ES2856179T3

ES2856179T3 - Reconstitución y autorreconstitución potenciadas del compartimento hematopoyético

Info

Publication number: ES2856179T3
Application number: ES13820331T
Authority: ES
Inventors: Brian Turner; Yosef Refaeli; Gregory Bird
Original assignee: Taiga Biotechnologies Inc
Current assignee: Taiga Biotechnologies Inc
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2033-07-19
Also published as: AU2013292330A1; JP2022145801A; JP2015524415A; AU2020267206A1; CN110643576A; CA3133302A1; US10953048B2; JP6851435B2; DK2877189T3; JP2018095654A; IL236763B; JP2019178180A; SG10201700459XA; JP2021088608A; AU2018247295A1; EP2877189A4; EP2877189A1; US20210177907A1; IL236763A0; WO2014015312A1

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de sujetos que necesitan un trasplante de células madre hematopoyéticas, que comprende: una población de células madre hematopoyéticas tratadas con una proteína de fusión TAT-MYC, una proteína de fusión TAT-Bcl-2, o ambas, durante de 10 minutos a 24 horas, en la que la reconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en el sujeto en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administra una población de células madre hematopoyéticas que no se trataron con la composición.

Description

DESCRIPCIÓN

Reconstitución y autorreconstitución potenciadas del compartimento hematopoyético

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Presentación de la lista de secuencias como archivo de texto ASCII

El contenido de la siguiente presentación en un archivo de texto ASCII es un formulario legible por ordenador (CRF) de la Lista de secuencias (nombre de archivo: 691772000840SeqList.txt, fecha de registro: 19 de julio de 2013, tamaño: 9 KB).

Campo

La presente divulgación se refiere en general a la formación de células del compartimento hematopoyético, a la supervivencia celular y a la proliferación celular por células madre hematopoyéticas. En particular, la presente divulgación se refiere a la aceleración de la reconstitución del compartimento hematopoyético y a la potenciación de la autorreconstitución del compartimento hematopoyético.

Antecedentes

El uso de células madre hematopoyéticas para el trasplante de médula ósea ha revolucionado los enfoques usados para tratar una gran cantidad de neoplasias malignas hematológicas (por ejemplo, leucemias), así como varias enfermedades autoinmunitarias extendidas, y es un tratamiento fundamental para las inmunodeficiencias (Buckley, RH, Annu Rev Immunol 22, 625-655, 2004). El uso de trasplantes de células madre hematopoyéticas también ha tenido éxito en mitigar los efectos de la exposición a altos niveles de radiación en varios casos (Bishop, MR, Stem Cells 15 Supl. 2, 305-310, 1997). Además, los trasplantes de células madre hematopoyéticas se han usado para permitir la administración de altas dosis de agentes quimioterápicos citotóxicos a pacientes que presentan varios tumores de órganos sólidos, permitiendo así la repoblación de la médula ósea tras la toxicidad inducida por fármacos (Crivellari, G et al, Oncologist 12, 79-89, 2007). El uso del trasplante de células madre hematopoyéticas para mejorar la tasa de injerto de trasplantes de órganos sólidos es otra aplicación reciente de este procedimiento médico (Delis, S et al, Pancreas 32, 1-8, 2006). Estudios recientes también indican que el trasplante de médula ósea puede tener valor en el tratamiento de enfermedades cardiacas (Engelmann, mg et al, Curr Opin Mol Ther 8, 396 414, 2006). Aunque se desconoce la base de este efecto, estos hallazgos plantean la posibilidad de que las células madre hematopoyéticas puedan reprogramarse para dar lugar a otros tejidos (Kiel, MJ et al, Dev Biol 283, 29-39, 2005). Por consiguiente, las células madre hematopoyéticas adultas pueden tener una utilidad mucho más amplia que, y pueden proporcionar una alternativa a, la controvertida terapia con células madre embrionarias. Estas aplicaciones terapéuticas del trasplante de células madre hematopoyéticas demuestran el impacto médico y económico de mejorar el trasplante de células madre hematopoyéticas.

Varios problemas han limitado la aplicación terapéutica del trasplante de células madre hematopoyéticas (CMH). Por ejemplo, un problema importante es el bajo número de CMH disponibles para trasplantes. Los pacientes que presentan insuficiencia de la médula ósea, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias congénitas o neoplasias malignas hematológicas no proporcionan una buena fuente de CMH para el autotrasplante (Linker, C, Best Pract Res Clin Haematol 20, 77-84, 2007). Además, algunos pacientes con insuficiencia de la médula ósea y pacientes con cáncer requieren múltiples tandas de trasplante de CMH para lograr un injerto completo de CMH después del tratamiento de radioterapia o quimioterapia (Oliansky, DM et al, Biol Blood Marrow Transplant 13, 1-25, 2007). En los casos en los que el trasplante de CMH autólogas no es posible, existe el problema adicional de identificar un donante de médula ósea histocompatible de manera apropiada. Esto se logra generalmente usando registros en los que se han inscrito más de 6 millones de donantes potenciales (de Mello, AN et al, J. Telemed. Telecare 12 Supl. 3, 64-6, 2006). Además, una vez seleccionado, el donante debe someterse a un proceso agotador y doloroso para movilizar las CMH en la sangre, seguido de 4-5 días de leucocitaféresis para aislar las CMH raras a largo plazo (Nervi, B et al, J Cell Biochem 99, 690-705, 2006). Ha habido varios enfoques novedosos destinados a resolver el problema del bajo número de CMH disponibles para trasplantes, mediante la expansión de las CMH ex vivo después del aislamiento, pero la capacidad de generar un gran número de CMH de repoblación a largo plazo que permanecen disponibles y bioactivas a lo largo de un periodo de años sigue siendo difícil de alcanzar (Hoffman, R, Curr Opin Hematol 6, 184-91, 1999).

Otro problema que limita la aplicación terapéutica del trasplante de CMH es el tiempo requerido para que las CMH trasplantadas reconstituyan los linajes hematopoyéticos maduros y funcionales (es decir, el compartimento hematopoyético) después de la ablación del sistema inmunitario residente del receptor del trasplante. Uno de los elementos necesarios para fomentar el injerto satisfactorio de las CMH trasplantadas es la eliminación del sistema inmunitario residente. Esto se realiza habitualmente mediante irradiación corporal total o ablación química. El resultado final de este proceso es un paciente casi completamente inmunodeprimido que es altamente susceptible a la infección oportunista por microorganismos ambientales con los que los seres humanos interaccionan rutinariamente durante actividades normales, tales como respirar y comer. Este problema es de mayor preocupación con el aumento significativo en la variedad y heterogeneidad de agentes infecciosos iatrogénicos, muchos de los cuales son altamente resistentes a los antibióticos existentes. El tiempo requerido para la recuperación de linajes hematopoyéticos maduros después de un trasplante de CMH afecta significativamente al riesgo de que el receptor del trasplante desarrolle y finalmente sucumba a infecciones oportunistas.

El tiempo requerido para repoblar linajes hematopoyéticos maduros en un receptor de trasplante de CMH se ve afectado por varias variables. Una de esas variables son los diferentes tiempos de recuperación necesarios para repoblar los diferentes linajes hematopoyéticos después de un trasplante de CMH. Por ejemplo, el compartimento mieloide, que está compuesto por monocitos, neutrófilos y basófilos, requiere habitualmente 4-8 semanas para recuperarse después de trasplantar las CMH. El compartimento linfoide requiere un tiempo de recuperación significativamente más largo en seres humanos. Por ejemplo, las células T, las células NK y las células NKT necesitan entre 4-8 meses para recuperarse, mientras que las células B necesitan más de 12 meses para recuperarse en la mayoría de las personas. El tiempo de recuperación de las células del linaje mieloide es crítico para las defensas mínimas requeridas contra los microorganismos ambientales y transmitidos por los alimentos. Otra variable que afecta al tiempo requerido para repoblar los linajes hematopoyéticos maduros en un receptor de trasplante de CMH es el número de CMH disponibles para trasplante y el tamaño/peso del receptor. Una variable adicional es la naturaleza de otros tratamientos a los que un paciente de trasplante de CMH puede haberse sometido antes del trasplante. En la mayoría de los pacientes con algún tipo de cáncer, el paciente habrá recibido varias tandas de quimioterapia antes de recibir un trasplante de CMH. El uso de tales fármacos citotóxicos puede afectar a los nichos de la médula ósea en los que se localizan las CMH trasplantadas y comienzan el proceso de diferenciación. En algunos casos en los que los nichos han sido destruidos por fármacos citotóxicos, es posible que se requieran varios trasplantes de CMH para reconstituir inicialmente los nichos y posteriormente sembrar los nichos con CMH pluripotentes.

Además, el tiempo de recuperación de los linajes hematopoyéticos maduros después de trasplantar las CMH depende en gran medida de la capacidad de las CMH del donante para encontrar su camino hacia los nichos de la médula ósea. Una vez que las CMH llegan a los nichos de la médula ósea, es necesario que establezcan una interferencia molecular con las células residentes en el nicho. Se cree que esta interferencia regula la naturaleza y los niveles de las señales intrínsecas de las células dentro de las CMH que regulan su supervivencia, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Por tanto, el hecho de que las CMH no encuentren su camino hacia los nichos de la médula ósea, se ubiquen apropiadamente o establezcan correctamente tal interferencia molecular con los nichos puede dar como resultado un fracaso del injerto de las CMH. Adicionalmente, el hecho de que las células madre hematopoyéticas no encuentren su camino hacia los nichos de la médula ósea también puede dar como resultado sólo una recuperación a corto plazo de los linajes hematopoyéticos maduros o sólo una reconstitución parcial de los linajes hematopoyéticos maduros que desaparecerán lentamente como resultado de la insuficiencia de la médula ósea a largo plazo.

El periodo de demora entre la ablación del sistema inmunitario residente de un paciente y la reconstitución del linaje hematopoyético mediante el trasplante de CMH es, por tanto, uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de complicaciones potencialmente fatales, tales como infecciones oportunistas o fracaso del injerto de CMH. Se han intentado varios enfoques para disminuir el tiempo requerido para reconstituir los linajes hematopoyéticos maduros después de trasplantar las CMH. Los ejemplos de tales enfoques incluyen el uso de un mayor número de CMH para trasplantes, ablación parcial del sistema inmunitario residente y trasplantes múltiples de un número menor de CMH, acondicionamiento previo de la médula ósea del donante para retener sus células T residentes, tratamiento del paciente con factor de crecimiento después de trasplantar las CMH, y el uso de anticuerpos monoclonales y/o modificadores de molécula pequeña que se seleccionan como diana enzimas que afectan a la expresión de selectina E para mejorar la localización de CMH en nichos de médula ósea después de trasplantar las CMH (Adams GB y Scadden dT, Gene Ther 15, 96-99, 2008; Campbell TB y Broxmeyer h E, Front. Biosc. 13, 1795-1805, 2008; Rocha V y Boxmeyer H, Biology of Bone marrow transplantation 16, S126-S132, 2009; y Hogatt J. et al, Blood 113, 5444-55, 2009). Sin embargo, estas soluciones sólo proporcionan una mejora moderada con respecto a los enfoques actuales sin afectar significativamente a la frecuencia de infecciones oportunistas fatales en la población de pacientes.

Breve sumario

Por consiguiente, existe la necesidad de enfoques mejorados para acelerar la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de células madre hematopoyéticas (CMH) que den como resultado uno o más de los siguientes: aumentar el número de CMH disponibles para trasplante, aumentar el número de CMH que se localizan productivamente en nichos de médula ósea, reducir el riesgo de infecciones oportunistas y reducir el riesgo de fracaso del injerto de CMH. También existe la necesidad de enfoques mejorados para potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que necesite la autorreconstitución del compartimento hematopoyético.

Aunque Refaeli et al. afirman que el protooncogén MYC puede romper la tolerancia de las células B (Refaeli et al. Proc Nat Acad Sci 102(11): 4097-4102, 2005), Refaeli et al. no proporcionan orientación sobre el uso de proteínas de fusión PTD-MYC, o el papel de MYC en la mejora de la capacidad de las CMH para formar células del compartimento hematopoyético. Además, aunque los documentos US2007/0116691, US2010/0297763, WO2007/047583, US2010/0047217 y WO2010/011644 divulgan células madre a largo plazo inmortalizadas de manera condicional y métodos para preparar células diferenciadas, ninguna de estas solicitudes divulga que MYC potencie la capacidad de las CMH agregadas de manera exógena para reconstituir el compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH, o la capacidad de las CMH endógenas para autorreconstituir el hematopoyético compartimento en un sujeto.

A diferencia de Refaeli et al, los documentos US2007/0116691, US2010/0297763, WO2007/047583, US2010/0047217 y WO2010/011644, los inventores han demostrado sorprendentemente que la administración de una composición de MYC, tal como una proteína de fusión PTD-MYC en receptores de trasplantes de CMH 24 horas después, acelera la reconstitución del compartimento hematopoyético al reducir el tiempo requerido para la recuperación de linajes hematopoyéticos maduros en al menos el 50 %. Los inventores también han mostrado sorprendentemente que la administración de una composición de MYC, tal como una proteína de fusión PTD-MYC en un sujeto que tiene una reducción de su compartimento hematopoyético potencia la autorreconstitución en el sujeto.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente invención se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de sujetos que necesitan un trasplante de células madre hematopoyéticas, que comprende: una población de células madre hematopoyéticas tratadas con una proteína de fusión TAT-MYC, una proteína de fusión TAT-Bcl-2, o ambas, durante de 10 minutos a 24 horas, en la que la reconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en el sujeto en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administra una población de células madre hematopoyéticas que no se trataron con la composición.

En determinadas realizaciones, el sujeto tiene o ha tenido una neoplasia maligna hematológica, un mieloma, mieloma múltiple, una leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, un linfoma, linfoma de crecimiento lento, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, neuroblastoma, retinoblastoma, síndrome de Shwachman-Diamond, un tumor cerebral, sarcoma de Ewing, un tumor desmoplásico de células pequeñas redondas, un tumor de células germinales recidivante, un trastorno hematológico, una hemoglobinopatía, un trastorno autoinmunitario, artritis idiopática juvenil, lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencia combinada grave, neutropenia congénita con células madre defectuosas, anemia aplásica grave, enfermedad de células falciformes, un síndrome mielodisplásico, enfermedad granulomatosa crónica, un trastorno metabólico, síndrome de Hurler, enfermedad de Gaucher, osteopetrosis, osteopetrosis maligna infantil, cardiopatía, VIH o SIDA. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto ha tenido un trasplante de órgano. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la población de células madre hematopoyéticas se obtuvo de la médula ósea, de células de sangre periférica, de células de sangre periférica que se han sometido a aféresis, de células de sangre periférica que se han sometido a leucocitaféresis, de sangre del cordón umbilical, de líquido amniótico, de células CMH cultivadas, de una línea celular de CMH inmortalizada, o de una línea celular de CMH inmortalizada de manera condicional. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el trasplante de CMH es un trasplante de CMH autólogo o un trasplante de CMH alogénico. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la población de células madre hematopoyéticas es una población de células madre hematopoyéticas humanas. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un paciente humano. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto es un animal no humano. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto está sometiéndose o se ha sometido a quimioterapia. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la composición previene una disminución de la cantidad de CMH endógenas debido a la quimioterapia. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, la composición previene una disminución de la cantidad de CMH endógenas debido a la radioterapia. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el sujeto tiene un síndrome de insuficiencia de la médula ósea. En determinadas realizaciones, el síndrome de insuficiencia de la médula ósea es anemia aplásica o síndrome de la Guerra del Golfo. En determinadas realizaciones, el síndrome de insuficiencia de la médula ósea es un síndrome hereditario con insuficiencia de la médula ósea heredado (SHIMO). En determinadas realizaciones, el SHIMO se selecciona de trombocitopenia amegacariocítica, anemia de Diamond-Blackfan, disqueratosis congénita, anemia de Fanconi, síndrome de Pearson, neutropenia congénita grave, síndrome de Shwachman-Diamond y trombocitopenia con ausencia de radios, síndrome IVIC, síndrome WT, sinostosis radiocubital y ataxia-pancitopenia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células T en ratones 4 semanas después del trasplante con células de médula ósea expandidas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC positivas para TCRp. La figura 1Ay la figura 1B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 1A) y C57BL/6 (figura 1B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 1C y la figura 1D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 5x103 células de médula ósea expandidas solas (figura 1C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 1D).

La figura 2 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células B en ratones 4 semanas después del trasplante con células de médula ósea expandidas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC positivas para B220. La figura 2Ay la figura 2B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 2A) y C57BL/6 (figura 2B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 2C y la figura 2D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 5x103 células de médula ósea expandidas solas (figura 2C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 2D).

La figura 3 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células T en ratones 8 semanas después del trasplante con células de médula ósea expandidas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC positivas para TCRp. La figura 3Ay la figura 3B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 3A) y C57BL/6 (figura 3B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 3C y la figura 3D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 5x103 células de médula ósea expandidas solas (figura 3C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 3D).

La figura 4 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células B en ratones 8 semanas después del trasplante con células de médula ósea expandidas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC positivas para B220. La figura 4Ay la figura 4B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 4A) y C57BL/6 (figura 4B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 4C y la figura 4D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 5x103 células de médula ósea expandidas solas (figura 4C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 4D).

La figura 5 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células T en ratones 4 semanas después del trasplante con células de médula ósea completa recién aisladas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para CD8xCD4. La figura 5Ay la figura 5B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 5A) y C57BL/6 (figura 5B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 5C y la figura 5D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 1x106 células de médula ósea completa solas (figura 5C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 5D).

La figura 6 representa gráficamente el porcentaje de células T para la cohorte completa de ratones que se muestra en la figura 5. La figura 6A muestra el % de células T positivas para CD4 en ratones de control C57BL/6 (sin tratar; primera columna), ratones Rag-1'/_ tratados sólo con 106 células de MO (columna central); y ratones Rag-1'/_ tratados con 106 células de MO seguido 24 horas después por 10 |ig de TAT-MYC (última columna). La figura 6B muestra el % de células T CD8 en ratones de control C57BL/6 (sin tratar; primera columna), ratones Rag-1'/_ tratados sólo con 106 células de MO (columna central); y ratones Rag-1'/_ tratados con 106 células de MO seguido 24 horas después por 10 |ig de TAT-MYC (última columna).

La figura 7 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran el desarrollo de células B en ratones 4 semanas después del trasplante con células de médula ósea completa recién aisladas y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para B220xCD19. La figura 7Ay la figura 7B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 7A) y C57BL/6 (figura 7B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 7C y la figura 7D representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 1x106 células de médula ósea completa solas (figura 7C), o que también recibieron una inyección de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante (figura 7D).

La figura 8 representa gráficamente el porcentaje de células B para la cohorte completa de ratones que se muestra en la figura 7. El gráfico muestra el % de células B positivas para CD19xB220 en ratones de control C57BL/6 (sin tratar; primera columna), ratones Rag-1'/_ tratados sólo con 106 células de MO (columna central); y ratones Rag-1'/_ tratados con 106 células de MO seguido 24 horas después por 10 |ig de TAT-MYC (última columna).

La figura 9 representa gráficamente la activación de células T esplénicas y células B de cohortes de ratones Rag-1'/_ mostradas en las figuras 5-8. La figura 9Ay la figura 9B muestran la activación de células T (figura 9A) y células B (figura 9B) de ratones Rag-1'/_ a los que se les trasplantaron 106 células de médula ósea recién obtenidas, pero sin tratar con TAT-MYC. La figura 9C y la figura 9D muestran la activación de células T (figura 9C) y células B (figura 9D) de ratones Rag-11'/_ tratados con 10 |ig de TAT-MYC después del trasplante con células de médula ósea recién obtenidas.

La figura 10 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de células T en ratones 2 semanas después de la exposición no letal a 5FU seguida de tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para CD8xCD4. La figura 10A representa la citometría de flujo de células de ratones de control C57BL/6 que no recibieron tratamiento con TAT-MYC. La figura 10B representa la citometría de flujo de células de ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de TAT CRE. La figura 10C representa la citometría de flujo de células de ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después de la exposición a 5FU.

La figura 11 representa gráficamente el porcentaje de células T CD4 reconstituidas para la cohorte completa de ratones expuestos a 5FU que se muestra en la figura 10. El gráfico muestra el % de células T positivas para CD4 en ratones de control C57BL/6 (sin tratar; primera columna), ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de TAT-MYC (columna central); y ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de TAT-CRE (última columna).

La figura 12 representa gráficamente el porcentaje de células T CD8 reconstituidas para la cohorte completa de ratones expuestos a 5FU que se muestra en la figura 10. El gráfico muestra el % de células T positivas para CD8 en ratones de control C57BL/6 (sin tratar; primera columna), ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de TAT-MYC (columna central); y ratones C57BL/6 tratados con 10 |ig de TAT-CRE (última columna).

La figura 13 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de células T en ratones 4 semanas después de la irradiación subletal seguida del trasplante de médula ósea completa recién aislada y el tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para CD4xTCRp. La figura 13Ay la figura 13B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 13A)y C57BL/6 (figura 13B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 13C, la figura 13D, y la figura 13E representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 1x106 células de médula ósea completa solas (figura 13C), o que también recibieron una inyección intravenosa (figura 13D)o intramuscular (figura 13E) de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante.

La figura 14 representa gráficamente el porcentaje de células T CD4 reconstituidas para la cohorte completa de ratones expuestos a 5FU que se muestra en la figura 13. El gráfico muestra el % de células T positivas para CD4 en ratones Rag-1'/_ de control (sin tratar; primera columna), ratones Rag-1'/_ tratados con 10 |ig de TAT-MYC por vía intravenosa (columna central); y ratones Rag-1'/_ tratados con 10 |ig de TAT-CRE por vía intramuscular (última columna).

La figura 15 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de células B en ratones 4 semanas después de la irradiación subletal seguida de trasplante de médula ósea completa recién aislada y tratamiento con TAT-MYC. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para IgMxCD19. La figura 15Ay la figura 15B representan la citometría de flujo de células de ratones de control Rag-1'/_ (figura 15A)y C57BL/6 (figura 15B) que no recibieron un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC. La figura 15C, La figura 15D, y la figura 15E representan la citometría de flujo de células de ratones Rag-1'/_ a los que se les inyectó 1x106 células de médula ósea completa solas (figura 15C), o que también recibieron una inyección intravenosa (figura 15D)o intramuscular (figura 15E) de 10 |ig de Tat-MYC 24 horas después del trasplante.

La figura 16 representa gráficamente el porcentaje de células B reconstituidas para la cohorte completa de ratones irradiados de manera subletal que recibieron trasplantes de CMH y luego se trataron con Tat-MYC o Tat-Cre, o un control 24 horas después del trasplante que se muestra en la figura 15. El gráfico muestra el % de células B positivas para CD19xB220 en ratones Rag-1'/_ de control (sin tratar; primera columna), ratones Rag-1'/_ tratados con 10 |ig de TAT-MYC por vía intravenosa (columna central); y ratones Rag-1'/_ tratados con 10 |ig de TAT-CRE por vía intramuscular (última columna).

La figura 17 muestra un análisis funcional de CMH a largo plazo transducida con proteínas derivadas de sangre del cordón humano (ptlt) in vivo. La figura 17A representa los resultados del análisis por FACS que muestran la reconstitución de la médula ósea de cohortes de ratones NSG irradiados de manera subletal a los que se les han realizado trasplantes de 106 células de sangre del cordón expandidas in vitro en un cóctel de citocinas (primer panel; FCB), o expandidas en un cóctel de citocinas complementado con Tat-Myc y Tat-Bcl-2 (segundo panel; FCB TMTB), o 5x106 células de sangre del cordón umbilical recién obtenidas sin manipular (tercer panel; FCB recién obtenidas). La figura 17B representa los resultados del análisis por FACS de células de médula ósea, bazo y timo de los ratones xenoquiméricos reconstituidos con ptlt-CMH mostrados en el segundo panel de la figura 17A. Todas las células se tiñeron para CD45 humano. La selección de células CD45+ mostró células CD381o CD34+ humanas en la médula ósea (primer panel; MO); linfocitos CD19+ humanos y CD3+ humanos en el bazo (segundo panel; bazo); y células CD3+ humanas en el timo (tercer panel; timo). La figura 17C representa los resultados del análisis por FACS de células B esplénicas humanas que se desarrollaron en el ratón NSG mostrado en el segundo panel de la figura 17A. Las células B esplénicas se marcaron con CFSE y se cultivaron en presencia de anticuerpos monoclonales contra CD40 e IgM humanos. Las células B humanas de este ratón experimentaron proliferación tras la estimulación de su receptor antigénico. La figura 17D muestra una representación gráfica de la cuantificación de las colonias mieloeritroides (unidad formadora de brotes eritroide (UFB-E), unidades formadoras de colonias de megacariocitos (UFC-M), unidades formadoras de colonias de granulocitos (UFC-G) y unidades formadoras de colonias de granulocitos y monocitos (UFC-GM)) de células CD38lD CD34+ humanas después de la siembra en placas de metilcelulosa. Las células CD38lD CD34+ humanas se obtuvieron de la médula ósea del ratón xenoquimérico NSG mostrado en la figura 17A, segundo panel, analizado adicionalmente en la figura 17B, primer panel. La figura 17E muestra una representación gráfica de la cuantificación del desarrollo de colonias mieloeritroides después de la nueva siembra en placas en metilcelulosa. La figura 17F muestra una representación gráfica de la cuantificación de la diferenciación de células mieloides y linfoides (expresión de CD11b, CD33, CD3 y CD19) en la población positiva para CD45 de células de médula ósea del ratón NSG mostrado en el segundo panel de la figura 17A. La figura 17G muestra una representación gráfica de la cuantificación de la diferenciación de células mieloides y linfoides (expresión de CD11b, CD33, CD3 y CD19) en la población positiva para CD45 de células de bazo del ratón NSG mostrado en el segundo panel de la figura 17A.

La figura 18 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de la sangre periférica en ratones NSG 8 semanas después de la irradiación subletal seguida del trasplante de células de sangre del cordón fetales recién obtenidas y el tratamiento con TAT-MYC o proteína de control Tat-Cre. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para CD45 humano. Las figuras 18A-18C representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 18A), 1x106 (figura 18B) o 5 x 106 (figura 18C) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 Tat-Cre. Las figuras 18D-18F representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 18D), 1x106 (figura 18E)o 5 x 106 (figura 18F) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 |ig de Tat-MYC.

La figura 19 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de la médula ósea de ratones NSG 8 semanas después de la irradiación subletal seguida del trasplante de células de sangre del cordón fetales recién obtenidas y el tratamiento con TAT-MYC o proteína de control Tat-Cre. Los paneles muestran la citometría de flujo de médula ósea aislada seleccionada para células positivas para CD45 humano. Las figuras 19A-19C representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 19A), 1x106 (figura 19B) o 5 x 106 (figura 19C) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 |ig de Tat-Cre. Las figuras 19D-19F representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 19D), 1x106 (figura 19E), o 5 x 106 (figura 19F) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 |ig de Tat-MYC.

La figura 20 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución del bazo en ratones NSG 8 semanas después de la irradiación subletal seguida del trasplante de células de sangre del cordón fetales recién obtenidas y el tratamiento con TAT-MYC o proteína de control Tat-Cre. Los paneles muestran la citometría de flujo de células de bazo aisladas seleccionadas para células positivas para CD45 humano. Las figuras 20A-20C representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 20A), 1x106 (figura 20B) o 5 x 106 (figura 20.C) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 |ig de Tat-Cre. Las figuras 20D-20F representan la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x105 (figura 20D), 1x106 (figura 20E) o 5 x 106 (figura 20F) células de sangre del cordón fetales recién aisladas seguido 24 horas más tarde por una inyección de 10 |ig de Tat-MYC.

La figura 21 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución de la sangre periférica en ratones NSG 8 semanas después de la irradiación subletal seguida del trasplante de células de sangre del cordón fetales recién obtenidas que se trataron in vitro durante 1 hora con TAT-MYC antes de inyectarlas en ratones. Los paneles muestran la citometría de flujo de PBMC aisladas seleccionadas para células positivas para CD45 humano. La figura 21A representa la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas. La figura 21B representa la citometría de flujo de células de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas tratadas in vitro con Tat-MYC durante 1 hora antes de inyectar las células en ratones.

La figura 22 representa los resultados de la tinción mediante FACS que muestran la reconstitución a largo plazo de la médula ósea, el bazo y el timo en ratones NSG 8 meses después de la irradiación subletal seguida del trasplante de células de sangre del cordón fetales recién obtenidas que se trataron in vitro durante 1 hora con TAT-MYC antes de inyectarlas en ratones. Los paneles muestran la citometría de flujo de células aisladas de médula ósea, bazo y timo seleccionadas para células positivas para CD45 humano. La figura 22A representa la citometría de flujo de células de médula ósea de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas. La figura 22B representa la citometría de flujo de células de médula ósea de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas tratadas in vitro con Tat-MYC durante 1 hora antes de inyectar las células en ratones. La figura 22C representa la citometría de flujo de células del bazo de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas. La figura 22D representa la citometría de flujo de células del bazo de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas tratadas in vitro con Tat-MYC durante 1 hora antes de inyectar las células en ratones. La figura 22E representa la citometría de flujo de células del timo de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas. La figura 22F representa la citometría de flujo de células del timo de ratones NSG que recibieron 5x106 células de sangre del cordón fetales recién aisladas tratadas in vitro con Tat-MYC durante 1 hora antes de inyectar las células en ratones.

La figura 23 representa un análisis por FACS de la sangre periférica de un ratón NSG de control (figura 23A), un ratón NSG irradiado de manera subletal que recibió trasplantes de 5x106 células sanguíneas adultas movilizadas C-GSF expandidas in vitro en un cóctel de citocinas (figura 23B), o 5 x 106 células sanguíneas adultas movilizadas CGSF expandidas en un cóctel de citocinas complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl-2 (figura 23C).

La figura 24 representa las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para algunas realizaciones del polipéptido Tat-Myc.

La figura 25 representa las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para algunas realizaciones del polipéptido de dominio Bcl-2.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere, en parte, a potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una composición que contiene una composición de MYC, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC), una composición que contiene una composición de Bcl-2, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteína-Bcl-2 (PTD-Bcl-2), o ambas. En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a la aceleración del injerto de células madre hematopoyéticas (CMH) y la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH mediante la administración de una composición que contiene una composición de MYC, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC), una composición que contiene una composición de Bcl-2, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-Bcl-2 (PTD-Bcl-2), o ambas. En algunas realizaciones, al receptor de trasplante de CMH también se le administra una composición que contiene una composición de MYC, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC), una composición que contiene una composición de Bcl-2, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-Bcl-2 (PTD-Bcl-2), o ambas para mantener y/o acelerar adicionalmente el injerto de CMH y la reconstitución del compartimento hematopoyético en el receptor de trasplante de CMH. Tal como se usa en el presente documento, el trasplante de CMH incluye, sin limitación, el trasplante de médula ósea.

Además, la presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la administración de una composición que tiene una proteína de fusión que contiene un polipéptido de MYC y un PTD, tal como el dominio de transducción de proteína tAt del VIH, después de trasplante óseo redujo el tiempo requerido para la recuperación de linajes hematopoyéticos maduros después del trasplante de médula ósea. Por ejemplo, se mostró que el tiempo requerido para la recuperación de células T se redujo desde aproximadamente 9 semanas hasta aproximadamente 4 semanas, y el tiempo requerido para la recuperación de células B se redujo desde aproximadamente 10 semanas hasta aproximadamente 4 semanas en ratones irradiados de manera letal a los que se les administró una composición de MYC después del trasplante de médula ósea (ejemplo 1). Por consiguiente, un aspecto de la presente divulgación proporciona métodos para acelerar la reconstitución del compartimento hematopoyético después del trasplante de células madre hematopoyéticas (CMH) en un sujeto, mediante: a) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una primera composición que contiene CMH para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesita; y b) administrar una segunda composición que contiene una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas al sujeto, en los que la administración de la segunda composición logra una aceleración de al menos el 50 % en la reconstitución del compartimento hematopoyético en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra la segunda composición.

En otros aspectos, la presente divulgación se refiere a potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesita mediante la administración de una composición que tiene una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC). La presente divulgación también se basa, al menos en parte, en el nuevo descubrimiento de que la administración de una composición de MYC puede potenciar la recuperación en un sujeto sometido a quimioterapia y/o radioterapia después de experimentar una disminución de las células del compartimento hematopoyético debido a la terapia. Por ejemplo, se mostró que la administración de una composición de MYC a un sujeto después del tratamiento con el fármaco quimioterápico 5-fluorouracilo aceleraba la recuperación de las células del compartimento hematopoyético (por ejemplo, células T CD8+) tras la reducción debida al tratamiento con 5-fluorouracilo (figura 14).

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona métodos de potenciación de la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene una composición de MYC, una composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas a un sujeto que necesite la autorreconstitución del compartimento hematopoyético, en los que la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas inducen a las CMH endógenas a autorreconstituir el compartimento hematopoyético en el sujeto, y en los que la autorreconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en comparación con la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se administra la composición.

En otros aspectos, la presente divulgación se refiere, en parte, a potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que necesita un trasplante de células madre hematopoyéticas mediante el pretratamiento de una población de CMH con una composición de MYC, tal como una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC); una composición de Bcl-2, tal como una proteína de fusión PTD-Bcl-2; o ambas, antes de administrar las CMH al sujeto. En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a acelerar el injerto de células madre hematopoyéticas (CMH) y la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH mediante el pretratamiento de las CMH con una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-MYC (PTD-MYC), una proteína de fusión de dominio de transducción de proteínas-Bcl-2 (PTD-Bcl-2), o ambas antes de administrar las CMH al sujeto. Sorprendentemente, el pretratamiento de las CMH durante al menos 1 hora antes del trasplante (y quizás tan sólo unos 10 minutos) es suficiente para que la composición de MYC, la composición de Bcl-2 o ambas logren una potenciación en la reconstitución del compartimento hematopoyético.

Por consiguiente, determinadas realizaciones preferidas se refieren a métodos para potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que necesita un trasplante de células madre hematopoyéticas, mediante el tratamiento de una población de células madre hematopoyéticas con una composición que contiene una composición de MYC, una composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas, durante menos de aproximadamente 13 días; y administrar al sujeto, una cantidad terapéuticamente eficaz de la población tratada de células madre hematopoyéticas para reconstituir el compartimento hematopoyético del sujeto, en los que la reconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administra una población de células madre hematopoyéticas. que no se trataron con la composición que contiene una composición de MYC, la composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas. En algunas realizaciones, la población de células madre hematopoyéticas se trata con la composición que contiene una composición de MYC, la composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas, durante menos de aproximadamente o aproximadamente 12 días hasta menos de aproximadamente o aproximadamente 1 día, por ejemplo, menos de aproximadamente o aproximadamente 12 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 11 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 10 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 9 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 8 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 7 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 6 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 5 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 4 días, menos de aproximadamente o aproximadamente 2 días, o menos de aproximadamente o aproximadamente 1 día. En algunas realizaciones, la población de células madre hematopoyéticas se trata con la composición que contiene una composición de MYC, la composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas, durante menos de aproximadamente o aproximadamente 24 horas hasta menos de aproximadamente o aproximadamente 1 hora, por ejemplo, menos de aproximadamente o aproximadamente 24 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 23 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 22 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 21 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 20 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 19 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 18 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 17 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 16 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 15 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 14 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 13 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 12 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 11 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 10 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 9 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 8 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 7 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 6 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 5 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 3 horas, menos de aproximadamente o aproximadamente 2 horas, o menos de aproximadamente o aproximadamente 1 hora. En algunas realizaciones, la población de células madre hematopoyéticas se trata con la composición que contiene una composición de MYC, la composición que contiene una composición de Bcl-2, o ambas, durante menos de aproximadamente o aproximadamente 60 minutos hasta menos de aproximadamente o aproximadamente 10 minutos, por ejemplo, menos de aproximadamente o aproximadamente 60 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 55 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 50 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 45 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 40 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 35 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 29 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 28 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 27 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 26 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 25 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 24 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 23 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 22 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 21 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 19 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 18 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 17 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 16 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 15 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 14 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 13 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 12 minutos, menos de aproximadamente o aproximadamente 11 minutos, o menos de aproximadamente o aproximadamente 10 minutos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “compartimento hematopoyético” se refiere al compartimento celular en un sujeto que contiene todos los linajes de células sanguíneas, incluyendo, sin limitación, el linaje mieloide, que incluye, sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos, plaquetas y células dendríticas; y el linaje linfoide, que incluye, sin limitación, células T, células B, células NKT y células NK. El “compartimento hematopoyético” puede contener todas las poblaciones y subpoblaciones de glóbulos blancos inmaduros, maduros, indiferenciados y diferenciados, incluidas las variedades específicas de tejido y especializadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “formación de células del compartimento hematopoyético” en un sujeto se refiere a la producción y/o expansión de una o más células de cualquier linaje de células sanguíneas del compartimento hematopoyético en el compartimento hematopoyético a partir de la diferenciación de células madre hematopoyéticas (CMH), la proliferación de CMH y/o la supervivencia de CMH. La “formación de células del compartimento hematopoyético” puede ser el resultado del injerto de CMH por CMH exógenas, tal como a partir de la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH. Alternativamente, la formación de células del compartimento hematopoyético “puede ser el resultado de la diferenciación de CMH endógenas, la proliferación de CMH endógenas y/o la supervivencia de CMH endógenas, tal como la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto. En algunas realizaciones, la “formación de células del compartimento hematopoyético” incluye, sin limitación, una o más de la formación del linaje mieloide, formación de células progenitoras del linaje mieloide, formación de células de monocitos, formaciones de células de macrófagos, formación de células de neutrófilos, formación de células de basófilos, formación de células de eosinófilos, formación de células de eritrocitos, formación de células de megacariocitos, formación de células plaquetarias, formación de células dendríticas, formación del linaje linfoide, formación de células progenitoras del linaje linfoide, formación de células T, formación de células B, formación de células NKT y formación de células NK.

Tal como se usa en el presente documento, “potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético” en un sujeto se refiere a uno o más de: i) aumentar la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético (por ejemplo, acelerar la reconstitución del compartimento hematopoyético con CMH exógenas o acelerar la autorreconstitución con CMH endógenas) en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2, o ambas, o en comparación con la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético a partir de CMH en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC; ii) aumentar la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético del sujeto a partir de CMH o bien exógenas o bien endógenas en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que se administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas; o iii) reducir la pérdida de células del compartimento hematopoyético en el sujeto en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que se administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que no se le ha administrado una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas. Además, “potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético” en un sujeto incluye, sin limitación, potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético a partir de CMH exógenas (por ejemplo, injerto de CMH) y potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético a partir de CMH endógenas. Tal como se usa en el presente documento, “pérdida de células del compartimento hematopoyético” en un sujeto se refiere a una reducción de la cantidad de células del compartimento hematopoyético debido a necrosis celular, apoptosis, y similares.

De manera similar, la formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto se potencia cuando: i) aumenta la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético (por ejemplo, se acelera la reconstitución del compartimento hematopoyético con CMH exógenas o se acelera la autorreconstitución con CMH endógenas), por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2, o ambas, o en comparación con la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético a partir de CMH en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC; ii) la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético del sujeto aumenta, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC; y/o iii) la pérdida de células del compartimento hematopoyético en el sujeto se reduce, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC.

Puede usarse cualquier método conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento para medir la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético (por ejemplo, reconstitución o autorreconstitución del compartimento hematopoyético) a partir de las CMH, para medir la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético de un sujeto, y/o para medir la pérdida de células del compartimento hematopoyético en un sujeto. En un ejemplo no limitativo, se usan anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para marcadores de linaje de células sanguíneas y análisis por citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS).

En determinadas realizaciones, se considera que la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético aumenta cuando la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético aumenta, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor, en comparación con la tasa de formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la tasa de formación de células del compartimiento hematopoyético a partir de CMH en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC.

En determinadas realizaciones, se considera que la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético de un sujeto aumenta cuando la cantidad de células del compartimento hematopoyético formadas aumenta, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, un Bcl-2, o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman en el compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC.

En determinadas realizaciones, se considera que la pérdida de células del compartimento hematopoyético en un sujeto disminuye cuando la pérdida de células se reduce, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor, en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que se le administran CMH exógenas que no se han tratado con una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas, o en comparación con la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se pierden en un sujeto al que no se le administra una composición de MYC.

Composiciones de MYC

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren al tratamiento de una población de células madre hematopoyéticas (CMH) con una composición que contiene una composición de MYC para potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético. Las CMH de la presente divulgación pueden tratarse con la composición de MYC sola o en combinación con una composición de Bcl-2 de la presente divulgación. Puede usarse cualquier método de tratamiento de células con una composición, tal como proteína de fusión, conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede cultivarse una población de células madre hematopoyéticas en presencia de la composición de MYC. Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la administración a un sujeto que lo necesita, de una composición que contiene una composición de MYC para potenciar la formación del compartimento hematopoyético en el sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, una “composición de MYC” se refiere a un polipéptido de MYC; una variante o un mutante de un polipéptido de MYC, un polipéptido de MYC modificado, un homólogo de un polipéptido de MYC; un análogo de un polipéptido de MYC; un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de MYC; una diana posterior de un polipéptido de MYC, un homólogo del mismo, un análogo del mismo o un fragmento biológicamente activo del mismo; y una proteína de fusión que contiene un polipéptido de MYC, un homólogo del mismo, un análogo del mismo y un fragmento biológicamente activo del mismo. Una composición de MYC de la presente divulgación incluye cualquier polipéptido de MYC, variante del mismo, mutante del mismo, homólogo del mismo, análogo del mismo o fragmento biológicamente activo del mismo conocido en la técnica (por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os US 2007/0116691, US 2009/0291094, US 2010/0047217, US 2010/0055129 y US 2010/0279351).

En determinadas realizaciones preferidas, las composiciones de MYC de la presente divulgación son proteínas de fusión que contienen un polipéptido de MYC, una variante del mismo, un mutante del mismo, homólogo del mismo, análogo del mismo o fragmento biológicamente activo del mismo que se ha acoplado (por ejemplo, fusionado) a un dominio de transducción de proteínas (PTD).

Polipéptidos de MYC

En algunas realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es un polipéptido de MYC. Un polipéptido de MYC de la presente divulgación incluye, sin limitación, cualquier polipéptido que tenga una o más actividades de una proteína MYC de longitud completa.

Tal como se usa en el presente documento, “MYC” y “proteína MYC” se usan indistintamente y se refieren a una proteína que es miembro de la familia MYC de factores de transcripción bHLH (hélice-bucle-hélice básica). Las proteínas MYC de la presente divulgación son factores de transcripción que regulan la expresión de genes que responden a MYC y, como tales, se requiere que entren en el núcleo de una célula para funcionar como factores de transcripción. La actividad de MYC puede activar la expresión de determinados genes sensibles a MYC, mientras reprime la expresión de otros genes sensibles a MYC. La actividad de MYC puede regular diversas funciones celulares incluyendo, sin limitación, la proliferación celular, el crecimiento celular y la apoptosis.

Las composiciones de MYC de la presente divulgación permiten un aumento de la actividad de MYC en un sujeto que necesita la formación de células del compartimento hematopoyético mediante la adición exógena de MYC, sin la necesidad de sobreexpresar MYC endógeno o expresar de manera recombinante MYC mediante manipulación genética.

Los polipéptidos de MYC de la presente divulgación incluyen, sin limitación, proteínas MYC de longitud completa, fragmentos de proteínas MYC que retienen al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa, homólogos de las mismas que retienen al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa y análogos de las mismas que retienen al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa. Los polipéptidos de MYC de la presente divulgación pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de MYC puede purificarse a partir de una fuente nativa, puede expresarse de manera recombinante o puede sintetizarse químicamente.

Proteínas MYC

Los ejemplos de proteínas MYC de longitud completa adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación incluyen, sin limitación, c-Myc, N-Myc, L-Myc y S-Myc.

En determinadas realizaciones preferidas, el polipéptido de MYC es un polipéptido de c-Myc de longitud completa. El polipéptido de c-Myc puede tener una o más de las siguientes características: el polipéptido puede ser un polímero de 439 aminoácidos, el polipéptido puede tener un peso molecular de 48.804 kDa, el polipéptido puede contener una hélice-bucle-hélice básica-cremallera de leucina por dominio (bHLH/LZ), o el polipéptido puede unirse a una pA ppTP

secuencia que contiene (es decir, una secuencia de caja E). Preferiblemente, el polipéptido de c-Myc es el polipéptido de c-Myc humano que tiene el número de registro NCBI NP_002458.2. Además, un polipéptido de c-Myc de la presente divulgación puede ser un polipéptido de c-Myc que no ha experimentado ninguna modificación postraduccional. Alternativamente, un polipéptido de c-Myc de la presente divulgación puede ser un polipéptido de c-Myc que ha experimentado modificaciones postraduccionales.

En algunas realizaciones, el polipéptido de MYC es una proteína de fusión que contiene un dominio de transducción de proteínas (PTD). En determinadas realizaciones, el polipéptido de MYC es una proteína de fusión que contiene una proteína TAT, o un fragmento de la misma, de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el polipéptido de MYC es una proteína de fusión TAT-MYC con la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1):

MRKKRRQRRRMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPS EDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTE LLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSP NPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSD SLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGS PSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISN NRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVIL KKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLEGKPIPNPLLG LDSTRTGHHHHHH

En el polipéptido de TAT-MYC de SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 2-10 corresponden al dominio de transducción de proteína ^tA^tde VIH, los aminoácidos 11-454 corresponden a la secuencia de aminoácidos de c-Myc, los aminoácidos 455-468 corresponden a un epítopo V5 de 14 aminoácidos y los aminoácidos 472-477 corresponden a una etiqueta de 6 histidinas.

Fragmentos de MYC biológicamente activos

En otras realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es un fragmento biológicamente activo de una proteína MYC de longitud completa que retiene al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa. El polipéptido de MYC puede ser un fragmento de c-Myc, N-Myc, L-Myc o S-Myc.

Un fragmento de MYC de la presente divulgación puede contener al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400 o más residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de una proteína MYC.

Homólogos de MYC

En otras realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es un homólogo de una proteína MYC, o un homólogo de un fragmento de la misma que retiene al menos una actividad de una proteína ^mY^cde longitud completa.

Por ejemplo, un polipéptido de MYC de la presente divulgación puede incluir una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos del 40 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 40 % hasta aproximadamente el 100 % a una proteína MYC o fragmentos de la misma. En determinadas realizaciones, el polipéptido de MYC es un homólogo de c-Myc, N-Myc, L-Myc, S-Myc o fragmentos de los mismos.

Los polipéptidos de MYC de la presente divulgación también incluyen homólogos o análogos funcionales del polipéptido de c-Myc humano que tiene el número de registro NCBI NP_002458.2, o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, el homólogo o análogo de c-Myc contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos del 40 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %,

70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %,el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 40 % hasta aproximadamente el 100 % a la secuencia del polipéptido de c-Myc de número de registro NCBI NP_002458.2 o un fragmento de la misma.

En otras realizaciones, el homólogo o análogo de c-Myc contiene una secuencia de polipéptido de al menos 10 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, o más de longitud que es idéntica en al menos del 50 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %,

75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 100 % a la secuencia del polipéptido de c-Myc de número de registro NCBI NP_002458.2 o un fragmento de la misma.

Tal como se usa en el presente documento, un “homólogo” se refiere a una proteína o un polipéptido que tiene una similitud de secuencia de aminoácidos entre una secuencia de referencia y al menos un fragmento de una segunda secuencia. Los homólogos pueden identificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, preferiblemente, usando la herramienta BLAST para comparar una secuencia de referencia con una única segunda secuencia o fragmento de una secuencia o con una base de datos de secuencias. Tal como se describe a continuación, BLAST comparará secuencias basándose en el porcentaje de identidad y similitud.

Los términos “idénticas” o “identidad” en porcentaje, en el contexto de dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de aminoácidos), se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son sustancialmente idénticas si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, identidad del 29 %, opcionalmente identidad del 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55

%, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o el 100 % en una región especificada o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se comparan y alinean para obtener la máxima correspondencia a lo largo de una ventana de comparación, o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente en una región que tiene 20, 50, 200 o más aminoácidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros de programa predeterminados o pueden designarse parámetros alternativos. Entonces, el algoritmo de comparación de secuencias calcula las identidades de secuencia en porcentaje para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa. Cuando se comparan dos secuencias para determinar la identidad, no es necesario que las secuencias sean contiguas, pero cualquier hueco conllevaría una penalización que reduciría el porcentaje de identidad global. Para blastp, los parámetros predeterminados son penalización por apertura de hueco = 11 y penalización por extensión de hueco = 1. Para blastn, los parámetros predeterminados son penalización por apertura de hueco = 5 y penalización por extensión de hueco = 2.

Tal como se usa en el presente documento, una “ventana de comparación” incluye la referencia a un segmento de cualquiera de las posiciones contiguas que incluyen, pero no se limitan a, desde 20 hasta 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente

150 en las que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para su comparación se conocen bien en la técnica. La alineación óptima de secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J Mol Biol 48(3): 443-453, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8): 2444 2448, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr, Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual [véase, por ejemplo, Brent et al, (2003) Current Protocols in Molecular Biology,

John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou Ed)].

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar la identidad de secuencia en porcentaje y similitud

de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1997) Nucleic Acid Res 25 (17): 3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol Biol 215 (3) -403-410, respectivamente. El software para realizar análisis por BLAST está a disposición pública a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que o bien coinciden o bien satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al, citado anteriormente). Estas coincidencias de palabras vecinas iniciales actúan como simientes para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Las coincidencias de palabras se extienden en ambos sentidos a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las coincidencias de palabra en cada sentido se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulada disminuye en la cantidad X con respecto a su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST, W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 [véase Henikoff y Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22): 10915-10919] alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de nucleótidos, el programa BLASTN usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(12): 5873-5877). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0,001.

Aparte del porcentaje de identidad de secuencia indicado anteriormente, otra indicación de que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido sea inmunológicamente reactivo de manera cruzada con anticuerpos producidos contra el segundo polipéptido. Por tanto, un polipéptido normalmente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos se diferencian sólo por sustituciones conservativas.

Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de MYC adecuados también incluyen variantes modificadas de manera conservativa de polipéptidos de MYC de la presente divulgación. “Variantes modificadas de manera conservativa”, tal como se usa en el presente documento, incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de aminoácidos codificada que dan como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien en la técnica. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Análogos de MYC

En otras realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es un análogo de una proteína MYC, o un análogo de un fragmento de la misma que retiene al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa. En determinadas realizaciones, el polipéptido de MYC es un análogo de c-Myc, N-Myc, L-Myc, S-Myc, o fragmentos de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, un “análogo” se refiere a una proteína que se parece estructural o funcionalmente a una proteína de interés, tal como un polipéptido de MYC. En comparación con la proteína de partida, un análogo puede presentar una actividad y/o función igual, similar o mejorada. Los métodos de cribado de análogos y/o síntesis de análogos se conocen bien en la técnica.

Los análogos de MYC adecuados de la presente divulgación incluyen, sin limitación, HIF-1a e ICN-1.

Proteínas posteriores a MYC

En otras realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es una proteína que es posterior a MYC en una ruta de MYC. Cualquier proteína posterior conocida en la técnica es adecuada para su uso con los métodos de la presente divulgación. Los ejemplos de proteínas adecuadas que son posteriores a MYC incluyen, sin limitación, AKT y proteínas relacionadas con AKT, tales como PDK-1, mTORC2, PI3K-delta. La proteína posterior a MYC t puede incluir además un dominio de transducción de proteínas (PTD). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la proteína posterior a MYC es una proteína de fusión AKT-PTD, una proteína de fusión PTD-PDK-1, una proteína de fusión PTD-mTORC2 o una proteína de fusión PTD-PI3K-delta.

En otras realizaciones, la reconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en un sujeto que lo necesita mediante la administración de CMH que se han pretratado con un inhibidor (por ejemplo, genético, químico, de molécula pequeña, etc.) que inhibe una proteína que antagoniza la supervivencia y/o proliferación de las CMH y eso es de manera posterior a MYC. De manera similar, la formación del compartimento hematopoyético se potencia en un sujeto que lo necesita administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un inhibidor (por ejemplo, genético, químico, de molécula pequeña, etc.) que inhibe una proteína que antagoniza la supervivencia y/o proliferación de las CMH y que es posterior a MYC. Los métodos para administrar cantidades terapéuticamente eficaces de composiciones, tales como las que contienen inhibidores, y determinar cantidades terapéuticas se conocen bien en la técnica y se describen en el presente documento. Los ejemplos de proteínas que antagonizan la supervivencia y/o proliferación de las CMH y que son posteriores a MYC incluyen, sin limitación, pTEN, PP2A, PHLPP, CTMP. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para inhibir la expresión, actividad y/o función de proteínas y/o genes incluyendo, entre otros, los métodos dados a conocer en el presente documento. Los ejemplos no limitativos incluyen inhibidores genéticos, inhibidores de molécula pequeña, interferencia de ARN y anticuerpos.

Actividades de proteínas MYC de longitud completa

En otras realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación contiene un polipéptido de MYC de longitud completa que tiene al menos una actividad de MYC, un fragmento de una proteína ^mY^cque retiene al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa, un homólogo de una proteína MYC que retiene al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa, o un análogo de una proteína MYC que retiene al menos una actividad de una proteína MYC de longitud completa.

Las proteínas MYC de longitud completa de la presente divulgación tienen numerosas actividades. Los ejemplos de tales actividades incluyen, sin limitación, actividad de factor de transcripción, actividad de unión a proteínas, actividad de unión a ácidos nucleicos, actividad de regulación de la proliferación celular, actividad de regulación del crecimiento celular, actividad de regulación de la apoptosis, actividad de regulación de la morfogénesis, actividad de regulación del desarrollo y actividad de reconstitución del compartimento hematopoyético potenciada.

En algunas realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación tiene una actividad de MYC que potencia la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH, incluyendo, sin limitación, un receptor de trasplante de médula ósea. Sin desear restringirse a ninguna teoría, se cree que la actividad de MYC potencia la localización productiva de las CMH trasplantadas en los nichos de la médula ósea en el receptor. El tiempo de recuperación de los linajes hematopoyéticos maduros tras el trasplante de CMH depende en gran medida de la capacidad de las CMH administradas para localizarse en nichos de médula ósea. Una vez que las CMH llegan a los nichos de la médula ósea, es necesario que establezcan una interferencia molecular con las células residentes en el nicho. Se cree que esta interferencia regula la naturaleza y los niveles de señales intrínsecas de las células dentro de las CMH que regulan su supervivencia, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Aunque la extensión total de las moléculas de superficie que regulan el proceso de división celular polarizada y de localización entre los nichos de la médula ósea y las CMH aún no se comprende completamente, está claro que varias moléculas de adhesión, tales como la selectina P y la selectina E, están implicadas en este proceso. Sin desear restringirse a ninguna teoría, se cree que MYC es un regulador clave de la expresión de selectina P y selectina E, además de PSGL1, VLA4, VLA5, LFA1 y CD26 en la localización y el mantenimiento de las CMH en nichos de la médula ósea. También se cree que MYC es un regulador de las señales de supervivencia y diferenciación dentro de las CMH. Además, se cree que MYC regula la expresión y/o función de varias rutas adicionales, tales como la ruta de Wnt, que están implicadas en el mantenimiento de la pluripotencia y la autorrenovación de las CMH. Esta interacción molecular permite que las CMH reanuden un estado casi quiescente que soporta su división celular asimétrica, lo que permite la generación de CMH a corto plazo que dan lugar a linajes hematopoyéticos maduros y un compartimento de CMH a largo plazo que permite la reconstitución satisfactoria de los linajes hematopoyéticos durante la vida del receptor de trasplante de CMH. Por tanto, administrar una composición de MYC de la presente divulgación a un receptor de trasplante de CMH da como resultado un aumento de al menos el 50 % en la localización productiva de CMH en los nichos de la médula ósea en el receptor.

En realizaciones adicionales, una composición de MYC de la presente divulgación contiene un polipéptido de MYC cuya actividad potencia la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que necesita la autorreconstitución del compartimento hematopoyético. Sin desear restringirse por la teoría, se cree que la actividad de MYC mejora la capacidad de las CMH endógenas para autorrenovarse y diferenciarse en todos los linajes del compartimento hematopoyético, potenciando así la autorreconstitución del compartimento hematopoyético. Sin desear restringirse por la teoría, también se cree que la actividad de MYC potencia la localización de las CMH en sus nichos de médula ósea.

Ventajosamente, administrar MYC en forma de una composición de MYC da como resultado una actividad de MYC transitoria en un sujeto. Esta actividad de MYC transitoria previene los efectos potencialmente negativos de la actividad de MYC prolongada, tales como la oncogenicidad.

Adicionalmente, las composiciones de MYC de la presente divulgación pueden aumentar los niveles intracelulares de MYC en CMH endógenas y trasplantadas de manera exógena y precursores de linaje comprometido. Por tanto, en determinadas realizaciones, administrar una composición de MYC de la presente divulgación a un sujeto que necesita la autorreconstitución del compartimento hematopoyético da como resultado una expansión de ^cM^hendógenas. En otras realizaciones, administrar una composición de MYC de la presente divulgación a un receptor de trasplante de CMH, tal como un receptor de trasplante de médula ósea, da como resultado una expansión de las CMH trasplantadas.

Tal como se da a conocer en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de MYC de la presente divulgación es de al menos aproximadamente o aproximadamente 0,5 |j/ml a al menos aproximadamente o aproximadamente 100 |j/ml, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,5 |j/ml, en al menos aproximadamente o aproximadamente 0,6 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,7 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,8 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,9 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 1 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 2 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 3 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 4 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 5 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 6 |j/ml, al menos 7 aproximadamente o aproximadamente |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 8 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 9 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 10 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 15 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 20 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 25 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 30 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 35 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 40 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 45 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 50 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 55 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 60 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 65 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 70 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 75 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 80 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 85 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 90 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 95 |j/ml, o al menos aproximadamente o aproximadamente 100 |j/ml de la composición de MYC.

Composiciones de Bcl-2

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren al tratamiento de una población de células madre hematopoyéticas (CMH) con una composición que contiene una composición de Bcl-2 para potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético. Las CMH de la presente divulgación pueden tratarse con la composición de Bcl-2 sola o en combinación con una composición de MYC de la presente divulgación. Puede usarse cualquier método de tratamiento de células con una composición, tal como proteína de fusión, conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede cultivarse una población de células madre hematopoyéticas en presencia de la composición de Bcl-2. En algunas realizaciones, una población de células madre hematopoyéticas puede tratarse con una combinación de una composición de MYC de la presente divulgación junto con una composición de Bcl-2 de la presente divulgación. Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la administración a un sujeto que lo necesita, de una composición que contiene una composición de Bcl-2 para potenciar la formación del compartimento hematopoyético en el sujeto.

En algunas realizaciones, una composición que contiene una composición de Bcl-2 de la presente divulgación puede administrarse a un sujeto que lo necesite, para potenciar la formación del compartimento hematopoyético en el sujeto. Sin desear restringirse por la teoría, se cree que la composición de Bcl-2 puede mantener vivas más células madre hematopoyéticas exógenas y/o endógenas (es decir, aumentar la supervivencia celular) el tiempo suficiente para potenciar la formación del compartimento de células hematopoyéticas (por ejemplo, reconstitución del compartimento hematopoyético y/o injerto por CMH exógenas o autorreconstitución por CMH endógenas). Se dan a conocer en el presente documento métodos a modo de ejemplo para determinar la formación de compartimento de células hematopoyéticas y se conocen en la técnica. La composición de Bcl-2 puede administrarse además o en lugar de una composición de MYC de la presente divulgación.

Tal como se usa en el presente documento, una “composición de Bcl-2” se refiere a un polipéptido de Bcl-2; una variante o un mutante de un polipéptido de Bcl-2, un polipéptido de Bcl-2 modificado, un homólogo de un polipéptido de Bcl-2; un análogo de un polipéptido de Bcl-2; un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de Bcl-2; una diana posterior de un polipéptido de Bcl-2, un homólogo del mismo, un análogo del mismo o un fragmento biológicamente activo del mismo; y una proteína de fusión que contiene un polipéptido de Bcl-2, un homólogo del mismo, un análogo del mismo y un fragmento biológicamente activo del mismo. Una composición de Bcl-2 de la presente divulgación incluye cualquier polipéptido de Bcl-2, variante del mismo, mutante del mismo, homólogo del mismo, análogo del mismo o fragmento biológicamente activo del mismo conocido en la técnica (por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os US 2007/0116691, US 2010/0047217 y US 2010/0279351).

En determinadas realizaciones preferidas, las composiciones de Bcl-2 de la presente divulgación son proteínas de fusión que contienen un polipéptido de Bcl-2, una variante del mismo, un mutante del mismo, un homólogo del mismo, un análogo del mismo o un fragmento biológicamente activo del mismo que se ha acoplado (por ejemplo, Fusionado ) a un dominio de transducción de proteínas (PTD).

Polipéptidos de Bcl-2

En algunas realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación es un polipéptido de Bcl-2. Un polipéptido de Bcl-2 de la presente divulgación incluye, sin limitación, cualquier polipéptido que tenga la actividad de una proteína Bcl-2.

Tal como se usa en el presente documento, “Bcl-2”, “polipéptido de Bcl-2” y “proteína Bcl-2” se usan indistintamente y se refieren a una proteína que es un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 que tiene uno o más y/o todos los dominios de homología de Bcl-2 (BH), tales como, pero sin limitación, BH1, BH2, BH3 y BH4. Los miembros de la familia de proteínas bcl-2 forman normalmente heterodímeros u homodímeros y funcionan como reguladores de la apoptosis. En determinadas realizaciones preferidas, los polipéptidos de Bcl-2 de la presente divulgación tienen actividad antiapoptótica.

Las composiciones de Bcl-2 de la presente divulgación pueden permitir un aumento de la actividad de Bcl-2 en un sujeto que necesite la formación de células del compartimento hematopoyético mediante la adición exógena de Bcl-2, sin la necesidad de sobreexpresar Bcl-2 endógeno o expresar de manera recombinante Bcl-2 mediante manipulación genética.

Los polipéptidos de Bcl-2 de la presente divulgación incluyen, sin limitación, proteínas Bcl-2 de longitud completa, fragmentos que retienen la actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa, homólogos de las mismas y análogos de las mismas. En algunas realizaciones, los fragmentos de Bcl-2 que retienen la actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa incluyen una forma truncada de Bcl-2 que tiene delecionado el dominio de bucle no estructurado (Anderson, M. et al. (1999). Refolding, purification and characterization of a loop deletion mutant of human Bcl-2 from bacterial inclusion bodies. Prot Expr. Purif. 15, 162-70). Los polipéptidos de Bcl-2 de la presente divulgación pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de Bcl-2 puede purificarse a partir de una fuente nativa, puede expresarse de manera recombinante o puede sintetizarse químicamente.

Proteínas Bcl-2

Los ejemplos de proteínas Bcl-2 de longitud completa adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación incluyen, sin limitación, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL, Mcl-1, CED-9, proteína relacionada con Bcl-2 A1, Bfl-1 y Bcl-w.

En determinadas realizaciones preferidas, el polipéptido de Bcl-2 es un polipéptido de Bcl-2 humano de longitud completa que tiene delecionado el dominio de bucle no estructurado. El polipéptido de Bcl-2 humano puede tener una o más de las siguientes características: el polipéptido puede ser un polímero de 239 aminoácidos, el polipéptido puede tener un peso molecular de aproximadamente 26,3 kDa o el polipéptido puede contener al menos un dominio de homología de Bcl-2 (BH), tal como BH1, BH2, BH3 y BH4. Preferiblemente, el polipéptido de Bcl-2 humano es el polipéptido de Bcl-2 que tiene el número de registro NCBI NP_000624.2. Además, un polipéptido de Bcl-2 de la presente divulgación puede ser un polipéptido de Bcl-2 que no ha experimentado ninguna modificación postraduccional. Alternativamente, un polipéptido de Bcl-2 de la presente divulgación puede ser un polipéptido de Bcl-2 que ha experimentado modificaciones postraduccionales.

En algunas realizaciones, el polipéptido de Bcl-2 es una proteína de fusión que contiene un dominio de transducción de proteínas (PTD). En determinadas realizaciones, el polipéptido de Bcl-2 es una proteína de fusión que contiene una proteína Ta T, o un fragmento de la misma, de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el polipéptido de Bcl-2 es una proteína de fusión TAT-Bcl-2A, en el que el polipéptido de Bcl-2 tiene una deleción del dominio de bucle no estructurado. En determinadas realizaciones, la proteína de fusión TAT-Bcl-2A tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3):

MRKKRRQRRRMAHAGRSGYDNREIVMKYIHYKLSQRATSGISIEAAGPALSPVPPVV HLTLRQ AGDDFSRR YRRDFAEMS S QLHLTPFT ARGCFAT V VEELFRDG VNW GRIV A FFEFGGVMCVESVNREMSPFVDNIAFWMTEYFNRHFHTWIQDNGGWDAFVEFYGP SMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLSHKKGELNSKLEGKPIPNPLLGLDST RTGHHHHHH

En el polipéptido TAT-Bcl-2A de SEQ ID NO: 3, los aminoácidos 2-10 corresponden al dominio de transducción de proteína TAT de VIH, los aminoácidos 11-212 corresponden a la secuencia de aminoácidos de Bcl-2^A, los aminoácidos 4213-226 corresponden a un epítopo V5 de 14 aminoácidos, y los aminoácidos 230-235 corresponden a una etiqueta de 6 histidinas.

Fragmentos de Bcl-2 biológicamente activos

En otras realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación es un fragmento biológicamente activo de una proteína Bcl-2 de longitud completa que retiene al menos una actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa. El polipéptido de Bcl-2 puede ser un fragmento de Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL, Mcl-1, ^cED-9, proteína relacionada con Bcl-2 A1, Bfl-1 o Bcl-w.

Un fragmento de Bcl-2 de la presente divulgación puede contener al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, al menos 200, al menos 210, al menos 220, al menos 230, o más residuos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos de una proteína Bcl-2.

Homólogos y análogos de Bcl-2

En otras realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación es un homólogo o análogo de una proteína Bcl-2 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, un polipéptido de Bcl-2 de la presente divulgación puede incluir una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos del 40 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 40 % hasta aproximadamente el 100 % a una proteína Bcl-2 o fragmentos de la misma. En determinadas realizaciones, el polipéptido de Bcl-2 es un homólogo o análogo de Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL, Mcl-1, CED-9, proteína relacionada con Bcl-2 ^a1, Bfl-1, Bcl-w, o fragmentos de los mismos.

Los polipéptidos de Bcl-2 de la presente divulgación también incluyen homólogos o análogos funcionales del polipéptido de Bcl-2 humano que tiene el número de registro NCBI N^p_00624.2, o un fragmento del mismo. En determinadas realizaciones, el homólogo o análogo de Bcl-2 contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos del 40 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 40 % hasta aproximadamente el 100 % a la secuencia de polipéptido de Bcl-2 de número de registro NCBI NP_00624.2 o fragmento de la misma.

En otras realizaciones, el homólogo o análogo de Bcl-2 contiene una secuencia de polipéptido de al menos 10 aminoácidos, al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, al menos 40 aminoácidos, al menos 50 aminoácidos, al menos 60 aminoácidos, al menos 70 aminoácidos, al menos 80 aminoácidos, al menos 90 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 110 aminoácidos, al menos 120 aminoácidos, al menos 130 aminoácidos, al menos 140 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 160 aminoácidos, al menos 170 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos, al menos 210 aminoácidos, al menos 220 aminoácidos, al menos 230 aminoácidos, o más de longitud que es idéntica en al menos del 50 % al 100 %, por ejemplo, idéntica en al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, el 98 % o cualquier otro porcentaje desde aproximadamente el 50 % hasta aproximadamente el 100 % a la secuencia del polipéptido de Bcl-2 de número de registro NCBI NP_00624.2 o fragmento de la misma.

Tal como se describe en el presente documento, los polipéptidos de Bcl-2 adecuados también incluyen variantes modificadas de manera conservativa de polipéptidos de Bcl-2 de la presente descripción.

Actividades de proteínas Bcl-2 de longitud completa

En otras realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación contiene un polipéptido de Bcl-2 de longitud completa que tiene al menos una actividad de Bcl-2, un fragmento de una proteína Bcl-2 que retiene al menos una actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa, un homólogo de una proteína Bcl-2 que retiene al menos una actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa, o un análogo de una proteína Bcl-2 que retiene al menos una actividad de una proteína Bcl-2 de longitud completa.

Las proteínas Bcl-2 de longitud completa de la presente divulgación tienen numerosas actividades. Los ejemplos de tales actividades incluyen, sin limitación, actividad de regulación de la apoptosis, actividad de regulación de la supervivencia celular, actividad de unión a proteínas, actividad de regulación de la permeabilidad de la membrana mitocondrial, actividad de regulación de caspasas, actividad de regulación de canales aniónicos dependientes de voltaje, actividad de regulación de puntos de control de G2, actividad de regulación de canales de membrana mitocondrial externa (VDAC), actividad de regulación del potencial de membrana mitocondrial, actividad de canales proteicos y actividad de regulación del citocromo C.

En algunas realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación tiene una actividad de Bcl-2 que o bien sola o en combinación con una composición de MYC potencia la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH, incluyendo, sin limitación, un receptor de trasplante de médula ósea, cuando se tratan las CMH con las composiciones antes de trasplantar las CMH.

Tal como se da a conocer en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de Bcl-2 de la presente divulgación es de al menos aproximadamente o aproximadamente 0,5 |j/ml a al menos aproximadamente o aproximadamente 100 |j/ml, por ejemplo al menos aproximadamente o aproximadamente 0,5 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,6 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,7 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,8 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 0,9 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 1 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 2 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 3 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 4 |j/ml, al menos

aproximadamente o aproximadamente 5 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 6 |j/ml, al menos 7 aproximadamente o aproximadamente |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 8 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 9 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 10 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 15 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 20 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 25 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 30 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 35 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 40 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 45 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 50 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 55 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 60 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 65 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 70 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 75 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 80 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 85 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 90 |j/ml, al menos aproximadamente o aproximadamente 95 |j/ml, o al menos aproximadamente o aproximadamente 100 |j/ml de la composición de Bcl-2.

Dominios de transducción de proteínas

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a proteínas de fusión que contienen un dominio de transducción de proteínas. En algunas realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación es una proteína de fusión que contiene un dominio de transducción de proteínas fusionado a un polipéptido de MYC. En otras realizaciones, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación es una proteína de fusión que contiene un dominio de transducción de proteínas fusionado a un polipéptido de Bcl-2.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “dominio de transducción de péptidos,” “dominio de transducción de proteínas” y “PTD” se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de péptido o dominio de una proteína que fomenta la penetración de la proteína en una célula y/o compartimento(s) de mamífero dentro de una célula de mamífero. En un ejemplo no limitativo, un PTD fomenta la penetración de un péptido y/o una proteína acoplados en el núcleo de una célula.

Los PTD de la presente divulgación pueden aislarse de una proteína que contiene PTD mediante cualquier método de aislamiento de un dominio de proteína conocido en la técnica, tal como técnicas convencionales de biología molecular y bioquímicas. Alternativamente, los PTD de la presente divulgación pueden sintetizarse. Los PTD adecuados de la presente divulgación pueden tener de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 residuos de aminoácido de longitud, y enriquecerse en residuos de aminoácido básicos, tales como argentina (Arg) y lisina (Lys).

Los PTD adecuados de la presente divulgación no son fuertemente inmunogénicos, y como tal no inducen una fuerte respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto. Además, los PTD de la presente divulgación tampoco inducen una respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto inmunodeprimido, tal sujeto que ha recibido, está recibiendo o recibirá un trasplante de médula ósea o CMH.

Tal como se da a conocer en el presente documento, los PTD de la presente divulgación se acoplan (por ejemplo, se fusionan, conjugan, reticulan, etc.) a un péptido y/o una proteína para facilitar la penetración del péptido y/o la proteína en una célula y/o un compartimento de mamífero dentro de una célula de mamífero. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un PTD de la presente divulgación se acopla a una proteína MYC.

Los dominios de transducción de proteínas adecuados para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación incluyen cualquier PTD conocido en la técnica (por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.os US 2007/0116691 y US 2010/0055129). Por ejemplo, pueden obtenerse PTD adecuados o derivarse de proteínas que incluyen, sin limitación, proteínas TAT (transactivador de transcripción) lentivirales, proteínas VPR lentivirales, proteínas VP22 de virus del herpes y homeoproteínas.

Los ejemplos de PTD adecuados obtenidos o derivados de proteínas TAT lentivirales incluyen, sin limitación, el PTD de una proteína TAT de un virus que contiene proteína TAT, el PTD de una proteína TAT de un lentivirus que contiene proteína TAT, el PTD de la proteína ^tA^tde VIH-1, el PTD de la proteína TAT de VIH-2, el PTD de la proteína TAT de VIS, el PTD de una proteína TAT lentiviral de primate, el PTD de una proteína TAT lentiviral de ovino, el PTD de una proteína TAT lentiviral de bovino, el PTD de una proteína TAT lentiviral de equino, el PTD de una proteína TAT lentiviral de felino, un PTD de la proteína TAT de una subvariante de VIH, VIS, lentivirus de primate, lentivirus de ovino, lentivirus de bovino, lentivirus de equino o lentivirus de felino, y homólogos de los mismos. En determinadas realizaciones, el PTD son los residuos de aminoácido 48-57 de la proteína TAT de VIH (TAT[⁴⁸-⁵⁷]). En otras realizaciones, el PTD son los residuos de aminoácido 57-48 de la proteína TAT de VIH (TAT[⁵⁷-48]).

Los ejemplos de PTD adecuados que pueden obtenerse o derivarse de proteínas VPR lentivirales incluyen, sin limitación, el PTD de una proteína VPR de un virus que contiene proteína VPR, el PTD de una proteína VPR de un lentivirus que contiene proteína VPR, el PTD de la proteína VPR de VIH-1, el PTD de la proteína VPR de VIH-2, el PTD de la proteína VPR de VIS, el PTD de una proteína VPR lentiviral de primate, el PTD de una proteína VPR lentiviral de ovino, el PTD de una proteína VPR lentiviral de bovino, el PTD de una proteína VPR lentiviral de equino, el PTD de una proteína VPR lentiviral de felino, un PTD de la proteína VPR de una subvariante de VIH, VIS, lentivirus de primate, lentivirus de ovino, lentivirus de bovino, lentivirus de equino o lentivirus de felino, y homólogos de los mismos.

Los ejemplos de PTD adecuados que pueden obtenerse o derivarse de proteínas VP22 de virus del herpes incluyen, sin limitación, el PTD de la proteína VP22 del virus del herpes humano 1 (VHS-1), el PTD de la proteína VP22 del virus del herpes humano 2 (VHS-2), el PTD de la proteína Vp22 de VHB-1, el Pt D de la proteína VP22 de virus del herpes de los psitácidos 1, el PTD de la proteína VP22 de virus del herpes equino 1, el PTD de la proteína VP22 de virus del herpes equino 4, el PTD de la proteína VP22 de virus del herpes gálido 2, el PTD de la proteína VP22 de virus de la varicela-zóster, y homólogos de los mismos.

Los ejemplos de PTD adecuados que pueden obtenerse o derivarse de factores de transcripción de homeodominios incluyen, sin limitación, el homeodominio (HD) de la proteína Antennapedia (Antp) de Drosophila , e1HD de la proteína Fushi tarazu (Ftz) de Drosophila, el HD de la proteína Engrailed (En) de Drosophila , e1HD de la proteína Engrailed-2 de pollo, el HD de homeoproteínas de mamífero, el HD de homeoproteínas humanas, e1HD de homeoproteína Hox-A5 humana, el HD de homeoproteína Hox-A4 humana, el H^dde homeoproteína Hox-B5 humana, el HD de homeoproteína Hox-B6 humana, el HD de homeoproteína Hox-B7 humana, e1HD de homeoproteína HOX-D3 humana, el HD de homeoproteína GOX humana, el HD de homeoproteína MOX-2 humana, el HD de homeoproteína Hoxc-8 humana, el HD de homeoproteína del islote 1 (Isl-1) humana, y homólogos de los mismos.

Adicionalmente, los PTD adecuados incluyen, sin limitación, el PTD derivado de Kaposi-FGF (K-FGF o FGF-4), el PTD derivado de FGF-2, el PTD derivado de FGF-1, y el PTD de otros miembros de la familia de proteínas FGF. Otros PTD adecuados incluyen PTD sintéticos (por ejemplo, Beerens, AMJ et al. Curr Gene Ther. oct. de 2003;3(5):486-94).

Los PTD adecuados adicionales incluyen, sin limitación, un péptido CHARIOT™ (Active Motif, Carlsbad, CA).

En algunas realizaciones, los PTD de la presente divulgación se producen de manera recombinante, mientras que en otras los PTD se producen sintéticamente o se purifican a partir de una fuente nativa.

Modificaciones de proteína de fusión de PTD

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión que contienen PTD de la presente divulgación incluyen proteínas de fusión PTD-MYC y proteínas de fusión PTD-Bcl-2 que contienen una o más moléculas que ligan el PTD al polipéptido de MYC o Bcl-2. En algunas realizaciones, la una o más moléculas ligadoras son péptidos de aminoácidos.

Las proteínas de fusión que contienen PTD de la presente divulgación pueden contener además al menos una secuencia de aminoácidos que facilita la purificación de las proteínas de fusión. Por ejemplo, las proteínas de fusión PTD-MYC pueden contener una etiqueta de proteína, tal como una etiqueta de polihistidina, tal como una etiqueta de epítopo de seis histidinas. Alternativamente, las proteínas de fusión que contienen PTD pueden contener un dominio V5. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las proteínas de fusión que contienen PTD de la presente divulgación contienen además una etiqueta de polihistidina. Preferiblemente, la etiqueta de polihistidina es una etiqueta de 6-histidina. Más preferiblemente, la etiqueta de histidina contiene la secuencia HHHHHH Adicionalmente, la etiqueta de histidina puede añadirse a una proteína de fusión que contiene PTD de la presente divulgación mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, una secuencia puede clonarse en un vector de expresión que codifica para una etiqueta de polihistidina. Alternativamente, puede añadirse una etiqueta de polihistidina mediante PCR (es decir, los cebadores de PCR contienen una secuencia de polihistidina).

Además, una proteína de fusión que contiene PTD de la presente divulgación también puede contener al menos una etiqueta de proteína. En algunas realizaciones, la al menos una etiqueta de proteína es una etiqueta de epítopo. Preferiblemente, la etiqueta de epítopo es una etiqueta de epítopo V5. En algunas realizaciones, la etiqueta de epítopo V5 contiene la secuencia de aminoácidos: GKPIPNPLLGLDST mientras que en otras, la etiqueta de epítopo V5 contiene la secuencia de aminoácidos: IPNPLLGLD Los aminoácidos pueden estar o bien en la formación D o bien en la formación L. En algunas realizaciones, una primera pluralidad de aminoácidos está en la formación D y una segunda pluralidad está en la formación L. Adicionalmente, una etiqueta de epítopo V5 de la presente divulgación puede añadirse a una proteína de fusión que contiene PTD de la presente divulgación mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, puede clonarse una secuencia de proteína de fusión que contiene PTD en un vector de expresión que codifica para una etiqueta de epítopo V5. Alternativamente, puede añadirse una etiqueta de epítopo V5 mediante PCR (es decir, los cebadores de PCR contienen una secuencia de epítopo V5).

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión que contiene PTD de la presente divulgación contiene además una etiqueta de polihistidina y una etiqueta de epítopo. Preferiblemente, la proteína de fusión que contiene PTD contiene una etiqueta de 6 histidinas y una etiqueta de epítopo V5.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión que contiene PTD de la presente divulgación puede disponerse en cualquier orden deseado. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene PTD puede disponerse en el orden de a) el dominio de transducción de proteínas conectado en marco al polipéptido de Myc o Bcl-2, b) el polipéptido de Myc o Bcl-2 conectado en marco al dominio V5, y c) el dominio V5 conectado en marco a la etiqueta de epítopo de seis histidinas. En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene PTD tiene un orden de componentes de a) el polipéptido de Myc o Bcl-2 conectado en marco al dominio de transducción de proteínas, b) el dominio de transducción de proteína conectado en marco al dominio V5, y c) el dominio V5 conectado en marco a la etiqueta de epítopo de seis histidinas. En algunas realizaciones, pueden incluirse secuencias de aminoácidos intermedias adicionales entre cada una de las secuencias. En algunas realizaciones, pueden incluirse secuencias de aminoácidos adicionales al inicio y/o al final de las secuencias.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene PTD contiene un dominio de transducción de proteínas, un polipéptido de Myc o Bcl-2 y un dominio de péptido corto. El dominio de péptido corto puede variarse. En algunas realizaciones, el dominio de péptido corto se selecciona de al menos uno de V5, una etiqueta de histidina, etiquetas HA (hemaglutinina), etiqueta FLAG, CBP (péptido de unión a calmodulina), CYD (péptido NorpD covalente pero disociable), StrepII o h Pc (cadena pesada de proteína C). En algunas realizaciones, el dominio de péptido corto tiene aproximadamente 10 ó 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio de péptido corto tiene una longitud de 2-20, por ejemplo, 6-20 aminoácidos. En algunas realizaciones, dos de los elementos enumerados anteriormente (por ejemplo, V5 y la etiqueta his) pueden usarse juntos como el dominio de péptido corto.

Construcción de proteínas de fusión que contienen PTD

Las proteínas de fusión que contienen PTD de la presente divulgación pueden construirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de estadounidense n.° US 2010/0055129).

En un ejemplo no limitativo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión PTD-MYC de la presente divulgación puede generarse mediante PCR. Esto puede lograrse diseñando un cebador directo para una secuencia de MYC que contiene una secuencia de PTD en marco, tal como la secuencia RKKRRQRRR de 9 aminoácidos de TAT, y un cebador inverso para la secuencia de MYC que está diseñada para eliminar el codón de terminación. El producto de PCR de una reacción de PCR que usa tales cebadores puede clonarse luego en cualquier vector de expresión adecuado conocido en la técnica.

En un ejemplo no limitativo, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión PTD-Bcl-2 de la presente divulgación puede generarse mediante PCR. Esto puede lograrse diseñando un cebador directo para una secuencia Bcl-2 que contiene una secuencia de PTD en marco, tal como la secuencia ^ de 9 aminoácidos de TAT, y un cebador inverso para la secuencia de Bcl-2 que está diseñada para eliminar el codón de terminación. El producto de PCR de una reacción de PCR que usa tales cebadores puede clonarse luego en cualquier vector de expresión adecuado conocido en la técnica. El bucle no estructurado de Bcl-2 puede eliminarse de la secuencia codificante de BCL-2 usando un kit de mutagénesis dirigida al sitio.

Composiciones que contienen PTD

En otras realizaciones, las proteínas de fusión que contienen PTD de la presente divulgación se incluyen en una composición. Para los métodos terapéuticos, tales composiciones que contienen proteína de fusión pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable, que incluye excipientes y/o vehículos de administración farmacéuticamente aceptables, para administrar una proteína de fusión que contiene PTD a un sujeto, tal como un receptor de trasplante de CMH.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión que contiene PTD es un PTD-MYC, y una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición que contiene proteína de fusión PTD-MYC (composición de PTD-MYC) se administra a un sujeto para lograr una aceleración de al menos el 50 %, en la reconstitución del compartimento hematopoyético en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra la segunda composición. En otras realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de PTD-MYC a un sujeto para lograr una autorreconstitución potenciada del compartimento hematopoyético en comparación con la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se administra la composición de PTD-MYC. Ventajosamente, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación tienen baja toxicidad cuando se administran a un sujeto. Por consiguiente, puede administrarse una composición de PTD-MYC en una cantidad que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg del peso del sujeto. En determinadas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene una proteína de fusión PTD-MYC es de al menos 0,1 mg/kg, al menos 0,2 mg/kg, al menos 0,3 mg/kg, al menos 0,4 mg/kg, al menos 0,5 mg/kg, al menos 0,6 mg/kg, al menos 0,7 mg/kg, al menos 0,8 mg/kg, al menos 0,9 mg/kg, al menos 1 mg/kg, al menos 2 mg/kg, al menos 3 mg/kg, al menos 4 mg/kg, al menos 5 mg/kg, al menos 6 mg/kg, al menos 7 mg/kg, al menos 8 mg/kg, al menos 9 mg/kg, al menos 10 mg/kg, al menos 20 mg/kg, al menos 30 mg/kg, al menos 40 mg/kg o al menos 50 mg/kg del peso del sujeto.

En otras realizaciones, la proteína de fusión que contiene PTD es una PTD-Bcl-2, y se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición que contiene la proteína de fusión PTD-Bcl-2 (composición de PTD-Bcl-2) a un sujeto lograr una aceleración de al menos el 50 % en la reconstitución del compartimento hematopoyético en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra la segunda composición. En otras realizaciones, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de PTD-Bcl-2 a un sujeto para lograr una autorreconstitución potenciada del compartimento hematopoyético en comparación con la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra la composición de PTD-Bcl-2. Ventajosamente, las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación tienen baja toxicidad cuando se administran a un sujeto. Por consiguiente, puede administrarse una composición de PTD-Bcl-2 en una cantidad que oscila entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg del peso del sujeto. En determinadas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene una proteína de fusión PTD-Bcl-2 es de al menos 0,1 mg/kg, al menos 0,2 mg/kg, al menos 0,3 mg/kg, al menos 0,4 mg/kg, al menos al menos 0,5 mg/kg, al menos 0,6 mg/kg, al menos 0,7 mg/kg, al menos 0,8 mg/kg, al menos 0,9 mg/kg, al menos 1 mg/kg, al menos 2 mg/kg, al menos 3 mg/kg, al menos 4 mg/kg, al menos 5 mg/kg, al menos 6 mg/kg, al menos 7 mg/kg, al menos 8 mg/kg, al menos 9 mg/kg, al menos 10 mg/kg, al menos 20 mg/kg, al menos 30 mg/kg, al menos 40 mg/kg o al menos 50 mg/kg del peso del sujeto.

Las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden administrarse al menos una vez al día, al menos dos veces al día, al menos tres veces al día, al menos cuatro veces al día, al menos cinco veces al día, o más veces al día. Alternativamente, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden administrarse al menos una vez cada dos días, al menos una vez cada tres días, al menos una vez cada cuatro días, al menos una vez cada cinco días, o al menos una vez cada seis días, al menos una vez a la semana, al menos una vez cada dos semanas, al menos una vez cada tres semanas o al menos una vez cada cuatro semanas.

Ventajosamente, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden acelerar la reconstitución del compartimento hematopoyético a partir de trasplante de CMH (por ejemplo, injerto de CMH), tal como a partir de trasplante de médula ósea, en un sujeto cuando se administran desde al menos aproximadamente o aproximadamente 5 días hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas antes de un trasplante de CMH, simultáneamente con un trasplante de CMH, o desde al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 3 semanas después de un trasplante de CMH. Una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación puede administrarse en cualquier ubicación adecuada, incluyendo, sin limitación, la misma ubicación en la que se produce el trasplante de CMH, una clínica o una consulta médica que está separada de la ubicación en la que se realiza el trasplante de CMH y el hogar o residencia del sujeto que recibe el trasplante de CMH. Puede usarse cualquier método de administración de composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administra junto con cualquier portador farmacéuticamente aceptable adecuado conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administran como una formulación adecuada conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación, una formulación intravenosa.

Tal como se usa en el presente documento, administrar una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación se producen “simultáneamente” con un trasplante de CMH cuando se administra en la misma mezcla y/o formulación que las CMH que van a trasplantarse, o en una mezcla y/o formulación independiente de la de las CMH que van a trasplantarse. Cuando la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administran en una mezcla y/o formulación independiente, se administran una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación “simultáneamente” con un trasplante de CMH incluye, sin limitación, administrar la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 desde al menos aproximadamente 11 horas hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 1 minuto antes de trasplantar las CMH, o desde al menos aproximadamente o aproximadamente 1 minuto hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 11 horas después de trasplantar las CMH. Tal como se usa en el presente documento, administrar una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación se produce “antes” de un trasplante de CMH cuando se administra en una mezcla y/o formulación independiente de tal de las CMH que van a trasplantarse desde al menos aproximadamente o aproximadamente 5 días hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas antes de trasplantar las CMH. Tal como se usa en el presente documento, administrar una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación se produce “después” de un trasplante de CMH cuando se administra en una mezcla y/o formulación independiente de la de las CMH que van a trasplantarse desde al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas hasta al menos aproximadamente o aproximadamente 3 semanas después de trasplantar las CMH.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación se administran antes, después o simultáneamente con un trasplante de CMH en un sujeto. En algunas realizaciones, la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administran al menos aproximadamente o aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 3 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente o aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 22 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 16 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 15 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 14 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 13 horas, o al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas antes de un trasplante de CMH. En otras realizaciones, la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administran simultáneamente con un trasplante de CMH. En realizaciones adicionales, la composición de PTD-MYC y/o la composición de PTD-Bcl-2 se administran al menos aproximadamente o aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 13 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 14 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 15 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 16 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 17 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 18 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 19 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 20 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 21 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 22 horas, o al menos aproximadamente o aproximadamente 23 horas, al menos aproximadamente o aproximadamente 1 día, al menos aproximadamente o aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente o aproximadamente tres días, al menos aproximadamente o aproximadamente 4 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 6 días, al menos aproximadamente o aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente o aproximadamente 2 semanas, o al menos aproximadamente o aproximadamente 3 semanas después de un trasplante de CMH.

Usos terapéuticos

Las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación encuentran muchos usos terapéuticos en el tratamiento de diversas afecciones, enfermedades y síndromes. Tales usos incluyen, sin limitación, acelerar la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH, tal como un receptor de trasplante de médula ósea; potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético; tratar disminuciones del compartimento hematopoyético debido a quimioterapia o radioterapia; tratamiento de los síndromes de insuficiencia de la médula ósea; y el tratamiento del fracaso del injerto de CMH a largo plazo.

Tal como se usa en el presente documento, “prevenir una disminución de las células del compartimento hematopoyético” debido a quimioterapia, radioterapia, insuficiencia de la médula ósea y/o cualquier otra afección que conduzca a la pérdida de células del compartimento hematopoyético, se refiere a reducir y/o inhibir la reducción de la cantidad de células del compartimento hematopoyético de la presente divulgación que se pierden debido a necrosis celular, apoptosis o similar como resultado de la quimioterapia, radioterapia, insuficiencia de la médula ósea y/o afección que conduce a la pérdida de células del compartimento hematopoyético. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento para cuantificar la pérdida celular (por ejemplo, cuantificar la necrosis celular, la apoptosis, etc.). En un ejemplo no limitativo, se usan colorantes intercalantes de ADN para cuantificar la pérdida celular. En algunas realizaciones, “prevenir una disminución de las células del compartimento hematopoyético” puede incluir, sin limitación, una reducción de al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 99 %, o más, de la pérdida de células del compartimento hematopoyético debido a la quimioterapia, radioterapia, insuficiencia de la médula ósea y/o afección que conduce a la pérdida de células del compartimento hematopoyético.

En determinadas realizaciones, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden usarse para reducir el riesgo de fracaso del injerto e infecciones oportunistas en un receptor de trasplante de CMH acelerando la reconstitución del compartimento hematopoyético en el receptor.

Alternativamente, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden usarse para tratar los síndromes de insuficiencia de la médula ósea en un sujeto. Los síndromes de insuficiencia de la médula ósea pueden ser hereditarios o pueden producirse como resultado de, por ejemplo, una enfermedad infecciosa o el síndrome de fatiga crónica. Además, la insuficiencia de la médula ósea en un receptor de trasplante de CMH puede producirse como resultado, por ejemplo, de un trasplante de un número insuficiente de CMH, un trasplante de CMH no coincidentes o el estado de salud del receptor.

Los síndromes de insuficiencia de la médula ósea adquirida pueden incluir, sin limitación, anemia aplásica y síndrome de la Guerra del Golfo.

Los síndromes hereditarios de insuficiencia de la médula ósea (SHIMO) pueden incluir, sin limitación, trombocitopenia amegacariocítica, anemia de Diamond-Blackfan, disqueratosis congénita, anemia de Fanconi, síndrome de Pearson, neutropenia congénita grave, síndrome de Shwachman-Diamond y trombocitopenia sin radios, síndrome IVIC, síndrome WT, sinostosis radiocubital y ataxia-pancitopenia.

En realizaciones adicionales, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden usarse en el tratamiento de un receptor de trasplante de CMH cuyo quimerismo hematopoyético está fallando después de un injerto inicial de CMH trasplantadas (es decir, fracaso del injerto de CMH a largo plazo).

La exposición a toxinas, tales como productos químicos, fármacos quimioterápicos o radiación, puede conducir a una disminución o pérdida del compartimento hematopoyético de un sujeto. Tal como se usa en el presente documento, puede producirse una disminución del compartimento hematopoyético cuando hay una disminución de la cantidad total de células en el compartimento hematopoyético o una disminución de una población o subpoblación específica de células en el compartimento hematopoyético. Los ejemplos de poblaciones o subpoblaciones específicas de células en el compartimento hematopoyético incluyen, sin limitación, células mieloides, monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos, plaquetas, células dendríticas, linfocitos, células progenitoras de células T, células pro-T, células pre-T, células T dobles positivas, células T inmaduras, células T maduras, células progenitoras de células B, células pro-B, células pro-B tempranas, células pro-B tardías, células pre-B grandes, células pre-B pequeñas, células B inmaduras, células B maduras, células NKT y células NK. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las composiciones de PTD-MYC de la presente divulgación y/o las composiciones de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación pueden usarse para tratar sujetos que han estado expuestos a tales toxinas. En algunas realizaciones, el tratamiento de sujetos con una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación previene una disminución o pérdida en las células del compartimento hematopoyético en sujetos que están sometiéndose o se han sometido a quimioterapia o radioterapia. En otras realizaciones, el tratamiento de sujetos con una composición de PTD-MYC de la presente divulgación y/o una composición de PTD-Bcl-2 de la presente divulgación previene una disminución o pérdida en la cantidad de CMH endógenas en sujetos que están sometiéndose o se han sometido a quimioterapia o radioterapia.

Células madre hematopoyéticas

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren al tratamiento de una población de células madre hematopoyéticas (CMH) con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas antes de trasplantar las CMH en un sujeto que lo necesita para potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético. Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesita mediante administrar una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación o ambas para inducir que las CMH generen células del compartimento hematopoyético. Un “sujeto”, “paciente” o “huésped” que va a tratarse mediante los métodos de la presente divulgación puede ser un ser humano o no humano, tales como cualquiera de los animales no humanos dados a conocer en el presente documento, que necesite la potenciación de la formación de células del compartimento hematopoyético. (por ejemplo, reconstitución o autorreconstitución del compartimento hematopoyético). Tal como se da a conocer en el presente documento, las CMH de la presente divulgación pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas, pueden lavarse antes de administrarse a un sujeto que necesita la reconstitución del compartimento hematopoyético. Alternativamente, las CMH pretratadas pueden administrarse al sujeto sin lavarse antes de la administración, ya que los efectos transitorios de la composición de MYC y/o la composición de Bcl-2 no son perjudiciales para el sujeto. Puede usarse cualquier disolución adecuada conocida en la técnica tal como se da a conocer en el presente documento para lavar las CMH pretratadas. En un ejemplo no limitativo, se usa una solución salina con pH equilibrado para lavar las CMH pretratadas antes de administrar las CMH al sujeto. Las CMH pretratadas pueden lavarse desde menos de aproximadamente o aproximadamente 1 minuto hasta aproximadamente 1 hora, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas o más antes de la administración al sujeto.

Las CMH de la presente divulgación pueden dar lugar a todos los tipos de células del compartimento hematopoyético incluyendo, sin limitación, el linaje mieloide, incluyendo, sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos, plaquetas y células dendríticas; y el linaje linfoide, incluyendo, sin limitación, células T, células B, células NKT y células NK.

En algunas realizaciones, una composición de MYC de la presente divulgación acelera la reconstitución del compartimento hematopoyético en receptores de trasplante de CMH. Tal como se da a conocer en el presente documento, los receptores de trasplante de CMH pueden recibir un trasplante de médula ósea, un trasplante de médula ósea enriquecida en CMH, un trasplante de sangre del cordón, un trasplante de sangre del cordón enriquecida en c Mh , un trasplante de sangre derivada de placenta, un trasplante de CMH purificadas o parcialmente purificadas, un trasplante de CMH derivadas de una línea celular de CMH o un trasplante de CMH inmortalizadas de manera condicional. En tales realizaciones, las CMH pueden administrarse como una etapa en el proceso de un procedimiento de trasplante de CMH. Tal como se da a conocer en el presente documento, las CMH pueden incluirse, sin limitación, en médula ósea trasplantada, sangre de cordón trasplantada o en líneas celulares trasplantadas. En determinadas realizaciones preferidas, el receptor del trasplante es un sujeto humano. Las CMH adecuadas pueden obtenerse mediante cualquier técnica adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, las CMH pueden encontrarse en la médula ósea de un donante, que incluye fémures, cadera, costillas, esternón y otros huesos. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para extraer o recoger células de médula ósea. En un ejemplo no limitativo, las CMH pueden obtenerse directamente de la cavidad medular de la cadera usando una aguja y una jeringa para aspirar células de la cavidad medular. Puede obtenerse una médula rica de la cadera realizando múltiples aspiraciones pequeñas.

Las CMH adecuadas para su uso con los métodos de la presente divulgación pueden producirse a partir de células madre embrionarias (CME) y/o células madre pluripotentes inducidas (MPi). Puede usarse cualquier método para producir CMH a partir de células CME y/o células MPi conocido en la técnica (por ejemplo, Keller, G. Genes Dev.

2005 19: 1129-1155; y Papapetrou Sadelain, F1000 Med Rep. 16 de junio de 2010;2). Por ejemplo, las CMH pueden producirse a partir de células madre embrionarias al modelar el desarrollo hematopoyético del cultivo de CME en el compromiso hematopoyético en el embrión temprano (por ejemplo, Keller, G. Genes Dev. 2005 19: 1129-1155). En la medida en que las CMEh mencionadas se obtuvieron mediante la destrucción de un embrión humano o de una línea celular que se había establecido mediante la destrucción de un embrión humano, las CMEh no forman parte de la invención reivindicada y se mencionan únicamente con fines de referencia.

Adicionalmente, las CMH adecuadas para su uso con los métodos de la presente divulgación pueden obtenerse mediante cualquier técnica adecuada conocida en la técnica. Por ejemplo, las CMH pueden encontrarse en la médula ósea de un donante, que incluye fémures, cadera, costillas, esternón y otros huesos. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para extraer o recoger células de médula ósea. En un ejemplo no limitativo, las CMH pueden obtenerse directamente de la cavidad medular de la cadera usando una aguja y una jeringa para aspirar células de la cavidad medular. Puede obtenerse una médula rica de la cadera realizando múltiples aspiraciones pequeñas.

Las CMH adecuadas también pueden obtenerse a partir de células de sangre periférica que se encuentran en la sangre de un donante, a menudo después del pretratamiento con citocinas, tales como G-CSF (factores estimulantes de colonias de granulocitos), que inducen la liberación de las CMH del compartimento de la médula ósea. del donante. Las CMH también pueden obtenerse de sangre periférica que se ha sometido a un procedimiento de aféresis para enriquecerse en CMH. Puede usarse cualquier procedimiento de aféresis conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, el procedimiento de aféresis es un procedimiento de leucocitaféresis.

Además, pueden obtenerse CMH adecuadas a partir de sangre del cordón umbilical, placenta y sangre periférica movilizada. Con fines experimentales, el hígado fetal, el bazo fetal y la AGM (aorta-gónada-mesonefros) de los animales también son fuentes útiles de CMH. Además, las CMH pueden obtenerse de una fuente que las haya obtenido de la médula ósea, sangre periférica, cordón umbilical o tejido fetal de un donante. Alternativamente, las CMH pueden incluirse en una muestra de médula ósea, sangre periférica, cordón umbilical o tejido fetal de un donante.

En algunas realizaciones, las CMH se obtienen de un cordón umbilical o placenta humanos. Otra fuente de CMH que puede usarse son los tejidos hematopoyéticos en desarrollo de animales fetales. En seres humanos, las células madre hematopoyéticas pueden encontrarse en la sangre circulante de un feto humano entre las 12 y las 18 semanas. En algunas realizaciones, las CMH humanas se obtienen de cualquier fuente, por ejemplo, la médula ósea, el cordón umbilical, sangre periférica o tejido fetal de la sangre, de donantes de tipo A+, A-, B+, B-, O+, O-, AB+ y AB-. En otras realizaciones, las CMH humanas se obtienen de cualquier fuente, por ejemplo, la médula ósea, el cordón umbilical, la sangre periférica o el tejido fetal de la sangre, de donantes universales o de donantes que tienen un tipo de sangre poco habitual. Se conocen tipos de sangre poco habituales en la técnica e incluyen, sin limitación, Oh, CDE/CDE, CdE/CdE, CwD-/CwD-, -D-/-D-, Rhnulo, Rh: -51, LW(a-b+), LW(a-b-), S-s-U-, S-s-U(+), pp, Pk, Lu a+b-), Lu(a-b-), Kp(a+b-), Kp(a-b-), Js(a+b-), Ko, K: -11, Fy(a-b-), Jk(a-b-), Di(b-), I-, Yt(a-), Sc: -1, Co(a-), Co(a-b-), Do(a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan(+), Gy(a-), Hy-, At(a -), Jr(a-), In(b-), Tc(a-), Cr(a-), Er(a-), Ok(a-), JMH- y En(a-).

En otras realizaciones, las CMH humanas se obtienen de cualquier fuente, por ejemplo, la médula ósea, el cordón umbilical, la sangre periférica o el tejido fetal de la sangre, de donantes que tienen un trastorno autoinmunitario, inmunodeficiencia o cualquier otra enfermedad o trastorno que se beneficiaría de un trasplante de CMH. Tales donantes también pueden ser los receptores. De manera ventajosa, las CMH obtenidas de tal donante pueden usarse para terapia personalizada con CMH.

En un ejemplo no limitativo, las CMH humanas pueden obtenerse anestesiando al donante de células madre, realizando una punción en la cresta ilíaca posterior superior con una aguja y realizando la aspiración de células de médula ósea con una jeringa. En otro ejemplo no limitativo, las CMH pueden obtenerse de la sangre periférica de un donante, donde unos días antes de la recogida de las células madre de la sangre periférica, se inyecta al donante G-CSF para movilizar las células madre a la sangre periférica.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, las CMH se obtienen de un donante autólogo, es decir, el donante también será el receptor de las CMH derivadas de tales CMH. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento para obtener CMH del donante autólogo. Las CMH y/o cualquier producto terapéutico derivado o producido a partir de las mismas entonces se trasplantan, administran o transfunden de vuelta al donante original. De manera similar, las CMH pueden obtenerse de un donante alogénico, tales como un hermano, padre u otro pariente de un sujeto que necesite un trasplante de CMH. En un ejemplo no limitativo, las CMH alogénicas se obtienen recogiendo CMH de diferentes grupos sanguíneos o fuentes de emparejamiento del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) o del antígeno leucocitario humano (HLA). El trasplante autólogo y/o alogénico de CMH puede producirse en cualquier momento después de la donación, tal como días después, meses después o incluso años después. La donación autóloga puede ser particularmente útil en los casos en los que el sujeto que necesita CMH tuviera una reacción negativa, perjudicial o tóxica al trasplante y/o transfusión de CMH de cualquier otro donante, incluyendo los donantes alogénicos y/o universales. Los ejemplos de pacientes que pueden beneficiarse de la donación autóloga y/o alogénica se conocen bien en la técnica e incluyen, sin limitación, aquellos que padecen un trastorno autoinmunitario, enfermedad o trastorno hematológico, enfermedad o trastorno inmunitario u otras enfermedades o afecciones relacionadas.

Las células obtenidas, por ejemplo, de médula ósea, sangre periférica o sangre del cordón, se procesan normalmente después de la extracción o recogida. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para procesar células extraídas o recogidas. Los ejemplos de etapas de procesamiento incluyen, sin limitación, filtración, centrifugación, detección de hematopatologías, detección de infección viral y/o microbiana, agotamiento de eritrocitos, agotamiento de células T para reducir la incidencia de enfermedad de injerto contra huésped en receptores de trasplantes de células madre alogénicas, reducción de volumen, separación celular, resuspensión de células en medio de cultivo o un tampón adecuado para el procesamiento posterior, separación de células madre de células distintas de las células madre, por ejemplo, enriquecimiento en células madre), expansión de células madre ex vivo o in vitro con factores de crecimiento, citocinas y/u hormonas y crioconservación.

Puede usarse cualquier método adecuado para el enriquecimiento de células madre conocido en la técnica. Los ejemplos de métodos de enriquecimiento de células madre incluyen, sin limitación, separación de células activada por fluorescencia (FACS) y separación de células activada magnéticamente (MACS).

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en los métodos de la presente divulgación son CMH humanas. En otras realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en los métodos de la presente divulgación son autólogas para el sujeto. En realizaciones adicionales, las CMH adecuadas para su uso en los métodos de la presente divulgación son alogénicas para el sujeto.

Las CMH obtenidas de un donante pueden identificarse y/o enriquecerse mediante cualquier método adecuado de identificación y enriquecimiento de células madre conocido en la técnica, tal como mediante la utilización de determinados marcadores fenotípicos o genotípicos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la identificación de CMH incluye el uso de marcadores de superficie celular asociados con CMH o asociados específicamente con células diferenciadas terminalmente del sistema. Los marcadores de superficie adecuados pueden incluir, sin limitación, uno o más de c-kit, Sca-1, CD4, CD34, CD38, Thy1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD43, CD45, CD59, CD90, CD105, CD133, CD135, ABCG2, NK1.1, B220, Ter-119, Flk-2, CDCP1, endomucina, Gr-1, CD46, Mac-1, Thy1.1 y la familia de receptores de la molécula de activación de linfocitos de señalización (SLAM). Los ejemplos de receptores SLAM incluyen, sin limitación, CD150, CD48 y CD244.

Adicionalmente, las CMH obtenidas de un donante pueden separarse de las células distintas de las células madre mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica incluyendo, sin limitación, separación de células activada por fluorescencia (FACS) y separación de células activada magnéticamente (MACS).

En un ejemplo no limitativo, las células de sangre periférica humana se incuban con anticuerpos que reconocen c-kit, Sca-1, CD34, CD38, Thy1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD43, CD45, CD59, CD90, CD105, CD133, ABCG2, NK1.1, B220, Ter-119, Flk-2, CDCP1, endomucina o Gr-1. Los anticuerpos para CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, Ter-119 y Gr-1 se conjugan con perlas magnéticas. Las células que expresan CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, Ter-119 o Gr-1 se retienen en la columna equipada para atrapar perlas magnéticas y células unidas a anticuerpos conjugados con perlas magnéticas. Las células que no son capturadas por la columna de MACS se someten a análisis por FACS. Los anticuerpos para c-kit, Sca-1, CD34, CD38, Thy1, se conjugan con materiales fluorescentes conocidos en la técnica. Las células que son CD34+, CD38lowA, c-kit-/low, Thy1 se separan del resto de la muestra en virtud de los tipos de anticuerpos fluorescentes asociados con las células. Estas células se proporcionan como CMH humanas a largo plazo adecuadas para su uso con cualquiera de los métodos de la presente divulgación.

En otro ejemplo no limitativo, las células obtenidas de un sujeto se marcan con el mismo conjunto de anticuerpos conjugados con perlas magnéticas tal como se describió anteriormente (anticuerpos contra uno o más de CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, Ter-119, o Gr-1) y anticuerpos contra CD150, CD244 y/o CD48 conjugados fluorescentes. Después de retirar las células capturadas por los anticuerpos conjugados con perlas magnéticas de la muestra, la muestra se analiza mediante FACS y se retienen las células CD150+, CD244- y CD48- como CMH a largo plazo.

En algunas realizaciones, las CMH utilizadas en los métodos de la presente divulgación contienen uno o más de los marcadores: c-kit+, Sca-1+, CD34'°w/-, CD38+, Thy1+/low, CD34+, CD38'°w/-, c-kit-/low y/o Thy1+. En algunas realizaciones, las CMH utilizadas en los métodos de la presente divulgación carecen de uno o más de los marcadores: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, Ter-119 y/o Gr-1. En determinadas realizaciones, las CMH utilizadas en los métodos de la presente divulgación son de un tipo A+, A-, B+, B-, O+, O', AB+ o AB‘.

Alternativamente, pueden obtenerse CMH adecuadas de una fuente no humana. Las CMH no humanas adecuadas pueden aislarse de fémures, cadera, costillas, esternón y otros huesos de un animal no humano incluyendo, sin limitación, animales de laboratorio/investigación, roedores, mascotas, ganado, animales de granja, animales de trabajo, animales de carga, especies raras o en peligro de extinción, animales para carreras y animales de zoológico. Otros ejemplos de animales no humanos adecuados incluyen, sin limitación, monos, primates, ratones, ratas, cobayas, hámsteres, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras y gallinas. Por ejemplo, las CMH pueden obtenerse a partir de células de médula ósea murina, incubando las células de médula ósea con anticuerpos que reconocen moléculas de la superficie celular tales como una o más de c-kit, Sca-1, CD34, CD38, Thy1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD43, CD45, CD59, CD90, CD105, CD133, ABCG2, NK1.1, B220, Ter-119, Flk-2, CDCP1, endomucina o Gr-1. Los anticuerpos para CD2, CD3, CD4, CD5, CDS, NK1.1, B220, Ter-119 y Gr-1 se conjugan con perlas magnéticas. En el equipo de MACS, las células que albergan CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, Ter-119 o Gr-1 en su superficie se retienen en la columna equipada para atrapar perlas magnéticas y las células unidas a anticuerpos conjugados con perlas. Las células que no son capturadas por la columna de MACS se someten a análisis por FACS. Para el análisis por FACS, se conjugan anticuerpos para moléculas de superficie tales como c-kit, Sca-1, CD34, CD38, Thy1, con materiales fluorescentes. Las células que son c-kit+, Sca-1+, CD34low/_, CD38+, Thy1+/lowse separan del resto de la muestra en virtud de los tipos de anticuerpos fluorescentes asociados con las células. Estas células se proporcionan como CMH murinas a largo plazo adecuadas para su uso con cualquiera de los métodos de la presente divulgación. En otras realizaciones, se usan diferentes conjuntos de marcadores para separar CMH murinas a largo plazo de células de médula ósea, sangre del cordón umbilical, tejido fetal y sangre periférica.

En algunas realizaciones, obtener CMH a partir de la médula ósea incluye inyectar en primer lugar al donante de CMH, tal como un ratón, 5-fluorouracilo (5-FU) para inducir la proliferación de las CMH con el fin de enriquecer las CMH en la médula ósea del donante.

Además, las CMH adecuadas para su uso con cualquiera de los métodos de la presente divulgación, ya se obtengan de o estén en sangre del cordón, médula ósea, sangre periférica u otra fuente, pueden hacerse crecer o expandirse en cualquier medio adecuado, disponible comercialmente o definido de manera personalizada, con o sin suero, según se desee (por ejemplo, Hartshorn et al, Cell Technology for Cell Products, páginas 221-224, R. Smith, editor; Springer Netherlands, 2007). Por ejemplo, el medio libre de suero puede utilizar albúmina y/o transferrina, que han demostrado ser útiles para el crecimiento y la expansión de células CD34+ en medio libre de suero. Además, pueden incluirse citocinas, tales como ligando Flt-3, factor de células madre (SCF) y trombopoyetina (TPO), entre otros. Las CMH también pueden hacerse crecer en recipientes tales como biorreactores (por ejemplo, Liu et al, Journal of Biotechnology 124:592-601, 2006). Un medio adecuado para la expansión ex vivo de las CMH también puede contener células de soporte de CMH, tales como las células del estroma (por ejemplo, células del estroma linforreticular), que pueden derivarse, por ejemplo, de la desagregación del tejido linfoide, y que se ha demostrado que soportan el mantenimiento, crecimiento y la diferenciación in vitro, ex vivo e in vivo de las CMH, así como de su progenie.

Puede medirse el crecimiento o la expansión de CMH in vitro o in vivo de acuerdo con técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, el documento WO 2008/073748, describe métodos para medir la expansión in vivo e in vitro de las CMH y para distinguir entre el crecimiento/expansión de las CMH y el crecimiento/expansión de otras células en una población potencialmente heterogénea (por ejemplo, médula ósea), tales como las células progenitoras intermedias.

Líneas celulares de CMH

En otras realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación también pueden derivarse de una línea celular de CMH. Las líneas celulares de CMH adecuadas incluyen cualquier línea de células madre hematopoyéticas cultivadas conocida en la técnica. Los ejemplos no limitativos incluyen las líneas de células madre a largo plazo inmortalizadas de manera condicional descritas en las publicaciones de solicitud de patente de estadounidense n.os US 2007/0116691 y US 2010/0047217.

En determinadas realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en los métodos de la presente divulgación se inmortalizan de manera condicional antes de administrar las CMH a un sujeto. Por ejemplo, las CMH obtenidas mediante cualquier método dado a conocer en el presente documento pueden tratarse con un protooncogén regulable (por ejemplo, inducible, controlable) que fomenta la supervivencia y proliferación celular, tal como MYC, y/o con una proteína que inhibe la apoptosis de las CMH, tal como Bcl-2 (por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.°US 2007/0116691). En algunas realizaciones, el protooncogén regulable es una composición de MYC. Preferiblemente, la composición de MYC es una proteína de fusión TAT-MYC. La proteína que inhibe la apoptosis de las CMH también puede ser regulable. Por ejemplo, la proteína regulable puede ser una proteína de fusión PTD-Bcl-2, tal como una proteína de fusión TAT-Bcl-2.

En otras realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en los métodos de la presente divulgación se cultivan en presencia de una composición de MYC (por ejemplo, una proteína de fusión TAT-MYC) de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 (por ejemplo, una proteína de fusión TAT-BCl-2) de la presente divulgación, o ambas antes de administrar las ^cM^ha un sujeto. Preferiblemente, cultivar la primera composición en presencia de la composición de MYC y/o la composición de Bcl-2 inmortaliza de manera condicional las CMH, lo que da como resultado una expansión de las ^cM^hcultivadas.

Tal como se usa en el presente documento, una “expansión de células madre hematopoyéticas” o una “expansión de CMH” se refiere a un aumento de la proliferación celular y/o supervivencia celular, en comparación con las CMH que no se han cultivado o tratado con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas. Por ejemplo, la expansión de las CMH se produce cuando la proliferación de las CMH, la supervivencia de las CMH o ambas aumentan en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica y dado a conocer en el presente documento para medir un aumento de la proliferación y/o supervivencia de las CMH.

Por consiguiente, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación pueden obtenerse de la médula ósea, de un procedimiento de aféresis, de células de sangre periférica, de células de sangre periférica que se han sometido a leucocitaféresis, de sangre del cordón umbilical, de líquido amniótico, de células CMH cultivadas, de una línea celular de CMH inmortalizada, o de una línea celular de CMH inmortalizada de manera condicional. Alternativamente, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación pueden estar presentes en la médula ósea, en células de sangre periférica, en células de sangre periférica que se han sometido a leucocitaféresis, en sangre del cordón umbilical, en líquido amniótico y en líneas celulares.

Enfoque transgénico

En algunas realizaciones, las CMH inmortalizadas de manera condicional para su uso en los métodos de la presente divulgación se establecen usando cualquier enfoque transgénico conocido en la técnica (por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de estadounidense n.° US 2007/0116691 y US 2010/0047217. Por ejemplo, las CMH pueden inmortalizarse obteniendo una población expandida de CMH, transfectando (transduciendo) las CMH con un vector que codifica, por ejemplo, para un polipéptido de MYC y/o un polipéptido de Bcl-2 (por ejemplo, inducible y/o controlable), transfectando (transduciendo) las CMH con un vector que codifica para el polipéptido de MYC y/o el polipéptido de Bcl-2, y expandiendo las CMH transfectadas en presencia de una combinación de factores de crecimiento de células madre en condiciones en las que el polipéptido de MYC y/o el polipéptido de Bcl-2 se inducen y/o están activos.

El polipéptido de MYC y/o polipéptido de Bcl-2 son regulables (por ejemplo, inducibles o controlables), de modo que el polipéptido puede activarse y desactivarse (es decir, encenderse o apagarse) según se desee o bien para mantener las CMH en un estado inmortalizado o bien para permitir que se diferencien en un tipo de célula deseado. En algunas realizaciones, el polipéptido de MYC y/o el polipéptido de Bcl-2 se ha modificado de manera que la actividad sea inducible o reprimible. Por ejemplo, el polipéptido de MYC y/o el polipéptido de Bcl-2 pueden contener además un receptor inducible. En determinadas realizaciones, las proteínas recombinantes contienen un receptor de estrógenos (RE). En determinadas realizaciones, la proteína recombinante que fomenta la supervivencia y/o proliferación celular y que contiene un receptor de estrógenos es un polipéptido de MYC-ER y/o un polipéptido de Bcl-2-ER. En determinadas realizaciones, las proteínas que contienen un receptor de estrógenos se inducen por 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). Alternativamente, las proteínas pueden contener un receptor de glucocorticoides (GR), por ejemplo, un receptor de glucocorticoides que es sensible a la mifepristona (MlFEPREX). En determinadas realizaciones, la proteína que contiene un receptor de glucocorticoides es un polipéptido de MYC-GR y/o un polipéptido de Bcl-2-GR.

Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para obtener una población expandida de CMH conocidas en la técnica. Por ejemplo, las CMH pueden cultivarse con uno o más factores de crecimiento que fomentan la proliferación y/o división celular.

Preferiblemente, los vectores son un vector de integración, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma de una célula (por ejemplo, un vector retroviral). Las CMH pueden transfectarse y/o transducirse con los vectores usando cualquier método adecuado de transfección de células, y particularmente células de mamíferos, incluyendo el uso de combinaciones de técnicas. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen, sin limitación, vectores retrovirales, vectores de lentivirus, vectores de parvovirus, vectores de virus vaccinia, vectores de coronavirus, vectores de calicivirus, vectores de papilomavirus, vectores de flavivirus, vectores de ortomixovirus, vectores de togavirus, vectores de picornavirus, vectores adenovirales y vectores de herpesvirus modificados y atenuados. Cualquier vector viral de este tipo puede modificarse adicionalmente con moléculas expresadas en la superficie específicas que las dirigen a las CMH, tales como el SCF unido a membrana u otros ligandos de factor de crecimiento específicos de células madre. Otros métodos de transfección de células de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, electroporación directa de vectores de expresión de mamíferos, tal como mediante el uso de tecnología NUCLEOFECTOR™ (AMAXA Biosystems). Esta tecnología es un método de transferencia de genes no virales altamente eficiente para la mayoría de las células primarias y para líneas celulares difíciles de transfectar, lo cual es una mejora en el método de electroporación conocido desde hace mucho tiempo, basado en el uso de combinaciones específicas de tipos celulares de corriente eléctrica y disoluciones para transferir macromoléculas polianiónicas directamente al núcleo. Además, los métodos adecuados de transfección pueden incluir cualquier método bacteriano, de levadura u otros métodos artificiales de inserción génica que se conocen en la técnica.

Potenciación de la expresión endógena

En algunas realizaciones, las CMH inmortalizadas de manera condicional para su uso en los métodos de la presente divulgación pueden establecerse potenciando la expresión de proteínas endógenas que fomentan la supervivencia y/o proliferación celular incluyendo, sin limitación, cualquier proteína MYC de la presente divulgación. Adicionalmente, las CMH inmortalizadas de manera condicional para su uso en los métodos de la presente divulgación pueden establecerse potenciando también la expresión de proteínas endógenas que inhiben la apoptosis incluyendo, sin limitación, cualquier proteína Bcl-2 de la presente divulgación.

Enfoque de transducción de proteínas

En algunas realizaciones, las CMH obtenidas y/o producidas mediante cualquier método dado a conocer en el presente documento pueden tratarse con un producto génico que fomenta la supervivencia y/o proliferación celular, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier proteína MYC de la presente divulgación, y/o con una proteína que inhibe la apoptosis de las CMH incluyendo, pero sin limitarse a, una proteína Bcl-2 de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la proteína MYC es una proteína de fusión que contiene un PTD. En algunas realizaciones, la proteína Bcl-2 es una proteína de fusión que contiene un PTD. En algunas realizaciones, las CMH obtenidas y/o producidas mediante cualquier método descrito en el presente documento pueden tratarse con uno o más compuestos (opcionalmente una proteína exógena) que permite la regulación por incremento transitoria de al menos una función de una proteína MYC de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la proteína MYC es una proteína de fusión PTD-MYC. En determinadas realizaciones, la proteína de fusión PTD-MYC es una proteína de fusión TAT-MYC.

En algunas realizaciones, las CMH obtenidas mediante cualquier método dado a conocer en el presente documento pueden tratarse con uno o más compuestos (opcionalmente una proteína exógena) que permite la regulación por incremento transitoria de al menos una función de una proteína Bcl-2 de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la proteína Bcl-2 exógena es una proteína de fusión PTD-Bcl-2. En algunas realizaciones, la proteína de fusión PTD-Bcl-2 es una proteína de fusión TAT-Bcl-2.

En otras realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación se tratan con una composición que contiene una proteína de fusión que contiene una proteína MYC de la presente divulgación fusionada a un PTD (por ejemplo, una proteína de fusión PTD-MYC), una composición que contiene una proteína de fusión que contiene una proteína Bcl-2 de la presente divulgación fusionada a un PTD (por ejemplo, una proteína de fusión PTD-Bcl-2), o ambas.

Por consiguiente, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación pueden obtenerse a partir de células madre embrionarias (CME), células madre fetales, células madre pluripotentes inducidas (células MPi), médula ósea, a partir de células de sangre periférica, a partir de células de sangre periférica que se han sometido a aféresis, a partir de células de sangre periférica que se han sometido a leucocitaféresis, a partir de sangre del cordón umbilical, a partir de líquido amniótico, a partir de células CMH cultivadas, a partir de una línea celular CMH inmortalizada o a partir de una línea celular CMH inmortalizada de manera condicional.

Composiciones de CMH

En otras realizaciones, las CMH adecuadas para su uso en cualquiera de los métodos de la presente divulgación se incluyen en una composición. Las composiciones que contienen CMH adecuadas pueden contener, sin limitación, CMH aisladas y/o purificadas; médula ósea completa; médula ósea enriquecida en CMH (por ejemplo, médula ósea tratada con 5-F^u); sangre periférica; y sangre del cordón umbilical. En algunas realizaciones, tales composiciones incluyen un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados pueden incluir excipientes y/o vehículos de administración farmacéuticamente aceptables, para administrar las CMH a un sujeto, tal como un paciente. Además, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener un medio de cultivo celular que soporte la viabilidad de las CMH. El medio estará exento de suero generalmente para evitar provocar una respuesta inmunitaria en el receptor. El portador generalmente estará tamponado y/o libre de pirógenos.

En algunas realizaciones, se administra a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene CMH para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto. Generalmente, administrar de 104a 106CMH es suficiente para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético. En determinadas realizaciones, administrar una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación o ambas a un receptor de trasplante de CMH puede reducir el número de CMH requeridas para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético. Por ejemplo, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas, a un receptor de trasplante de CMH puede reducir la cantidad terapéuticamente eficaz de CMH en una composición de CMH de la presente divulgación requerida para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, en comparación con la cantidad de CMH requerida para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que no se le administra la composición de MYC y/o la composición de Bcl-2.

En determinadas realizaciones, administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas, a un receptor de trasplante de CMH puede reducir la cantidad terapéuticamente eficaz de CMH en una composición de CMH de la presente divulgación requerida para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, o un porcentaje mayor menos, en comparación con la cantidad de CMH requerida para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que no se le administra la composición de MYC y/o la composición de Bcl-2.

En determinadas realizaciones, el tratamiento de una población con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de MYC, una composición de Bcl-2 o ambas en una población de CMH antes de que las CMH se trasplanten al sujeto que lo necesite puede reducir la cantidad terapéuticamente eficaz de CMH requerida para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente o aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, o un porcentaje mayor menos, en comparación con la cantidad de CMH requerida para lograr el reconstitución del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH que sí recibe CMH que se pretrataron con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas.

Las composiciones de CMH y las poblaciones de CMH de la presente divulgación se administran generalmente en el cuerpo de un sujeto, tal como un paciente, mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, inyección e implantación. Por ejemplo, las CMH pueden inyectarse directamente en el tejido en el que se pretende que actúen usando una jeringa que contiene una composición de CMH de la presente divulgación. Alternativamente, una composición de CMH de la presente divulgación puede administrarse a través de un catéter, tal como un catéter venoso central, unido a una jeringa que contiene la composición de CMH.

Trasplante de CMH

En realizaciones adicionales, las composiciones que contienen CMH y las poblaciones de CMH de la presente divulgación se administran a un sujeto que necesita un trasplante de células madre hematopoyéticas (CMH) como una etapa en el proceso de un procedimiento de trasplante de CMH. En determinadas realizaciones preferidas, el sujeto es un paciente humano que necesita un trasplante de CMH. En otras realizaciones, el sujeto es cualquier animal no humano, incluyendo, sin limitación, animales de laboratorio/investigación, roedores, mascotas, ganado, animales de granja, animales de trabajo, animales de carga, especies raras o en peligro de extinción, animales para carreras, animales de zoológico, monos, primates, ratones, ratas, cobayas, hámsteres, perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas, cabras y gallinas.

El procedimiento de trasplante de CMH puede ser un trasplante de CMH mieloablativo. La mieloablación se refiere generalmente a la ablación o supresión del compartimento hematopoyético endógeno de un receptor de trasplante de CMH. La mieloablación se produce antes de trasplantar las CMH. En los receptores de trasplante de CMH que padecen una enfermedad hematológica, tal como un cáncer hematológico, puede realizarse una mieloablación para ayudar a erradicar la enfermedad. La mieloablación también puede realizarse para suprimir el sistema inmunitario endógeno del receptor de trasplante de CMH con el fin de ayudar a reducir el riesgo de rechazo de las CMH trasplantadas (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped). Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para la mieloablación. Los ejemplos de procedimientos de mieloablación incluyen, sin limitación, quimioterapia, irradiación y combinaciones de los mismos.

Alternativamente, el procedimiento de trasplante de CMH puede no ser mieloablativo. En los procedimientos no mieloablativos, se usan menores dosis de quimioterapia y/o radiación en el receptor antes de trasplantar las CMH. Los sujetos que necesitan un trasplante de CMH incluyen sujetos que presentan una indicación de trasplante de CMH. Los ejemplos de indicaciones de trasplante de CMH incluyen, sin limitación, una neoplasia maligna hematológica, un mieloma, mieloma múltiple, una leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, un linfoma, linfoma de crecimiento lento, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, un neuroblastoma, un retinoblastoma, síndrome de Shwachman-Diamond, un tumor cerebral, sarcoma de Ewing, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un tumor de células germinales recidivante, un trastorno hematológico, una hemoglobinopatía, un trastorno autoinmunitario, artritis idiopática juvenil, lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencia combinada grave, neutropenia congénita con células madre defectuosas, anemia aplásica grave, una enfermedad de células falciformes, un síndrome mielodisplásico, enfermedad granulomatosa crónica, un trastorno metabólico, síndrome de Hurler, enfermedad de Gaucher, osteopetrosis, osteopetrosis maligna infantil, cardiopatía, VIH y SIDA. Adicionalmente, un sujeto que necesita un trasplante de CMH también puede incluir un sujeto que ha tenido un trasplante de órgano.

Potenciación de la formación de células del compartimento hematopoyético

Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesite administrando una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; y/o administrando una población de CMH que se ha pretratado con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas. En algunas realizaciones, potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético incluye potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético. En algunas realizaciones, potenciar la formación de células del compartimento hematopoyético incluye potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético.

Potenciación de la reconstitución del compartimento hematopoyético

En determinadas realizaciones, administrar una población de CMH que se han pretratado con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas, a un sujeto que necesita un trasplante de CMH potencia la reconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto. En otras realizaciones, administrar una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación o ambas a un sujeto que ha recibido o recibirá un trasplante de CMH potencia la reconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto. Por ejemplo, pretratar las CMH con la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas, y luego administrar las CMH; o administrar la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas, puede mejorar la tasa de reconstitución del compartimento hematopoyético, aumentar la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman o reducir la pérdida de células del compartimento hematopoyético en el sujeto, en comparación con un sujeto al que se le administran CMH que no se pretrataron con la composición de MYC, la composición de Bcl-2 o ambas; o no se le administró la composición de MYC, la composición de Bcl-2 o ambas.

Preferiblemente, pretratar las CMH con la composición de MYC, la composición de Bcl-2 o ambas antes de administrar las c Mh a un sujeto; o administrar la composición de MYC, la composición de Bcl-2 o ambas al sujeto acelera (es decir, aumenta la tasa de) la reconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto, en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le ha administrado las CMH pretratadas o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

Tal como se usa en el presente documento, una “aceleración en la reconstitución del compartimento hematopoyético” se refiere a una reducción del tiempo requerido para reconstituir al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 100 % de uno o más de los linajes de células sanguíneas en el compartimento hematopoyético, incluyendo, sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos, plaquetas y células dendríticas; y el linaje linfoide, incluyendo, sin limitación, células T, células B, células NKT y células NK. Por ejemplo, una reducción desde 8 hasta 4 semanas del tiempo requerido para reconstituir el compartimento hematopoyético constituiría una aceleración del 50 %.

El pretratamiento con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente

divulgación o ambas; o la administración de una composición de MYC de la presente divulgación, una composición

de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas pueden lograr al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %

a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o

aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadament

imadament

imadament imadament

imadament

o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos

aproximadamente o una alrededor del 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor de aceleración en la reconstitución del

compartimento hematopoyético en un sujeto que ha recibido o recibirá un trasplante de CMH, en comparación con la

reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se administran las CMH pretratadas; o la

composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

Tal como se da a conocer en el presente documento, la reconstitución del compartimento hematopoyético incluye,

sin limitación, la reconstitución del compartimento de células T, la reconstitución del compartimento de células B, la

reconstitución del compartimento de células NK, la reconstitución del compartimento de células mieloides y la

recuperación de neutrófilos. Tal como se usa en el presente documento, el término “compartimento de células T” se

refiere al compartimento de células en un sujeto que contiene todas las células B inmaduras, maduras,

indiferenciadas y diferenciadas. El “compartimento de células T” incluye, sin limitación, células progenitoras de

células T, células pro-T, células pre-T, células T dobles positivas, células T inmaduras, células T maduras, células T

auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras, linfocitos citolíticos naturales (células

NKT) y células T gamma delta. Tal como se usa en el presente documento, el término “compartimento de células B”

se refiere al compartimento de células en un sujeto que contiene todas las células B inmaduras, maduras,

indiferenciadas y diferenciadas. El “compartimento de células B” incluye, sin limitación, células progenitoras de

células B, células pro-B, células pro-B tempranas, células B tardías, células pre-B grandes, células pre-B pequeñas,

células B inmaduras, células B maduras, células B plasmáticas, células B de memoria, células B-1, células B-2,

células B de la zona marginal y células B foliculares. Tal como se usa en el presente documento, el término

“compartimento de células NK” se refiere al compartimento de células en un sujeto que contiene todos los linfocitos

citolíticos naturales (células NK) progenitores, inmaduros, maduros, indiferenciados y diferenciados. Las células NK

del “compartimento de células N^k”. Tal como se usa en el presente documento, el término “compartimento de

células mieloides” se refiere al compartimento de células en un sujeto que contiene todas las poblaciones de células

mieloides progenitoras, inmaduras, maduras, indiferenciadas y diferenciadas. El “compartimento de células

mieloides” incluye, sin limitación, monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos,

megacariocitos, plaquetas y células dendríticas.

Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en

un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de

la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una

composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da

como resultado la reconstitución del compartimento de células T que se acelera en al menos aproximadamente o

aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos

aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al

menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %,

al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución del compartimento de células T en un sujeto al que no se administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de células NKT que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de células NKT en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución del compartimento de células B que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución del compartimento de células B en un sujeto al que no se les administraron las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución del compartimento de células NK que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente ut o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución del compartimento de células NK en un sujeto al que no se les administraron las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución del compartimento de células mieloides que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución del compartimento de células mieloides en un sujeto al que no se administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de monocitos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de monocitos en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas ; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado una reconstitución de macrófagos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de macrófagos en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado una reconstitución de basófilos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de basófilos en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de eosinófilos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de eosinófilos en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de eritrocitos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de eritrocitos en un sujeto al que no se le administra el pretratado CMH; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de megacariocitos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de megacariocitos en un sujeto al que no se le administra el tratamiento previamente CMH; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución plaquetaria que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de plaquetas en un sujeto al que no se le administran las ^cM^hpretratadas ; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado la reconstitución de células dendríticas que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la reconstitución de células dendríticas en un sujeto al que no se le administra la CMH tratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

En otras realizaciones, la reconstitución acelerada del compartimento hematopoyético en un receptor de trasplante de CMH al que se le han administrado CMH pretratadas con una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas; o administrado una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas da como resultado una recuperación de neutrófilos que se acelera en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o un porcentaje mayor más, en comparación con la recuperación de neutrófilos en un sujeto al que no se le administran las CMH pretratadas; o la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

Autorreconstitución potenciada del compartimento hematopoyético

En otras realizaciones, administrar una composición de MYC de la presente divulgación a un sujeto que necesita una autorreconstitución potencia la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto. Por ejemplo, administrar la composición de MYC puede mejorar la tasa de autorreconstitución, aumentar la cantidad de células del compartimento hematopoyético que se forman o reducir la pérdida de células del compartimento hematopoyético en el sujeto, en comparación con un sujeto al que no se le administra la composición de MYC.

La administración de una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas, puede potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 % a al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, por ejemplo, al menos aproximadamente o aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 31 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 32 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 33 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 34 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 67 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 69 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 150 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 200 %, en menos aproximadamente o aproximadamente el 250 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente o aproximadamente el 500 %, o más, en comparación con la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que no se le administra la composición de la composición de MYC, la composición de Bcl-2, o ambas.

Tal como se da a conocer en el presente documento, la autorreconstitución del compartimento hematopoyético incluye, sin limitación, l autorreconstitución del compartimento de células T, autorreconstitución del compartimento de células B, autorreconstitución del compartimento de células NKT y autorreconstitución del compartimento de células NK; la autorreconstitución del compartimento de células mieloides, tal como autorreconstitución de monocitos, autorreconstitución de macrófagos, autorreconstitución de basófilos, autorreconstitución de eosinófilos, autorreconstitución de eritrocitos, autorreconstitución de megacariocitos, autorreconstitución de plaquetas y autorreconstitución de células dendríticas; y recuperación de neutrófilos.

Formulaciones de composición

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a composiciones que contienen una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas para pretratar las CMH de la presente divulgación y para tratar a sujetos que necesitan un trasplante de CMH. Otros aspectos se refieren a una primera composición que contiene CMH para lograr la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesita, y una segunda composición que contiene una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas para potenciar la reconstitución del compartimento hematopoyético en el sujeto. Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a una composición que contiene una composición de MYC de la presente divulgación, una composición de Bcl-2 de la presente divulgación, o ambas para potenciar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente divulgación se formulan de manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables incluyendo, por ejemplo, excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que son adecuadas para uso farmacéutico. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin limitación, solución salina, disoluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales portadores se conoce bien en la técnica. El portador es preferiblemente estéril. En algunas realizaciones, el portador es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos, mediante el uso, por ejemplo y sin limitación, de parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico o timerosal.

Los ejemplos de materiales y disoluciones que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) maltosa; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja;

(10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones con pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

La formulación apropiada de las composiciones de la presente divulgación puede depender de la vía de administración elegida. Un resumen de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se encuentra, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, decimonovena edición (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1975; Liberman, H. A. y Lachman, L., eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y, 1980; y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, séptima edición. (Lippincott Williams & Wilkins 1999).

Las composiciones de la presente divulgación pueden facilitar la administración de un compuesto de la presente divulgación (por ejemplo, CMH o una composición de MYC o una composición de Bcl-2) a un sujeto o célula. En determinadas realizaciones de los métodos de la presente divulgación, se administran cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos descritos en el presente documento en una composición farmacéutica a un sujeto que padece un trastorno, enfermedad o afección a tratar. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente humano. En otras realizaciones, el sujeto es un animal no humano, incluyendo, sin limitación, un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, mono, rata, ratón o similares.

Las composiciones de CMH, las composiciones que contienen la composición de MYC y/o las composiciones que contienen la composición de Bcl-2 de la presente divulgación pueden usarse solas o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, pueden administrarse citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos y/o modificadores de molécula pequeña que se sabe que ayudan a reducir el tiempo requerido para reconstituir los linajes hematopoyéticos maduros después de trasplantar las CMH, en combinación con las CMH, composiciones que contienen la composición de MYC y/o que contienen la composición de Bcl-2. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y/o modificadores de molécula pequeña que seleccionan como diana enzimas que afectan a la expresión de selectina E pueden mejorar la localización de las CMH en los nichos de la médula ósea después de un trasplante de CMH. Otros ejemplos incluyen, sin limitación, anticuerpos o moléculas pequeñas que afectan a proteínas de adhesión tales como la integrina p6, G-MCSF, G-CSF es el mismo y Epo. Por consiguiente, determinadas realizaciones de los métodos de la presente divulgación incluyen además administrar una tercera composición que contiene al menos una citocina, factor de crecimiento, anticuerpo y/o modificador de molécula pequeña. En algunas realizaciones, la composición de citocina y/o factor de crecimiento contiene además un portador farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones de la presente divulgación pueden administrarse a un sujeto de cualquier manera adecuada, incluyendo, sin limitación, una o más de múltiples vías de administración, tales como las vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular), intranasal, bucal, rectal o transdérmica.

Las formulaciones de composición de la presente divulgación incluyen, sin limitación, dispersiones líquidas acuosas, emulsiones oleosas, dispersiones autoemulsionantes, disoluciones sólidas, dispersiones liposomales, aerosoles, formas farmacéuticas sólidas, polvos, formulaciones de liberación inmediata, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fusión rápida, comprimidos, cápsulas, píldoras, formulaciones de liberación retardada, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación pulsátil, formulaciones multiparticuladas y formulaciones mixtas de liberación inmediata y controlada.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación (por ejemplo, una composición de PTD-MYC, una composición de PTD-Bcl-2 o una composición de citocina y/o factor de crecimiento) se fabrican opcionalmente de una manera convencional, incluyendo, sin limitación, procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsionamiento, encapsulación, atrapamiento o compresión.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación (por ejemplo, una composición de PTD-MYC, una composición de PTD-Bcl-2 o una composición de citocina y/o factor de crecimiento) están en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración única de dosis precisas. En la forma de dosificación unitaria, la formulación se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas de uno o más compuestos. En algunas realizaciones, la dosis unitaria está en forma de un paquete que contiene cantidades discretas de la formulación. Los ejemplos no limitativos incluyen comprimidos o cápsulas envasados y polvos en viales o ampollas. Las composiciones en suspensión acuosa se envasan opcionalmente en recipientes de dosis única que no pueden volver a cerrarse. En algunas realizaciones, se usan recipientes de dosis múltiples que pueden volver a cerrarse. En determinadas realizaciones, los envases de dosis múltiples contienen un conservante en la composición. Las formulaciones para inyección parenteral pueden presentarse en formas de dosificación unitaria, que incluyen, sin limitación, ampollas o en recipientes multidosis con un conservante añadido.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar ningún aspecto de la presente divulgación en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones

El siguiente ejemplo describe los resultados del tratamiento de ratones con una proteína de fusión TAT-MYC después del trasplante con células de médula ósea expandidas (por ejemplo, células madre hematopoyéticas a largo plazo transducidas con proteínas (ptlt-CMH)).

Materiales y métodos

Se obtuvieron cohortes de ratones C57BL/6J hembra de 4-6 semanas de edad de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Se trataron los ratones con 5 mg/ratón de 5-fluorouracilo (5FU), por vía intravenosa. Se recogieron células de médula ósea (MO) de los huesos de la tibia y el fémur 5 días después del tratamiento con 5FU. Se lisaron los glóbulos rojos mediante incubación en 5 ml de tampón TAC estéril (NH⁴Cl 135 mM, Tris 17 mM pH 7,65). se expandieron las células de médula ósea en medio BM (DMEM que contiene FCS al 15 %, 100 unidades por ml de pen./estrep., MEM NEAA (Gibco), HEPES 10 mM, IL-3 murina recombinante, IL-6 y SCF) complementado con Tat-Myc recombinante 5 |ig/ml y Tat-Bcl-2 recombinante 10 |ig/ml. Se cultivaron las células durante 21 días con un cambio de medio BM cada 48 h para regenerar las proteínas de fusión de Tat.

Se prepararon citocinas sembrando células 293FT en placas de 150 mm a 12x106 células por placa en medio D10 (DMEM, FBS al 10 %, 100 unidades por ml de pen./estrep., MEM NEAA (Gibco), L-glutamina 2mM (Gibco)). Se transfectaron las células con 30 |ig de ADN total por placa que consistía en 10 |ig de pcDNA3.1-SCF, 10 |ig de pcDNA3.1-IL3 y 10 |ig de pcDNA3.1-IL6 o 10 |ig de pcDNA3.1-TPO, 10 |ig de pcDNA3.1-Flt3-L y 10 |ig de pcDNA3.1-GM-CSF usando fosfato de calcio (Young, R.M. et al. (2008). Future Oncology, 4, 591-4.). Al día siguiente, se retiró el medio y se reemplazó con 100 ml de medio D10. Se incubaron las células a 37 °C/5 % de CO²durante 4-5 días. Se recogió el medio, se sometió a filtración esterilizante y se congeló a -20 °C en alícuotas de 30 ml.

Después de 21 días, se trasplantaron 5x103 células de médula ósea expandidas en ratones Rag-1 ~-~ irradiados de manera subletal en un contexto de C57/BL6 (Jackson Laboratory) que recibieron 350 Rads de radiación justo antes de la inyección de las células de MO a través de la vena de la cola. Se lavaron 3 veces las células expandidas en PBS antes de la inyección a través de la vena de la cola en 200 |il de PBS.

Después de 24 horas, se inyectó por vía intramuscular a una cohorte de ratones 10 |ig de TAT-MYC emulsionado en aceite de maíz. Se prepara la emulsión añadiendo 30 |ig de Tat-MYC en 1 ml de aceite de maíz. Justo antes de la inyección, el aceite de maíz que contiene Tat-MYC se hace pasar varias veces de 1 jeringa a una segunda jeringa a través de una llave de dos vías. Se inyectan por vía i.m. al ratón 300 |il de la emulsión que contiene 10 |ig de Tat-MYC, justo al lado de la cola.

Se monitorizó la reconstitución del compartimento linfoide mediante análisis de citometría de flujo (FACS) de muestras de sangre periférica obtenidas mediante venopunción de la cola a las 4 semanas y 8 semanas después del trasplante. Se monitorizaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante FACS para determinar la expresión de TCRp y de B220.

Resultados

Tal como se muestra en las figuras 1 y 3, se observó un desarrollo acelerado de células T en ratones tratados con TAT-MYC después de un trasplante de médula ósea con células de médula ósea expandidas ex vivo. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ de manera subletal y se les administraron trasplantes de 5x103 células de médula ósea expandidas (figuras 1C y 1D; figuras 3C y 3D). A la mitad de los ratones irradiados y trasplantados en cada cohorte se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC 24 horas después del trasplante (figuras 1D y 3D). También se proporcionan como control análisis por FACS de ratones Rag-1'/_ silvestre (sin tratar y sin irradiar) (figuras 1A, 0,9 % de células TCRp+ y 3A, 0,8 % de células TCRp+) y ratones C57BL/6 (figuras 1B, 34,3 % de células TCRp+ y 3B, 34,3 % de células TCRp+).

Se sometieron a prueba ratones para determinar la reconstitución de células T a las 4 semanas (figura 1) y a las 8 semanas (figura 3) mediante análisis por FACS de su sangre periférica. La figura 1D muestra los niveles a las 4 semanas de células T en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (5,6 % de células TCRp+), en comparación con el control (figura 1C) al que no se le inyectó TAT-MYC (0,2 % de células TCRp+). La figura 3D muestra los niveles de células T a las 8 semanas en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (13,1 % de células TCRp+), en comparación con el control (figura 3C) al que no se le inyectó TAT-MYC (4,2 % de células TCRp+). A las 4 semanas, los ratones a los que se les inyectó TAT-MYC mostraron niveles de células T similares a los de los ratones de control a los que no se les inyectó TAT-MYC a las 8 semanas. Como el tiempo promedio de recuperación de las células T es de 8-10 semanas, esto representa una aceleración de aproximadamente el 50-60 %.

Tal como se muestra en las figuras 2 y 4, también se observó un desarrollo acelerado de células B en ratones tratados con TAT-MYC tras un trasplante de médula ósea con células de médula ósea expandidas. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ en un contexto de C57/BL6 de manera subletal y recibieron trasplantes de 5x103 células de médula ósea expandidas. A la mitad de los ratones irradiados y trasplantados en cada cohorte se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC 24 horas después del trasplante (figuras 2D y 4D). También se proporcionan como control análisis por FACS de ratones Rag-1'/_ silvestres (sin tratary sin irradiar) (figuras 2A, 1,15 % de células B220+ y 4A, 1 % de células B220+) y ratones C57BL/6 (figuras2B, 21,4 % de células B220+ y 4B, 29,2 % de células B220+).

Se sometieron a prueba ratones para determinar la reconstitución de células B a las 4 semanas (figura 2) y a las 8 semanas (figura 4) mediante análisis por FACS de su sangre periférica. La figura 2D muestra los niveles a las 4 semanas de células B en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (12,1 % de células B220+), en comparación con el control (figura 2C) al que no se le inyectó TAT-MYC (0,3 % de células B220+). La figura 4D muestra los niveles de células B durante 8 semanas en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (5,4 % de células B220+), en comparación con el control (figura 4C) al que no se le inyectó TAT-MYC (1,2 % de células B220+). A las 4 semanas, los ratones a los que se les inyectó TAT-MYC mostraron mayores niveles de células B que los de los ratones de control a los que no se les inyectó TAT-MYC a las ⁸semanas. Como el tiempo promedio de recuperación de las células B es de 8-12 semanas, esto representa una aceleración de aproximadamente el 50-67 %.

Ejemplo 2: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones

El siguiente ejemplo describe los resultados del tratamiento de ratones con una proteína de fusión TAT-MYC tras un trasplante de médula ósea completa recién aislada.

Materiales y métodos

Para los trasplantes de médula ósea completa en ratones, tanto los donantes como los receptores tenían un contexto C57/BL6.

Se lavaron células de médula ósea de fémures y huesos tibiales obtenidos de dos ratones C57/BL6 silvestres donantes. Se transfirieron las células recogidas a medio completo D10 (DMEM complementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 10 %, penicilina/estreptomicina 100 unidades/ml, L-glutamina 10 |ig/ml, así como MEM NEAA). Los aspirados de médula ósea se disociaron en suspensiones monocelulares y se sedimentaron mediante centrifugación. Se lisaron los glóbulos rojos mediante la incubación de la suspensión celular en un tampón hipotónico (NH⁴O 135 mM, Tris 17 mM, pH 7,65). Se lavaron luego las células restantes en medio D10 seguido por dos lavados con PBS y se mantuvieron frías hasta el trasplante en ratones Rag-1'/_ el mismo día.

Se irradiaron los ratones Rag-1'/_ receptores con 350 Rads (irradiación de cuerpo entero). Los ratones receptores recibieron 1 x 10⁶células de médula ósea completa mediante inyección en la vena de la cola. 24 horas después del trasplante de células de médula ósea, se administraron a los ratones 10 |ig de TAT-MYC emulsionado en 300 |il de aceite de maíz tal como se describe en el ejemplo 1. Se administró TAT-MYC mediante inyección intramuscular. Se monitorizó la reconstitución del compartimento linfoide mediante análisis por citometría de flujo (FACS) de muestras de sangre periférica obtenidas mediante venopunción de la cola. Específicamente, se monitorizaron muestras para determinar la aparición de células T que expresan CD4 o CD⁸(TCRp), así como células B (células que expresan CD19 y B220).

También se midieron muestras de células de bazo de ratones quiméricos para determinar la capacidad para responder a la estimulación mitogénica. Se marcaron células T y las células B derivadas del bazo con CFSE y se activaron o bien con anticuerpos contra CD3 (células T) o bien con anticuerpos contra IgM y CD40 (células B). Se evaluó la proliferación de las células, determinada mediante dilución de la señal de CFSE, usando FACS, 72 horas después de la estimulación.

Resultados

Se irradiaron cohortes de 5 ratones cada una (ratones Rag-1'/_) de manera subletal y se les administraron 10⁶células de MO completa obtenidas de ratones donantes C57/BL6 hembra. A los ratones receptores de trasplantes se les inyectó TAT-MYC 24 horas después o no se trataron. Se mantuvieron los ratones quiméricos en el vivero para observación durante 4 semanas. En ese momento, se sacrificó a los ratones y se recogieron PBMC y bazos. Los bazos se usaron para generar una suspensión monocelular. Luego, se tiñeron esas células con anticuerpos fluoresceinados contra CD4 y CD⁸murinos y se analizaron mediante citometría de flujo.

Las figuras 5 y ⁶muestran el desarrollo acelerado de células T en ratones tratados con TAT-MYC tras un trasplante de médula ósea completa recién aislada. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ en un contexto de C57/BL6 de manera subletal y recibieron trasplantes de 1x10⁶células de médula ósea completa. A la mitad de las cohortes trasplantadas se les inyectó TAT-MYC 24 horas después del trasplante.

La figura 5A muestra el nivel de células T CD4 y CD⁸de sangre periférica en ratones Rag-1'/_ de control que no recibieron irradiación, un trasplante de células ni tratamiento con Tat-Myc (0,03 % de células CD4+y 0,8 % de CD⁸+). La figura 5B muestra el nivel de células T CD4 y CD⁸de sangre periférica en ratones C57BL/6 silvestre sin tratar y sin irradiar como control (13,1 % de células CD4+ y 11,1 % de c D8+). La figura 5D muestra la detección de células T tanto CD4 como CD⁸en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (14,9 % de células CD4+ y ^{8 , 6}% de CD⁸), en comparación con los ratones (figura 5C) a los que no se les inyectó TAT-MYC (4,2 % de células CD4+ y 3,2 % de CD⁸). A las 4 semanas, los ratones tratados con TAT-MYC 24 horas después del trasplante de médula ósea completa tienen aproximadamente los mismos niveles de células T CD4 y CD⁸que los ratones C57BL/6 silvestres.

La figura ⁶representa gráficamente el porcentaje de células T para la cohorte completa de ratones descrita anteriormente y mostrada en la figura 5. La figura ⁶A muestra el porcentaje de células CD4+ en la sangre periférica a las 4 semanas después del trasplante en C57BL/6 silvestres (primera columna), en ratones Rag-1'/_ irradiados y trasplantados, pero sin tratar con TAT-MYC (segunda columna) y en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC (tercera columna). La figura ⁶B muestra el porcentaje de células CD⁸+ en la sangre periférica a las 4 semanas después del trasplante en C57BL/6 silvestres (primera columna), en ratones Rag-1-/" irradiados y trasplantados, pero sin tratar con TAT-MYC (segunda columna) y en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC (tercera columna).

Las figuras 7 y 8 muestran el desarrollo acelerado de células B en ratones tratados con TAT-MYC tras un trasplante de médula ósea recién aislada. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ en un contexto de C57/BL6 de manera subletal y recibieron trasplantes de 1x106 células de médula ósea completa. A la mitad de las cohortes trasplantadas se les inyectó TAT-MYC 24 horas después del trasplante.

La figura 7A muestra el nivel de células B CD19xB220 de sangre periférica en ratones Rag-1'/_ de control que no recibieron irradiación, un trasplante de células ni tratamiento con TAT-MYC (0,2 % de células CD19+xB220+). La figura 7B muestra el nivel de células B CD19xB220 de sangre periférica en ratones C57BL/6 silvestres sin tratar y sin irradiar como control (25,8 % de células CD19+xB220+). La figura 7D muestra la detección de ambas células B CD19xB220 en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC (5,2 % células CD19+xB220+), en comparación con los ratones (figura 7C) que a los que no se les inyectó TAT-MYC (1,4 % de células CD19+xB220+). A las 4 semanas, los ratones tratados con TAT-MYC 24 horas después del trasplante de médula ósea completa tienen niveles significativamente mayores de células B CD19xB220 que los ratones de control trasplantados no tratados con TAT-MYC.

La figura 8 representa gráficamente el porcentaje de células B para la cohorte completa de ratones descrita anteriormente y mostrada en la figura 7. La figura 8A muestra el porcentaje de células CD19xB220+ en la sangre periférica a las 4 semanas después del trasplante en C57BL/6 silvestres (primera columna), en ratones Rag-1'/_ irradiados y trasplantados, pero no tratados con TAT-MYC (segunda columna) y en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC (tercera columna).

La figura 9 muestra que las células T y las células B que se desarrollaron en ratones quiméricos a los que se les trasplantó médula ósea completa y se trataron con TAT-MYC 24 horas después del trasplante fueron funcionales y proliferaron tras la estimulación de sus receptores antigénicos. Se marcaron células T y las células B derivadas del bazo con CFSE y se activaron o bien con anticuerpos contra CD3 (células T) o bien con anticuerpos contra IgM y CD40 (células B). Se evaluó la proliferación de las células, determinada mediante dilución de la señal de CFSE, usando FACS, 72 horas después de la estimulación.

Tal como se muestra en la figura 9A, el 33,3 % de las células del bazo de los ratones que recibieron trasplantes de 1x106 células de MO completa, pero no tratadas con TAT-MYC, mostraron una activación de células T tras la estimulación con anticuerpo anti-CD3. Las células del bazo del ratón quimérico que recibieron trasplantes de 1x106 células de MO completa y se trataron con TAT-MYC mostraron el 36,6 % de activación de células T después de la estimulación con CD3 (figura 9C). De manera similar, la figura 9B muestra el 6,92 % de las células del bazo de ratones que recibieron trasplantes de 1x106 células de MO completa, pero no tratadas con TAT-MYC, mostraron una activación de células B tras la estimulación con anticuerpo anti-CD40 y anti-IgM. Las células del bazo del ratón quimérico que recibieron trasplantes de 1x106 células de MO completa y se trataron con TAT-MYC mostraron el 15,8 % de activación de células B después de la estimulación con CD40 e IgM (figura 9D). Estos datos muestran que las células linfoides maduras obtenidas de ratones quiméricos para CMH que recibieron tratamiento con TAT-MYC fueron capaces de activarse y experimentar división celular tras la activación a través de sus receptores antigénicos. Ejemplo 3: Inducción de la reconstitución hematopoyética en ratones tratados con 5-fluorouracilo

El siguiente ejemplo describe los resultados del tratamiento de ratones con una proteína de fusión TAT-MYC después de la administración de 5-fluorouracilo (5-FU), un agente quimioterápico conocido por ser tóxico para el compartimento hematopoyético.

Introducción

Los enfoques actuales para revertir la insuficiencia de la médula ósea que surge de diversas agresiones ambientales o enfermedades, entre otros, se basan básicamente en la administración de factores de crecimiento y transfusiones de glóbulos rojos como terapia de apoyo. El objetivo final de estos enfoques es fomentar que las CMH endógenas restantes se movilicen y repueblen el compartimento hematopoyético (autorreconstitución). Sin embargo, los enfoques actuales son ineficaces y en muchos casos simplemente retrasan el requisito de un trasplante de médula ósea mielosupresor.

Además, la sensibilidad de las CMH a los fármacos quimioterápicos así como a la radiación ha limitado históricamente las dosis de cada terapia que pueden aplicarse a un paciente con un tumor sólido, por ejemplo. La pérdida de CMH y del compartimento hematopoyético es uno de los primeros signos de toxicidad relacionada con la terapia en pacientes con cáncer. La capacidad de preservar el compartimento de las CMH de los agentes terapéuticos usados para el cáncer podría cambiar significativamente los enfoques que se usan actualmente para administrar tales tratamientos.

Los resultados anteriores en los ejemplos 1 y 2 que utilizan TAT-MYC en el contexto del trasplante de CMH con un bajo número de células del donante mostraron que TAT-MYC también podría ser útil para fomentar la autorreconstitución del compartimento hematopoyético en pacientes con síndrome de insuficiencia de la médula ósea. Aunque sin pretender restringirse por la teoría, se cree que el tratamiento con TAT-MYC seleccionará como diana un pequeño número de las CMH residentes restantes e inducirá que tales CMH se dividan y den lugar a linajes hematopoyéticos diferenciados.

Materiales y métodos

Se usaron para estos experimentos cohortes de ratones silvestres (WT) C57/BL6 hembra de 4-6 semanas de edad. Se trataron cohortes de 5 ratones por vía intravenosa con 5-fluorouracilo (5 mg/ratón) solo, o seguido de un tratamiento con 10 |ig/ratón de TAT-MYC o 10 |ig/ratón de TAT-Cre (24 horas después de la exposición a 5FU). Ambas proteínas se emulsionaron en aceite de maíz inmediatamente antes de la inyección intramuscular. En algunos experimentos, se pretrataron los ratones (48 horas antes de la exposición a 5FU) o bien con 10 |ig/ratón de TAT-MYC o bien de TAT-Cre.

Se monitorizó la reconstitución del compartimento linfoide mediante análisis por citometría de flujo (FACS) de muestras de sangre periférica obtenidas mediante venopunción de la cola. Específicamente, se monitorizaron muestras para determinar la aparición de células T que expresan CD4 o CD8 (TCRp), así como células B (células que expresan CD19 y B220).

Resultados

Se usó la exposición a 5-fluorouracilo como modelo de agresión ambiental y, de manera más general, tales como modelo para el tratamiento de cualquier insuficiencia de la médula ósea. Las figuras 10, 11 y 12 muestran la autorreconstitución acelerada de células T a las 2 semanas en ratones tratados con TAT-MYC 24 horas después de la exposición a 5-fluorouracilo. Se expusieron cohortes de ratones C57BL/6 a 5FU y o bien se dejaron sin tratar (figura 10A) o bien se les inyectó por vía intramuscular una proteína de control TAT-CRE (figura 10B) o bien TAT-MYC 24 horas después de la exposición a 5FU (figura 10C).

La figura 10A muestra el nivel de células T positivas para CD4 y CD8 de sangre periférica a las 2 semanas en ratones C57/BL6 expuestos a 5FU que no recibieron tratamiento con TAT-Cre o TAT-MYC después de la exposición a 5FU (3,9 % de células CD4+ y 2,4 % de CD8+). La figura 10B muestra el nivel de células T positivas para CD4 y CD8 de sangre periférica en ratones C57/BL6 expuestos a 5FU que recibieron tratamiento con 10 |ig de TAT-Cre después de la exposición a 5FU (5,5 % de células CD4+ y 2,55 % de CD8+). La figura 5C muestra el nivel de células T positivas para CD4 y CD8 de sangre periférica en ratones C57/BL6 expuestos a 5FU que recibieron tratamiento con 10 |ig de TAT-MYC después de la exposición a 5FU (14,9 % de células CD4+ y 9,69 % de CD8+).

Las figuras 11 y 12 representan gráficamente el porcentaje de células T para la cohorte completa de ratones descrita anteriormente y mostrada en la figura 10. La figura 11 muestra el porcentaje de células CD4+ de sangre periférica a las 2 semanas después de la exposición a 5FU en ratones C57BL/6 no tratados con ninguna de las proteínas (primera columna), en ratones C57BL/6 a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC (segunda columna) y en ratones C57BL/6 a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-CRE (tercera columna). La figura 12 muestra el porcentaje de células CD8+ de sangre periférica a las 2 semanas después de la exposición a 5FU en ratones C57BL/6 no tratados con ninguna de las proteínas (primera columna), en ratones C57BL/6 a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-MYC (segunda columna) y en ratones C57BL/6 a los que se les inyectaron 10 |ig de TAT-CRE (tercera columna).

En otros experimentos, se usa la exposición a 5-fluorouracilo como modelo para la protección frente a agresiones ambientales, incluyendo para la protección de las CMH frente a los efectos secundarios de la quimioterapia o la radioterapia.

Se dejan sin tratar cohortes de ratones C57BL/6, se tratan por vía intramuscular con TAT-MYC o se tratan por vía intramuscular con una proteína de control (TAT-CRE). Se administran cinco mg de 5-FU por vía intravenosa 24 horas más tarde. En diversos momentos después de la exposición a 5FU (opcionalmente, los días 3, 5, 7 o más), se analizan por FACS muestras de sangre periférica para evaluar la frecuencia de células T (células T CD4+ y CD8+) en la sangre. Una comparación entre ratones pretratados con TAT-MYC o la proteína de control TAT-CRE indicará si TAT-MYC puede conferir quimioprotección a los linajes hematopoyéticos.

Ejemplo 4: Inducción de la reconstitución hematopoyética en ratones tratados con agentes de estrés genotóxico En el siguiente ejemplo se usan dos formas de estrés genotóxico para las CMH, químico y radiológico. Se tratan ratones C57/BL6 de la misma edad y sexo o bien con TAT-MYC o bien con una proteína de control y luego se someten a exposición con o bien un agente quimioterápico como tal (5FU) o ciclofosfamida (CTX), o bien con dosis subletales de radiación. Se monitorizan las fluctuaciones en la frecuencia de células T y células B maduras en la sangre periférica de los ratones, comenzando 5-7 días después de la exposición a los estímulos específicos.

Uso de TAT-MYC para conferir quimioprotección a linajes hematopoyéticos in vivo

Se inyecta TAT-MYC a cohortes de 10 ratones C57/BL6, se les inyecta un control negativo (por ejemplo, TAT-CRE) o se dejan sin tratar. 24, 48 ó 72 horas más tarde (opcionalmente en cualquier punto de tiempo entre 1 y 72 horas), se tratarán 5 ratones en cada cohorte con 5 mg/ratón de 5FU o 4 mg/ratón de ciclofosfamida (CTX). Los otros 5 ratones de la cohorte se dejarán sólo con el tratamiento inicial de TAT-MYC, TAT-CRE o sin inyección). Se obtiene sangre periférica mediante venopunción y se analiza por FACS la frecuencia de células T y células B maduras en la sangre.

Se evalúan los ratones para detectar cambios reducidos en la frecuencia de células T y células B murinas en la sangre periférica de ratones tratados con TAT-MYC antes de la exposición a 5FU, busulfano A o ciclofosfamida (CTX), a diferencia de la disminución significativa de la frecuencia de células T y células B maduras observada en todos los demás ratones expuestos a esos agentes quimioterápicos. Alternativamente, se evalúa el tiempo de recuperación fallecido de los ratones para restaurar la frecuencia de células T y células B murinas en la sangre periférica de los ratones tratados con TAT-MYC antes de la exposición a 5FU, busulfano A o CTX, en comparación con el tiempo de duración requerido para ver la recuperación en la frecuencia de células T y células B maduras observada en todos los demás ratones expuestos a esos agentes quimioterápicos.

Los estudios adicionales implican un aumento de la dosis (o disminución) de o bien 5FU, busulfano A o bien CTX en ratones que se tratan con TAT-MYC para determinar los parámetros de los aumentos de las dosis de agentes quimioterápicos que se facilitan por el tratamiento con TAT-MYC.

Uso de TAT-MYC para conferir radioprotección a linajes hematopoyéticos in vivo

La configuración experimental es esencialmente la misma que la anterior. La única diferencia es que los ratones se exponen a una variedad de dosis de radiación en lugar de a agentes quimioterápicos tras el tratamiento con TAT-MYC, TAT-CRE o sin tratamiento. Por consiguiente, pueden usarse 350 Rads y 600 Rads para los ratones C57/BL6J. Se monitoriza la sangre periférica por la fluctuación de células linfoides o mieloides maduras en FACS. Se evalúan los ratones para detectar cambios reducidos en la frecuencia de células T y células B murinas en la sangre periférica de los ratones tratados con TAT-MYC antes de la exposición a radiación subletal o letal, a diferencia de la disminución significativa de la frecuencia de células T y células B maduras observada en todos los demás ratones expuestos a radiación. Alternativamente, se evalúan los ratones para determinar el tiempo de recuperación fallecido para restaurar la frecuencia de células T y células B murinas en la sangre periférica de los ratones tratados con TAT-MYC antes de la exposición a la radiación, en comparación con el tiempo de duración requerido para ver la recuperación en la frecuencia de células T y células B maduras observadas en todos los demás ratones expuestos a radiación.

Los estudios adicionales implican un aumento (o disminución) de dosis de las dosis de radiación en ratones que se tratan con TAT-MYC para determinar los parámetros de los aumentos de las dosis de radiación que se habilitan por el tratamiento con TAT-MYC y una posible combinación de radiación y agentes quimioterápicos.

Ejemplo 5: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones siguiendo diferentes vías de administración El siguiente ejemplo describe los resultados del tratamiento de ratones con una proteína de fusión TAT-MYC administrada o bien por vía intramuscular o bien por vía intravenosa tras un trasplante de médula ósea completa recién aislada.

Materiales y métodos

Se realizaron experimentos tal como se describe en el ejemplo 2 y se acepta que se proporcionó TAT-MYC usando diferentes vías de administración.

En resumen, tanto los ratones donantes como receptores tenían un contexto C57BL/6. Se lavaron células de médula ósea de fémures y huesos tibiales obtenidos de dos ratones C57/BL6 silvestres donantes. Los aspirados de médula ósea se disociaron en suspensiones monocelulares, se sedimentaron mediante centrifugación y se lisaron los glóbulos rojos. Se lavaron luego las células restantes y se mantuvieron frías hasta el trasplante en ratones Rag-1'/_ el mismo día.

Se irradiaron los ratones Rag-1'/_ receptores con 350 Rads (irradiación de cuerpo entero). Los ratones receptores recibieron 1 x 106 células de médula ósea completa mediante inyección en la vena de la cola. 24 horas después del trasplante de células de médula ósea, los ratones recibieron una inyección intravenosa de 10 |ig de TAT-MYC disuelto en 200 |il de PBS o una inyección intramuscular de 10 |ig de TAT-MYC emulsionado en 300 |il de aceite de maíz tal como se describe en el ejemplo 1.

Se monitorizó la reconstitución del compartimento linfoide mediante análisis por citometría de flujo (FACS) de muestras de sangre periférica obtenidas mediante venopunción de la cola. Específicamente, se monitorizaron muestras para determinar la aparición de células T que expresan CD4 o CD8 (CD4xTCRp), así como células B (células que expresan IgMxCD19).

Resultados

Se irradiaron cohortes de 5 ratones cada una (ratones Rag-1'/_) de manera subletal y se les administraron trasplantes de 106 células de médula ósea completa obtenidas de ratones donantes C57/BL6 hembra. A los ratones receptores de trasplantes o bien se les inyectó TAT-MYC 24 horas más tarde o bien no se trataron. Se mantuvieron los ratones quiméricos en el vivero para observación durante al menos 4 semanas, momento en el que se obtuvo sangre periférica mediante venopunción y se evaluaron los niveles de células T y B por FACS.

Las figuras 13 y 14 muestran el desarrollo acelerado de células T en ratones tratados con TAT-MYC después de un trasplante de médula ósea completa recién aislada. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ en un contexto de C57/BL6 de manera subletal y recibieron trasplantes de 1x106 células de médula ósea completa (figuras 13C, 13D y 13E). Dos tercios de los ratones trasplantados en la cohorte recibieron inyección intravenosa (figura 13D) o intramuscular (figura 13E) con 10 |ig de TAT-MYC 24 horas después del trasplante. También se proporcionan como control análisis por FACS de ratones Rag-1'/_ silvestres (sin tratar y sin irradiar) (figura 13A, 0,579 % de células CD4xTCRp+) y ratones C57BL/6 (figura 13B, 17,5 % de células CD4xTCRp+).

Las figuras 13D y 13E muestran la detección de células T CD4xTCRp+en la sangre periférica de ratones que recibieron TAT-MYC intravenoso (32,8 % de células CD4xTCRp+) o TAT-MYC intramuscular (18,2 % de células CD4xTCRp+), en comparación con el control (figura 13C) al que no se le inyectó TAT-MYC (6,39 % de células CD4xTCRp+). TAT-MYC inyectado por cualquier vía dio como resultado que los ratones tuvieran aproximadamente los mismos niveles de células T CD4xTCRp+ que los ratones C57BL/6 silvestres.

La figura 14 representa gráficamente el porcentaje de células T para la cohorte completa de ratones descrita anteriormente y mostrada en la figura 13. El gráfico muestra el porcentaje de células CD4+ en la sangre periférica a las 4 semanas después del trasplante en ratones Rag-1'/_ silvestres (NT), en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y que recibieron una inyección intravenosa de TAT-MYC (i.v.), y en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y que recibieron una inyección intramuscular de TAT-MYC (i.m.).

Las figuras 15 y 16 muestran el desarrollo acelerado de células B en ratones tratados con TAT-MYC después de un trasplante de médula ósea completa recién aislada. Se irradiaron cohortes de ratones Rag-1'/_ en un contexto de C57/BL6 de manera subletal y recibieron trasplantes de 1x106 células de médula ósea completa (figuras 15C, 15D y 15E). Dos tercios de los ratones trasplantados en la cohorte recibieron inyección intravenosa (figura 15D) o intramuscular (figura 15E) con 10 |ig de TAT-MYC 24 horas después del trasplante. También se proporcionan como control análisis por FACS de ratones Rag-1'/_ silvestres (sin tratar y sin irradiar) (figura 15A, 0,071 % de células IgMxCD19+) y ratones C57BL/6 (figura 15B, 23,5 % de células IgMxCD19+).

Las figuras 15D y 15E muestran la detección de células B IgMxCD19+ en la sangre periférica de ratones que recibieron TAT-m Yc intravenoso (figura 15D, 2,41 % de células IgMxCD19+) o TAT-MYC intramuscular (figura 15e , 6,53 % de células IgMxCD19+), en comparación con el control (figura 15C) al que no se le inyectó TAT-MYC (1,49 % de células IgMxCD19+). TAT-MYC inyectado por cualquier vía dio como resultado que los ratones tuvieran mayores niveles de células B IgMxCD19+ que ratones Rag-1'/_ a los que se les trasplantó médula ósea completa, pero no tratados con TAT-MYC.

La figura 16 representa gráficamente el porcentaje de células B para la cohorte completa de ratones descrita anteriormente y mostrada en la figura 15. El gráfico muestra el porcentaje de células CD19xB220+ en la sangre periférica a las 4 semanas después del trasplante en ratones Rag-1 '/_ silvestres (NT), en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y que recibieron una inyección intravenosa de TAT-MYC (i.v.), y en ratones Rag-1'/_ irradiados, trasplantados y que recibieron una inyección intramuscular de TAT-MYC (i.m.).

Ejemplo 6: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones a los que se les trasplantaron CMH derivadas de sangre del cordón humanas expandidas con TAT-MYC y TAT-Bcl-2

El siguiente ejemplo describe los resultados de expandir las CMH derivadas de sangre del cordón in vitro usando TAT-MYC y TAT-Bcl-2 para formar células madre hematopoyéticas a largo plazo transducidas con proteína (ptlt-CMH), antes del trasplante en ratones irradiados de manera subletal.

Materiales y métodos

Se obtuvieron células de sangre del cordón recién obtenidas a partir de muestras que se descartaron de un banco de sangre del cordón local. Se eliminó la identificación de todas las células humanas y estaban exentas de la supervisión del IRB. El volumen total del cordón se dividió en alícuotas de 20 ml y se diluyeron 1:1 en PBS. Se superpuso la sangre del cordón diluida (20 ml) suavemente sobre 20 ml de Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences n.° de cat. 17-1440-03). Se centrifugaron las células a 900x gravedad durante 60 min. Se retiró la capa leucocítica con una pipeta de vidrio y se lavó dos veces con PBS. Se resuspendieron las células en medio ^fC^b(Iscove's (Gibco) complementado con plasma humano al 10 %, 100 unidades por ml de pen./estrep., 30 ml de medio que contiene SCF, IL3 e IL6 y 30 ml de medio que contiene TPO, FLT3-L y GM-CSF descrito anteriormente en el ejemplo 1).

Se iniciaron dos cultivos de expansión en FCB. El primer cultivo contenía medio FCB solo mientras que el segundo contenía medio FCB complementado con Tat-MYC recombinante 5 |ig/ml y Tat-Bcl-2 recombinante 10 |ig/ml. El medio de ambos cultivos se reemplazó cada 3 días durante una expansión de 14 días. El fenotipo de superficie de las CMH humanas expandidas in vitro se evaluó mediante análisis por FACS usando anticuerpos contra los antígenos humanos CD45, CD34 y CD38.

Se inyectaron células de sangre del cordón fetales (FCB) expandidas en medio FCB o medio FCB complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl2 en ratones NOD/SCID/yc-/-(NSG) (Jackson Laboratory) que recibieron 180 Rads de radiación justo antes de la inyección. Las FCB expandidas se lavaron 3 veces en p Bs y se inyectaron a través de la vena de la cola en 200 |il de PBS. Ocho semanas después del trasplante, se recogieron las células de médula ósea de los huesos tibiales y femorales de los ratones NSG trasplantados. Se lisaron los glóbulos rojos mediante incubación en 5 ml de tampón TAC estéril (NH⁴Cl 135 mM, Tris 17 mM pH 7,65) seguido de 2 lavados con medio D10. Se analizaron las células de MO por citometría de flujo usando anticuerpos contra los antígenos humanos CD45, CD34, CD38, CD3, CD19, CD11b y CD33.

Se recogieron el bazo y el timo de ratones NSG sacrificados y se generó una suspensión monocelular mediante disociación mecánica. Se trataron las células con tampón TAC (NH⁴Cl 135 mM, 17 mM Tris pH 7,65) para lisar los glóbulos rojos.

Se sometieron a prueba funcionalmente las CMH humanas recogidas de la MO de ratones NSG sembrándolas en placa en MethoCult Optimum (StemCell Technologies), y se examinó su capacidad para dar lugar a colonias UFB-E, UFC-M, UFC-G y U^fC-GM. El día de la recogida de la MO, se añadieron 10.000 células de MO en 300 ul de D10 a 4 ml de MethoCult. Los 4 ml que contienen las células de MO se dividieron por igual entre 2 placas 30 mM, cada una de las cuales contenía 5000 células. Se incubaron las placas a 37° en el 5 % CO²durante 14 días. Se contaron las colonias y se identificaron basándose en la morfología celular usando un microscopio invertido.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 17, los ratones NSG xenoquiméricos generados mediante trasplante de CMH expandidas en medio FCB complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl2 (ptlt-CMH) mostraron un aumento del injerto de MO. Ocho semanas después del trasplante, los ratones NSG a los que se les inyectó 1x106 células CD34+/CD38lo expandidas en medio FCB solo tenían el 0,03 % de su compartimento de médula ósea derivado de las células trasplantadas (figura 17A, primer panel). Ratones NSG a los que se les inyectó 1x106 células CD34+/CD38lo expandidas en medio FCB complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl2 tenían el 18,2 % de su compartimento de médula ósea derivado de las células trasplantadas (figura 17A, segundo panel). Se usó como control un ratón NSG al que se le trasplantaron 5x106 células de sangre del cordón recién obtenidas para el injerto (figura 17A, tercer panel), y mostraron un injerto del 2,7 % con las células trasplantadas.

Se analizaron células CD45+ humanas de la MO, el bazo y el timo de ratones NSG xenoquiméricos generados mediante trasplante de CMH expandidas en medio FCB complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl2. El análisis por FACS muestra que el 6,8 % de la población CD45+ humana en la MO también se tiñó positiva para el marcador de células madre hematopoyéticas ^cD34 (figura 17B, primer panel). Se evaluaron células CD45+ humanas del bazo y el timo de estos ratones para determinar el marcador de células B CD19 y el marcador de células T CD3. La mayoría de las células CD45+ humanas del bazo se tiñeron positivas para el marcador de células B CD19 (figura 17B, segundo panel, 69,2 %), en comparación con el marcador de células T CD3 (figura 17B, segundo panel, 7,7 %). La mayoría de la población CD45+ en el timo se tiñó positivamente para el marcador de células T CD3 (figura 17B, tercer panel, 91,3 %), en comparación con el marcador de células B CD19 (figura 17B, tercer panel, 1,2 %).

Se marcaron con CFSE células CD45+ CD19+ humanas de los bazos de ratones NSG xenoquiméricos a los que se les trasplantaron ptlt-CMH y se activaron con anticuerpos monoclonales contra CD40 e IgM humanos. Se analizaron las células a las 72 horas por citometría de flujo para determinar la dilución de CFSE. La figura 17C muestra el perfil de proliferación de las células B humanas que se desarrollaron in vivo en ratones NSG xenoquiméricos. Estos resultados demuestran que las células B derivadas de las CMH trasplantadas que recibieron pretratamiento con Tat-MYC y Tat-Bcl2 pueden activarse a través de su receptor de células B.

Se usaron CMH CD45+, CD34+ CD38lo humanas de la médula ósea de ratones NSG xenoquiméricos a los que se les trasplantaron ptlt-CMH para sembrarse en MethoCult Optimum para evaluar la presencia de células madre mieloeritroides. Estas células de ratones NSG a los que se les trasplantaron ptlt-CMH dieron lugar a más colonias en placas MethoCult (figura 17D, FCB TMTB), en comparación con células de ratones NSG de control a los que se les trasplantaron células expandidas en medio solo (figura 17D, FCB). Aunque se observó la formación de colonias en condiciones selectivas para los linajes eritroides (UFB-E), mieloides (UFC-M), granulocitos (UFC-G) y granulocitos y macrófagos (UFC-GM), se observó más crecimiento mieloide y de granulocitos. Además, algunas de las colonias todavía pudieron observarse después de la nueva siembra en placas en serie (figura 17E). El número de colonias en ambos casos fue significativamente mayor para los ratones NSG reconstituidos con células de sangre del cordón humanas cultivadas durante 14 días con Tat-MYC y Tat-Bcl-2 que para las células obtenidas de ratones NSG reconstituidas con células de sangre de cordón humanas recién obtenidas no manipuladas.

Estos resultados muestran que las CMH CD45+, CD34+ CD38lo de la médula ósea de ratones injertados son células madre hematopoyéticas que pueden dar lugar a los 4 tipos de colonias en el medio MethoCult. Además, el aumento del número de colonias observado en placas sembradas con médula ósea de ratones NSG a los que se les injertaron cultivos de FCB con Tat-MYC y Tat-Bcl2 refleja un mayor número de células madre hematopoyéticas que residen en el nicho de la médula ósea.

Además, se evaluó una cohorte de ratones xenoquiméricos, a los que se les injertaron 106 células de sangre del cordón expandidas previamente in vitro en un cóctel de citocinas complementado con Tat-MYC y Tat-Bcl-2 (cuadrados negros) para determinar la diferenciación de células mieloides y linfoides. La población positiva para CD45 de células de médula ósea (figura 17F) y células de bazo (figura 17G) se analizaron para determinar la expresión de CD11b, CD33, CD3 y CD19. Se observó diferenciación de células tanto mieloides como linfoides en la médula ósea y el bazo de estos ratones xenoquiméricos.

Ejemplo 7: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones a los que se les trasplantó sangre de cordón completa humana recién aislada y a los que se les inyectó TAT-MYC

El siguiente ejemplo describe los resultados del tratamiento de ratones con una proteína de fusión TAT-MYC después del trasplante con células de sangre del cordón humanas recién obtenidas.

Materiales y métodos

Se obtuvieron células de sangre del cordón humanas y se prepararon tal como se describe en el ejemplo 6. En resumen, se separó la sangre de cordón usando Ficoll-Hypaque y centrifugación para obtener la fracción de capa leucocítica. Se retiraron células de la capa leucocítica, se lavaron dos veces, luego se resuspendieron en PBS y se mantuvieron frías hasta que se trasplantaron a ratones más tarde el mismo día.

Antes de inyectar a ratones NOD/SCID/yc^ (NOG) células FCB, se irradiaron los ratones con 180 Rads (irradiación de cuerpo entero). A cada ratón receptor se le administró un trasplante que consistía en 5x105, 1x106 o 5x106 células FCB humanas mediante inyección en la vena de la cola. 24 horas después del trasplante de células de médula ósea, los ratones recibieron una inyección intramuscular de 10 |ig de TAT-MYC o 10 |ig de TAT-CRE emulsionado en 300 |il de aceite de maíz.

Se monitorizó el injerto con citometría de flujo para evaluar la presencia de células positivas para CD45 humano en la sangre periférica, la médula ósea y el bazo de los ratones xenoquiméricos ocho semanas después del trasplante.

Resultados

Tal como se muestra en las figuras 18, 19 y 20, se observó un desarrollo acelerado de células humanas en la sangre periférica (figura 18), la médula ósea (figura 19) y el bazo (figura 20) de ratones xenoquiméricos NOD/SCID/yc^ tratados con TAT-MYC después de un xenotrasplante de células de sangre del cordón fetales humanas recién obtenidas. Se administró a cohortes de ratones NOD/SCID/yc^ una dosis subletal de radiación seguida de 5x105 células de sangre del cordón (figuras 18A y 18D; figuras 19A y 19D; figuras 20A y 20D), 1x106 (figuras 18B y 18E; figuras 19B y 19E; figuras 20B y 20E) o 5x106 (figuras 18C y 18F; figuras 19C y 19E; figuras 20C y 20E). 24 horas después del trasplante, a la mitad de los ratones de cada cohorte se les inyectó TAT-MYC (figuras 18D, 18E y 18F; figuras 19D, 19E y 19F; figuras 20D, 20E y 20F) y la otra a la mitad se les inyectó una proteína de control, TAT-CRE (figuras 18A, 18B y 18C; figuras 19A, 19B y 19C; figuras 20A, 20B y 20C)

La figura 18 muestra que ratones NOD/SCID/yc^ de control, irradiados de manera subletal, tratados con TAT-CRE después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en su sangre periférica a las ocho semanas, el 0 % de células CD45+ después del trasplante de 5x105 células (figura 18A), el 0,2 % de células CD45+ (figura 18B) después del trasplante de 1x106 células y el 0,7 % de células CD45+ (figura 18C) después del trasplante de 5x106 células. Ratones NOD/SCID/yc^ irradiados de manera subletal tratados con TAT-MYC después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en su sangre periférica a las ocho semanas, el 0,09 % de células CD45+ después del trasplante de 5x105 células (figura 18D), el 0,1 % de células CD45+ (figura 18E) después del trasplante de 1x106 células, y el 9,3 % de células CD45+ (figura 18F) después del trasplante de 5x106 células. Por consiguiente, la figura 18F muestra la detección de células T humanas (células positivas para hCD45) en la sangre periférica de ratones quiméricos 8 semanas después del trasplante. Como el tiempo promedio de recuperación de las células T es de 12-20 semanas, esto representa una aceleración de aproximadamente el 33-60 %.

La figura 19 muestra que ratones NOD/SCID/yc^ de control irradiados de manera subletal, tratados con TAT-CRE después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en su médula ósea a las ocho semanas, el 0,02 % de células CD45+ después del trasplante de 5x105 células (figura 19A), el 7,7 % de células CD45+ (figura 19B) después del trasplante de 1x106 células y el 11,3 % de células CD45+ (figura 19C) después del trasplante de 5x106 células. Ratones NOD/SCID/yc^ irradiados de manera subletal tratados con TAT-MYC después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en su médula ósea a las ocho semanas, el 0,04 % de células CD45+ después de un trasplante de 5x105 células (figura 19D), el 8,6 % de células CD45+ (figura 19E) después de un trasplante de 1x106 células y el 20,7 % de células CD45+ (figura 19F) después de un trasplante de 5x106 células.

La figura 20 muestra que ratones NOD/SCID/yc^ de control, irradiados de manera subletal, tratados con TAT-CRE después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en el bazo a las ocho semanas, el 0,9 % de células CD45+ después del trasplante de 5x105 células (figura 20A), el 13,9 % de células CD45+ (figura 20B) después del trasplante de 1x106 células y el 27,6 % de células CD45+ (figura 20C) después del trasplante de 5x106 células. Ratones NOD/SCID/yc^ irradiados de manera subletal tratados con TAT-MYC después de un xenotrasplante con células de sangre del cordón completas humanas, tenían en el bazo a las ocho semanas, el 1,2 % de células CD45+ después del trasplante de 5x105 células (figura 20D), el 4,9 % de células CD45+ (figura 20E) después del trasplante de 1x106 células y el 258 % de células CD45+ (figura 20F) después del trasplante de 5x106 células.

Ejemplo 8: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones a los que se les trasplantaron células de sangre del cordón humanas recién aisladas pretratadas con TAT-MYC y TAT-Bcl-2

El siguiente ejemplo describe los resultados de pretratar células de sangre del cordón humanas recién obtenidas con TAT-MYC y TAT-Bcl-2 antes del trasplante en ratones.

Materiales y métodos

Se obtuvieron y prepararon células de sangre del cordón humanas tal como se describe en el ejemplo 6. En resumen, se separó la sangre de cordón usando Ficoll-Hypaque y centrifugación para obtener la fracción de capa leucocítica. Se retiraron células de la capa leucocítica, se lavaron dos veces y luego se resuspendieron en PBS.

Antes de la inyección en ratones, las células de sangre del cordón aisladas se expusieron a TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl-25 |ig/ml durante una hora. Después de la exposición a las proteínas de fusión, se lavaron las células dos veces con PBS, luego se resuspendieron en PBS a 5x106 células por 200 ul, y se mantuvieron frías hasta que se inyectaron en ratones.

Antes de inyectar a ratones NOD/SCID/yc^ (NOG) las células FCB, se irradiaron los ratones con 180 Rads (irradiación de cuerpo entero). A cada ratón receptor se le administró un trasplante que consistía en 5x106 células FCB humanas en 200 ul de PBS mediante inyección en la vena de la cola.

Se monitorizó el injerto con citometría de flujo para evaluar la presencia de células positivas para CD45 en la sangre periférica de los ratones xenoquiméricos. Se realizó la primera extracción de sangre 8 semanas después del trasplante de FCB.

Después de ocho meses, se sacrificaron los ratones y se recogieron las células de médula ósea de los huesos tibiales y femorales de los ratones NSG xenoquiméricos. También se recogieron el bazo y el timo y se prepararon suspensiones monocelulares presionando las células a través de una malla de tela metálica estéril. Se lisaron los glóbulos rojos de la MO, el bazo y el timo en 5 ml de tampón TAC estéril (NH⁴Cl 135 mM, Tris 17 mM pH 7,65) seguido de 2 lavados en medio D10. Se prepararon la MO, las células del bazo y las células del timo para el análisis por FACS para evaluar la presencia de células positivas para CD45 humano.

Resultados

Las figuras 21 y 22 muestran que el pretratamiento de células de sangre del cordón completas recién obtenidas humanas con TAT-MYC durante una hora antes del trasplante en ratones NOD/SCID/yc^ (NOG) dio como resultado un desarrollo acelerado de células CD45 humanas en la sangre periférica de los ratones, así como una mayor persistencia a largo plazo de células CD45 humanas en la médula ósea, el bazo y el timo de los ratones. Se les administró a cohortes de ratones NOD/SCID/yc^ una dosis subletal de radiación seguida de 5x106 células de sangre del cordón. Para la mitad de los ratones de cada cohorte, se pretrataron las células con TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl-25 |ig/ml en medio FCB (figura 21B; figuras 22B, 22D y 22F); para la otra mitad de los ratones de la cohorte, se pretrataron las células en medio FCB solo (figura 21A; figuras 22A, 22C y 22E).

La figura 21 muestra que ratones NOD/SCID/yc^ de control, irradiados de manera subletal, con xenotrasplante de células de sangre del cordón completas humanas pretratadas con medio FCB solo, tenían en su sangre periférica a las ocho semanas, el 0,89 % de células CD45+ (figura 21A). Por el contrario, ratones NOD/SCID/yc^ irradiados de manera subletal, con xenotransplante de células de sangre del cordón completas humanas pretratadas con TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl-25 |ig/ml en medio FCB, tenían en su sangre periférica a las ocho semanas, el 15,7 % de células CD45+ (figura 21B).

La figura 22 muestra que ratones NOD/SCID/yc^ de control, irradiados de manera subletal, con xenotrasplante de células de sangre del cordón completas humanas pretratadas con medio FCB solo, tenían a los ocho meses en su médula ósea, el 0,04 % de células CD45+ (figura 22a ), en su bazo el 0,03 % de células CD45+ (figura 22C), y en su timo, el 0,5 % de células CD45+ (figura 22E). Por el contrario, ratones NOD/SCID/yc^ irradiados de manera subletal, con xenotrasplante de células de sangre del cordón completas humanas pretratadas con TAT-MYC 5 |ig/ml y TATBcl-25 |ig/ml en medio FCB, tenían a los ocho meses en su médula ósea, el 0,37 % de células CD45+ (figura 22B), en su bazo el 25,2 % de células CD45+ (figura 22D), y en su timo, el 5,4 % de células CD45+ (figura 22F).

En otros experimentos, se usan TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl-25 |ig/ml para pretratar poblaciones independientes de células de sangre del cordón humanas antes de trasplantarlas a diferentes cohortes de ratones NOG. Los inventores esperan que la incubación independiente de células con TAT-MYC y TAT-Bcl-2 todavía proporcione mejores resultados de injerto y reconstitución que el trasplante de las mismas células sin pretratamiento.

Ejemplo 9: Injerto acelerado con CMH de sangre periférica movilizadas con G-CSF humano cultivadas con Tat-Myc y Tat-Bcl-2

Se recibieron células movilizadas con G-CSF en un volumen de 1 ml de sangre sometida a elutración de 5 pacientes que se sometieron a movilización con G-CSF para un trasplante de CMH autólogas. Se eliminó la identificación de todas las muestras de G-CSF y no se asocia ninguna información de identificación adicional con las células usadas para estos estudios. Se añadieron las células gota a gota a 10 ml de medio FCB. Se lavaron las células dos veces en medio FCB y se trataron con TAT-MYC recombinante 5 |ig/ml y TAT-Bcl-2 recombinante 5 |ig/ml en un volumen de 10 ml. Se cultivaron las células durante 12 días.

Se expandieron las células en medio complementado con citocinas más Tat-Myc y Tat-Bcl2 durante 12 días. El día 12°, la mitad del día de las células recibieron un tratamiento adicional con TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl25 |ig/ml. La otra mitad de las células se dejó en medio FCB solo. Se incubaron las células durante 60 minutos en una incubadora a 37°. Se lavaron las células tres veces en PBS y se resuspendieron a 5x106 células por 200 ul. Se monitorizó el injerto con citometría de flujo para evaluar la presencia de células positivas para CD45 en la sangre periférica de los ratones xenoquiméricos. Se realizó la primera extracción de sangre 8 semanas después de trasplantar las CMH. La figura 23A muestra un análisis por FACS de la tinción CD45+ de la sangre periférica de ratones NSG de control (figura 23A), NSG a los que se trasplantó 8 semanas antes 1x106 CMH movilizadas con G-CSF expandidas (figura 23B) o 1x106 CMH movilizadas con G-CSF expandidas tratadas con Tat-Myc/Tat-Bcl-2 (figura 23C). Tal como se muestra para la sangre periférica, los inventores esperan que la MO, el bazo y el timo de ratones a los que se les injertaron células movilizadas con G-CSF pretratadas con TAT-MYC y TAT-Bcl-2 proporcionarán mejores resultados de injerto y reconstitución que el trasplante de las mismas células sin pretratamiento.

Ejemplo 10: Reconstitución hematopoyética acelerada en ratones tratados con TAT-MYC después del trasplante con células movilizadas con G-CSF humano pretratadas con TAT-MYC y TAT-Bcl-2

El siguiente ejemplo describe los resultados del pretratamiento de células movilizadas con G-CSF humano con TAT-MYC y TAT-Bcl-2 antes del trasplante en ratones, y luego seguido por el tratamiento de los ratones con TAT-MYC 24 horas más tarde.

Materiales y métodos

Se recibieron células movilizadas con G-CSF en un volumen de 1 ml de sangre sometida a elutriación de 5 pacientes que se sometieron a movilización con G-CSF para un trasplante de CMH autólogas. Se eliminó la identificación de todas las muestras de G-CSF y no se asoció ninguna información de identificación adicional con las células usadas para estos estudios. Se añadieron las células gota a gota a 10 ml de medio FCB. Se lavaron las células dos veces en medio FCB y se trataron con TAT-MYC recombinante 5 |ig/ml y TAT-Bcl-2 recombinante 5 |ig/ml en un volumen de 10 ml. Se cultivaron las células durante 12 días.

El día 12, las células movilizadas con G-CSF expandidas recibieron un segundo tratamiento de TAT-MYC 5 |ig/ml y TAT-Bcl25 |ig/ml durante una hora antes de inyectarlas en ratones NSG. Se lavaron las células 3 veces con PBS y luego se inyectaron a 5x106 célula por ratón en 200 |il de PBS a través de la vena de la cola. Antes de inyectar a ratones NOD/SCID/yc^ (NOG) las células CMH, se irradiaron los ratones con 180 Rads (irradiación de cuerpo entero). 24 horas después de la inyección con las CMH expandidas, los ratones recibieron 10 |ig de Tat-MYC o 10 |ig de Tat-Cre en aceite de maíz por vía intramuscular, o no recibieron inyección. Ocho semanas más tarde, se extrajo sangre de los ratones.

Se monitorizó el injerto con citometría de flujo para evaluar la presencia de células positivas para CD45 en la sangre periférica de los ratones xenoquiméricos. Se realizó la primera extracción de sangre 8 semanas después de trasplantar las CMH.

Después de ocho semanas, se sacrifican los ratones y se recogen las células de médula ósea de los huesos tibiales y femorales de los ratones NSG xenoquiméricos. También se recogen el bazo y el timo y se preparan suspensiones monocelulares presionando las células a través de una malla de tela metálica estéril. Se lisan los glóbulos rojos de la MO, el bazo y el timo en 5 ml de tampón TAC estéril (NH⁴Cl 135 mM, Tris 17 mM pH 7,65) seguido de 2 lavados en medio D10. Se preparan las células de MO, del bazo y las células del timo para el análisis por FAC para evaluar la presencia de células positivas para CD45 humano.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Una composición para su uso en el tratamiento de sujetos que necesitan un trasplante de células madre hematopoyéticas, que comprende:

una población de células madre hematopoyéticas tratadas con una proteína de fusión TAT-MYC, una proteína de fusión TAT-Bcl-2, o ambas, durante de 10 minutos a 24 horas, en la que la reconstitución del compartimento hematopoyético se potencia en el sujeto en comparación con la reconstitución del compartimento hematopoyético en un sujeto al que se le administra una población de células madre hematopoyéticas que no se trataron con la composición.
2. La composición para el uso según la reivindicación 1, en la que la población de células madre hematopoyéticas se trata con la proteína de fusión TAT-MYC, una proteína de fusión TAT-Bcl-2, o ambas, durante 1 hora.
3. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que el sujeto tiene o ha tenido una disminución de las células del compartimento hematopoyético.
4. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el sujeto padece una neoplasia maligna hematológica, síndrome de insuficiencia de la médula ósea o un trastorno autoinmunitario, o el sujeto está sometiéndose o se ha sometido a quimioterapia o radioterapia.
5. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el sujeto ha recibido un trasplante de órgano.
6. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el sujeto ha recibido un trasplante de células madre hematopoyéticas o un trasplante de médula ósea.
7. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las células madre hematopoyéticas proceden de la médula ósea, células de sangre periférica, células de sangre periférica que se han sometido a aféresis, células de sangre periférica que se han sometido a leucoféresis, sangre de cordón umbilical o líquido amniótico.
8. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición reduce el riesgo de fracaso del injerto de células madre hematopoyéticas cuando se administra al sujeto.
9. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición previene una disminución de la cantidad de células madre hematopoyéticas endógenas debido a la radioterapia cuando se administra al sujeto.
10. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composición previene una disminución de la cantidad de células madre hematopoyéticas endógenas debido a la quimioterapia cuando se administra al sujeto.