado de un caldo de fermentación obtenido cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido sialilado a partir de un precursor de carbohidrato internalizado, comprendiendo la separación las etapas de:
i) ultrafiltración (UF) para separar biomasa del caldo,
ii) nanofiltración (NF), preferiblemente para concentrar el oligosacárido sialilado en el caldo y/o reducir un contenido de sal inorgánica del caldo,
iii) opcionalmente, tratamiento con carbón activado, preferiblemente para decolorar el caldo, y
iv) tratamiento con una resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte, preferiblemente para eliminar materiales cargados,
en el que el oligosacárido sialilado es un oligosacárido de leche humana ácido,
en el que el caldo de fermentación se somete a ultrafiltración como primera etapa,
en el que la membrana usada en la ultrafiltración tiene un punto de corte de peso molecular de 5-30 kDa, y en el que el pH del caldo de fermentación procesado en la etapa de ultrafiltración se ajusta a 4-5,5.
Las etapas ii), iii) y iv) pueden realizarse en cualquier orden. El oligosacárido sialilado puede recogerse tras cualquiera de las etapas ii), iii) y iv).
Preferiblemente, el método se lleva a cabo en la siguiente secuencia: etapa i), etapa ii), etapa opcional iii) y etapa iv). Una realización de la invención se refiere a un método para aislar un oligosacárido sialilado a partir de un caldo de fermentación, produciéndose dicho oligosacárido sialilado cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido sialilado a partir de un precursor de carbohidrato internalizado, que comprende las etapas de:
i) ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de UF (UFP),
ii) nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de NF (NFR),
iii) opcionalmente, tratar el UFP y/o NFR con carbón activado y recoger el eluato de carbón (CE), y iv) tratar el UFP, NFR y/o CE con una resina de intercambio aniónico y/o resina de intercambio catiónico fuerte. Las etapas iii) y iv) pueden realizarse en cualquier orden.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
1. Términos y definiciones
Según esta invención, el término “oligosacárido sialilado” significa preferiblemente un polímero de azúcar que contiene al menos dos unidades de monosacárido, al menos una de las que es un radical sialilo (N-acetilneuraminilo). El oligosacárido sialilado puede tener una estructura lineal o ramificada que contiene unidades de monosacárido que están enlazadas entre sí mediante un enlace interglicosídico. Ventajosamente, el oligosacárido sialilado es un oligosacárido de leche humana ácido.
El término “oligosacárido de leche humana ácido” o “HMO ácido” significa preferiblemente un carbohidrato complejo encontrado en la leche materna humana (Urashimaetal.: MilkOligosaccharides.Nova Science Publishers, 2011) que comprende una estructura de núcleo que es una unidad de lactosa en el extremo reductor que puede estar prolongada con una o más unidades B-N-acetil-lactosaminilo y/o una o más unidades B-lacto-N-biosilo, y estructura de núcleo que está sustituida con un radical a-N-acetil-neuraminilo (sialilo) y opcionalmente puede estar sustituida con un radical a-L-fucopiranosilo. A este respecto, los HMO ácidos tienen al menos un residuo sialilo en su estructura. Los ejemplos de HMO ácidos incluyen 3’-sialil-lactosa (3’-SL), 6’-sialil-lactosa (6’-SL), 3-fucosil-3’-sialil-lactosa (FSL), LST a, fucosil-LST a (FLST a), LST b, fucosil-LST b (FLST b), LST c, fucosil-LST c (FLST c), sialil-LNH (SLNH), sialil-lacto-N-hexaosa (SLNH), sialil-lacto-N-neohexaosa I (SLNH-I), sialil-lacto-N-neohexaosa II (SLNH-II) y disialil-lacto-N-tetraosa (DS-LNT).
El término “célula modificada genéticamente” o “microorganismo modificado genéticamente” significa preferiblemente una célula de un microorganismo, tal como una célula bacteriana, por ejemplo, una célula deE. coli, en la que hay al menos una alteración en su secuencia de ADN. La alteración puede dar como resultado un cambio en las características originales de la célula de tipo silvestre, por ejemplo, la célula modificada es capaz de realizar una transformación química adicional debido al nuevo material genético introducido que codifica la expresión de unas enzimas que no están en la célula de tipo silvestre, o no es capaz de llevar a cabo una transformación, tal como degradación, debido a la eliminación de un gen/genes (desactivación). Una célula modificada genéticamente puede producirse de manera convencional mediante técnicas de ingeniería genética que son ampliamente conocidas para los expertos en la técnica.
El término “microorganismo modificado genéticamente capaz de producir un oligosacárido sialilado a partir de un precursor de carbohidrato internalizado” significa preferiblemente una célula de un microorganismo que está manipulada genéticamente (véase anteriormente) para comprender un gen recombinante que codifica una sialil transferasa necesaria para la síntesis de dicho oligosacárido sialilado, una ruta de biosíntesis para producir un donador de nucleótidos de ácido siálico adecuado para transferirse mediante dicha glicosil transferasa a un precursor de carbohidrato (aceptor) y un mecanismo de internalización de un precursor de carbohidrato (aceptor) del medio de cultivo a la célula en la que se sialila para producir el oligosacárido sialilado de interés.
El término “alrededor de” significa, en una realización, una desviación de ± 10% con respecto al valor indicado, o en otra realización, una desviación del ± 5%.
2. Método para separar oligosacáridos sialilados
La invención se refiere a un método para separar un oligosacárido sialilado/una lactosa sialilada, que es un HMO ácido, de otros compuestos presentes en un caldo de fermentación obtenido cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido sialilado/dicha lactosa sialilada a partir de un precursor de carbohidrato internalizado.
En una realización preferida, el método comprende:
i) ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
ii) nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
iii) opcionalmente, tratamiento con carbón activado de UFP y/o NFR, y recogida del eluato de carbón (CE), y iv) tratamiento de UFP, NFR y/o CE de (a) con una resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte.
En otra realización preferida, el método comprende:
i) ultrafiltración (UF) del caldo de fermentación y recogida del permeado de ultrafiltración (UFP),
ii) nanofiltración (NF) del UFP y recogida del retenido de nanofiltración (NFR),
iii) tratamiento de UFP y/o NFR con resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte, y recogida del eluato de resina (RE), y
iv) opcionalmente, tratamiento con carbón activado de UFP, NFR y/o RE, y recogida del retenido de carbón. El método de la invención proporciona una disolución altamente enriquecida con el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada a partir de la que puede obtenerse el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en un alto rendimiento y preferiblemente con una pureza satisfactoria.
2.1. Producción del oligosacárido sialilado mediante un microorganismo modificado genéticamente
La producción del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada cultivando una célula modificada genéticamente se produce preferiblemente de la siguiente manera. Un aceptor añadido de manera exógena se internaliza desde el medio de cultivo en la célula en la que se convierte en el oligosacárido de sialilo de interés en una reacción que comprende sialilación enzimática. En una realización, la internalización puede tener lugar por medio de un mecanismo de transporte pasivo durante el que el aceptor exógeno se difunde de manera pasiva a través de la membrana plasmática de la célula. El flujo está dirigido por la diferencia de concentración en el espacio extra- e intracelular con respecto a la molécula aceptora que debe internalizarse, aceptor que se supone que pasa del sitio de mayor concentración a la zona de menor concentración tendiendo hacia el equilibrio. En otra realización, el aceptor exógeno puede internalizarse en la célula con la ayuda de un mecanismo de transporte activo, durante el que el aceptor exógeno se difunde a través de la membrana plasmática de la célula bajo la influencia de una proteína transportadora o permeasa de la célula. La lactosa permeasa (LacY) tiene especificidad hacia un mono- o disacárido seleccionado de galactosa, N-acetil-glucosamina, un monosacárido galactosilado (tal como lactosa), un monosacárido N-acetil-glucosaminilado y derivados glicosídicos de los mismos. Todos estos derivados de carbohidrato pueden captarse fácilmente por una célula que tiene una permeasa LacY por medio de un transporte activo y acumularse en la célula antes de glicosilarse (documento WO 01/04341, Fortet al. J. Chem. Soc., Chem. Comm.2558 (2005), documento EP-A-1911850, documento WO 2013/182206, documento WO 2014/048439). Esto se debe a que la célula es capaz de transportar estos aceptores de carbohidrato al interior de la célula usando su permease LacY, y la célula carece de cualquier enzima que pueda degradar estos aceptores, especialmente LacZ. La especificidad hacia el radical azúcar del sustrato que debe internalizarse puede alterarse mediante mutación por medio de técnicas de ADN recombinante conocidas. En una realización preferida, el aceptor añadido de manera exógena es lactosa y su internalización tiene lugar por medio de un mecanismo de transporte activo mediado por una lactosa permeasa de la célula, más preferiblemente LacY. Al internalizarse en la célula, el aceptor se sialila por medio de una sialil transferasa expresada por un gen o una secuencia de ácido nucleico heterólogos que se introduce en la célula mediante técnicas conocidas, por ejemplo, integrándolos en el cromosoma de la célula o usando un vector de expresión. La célula modificada genéticamente comprende una ruta de biosíntesis para producir un donador de nucleótidos de monosacárido de ácido siálico (normalmente CMP-ácido siálico) adecuado para transferirse mediante la sialil transferasa correspondiente. La célula modificada genéticamente puede producir CMP-ácido siálico, en dos maneras. En una manera, ácido siálico añadido de manera exógena se internaliza de manera activa o de manera pasiva, preferiblemente de manera activa, mediante un ácido siálico permeasa, más preferiblemente mediante la codificada pornanT,y convertida posteriormente en CMP-ácido siálico mediante una CMP-NeuAc sintasa, por ejemplo, codificada por unneuAheterólogo. De otro modo, se utiliza el UDP-GlcNAc disponible internamente, expresandoneuC, neuByneuAheterólogos que lo convierten en CMP-ácido siálico por medio de ManNAc y ácido siálico como productos intermedios. Mientras tanto, la actividad catabólica de la célula sobre el ácido siálico y su precursor se suprime mediante la inactivación/deleción del gen aldolasa(nanA)y/o el gen ManNAc cinasa(nanK).El precursor de carbohidrato internalizado puede ser el sujeto de glicosilación distinta de sialilación, por ejemplo, N-acetilglucosaminilación, galactosilación y/o fucosilación antes de sialilarse tal como se describió anteriormente.
2.2. Etapa i) de la separación del oligosacárido sialilado
Según la etapa i) del método, el caldo obtenido de la fermentación se somete a ultrafiltración como primera etapa. El caldo de fermentación contiene normalmente, además del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada producidos, la biomasa de las células del microorganismo usado junto con proteínas, fragmentos de proteína, ADN, endotoxinas, aminas biogénicas, sales inorgánicas, aceptor de carbohidrato sin reaccionar tal como lactosa, subproductos de tipo azúcar, ácido siálico, cuerpos colorantes, etc. La etapa de ultrafiltración es para separar la biomasa y, preferiblemente, también sólidos suspendidos de alto peso molecular de los componentes solubles del caldo que pasan a través de la membrana de ultrafiltración en el permeado. Este permeado de UF (UFP) es una disolución acuosa que contiene el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada producidos.
Puede usarse cualquier membrana de ultrafiltración convencional que tenga un intervalo de punto de corte de peso molecular (MWCO) de entre 5-30 kDa, o cualquier otro subintervalo adecuado. El material de membrana puede ser una cerámica o estar hecho de un polímero sintético o natural, por ejemplo, polisulfona, polipropileno, acetato de celulosa o ácido poliláctico. La etapa de ultrafiltración puede aplicarse en un modo de extremo cerrado o de flujo cruzado. Esta etapa i) puede comprender más de una etapa de ultrafiltración que usa membranas con diferente MWCO, por ejemplo, que usa dos separaciones de ultrafiltración en las que la primera membrana tiene un MWCO mayor que el de la segunda membrana. Esta disposición puede proporcionar una mejor eficacia de separación de los componentes de mayor peso molecular del caldo. Tras esta etapa de separación, el permeado contiene materiales que tienen un peso molecular menor que el MWCO de la segunda membrana, incluyendo el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada de interés.
El caldo de fermentación se ultrafiltra usando una membrana que tiene un MWCO de 5-30 kDa, tal como 10-25, 15 o 20 kDa.
El pH del caldo de fermentación procesado en la etapa de UF se ajusta a 4-5,5, por ejemplo, alrededor de 5. Este intervalo de pH ofrece un mejor rendimiento de la etapa de UF y un mayor rendimiento de recuperación del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada, como lactosas sialiladas, ya que previene la reorganización para dar los isómeros de fructosa correspondiente en particular cuando la UF se realiza a temperatura elevada (véase más adelante), y además previene la precipitación inorgánica durante la concentración.
En una realización, la etapa de ultrafiltración va precedida de la dilución del caldo de fermentación. La etapa de UF se realiza de modo que el grado de concentración (factor de concentración, CF<1>) sea al menos 1,25, más preferiblemente al menos 1,5. Por otro lado, el CF<1>es ventajosamente no más de 4, preferiblemente no más de 3. El factor de concentración (CF<1>) en esta etapa de UF es la relación del volumen (o masa) de la alimentación (que equivale a la del caldo diluido) y el del retenido de UF (UFR). Por ejemplo, cuando 50 kg de caldo se diluyen hasta 100 kg, caldo diluido que está ultrafiltrado, y se recogen 40 kg de permeado y 60 kg de retenido, el CF<1>es 1,67. Intervalos de CF<1>a modo de ejemplo de la etapa de UF son 1,25-4, 1,25-3, 1,25-2,25, 1,5-4, 1,5-3, 1,5-2,25, 1,25-2 o 1,5-2. El UFR puede lavarse opcionalmente con cantidades pequeñas de agua. En general, esta etapa de UF que comprende una dilución del caldo antes de la ultrafiltración y opcionalmente lavar el UFP con agua está caracterizada por un factor de dilución (DF<1>) de 1-3,5. El DF<1>en esta etapa se calcula como la relación del volumen (o masa) total del UFP combinado opcionalmente con filtrado de lavado y el del caldo de fermentación sin diluir. Por ejemplo, cuando 50 kg de caldo se diluyen hasta 100 kg, caldo diluido que está ultrafiltrado, y se recogen 70 kg de UFP y 30 kg de UFR, entonces el DF<1>es 1,4. Intervalos de DF<1>a modo de ejemplo son 1-3,1, 1,5-3,1, 1,8-3,1, 1-2,5, 1,5-2,5, 1,8-2,5, 2-3,1,2-2,5, 2-2,3.
En otra realización, el caldo de fermentación tal como se obtiene (es decir no diluido) se ultrafiltra, la etapa de UF se realiza de modo que el grado de concentración (factor de concentración, CF<2>) es al menos 1,25, más preferiblemente al menos 1,5. Por otro lado, el CF<2>es ventajosamente no más de 4, preferiblemente no más de 3. El factor de concentración en esta etapa de UF es la relación del volumen (o masa) del caldo (que equivale al de la alimentación de UF) y el del retenido de UF (UFR). Por ejemplo, cuando 100 kg de caldo se ultrafiltran directamente y se recogen 40 kg de permeado y 60 kg de retenido, el CF<2>es 1,67. Intervalos de CF<2>a modo de ejemplo de la etapa de UF son 1,25-4, 1,25-3, 1,25-2,25, 1,5-4, 1,5-3, 1,5-2,25, 1,25-2 o 1,5-2. Preferiblemente, esta etapa comprende una etapa de lavado del UFR obtenido en la etapa de UF anterior, con el fin de mejorar el rendimiento de recuperación del producto de oligosacárido sialilado/lactosa sialilada. Esta etapa se realiza añadiendo agua, preferiblemente agua purificada, al UFR para dar una suspensión y la fase acuosa de la suspensión se hace pasar a través de la misma membrana de UF usada en la etapa de UF anterior para recoger un filtrado de lavado de preferiblemente el mismo volumen (o masa) que el del agua de lavado aplicada. Por regla general, cuanto mayor sea el CF de la etapa de UF precedente, más agua se añade. Además, cuanta más agua de lavado, más producto recuperado adicionalmente. Sin embargo, por encima de un cierto volumen de agua de lavado no puede lavarse significativamente más producto del UFR. El agua de lavado puede añadirse en una porción o más porciones posteriores, sin embargo es favorable que el agua de lavado se añade de manera continua al UFR con la misma tasa de flujo que la tasa de flujo de la recogida de filtrado, para mantener un volumen de concentrado de UFR constante. Tras la etapa de lavado, el UFP y el filtrado de lavado se combinan para la(s) siguiente(s) etapa(s) de purificación/aislamiento. Las fracciones de UFP filtrado de lavado combinadas contienen el 85-96% del producto de oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada del caldo de fermentación (en masa), cuando su factor de dilución (DF<2>) es de 1 a 3,5. El DF<2>en esta etapa se calcula como la relación del volumen (o masa) total del UFP combinado con filtrado de lavado y el del caldo de fermentación sin diluir (que equivale al de la alimentación de UF). Por ejemplo, cuando 100 kg de caldo se ultrafiltran directamente, se recogen 40 kg de UFP, y el UFR se lava con 200 kg de agua, entonces el DF<2>es 2,4. Intervalos de DF<2>a modo de ejemplo son 1-3,1, 1,5-3,1, 1,8-3,1, 1-2,5, 1,5-2,5, 1,8-2,5, 2-3,1, 2-2,5, 2-2,3. Preferiblemente, la aplicación de más de 3 veces de volumen de agua de lavado o masa de agua de lavado (en comparación con el volumen o la masa de caldo antes de la UF) no contribuye significativamente a mejorar la recuperación. Por otro lado, la recogida de un mayor volumen de filtrado de lavado aumenta el tiempo tecnológico de las etapas ii), iii) y iv) posteriores. Desde un punto de vista tecnológico, es ventajoso que el volumen (o masa) del agua de lavado usada sea de alrededor de 1,5-2,5 veces, por ejemplo, 1,6-1,9 veces, el del caldo usado en la etapa de UF.
La etapa de UF se realiza, o las etapas de UF y de lavado se realizan, a temperatura constante, preferiblemente entre 15 y 65°C, tal como por ejemplo, a 15-20 o a 55-65°C. Por todo este intervalo está disponible un rendimiento de recuperación satisfactorio, sin embargo cuanto mayor sea la temperatura, mayor será el rendimiento de recuperación. En consecuencia, a una mayor temperatura, una DF menor es suficiente para alcanzar el mismo rendimiento de recuperación. Preferiblemente, a 55-65°C un DF de alrededor de 2,0-2,3 garantiza alrededor del 90% del rendimiento de recuperación o incluso más.
Debe enfatizarse que no es necesario aplicar ninguna alteración desactivación por calor de la célula productora, ni ningún tratamiento de la célula con un agente (como T riton X) que haga que la pared celular sea más permeable, con el fin de recoger el producto acumulado intracelularmente.
2.3. Etapa ii) de la separación del oligosacárido sialilado
La etapa ii) del método comprende una etapa de nanofiltración (NF). La etapa ii) puede seguir a la etapa i), la etapa opcional iii) o la etapa iv). Esta etapa de nanofiltración puede usarse ventajosamente para concentrar el caldo de fermentación tratado previamente que contiene el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada y/o para eliminar iones, principalmente iones monovalentes, y materiales orgánicos que tienen un peso molecular menor que el del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada, tal como monosacáridos. La membrana de nanofiltración tiene un MWCO que garantiza la retención del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada de interés, es decir su MWCO es menor que el de la(s) membrana(s) de ultrafiltración usada(s) en la etapa a), y alrededor del 25-50% del peso molecular del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada. Como ejemplo, una membrana de nanofiltración que tiene un MWCO de aproximadamente 150-300 Da es adecuada para retener lactosa sialilada. A este respecto, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada se acumula en el retenido de NF (NFR). La nanofiltración puede combinarse con diafiltración con agua con el fin de eliminar moléculas permeables de manera más efectiva, por ejemplo, hasta que la conductividad del permeado no muestre ninguna o muy poca presencia de sales.
La etapa de NF según esta invención se realiza, con o sin la etapa de diafiltración opcional, a temperatura constante, preferiblemente entre 15-45°C, tal como a 15-20°C o a 35-45°C. Se continúa con esta etapa de NF, con o sin diafiltración, hasta alcanzar la concentración deseada del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada en el NFR. Otros parámetros técnicos como el ajuste en el flujo y la presión es una cuestión de habilidades rutinarias.
Con la etapa de NF dada a conocer anteriormente, puede retenerse al menos el 95% del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada obtenidos en la etapa previa.
En una realización preferida, la etapa ii) sigue a la etapa i), es decir el permeado de UF obtenido en la etapa i) se nanofiltra y se recoge el retenido de NF que contiene el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada producidos y o bien se somete a etapas de separación adicionales del método o bien se usa como disolución fuente para obtener el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada.
2.4. Etapa iii) de la separación del oligosacárido sialilado
El método, tal como se mencionó anteriormente, puede comprender una o más etapas de separación opcionales, tal como la etapa iii) descrita más adelante.
Según una realización, el método comprende la etapa opcional iii): se aplica un tratamiento con carbón activo. La etapa opcional iii) puede seguir a la etapa i), la etapa ii) o la etapa iv). El tratamiento con carbón activo (AC) ayuda a eliminar los agentes colorantes y/o contaminantes solubles en agua, tales como sales, si se requiere.
Una sustancia de carbohidrato como un oligosacárido sialilado/una lactosa sialilada de interés tiende a unirse a la superficie de partículas de carbón a partir de su disolución acuosa, por ejemplo, una disolución acuosa obtenida tras en la etapa i), etapa ii) o etapa iv). De manera similar, los agentes colorantes se adsorben también al carbón. Mientras los carbohidratos y materiales que proporcionan color se adsorben, los materiales solubles en agua no unidos o unidos de manera más débil al carbón pueden eluirse con agua. Cambiando el eluyente de agua a etanol acuoso, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada adsorbidos pueden eluirse fácilmente y recogerse en una fracción independiente. Las sustancias que proporcionan color adsorbidas permanecerán todavía adsorbidas en el carbón, por tanto una decoloración y desalinización pueden conseguirse simultáneamente en la etapa iii). El tratamiento con carbón puede realizarse añadiendo carbón (por ejemplo, polvo, pellet o granulado) a la disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada con agitación, eliminando mediante filtración el carbón, resuspendiendo en etanol acuoso con agitación y separando el carbón mediante filtración. En la purificación a una escala mayor, la disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada tras la etapa i), la etapa ii) o la etapa iv) se carga en una columna empaquetada con carbón, que puede mezclarse ¡opcionalmente con Celite, entonces la columna se lava con el eluyente requerido. Las fracciones que contienen el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada se recogen. De estas fracciones, si es necesario, el etanol puede eliminarse mediante, por ejemplo, evaporación para dar una disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada.
Alternativamente, en ciertas condiciones, el oligosacárido sialilado no se adsorbe, o al menos no sustancialmente, en las partículas de carbón y la elución con agua da lugar a una disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada sin su pérdida significativa, mientras tanto las sustancias que dan color permanecen adsorbidas. Para conseguir esto, la cantidad de carbón activado aplicado para la decoloración debe ser de aproximadamente el 12-25% en masa en relación con el contenido de oligosacárido sialilado de la disolución de alimentación obtenida en una etapa previa, de manera preferible aproximadamente el 15-20% en relación con el contenido de sialil-lactosa de la disolución de alimentación. Con esta disposición particular, tanto como al menos el 90% del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada (en masa) obtenidos en la etapa previa puede recogerse de vuelta en forma de una disolución decolorada.
Opcionalmente, el lecho de carbón puede lavarse con agua pura para recoger cantidades adicionales de oligosacárido sialilado/lactosa sialilada que están unidas opcionalmente a carbón. Cuanto más agua de lavado se aplique, más producto recuperado adicionalmente. Sin embargo, por encima de un cierto volumen de agua de lavado no puede eliminarse mediante lavado significativamente más producto del carbón, y la posibilidad de lavar conjuntamente cuerpos de color ya unidos aumenta. Por tanto, para mantener un término medio entre un rendimiento de recuperación máximo y la dilución del eluato, se usan 16-25 l de agua purificada/kg de carbón en esta etapa de lavado, preferiblemente en al menos dos porciones. Esto da como resultado una recuperación adicional de alrededor del 5% de oligosacárido sialilado/lactosa sialilada del carbón (por tanto hasta alcanzar al menos el 95% de rendimiento de recuperación acumulado en esta etapa de tratamiento con AC), mientras que la disolución obtenida es incolora y el factor de dilución de AC es solo de alrededor de 1,4-1,9 (el factor de dilución de AC se calcula como la relación del volumen (o masa) de eluyentes combinados tratados con carbón y el de la disolución de alimentación). En una realización preferida, el tratamiento con carbón activo sigue a la etapa de nanofiltración ii), y se aplica sobre el retenido de NF.
2.5. Etapa iv) de la separación del oligosacárido sialilado
En la etapa iv), la disolución acuosa tratada previamente del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada de la etapa i), ii) o iii) se purifica adicionalmente por medio de tratamiento con resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte.
Según una realización de la etapa iv), la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio aniónico fuerte. La disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada se pone en contacto con una resina de intercambio aniónico de cualquier manera adecuada lo que permitiría que los materiales cargados negativamente se absorbieran sobre la resina de intercambio aniónico, incluyendo el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada. El líquido resultante, tras entrar en contacto con la resina de intercambio aniónico como eluato, contiene principalmente agua, cationes y carbohidratos neutrales como el aceptor de carbohidrato añadido previamente al cultivo de fermentación que debe sialilarse, por ejemplo, lactosa (si todavía queda tras una o más etapas de purificación previas). El oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada pueden recuperarse de la resina de intercambio aniónico eluyéndolos con una disolución acuosa de una sal adecuada tal como la de un metal alcalino (Li, Na, K), metal alcalinotérreo (tal como Ca, Mg) o ion amonio en forma de, por ejemplo, acetato, haluro (tal como cloruro o bromuro), carbonato, bicarbonato, sulfato, etc., como eluyente. Alternativamente, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada retenidos pueden eliminarse también de la resina de intercambio aniónico con una disolución alcalina acuosa para obtener su sal correspondiente. Con el fin de obtener el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en forma ácida, puede usarse una disolución de ácido como eluyente, por ejemplo, HCl, ácido sulfúrico, ácido nítrico, etc. La concentración de la disolución alcalina o ácida acuosa tiene estar suficientemente diluida para no destruir la estructura del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada. Las condiciones de desorción adecuadas pueden determinarse a través de experimentación rutinaria. Si es necesario, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en forma ácida puede convertirse en su sal orgánica o inorgánica tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2011/100979. O bien el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada ácidos o bien su sal adecuada pueden aislarse de su disolución acuosa mediante precipitación usando una disolución de alcohol o de alcohol acuosa.
Según otra realización de la etapa iv), la resina de intercambio iónico es una resina de intercambio catiónico fuerte. La disolución del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada se pone en contacto con la resina de intercambio catiónico de cualquier manera adecuada que permita que los materiales cargados positivamente se absorban sobre la resina de intercambio catiónico. El líquido resultante (eluato), tras entrar en contacto con la resina de intercambio catiónico, contiene el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en forma ácida (cuando la resina de intercambio catiónico está en forma de H) o una forma de sal (cuando la resina de intercambio catiónico está en la forma de sal correspondiente). Si es necesario, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en forma ácida puede convertirse en su sal orgánica o inorgánica tal como describe, por ejemplo, en el documento WO 2011/100979. Preferiblemente, se usa una disolución alcalina acuosa hasta que el pH alcanza alrededor de 7 para obtener la sal alcalina correspondiente del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada. O bien el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada ácidos o bien su sal adecuada pueden aislarse de su disolución acuosa mediante precipitación usando una disolución de alcohol o de alcohol acuosa.
En la etapa iv), la concentración de la disolución alcalina acuosa o la de ácido usada opcionalmente como eluyente tiene que estar suficientemente diluida para no degradar el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada.
Uno de los tratamientos con resina de intercambio iónico dados a conocer anteriormente en la etapa iv) puede ser suficiente para obtener el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada en una pureza requerida. Si es necesario, puede aplicarse cromatografía de resina de intercambio tanto catiónico como aniónico, en cualquier orden.
Además, en la etapa iv), el grado de reticulación en la resina de intercambio iónico puede elegirse dependiendo de las condiciones operativas de la columna de intercambio iónico. Una resina altamente reticulada ofrece la ventaja de la durabilidad y un alto grado de integridad mecánica, sin embargo sufre de una porosidad disminuida y una caída en la transferencia de masa. Una resina poco reticulada es más frágil y tiende a hincharse mediante la absorción de la fase móvil. El tamaño de partícula de la resina de intercambio iónico se selecciona para permitir un flujo eficiente del eluyente, mientras los materiales cargados se eliminan todavía de manera efectiva. Una tasa de flujo adecuada puede obtenerse también aplicando una presión negativa al extremo de elución de la columna o una presión positiva al extremo de carga de la columna, y recogiendo el eluyente. También puede usarse una combinación de presión tanto positiva como negativa.
Ejemplos no limitativos de una resina de intercambio catiónico ácida adecuada pueden ser, por ejemplo, Amberlite IR100, Amberlite IR120, Amberlite FPC22, Dowex 50WX, Finex CS16GC, Finex CS13GC, Finex CS<12>GC, Finex CS<11>GC, Lewatit S, Diaion SK, Diaion UBK, Amberjet 1000, Amberjet 1200.
Ejemplos no limitativos de una resina de intercambio aniónico ácida adecuada pueden ser, por ejemplo, Amberjet 4200, Amberjet 4600, Amberlite IR400, Amberlite IR410, Amberlite IR458, Diaion SA, Diaion UBA120, Lewatit MonoPlus M, Lewatit S7468.
En una realización, una resina de intercambio catiónico fuerte en forma de H+ se usa en la etapa iv) seguido de la adición de una disolución alcalina al eluyente para obtener una sal alcalina del oligosacárido sialilado.
En otra realización, la etapa iv) de la presente invención comprende la utilización de una resina de intercambio catiónico fuerte en forma de sal, más preferiblemente la forma de sal es de un catión alcalino monovalente tal como Na+ o K+. Con este tipo de resina de intercambio iónico, cationes de la disolución de carga que contiene el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada se intercambian por el catión alcalino (por ejemplo, Na+ o K+) de la resina directamente para proporcionar la sal alcalina correspondiente del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada sin la necesidad del ajuste de pH sugerido por la técnica anterior.
El rendimiento de recuperación de esta etapa es de más del 95%, incluso cerca al cuantitativo. El exceso de los cationes alcalinos monovalentes puede eliminarse en una etapa de diafiltración, usando preferiblemente una membrana de nanofiltración como en la etapa ii) dada a conocer anteriormente, para mejorar la pureza de la sal de oligosacárido sialilado/lactosa sialilada aislada. Además, la aplicación de resina de intercambio aniónico en forma de HCO<3>- sugerida por la técnica anterior puede evitarse, lo que es beneficioso en un funcionamiento a escala industrial con respecto a la factibilidad, porque la eliminación de bicarbonato mediante acidificación liberaría una cantidad significativa de gas de dióxido de carbono que puede requerir medidas de seguridad y técnicas extra.
Tras la etapa de aislamiento/purificación ii), la etapa opcional iii) y la etapa iv), el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada así obtenidos pueden proporcionarse en su forma ácida o de sal. Si se requiere una forma sólida del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada, puede secarse por pulverización, liofilizarse o cristalizarse. Por consiguiente, el método de la invención puede comprender una o más etapas adicionales, tales como secar por pulverización una disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada obtenida tras la etapa ii), la etapa opcional iii) o la etapa iv); o liofilizar una disolución acuosa del oligosacárido sialilado/de la lactosa sialilada obtenida tras la etapa ii), la etapa opcional iii) o la etapa iv); o cristalizar un oligosacárido sialilado/una lactosa sialilada a partir de una disolución acuosa obtenida tras la etapa ii), la etapa opcional iii) o la etapa iv). Alternativamente, el oligosacárido sialilado/la lactosa sialilada aislados y purificados mediante el método anterior pueden proporcionarse en forma de una disolución acuosa concentrada o jarabe eliminando agua, por ejemplo, por medio de destilación, preferiblemente destilación a vacío, o nanofiltración.
En una realización preferida de la producción de un oligosacárido sialilado/lactosas sialiladas mediante un microorganismo modificado genéticamente, el microorganismo capaz de producir un oligosacárido sialilado es unaE. coli,preferiblemente de genotipo LacY+LacZ- que portaneuBCA.El gen de sialil transferasa heterólogo en el microorganismo es preferiblemente una a-2,3- o una a-2,6-sialil transferasa con cuya ayuda, a partir de la lactosa añadida de manera exógena como aceptor de carbohidrato, se produce 3’-SL o 6’-SL, respectivamente. Un microorganismo de este tipo se da a conocer, por ejemplo, en el documento WO 2007/101862, Fierfortet al. J. Biotechnol.134, 261 (2008) y Drouillardet al. Carbohydr. Res.345, 1394 (2010).
Por consiguiente, una realización de la presente invención es un método para aislar una lactosa sialilada a partir de un caldo de fermentación obtenido cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicha lactosa sialilada a partir de una lactosa internalizada, que comprende las etapas de:
i) ultrafiltración del caldo para obtener un permeado de ultrafiltración,
ii) nanofiltración del permeado de ultrafiltración para obtener un retenido de nanofiltración,
iii) tratamiento con carbón activado del retenido de nanofiltración para obtener una disolución acuosa decolorada, y
iv) tratamiento de la disolución acuosa de la etapa iii) con una resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte.
Como ejemplo no limitativo, el rendimiento de aislamiento de 3’-SL a partir de su caldo de fermentación, producido según el documento WO 2007/101862 o Fierfortet al. J. Biotechnol.134, 261 (2008), se ha mejorado mediante la siguiente realización del presente método:
i) ultrafiltrar el caldo, preferiblemente a través de una membrana de 15 kDa, para obtener un permeado de UF, seguido de un lavado con agua del retenido de UF, siendo el DF 1,8-3,1, y siendo preferiblemente el CF de la ultrafiltración 1,25-2,25,
ii) nanofiltrar, preferiblemente con una membrana de 150-300 kDa, el permeado de UF y el filtrado de lavado con agua combinados para obtener un retenido de NF,
iii) añadir carbón activo al retenido de NF, preferiblemente carbón activo en polvo, más preferiblemente en una cantidad del 12-25% en masa en relación con el contenido de 3’-SL del retenido de NF, para obtener una disolución acuosa decolorada, y
iv) tratar la disolución decolorada con una resina de intercambio iónico, que consiste en la aplicación de una resina de intercambio iónico ácida fuerte
- o bien en forma de H+ seguido de neutralización del eluato con disolución de NaOH, - o bien en forma de Na+,
para dar lugar a la sal de sodio de 3’-SL.
Con el procedimiento anterior, al menos el 70% de la 3’-SL producida mediante la fermentación que precede a la etapa i) puede aislarse en la forma de sal de sodio purificada. El procedimiento anterior puede aplicarse a caldo de fermentación que contiene 6’-SL con el mismo rendimiento.
Ejemplos
Ejemplo 1: ultrafiltración
Un caldo de fermentación que contiene 3’-SL (340-450 l) se ultrafiltró (15 kDa) a 60-65°C para recoger el UFP con un CF de 1,6-1,7. El retenido de UF se lavó entonces con agua purificada (volúmenes de 1,5-2,5 veces en relación con el volumen de caldo ultrafiltrado) y la suspensión se filtró a través de la misma membrana para recoger un filtrado de lavado de modo que los volúmenes combinados del UFP y del filtrado de lavado fuese de 1050 l. El análisis mostró que se recuperó el 87-96% de la 3’-SL contenida en el caldo en el UFP y el filtrado de lavado combinados.
Ejemplo 2: nanofiltración
El UFP y el filtrado de lavado combinados de la etapa previa (14,6 kg) se nanofiltró aplicando una membrana de 150 300 Da a 20-22 bares y 45°C hasta que el retenido mostró una Brix de aproximadamente 20-25. El análisis mostró que se recuperó el 96% de la 3’-SL contenida en el UFP y el filtrado de lavado combinados en el retenido de NF. Ejemplo 3: tratamiento con carbón activo
A un retenido de NF elaborado según el ejemplo 1 seguido del ejemplo 2 (intervalo de volumen: 200-470 l, intervalo de concentración con respecto a 3’-SL: 170-210 g/l) se le añadió carbón activo en polvo (16-20% p/p frente a 3’-SL en el retenido de NF), y la suspensión se agitó durante 1 hora. El carbón se filtró recirculando la disolución hasta que se volvió clara. El carbón se lavó con agua dos veces (10 l/kg de carbón per lavado) y se combinaron los filtrados. El análisis mostró que se recuperó el 91-98% de la 3’-SL contenida en el retenido de NF en el filtrado de AC.
Ejemplo 4: tratamiento con carbón activo e intercambio iónico
A un retenido de NF elaborado según el ejemplo 1 seguido del ejemplo 2 con la diferencia de que contenía 6’-SL en lugar de 3’-SL (201 g de disolución contenían 16,8 g de 6’-SL) se le añadió carbón activo en polvo (5 g), y la suspensión se agitó durante 1 hora. El carbón se eliminó entonces mediante filtración y se lavó con agua destilada (40 ml). El filtrado combinado (231 g) se dividió en dos partes iguales. La primera disolución se llevó hasta la parte superior de una combinación de intercambio iónico (50 ml) Amberlite FPC 22 (H+) y se eluyó seguido del lavado de la columna con agua destilada (50 ml). Al eluato se le añadió disolución de NaOH (5 M, 3,1 ml) para alcanzar un pH de 6,7. La disolución se liofilizó para dar 9,24 g de polvo blanco. La segunda disolución se llevó hasta la parte superior de una columna de intercambio iónico (50 ml) Amberlite FPC 22 (Na+) y se eluyó seguido del lavado de la columna con agua destilada (50 ml). El eluato se liofilizó para dar 9,27 g de polvo blanco.
Ensayo (mediante IC): 82,9% (ácido libre), 90,8% (ácido libre como libre de agua), 85,7% (sal de Na), 94,0% (sal de Na como libre de agua). Ensayo (mediante RMN): 88,9% (ácido libre), 92,0% (sal de Na). Contenido de agua (mediante KF): 8,8%.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método para separar un oligosacárido sialilado de un caldo de fermentación obtenido cultivando un microorganismo modificado genéticamente capaz de producir dicho oligosacárido sialilado a partir de un precursor de carbohidrato internalizado, comprendiendo la separación las etapas de:
    i) ultrafiltración (UF) para separar biomasa del caldo,
    ii) nanofiltración,
    iii) opcionalmente, tratamiento con carbón activado, y
    iv) tratamiento con resina de intercambio aniónico y/o catiónico fuerte,
    en el que el oligosacárido sialilado es un oligosacárido de leche humana ácido,
    en el que el caldo de fermentación se somete a ultrafiltración como primera etapa,
    en el que la membrana usada en la ultrafiltración tiene un punto de corte de peso molecular de 5-30 kDa, y en el que el pH del caldo de fermentación procesado en la etapa de ultrafiltración se ajusta a 4-5,5.
  2. 2. - El método según la reivindicación 1, en el que la etapa i) comprende dos ultrafiltraciones consecutivas y el punto de corte de peso molecular de la primera membrana de ultrafiltración es mayor que el de la segunda membrana.
  3. 3. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la etapa i) comprende además
    - una etapa de lavado del retenido de ultrafiltración, para obtener un filtrado de lavado, o
    - una dilución del caldo de fermentación antes de la UF,
  4. 4. - El método según la reivindicación 3, en el que el factor de dilución de la etapa i) es de 1 a 3,5.
  5. 5. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el permeado de ultrafiltración, o el permeado de ultrafiltración y el filtrado de lavado combinados, se nanofiltra en la etapa ii).
  6. 6. - El método según la reivindicación 5, en el que el punto de corte de peso molecular de la membrana de nanofiltración en la etapa ii) es del 25-50% del peso molecular del oligosacárido sialilado.
  7. 7. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el permeado de ultrafiltración, o el permeado de ultrafiltración y el filtrado de lavado combinados, o el retenido de nanofiltración se trata con carbón activo, y en el que la cantidad de carbón activo aplicado es de aproximadamente el 12-25% en masa en relación con el contenido de oligosacárido sialilado del permeado de ultrafiltración, el permeado de ultrafiltración y el filtrado de lavado combinados, o el retenido de nanofiltración.
  8. 8. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que
    - una resina de intercambio catiónico fuerte en forma de H+ seguido de la adición de una disolución alcalina al eluyente, o
    - una resina de intercambio catiónico fuerte en forma de catión alcalino monovalente
    se usa en la etapa iv) para obtener la sal alcalina del oligosacárido sialilado.
  9. 9. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el oligosacárido sialilado es una lactosa sialilada.
  10. 10. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el microorganismo modificado genéticamente es unaE. colide genotipo LacY+LacZ-.
  11. 11. - El método según la reivindicación 10, en el que laE. colicomprende una a-2,3- o a-2,6-sialil transferasa recombinante.
  12. 12. - El método según la reivindicación 11, en el que laE. coliporta genesneuBCA.
  13. 13. - El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la lactosa sialilada es 3’-SL o 6’-SL.
  14. 14.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que no se aplica ninguna alteración ni desactivación térmica del microorganismo modificado genéticamente, o tratamiento del microorganismo modificado genéticamente con un agente que hace que la pared celular sea más permeable, con el fin de recoger oligosacárido sialilado acumulado de manera intracelular.
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