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ES2845698T3 - Producción de partículas de tipo rotavirus en plantas - Google Patents

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ES2845698T3
ES2845698T3 ES19186469T ES19186469T ES2845698T3 ES 2845698 T3 ES2845698 T3 ES 2845698T3 ES 19186469 T ES19186469 T ES 19186469T ES 19186469 T ES19186469 T ES 19186469T ES 2845698 T3 ES2845698 T3 ES 2845698T3
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plant
rotavirus
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ES19186469T
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Marc-Andre D'aoust
Nathalie Landry
Pierre-Olivier Lavoie
Masaaki Arai
Naomi Asahara
David Levi Rutendo Mutepfa
Inga Isabel Hitzeroth
Edward Peter Rybicki
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Medicago Inc
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Original Assignee
Medicago Inc
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
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Abstract

Un procedimiento para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta, parte de una planta o célula vegetal, que comprende: a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7, y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7 en la planta, parte de una planta o célula vegetal, en el que la primera, segunda o tercera secuencia de nucleótidos que codifica la VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal, y en el que la RLP comprende VP2, VP6 y VP7; o a) proporcionar una planta, parte de una planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal; en el que la primera proteína estructural de rotavirus es VP2, la segunda proteína estructural de rotavirus es VP6 y la tercera proteína estructural de rotavirus es VP7, en la que VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal; y b) incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer, segundo y tercer ácido nucleico, produciendo de este modo la RLP.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de partículas de tipo rotavirus en plantas
Campo de la invención
Esta invención se refiere a la producción de proteínas estructurales de rotavirus en plantas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la producción de partículas pseudovíricas que comprenden proteínas estructurales de rotavirus en plantas.
Antecedentes de la invención
La infección por rotavirus es un problema global que afecta principalmente a niños menores de cinco años. Produce gastroenteritis grave y, en el peor de los casos, la muerte.
Los rotavirus son miembros de la familia de virus Reoviridae (género Rotavirus) que afectan el sistema gastrointestinal y el tracto respiratorio. El nombre se deriva de la apariencia de tipo rueda de los viriones cuando se observan mediante microscopía electrónica de contraste negativo (Figura 1a, técnica anterior). El rotavirus es generalmente de forma globular y se nombra después de las envolturas externas e internas o la estructura de la cápside de doble envoltura del mismo. La cápside externa es de aproximadamente 70 nm, y la cápside interna tiene aproximadamente 55 nm de diámetro, respectivamente. La cápside de doble envoltura del rotavirus rodea el núcleo, incluida la envoltura proteica interna y el genoma. El genoma del rotavirus consiste en segmentos de ARN bicatenario que codifican al menos 11 proteínas de rotavirus.
El ARNds codifica seis proteínas estructurales (VP) y seis proteínas no estructurales (NSP) (Figura 1c, técnica anterior). Las proteínas estructurales comprenden VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 y VP7 (Figura 1b, técnica anterior). Tres capas concéntricas están formadas por el ensamblaje de VP2, VP6 y VP7 respectivamente, formando VP4 "picos" en la superficie de la estructura del virus. Las NSP se sintetizan en células infectadas y funcionan en diversas partes del ciclo de replicación o interactúan con algunas de las proteínas huésped para influir en la patogénesis o la respuesta inmune a la infección (Greenberg y Estes, 2009).
VP2 es una proteína de 102 kDa y es la proteína más abundante del núcleo viral. Forma la capa de proteína estructural más interna y proporciona un andamiaje para el ensamblaje correcto de los componentes y las enzimas de transcripción del núcleo viral (Lawton, 2000). VP1, la proteína viral más grande en 125 kDa, actúa como una polimerasa dependiente de ARN para rotavirus, creando un intermedio de replicación central, y se asocia con VP2 en sus vértices icosaédricos (Varani y Allain, 2002; Vende et al., 2002). La VP3, una proteína de 98 kDa, también está directamente asociada con el genoma viral, que actúa como una enzima que bloquea el ARNm y añade una estructura de protección de 5' a los ARNm virales. Juntas, VP1 y VP3 forman un complejo que está unido a los vértices exteriores de 5 veces de la capa de cápside VP2 (Angel, 2007). VP6 es una proteína de 42 kDa que forma la envoltura media del núcleo viral, es la principal proteína de la cápside y representa más del 50% de la masa de proteína total del virión (Gonzalez et al., 2004; Estes, 1996). Es necesario para la transcripción génica y puede desempeñar un papel en la encapsulación del ARN del rotavirus mediante el anclaje de VP1 a VP2 en el núcleo, como se ve en el virus de la lengua azul, otro miembro de la familia Reoviridae. También determina la clasificación de los rotavirus en cinco grupos (A a E) afectando el grupo A con mayor frecuencia a los humanos (Palombo, 1999). La VP6 en el grupo A de rotavirus tiene al menos cuatro subgrupos (SG), que dependen de la presencia o ausencia de epítopos específicos de SG: SG I, SG II, SG (I+II) y SG no (I+II). Los grupos B y C carecen de un antígeno común del grupo A, pero también se sabe que infectan a los humanos, mientras que el grupo D solo afecta a los animales, por ejemplo, pollos y vacas (Thongprachum, 2010).
Las dos proteínas de la cápside externa VP7, una glicoproteína de 37 kDa (G) y la VP4 (P) sensible a la proteasa de 87 kDa, definen los serotipos del virus. Estas dos proteínas inducen respuestas de anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, se usan para clasificar los serotipos de rotavirus en un sistema de nomenclatura dual, dependiendo de la combinación de antígeno GP (por ejemplo, G1 P[8] o G2 P[4]) (Sanchez-Padilla et al., 2009). La proteína VP4 se dimeriza para formar 60 picos en la envoltura externa del virus, que están directamente implicados en las fases iniciales de la entrada de la célula huésped. La proteína espicular contiene un sitio de escisión en la posición 248 de aminoácido (aa). Tras la infección, se escinde por la proteasa tripsina para producir VP5 (529 aa, 60 kDa) y VP8 (246 aa, 28 kDa) (Denisova et al., 1999). Este proceso mejora la infectividad del virus (unión de células e invasión de la célula huésped) y estabiliza la estructura espicular (Glass, 2006). La glucoproteína VP7 forma la tercera capa o capa externa del virus. En la actualidad, se conocen los genotipos 27 G y 35 P (Greenberg y Estes, 2009). VP4 y VP7 son los principales antígenos involucrados en la neutralización vírica y son dianas importantes para el desarrollo de vacunas (Dennehy, 2007).
En células de mamífero infectadas, los rotavirus experimentan un modo único de morfogénesis para formar las partículas virales VP2/6/4/7 de triple capa completas (Lopez et al., 2005). La cápside de triple capa es un complejo muy estable que permite la transmisión fecal-oral y la administración del virus al intestino delgado, donde infecta enterocitos diferenciados no divisorios cerca de las puntas de las vellosidades (Greenberg y Estes, 2009). En primer lugar, el virus intacto se adhiere a los receptores independientes de ácido siálico a través de 60 picos diméricos de VP4 sobre la superficie del virus (Lundgren y Svensson, 2001). Los 60 picos diméricos de VP4 en la superficie del virus permiten que el virus se adhiera a estos receptores celulares. La VP4 es susceptible a la escisión proteolítica por la tripsina, lo que da como resultado un cambio conformacional que expone sitios de unión adicionales en la superficie de la glucoproteína para la interacción con una serie de correceptores.
Sin embargo, el proceso de adhesión y entrada multietapa no se entiende claramente, pero el virus se administra a través de la membrana plasmática huésped. La envoltura de la cápside externa de VP7 que también está involucrada en el proceso de entrada, se elimina en el proceso y las partículas de doble capa (DLP) se administran al citoplasma celular en vesículas (Figura 2; técnica anterior). La DLP escapa de la vesícula y entra en inclusiones citoplasmáticas no unidas a la membrana. La transcripción temprana del genoma por VP1 comienza en las partículas de manera que el ARNds nunca se expone al citoplasma. La replicación del ARN y la formación del núcleo tienen lugar en estas inclusiones citoplasmáticas no unidas a la membrana. Los ARN (+) nacientes se transportan luego al citoplasma y sirven como plantillas para la síntesis de proteínas virales. VP4 se produce en el citosol y se transporta al retículo endoplasmático rugoso (RER), y VP7 se secreta en el RER. VP2 y VP6 se producen y se ensamblan en el citosol en virosomas y posteriormente brotan en los compartimentos del RER, recibiendo una envoltura de membrana transitoria en el proceso (Lopez et al., 2005; Tian et al., 1996). En el RER, las envolturas transitorias de las partículas virales se eliminan y se reemplazan por los monómeros de proteínas VP4 y VP7, con participación crítica de la glucoproteína rotavírica NSP4 (Tian et al., 1996; Lopez et al., 2005; Gonzalez et al., 2000). NSP4 funciona como un receptor intracelular en la membrana del RE y se une a las partículas subvirales recién creadas y probablemente también a la proteína espicular VP4 (Tian et al., 1996). NSP4 también es tóxica para los seres humanos y es el agente causante de la diarrea. Las partículas maduras completas se transfieren posteriormente desde el RER a través del aparato de Golgi a la membrana plasmática para su secreción (Lopez et al., 2005).
Se han adoptado una diversidad de enfoques diferentes para generar una vacuna de rotavirus adecuada para proteger poblaciones humanas de los diversos serotipos de rotavirus. Estos enfoques incluyen diversos enfoques de Jenner, el uso de virus vivos atenuados, el uso de partículas pseudovíricas, vacunas de ácidos nucleicos y subunidades virales como inmunógenos. En la actualidad hay dos vacunas orales disponibles en el mercado, sin embargo, tienen una baja eficacia en algunos países en desarrollo debido a la variación de las cepas y la presencia de otros patógenos.
Las Patentes de Estados Unidos N.° 4.624.850, 4.636.385, 4.704.275, 4.751.080, 4.927.628, 5.474.773, y 5.695.767 describen cada una una diversidad de vacunas contra rotavirus y/o procedimientos para preparar las mismas. Una característica común compartida por los miembros de este grupo es que cada una de estas vacunas se basa en el uso de partículas virales completas para crear las últimas vacunas contra el rotavirus. Dada la necesidad de larga data de una vacuna multivalente eficaz, está claro que este trabajo ha sido solo parcialmente exitoso al abordar la necesidad de tal vacuna.
Partiendo de los procedimientos tradicionales de generación de vacunas, los avances en el campo de la biología molecular han permitido la expresión de proteínas de rotavirus individuales. Crawford et al. (J Virol. septiembre de 1994; 68(9): 5945-5952) clonaron la codificación de VP2, VP4, VP6 y VP7 para la proteína de la cápside principal en el sistema de expresión de baculovirus y expresaron cada proteína en células de insecto. La coexpresión de diferentes combinaciones de las principales proteínas estructurales de rotavirus dio como resultado la formación de partículas pseurovíricas (VLP) estables. La coexpresión de VP2 y VP6 en solitario o con VP4 dio como resultado la producción de las VLP VP2/6 o VP2/4/6, que eran similares a las partículas de rotavirus de doble capa. La coexpresión de VP2, VP6 y VP7, con o sin VP4, produjo VLP de tres capas VP2/6/7 o VP2/4/6/7, que eran similares a las partículas de rotavirus infecciosas nativas. Las VLP mantuvieron las características estructurales y funcionales de las partículas nativas, según se determinó por examen microscópico electrónico de las partículas, la presencia de epítopos no neutralizantes y neutralizantes en VP4 y VP7, y la actividad de hemaglutinación de las VLP VP2/4/6/7.
Los candidatos a vacuna generados a partir de partículas pseudovíricas de diferentes composiciones de proteínas han demostrado ser potenciales como vacunas de subunidades. O'Neal et al. ("Rotavirus Virus-like Particles Administered Mucosally Induce Protective Immunity", J. Virology, 71(11):8707-8717 (1997)) demostraron que las VLP que contienen las VP 2 y 6 o VP 2, 6 y 7 cuando se administran a ratones con y sin la adición de toxina del cólera indujeron una inmunidad protectora en ratones inmunizados, aunque la protección fue más eficaz cuando las VLP se administraron con toxina del cólera (CT).
También se han usado partículas tipo núcleo (CLP) y VLP para inmunizar vacas Fernandez, et al., ("Passive Immunity to Bovine Rotavirus in Newborn Calves Fed Colostrum Supplements From Cows Immunized with Recombinant SA11 rotavirus core-like particle (CLP) or virus-like particle (VLP) vaccines", Vaccine, 16(5):507-516 (1998)). En este estudio, se estudió la capacidad de las CLP y VLP para crear inmunidad pasiva. Este grupo concluyó que las VLP eran más eficaces que las CLP para inducir la inmunidad pasiva.
Se usan cada vez más plantas para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. Por ejemplo, el documento US 2003/0175303 describe la expresión de la proteína estructural de rotavirus recombinante VP6, VP2, VP4 o VP7 en plantas de tomate transformadas estables.
Saldana et al. expresaron VP2 y VP6 en el citoplasma de plantas de tomate utilizando un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y A. tumefaciens recombinante (Saldana et al., 2006). Los estudios de microscopía electrónica mostraron que una pequeña proporción de las partículas se había ensamblado en 2/6 VLP. Se detectó una respuesta inmune protectora en ratones y esto puede haber sido contribuido hasta cierto punto por las VP no ensambladas. Se ha demostrado que las proteínas individuales provocan respuestas inmunes en ratones, como en el caso de VP8 y VP6 (Zhou et al., 2010).
Matsumura y col., (2002) fueron los primeros en informar sobre la expresión y el ensamblaje de VP6 de rotavirus A bovino en plantas de patata transgénicas. En su estudio, usaron plantas de patata transgénicas reguladas por un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y Agrobacterium tumefaciens recombinante que portaban el gen VP6. La proteína se expresó, se purificó y se realizaron estudios inmunogénicos. La respuesta inmune en ratones adultos mostró presencia de anticuerpos VP6 en los sueros. Sin embargo, no mostraron evidencia de proteínas VP6 ensambladas. Pueden haber sido monómeros simples o trímeros lo que podrían provocar una respuesta inmune en ratones. El trabajo de otro grupo mostró ensamblaje de VP6 en Nicotiana benthamiana utilizando un vector de virus de la patata X (PVX) (O'Brien et al., 2000). Cuando la proteína VP6 se expresó en plantas, se descubrió que solamente se ensamblaba cuando se fusionaba con las varillas de proteína PVX. Una vez que se produjo la escisión, la VP6 se ensambló en VLP icosaédricas como se vio en un estudio similar de HIV-PVX de Marusic et al., (2001). Este resultado sugiere probablemente que las proteínas del rotavirus pueden requerir un factor o mejora adicional para formar VLP.
La producción de VLP es una tarea desafiante, ya que se requieren tanto la síntesis como el ensamblaje de una o más proteínas recombinantes. Este es el caso de la VLP de rotavirus que es un virus de ARN con una cápside formada por 1860 monómeros de cuatro proteínas diferentes. Para la producción de VLP, es necesaria la expresión simultánea y el ensamblaje de dos a tres proteínas recombinantes. Estas comprenden 120 moléculas de VP2 (capa interna), 780 moléculas de VP6 (capa media) y 780 moléculas de la glucoproteína VP7 (capa externa), formando finalmente una partícula de doble o triple capa. Además, la producción de la mayoría de las VLP requiere la expresión simultánea y el ensamblaje de varias proteínas recombinantes, que, para el caso de la partícula de tipo rotavirus (RLP), debe producirse en una única célula huésped.
Un estudio más reciente mostró la expresión exitosa de VP6 de rotavirus humano optimizada por codones en Chenopodium amaranticolor usando un sistema de expresión mediado por el virus de la quemadura de ennegrecimiento de la remolacha (BBSV). La proteína se diseñó como un reemplazo del marco de lectura abierto de proteína de cubierta del BBSV. La inmunización oral de ratones hembra BALB/c con la proteína VP6 basada en plantas indujo altos títulos de IgA de mucosa anti-VP6 e IgG sérica (Zhou et al., 2010). El grupo, sin embargo, no mencionó si las proteínas VP6 se ensamblaron en VLP o partículas.
El rotavirus VP7 también se ha expresado con éxito en plantas de tabaco y se ha demostrado que mantiene su respuesta inmune neutralizante en ratones (Yu y Langridge, 2001). Otro estudio que utilizó plantas de patata transgénicas para expresar VP7 mostró que el gen VP7 fue estable durante 50 generaciones en las plantas transformadas. La proteína VP7 de la 50a generación indujo anticuerpos tanto protectores como neutralizantes en ratones adultos (Li et al., 2006).
Yang et al. (Yang Y M, Li X, Yang H, et al. 2011) coexpresaron tres proteínas de la cápside del rotavirus VP2, VP6 y VP7 del grupo A RV (P[8]G1) en las plantas de tabaco, se estudiaron los niveles de expresión de estas proteínas, así como la formación de partículas de tipo rotavirus y la inmunogenicidad. Las VLP se purificaron a partir de plantas de tabaco transgénicas y se analizaron mediante microscopía electrónica y transferencia Western. Los resultados de Yang et al. indican que la proteína VP2, VP6 y VP7 derivada de planta se autoensambló en 2/6 o 2/6/7 partículas de tipo rotavirus con un diámetro de 60-80 nm.
Sumario
La presente invención se refiere a la producción de proteínas estructurales de rotavirus en plantas. Más específicamente, la presente invención también se refiere a la producción de partículas pseudovíricas que comprenden proteínas estructurales de rotavirus en plantas.
De acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un procedimiento (A) para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta, que comprende:
a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus, y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal,
b) incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer, segundo y tercer ácido nucleico, produciendo de este modo la RLP,
c) cultivar la planta, parte de la planta o célula vegetal.
Además, un cuarto ácido nucleico que comprende una cuarta región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína estructural de rotavirus puede introducirse en la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa a), y se expresa al incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa b).
En el procedimiento (A) descrito anteriormente, la primera proteína estructural de rotavirus puede ser VP2, la segunda proteína estructural de rotavirus puede ser VP6 y la tercera proteína estructural de rotavirus puede ser VP4 o VP7. Además, la cuarta proteína estructural de rotavirus puede ser VP7 o VP4. El VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8. La escisión de VP4 puede realizarse usando una proteasa, por ejemplo, tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, o una subtilisina. La proteasa puede coexpresarse en la planta.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento (B) para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) que comprende:
a) introducir un ácido nucleico que comprende una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, en la planta, parte de una planta o célula vegetal,
b) incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer ácido nucleico, produciendo así la RLP.
El procedimiento (B) tal como descrito anteriormente puede comprender además introducir en (etapa a) un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus y que expresa el segundo ácido nucleico al incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa b).
El procedimiento (B) tal como descrito anteriormente puede comprender además introducir en (etapa a) un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa a), y expresar el tercer ácido nucleico al incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa b).
Además, en el procedimiento (A) o (B), se puede expresar un ácido nucleico adicional en la planta, parte de una planta o célula vegetal, y en el que el ácido nucleico adicional comprende una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un supresor de silenciamiento.
El uso de codones de la secuencia de nucleótidos se puede ajustar al uso de codones humanos preferidos, aumento del contenido de GC, o una combinación de los mismos.
La proteína estructural de rotavirus puede comprender un péptido señal truncado nativo o no nativo. El péptido señal no nativo puede ser un péptido señal de proteína disulfuro isomerasa (PDI).
La primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de nucleótidos, o una combinación de las mismas, se pueden unir operativamente a una región reguladora del virus del mosaico del caupí (CPMV).
El procedimiento (A) o (B) como se ha descrito anteriormente además puede comprender las etapas de:
c) cultivar la planta, parte de una planta o célula vegetal, y
d) purificar las RLP de la planta, parte de una planta o célula vegetal.
Durante la etapa de recolección o purificación en el procedimiento (A) o (B), la VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 usando tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, y subtilisina.
Las RLP pueden tener un tamaño de 70-100 nm y se pueden purificar en presencia de calcio.
La presente divulgación proporciona una RLP producida por el procedimiento (A) o (B) como se ha descrito anteriormente. La RLP producida puede comprender al menos una proteína estructural de rotavirus VP4. La VP4 puede escindirse en VP5 y VP8 usando una proteasa, por ejemplo, tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, y subtilisina. La proteasa puede coexpresarse dentro de la planta o añadirse durante la recolección, purificación, o ambas. Además, la RLP producida por el procedimiento (A) o (B) puede ser una RLP de doble capa y/o una RLP de triple capa.
Además, se proporcionan secuencias de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos que codifica VP2 puede comprender del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO: 45. La secuencia de nucleótidos que codifica VP6 puede comprender del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la s Eq ID NO:17, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:46. La secuencia de nucleótidos que codifica VP7 puede comprender del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 o 57. Y la secuencia de nucleótidos que codifica VP4 puede comprender del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50, o 51. Además, VP2 puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO: 25. VP6 puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO: 31. VP7 puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 4, 39, 43 o 59. VP4 puede codificarse por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 2 o s Eq ID NO: 36. 33. La una o más proteínas estructuras de pueden ser VP2, VP4, VP6 y/o VP7. La VP4 puede procesarse para producir VP5 y VP8. La una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden seleccionarse de la cepa de rotavirus G9 P[6], la cepa WA de rotavirus A, la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra rotavirus A, y la cepa SA11 de rotavirus. En el procedimiento (A) como descrito anteriormente, la primera, segunda o tercera secuencia de ácidos nucleicos, o una combinación de las mismas, puede comprender una región reguladora activa en la planta unida operativamente a uno o más de un potenciador de comovirus, a uno o más de un elemento de amplificación, y a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de rotavirus, y en la que se puede introducir un cuarto ácido nucleico que codifica una replicasa en la planta, parte de una planta o célula vegetal.
En el procedimiento (B) como se describió anteriormente, la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ácido nucleico o una combinación de las mismas puede comprender una región reguladora activa en la planta unida operativamente a uno o más de un potenciador de comovirus, a uno o más de un elemento de amplificación y a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína estructural de rotavirus, y en el que un quinto ácido nucleico que codifica una replicasa puede introducirse en la planta, parte de una planta o célula vegetal.
Además, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un procedimiento (C) para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta que comprende:
a) introducir un ácido nucleico que comprende una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, en la planta o parte de la planta,
b) incubar la planta, parte de la planta en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer ácido nucleico, produciendo así la RLP.
Además, se puede introducir un segundo ácido nucleico en la planta o parte de la planta, el segundo ácido nucleico comprende una segunda región reguladora que está activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus y en el que el segundo ácido nucleico se expresa al incubar la planta o parte de la planta en la etapa b).
Además, se puede introducir una tercera secuencia de nucleótidos en la planta o parte de la planta, el tercer ácido nucleico comprende una tercera región reguladora que está activa en la planta y unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus y en el que el tercer ácido nucleico se expresa al incubar la planta o parte de la planta en la etapa b).
El procedimiento (C) como se describió anteriormente puede comprender además una etapa de recolectar la planta y extraer las RLP.
La una o más proteínas estructurales de rotavirus del procedimiento (C) puede ser la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP6. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificada por la primera o segunda secuencia de nucleótidos puede ser VP2 o VP6. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificada por la tercera secuencia de nucleótidos puede ser VP4. La VP4 se puede escindir para producir VP5 y VP8.
La primera, segunda o tercera secuencia de nucleótidos puede codificar, comprender o codificar y comprender además una o más de una secuencia de direccionamiento de compartimento y/o un elemento de amplificación. La una o más secuencias de direccionamiento de compartimento dirige la una o más proteínas estructurales de rotavirus al retículo endoplasmático (RE), cloroplasto, plastidio o apoplasto de la célula vegetal.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento (D) para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) que comprende:
a) proporcionar una planta o parte de una planta que comprende un ácido nucleico que comprende una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus;
b) incubar la planta, parte de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del ácido nucleico, produciendo así la RLP.
Además, la planta o parte de la planta del procedimiento (D) puede comprender además:
i) un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, o
ii) un segundo y tercer ácido nucleico, en el que el segundo ácido nucleico comprende una segunda región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus y el tercer ácido nucleico comprende una tercera región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus,
en el que el segundo o el segundo y tercer ácido nucleico se expresan al incubar la planta o parte de la planta en la etapa b).
La una o más proteínas estructurales en el procedimiento (D) puede ser la proteína de rotavirus VP2, VP4 o VP6. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificada por la primera o segunda secuencia de nucleótidos puede ser VP2 o VP6. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificada por la tercera secuencia de nucleótidos puede ser VP4. La VP4 se puede escindir en VP5 y VP8 usando una proteasa, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. La proteasa se puede coexpresar dentro de la planta o añadirse durante la recolección, purificación o ambas.
La presente divulgación proporciona una RLP producida por el procedimiento (A), procedimiento (B), procedimiento (C), procedimiento (D) o una combinación de los mismos, tal como se describió anteriormente. La RLP puede comprender una o más proteínas estructurales de rotavirus que pueden comprender N-glicanos específicos de plantas o N-glicanos modificados.
La presente divulgación incluye una composición que comprende una dosis eficaz de la RLP preparada por el procedimiento (A), procedimiento (B), procedimiento (C), procedimiento (D) o una combinación de los mismos, como se han descrito anteriormente, para inducir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación también incluye un procedimiento para inducir inmunidad a una infección por rotavirus en un sujeto, que comprende administrar la RLP tal como se acaba de describir, al sujeto. La RLP se puede administrar a un sujeto por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.
La presente descripción también proporciona una materia vegetal que comprende una RLP producida por el procedimiento (A), procedimiento (B), procedimiento (C), procedimiento (D) o una combinación de los mismos, como se han descrito anteriormente. La materia vegetal puede usarse para inducir inmunidad a una infección por virus rotavirus en un sujeto. La materia vegetal también se puede mezclar como un complemento alimenticio. En los procedimientos como se han descrito anteriormente (procedimientos A, B, C o D), a la planta o parte de la planta se le puede administrarse además, o puede comprender adicionalmente, otra secuencia de ácido nucleico que codifica un supresor de silenciamiento.
Además, la presente divulgación también proporciona un procedimiento (E) para producir proteína estructural de rotavirus en plantas, que comprende:
a) introducir un ácido nucleico que comprende una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, en la planta o parte de la planta;
b) incubar la planta o parte de la planta en condiciones que permitan la expresión transitoria del ácido nucleico, produciendo así una o más proteínas estructurales de rotavirus.
La invención está dirigida a un procedimiento para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta, parte de una planta o célula vegetal, que comprende: a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus seleccionada entre VP2, VP6 y VP7, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus seleccionada de uno de VP2, VP6 y VP7 y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus seleccionada entre VP2, VP6 y VP7 en la planta, parte de una planta o célula vegetal, en el que la primera, segunda o tercera secuencia de nucleótidos que codifica la VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal, y en el que la r Lp comprende VP2, VP6 y VP7; o a) proporcionar una planta, parte de una planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal; en el que la primera proteína estructural de rotavirus es VP2, la segunda proteína estructural de rotavirus es VP6 y la tercera proteína estructural de rotavirus es VP7, en el que VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal; y b) incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer, segundo y tercer ácidos nucleicos, produciendo así la RLP. Este sumario de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la estructura del rotavirus y la asignación de genes y proteínas. (A) Microscopía electrónica de transmisión de partículas de rotavirus (la barra representa 100 nm). (B) Organización de las proteínas de la cápside del virus que comprende el interior, la parte intermedia y el exterior. (C) Segmentos de ARNds de rotavirus dispuestos según tamaño y función. El ARNds se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida (D). Las proteínas en (C) están indicadas por segmentos de ARNds en (D). Imágenes de Crawford et al., 1997 (A), Swiss Institute of Bioinformatics, 2008 (B) y Greenberg y Estes, 2009 (D).
La Figura 2 muestra la entrada y replicación de células de rotavirus Cuando el rotavirus entra en una célula, VP4 y VP7 se pierden, formando una partícula de doble capa (DLP La transcripción del ARNds comienza dando como resultado la traducción de VP2, VP4, VP6 y VP7. Los núcleos de progenie con actividad de replicasa se producen en fábricas de virus (también llamadas viroplasmas). La transcripción tardía se produce en estos núcleos de progenie. En la periferia de las fábricas de virus, estos núcleos están recubiertos con VP6, formando DLP inmaduras que se extienden a través de la membrana del retículo endoplasmático, adquiriendo una membrana lipídica transitoria que se modifica con las glucoproteínas vivas residentes del RE NSP4 y VP7; estas partículas envueltas también contienen VP4. A medida que las partículas se mueven hacia el interior de las cisternas del RE, la membrana lipídica transitoria y la proteína no estructural NSP4 se pierden, mientras que las proteínas VP4 y VP7 de la superficie del virus se reorganizan para formar la capa proteica del virus externa, produciendo partículas infecciosas maduras de triple capa (véase Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html).
La Figura 3 muestra los vectores de Agrobacterium pTRAc, pTRAkc-rbcs1-cTP y pTRAkc-ERH. P35SS, promotor CaMV 35S con potenciador transcripcional duplicado; CHS, región no traducida de chalcona sintasa 5'; pA35S, señal de poliadenilación CaMV 35S; SAR, región de unión del andamiaje del gen Rb7 del tabaco; LB y RB, los bordes izquierdo y derecho para la integración del ADN-T; ColE1ori, origen de replicación para E. coli; RK2ori, origen de replicación para Agrobacterium; bla, gen bla de resistencia a ampicilina/carbenicilina; LPH, secuencia del péptido señal de la cadena pesada de mAb24 murino; his6, 6 x secuencia His tag; SEKDEL, secuencia señal de retención del RE; rbcs1-cTP, secuencia peptídica del tránsito de cloroplastos de un gen de unidad pequeña Rubisco (rbcSl) de Solanum tuberosum; npt II, gen npt II de resistencia a la kanamicina; Pnos y pAnos, promotor y señal de poliadenilación del gen nopalina sintasa (Maclean et al., 2007).
La Figura 4 muestra una descripción general de la clonación de rotavirus y el procedimiento de infiltración
La Figura 5 muestra un procedimiento de extracción de proteína de apoplasto. (A) Ilustración de la célula vegetal y la ubicación del apoplasto. Las proteínas VP se expresan en el citosol y se dirigen al apoplasto (flecha roja). (B) - Después de la prueba de contrarreloj, la hoja de la planta se infiltra al vacío con PBS (1) y se coloca en una columna de centrifugación perforada (2), después se centrifuga en un tubo Eppendorf de 2 ml para recoger la savia (3).
La Figura 6 muestra una transferencia western de expresión de la proteína VP6 de rotavirus en compartimentos de células foliares de plantas durante 7 días. Se usó anticuerpo VP6 anti-rotavirus de ratón (1:5000) para sondar las membranas. (+) y (-) indican expresión con o sin supresor de silenciamiento respectivamente. Las líneas rojas indican la posición de las proteínas VP6 en las diversas muestras analizadas (~40 kDa). La eficacia de la expresión y extracción de VP6 fue mejor en el citoplasma.
La Figura 7 muestra una transferencia Western que muestra la expresión individual de las proteínas del rotavirus marcadas en his el día 3 en el citoplasma de las hojas de la planta N. benthamiana. ve - VP2 del rotavirus expresado en bacterias; M - marcador de peso molecular; VP - proteína de la cápside del rotavirus. La infiltración de VP7 dio como resultado el amarillamiento de las hojas (b).
La Figura 8 muestra la expresión de VP2 (a) y VP4 (b) de rotavirus dirigida a diversos compartimentos de células foliares de la planta de N. benthamiana el día 3. Se usaron los respectivos sueros anti-rotavirus de pollo (1:2000) para VP2 y VP4 para sondear las proteínas. cTp - cloroplastos; RE - retículo endoplasmático; pTRAc - citoplasma; A - apoplasto; Control negativo (-ve) - plantas infiltradas solo con supresor de silenciamiento; Control positivo (+ ve) en (a) - VP2 expresada en bacterias, (b) - VP4 expresada en bacterias; (- y ) con o sin supresor de silenciamiento; M - marcador de peso molecular. Las flechas indican la posición de las bandas de proteína en cuestión.
La Figura 9 muestra el análisis de transferencia Western de extractos del día 3 de VP2/6/4 coexpresada en el citoplasma de hojas de N. benthamiana. Las proteínas se probaron con una mezcla de suero antirotavirus de pollo (anti-VP2 (1/5000) y anti-VP4 (1/5000)) y anticuerpo anti-VP6 de ratón (1:5000). La infiltración de Agrobacterium recombinante se realizó con un supresor del silenciamiento. Control negativo (­ ve) - plantas enteras infiltradas solo con supresor de silenciamiento; M - marcador de peso molecular.
La Figura 10 muestra micrografías electrónicas de proteínas de rotavirus extraídas del citoplasma del día 3 teñidas con acetato de uranilo, (a) Extracto de muestra de proteína negativa con supresor de silenciamiento; (b) extracto de proteína VP6; (c) extracto de proteína VP2/6 y (d) extracto de proteína VP2/6/4. Barras = 200 nm. Todas las RLP detectadas tenían entre 70 y 100 nm de diámetro. La flecha en (b) indica la vaina/estera de VP6. La flecha en (c) indica un ejemplo de una RLP. Todas las proteínas se expresaron en presencia de un supresor de silenciamiento. Todas se capturaron con anticuerpo anti-VP6 de ratón (1 :2000).
La Figura 11 muestra la purificación en gradiente de sacarosa de VP2/6 y VP2/6/4 (a) coexpresadas. Dots blots de gradiente de sacarosa de VP2/6 (b) y VP2/6/4 (c) purificadas. Los extractos de proteínas se cargaron en un gradiente de sacarosa (10 - 60%) y se ultracentrifugaron. Las fracciones se analizaron probando con (b) anticuerpo anti-VP6 de ratón (1:5000) y (c) suero anti-VP2 y VP4 de pollo (1:5000).
La Figura 12 muestra el análisis de transferencia western de las fracciones VP2/6 (a), fotografía de gel teñido con Coomassie de SDS-PAGE de las fracciones 16 y 17 (b) de VP2/6, y análisis de transferencia Western de las fracciones 16 y 17 (c). Se utilizó suero anti-VP6 de ratón (1:5000) y suero anti-VP2 de pollo (1:5000) en la transferencia Western (a) y solo anti-VP6 de ratón (1:5000) en (c). Control negativo (- ve) en (a) y (c) - VP4 expresada en bacterias, y en (b) - plantas infiltradas con supresor de silenciamiento y gradiente de sacarosa purificado; en bruto - extracto de VP2/6 no purificado; Control positivo (+ ve) en (a) -VP2 expresada en bacterias, (b) y (c) - VP6 expresada en plantas; VP6-SF9 - proteína VP6 de concentración conocida expresada en células de insecto SF9. Las flechas indican bandas de proteínas de interés.
La Figura 13 muestra el ensayo de proteína soluble total en fracciones de VP2/6 purificada de gradiente de densidad de sacarosa. (a) - Curva estándar de IgG, (b) - lecturas de absorbancia de fracciones tomadas a 750 nm. Puntos de interés: fracciones 16 a 19.
La Figura 14 muestra el análisis del gradiente de densidad de sacarosa de las fracciones de VP2/6/4 coexpresadas en el citoplasma. Se tomaron lecturas de absorbancia en bruto a 750 nm para verificar los picos de proteína detectados previamente en el dot blot de VP2/6/4.
La Figura 15 muestra micrografías electrónicas de transmisión de partículas de VP2/6 purificadas en gradiente de densidad de sacarosa. Tanto (a) como (b) muestran dos secciones diferentes vistas sobre la rejilla de cobre. Todas las RLP detectadas tenían entre 70 y 100 nm de diámetro. Las muestras se capturaron con anticuerpo anti-VP6 de ratón (1:2000). Las barras representan 200 nm.
La Figura 16a muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:1) y las secuencias de nucleótidos de VP2 de Rotavirus (SEQ ID NO:13 y 14). La Figura 16b muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) y las secuencias de nucleótidos de VP4 de Rotavirus (SEQ ID No: 15 y 16). La Figura 16c muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) y las secuencias de nucleótidos de VP6 de Rotavirus (SEQ ID NO: 17 y 18). La Figura 16d muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4) y las secuencias de nucleótidos de VP7 de Rotavirus (SEQ ID NO: 19 y 20).
La Figura 17A muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-WA_VP2(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 21).
La Figura 17B muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-WA_VP2(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 22). La Figura 17C muestra una representación esquemática de la construcción 1191. Los sitios de la enzima de restricción SacII y StuI usados para la linealización del plásmido están anotados en la representación.
La Figura 18 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 23) de la construcción 1191 de los bordes izquierdo a derecho de ADNt (subrayados). 2X35S/CPMV-HT/NOS con casete de expresión del inhibidor de silenciamiento de plastocianina-P19-plastocianina.
La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica VP2(opt) de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO:45).
La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 25).
La Figura 21 muestra una representación esquemática de la construcción número 1710.
La Figura 22A muestra una representación esquemática de la construcción 193. Los sitios de la enzima de restricción SacII y StuI usados para la linealización del plásmido están anotados en la representación. La Figura 22B muestra la secuencia de nucleótidos de la construcción 193 (SEQ ID NO: 26). Se muestra la construcción 193 de los bordes izquierdo a derecho de ADNt (subrayados). 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación de BeYDV(m)+Replicasa con casete de expresión del inhibidor de silenciamiento de plastocianina-P19-plastocianina.
La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión 1710 (SEQ ID NO: 27). Se muestra el casete de expresión número 1710 del promotor 2X35S al terminador NOS. Está subrayada la VP2(opt) de la cepa WA de Rotavirus A.
La Figura 24 muestra una representación esquemática de la construcción número 1711.
La Figura 25A muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-WA_VP6(opt).s1+3c (SEQ ID NO:28). La Figura 25B muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-WA_VP6(opt).s1-4r (SeQ ID NO: 29). La Figura 25C muestra el casete de expresión número 1713 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO: 30). Está subrayada la VP6(opt) de la cepa WA de Rotavirus A. La Figura 25d muestra la secuencia de nucleótidos que codifica VP6(opt) de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 46)
La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A (SEQ ID NO: 31).
La Figura 27 muestra la representación esquemática de la construcción número 1713.
La Figura 28 muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1714 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO:32). Está subrayada la VP6(opt) de la cepa WA de Rotavirus A.
La Figura 29 muestra una representación esquemática de la construcción número 1714.
La Figura 30A muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 33).
La Figura 30B muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 34).
La Figura 31A muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1731 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO: 35). Está subrayada la VP4(opt) de la cepa Rotarix de Rotavirus A. La Figura 31B muestra la secuencia de codificación optimizada de VP4 de Rotavirus A de la cepa RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 47). La Figura 31C muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1730 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO: 44). Está subrayada la VP4(opt) de la cepa Rotarix de Rotavirus A.
La Figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos de VP4 de la cepa Rotarix de Rotavirus A (SEQ ID NO: 36).
La Figura 33A muestra una representación esquemática de la construcción número 1730. La Figura 33B muestra una representación esquemática de la construcción número 1731.
La Figura 34A muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP7(opt).s1+3c (SEQ ID NO: 37). La Figura 34B muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 38). La Figura 34C muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1733 del promotor 2X35S al terminador NOS. Está subrayada la VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 24). La Figura 34D muestra la secuencia de nucleótidos que codifica VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 48). La Figura 34E muestra la secuencia codificante optimizada de VP7 de Rotavirus A de la cepa RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO 54).
La Figura 35 muestra la secuencia de aminoácidos de VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1 P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 39).
La Figura 36 muestra una representación esquemática de la construcción número 1733.
La Figura 37 muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c (SEQ ID NO: 40).
La Figura 38 muestra una representación esquemática de la construcción 1192. Los sitios de la enzima de restricción SacII y StuI usados para la linealización del plásmido están anotados en la representación.
La Figura 39 muestra la secuencia de nucleótidos de la construcción 1192 de los bordes izquierda a derecha de ADNt (subrayados) (SEQ ID NO: 41). Se muestran 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS con casete de expresión del inhibidor de silenciamiento de plastocianina-P19-plastocianina.
La Figura 40A muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1735 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO: 42). Está subrayada la PDISP/VP7(opt) de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A. Figura 40B Secuencia de nucleótidos que codifica PDISP/VP7(opt) de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 49).
La Figura 41 muestra la secuencia de aminoácidos de PDISP/VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1 P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 43).
La Figura 42 muestra una representación esquemática de la construcción número 1735.
La Figura 43A muestra la secuencia codificante de VP4 de Rotavirus A de la cepa RVA/Simiantc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 50). La Figura 43B muestra la secuencia codificante optimizada de VP4 de Rotavirus A de la cepa RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3PSB[2] (SEQ ID NO : 51). La Figura 43C muestra la secuencia codificante de VP7 de de la cepa RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO : 52). La Figura 43D muestra la secuencia codificante optimizada de VP7 de Rotavirus A de la cepa RVA/Simian-tc/ZAF/SA11-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO :53).
La Figura 44A muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (SEQ ID NP: 55) . La Figura 44B muestra la secuencia de nucleótidos del cebador IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (SEQ ID NO: 56) . La Figura 44C muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia codificante optimizada de VP7 de Rotavirus A de la cepa RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 57). La Figura 44D muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 1734 del promotor 2X35S al terminador NOS (SEQ ID NO 58). Está subrayada la VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A. La Figura 44E muestra la secuencia de aminoácidos de TrSp-VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A (SEQ ID NO: 59). La Figura 44F muestra la representación esquemática de la construcción número 1734.
La Figura 45 muestra la purificación de las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2 y VP6 por centrifugación de gradiente de densidad de iodixanol. Figura 45A Análisis SDS-PAGE con tinción de Coomassie de la carga antes de la centrifugación y fracciones 1 a 10 (estando la fracción 1 en el fondo del tubo). Las posiciones de los antígenos de rotavirus se muestran mediante flechas. Figura 45B Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-rotavirus policlonal de conejo. Figura 45C Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-VP2 policlonal de conejo.
La Figura 46 muestra la purificación de las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP6 y VP7 por centrifugación de gradiente de densidad de iodixanol. Figura 46A Análisis SDS-PAGE con tinción de Coomassie de la carga antes de la centrifugación y fracciones 1 a 10 (estando la fracción 1 en el fondo del tubo). Las posiciones de los antígenos de rotavirus se muestran mediante flechas. Figura 46B Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-rotavirus policlonal de conejo. Figura 46C Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-VP7 policlonal de conejo.
La Figura 47 muestra la purificación de las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP4, VP6 y VP7 por centrifugación de gradiente de densidad de iodixanol. Figura 47A Análisis SDS-PAGE con tinción de Coomassie de la carga antes de la centrifugación y fracciones 1 a 10 (estando la fracción 1 en el fondo del tubo). Las posiciones de los antígenos de rotavirus se muestran mediante flechas. Figura 47B Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-rotavirus policlonal de conejo. Figura 47C Análisis de transferencia Western de las mismas fracciones que en (A) usando un anticuerpo anti-VP7 policlonal de conejo.
La Figura 48 muestra la evaluación del contenido de VP4 en partículas de tipo rotavirus purificadas que comprenden VP2, VP4, VP6 y VP7 por ELISA específico para anti-VP4.
La Figura 49 muestra una imagen por microscopía crioelectrónica de partículas de tipo rotavirus purificadas que comprenden VP2 y VP6 (panel izquierdo) y VP2, VP4, VP6 y VP7 (panel derecho).
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a partículas pseudovíricas (VLP) que comprenden una o más proteínas estructurales de rotavirus (es decir, una partícula de tipo rotavirus, VLP o RLP de rotavirus) y procedimientos para producir partículas de tipo rotavirus (RLP) en plantas. La partícula de tipo rotavirus (RLP) puede comprender, por lo tanto, una o más proteínas estructurales de rotavirus. La RLP puede ser de doble capa o de triple capa.
La presente divulgación proporciona un procedimiento para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta. El procedimiento comprende introducir uno o más ácidos nucleicos que comprenden una región reguladora activa en la planta unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus en la planta o parte de la planta. Seguido de la incubación de la planta o parte de la planta en condiciones que permitan la expresión transitoria de los ácidos nucleicos, produciendo así la RLP.
Además, la presente divulgación en parte proporciona un procedimiento para producir un candidato a vacuna de partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta. El procedimiento puede comprender introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal. Seguido de incubar la planta, parte de la planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer, segundo y tercer ácido nucleico, produciendo de este modo la RLP. la RLP puede ser de capa simple, doble o triple.
La "proteína estructural de rotavirus" puede referirse a la totalidad o a una parte de una secuencia de proteína estructural de rotavirus aislada de rotavirus, presente en cualquier cepa o aislado de rotavirus de origen natural o variante. Por lo tanto, la expresión proteína estructural de rotavirus, y similares, incluye variantes de secuencias de proteínas estructurales de rotavirus de origen natural producidas por mutación durante el ciclo de vida del virus o producidas en respuesta a presión selectiva (por ejemplo, terapia farmacológica, expansión del tropismo o infectividad de la célula huésped, etc.) Como apreciará un experto en la técnica, dichas secuencias de proteínas estructurales de rotavirus y variantes de las mismas, también pueden producirse usando técnicas recombinantes.
Además, las proteínas estructurales pueden incluir proteínas de cápside tales como, por ejemplo, VP2 y VP6 y/o proteínas de superficie tal como, por ejemplo, VP4. La proteína estructural puede incluir además, por ejemplo, VP7.
Los ejemplos no limitantes de proteína estructural de rotavirus son la proteína de rotavirus VP2, VP4, VP6 y VP7, y un fragmento de VP2, VP4, VP6 y VP7. Los ejemplos no limitantes de VP2, VP4, VP6 y VP7, o fragmentos de proteína VP2, VP4, VP6 y VP7 que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen las proteínas VP2, VP4 VP6 y VP7 de la cepa de rotavirus G9 P[6], cepa Wa de rotavirus A, cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] para la vacuna contra rotavirus A y cepa SA11 de rotavirus.
Un ejemplo de una proteína estructural VP2, que no se considerará limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:25. Además, la proteína estructural VP2 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:25, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% se similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP2 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO:13, 14, 25, o 45 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente el 80-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP4, que no se considerará limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 36. Además, la proteína estructural VP4 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP4 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 o 51 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP6, que no se considerará limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 31. Además, la proteína estructural VP6 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP6 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO:17, 18, o 46 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma.
Un ejemplo de una proteína estructural VP7, que no se considerará limitante, se expone en la secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID NO: 47. Además, la proteína estructural VP7 puede comprender la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 43, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 90-100% de similitud con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma. Además, una proteína estructural VP7 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO:19, 20, 48, 49, 52, 53 o 54 o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80-100% de similitud de secuencia con la misma, incluyendo cualquier porcentaje de similitud dentro de estos intervalos, tal como un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de similitud de secuencia con la misma.
La similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos se puede calcular utilizando los programas BLASTP y TBLASTN que emplean el algoritmo 2.0 BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básico). Las técnicas para calcular la similitud o identidad de la secuencia de aminoácidos se conocen bien por los expertos en la técnica, y el uso del algoritmo BLAST se describe en ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403-410) y ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
La expresión "partícula de tipo virus" (VLP), o "partículas pseudovíricas" o "VLP" se refiere a estructuras que se autoensamblan y comprenden una o más proteínas estructurales tales como, por ejemplo, una proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitación, la proteína estructural VP2, VP4, VP6 y/o VP7. Las VLP que comprenden una proteína estructural de rotavirus también pueden denominarse "v Lp de rotavirus", "partícula de tipo rotavirus (RVLP)", "partícula de tipo rotavirus (RLP)", "partícula de tipo rotavirus", "RVLP" o "RLP". Las VLP o RLP generalmente son morfológica y antigénicamente similares a los viriones producidos en una infección, pero carecen de información genética suficiente para replicarse y, por lo tanto, no son infecciosas. Las VLP pueden producirse en células huésped adecuadas, incluyendo células huésped vegetales. Después de la extracción de la célula huésped y tras el aislamiento y la purificación adicional en las condiciones adecuadas, las VLP se pueden purificar como estructuras intactas. La r Lp puede ser una RLP de una, dos o tres capas. Las RLP de una sola capa pueden obtenerse expresando una proteína estructural de rotavirus, tal como VP2 o VP6. Las RLP de doble capa pueden obtenerse expresando dos proteínas estructurales de rotavirus, tal como, por ejemplo, coexpresando tanto VP2 como VP6, con o sin VP4. Las RLP de tres capas pueden obtenerse mediante la expresión simultánea de al menos tres proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, la coexpresión de VP2, VP6 y VP7, con o sin VP4. La coexpresión de VP4 da como resultado una partícula con picos que se parece al rotavirus nativo. VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8. Este procesamiento puede tener lugar dentro del huésped usando proteasas endógenas, o coexpresando una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, subtilisina. Como alternativa, VP4 puede procesarse para producir VP5 y VP8 mediante la adición de una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, subtilisina durante cualquier etapa del procedimiento de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP.
Cada una de las proteínas estructurales de rotavirus tiene diferentes características y tamaño, y se requiere en diferentes cantidades para ensamblarse en RLP. La expresión "VLP de rotavirus", "partícula pseudovírica de rotavirus (RVLP)", "partícula pseudovírica de rotavirus (RLP)", "partícula pseudovírica de rotavirus", "RVLP" o "RLP" se refiere a una partícula pseudovírica (VLP) que comprende una o más proteínas estructurales de rotavirus. Un ejemplo de proteínas estructurales de rotavirus puede incluir, pero sin limitación, una proteína estructural VP2, VP4 (o VP5 y VP8), VP6 y VP7.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para producir las RLP en una planta, en el que un primer ácido nucleico (un primer ácido nucleico) que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, una proteína VP2 o VP6, se coexpresa con un segundo ácido nucleico que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, una proteína VP6 o VP2. Además, un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo VP4 o VP7 se puede coexpresar con el primer y segundo ácido nucleico de manera que el primero, el segundo y el tercer ácidos nucleicos se coexpresan en la planta. El primer ácido nucleico, el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico pueden introducirse en la planta en la misma etapa o pueden introducirse secuencialmente en la planta. La VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 dentro del huésped coexpresando un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP añadiendo una proteasa saciable, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus y un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus puede transformarse adicionalmente con un cuarto ácido nucleico que codifica una cuarta proteína estructural de rotavirus, por ejemplo una proteína VP7 o VP4, de manera que el primero, el segundo, el tercero y el cuarto ácido nucleico se coexpresan en la planta. La VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 dentro del huésped mediante la coexpresión de un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa de tipo tripsina, una serina proteasa, una proteasa de tipo quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP añadiendo una proteasa saciable, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
Además, una primera planta que expresa el primer ácido nucleico que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, una proteína VP2 o VP6, puede cruzarse con una segunda planta que expresa el segundo ácido nucleico que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitarse a la proteína VP6 o VP2, para producir una planta de progenie (tercera planta) que coexpresa el primer y segundo ácidos nucleicos que codifican VP2 y VP6 o VP6 y VP2, respectivamente. Además, la tercera planta que expresa el primer y segundo ácidos nucleicos que codifican VP2 y VP6 o VP6 y VP2, respectivamente, puede cruzarse con una cuarta planta que expresa el tercer ácido nucleico que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitarse a VP4 o VP7, para producir una planta de progenie adicional (quinta planta) que coexpresa el primer, segundo y tercer ácidos nucleicos que codifican VP2, VP6 y VP4 o VP7 respectivamente. La VP4 se puede procesar o escindir para producir VP5 y VP8 dentro de la planta utilizando una proteasa del huésped, o coexpresando un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a la tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina dentro de una de la primera, segunda, tercera o cuarta plantas. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP añadiendo una proteasa saciable, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
Como se describe con más detalle a continuación, las RLP pueden producirse en una planta expresando un ácido nucleico (un primer ácido nucleico) que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo y sin limitación, VP2, VP6 o VP7. Un segundo ácido nucleico que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus, por ejemplo y sin limitación, VP7, VP6 o VP2 se puede coexpresar en la planta. Además, un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo y sin limitación, VP6, VP7 o VP2 se puede coexpresar en la planta. El primer ácido nucleico, el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico pueden introducirse en la planta en la misma etapa, o pueden introducirse en la planta secuencialmente. El ácido nucleico, el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico se pueden introducir en la planta de manera transitoria, o de una manera estable.
Además, una planta que expresa un primer ácido nucleico que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo una proteína VP2, se puede transformar con un segundo ácido nucleico que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitación, en VP6 o VP7, de manera que tanto el primer como el segundo ácido nucleico se coexpresan en la planta. La planta se puede transformar adicionalmente con un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitación, VP7 o VP6.
Como alternativa, una planta que expresa una proteína VP6 o VP7, (segundo ácido nucleico) se puede transformar con el primer ácido nucleico que codifica la proteína VP2, de manera que tanto el primero como el segundo ácidos nucleicos se coexpresan en la planta. La planta se puede transformar adicionalmente con un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitación, VP7 o VP6.
Además, una planta que expresa un primer y un segundo ácido nucleico que codifica una primera y una segunda proteína estructural de rotavirus, por ejemplo una proteína VP2 y VP6, se puede transformar con un tercer ácido nucleico que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus, por ejemplo, VP4 o VP7. La VP4 puede procesarse o escindirse para producir VP5 y VP8 coexpresando un ácido nucleico que codifica una proteasa adecuada, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina. Alternativamente, VP4 puede procesarse durante cualquier etapa de extracción de RLP, o después de la purificación de RLP añadiendo una proteasa saciable, por ejemplo, tripsina, una proteasa similar a tripsina, una serina proteasa, una proteasa similar a quimotripsina, subtilisina.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para producir RLP en una planta que implica introducir uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más proteínas estructurales de rotavirus unidas operativamente a una región reguladora activa en la planta, y una o más de una secuencia de direccionamiento de compartimento y/o un elemento de amplificación, en la planta, parte de la planta o célula vegetal. La planta, parte de la planta o célula vegetal se incuba a continuación en condiciones que permiten la expresión del uno o más ácidos nucleicos, produciendo de ese modo las RLP. La una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden ser VP2, VP4 (o VP5 y VP8), VP6, VP7, un fragmento de VP2, VP4 (o VP5 y VP8), VP6, VP7 o una combinación de las mismas.
La presente descripción proporciona además una RLP que comprende una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo, pero sin limitación, VP2, VP4 (o VP5 y VP8), VP6, VP7 o una combinación de las mismas. La RLP puede producirse mediante uno o más de los procedimientos proporcionados por la presente divulgación.
La aparición de las RLP puede detectarse usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Las RLP pueden evaluarse para determinar la estructura y el tamaño mediante, por ejemplo, microscopía electrónica o mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
Para la cromatografía de exclusión de tamaño, las proteínas solubles totales pueden extraerse del tejido vegetal mediante homogeneización (Polytron) del material vegetal triturado congelado en tampón de extracción, y el material insoluble se elimina por centrifugación. La precipitación con acetona o PEG enfriados con hielo también puede ser beneficiosa. La proteína soluble se cuantifica y el extracto pasa a través de una columna Sephacryl™, por ejemplo, una columna Sephacryl™ S500. Puede usarse Blue Dextran 2000 como un estándar de calibración. Después de la cromatografía, las fracciones pueden analizarse adicionalmente mediante inmunotransferencia para determinar el complemento proteico de la fracción.
La fracción separada puede ser, por ejemplo, un sobrenadante (si se centrifuga, sedimenta o precipita), o un filtrado (si se filtra), y se enriquecen con proteínas, o proteínas superestructurales, tales como, por ejemplo, nanotubos, nanoesferas o partículas de mayor orden, de peso molecular más alto, tales como RLP monocapa (sl), bicapa (dl) o tricapa (tl).
La fracción separada puede procesarse adicionalmente para aislar, purificar, concentrar, o una combinación de los mismos, las proteínas, proteínas supraestructurales o partículas de mayor orden mediante, por ejemplo, etapas de centrifugación adicionales, precipitación, etapas cromatográficas (por ejemplo, exclusión de tamaño, intercambio iónico, cromatografía de afinidad), filtración de flujo tangencial, o una combinación de los mismos. La presencia de proteínas purificadas, proteínas de supraestructurales o partículas de mayor orden, tales como RLP, puede ser confirmada, por ejemplo, mediante un análisis Western nativo o SDS-PAGE, utilizando un anticuerpo de detección apropiado, electroforesis capilar, microscopía electrónica, o cualquier otro procedimiento que será evidente para un experto en la técnica.
Las RLP producidas de acuerdo con la presente invención se pueden purificar, purificar parcialmente a partir de una planta, parte de una planta o materia vegetal, o se pueden administrar como una vacuna oral, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
La purificación de RLP puede implicar centrifugación en gradiente, por ejemplo, pueden usarse gradientes de densidad de sacarosa, iodixanol, OptiPrep™ o cloruro de cesio (CsCl) para purificar o purificar parcialmente las RLP de la biomasa vegetal transformada. Como se muestra, por ejemplo, en la Figura 45, se puede usar un gradiente gradual de iodixanol o un gradiente continuo de iodixanol para purificar la RLP y/o las proteínas estructurales de rotavirus expresadas.
Se ha demostrado que la concentración de calcio (Ca2+) es importante para la transformación de partículas de triple capa (TLP) en partículas de doble capa (DLP) y depende de la cepa (véase, por ejemplo, Martin et al. Journal of Virology, Jan 2002). La pérdida completa de las proteínas de la cápside externa de las TLP (descapsidación de TLP) tiene lugar en el rango nanomolar de [Ca2+]. Por lo tanto, la purificación y/o extracción de RLP se puede realizar en presencia de calcio, y la etapa de centrifugación en gradiente puede realizar en presencia de calcio, por ejemplo en presencia de CaCl2. La concentración de CaCl2 puede estar entre, por ejemplo, 1 mM y 1000 mM, o cualquier cantidad entre las mismas, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 mM o cualquier cantidad entre las mismas.
Las plantas, o fragmentos de plantas pueden procesarse mínimamente. Con el término "procesamiento mínimo" se refiere a materia vegetal, por ejemplo, una planta o porción de la misma que comprende una proteína de interés y/o la RLP que se purifica parcialmente para producir un extracto vegetal, homogeneizado, fracción de homogeneizado vegetal, o similares (es decir, mínimamente procesado). La purificación parcial puede comprender, pero sin limitación, alterar estructuras celulares vegetales creando así una composición que comprende componentes vegetales solubles, y componentes vegetales insolubles que pueden separarse por ejemplo, pero sin limitación, por centrifugación, filtración o una combinación de los mismos. A este respecto, las proteínas secretadas dentro del espacio extracelular de la hoja u otros tejidos podrían obtenerse fácilmente mediante extracción al vacío o centrífuga, o los tejidos podrían extraerse a presión mediante el paso a través de rodillos o por trituración o similar para exprimir o liberar la proteína libre del interior del espacio extracelular. El procesamiento mínimo también podría implicar la preparación de extractos en bruto de proteínas solubles, ya que estas preparaciones tendrían una contaminación insignificante de los productos vegetales secundarios. Además, el procesamiento mínimo puede implicar la extracción acuosa de proteína soluble de las hojas, seguido de la precipitación con cualquier sal adecuada. Otros procedimientos pueden incluir maceración a gran escala y extracción de zumo para permitir el uso directo del extracto. Las RLP pueden purificarse o extraerse usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, extracción mecánica o bioquímica.
La una o más proteínas estructurales de rotavirus se pueden sintetizar en una cantidad de hasta 2 g por kilogramo de peso en fresco de planta. Por ejemplo, la cantidad de proteína estructural sintetizada puede variar entre 1 y 2 g por kilogramos de peso en fresco, u cualquier cantidad entre las mismas, tales como 1 ,0, 1 ,1 , 1 ,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 g por kilogramos de peso en fresco o cualquier cantidad entre las mismas. Por ejemplo, la proteína estructural se puede sintetizar en una cantidad de hasta 1,54 g por kilogramo de peso en fresco de planta.
Además, la RLP se puede sintetizar en una cantidad de hasta 1,5 g por kilogramo de peso en fresco de planta. Por ejemplo, la cantidad de RLP sintetizada puede variar entre 0,5 y 1,5 g por kilogramos de peso en fresco, u cualquier cantidad entre las mismas, tales como 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 g por kilogramos de peso en fresco. Por ejemplo, la RLP se puede sintetizar en una cantidad de hasta 1,1 g por kilogramo de peso en fresco de planta.
El tamaño (es decir, el diámetro) de las RLP definidas anteriormente, que puede medirse, por ejemplo, mediante técnicas de dispersión dinámica de la luz (DLS) o de microscopía electrónica (EM), está habitualmente entre 50 a 110 nm, o cualquier tamaño los mismos. Por ejemplo, el tamaño de la estructura de RLP intacta puede variar de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, o cualquier tamaño entre los mismos, tal como 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm o cualquier tamaño entre los mismos.
La presente divulgación proporciona además un ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus unidas operativamente a una región reguladora activa en una planta. La secuencia de nucleótidos puede optimizarse, por ejemplo, para el uso de codones humanos o el uso de codones de plantas. Además, una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden estar unidas operativamente a uno o más de un elemento de amplificación. Además, una o más proteínas estructurales de rotavirus pueden estar unidas operativamente a una o más secuencias de direccionamiento de un compartimento. La una o más proteínas estructurales de rotavirus codificadas por la secuencia de nucleótidos pueden ser, por ejemplo, VP2, VP4, VP6 o VP7. Además, la una o más proteínas estructurales de rotavirus codificadas por la secuencia de nucleótidos pueden ser, por ejemplo, de cualquier grupo de rotavirus A a G, pero más preferentemente, del grupo de rotavirus A. Además, la una o más proteínas estructurales de rotavirus codificadas por la secuencia de nucleótidos puede ser de cualquier cepa de rotavirus que tenga un genotipo de cualquier combinación de los tipos G y P de G1 a G27 y de P1 a P34, y más preferentemente, de G1 a G19 y de PI a P27, incluyendo, pero sin limitación, G1P[8], G2P[4], G2P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[6], G9P[8], cepa WA de rotavirus A, cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] para vacuna contra rotavirus A o cepa SA11 de rotavirus.
Una secuencia de ácido nucleico a la que se hace referencia en la presente divulgación, puede ser "sustancialmente homóloga", "sustancialmente similar" o "sustancialmente idéntica" a una secuencia, o un complemento de la secuencia si la secuencia de ácido nucleico se hibrida con una o más de una secuencia de nucleótidos o un complemento de la secuencia de ácidos nucleicos como se define en la presente memoria bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las secuencias son "sustancialmente homólogas", "sustancialmente similares" o "sustancialmente idénticas" cuando al menos aproximadamente el 70%, o entre el 70 al 100%, o cualquier cantidad entre las mismas, por ejemplo el 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 , 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100%, o cualquier cantidad entre las mismas, de los nucleótidos coinciden en una longitud definida de la secuencia de nucleótidos, siempre que tales secuencias homólogas presenten una o más de las propiedades de la secuencia, o el producto codificado como se describe en la presente memoria.
Por ejemplo, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado, que comprende un ácido nucleico que codifica una o más proteínas estructurales de rotavirus que es al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% 100% o cualquier cantidad entre las mismas idéntico a secuencias como se define, por ejemplo, en SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54. El polinucleótido puede ser un codón humano optimizado por cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica.
Además, la presente divulgación proporciona RLP que comprenden proteínas estructurales de rotavirus que, por ejemplo, están codificadas por ácidos nucleicos, que son al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 100% o cualquier cantidad entre las mismas, idénticos a las secuencias que se definen, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54.
Tal similitud o identidad de secuencia puede determinarse usando un programa de comparación de secuencias nucleotídicas, tal como el proporcionado en DNASIS (usando, por ejemplo, pero sin limitación, los siguientes parámetros: Penalización Ga P 5, n.° de diagonales superiores 5, penalización GAP fija 10, k-tupla 2 , hueco flotante 10 y tamaño de ventana 5). Sin embargo, otros procedimientos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica, por ejemplo, los algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444), y por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST, disponibles a través del NIH), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 complemento), o utilizando hibridación Southern o Northern en condiciones rigurosas (véase Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Preferentemente, las secuencias que son sustancialmente homólogas exhiben al menos aproximadamente un 80% y más preferentemente al menos aproximadamente un 90% de similitud de secuencia sobre una longitud definida de la molécula.
Un ejemplo de una de tales condiciones de hibridación rigurosas puede ser hibridación (de aproximadamente 16­ 20 horas) durante una noche en 4 x SSC a 65 °C seguido por lavado en 0,1 x SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C cada 20 o 30 minutos. Como alternativa, una condición de hibridación rigurosa ejemplar podría ser durante una noche (16-20 horas) en formamida al 50%, 4 x SSC a 42 °C seguido por lavado en 0,1 x SSC a 65 °C durante una hora, o 2 lavados en 0,1 x SSC a 65 °C durante 20 o 30 minutos, o durante una noche (16-20 horas), o hibridación en tampón de fosfato acuoso Church (SDS al 7%, tampón NaPO40,5 M, pH 7,2, EdTa 10 mM) a 65 °C, con 2 lavados a 50 °C en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65 °C en 2 x SSC, SDS al 0,1% durante 20 o 30 minutos cada uno para regiones de secuencia únicas.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido estructural de rotavirus se puede describir como un "ácido nucleico de rotavirus", una "secuencia de nucleótidos de rotavirus", un "ácido nucleico de rotavirus" o una "secuencia de nucleótidos de rotavirus". Por ejemplo, que no se debe considerar limitante, una partícula pseudovírica que comprende una o más proteínas estructurales de rotavirus o polipéptido estructural de rotavirus, se puede describir como una "VLP de rotavirus", "RVLP" o "RLP".
Muchos organismos muestran un sesgo para el uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena peptídica en crecimiento. La preferencia de codones o el sesgo de codones, las diferencias en el uso de codones entre organismos, se proporcionan por la degeneración del código genético, y está bien documentada entre muchos organismos. El sesgo de codones a menudo se correlaciona con la eficacia de la traducción del ARN mensajero (ARNm), que a su vez se cree que depende de, entre otros, las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de las moléculas de ARN de transferencia particular (ARNt). El predominio de ARNt seleccionados en una célula generalmente es un reflejo de los codones utilizados con mayor frecuencia en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden adaptar para la expresión génica óptima en un organismo dado basándose en la optimización de codones. El proceso de optimización de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína expresada de forma heteróloga puede ser un paso importante para mejorar los rendimientos de expresión. Los requisitos de optimización pueden incluir etapas para mejorar la capacidad del huésped para producir la proteína extraña.
La "optimización de codones" se define como la modificación de una secuencia de ácido nucleico para una expresión potenciada en células de interés reemplazando al menos uno, más de uno, o un número significativo, de codones de la secuencia nativa con codones que pueden usarse más frecuentemente o mucho más en los genes de otro organismo o especie. Varias especies presentan un sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular.
La presente divulgación incluye secuencias de polinucleótidos sintéticas que se han optimizado en codones, por ejemplo, las secuencias se han optimizado para el uso de codones humanos o uso de codones de plantas. Las secuencias de polinucleótidos optimizadas en codones pueden expresarse entonces en plantas. Más específicamente, las secuencias optimizadas para el uso de codones humanos o el uso de codones vegetales pueden expresarse en plantas. Sin desear quedar ligando a ninguna teoría, se cree que las secuencias optimizadas para el codón humano aumentan el contenido de guanina-citosina (contenido de GC) de la secuencia y mejoran los rendimientos de expresión en las plantas.
Existen diferentes técnicas de optimización de codones conocidas en la técnica para mejorar la cinética de traducción de las regiones de codificación de proteínas ineficientes en la traducción. Estas técnicas se basan principalmente en la identificación del uso de codones para un determinado organismo huésped. Si un cierto gen o secuencia se debe expresar en este organismo, la secuencia codificante de dichos genes y secuencias se modificará entonces de modo que se reemplacen los codones de la secuencia de interés por los codones más frecuentemente utilizados del organismo huésped.
La proteína estructural de rotavirus o polipéptido puede expresarse en un sistema de expresión que comprende un sistema de expresión basado en virus, ADN o ARN, por ejemplo, pero sin limitación, un casete de expresión basado en comovirus y un elemento de amplificación basado en geminivirus.
El sistema de expresión como se describe en la presente memoria, comprende un casete de expresión basado en un virus bipartita, o un virus con un genoma bipartita. Por ejemplo, los presentes virus bipartitas pueden ser de la familia de los Comoviridae. Los géneros de la familia de los Comoviridae incluyen Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus y Sadwavirus. Los Comovirus incluyen virus del mosaico del caupí (CPMV), virus del mosaico grave del caupí (CPSMV), virus del mosaico de la calabaza (SqMV), virus del moteado del trébol rojo (RCMV), virus del moteado de la vaina del frijol (BPMV), virus del mosaico del nabo (TuRSV), virus del mosaico verdadero del haba (BBtMV), virus de la mancha del haba (BBSV), virus del mosaico del rábano (RaMV). Los ejemplos de secuencias de ARN-2 de comovirus que comprenden elementos potenciadores que pueden ser útiles para diversos aspectos de la invención incluyen, pero sin limitación: ARN-2 de CPMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003550), ARN-2 de RCMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003738), ARN-2 de BPMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003495), ARN-2 de CPSMV (n.° de acceso al GenBank NC_003544), ARN-2 de SqMV (n.° de acceso al GenBank NC_003800), ARN-2 de TuRSV (n.° de Acceso al GenBank NC_013219.1). ARN-2 de BBtMV (n.° de Acceso al GenBank GU810904), ARN-2 de BBSV (n.° de Acceso al GenBank FJ028650), RaMV (n.° de Acceso al GenBank NC_003800).
Los segmentos del genoma de ARN como vírico bipartita se denominan como ARN-1 y ARN-2. ARN-1 codifica las proteínas implicadas en la replicación, mientras que ARN-2 codifica las proteínas necesarias para un movimiento célula a célula en las dos proteínas cápside. Puede usarse cualquier casete a base de comovirus adecuado, incluyendo, CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV o BPMV, por ejemplo, el casete de expresión puede basarse en CPMV.
"Casete de expresión" se refiere a una secuencia nucleotídica que comprende un ácido nucleico de interés bajo el control de, y operablemente (u operativamente) unido a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción del ácido nucleico de interés en una célula huésped.
Los sistemas de expresión también pueden comprender elementos de amplificación de un geminivirus, por ejemplo, un elemento de amplificación del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV). BeYDV pertenece al género de Mastrevirus adaptado a las plantas dicotiledóneas. BeYDV es un monopartita que tiene un genoma de ADN circular monocatenario y puede replicarse con números de copias muy elevados mediante un mecanismo en círculo rodante. Los sistemas de vectores de replicón de ADN derivado de BeYDV se han usado para una rápida producción de proteínas de alto rendimiento en plantas.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "elementos de amplificación" se refiere a un segmento de ácido nucleico que comprende al menos una porción de una o más regiones intergénicas largas o de repetición intergénica larga (LIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en la presente memoria, "región intergénica larga" o "repetición intergénica larga" se refiere a una región de una región intergénica larga que contiene un sitio de unión rep capaz de mediar la escisión y la replicación por una proteína Rep de geminivirus. En algunos aspectos, el segmento de ácido nucleico que comprende una o más LIR, puede comprender además una región intergénica corta o región intergénica pequeña (SIR) de un genoma de geminivirus. Como se usa en la presente memoria, la "región intergénica corta" o "región intergénica corta" se refiere a la cadena complementaria (la IR corta (SIR) de un Mastrevirus). Cualquier elemento de amplificación derivado de geminivirus adecuado puede usarse en la presente memoria. Véanse, por ejemplo, los documentos WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17). Si se usa más de una LIR en la construcción, por ejemplo dos LIR, entonces el promotor, las regiones CMPV-HT y la secuencia de ácido nucleico de interés y el terminador están delimitadas por cada una de las dos LIR. Además, el elemento de amplificación podría, por ejemplo, originarse a partir de la secuencia como se describe en Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, depositado bajo el número de acceso de GenBank DQ458791. El segmento de ácido nucleico que comprende las LIR se une a los nucleótidos 2401 a 2566 y 1 a 128. El segmento de ácido nucleico que comprende las SIR son los nucleótidos 1154 a 1212.
Como se describe en la presente memoria, la administración conjunta del vector derivado del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) y un vector que suministra Rep/RepA, por agroinfiltración de hojas de Nicotiana benthamiana da como resultado una amplificación de replicón eficaz y una producción de proteína robusta.
Un casete de expresión basado en un comovirus y un elemento de amplificación derivado de geminivirus pueden estar comprendidos en vectores separados, o las partes componentes pueden incluirse en un vector. Si se usan dos vectores, el primer y el segundo vector pueden introducirse en una célula vegetal simultáneamente o por separado.
También se puede incluir una replicasa viral en el sistema de expresión como se describe en la presente memoria para aumentar la expresión del ácido nucleico de interés. Un ejemplo no limitante de una replicasa es una replicasa BeYDV (pREP110) que codifica BeYDV Rep y RepA (C2/C1; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714). Otro ejemplo no limitante de una replicasa se describe en Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, depositado bajo el número de acceso de GenBank DQ458791. El segmento de ácido nucleico que comprende el gen C1:C2 son los nucleótidos 1310 a 2400.
Por "coexpresado" se entiende que dos o más de dos secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos no necesitan expresarse exactamente al mismo tiempo. Más bien, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan de una manera tal que los productos codificados tienen una oportunidad de interactuar. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden coexpresarse usando un sistema de expresión transitoria, donde las dos o más secuencias se introducen dentro de la planta aproximadamente al mismo tiempo en condiciones en las que se expresan ambas secuencias. Como alternativa, una planta de plataforma que comprende una de las secuencias de nucleótidos puede transformarse de una manera estable, con una secuencia adicional que codifica la proteína de interés, por ejemplo, una o más proteínas estructurales de rotavirus, introducidas en la planta de plataforma de forma transitoria.
El plegamiento correcto de la proteína puede ser importante para la estabilidad de la proteína, la formación de multímeros, la formación de RLP y la función. El plegamiento de una proteína puede estar influenciado por uno o más factores, incluyendo, pero sin limitación, la secuencia de la proteína, la abundancia relativa de la proteína, el grado de aglomeración intracelular, la disponibilidad de cofactores que pueden unirse o estar asociados transitoriamente con la proteína plegada, parcialmente plegada o desplegada. Además, el compartimento o subcompartimento dentro de la planta donde se expresa la proteína puede influir en los niveles de expresión y plegamiento de la proteína.
La expresión de una o más proteínas estructurales de rotavirus puede dirigirse a compartimientos y/o subcompartimentos de células vegetales específicas mediante agroinfiltración en plantas transgénicas. El compartimento o subcompartimentos pueden ser, por ejemplo, plástidos, retículo endoplasmático (RE), cloroplasto o apoplasto. Sin desear quedar ligando a la teoría, la selección de compartimentos o subcompartimentos puede aumentar la acumulación de proteínas en el compartimiento o subcompartimentos seleccionados sobre la acumulación citoplásmica. La acumulación de compartimentos o subcompartimentos puede proteger a las proteínas de la degradación por proteasas presentes en el citoplasma y/o permitir que se acumule a una mayor concentración sin afectar a la función de la célula de la planta.
Por lo tanto, el casete o vector de expresión se puede adaptar para dirigir el vector o la proteína estructural de rotavirus o polipéptido expresados desde el vector al compartimento o subcompartimento deseado en la planta.
Por ejemplo, el casete o vector de expresión se puede adaptar a plastidios diana haciendo que una proteína estructural de rotavirus o polipéptido que se expresa incluya una porción capaz de interactuar con las membranas tilacoides de los plástidos, en particular, el mecanismo de transferencia de las membranas tilacoides. Esta interacción puede causar que la proteína estructural de rotavirus o polipéptido se importe al plástido del citoplasma donde se expresa. Sin desear quedar ligando a la teoría, el mecanismo de importación desde el citoplasma puede ser importante para el correcto plegamiento de las proteínas. Se apreciará que el casete o vector de expresión puede estar adaptado para dirigir los propios plástidos a transformarse y la expresión de la proteína estructural de rotavirus o polipéptido puede ocurrir completamente dentro del plástido.
Por la expresión "secuencia de direccionamiento" se entiende que las secuencias de direccionamiento se pueden incluir en el vector o casete de expresión. Dichas secuencias de direccionamiento pueden traducirse en un péptido que dirige el vector o producto del mismo al compartimiento o subcompartimento deseado en la planta, tal como un plástido. Por ejemplo, los péptidos señal de plástido (también denominados "péptidos de tránsito de plástido" en la técnica) para dirigir proteínas a plástidos son conocidos en la técnica. Un ejemplo no limitante de un péptido de tránsito de plástidos que puede usarse es el de rbcs1-cTP. Como ejemplo adecuado de una secuencia de péptido de tránsito de cloroplastos es el gen de la subunidad pequeña de Rubisco (rbcS1), por ejemplo, de Solanum tuberosum.
Por lo tanto, la proteína estructural de rotavirus o polipéptido puede incluir un péptido señal que es el mismo que, o heterólogo con, el resto del polipéptido o proteína. La expresión "péptido señal" se conoce bien en la técnica y se refiere generalmente a una secuencia corta de aminoácidos (de aproximadamente 5-30 aminoácidos), encontrada generalmente en el extremo N de un polipéptido que puede dirigir la translocación del polipéptido recién traducido a un organelo particular, o facilitar el posicionamiento de dominios específicos de la cadena polipeptídica con respecto a otros. Como ejemplo no limitante, el péptido señal puede dirigirse a la translocación de la proteína en el retículo endoplasmático y/o facilitar la colocación del dominio proximal del extremo N en relación con un dominio de anclaje a la membrana del polipéptido naciente para ayudar en la escisión y el plegamiento de la proteína madura, por ejemplo, aunque no debe considerarse limitante, una proteína estructural de rotavirus.
Un péptido señal (SP) puede ser nativo de la proteína o proteína del virus, o un péptido señal puede ser heterólogo con respecto a la secuencia primaria de la proteína o proteína vírica que se expresa. Por ejemplo, el péptido señal nativo de la proteína estructural de rotavirus puede usarse para expresar la proteína estructural de rotavirus en un sistema vegetal.
Un péptido señal también puede ser no nativo, por ejemplo, de una proteína, proteína viral o proteína estructural nativa de un virus distinto de la proteína de rotavirus, o de un polipéptido vegetal, animal o bacteriano. Un ejemplo no limitante de un péptido señal que puede usarse es el de la proteína de alfalfa disulfuro isomerasa (PDISP) (nucleótidos 32-103 con n.° de Acceso Z11499). Además, el péptido señal puede ser completamente eliminado o estar truncado. Por truncamiento o truncado se entiende que el 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o cualquier cantidad entre las mismas de los residuos de aminoácidos se eliminan del péptido señal. Preferentemente, los residuos de aminoácidos truncados son continuos, y el truncamiento se produce desde la segunda metionina en adelante.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una proteína estructural de rotavirus, como por ejemplo VP2, VP6, VP6 y/o VP7, que comprende un péptido señal nativo, un péptido señal no nativo o péptido señal truncado, y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas estructurales de rotavirus.
La una o más construcciones genéticas de la presente divulgación pueden expresarse en cualquier planta huésped adecuada que sea transformada por la secuencia de nucleótidos, o las construcciones o vectores de la presente divulgación. Los ejemplos de huéspedes apropiados incluyen, pero sin limitación, cultivos agrícolas, incluyendo alfalfa, canola, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., patata, ginseng, guisante, avena, arroz, semilla de soja, trigo, cebada, girasol, algodón, y similares.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales de rotavirus pueden transferirse al huésped de la planta usando 1, 2, 3, 4 o 5 vectores plasmídicos binarios. Cada vector plasmídico binario puede, por lo tanto, contener 1, 2, 3, 4 o 5 secuencias de nucleótidos que codifican una proteína estructural de rotavirus.
La una o más construcciones genéticas de la presente divulgación pueden comprender además una región 3' no traducida. Una región 3' no traducida se refiere a esa porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal regulador capaz de realizar un procesamiento de ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente realizando la adición de pistas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con respecto a la forma canónica 5' AATAAA-3', aunque las variaciones no son poco frecuentes. Los ejemplos no limitantes de regiones 3' apropiadas son las regiones no traducidas transcritas 3' que contienen una señal de poliadenilación de genes plasmídicos que inducen tumor (Ti) de Agrobacterium, tales como los genes de nopalina sintasa (gen Nos) y genes vegetales, tal como los genes de proteína de almacenamiento de soja, la subunidad pequeña del gen de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO; US 4.962.028;), el promotor usado en la expresión de plastocianina, descrito en el documento de patente US 7.125.978.
La una o más de las construcciones genéticas de la presente divulgación también pueden incluir potenciadores adicionales, potenciadores de la traducción o de la transcripción, según se requiera. Los potenciadores pueden situarse 5' o 3' con respecto a la secuencia que se transcribe. Las regiones potenciadoras se conocen bien por los expertos en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio, si está presente, deberá estar en fase con el marco de lectura ("dentro del marco") de la secuencia codificante para proporcionar una traducción correcta de la secuencia transcrita.
Las construcciones de la presente divulgación se pueden introducir en células vegetales mediatne el uso de plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus vegetales, transformación de ADN directa, microinyección, electroporación, etc. Para revisiones de dichas técnicas véanse, por ejemplo, Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, págs. 421-463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2a Ed. (1988); y Miki e lyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. Londres, págs. 561­ 579 (1997). Otros procedimientos incluyen la captación de ADN directa, el uso de liposomas, electroporación, por ejemplo, usando protoplastos, microinyección, microproyectiles o triquitas, e infiltración al vacío. Véanse, por ejemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), Pat. de Estados Unidos N.° 4.945.050; 5.036.006; y 5.100.792, la solicitud de patente de Estados Unidos con N.° de serie 08/438.666, presentada el 10 de mayo de 1995, y 07/951.715, presentada el 25 de septiembre de 1992.
Expresión transitoria
Sin desear quedar ligando a la teoría, la concentración de proteína y la relación de las diferentes proteínas estructurales de rotavirus pueden ser importantes para la eficacia de ensamblaje de las RLP. Por lo tanto, la multiplicidad y el tiempo de infección pueden ser importantes para manipular la concentración de proteínas y la eficiencia general de ensamblaje de las RLP en las plantas.
La construcción de la presente divulgación se puede expresar de manera transitoria en plantas o parte de una planta. Se puede usar un sistema de expresión transitoria que se base en la expresión epicromosómica de Agrobacterium tumefaciens recombinante en una planta, parte de una planta o célula vegetal para expresar la proteína estructural de rotavirus, dirigida a diversos compartimentos o subcompartimentos celulares. Un sistema de expresión transitoria permite una alta velocidad de producción. Además, se pueden obtener grandes cantidades de proteína unos pocos días después de la infiltración de Agrobacterium recombinante en las plantas (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). También es posible expresar largas secuencias de genes y tener más de un gen expresado simultáneamente en la misma célula, lo que permite un ensamblaje eficiente de proteínas multiméricas (Lombardi et al., 2009).
Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas estructurales de rotavirus pueden transferirse al huésped de planta en 1,2, 3, 4 o 5 cepas de Agrobacterium tumefaciens transformadas.
Sin embargo, durante la expresión transitoria, el silenciamiento génico postranscripcional puede limitar la expresión de las proteínas heterólogas en las plantas. La coexpresión de un supresor de silenciamiento, por ejemplo, pero sin limitación, Nss del virus de la marchitez manchada del tomate puede usarse para contrarrestar la degradación específica de ARNm de transgén (Brigneti et al., 1998). Los supresores alternos de silenciamiento se conocen bien en la técnica y se pueden usar como se describe en la presente memoria (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14), por ejemplo, pero sin limitación, HcPro, TEV-p1/HC-Pro (Virus de grabado del Tabaco-p1/HCPro), BYV-p21, p19 de virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19), proteína de cápside del virus de oruga de tomate (TCV-CP), 2b de virus de mosaico de pepino; CMV-2b), p25 del Virus de patata X (PVX-p25), p11 del virus de patata M (PVM-p11), p11 del virus de patata S (PVS-p11), p16 del virus de quemadura de arándano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus-2 asociado con el enrollamiento de parra, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de parra, (GVA-p10), p14 del virus B de parra (GVB-p14), p10 del virus latente de Heracleum (HLV-p10), o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo HcPro, TEV -p1/HCPro, BYV-p21, TBSV p19, TcV-c P, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, puede coexpresarse junto con una o más proteínas estructurales de rotavirus, por ejemplo VP2, VP4, VP6, o una combinación de las mismas, para asegurar adicionalmente altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta o parte de una planta.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento como se ha descrito anteriormente, en el que una secuencia de nucleótidos adicional (segunda, tercera, cuarta, o quinta) se expresa dentro de la planta, la secuencia de nucleótidos adicional (segunda, tercera, cuarta o quinta) que codifica un supresor de silenciamiento se une operativamente con una región reguladora adicional (segunda, tercera, cuarta, o quinta) que está activa en la planta. La secuencia de nucleótidos que codifica un supresor de silenciamiento puede ser, por ejemplo, Nss, HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10.
Como se describe a continuación, los procedimientos de expresión transitoria pueden usarse para expresar las construcciones de la presente divulgación (véase Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Como alternativa, puede usarse un procedimiento de expresión transitorio a base de vacío, como se describe por Kapila et al., 1997. Estos procedimientos pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitación, un procedimiento de Agro-inoculación o Agro-infiltración, infiltración con jeringa, sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos transitorios como se ha indicado anteriormente. Con la Agro-inoculación, o Agroinfiltración, o infiltración por jeringa, una mezcla de Agrobacterias que comprende el ácido nucleico deseado entra en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo, las hojas, la porción aérea de la planta (incluyendo el tallo, hojas y flores), otra parte de la planta (tallo, raíz, flores), o la planta completa. Después de cruzar la epidermis, las copias de ADN-t se transfieren e infectan de Agrobacteria a las células. El ADN-t se transcribe de manera episomal y el ARNm se traduce, lo que conduce a la producción de la proteína de interés en células infectadas, sin embargo, el pase de ADN-t dentro del núcleo es transitorio.
Para ayudar en la identificación de células vegetales transformadas, las construcciones de la presente divulgación se pueden manipular adicionalmente para incluir marcadores seleccionables vegetales. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a productos químicos tales como un antibiótico, por ejemplo, gentamicina, higromicina, canamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfuro, y similares. De manera similar, pueden usarse enzimas que proporcionan la producción de un compuesto que puede identificarse por un cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.
También se consideran parte de la presente divulgación las plantas transgénicas, células vegetales o semillas que contienen la construcción génica de la presente divulgación. Los procedimientos para regenerar las plantas completas a partir de células vegetales también se conocen en la técnica. En general, las células vegetales transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, donde los marcadores seleccionados se usan para facilitar la identificación de células vegetales transformadas. Una vez que el callo se forma, la formación del brote puede fomentarse al emplear las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con procedimientos conocidos y los brotes se transfieren al medio de raíz para regeneración de las plantas. Después, las plantas pueden usarse para establecer generaciones repetitivas, de semillas o usando técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también pueden generarse sin usar cultivos tisulares.
El uso de las expresiones "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" en la presente solicitud se refiere a una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, aguas arriba de la región codificante de la proteína de un gen, que puede estar compuesta por ADN o ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando una región reguladora está activa, y en asociación operativa, u operativamente ligada, con un gen de interés, esto puede dar como resultado la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad del órgano, o controlar el desarrollo o activación del gen temporal. Una "región reguladora" puede incluir elementos promotores, elementos promotores del núcleo que muestran una actividad promotora inicial, elementos que pueden inducirse en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad promotora, tales como elementos reguladores negativos o potenciadores transcripcionales. La "región reguladora", como se usa en la presente memoria, también puede incluir elementos que están activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión génica, tales como potenciadores traduccionales y transcripcionales, represores traduccionales y transcripcionales, secuencias de activación aguas arriba, y determinantes de inestabilidad de ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden localizarse próximos a la región codificante.
En el contexto de esta divulgación, la expresión "elemento regulador" o "región reguladora" se refiere típicamente a una secuencia de ADN, normalmente, pero no siempre, aguas arriba (5') con respecto a la secuencia codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante proporcionando el reconocimiento de la ARN polimerasa y/u otros factores requeridos para iniciar la transcripción en un sitio particular. Sin embargo, debe entenderse que otras secuencias de nucleótidos, ubicadas dentro de los intrones, o 3' de la secuencia, pueden también contribuir a la regulación de expresión de una región codificante de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que proporciona el reconocimiento de la ARN polimerasa u otros factores de transcripción para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, aunque no todos los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada que consta de pares de bases de nucleótidos de adenosina y timidina normalmente situados aproximadamente 25 pares de bases aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción. Un elemento promotor comprende un elemento promotor inicial, responsable del inicio de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se han enumerado anteriormente) que modifican la expresión génica.
Existen varios tipos de regiones reguladoras, incluyendo aquellas que se regulan con respecto al desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que se regula con respecto al desarrollo, o controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa en ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que se regulan con respecto al desarrollo pueden estar activas preferentemente en ciertos órganos o tejidos en fases de desarrollo específicas, también pueden estar activas de una manera regulada con respecto al desarrollo, o a un nivel basal también en otros órganos o tejidos en la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas de tejido, por ejemplo, véase específicas de una región reguladora, incluyen el promotor de napina, y el promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). Un ejemplo de un promotor específico de la hoja incluye el promotor de plastocianina (véase, el documento US 7.125.978.
Una región reguladora inducible es aquella que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias o genes de ADN en respuesta a un inductor. En ausencia de un inductor, las secuencias o genes de ADN no serán transcribirán. Típicamente, el factor de proteína que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede presentarse en una forma activa, que es luego directa o indirectamente convertida en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de proteína también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico, tal como una proteína, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente mediante la acción de un patógeno o agente infeccioso tal como un virus. Una célula vegetal que contiene una región reguladora inducible puede ser expuesta a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o la planta por ejemplo por aspersión, riego, calentamiento o procedimientos similares. Los elementos reguladores inducibles pueden derivarse ya sea de genes de la planta o que no son de la planta (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, L.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358). Los ejemplos de promotores inducibles potenciales incluyen, pero sin limitación, un promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108), un promotor inducible por esteroides (Aoyama. T. y Chua, N.H., 1997, Plant 1. 2, 397-404) y un promotor inducible por etanol (Salter, M.G., et aI, 1998, Plant 10urnal 16, 127­ 132; Caddick, M.X., et al, 1998, Nature Biotech. 16, 177-180) genes IB6 y CK11 inducibles por citocina (Brandstatter, I. y Kieber, 1.1,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diferentes partes de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con el transcrito CaMV 35S (Odell et aI., 1985, Nature, 313: 810-812), los genes actina 1 de arroz (Zhang et aI, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), actina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121), o tms 2 (documento U.S. 5.428.147, y triosefosfato isomerasa 1 (Xu et. aI., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), el gen de ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), los genes de Arabidopsis ubiquitina 1 y 6 (Holtorf et aI, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), y el gen del factor 4A de inicio de la traducción del tabaco (Mandel et aI, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004).
El término "constitutivo" como se usa en la presente memoria, no necesariamente indica que un gen bajo el control de la región reguladora constitutiva se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos de células aún cuando a menudo se observa una variación en abundancia. Los elementos reguladores constitutivos pueden estar acoplados con otras secuencias para mejorar adicionalmente la transcripción y/o traducción de la secuencia de nucleótidos a la que están unidos operativamente. Por ejemplo, el sistema CPMV-HT se deriva de las regiones no traducidas del virus del mosaico del caupí (CPMV) y demuestra una traducción mejorada de la secuencia codificante asociada. Por "nativo" se entiende que la secuencia de ácido nucleico o aminoácido es de origen natural, o "tipo silvestre". Por "ligada operativamente" significa que las secuencias particulares, por ejemplo un elemento regulador y una región codificante de interés, interactúan directa o indirectamente para realizar una función pretendida, tal como la mediación o modulación de la expresión génica. La interacción de secuencias ligadas operativamente puede, por ejemplo, mediarse por proteínas que interactúan con las secuencias ligadas operativamente.
La RLP producida en una planta puede inducir una proteína estructural VP7 de rotavirus que comprende N-glicanos específicos de plantas. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona una RLP que comprende VP7 que tienen N-glicanos específicos de plantas.
Además, se conoce la modificación de N-glicano en las plantas (véase, por ejemplo, U.S. 60/944,344; y puede producirse VP7 que con N-glicanos modificados. Puede obtenerse VP7 que comprende un patrón de glicosilación modificado, por ejemplo, N-glicanos fucosilados, xilosilados, o ambos, fucosilados y xilosilados reducidos, o puede obtenerse VP7 con un patrón de glicosilación modificado, en el que la proteína carece de fucosilación, xilosilación, o ambas, y comprende un aumento de la galactosilación. Además, la modulación de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, la adición de galactosa terminal, puede dar como resultado una reducción de la fucosilación y la xilosilación de la VP7 expresada en comparación con una planta de tipo silvestre que expresa VP7.
Por ejemplo, algo que no debe considerarse limitante, la síntesis de VP7 que tiene un patrón de glucosilación modificado se puede conseguir coexpresando VP7 junto con una secuencia de nucleótidos que codifica beta-1,4-galactosiltransferasa (GalT), por ejemplo, pero sin limitación, GalT de mamífero, o GalT humano, pero también se puede usar GalT de otras fuentes. El dominio catalítico de GalT también se puede fusionar a un dominio CTS (es decir, la cola citoplásmica, el dominio transmembrana, la región del tallo) de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1), para producir una enzima híbrida GNT1-GalT, y la enzima híbrida puede co-expresarse con VP7. La VP7 también puede co-expresarse junto con una secuencia de nucleótidos que codifica N-acetilglucosaminil transferasa III (GnT-III), por ejemplo, pero sin limitación, GnT-III de mamífero o GnT-III humano, también puede usarse GnT-III de otras fuentes. Adicionalmente, también se puede usar una enzima híbrida GNT1-GnT-III, que comprende el CTS de GNT1 fusionado a GnT-III.
Por lo tanto, la presente descripción también proporciona RLP que comprenden VP7 que tiene N-glicanos modificados.
Sin desear quedar ligando a la teoría, la presencia de N-glicanos vegetales en VP7 puede estimular la respuesta inmune promoviendo la unión de VP7 por las células que presentan antígeno. La estimulación de la respuesta inmune usando N-glicano vegetal se ha propuesto por Saint-Jore-Dupas et al. (2007).
La presente invención se ilustrará en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Expresión de proteínas de rotavirus y producción de VLP en hojas de la planta N. benthamiana
El siguiente análisis utilizó proteínas de la cápside de rotavirus de la cepa de rotavirus G9P[6], y evaluó si se formaron partículas de tipo rotavirus en los diversos compartimentos de las células de la hoja de N. benthamiana del tabaco Se investigó la coexpresión de VP2 y VP6, así como varias combinaciones de VP2, VP6, VP7 y VP4 en hojas de plantas de tabaco.
Materiales y procedimientos
Construcción de plásmidos
Los ADNc de rotavirus optimizados para codones de plantas para VP2, VP4, VP6 y VP7 se suministraron por Geneart, Alemania. El ADN plasmídico se transformó en células de E. coli químicamente competentes DH5-a (E. cloni™, Lucigen) según las instrucciones del fabricante. Se usaron en este estudio nuevos vectores binarios de Agrobacterium pTRAc (citoplasma), pTRAkc-rbcs1-cTP (direccionamiento de cloroplastos) y pTRAkc-ERH (direccionamiento del retículo endoplasmático) suministrados por Rainer Fischer (Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, IME, Alemania). Un vector adicional, pTRAkc-A (apoplasto), se derivó de la modificación de pTRAkc-ERH por la digestión con enzimas de restricción (ER) en los sitios NcoI y XhoI en el sitio de clonación múltiple (Figura 3). Esto elimina la etiqueta de histidina y la secuencia KDEL que retienen proteínas en el RE. En su lugar, las proteínas están dirigidas al apoplasto.
El ADNc de VP2, VP4 y VP6 se digirió con enzimas de restricción (ER) con NcoI/XhoI mientras que VP7 se cortó con AflIII/XhoI. Las enzimas de restricción Afllll, NcoI y MluI tienen extremos adhesivos compatibles Para la clonación directa del ADN en pTRAc, pTRAkc-rbcs-cTP y pTRAkc-A, los vectores se digirieron con ER en los sitios AflIII/XhoI, MluI/XhoI y NcoI/XhoI, respectivamente. La clonación de ADN en los vectores se llevó a cabo según el protocolo estándar seguido de la transformación en células DH5-a de E. coli químicamente competentes (E. clon i™, Lucigen). Las colonias recombinantes seleccionadas se verificaron mediante PCR de colonias. Para la clonación en pTRAkc-ERH, se añadió un sitio de enzima de restricción NotI para reemplazar el codón de parada de cada uno de los cuatro ADNc de rotavirus por amplificación por PCR. El ADNc se amplificó con cebadores como se detalla en la Tabla 1. Las condiciones de la reacción de PCR incluyeron desnaturalización a 95 ° C durante 5 min, seguido de cinco ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, hibridación a 52 °C durante 1 min, y elongación a 72 °C durante 1,5 min. Se realizaron 20 ciclos adicionales de la siguiente manera; 95 °C durante 30 s, 57 °C durante 1 min, 72 °C durante 1,5 min y 72 °C durante 5 min. Los fragmentos amplificados se clonaron en pGEM-T-Easy (Promega) según las instrucciones del fabricante. La transformación se llevó a cabo en E. coli DH5-a químicamente competente (E. cloni™, Lucigen). La PCR de colonias se llevó a cabo en colonias seleccionadas como se hizo para las otras tres construcciones.
_____________Tabla 1: Cebadores de ADNc de rotavirus para clonación de vectores de RE_____________ Cebador Secuencia Sitio del RE añadido Orientación VP2F 5'-TTCCATGGCTTACCGTAAAAGG-3' - SEQ ID NO 5 Directo VP2R 5'-ATGCGGCCGCAAGCTCGTTCATAATCCTCATG-3' NotI SEQ ID NO 6 Inverso VP4F 5'-TTCCATGGCTTCCCTCATCTAC-3' - SEQ ID NO 7 Directo VP4R 5'-ATGCGGCCGCAAGACGGCACTGGAGAATGAG.3' NotI SEQ ID NO 8 Inverso VP6F 5'-TTCCATGGATGTGCTCTACTC-3' - SEQ ID NO 9 Directo VP6R 5'-ATGCGGCCGCCTTCACGAGCATGGAACG-3' NotI SEQ ID NO: 10 Inverso VP7F 5'-GTACATGTACGGAATCGAGTAC-3' - SEQ ID NO: 11 Directo VP7R 5'-ATGCGGCCGCCACACGGTAGTAGAAAGCAGC-3' NotI SEQ ID NO: 12 Inverso
Los ADN de pGEM-VP de colonias positivas se secuenciaron para verificar la fidelidad de la PCR. El ADN se digirió con NcoI/NotI y el fragmento de ADN apropiado se clonó en pTRAkc-ERH en los sitios NcoI y NotI para formar pTRAkc-ERH-VP. La transformación se llevó a cabo en células E. coli DH5-a como se hizo previamente. La PCR de colonias también se realizó para verificar el ADN de rotavirus en las colonias seleccionadas.
Transformación de Agrobacterium
La cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens se proporcionó por el Profesor Rainer Fischer (Instituto Fraunhofer para Biología Molecular y Ecología Aplicada IME, Aachen, Alemania) y se hizo electrocompetente como se ha descrito previamente (Shen y Forde, 1989). Se mezclaron trescientos nanogramos de construcciones de pTRA-VP de rotavirus aisladas con 100 j l de células GV3101 electrocompetentes en una cubeta de electrogap de 0,1 cm (BioRadTM) y luego se electroporaron en un GenePulser (BioRad) con los siguientes ajustes: 1,8 kV, 25 pF y 200 Q. La incubación se permitió durante 1 hora a 27 °C en 900 j l de LB antes de colocarlo en placas lA que contenían 50 jg/ml de carbenicilina (carb), 30 jg/ml de kanamicina (kan) y 50 jg/ml de rifampicina (rif). Las placas se incubaron a 27 °C durante 3 días. Para comprobar los transformantes positivos, se aisló ADN plasmídico de las colonias de Agrobacterium recombinante y se volvió a transformar en células DH5-a competentes de E. coli. Éstas se seleccionaron luego en 100 jg/ml de ampicilina (amp) LA. Se realizaron la PCR de colonias y digestiones de enzimas de restricción en ADNc para verificar los transformantes exitosos. Se prepararon reservas de glicerol de Agrobacterium recombinante relevante y se almacenaron a -70 °C.
Infiltración de Agrobacterium recombinante
A. tumefeciens LBA 4404 (pBIN-NS) utilizado en este estudio se obtuvo por parte de Marcel Prins (Laboratory of Virology, Wageningen University, Binnenhaven, Países Bajos). Contiene el supresor de silenciamiento NSs encontrado en el virus de la marchitez manchada del tomate (TSWV). Se cultivaron Agrobacterium recombinante (pTRA-VP) de reservas de glicerol a 27 °C durante la noche en LB con 50 jg/ml de carb, 30 jg/ml de kan y 50 jg/ml de rif. El Agrobacterium recombinante y LBA4404 (pBIN-NS) se inocularon cada uno en medio de inducción (LB, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico MES 10 mM, MgSO42 mM, acetosiringona 20 jM, 50 jg/ml de carb, 30 jg/ml de kan y 50 jg/ml de rif, y a pH 5,6).
Los cultivos se incubaron a 27 °C durante una noche. Las células de Agrobacterium se recogieron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 min a 4 °C y luego se resuspendieron en 2 ml de medio de infiltración (MES 10 mM, MgCl2 10 mM, sacarosa al 3%, pH 5,6, acetosiringona 200 jM y agua estéril). La densidad óptica (DO600) de las células se verificó y se diluyó con medio de infiltración para obtener una DO600 de 0,25. Para cada construcción de pTRA-VP, se mezcló LBA4404 con Agrobacterium recombinante hasta una DO600 final de 0,5. Para los estudios de coexpresión, cada construcción se añadió hasta un total de una DO600 de 0,5, por ejemplo; VP2 - 0,25 y VP6 - 0,25, hasta que la DO600 para la mezcla fue igual a 0,5. La acetosiringona utilizada en el medio de inducción e infiltración ayuda en la activación de genes vir en Agrobacterium.
Las células de plantas dañadas liberan compuestos fenólicos que son detectados por los genes Vir A y Vir G en Agrobacterium lo que posteriormente conduce a la inducción de la expresión de proteínas en las células huésped (Zupan, J. et al., 2000). Las células se incubaron luego a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir que la acetosiringona indujera los genes vir. Se infiltraron plantas de N. benthamiana de tipo silvestre de tres semanas de edad con Agrobacterium recombinante que expresaba las proteínas VP. Esto implicó la infiltración al vacío de plantas enteras o la inyección de Agrobacterium recombinante (pTRA-VP) en los espacios aéreos abaxiales en el lado ventral de las hojas de las plantas. La agrobacteria recombinante se infiltró con o sin el supresor de silenciamiento LBA 4404 (pBIN-NS).
Inicialmente, se inyectaron 2 ml de suspensión de medio de infiltración de Agrobacterium en cada planta usando una jeringa por construcción Se usó una planta por construcción en una prueba contrarreloj de siete días. También se llevó a cabo la coexpresión de proteínas de rotavirus en las que VP2, VP6 y VP4 se expresaron simultáneamente en el citoplasma de hojas de plantas de N. benthamiana. Las combinaciones investigadas fueron VP2/6 y VP2/6/4. La proteína "espicular" VP4 puede unirse a VP6 y, por lo tanto, existe la posibilidad de que puedan añadirse a las estructuras de RLP. Se intentó la clonación con VP7, pero los problemas de toxicidad para las células huésped demostraron ser un problema. Agrobacterium de VP7 recombinante eliminó las células de la hoja un día después de la infiltración. Se intentaron varios procedimientos para evitar esto, como infiltrar plantas a una temperatura baja de 17 °C e infiltrar después del día 3 y/o el día 5 de las pruebas de contrarreloj. Como tal, la VP7 se omitió en los estudios de coexpresión debido a su naturaleza tóxica en las plantas de tabaco.
Extracción de proteínas
Se recogieron hojas enteras o dos discos de hojas por construcción y se molieron en nitrógeno líquido. La materia de la hoja molida se resuspendió en PBS estéril que contenía el Inhibidor de Proteasa Completo (libre de EDTA, Roche). Esto se centrifugó entonces durante 5 minutos a 13000 rpm y los sedimentos (materia foliar vegetal) se descartaron. A continuación, se mezclaron 100 pl de cada construcción con tampón de carga de SDS-PAGE 5X y se hirvieron durante 2 min a 95 °C, listos para un análisis adicional en geles de SDS-PAGE y transferencias western. El resto de las muestras se almacenó a -20 ° C para un uso futuro. La Figura 4 muestra una descripción general del procedimiento de clonación e infiltración para el ADNc de rotavirus.
Extracción de proteína de apoplasto
Se llevó a cabo un procedimiento de extracción adicional en las construcciones de apoplasto pTRAkc-A. El apoplasto es el espacio difusional libre entre la membrana plasmática y las paredes celulares de las células vegetales (Figura 5a). Las proteínas expresadas en el citoplasma tienen una secuencia de exportación que las dirige al apoplasto, por lo que se acumulan aquí. En el procedimiento de extracción que siguió, las hojas enteras de cada día de extracción se infiltraron al vacío o por inyección con PBS estéril que contenía el inhibidor de proteasa completo. Para la infiltración al vacío, las hojas individuales de la planta se suspendieron en PBS y se pusieron al vacío a 100 mbar durante 10 min en un tanque de vacío. Después, las hojas se enrollaron y se colocaron suavemente en columnas de centrifugación (similares a las columnas centrifugación de Qiagen) con un orificio en el fondo (Figura 5b2). Los orificios permiten un fácil paso del fluido desde las hojas sin permitir el paso de la material foliar sólido. Las columnas de centrifugación se colocaron en tubos Eppendorf de 2 ml y la centrifugación se llevó a cabo a 4000 rpm durante 15 minutos (Figura 5 b3). El filtrado se recogió y se añadió colorante de carga de proteínas para geles SDS-PAGE y se añadió análisis de transferencia Western a 100 pl de cada muestra de filtrado.
Transferencias Western y tinciones Coomassie
Se usaron transferencias Western y geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie como se ha descrito previamente. Se usaron anticuerpo VP6 anti-rotavirus de ratón (US Biologicals) (1:5000), anticuerpo histidina tag anti-ratón (Sigma®) (1:2000), y suero anti-VP2 de pollo y anti-VP4 de pollo (1:2000) para probar cada una de las proteínas respectivas en transferencias Western. Se usaron geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie para cuantificar proteínas mediante barrido de densidad de bandas usando un Sistema de Documentación de Gel Syngene.
Microscopía de electrones
Para determinar si las proteínas expresadas se ensamblaron en las RLP, se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) de partículas inmuno-atrapadas el día 3 de expresión de VP6, VP2/6 y VP2/6/4 expresadas en el citoplasma, todo en presencia de un supresor del silenciamiento Nss. Se colocaron rejillas de carbono/cobre de descarga luminiscente sobre 20 pl de anticuerpo VP6 anti-rotavirus de ratón (1:5000) durante 5 minutos y luego se lavaron 3 veces con agua destilada estéril. A continuación, las rejillas se colocaron en 10 pl de los extractos proteicos y se dejaron durante 2 minutos antes de lavarse nuevamente 3 veces con agua destilada estéril. Finalmente, las rejillas se hicieron flotar sobre 20 pl de acetato de uranilo al 2% durante 1 minuto antes de visualizarse bajo un TEM (microscopio de electrones de transmisión con filtro de energía Zeiss 912 OMEGA, University of Cape Town).
Para muestras aisladas de gradientes de sacarosa, la sacarosa primero tuvo que ser eliminada por diálisis antes del atrapamiento inmunitario en las rejillas de cobre. Si no se elimina, los cristales de sacarosa inhiben la visión definitiva de las muestras bajo el TEM ya que forma cristales en las rejillas, lo que altera la estructura del carbono y el material unidos. Las fracciones de sacarosa se colocaron en casetes de diálisis de 10 000 MW y se dializaron en PBS estéril que contenía NaCl 0,4 M durante 4 horas antes de intercambiar el tampón y dejarlas durante una noche a 4 °C con agitación. Dado que el volumen aumenta con la diálisis, las muestras de proteína requieren concentración. Las muestras se liofilizaron al vacío durante 3 horas y se resuspendieron en 2 ml de PBS estéril, listas para análisis adicionales.
Purificación por gradiente de sacarosa de RLP
Los extractos de proteína vegetal se filtraron inicialmente a través de miracloth para eliminar la materia sólida de la planta. Se establecieron gradientes de sacarosa del 10 al 60% de sacarosa en tubos de 40 ml creando cada uno seis capas de 5 ml de sacarosa disuelta en PBS estéril (pH 7,4). A continuación, se cargaron muestras de proteínas aclaradas en volúmenes de 5 a 10 ml en la parte superior de cada columna de gradiente.
Se llevó a cabo una ultracentrifugación a 150000 g (rotor de cubeta oscilante SWTi28, Beckman Coulter) a 4 °C durante 1 h 30 min. Al final de la centrifugación, se recogieron fracciones de 2 ml del fondo de cada columna mediante punción de tubo. Se realizaron a continuación Dots blots para determinar fracciones con proteínas de interés. Para cada fracción, se cargó 1 pl de muestra en una rejilla sobre una membrana de nitrocelulosa, que luego se bloqueó con tampón de bloqueo BSA. El análisis de transferencia Western se realizó entonces como de costumbre. Las proteínas se probaron con anticuerpo anti-VP6 de ratón (1:5000) contra VP6 o suero de pollo anti-VP2 y VP4 (1:5000) para las otras dos proteínas.
Ensayo de proteína soluble total
La proteína soluble total (TSP) se determinó mediante ensayos de Bradford. Esto se llevó a cabo para comparar los niveles de proteínas acumuladas en la VP2/6 acumulada en el citoplasma. La proteína IgG (1,43 mg/ml de reserva) se usó en una serie de dilución como patrón. Se añadieron 5 pl de estándar y muestras a una placa de microtitulación limpia y seca. Los reactivos de proteína soluble total A y B se añadieron según las instrucciones del fabricante (ensayo de proteína Bio-Rad Dc). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las lecturas de absorbancia se registraron a 750 nm usando un lector de microplacas (Bio-tek PowerWave XS).
Resultados
Expresión de VP6 en compartimentos de células foliares vegetales
VP6 se expresó y se dirigió a todos los compartimentos celulares (Figura 6; (la línea marca VP6, a ~42 kDa)), con y sin el supresor de silenciamiento. En el citoplasma, la proteína se expresó desde el primer día de la prueba de contrarreloj, con un aumento de la acumulación de proteínas en el citoplasma durante la prueba de una semana (Figura 6a). En el RE, la acumulación de proteínas se observó claramente en el día 3 solamente (Figura 6b). La proteína se procesó a un tamaño de banda mayor (aproximadamente 11 kDa más) que las otras proteínas. Esto puede ser resultado de la adición de la etiqueta 6 histidina al extremo C-terminal de la proteína, así como el sitio de escisión (véase la secuencia de vector pProEx)
La acumulación de proteína en los cloroplastos ocurrió entre los días 1 y 3 (Figura 6 "cloroplastos"). El supresor del silenciamiento tuvo un efecto sobre las proteínas ya que no se detectaron proteínas en su ausencia. No hubo expresión de proteína en los días 5 y 7. El apoplasto, al igual que en el Re , tuvo la mejor acumulación de proteína entre los días 3 y 5 de prueba de contrarreloj (Figura 6 "apoplasto") y ninguna el día 1 y día 7. El supresor de silenciamiento tuvo un efecto positivo especialmente el día 3, lo que dio como resultado niveles de detección de proteína más altos en comparación a cuando se omitió. También se puede observar que son visibles dos bandas en la marca ~40 kDa, probablemente como resultado de la escisión de la etiqueta de señalización en la proteína VP6.
El RE, los cloroplastos y el apoplasto mostraron la mayor expresión de proteína el día 3, acumulando la mayor cantidad de proteína en presencia del supresor de silenciamiento. El citoplasma fue el mejor en términos de acumulación de proteína, ya que mostró una alta y creciente expresión de proteínas a lo largo de la prueba de contrarreloj.
Expresión de proteínas de rotavirus marcadas con histidina en el citoplasma
Las cuatro VP de rotavirus se clonaron en un vector adicional, pTRAc-HT. Este vector incluye una etiqueta de 6histidina para proteínas dirigidas al citoplasma y facilita la detección mediante el uso de un anticuerpo antihistidina tag si los anticuerpos para las proteínas de interés no están disponibles. En este caso, solo VP6 tiene un anticuerpo comercialmente disponible y, por lo tanto, se probó este procedimiento para la detección temprana de todas las proteínas mientras se esperaba el suero. El citoplasma también funcionó bien para la expresión de VP6 y motivó la prueba de las demás proteínas.
Los resultados de transferencia Western de los extractos del día 3 de una prueba de contrarreloj de 7 días mostraron una expresión exitosa de VP2, VP4 y VP6 (Figura 7a). Para obtener la expresión de VP7 en plantas, se probaron varias técnicas. Sin embargo, las plantas infiltradas con VP7 mostraron hojas amarillentas desde el día 1 y se marchitaron durante el transcurso de la prueba de contrarreloj (Figura 7b). No se detectó expresión de proteína en estas condiciones, ni siquiera después del día 1 de infiltración cuando la planta aún parecía que estaba razonablemente bien.
Expresión de VP2 y VP4 en plantas
VP2 y VP4 se infiltraron en hojas de plantas de N. benthamiana y se dirigieron al RE, el cloroplasto, el citoplasma y el apoplasto. No se pudo expresar VP2 dirigido al vector apoplasto ya que no se pudo obtener ningún clon positivo en E. coli. Sin embargo, la proteína se expresó con éxito y se dirigió a los otros 3 compartimentos (Figura 8a). Se usó suero anti-VP2 y anti-VP4 de pollo (1:2000) en el análisis de transferencia Western de extractos. Las bandas VP2 y VP4 eran visibles justo debajo de la marca de 100 kDa (banda de proteína indicada por la flecha) como se en la Figura 8a y 8b, respectivamente. La expresión pareció ser la mejor en el citoplasma y el RE para VP2, mientras que para VP4, en el citoplasma y el apoplasto. El supresor de silenciamiento no tuvo ningún efecto significativo sobre la expresión de proteínas. Solo aumentó ligeramente la expresión en la construcción de VP2 en el RE y no tanto en el resto, como se puede ver en la transferencia Western. Las construcciones de VP4 se expresaron todas en presencia del supresor del silenciamiento.
Coexpresión de VP2/6 y VP2/6/4 en el citoplasma
El citoplasma pareció ser el mejor para la expresión de la proteína de la cápside de rotavirus y mostró las mayores eficiencias de extracción. Por lo tanto, todos los trabajos de expresión adicionales se realizaron con proteínas dirigidas al citoplasma.
Se ha demostrado que VP2 y VP6 forman RLP con respuestas inmunogénicas protectoras en ratones y, por lo tanto, se investigó la coexpresión de VP2/6 y VP2/6/4 en el citoplasma. Los extractos del día 3 de VP2/6/4 coexpresado se detectaron mediante transferencia Western con suero anti-VP2 y VP4 (1/5000) y anticuerpo anti-VP6 de ratón (1:5000) (Figura 9). La expresión de VP6 fue muy alta como se determinó previamente, pero la expresión de VP2 y VP4 fue muy baja, como puede verse en la banda muy débil en la marca de 100 kDa. Esto puede haberse atribuido a la coexpresión que dio lugar a que se utilizaran más recursos de células huésped en la sobreexpresión de VP6, dejando menos para VP2 y/o VP4. Tampoco fue fácil determinar si la banda detectada era tanto VP2 como VP4 o ninguna de las 2 proteínas. La banda muy visible que transcurre por encima de 130 kDa puede ser por proteínas VP6 dimerizadas. La banda visible en la marca de 55 kDa es probablemente la abundante enzima vegetal Rubisco.
Se llevaron a cabo análisis por microscopía electrónica de transmisión en la VP6 expresada en citoplasma, así como en VP2/6 y VP2/6/4 co-expresadas, para verificar las partículas de proteína y las RLP ensambladas (Figura 10). Esto también determinó si VP2 y/o VP4 realmente se coexpresaron con éxito. VP6, cuando se expresa en solitario, se ensambla para formar vainas de proteína según lo indicado por la flecha en la Figura 10b. En la adición VP2, las partículas se ensamblaron para formar RLP (Figura 10c). VP2 actúa como una proteína de andamiaje que permite que otras proteínas se ensamblen y finalmente formen una estructura completa de rotavirus. VP6 como tal estaba vinculado a VP2, pero aún no era fácil determinar estructuras de VP4 en VP2/6/4 coexpresado. La micrografía electrónica en la Figura 10d pueden ser partículas VP2/6 puramente ensambladas. Sin embargo, se ha demostrado que VP4 se une a VP6 durante el ensamblaje de la proteína, y esto ocurre antes de que se una VP7. Es probable que estas estructuras de VP4 no sean estables y puedan caerse de la estructura de RLP durante los procedimientos de preparación para microscopía electrónica.
Purificación por gradiente de sacarosa de VP2/6 y VP2/6/4
Se purificaron VP2/6 y VP2/6/4 en un gradiente de sacarosa que variaba del 10 al 60% de sacarosa (Figura 11a). Se recogieron fracciones de 2 ml del fondo de cada uno de los tubos y se probaron con anticuerpo anti-VP6 de ratón y/o suero anti-VP2 de pollo y VP4 para determinar qué fracciones contenían las proteínas. Para VP2/6, se encontraron proteínas en las fracciones 16 y 17 ya que éstas eran positivas para la proteína VP6 en la transferencia (Figura 11b). El análisis de transferencia de VP2/6/4 con suero de pollo anti-VP2 y VP4 mostró resultados positivos en todas las fracciones. Esto puede haber sido como resultado de los altos niveles de detección de proteína de fondo por el suero de pollo. Sin embargo, la intensidad de los puntos fue mayor en las fracciones 17 y 18 como se ve en la Figura 11c, posiblemente debido a una mayor concentración de las proteínas de interés en estas fracciones.
Al juntar estos resultados (Figuras 11b y 11c), las proteínas de rotavirus estaban en fracciones que variaban de 16 a 20.
Transferencias Western y tinciones Coomassie de fracciones
Se realizó una transferencia Western y SDS-PAGE de VP2/6 coexpresada para verificar la presencia de proteínas VP2 y VP6 en las fracciones 13 a 20. El análisis de transferencia Western para la proteína VP6 probada con anticuerpo anti-VP6 de ratón fue positiva en las fracciones 16 hasta el 20 (Figura 12a, flecha inferior y Figura 12c). La proteína VP2 probada con suero anti-VP2 de pollo se detectó en las fracciones 17 a 20 (Figura 12a, flecha superior). Se ha demostrado que VP2 se expresa menos que VP6 en estudios de coexpresión anteriores y esto también se mostró aquí Figura 12a en la que las bandas de proteína VP2 tienen una intensidad menor en comparación con VP6.
Las fracciones 16 y 17 de VP2/6 coexpresada que determinó previamente que contenía proteína VP6 por dot blots (Figura 11b) se sometieron a electroforesis en un gel SDS-PAGE. Se incluyó una proteína de concentración conocida, VP6 expresada en células de insecto SF9 (0,91 pg/pl) para determinar la concentración de proteínas en bruto VP2/6 (Figuras 11b y c). Esto se hizo mediante el barrido de densidad de la banda de proteína en bruto (carril etiquetado como en bruto) usando un Sistema de Documentación de Gel Syngene y en consecuencia se pudo determinar la cantidad de VP2/6 por kilogramo de materia foliar. Se encontró que el rendimiento de proteína era de aproximadamente 1,54 g/kg de peso en fresco (FW). Se obtuvieron 1,1 mg de RLP purificadas a partir de 1 gramo de material vegetal (1,1 g/kg).
Ensayo de proteína soluble total de VP2/6
La proteína soluble total (TSP) se determinó en las fracciones de VP2/6 coexpresadas para determinar las cantidades relativas de proteína VP2/6 (Figura 13). Las concentraciones de proteína se calcularon como 0,538 mg/ml y 1,012 mg/ml para las fracciones 17 y 18 respectivamente con el uso de un estándar de IgG (Figura 13a). Las bandas de proteína correspondientes a VP2/6 en estas fracciones se calcularon por barrido de densidad en un Sistema de Documento de Gel Syngene y se encontró que eran aproximadamente 0,108 mg/ml y 0,202 mg/ml, respectivamente.
Por lo tanto, la TSP para VP2/6 en las fracciones 17 y 18 era en ambas TSP aproximadamente al 20%. La mayoría de las RLP en la columna de sacarosa se encontraron entre el 15 y el 25% de sacarosa, correspondiente con las fracciones 15 a aproximadamente 20, donde se observa que el gráfico de repente alcanza su punto máximo y luego disminuye. Las diferencias en la densidad de los diversos materiales en el extracto permitieron separar y, de este modo purificar las proteínas de interés. Los geles SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie mostraron solo una banda prominente que indicaba que las proteínas son relativamente puras (Figura 12b).
TEM de VP2/6 purificada
Las fracciones de VP2/6 purificadas se agruparon juntas y se dializaron en PBS con alto contenido de sal para eliminar la sacarosa antes de visualizarse en un microscopio electrónico de transmisión. Se realizó TEM para determinar la pureza y comprobar si las RLP se mantuvieron intactas después del procedimiento de purificación. Como se puede ver en la Figura 15, la mayor parte del material de fondo, que consistía principalmente en los productos de la célula huésped (Figura 10b, c y d), se eliminó, dejando atrás las RLP. La mayoría de las RLP permanecieron intactas, pero algunas parecían haber perdido forma probablemente como resultado de la deformación debido a las condiciones en la rejilla EM.
Análisis preliminar de la expresión de proteínas estructurales de rotavirus en hojas de N. benthamiana
Este análisis preliminar se centró en la expresión de las proteínas estructurales de rotavirus VP2 (SEQ ID NO: 1), VP4 (SEQ ID NO: 2), VP6 (SEQ ID NO: 3) y VP7 (SEQ ID NO: 4) en hojas de N. benthamiana como un ejemplo del sistema de expresión del huésped. La cepa de rotavirus seleccionada aquí fue una cepa G9 P[6] que circula predominantemente en Sudáfrica y otras regiones subsaharianas. Una vacuna RLP dirigida a esta cepa ayudaría a aliviar la carga de enfermedad en el África subsahariana.
Se usó un sistema de expresión transitoria mediado por Agrobacterium en este análisis. La expresión transitoria, a diferencia de la expresión transgénica, permite la expresión rápida de proteínas en un tiempo relativamente corto, sin la integración de los genes de la proteína de la cápside del rotavirus en el cromosoma del huésped. La mayoría de las proteínas se expresaron y se acumularon en cantidades detectables el día 3 de la infiltración de Agrobacterium recombinante en hojas de N. benthamiana. Como se muestra a continuación, se observó la expresión exitosa de varias proteínas estructurales de rotavirus que incluyen VP2, VP4 y VP6 en compartimentos de células foliares de plantas como se detalla en la tabla 2 :
Tabla 2: Expresión de proteínas VP de rotavirus en varios compartimentos de células foliares
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La expresión de la glucoproteína VP7 no se observó posiblemente debido a sus efectos tóxicos sobre las células vegetales. Cabe la pena señalar que para este estudio preliminar, se utilizó una VP7 que contenía su péptido señal nativo. La infiltración el día 3 durante los ensayos de coexpresión también se intentó. Esto se intentó para ver si la proteína se expresó y poco después se ensambló con VP2 y VP6 para formar RLP. La naturaleza tóxica de VP7 recombinante como se observó en este estudio se ha descrito previamente (Williams et al., 1995; McCorquodale, 1987; Arias et al., 1986).
Se han publicado estudios de expresión de VP7 anteriores en patatas transgénicas (Li et al., 2006, Choi y col., 2005, Wu et al., 2003). Choi et al. (2005) usaron una VP7 de rotavirus de simio, y Li et al. y Wu et al. (Li et al., 2006; Wu et al., 2003) utilizaron VP7 de G1 humano del grupo A. El resultado descrito en la presente memoria usó VP7 de G9 de rotavirus humano.
VP2 se expresó y se dirigió a todos los compartimentos, excepto al apoplasto, ya que no se pudo clonar el ADNc apropiado, y las limitaciones de tiempo solo permitieron algunos intentos antes de continuar con las demás construcciones. Se observó que los niveles de expresión de VP2 eran significativamente bajos en todos los compartimentos. En un estudio anterior citado por Saldana et al. 2006, se concluyó que una VP2 que tiene su secuencia optimizada para la expresión en la planta es imposible de expresar, a pesar de que se detecta ARNm en las células vegetales. Sin embargo, lograron expresarlo en las células de la planta del tomate con ADN sintético. La razón de la dificultad en la expresión de VP2 es muy probablemente como resultado de una traducción incorrecta de ARNm o porque el ARNm contiene algunos motivos de secuencia que desestabilizan las células de la planta (Kawaguchi y Bailey-Serres, 2002). Se han observado pruebas de bajos niveles de expresión de VP2 en comparación con VP6 en estudios de expresión de plantas e insectos por Mena et al. (2006), Saldana et al. (2006), Vieira et al. (2005), y Labbé et al. (1991).
La proteína de la cápside externa, VP4, que forma picos en la superficie de la estructura del virión, se expresó y se dirigió para su acumulación en el citoplasma, RE y apoplasto. No se detectó acumulación de proteínas en los cloroplastos. Como se observó para VP2, los niveles de expresión de proteínas para VP4 fueron menores que los observados para VP6 en transferencias Western. La proteína tiene un sitio de escisión de tripsina que da como resultado dos proteínas, VP5 y VP8. Es posible que la tripsina local en hojas de N. benthamiana escinda algunas de las proteínas a medida que se producen, dando como resultado niveles de concentración más bajos de VP4 intacta y acumulada en los compartimentos designados. Se ha demostrado que la proteína es un antígeno neutralizante principal pero ha habido algunos intentos de clonar la proteína completa para el desarrollo de vacunas (Khodabandehloo et al., 2009; Mahajan et al., 1995; Nishikawa et al., 1989). Sin embargo, se han realizado varios estudios en el sistema de expresión de células de insectos y levaduras que muestran la expresión de las subunidades VP5 o VP8 de VP4 (Andrés et al., 2006; Favacho et al., 2006; Kovacs-Nolan et al., 2001). Hasta la fecha, el presente estudio representa el primer estudio que muestra la expresión de la proteína completa en un sistema de expresión vegetal.
Se expresó VP6 en todos los compartimentos observándose una sobreexpresión en el citoplasma con acumulación de proteínas observada desde el día 1 al día 7 en este compartimento. Esto es contrario a determinada bibliografía, que sugiere que la actividad de la proteasa y el silenciamiento génico reducen o dificultan la acumulación de proteína extraña en el citoplasma (Fischer et al., 2004). Además, dadas las condiciones correctas de pH, se sabe que VP6 se autoensambla en partículas tubulares o helicoidales, al igual que las partículas observadas en este estudio (Figura 9b) (Estes et al., 1987). La VP6 constituye aproximadamente el 50% del núcleo viral y, por lo tanto, es un antígeno principal en el desarrollo de una vacuna contra rotavirus. El resultado obtenido anteriormente permitió investigar más a fondo la coexpresión de VP2, VP6 y VP4 en el citoplasma.
Cuando se coexpresan en el citoplasma, VP2 y VP6 se ensamblan para formar RLP. Se observaron rendimientos proteicos muy altos del sistema de expresión transitoria de entre 1,27 - 1,54 g/kg de FW. Cuando se purificó en una columna de sacarosa, la cantidad de VP retenida fue de 1,1 g/kg de peso corporal. Este rendimiento es comparable al obtenido para la producción de un anticuerpo, IgG, usando un sistema de expresión transitoria en N. benthamiana, con un rendimiento de hasta 1,5 g/kg de FW (Vézina et al., 2009). Saldana et al. (2006) fueron hasta ahora el único grupo que se sabe que han co-expresado con éxito VP2 y VP6 de rotavirus en plantas de tomate transgénicas y con niveles de aproximadamente el 1% de proteína soluble total. El ensamblaje de VP2/6 en el sistema de expresión de células de insectos ha sido bien documentado (Vieira et al., 2005; O'Brien et al., 2000). También se ha demostrado que estas RLP VP2/6 proporcionan inmunidad protectora contra la infección por rotavirus (Zhou et al., 2011, Saldana et al., 2006). Por lo tanto, las RLP VP2/6 que se produjeron en el sistema de expresión vegetal son candidatas adecuados para el desarrollo de una subunidad de vacuna contra rotavirus.
VP2/6/4 también se coexpresaron y se detectaron. El primer pico visible (Figura 14, fracción 16) en la lectura de absorbancia de proteína total de las proteínas coexpresadas podría ser VP2/6/4 ensamblado, pero al examinar esta fracción bajo un TEM, no se detectaron RLP. El pico de proteína observado puede ser resultado una acumulación de monómeros de VP4 o sus respectivas subunidades VP5 y VP8. El segundo pico (fracción 18), cuando se examinó bajo un TEM, mostró estructuras de RLP muy similares a las observadas en la muestra de VP2/6. Sin embargo, Crawford et al han informado previamente que VP4 no se podía ver bajo TEM, y que las partículas VP2/6/4 y VP2/6/4/7 tenían una estructura y diámetro similares bajo TEM (Crawford 1994). Se hizo la misma observación para las RLP VP2/6/7, RLP VP 2/6/4/7 y RLP VP2/6, que parecían todas similares bajo un TEM estándar.
Ejemplo 2
Construcciones
A-2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (Construcción número 1710)
Una secuencia optimizada que codifica VP 2 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en un sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP2 se amplificó usando los cebadores IF-WA_VP2(opt).s1+3c (Figura 17A, SEQ ID NO: 21) e IF-WA_VP2(opt).s1-4r (Figura 17B, SEQ ID NO: 22), usando una secuencia génica de VP2 optimizada (Figura 19, SEQ iD NO: 45) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP2 (número de acceso de Genbank CAA33074) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción número 1191 (Figura 17C) se digirió con la enzima de restricción SaclI y Stul y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1191 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A la construcción resultante se le da el número 1710 (Figura 23, s Eq ID NO: 27). La secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 20 (SEQ ID NO: 25). Una representación del plásmido 1710 se presenta en la Figura 21.
B-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP2(opt)/NOS en sistema de amplificación de BeYDV(m)+Replicasa (Construcción número 1711)
Una secuencia optimizada que codifica VP 2 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprendía el sistema de amplificación BeYDV(m)+replicasa en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP2 se amplificó usando los cebadores IF-WA_VP2(opt).s1+3c (Figura 17a , SEQ ID NO: 21) e IF-WA_VP2(opt).s1-4r (Figura 17B, SEQ ID NO: 22), usando una secuencia génica de VP2 optimizada (SEQ ID NO: 45) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP2 (número de acceso de Genbank CAA33074) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación de BeYDV(m) usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción 193 (Figura 22A) se digirió con la enzima de restricción SaclI y Stul y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 193 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m). También incorpora una construcción génica para la co­ expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 22B (SEQ ID NO: 23). 26). A la construcción resultante se le da el número 1711 (Figura 23, SEQ ID NO: 27). La secuencia de aminoácidos de VP2 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 20 (SEQ ID NO: 25). Una representación del plásmido 1711 se presenta en la Figura 24.
C-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (Construcción número 1713)
Una secuencia optimizada que codifica VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en un sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP6 se amplificó usando los cebadores IF-WA_VP6(opt).s1+3c (Figura 25a, SEQ ID NO: 28) e IF-WA_VP6(opt).s1-4r (Figura 25b, SEQ ID NO: 29), usando una secuencia génica de VP6 optimizada (SEQ ID NO: 46) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP6 (número de acceso de Genbank AAA47311) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción número 1191 (Figura 17c) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1191 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A la construcción resultante se le da el número 1713 (Figura 25c, SEQ ID NO: 30). La secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 26 (SEQ ID NO: 31). Una representación del plásmido 1713 se presenta en la Figura 27.
D-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS en sistema de amplificación de BeYDV(m)+Replicasa (Construcción número 1714)
Una secuencia optimizada que codifica VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se clonó en 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprendía el sistema de amplificación BeYDV(m)+replicasa en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP6 se amplificó usando los cebadores IF-WA_VP6(opt).s1+3c (Figura 25a, SEQ ID NO: 28) e IF-WA_VP6(opt).s1-4r (Figura 25b, SEQ ID NO: 29), usando una secuencia génica de VP6 optimizada (SEQ ID NO: 46) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP6 (número de acceso de Genbank AAA47311) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación de BeYDV(m) usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción 193 (Figura 22A) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 193 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m). También incorpora una construcción génica para la co­ expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 22B (SEQ ID NO: 23). 26). A la construcción resultante se le da el número 1714 (Figura 28, SEQ ID NO: 32). La secuencia de aminoácidos de VP6 de la cepa WA de Rotavirus A se presenta en la Figura 26 (SEQ ID NO: 31). Una representación del plásmido 1714 se presenta en la Figura 29.
C-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (Construcción número 1730)
Una secuencia optimizada que codifica VP 4 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se clonó en 2X35S/CPMV-HT/NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP4 se amplificó usando los cebadores IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (Figura 30A, SEQ ID NO: 33) e IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (Figura 30B, SEQ ID NO: 34), usando la secuencia génica optimizada de VP4 (Figura 31B, (SEQ ID NO: 47) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP4 (número de acceso de Genbank AEX30660) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción número 1191 (Figura 18, SEQ ID NO: se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1191 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la (Figura 18, SEQ ID No : 23). A la construcción resultante se le da el número 1730 (Figura 31C, SEQ ID NO: 50). La secuencia de aminoácidos de VP4 de USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se presenta en la Figura 32 (SEQ ID NO: 36). Una representación del plásmido 1730 se presenta en la Figura 33A.
E-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS en sistema de amplificación de BeYDV(m)+Replicasa (Construcción número 1731)
Una secuencia optimizada que codifica VP 4 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se clonó en 2X35S/CPMV-HT/NOS que comprendía el sistema de amplificación BeYDV(m)+replicasa en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP4 se amplificó usando los cebadores IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c (Figura 30A, SEQ ID NO: 33) e IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r (Figura 30B, SEQ ID NO: 34), usando una secuencia génica de VP4 optimizada (SEQ ID NO: 47) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP4 (número de acceso de Genbank AEX30660) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un casete de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS en el sistema de amplificación de BeYDV(m) usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción 193 (Figura 22A) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 193 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT en el sistema de amplificación BeYDV(m). También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 22B (SEQ ID No : 23). 26 ). A la construcción resultante se le da el número 1731 (Figura 31, SEQ ID NO: 35). La secuencia de aminoácidos de VP4 de USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se presenta en la Figura 32 (SEQ ID NO: 36). Una representación del plásmido 1731 se presenta en la Figura 33B.
F-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (Construcción número 1733)
Una secuencia optimizada que codifica VP 7 con su péptido señal nativo de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se clonó en un sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP7 se amplificó usando los cebadores IF-Rtx_VP7(opt).s1+3c (Figura 34A, SEQ ID NO: 37) e IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (Figura 34B, SEQ ID NO: 38), usando una secuencia génica de VP7 optimizada (SEQ ID NO: 54) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP7 (número de acceso de Genbank AEX30682) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción número 1191 (Figura 17C) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1191 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A la construcción resultante se le da el número 1733 (Figura 34C, SEQ ID NO: 24). La secuencia de aminoácidos de VP7 con su péptido señal nativo de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se presenta en la Figura 35 (SEQ ID NO: 39). Una representación del plásmido 1733 se presenta en la Figura 36.
D-2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (Construcción número 1734)
Una secuencia optimizada que codifica VP 7 con una versión truncada del péptido señal nativo de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se clonó en un sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP7 se amplificó usando los cebadores IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c (Figura 44A, SEQ ID NO: 55) e IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (Figura 44B, SEQ ID NO: 56), usando la secuencia génica de VP7 optimizada (correspondiente a nt 88-891 de la Figura 44C, SEQ ID NO: 57) como plantilla. Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP7 (número de acceso de Genbank AEX30682) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en un sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción número 1191 (Figura 17C) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1191 es un plásmido aceptor destinado a la clonación "In Fusion" de genes de interés en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 18 (SEQ ID NO: 23). A la construcción resultante se le da el número 1734 (Figura 44D, SEQ ID NO: 58). La secuencia de aminoácidos de VP7 con el péptido señal truncado de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se presenta en la Figura 44E (SEQ ID NO: 59). Una representación del plásmido 1734 se presenta en la Figura 44F.
G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/RVA(WA) VP7(opt)/NOS en sistema de amplificación de BeYDV(m)+Replicasa (Construcción número 1735)
Una VP7 codificante de secuencia de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se clonó en un sistema de expresión 2X35S-CPMV-HT-PDISP-NOS en un plásmido que contenía el casete de expresión Plasto_pro/P19/Plasto_ter usando el siguiente procedimiento basado en PCR. Un fragmento que contenía la secuencia codificante de VP7 sin su péptido señal de tipo silvestre se amplificó usando los cebadores IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c (Figura 37A, SEQ ID NO: 40) e IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r (Figura 34B, SEQ ID NO: 38), usando una secuencia génica de VP7 optimizada (SEQ ID NO: 54). Para la optimización de la secuencia, la secuencia de la proteína VP7 (número de acceso de Genbank AEX30682) se tradujo de nuevo y se optimizó para el uso del codón humano, el contenido de GC y la estructura del ARNm. El producto de PCR se clonó en marco con el péptido señal PDI de la alfalfa en el sistema de expresión 2X35S/CPMV-HT/NOS usando el sistema de clonación In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). La construcción 1192 (Figura 38) se digirió con la enzima de restricción SacII y StuI y el plásmido linealizado se usó para la reacción de ensamblaje In-Fusion. La construcción número 1192 es un plásmido aceptor diseñado para la clonación "In Fusion" de genes de interés dentro del marco con un péptido señal PDI de alfalfa en un casete de expresión basado en CPMV-HT. También incorpora una construcción génica para la co-expresión del supresor de TBSV P19 del silenciamiento bajo el promotor génico de plastocianina de la alfalfa y el terminador. La cadena principal es un plásmido binario de pCAMBIA y la secuencia de los bordes de ADN-t de izquierda a derecha se presenta en la Figura 39 (SEQ ID NO: 41). A la construcción resultante se le da el número 1735 (Figura 40, SEQ ID NO: 42). La secuencia de aminoácidos de PDISP/VP7 de la cepa USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] de la vacuna contra Rotavirus A se presenta en la Figura 41 (SEQ ID NO: 43). Una representación del plásmido 1735 se presenta en la Figura 42.
Tabla 3. Descripción de genes sintetizados para la producción de RLP SEQ ID No Antígeno Cepa de origen Tipo de secuencia* Figura en la descripción 45 VP2 WA Optimizada 19B
46 VP6 WA Optimizada 25D
47 VP4 Rotarix Optimizada 31B
50 VP4 SA11 Tipo silvestre 43A
51 VP4 SA11 Optimizada 43B
54 VP7 Rotarix Optimizada 34E
53 VP7 SA11 Tipo silvestre 43D
52 VP7 SA11 Optimizada 43C
* Las secuencias optimizadas se modificaron para favorecer el uso de codones humanos preferidos y aumentar el contenido de GC.
Tabla 4. Descripción de la construcción ensamblada y ensayada para la producción de RLP.
Sistema de Sistema de Péptido SEQ ID del gen nstrucción expresión amplificación señal1" Antígeno (cepa)** usada para Co
PCR número CPMV HT RVA(WA) VP2
[optimizado] SEQ ID NO: 45 1710 CPMV HT Be YDV(m)+rep - RVA(WA
z )
ad V
o P
] 2 SEQ ID NO [optimi : 45 1711 CPMV HT RVA(WA) VP6
[optimizado] SEQ ID NO: 46 1713 CPMV HT Be YDV(m)+rep - RVA(WA) VP6
[optimizado] SEQ ID NO: 46 1714
CPMV HT - - RVA
[opt (
i R
m t
i x
z )
ad V
o P
] 4 SEQ ID NO: 47 1730 CPMV HT Be YDV(m)+rep - RVA(Rtx) VP4 S [optimizado] EQ ID NO: 47 1731 CPMV HT - WtSp RVA(Rtx) VP7
[optimizado] SEQ ID NO: 54 1733 CPMV HT - TrSp RVA(Rtx) VP7 SEQ [optimizado] ID NO: 54 1734 CPMV HT - SpPDI RVA(Rtx) VP7
[optimizado] SEQ ID NO: 54 1735 CPMV HT Be YDV(m)+rep WtSp RVA(Rtx)VP7 SEQ ID NO 54 1736[optimizado]
CPMV HT Be YDV(m)+rep TrSp RVA(Rtx)VP7
[optimiza SEQ ID NO 54 1737do]
CPMV HT Be YDV(m)+rep SpPDI RVA(Rtx) VP7 SEQ ID NO 54 1738 [optimizado]
CPMV HT - - RVA(SA11) VP4 SEQ ID NO 50 1760
CPMV HT Be YDV(m)+rep - RVA(SA11) VP4 SEQ ID NO 50 1761
CPMV HT RVA(SA11) VP4
[optimizado] SEQ ID NO 51 1770
CPMV HT Be YDV(m)+rep - RVA(SA11) VP4
[optimizado] SEQ ID NO 51 1771
CPMV HT - WtSp RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1763
CPMV HT - TrSp RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1764
CPMV HT - SpPDI RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1765
CPMV HT Be YDV(m)+rep WtSp RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1766
CPMV HT Be YDV(m)+rep TrSp RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1767
CPMV HT Be YDV(m)+rep SpPDI RVA(SA11) VP7 SEQ ID NO 53 1768
CPMV HT - WtSp RVA(SA11) VP7
[optimizado] SEQ ID NO 52 1773
CPMV HT - TrSp RVA(SA11) VP7
[optimizado] SEQ ID NO 52 1774
CPMV HT - SpPDI RVA(SA11) VP7
[optimizado] SEQ ID NO 52 1775
CPMV HT Be YDV(m)+rep WtSp RVA(
[opt S
im A
i 1
z 1
a )
d V
o] P7 SEQ ID NO 52 1776
CPMV HT Be YDV(m)+rep TrSp RVA(SA1l)
VP7[optimizado] SEQ ID NO 52 1777
CPMV HT Be YDV(m)+rep SpPDI RVA(SA11) VP7
[optimizado] SEQ ID NO 52 1778
t WtSp: Péptido señal de tipo salvaje, SpPDI: Péptido señal de origen vegetal, clonado a partir del gen disulfuro de isomerasa de proteína de alfalfa, TrSp: péptido señal truncado de tipo silvestre, TrSp comienza en 2° Met en WtSp (M30).
* [optimizada] significa que la secuencia se ha optimizado en función del uso de codones, contenido de GC y estructura del ARN.
Ejemplo 3
Ensamblaje de construcciones génicas y transformación de Agrobacterium
Se usaron todos los plásmidos, incluyendo los plásmidos 1710, 1713, 1730 y 1734, para transformar Agrobacterium tumefaciens (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, Estados Unidos) por electroporación (Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747), como alternativa, puede usarse choque térmico usando células competentes preparadas con CaCl2 (XU et al., 2008, Plant Methods 4). La integridad de los plásmidos en las cepas de A. tumefaciens creadas se confirmó por mapeo de restricción. La cepa de A. tumefaciens transformada con un plásmido binario dado se denomina AGL1/"número de plásmido". Por ejemplo, la cepa de A. tumefaciens transformada con el número de construcción 1710 se denomina "AGL1/1710".
Preparación de biomasa, inóculo, agroinfiltración, y cosecha de la planta
Las plantas de Nicotiana benthamiana se cultivaron a partir de semillas en llanos rellenados con un sustrato de musgo de turbera comercial. Las plantas se dejaron crecer en el invernadero bajo un fotoperiodo 16/8 y un régimen de temperatura de 25 °C día/20 °C noche. Tres semanas después de la siembra, las plántulas individuales se seleccionaron, se transplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales bajo las mismas condiciones ambientales.
Las Agrobacteria tranfectadas con cada construcción se cultivaron en un medio LB de origen vegetal y complementado con ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 10 mM (MES) y 50 pg/ml de kanamicina a pH 5,6 hasta que alcanzaron una DO600 entre 0,6 y 2,5. Las suspensiones de Agrobacterium se mezclaron para alcanzar la relación apropiada para cada construcción y se llevaron a 2,5X DO600 con medio de infiltración (MgCl210 mM y MES 10 mM pH 5,6). Las suspensiones de A. tumefaciens se almacenaron durante una noche a 4 °C. El día de la infiltración, los lotes de cultivo se diluyeron con medio de filtración en 2,5 volúmenes de suspensión y se dejaron calentar antes de su uso. Las plantas completas de N. benthamiana se colocaron al revés en la suspensión bacteriana en un tanque de acero inoxidable hermético a un vacío de 20-40 Torr durante 2 min. Tras la infiltración, las plantas se devolvieron al invernadero durante un periodo de incubación de 3-12 días hasta la cosecha. La biomasa cosechada se mantuvo congelada (-80 °C) hasta su uso para la purificación de partículas.
Extracción y purificación de partículas de tipo rotavirus
Las proteínas se extrajeron de biomasa congelada mediante extracción mecánica en un mezclador con 3 volúmenes de tampón de extracción (TNC: Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl210 mM). La suspensión se filtró a través de un filtro de nylon de poros grandes para eliminar los residuos grandes y se centrifugó 5000 g durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante se recogió y se centrifugó de nuevo a 5000 g durante 30 minutos (4 °C) para eliminar restos adicionales. El sobrenadante se filtró en profundidad y se ultrafiltró, y el filtrado se centrifugó a 75000 g durante 20 min (4 °C) para concentrar las partículas de tipo rotavirus. El sedimento que contenía las partículas se resuspendió en 1/12 de volumen de TNC y los productos insolubles se eliminaron con una centrifugación a 5000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se filtró en Miracloth antes de cargarse en gradientes de densidad de iodixanol.
La centrifugación en gradiente de densidad se realizó de la siguiente manera. Se prepararon tubos que contenían gradientes escalonados del 5% al 45% de iodixanol y se superpusieron con los extractos filtrados que contenían las partículas de tipo rotavirus. Los gradientes se centrifugaron a 120000 g durante 4 horas (4 °C). Después de la centrifugación, se recogieron fracciones de 1 ml desde el fondo hasta la parte superior y se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie y transferencia Western. Para eliminar el iodixanol para las fracciones seleccionadas para un análisis adicional, las fracciones seleccionadas se centrifugaron a 75000 g durante 20 minutos (4 °C) y las partículas sedimentadas se resuspendieron en tampón TNC recién preparado.
SDS-PAGE e inmunotransferencia
Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de proteínas BCA (Pierce Biochemicals, Rockport IL). Las proteínas se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras y se tiñeron con azul de Coomassie. Se escanearon los geles teñidos y se realizó un análisis de densitometría usando ImageJ Software (NIH).
Para la inmunotransferencia, las proteínas sometidas a electroforesis se electrotransfirieron en membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN). Antes de la inmunotransferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y Tween-20 al 0,1% en una solución salina tamponada con Tris (TBS-T) durante 16-18 h a 4 °C.
La inmunotransferencia se realizó por incubación con un anticuerpo adecuado (Tabla 5), en 2 pg/ml en leche desnatada al 2% en TBS-Tween 20 al 0,1%. Los anticuerpos secundarios usados para la detección de quimioluminiscencia fueron los indicados en la Tabla 5, diluidos como se indica en leche desnatada al 2% en TBS-Tween 20 al 0,1%. Los complejos inmunorreactivos se detectaron por quimioluminiscencia usando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation). La conjugación de enzima peroxidasa de rábano picante de anticuerpo IgG humano se llevó a cabo utilizando el kit de conjugación de peroxidasa activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL).
Tabla 5: Condiciones de electroforesis, anticuerpos y diluciones para la inmunotransferencia de antígenos de rotavirus.
Figure imgf000036_0001
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de anti-VP4
Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo en U con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-VP4 (amablemente proporcionado por el Profesor Koki Taniguchi) diluido 1:100000 en PBS 10 mM pH 7,4 (solución salina tamponada con fosfato), NaCl 150 mM durante 16-18 horas a 4 °C. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS 10 mM pH 7,4, NaCI 1 M que contenía Tween-20 al 0,1% y se bloquearon con BSA al 5% en PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM que contenía Tween-20 al 0,1% durante 1 hora a 37 °C. Después de la etapa de bloqueo, las placas se lavaron tres veces con PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 1 M que contenía Tween-20 al 0,1%. Se añadieron muestras y las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después, la placa se lavó 3 veces con PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 1 M, CaCl2 1 mM, MgCl20,5 mM que contenía Tween-20 al 0,1%. Para todas las etapas de lavado restantes, el tampón de lavado sigue siendo el mismo y durante el tercer lavado, las placas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de eliminar completamente la solución de lavado. Se añadió anticuerpo policlonal de conejo producido contra Rotavirus (amablemente proporcionado por el Profesor Koki Taniguchi) diluido 1:10000 con BSA al 3% en PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 0,5 mM que contenía Tween-20 al 0,1% y las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después, las placas se lavaron 3 veces y se añadió anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (111-035-144, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) diluido 1:5000 con BsA al 3% en PBS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl21 mM, MgCl20,5 mM que contenía Tween-20 al 0,1% y las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Las placas se lavaron 3 veces. Después de los lavados finales, las placas se incubaron con sustrato de peroxidasa SureBlue TMB (KPL, Gaithersburg, MD) durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de HCl 1 N y los valores A450 se midieron usando un lector de placas (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Producción de partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2 y VP6.
Las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2 y VP6 se produjeron por expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Las plantas se agroinfiltraron con un inóculo de Agrobacteria que contenía una mezcla de AGL1/1710 y AGL1/1713 en una proporción 1:1 y se incubaron durante 7 días antes de la cosecha. Las partículas de tipo rotavirus se purificaron a partir de la biomasa usando la metodología descrita en la sección de materiales y procedimientos. Después de la centrifugación de los extractos aclarados sobre el gradiente de densidad de iodixanol, las primeras diez fracciones del fondo del tubo se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. Como se muestra en la Figura 45A, los antígenos de rotavirus (VP2 y VP6 ) se encontraron principalmente en las fracciones 2 y 3 del gradiente de densidad donde la concentración de iodixanol es de aproximadamente el 35%, una concentración donde se espera que se encuentren partículas de tipo rotavirus. Se encontró muy poca contaminación por proteínas vegetales en estas fracciones. El análisis de transferencia Western de las fracciones con suero de conejo hiperinmune anti-rotavirus y anticuerpos policlonales de conejo anti-VP2 confirmó la identidad de VP2 y VP6 en las fracciones de gradiente de densidad (Figuras 45B y 45C). Las fracciones 2 y 3 se combinaron y el iodixanol se eliminó mediante centrifugación a alta velocidad y resuspensión, y las partículas purificadas se enviaron para su análisis por microscopía crioelectrónica (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar el ensamblaje de VP2 y VP6 en partículas que se parecen a la partícula de rotavirus. Como se muestra en la Figura 49 (panel izquierdo), las imágenes de microscopía crio-electrónica de las partículas VP2/VP6 confirmaron el ensamblaje correcto de los antígenos en partículas de tipo rotavirus.
Producción de partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP6 y VP7.
Las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP6 y VP7 se produjeron por expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Las plantas se agroinfiltraron con un inóculo de Agrobacteria que contenía una mezcla de AGL1/1710, AGL1/1713, AGL1/1734 en una proporción 1:1:1 y se incubaron durante 7 días antes de la cosecha. Las partículas de tipo rotavirus se purificaron a partir de la biomasa usando la metodología descrita en la sección de materiales y procedimientos. Después de la centrifugación de los extractos aclarados sobre el gradiente de densidad de iodixanol, las primeras diez fracciones del fondo del tubo se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. Como se muestra en la Figura 46A, los antígenos de rotavirus (VP2, VP6 y VP7) se encontraron principalmente en las fracciones 2 y 3 del gradiente de densidad donde la concentración de iodixanol es de aproximadamente el 35%, una concentración donde se espera que se encuentren partículas de tipo rotavirus. Se encontró muy poca contaminación por proteínas vegetales en estas fracciones. El análisis de transferencia Western de las fracciones con suero de conejo hiperinmune anti-rotavirus y anticuerpos policlonales de conejo anti-VP7 confirmó la identidad de VP6 y VP7 en las fracciones de gradiente de densidad (Figuras 46B y 46C).
Producción de partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP4, VP6 y VP7.
Las partículas de tipo rotavirus que comprenden VP2, VP4, VP6 y VP7 se produjeron por expresión transitoria en Nicotiana benthamiana. Las plantas se agroinfiltraron con un inóculo de Agrobacteria que contenía una mezcla de AGL1/1710, AGL1/1730, AGL1/1713, AGL1/1734 en una proporción 1:1:1:1 y se incubaron durante 7 días antes de la cosecha. Las partículas de tipo rotavirus se purificaron a partir de la biomasa usando la metodología descrita en la sección de materiales y procedimientos. Después de la centrifugación de los extractos aclarados sobre el gradiente de densidad de iodixanol, las primeras diez fracciones del fondo del tubo se analizaron mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. Como se muestra en la Figura 47A, 3 de los 4 antígenos de rotavirus (VP2, VP6 y VP7) fueron visibles y se encontraron principalmente en la fracción 3 del gradiente de densidad donde la concentración de iodixanol es de aproximadamente el 35%, una concentración donde se espera que se encuentren partículas de tipo rotavirus. Se encontró muy poca contaminación por proteínas vegetales en estas fracciones. Se esperaba la ausencia de un nivel detectable de VP4 en el gel de tinción Coomassie, ya que no se puede observar la VP4 cuando se realiza el mismo análisis en el virión de rotavirus humano purificado. El análisis de transferencia Western de las fracciones con suero de conejo hiperinmune antirotavirus y anticuerpos policlonales de conejo anti-VP7 confirmó la identidad de VP6 y VP7 en las fracciones de gradiente de densidad (Figuras 47B y 47C). El iodixanol se eliminó de la fracción 3 mediante centrifugación a alta velocidad y resuspensión, y las partículas purificadas se analizaron por ELISA para confirmar la presencia de VP4. Los resultados presentados en la Figura 48 muestran claramente que el ELISA reconoce específicamente VP4, ya que las partículas de control negativo que comprenden VP2/VP6 y VP7 solo dieron como resultado un nivel de señal de fondo. Por el contrario, el análisis de 3 lotes diferentes de partículas purificadas que comprenden los antígenos VP2, VP4, VP6 y VP7 mostró señales fuertes y uniformes cuando se analizaron en las mismas condiciones. Se enviaron RLP VP2/VP4/VP6/VP7 purificadas para el análisis por microscopía crioelectrónica (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) para confirmar el ensamblaje de los cuatro antígenos en partículas que se asemejan a la partícula de rotavirus. Como se muestra en la Figura 49 (panel derecho), las imágenes de microscopía crio-electrónica de las partículas VP2/VP4/VP6/VP7 confirmaron el ensamblaje correcto de los antígenos en partículas de tipo rotavirus.
La tabla 6 enumera las secuencias proporcionadas en diversas realizaciones de la invención.
Figure imgf000038_0001
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Referencias
Yang Y M, Li X, Yang H, et al. Immunogenicity and virus-like partióle formation of rotavirus capsid produced in transgenic plants. Sci China Life Sci, 2011, 54: 82-89
Angel, J., Franco, M.A. and Greenberg, H.B. (2007). Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations. Nature reviews: Microbiology 5, 529-539
Araujo, I.T., Ferreira, M.S.R. and Failho, A.M. (2001). Rotavirus genotypes [4]G9, P[6]G9, and P[8]G9 in hospitalized children with acute gastroenteritis in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol 391999-2001. Arias, C.F., Ballado, T. and Plebafiski, M. (1986). Synthesis of the outer-capsid glycoprotein of the simian rotavirus SA11 in Escherichia coli. Gene 47, 211-219
Au K.S., Mattion N.M., Estes M.K., (1993). A Subviral Particle Binding Domain on the Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NS28. Virology 194, 665-67
Balen B, Krsnik-Rasol M, (2007). N-glycosylation of recombinant therapeutic glycoproteins in plant systems. Food Technology and Biotechnology 451-10.
Bardor, M., Faveeuw, C., Fitchette, A.C., Gilbert,D., Galas, L., Trottein, F., Faye, L. and Lerouge P. (2003). Immunoreactivity in mammals of two typical plant glycoepitopes, core alpha (1,3)-fucose and core xylose. Glycobiology 13427-434
Berois, M., Sapin, C., Erk, I., Poncet, D. and Cohen, J. (2003). Rotavirus Nonstructural Protein NSP5 Interacts with Major Core Protein VP2. Journal of virology 77, 1757
Bertolotti-Ciarlet, A., Ciarlet, M., Crawford, S.E., Conner, M.E. and Estes, M.K. (2003). Immunogenicity and protective efficacy of rotavirus 2/6-virus-like particles produced by a dual baculovirus expression vector and administered intramuscularly, intranasally, or orally to mice. Vaccine 21, 3885-3900 Chen, J.Z., Settembre, E.C., Aoki, A.T., Zhang, X., Bellamy, A.R., Dormitzer, P.R., Harrison, S.C. and Grigorieff, N. (2009). Molecular interactions in rotavirus assembly and uncoating seen by high-resolution cryo-EM. PNAS 106, 10644-10648
Crawford, S.E., Estes, M.K., Ciarlet, M., Barone, C., O'Neal, C.M., Cohen, J. and Conner, M.E. (1999). Heterotypic protection and induction of a broad heterotypic neutralization response by rotavirus-like particles. Journal of Virology 73, 4813- 4822
Crawford, S.E., Labbe, M., Cohen, J., Burroughs, M.H., Zhou, Y.J. and Estes, M.K. (1994). Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. Journal of virology 68, 5945-5952
Denisova, E.R., Dowling, W., LaMonica, R., Shaw, R., Scarlata, S., Ruggeri, F. and Mackow, E.R. (1999). Rotavirus Capsid Protein VP5* Permeabilizes Membranes. Journal of Virology 733147-3153 Dennehy, P.H. (2007). Rotavirus vaccines - An update. Vaccine 25, 3137-3141
Estes M.K (1996). Rotavirus and their replication. Fields Virology 2, 1625-1655 Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F. and Burrone, O.R. (1999). Two nonstructural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. J Gen Virol 80333-9.
Favacho, A.R., Kurtenbach, E., Sardi, S.I. and Gouvea, V.S. (2006). Cloning, expression, and purification of recombinant bovine rotavirus hemagglutinin, VP8*, in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 46, 196-203
Gentsch, J.R., Laird, A.R., Bielfelt, B., Griffin, D.D., Bányai, K., Ramachandran, M., Jain, V., Cunliffe, N.A., Nakagomi, O., Kirkwood, C.D., Fischer, T.K., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Jiang, B. and Glass, R.I. (2005). Serotype Diversity and Reassortment between Human and Animal Rotavirus Strains: Implications for Rotavirus Vaccine Programs J Infect Dis. 192 , S146-59
Glass, R.I., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Turcios, R., Fischer, T.K., Widdowson, MA., Jiang, B. amd Gentsch, J.R. (2006). Rotavirus vaccines: current prospects and future challenges. Lancet 368, 323-32 Gonzalez, A.M., Nguyen, T.V., Azevedo, M.S. P., Jeong, K., Agarib, F., Iosef, C., Chang, K., LovgrenBengtsson, K., Morein, B. and Saif, L.J. (2004). Antibody responses to human rotavirus (HRV) in gnotobiotic pigs following a new prime/boost vaccine strategy using oral attenuated HRV priming and intranasal VP2/6 rotavirus-like particle (VLP) boosting with ISCOM. Clinical & Experimental Immunology 135361-372
Gonzalez, R.A., Espinosa, R., Romero, P., López, S. and Arias C.F. (2000). Relative localization of viroplasmic and endoplasmic reticulum-resident rotavirus proteins in infected cells. Archives of Virology 145, 1963-1973
Greenberg, H.B. and Estes, M.K. (2009). Rotaviruses: From Pathogenesis to Vaccination. Gastroenterology 136, 1939-1951
Hoshino, Y., Jones, R.W. and Kapikian, A.Z. (1998). Serotypic characterization of outer capsid spike protein VP4 of vervet monkey rotavirus SA11 strain. Archives of Virology 143, 1233-1244
Istrate, C., Hinkula, J., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J., Svensson, L. and Johansen, K. (2008). Parenteral administration of RF 8-2/6/7 rotavirus-like particles in a one-dose regimen induce protective immunity in mice. Vaccine 26, 4594-4601
Khodabandehloo, M., Shamsi, S.M., Shahrabadi, Keyvani, H. and Bambai, B. (2009). Cloning and Expression of Simian Rotavirus Spike Protein (VP4) in Insect Cells by Baculovirus Expression System. Iranian Biomedical Journal 139-18
Kim, Y., Nielsen, P.R., Hodgins, D., Chang, K.O. and Saif, L.J. (2002). Lactogenic antibody responses in cows vaccinated with recombinant bovine rotavirus-like particles (VLPs) of two serotypes or inactivated bovine rotavirus vaccines. Vaccine 20, 1248-1258
Kovacs-Nolan J., Erika Sasaki, Dongwan Yoo, Yoshinori Mine, Cloning and Expression of Human Rotavirus Spike Protein, VP8*, in Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications, 282, 1183-1188
Lawton, J.A., Estes, M.K. and Venkataram, P.B.V. (2000). Mechanism of genome transcription in segmented dsRNA viruses. Advances in Virus Research 55, 185-214
Lopez, T., Camacho M., Zayas M., Najera R., Sanchez R., Arias C. F. and Lopez S. (2005). Silencing the Morphogenesis of Rotavirus. Journal of Virology 79, 184-92
Lundgren, O. and Svensson, L. (2001). Pathogenesis of Rotavirus diarrhoea. Microbes and Infection 3 1145-1156
Madore, H.P., Estes, M.K., Zarley, C.D., Hu, B., Parsons, S., Digravio, D., Greiner, S., Smith, R., Jiang, B., Corsaro, B., Barniak, V., Crawford, S. and Conner, M.E. (1999). Biochemical and immunologic comparison of virus-like particles for a rotavirus subunit vaccine. Vaccine 17, 2461-2471
Marusic, C., Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C., Spada, M., Belardelli, F., Benvenuto, E. and Capone, I. (2001). Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology 75, 8434-8439.
Matsumura, T., Itchoda, N. and Tsunemitsu, H. (2002). Production of immunogenic VP6 protein of bovine group A rotavirus in transgenic potato plants. Archives of Virology 147, 1263-1270
Mena, J.A., Ramírez, O.T. and Palomares, L.A. (2006). Intracellular distribution of rotavirus structural proteins and virus-like particles expressed in the insect cellbaculovirus system. Journal of Biotechnology 122, 443-452
Meyer, J.C., Bergmann, C.C. and Bellamy, A.R. (1989). Interaction of rotavirus cores with the nonstructural glycoprotein NS28. Virology 171, 98-107
Molinari, P., Peralta, A. and Taboga, O. (2008). Production of rotavirus-like particles in Spodoptera frugiperda larvae. Journal of Virological Methods 147, 364-367
Nilsson, M., von Bonsdorff, C.H., Weclewicz, K., Cohen, J. and Svensson, L. (1998). Assembly of viroplasm and virus-like particles of rotavirus by a Semliki Forest virus replicon. Virology 242, 255-265 Nishikawa, K., Fukuhara, N., Liprandi, F., Green, K., Kapikian, A., Chanock, R. and Gorziglia, M. (1989).
VP4 protein of porcine rotavirus strain OSU expressed by a baculovirus recombinant induces neutralizing antibodies. Virology 173, 631-637
O'Brien, G.J., Bryant, C.J., Voogd, C., Greenberg, H.B., Gardner, R.C. and Bellamy, A.R. (2000). Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into virus-like particles. Virology 270, 444-453
Palombo, E.A. (1999). Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on the success of candidate vaccines. FEMS Microbiology Letters 181, 1-8
Palomares, L.A. and Ramirez, O.T. (2009). Challenges for the production of virus-like particles in insect cells: The case of rotavirus-like particles. BiochemicalEngineering Journal 45(3), 158-167
Peralta, A., Molinari, P. and Taboga, O. (2009). Chimeric recombinant rotavirus-like particles as a vehicle for the display of heterologous epitopes. Virology Journal 6, 192
Ramachandran, M., Kirkwood, C.D., Unicomb, L., Cunliffe, N.A., Ward, R.L., Bhan, M.K., Clark, H.F., Glass, R.I. and Gentsch, J.R. (2000). Molecular characterization of serotype G9 rotavirus strains from a global collection. Virology 278, 436-444
Ribes, J.M., Ortego, J., Ceriani, J., Montava, R., Enjuanes, L. and Buesa, J. (2011). Transmissible gastroenteritis virus (TGEV)-based vectors with engineered murine tropism express the rotavirus VP7 protein and immunize mice against rotavirus. Virology 410107-118
Rodriguez-Limas, W.A., Tyo, K.E.J., Nielsen, J., Ramírez, O.T. and Palomares, L.A. (2011). Molecular and process design for rotavirus-like particle production in Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact.
10, 33
Saldana, S., Esquivel Guadarrama, F., Olivera Flores Tde, J., Arias, N., Lopez, S., Arias, C., Ruiz-Medrano, R., Mason, H., Mor, T., Richter, L., Arntzen, C.J. and Gomez Lim, M.A. (2006). Production of rotavirus-like particles in tomato (Lycopersicon esculentum L.) fruit by expression of capsid proteins VP2 and VP6 and immunological studies. Viral Immunology 19, 42-53
Sanchez-Padilla, E., Grais, R.F., Guerin, P.J., Steele, A.D., Burny, M.E. and Luquero, F.J. (2009). Burden of disease and circulating serotypes of rotavirus infection in sub-Saharan Africa: systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases 9, 567-576.
Steele, A.D., Ivanoff, B. and African Rotavirus Network (2003). Rotavirus strains circulating in Africa during 1996-1999: emergence of G9 strains and P[6] strains. Vaccine 21, 361-367
Tian, P., Ball, J.M., Zeng, C.Q.Y. and Estes, M.K. (1996). The Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NSP4 Possesses Membrane Destabilization Activity. Journal of Vriology 70, 6973-6981 Thongprachum, A., Chaimongkol, N., Khamrin, P., Pantip, C., Mizuguchi, M., Ushijima, H. and Maneekarn, N. (2010). A novel multiplex RT-PCR for identification of VP6 subgroups of human and porcine rotaviruses, Journal of Virological Methods, 168, 191-196
Trabelsi, A., Peenze, I., Pager, C., Jeddi, M. and Steele, D. (2000). Distribution of Rotavirus VP7 Serotypes and VP4 Genotypes Circulating in Sousse, Tunisia, from 1995 to 1999: Emergence of Natural Human Reassortants. Journal of Clinical Microbiology 38, 3415-3419
Varani, G. and Allain, F.H-T. (2002). How a rotavirus hijacks the human protein synthesis machinery. Nature Structural Biology 9, 158 _ 160.
Vende, P., Taraporewala, Z.F. and Patton, J.T. (2002). RNA-Binding Activity of the Rotavirus Phosphoprotein NSP5 Includes Affinity for Double-Stranded RNA. Journal of Virology 76, 5291-5299. Vesikari, T., Karvonen, A., Korhonen, T., Espo, M., Lebacq, E., Forster, J., Zepp, F., Delem, A. and De Vos, B. (2004). Safety and immunogenicity of RIX4414 live attenuated human rotavirus vaccine in adults, toddlers and previously uninfected infants. Vaccine 22, 2836-2842
Vézina, L.-P., Faye, L., Lerouge, P., D'Aoust, M.-A., Marquet-Blouin, E., Burel, C., Lavoie, P.-O., Bardor, M. and Gomord, V. (2009), Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal 7, 442-455.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir una partícula de tipo rotavirus (RLP) en una planta, parte de una planta o célula vegetal, que comprende:
a) introducir un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7, y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus seleccionada de VP2, VP6 y VP7 en la planta, parte de una planta o célula vegetal, en el que la primera, segunda o tercera secuencia de nucleótidos que codifica la VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal, y en el que la RLP comprende VP2, VP6 y VP7; o
a) proporcionar una planta, parte de una planta o célula vegetal que comprende un primer ácido nucleico que comprende una primera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína estructural de rotavirus, un segundo ácido nucleico que comprende una segunda región reguladora activa en la planta unida operativamente a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína estructural de rotavirus y un tercer ácido nucleico que comprende una tercera región reguladora activa en la planta unida operativamente a una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína estructural de rotavirus en la planta, parte de una planta o célula vegetal; en el que la primera proteína estructural de rotavirus es VP2, la segunda proteína estructural de rotavirus es VP6 y la tercera proteína estructural de rotavirus es VP7, en la que VP7 comprende un péptido señal nativo truncado o un péptido señal no nativo de un polipéptido vegetal; y
b) incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en condiciones que permitan la expresión transitoria del primer, segundo y tercer ácido nucleico, produciendo de este modo la RLP.
2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que un cuarto ácido nucleico que comprende una cuarta región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína estructural de rotavirus se introduce en la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa a), y se expresa al incubar la planta, parte de una planta o célula vegetal en la etapa b), en el que la cuarta proteína estructural de rotavirus es VP4.
3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la primera proteína estructural de rotavirus es VP2, la segunda proteína estructural de rotavirus es VP6 y la tercera proteína estructural de rotavirus es VP7.
4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la planta, parte de una planta o célula vegetal está dotada de un cuarto ácido nucleico que comprende una cuarta región reguladora activa en la planta y unida operativamente a una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína estructural de rotavirus, en el que la cuarta proteína estructural de rotavirus es VP4.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de nucleótidos, o una combinación de las mismas, está unida operativamente a una región reguladora del virus del mosaico del caupí (CPMV).
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica VP2 comprende del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, o SEQ ID NO: 45, la secuencia de nucleótidos que codifica VP6 comprende del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:46, y la secuencia de nucleótidos que codifica VP7 comprende del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 o 57.
7. El procedimiento según las reivindicaciones 2 o 4, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica VP4 comprende del 80% al 100% de identidad con una secuencia de nucleótidos como se define por la SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50, o 51.
8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la VP2 está codificada por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 25, la VP6 está codificada por una secuencia de aminoácidos que comprende de 80% a 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 31 y en el que la VP7 está codificada por una secuencia de aminoácidos que comprende de 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 4, 39, 43 o 59.
9. El procedimiento según las reivindicaciones 2 o 4, en el que la VP4 está codificada por una secuencia de aminoácidos que comprende del 80% al 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 36.
10. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer, segundo y tercer ácido nucleico se introducen en la planta, parte de la planta o célula vegetal por agroinfiltración con un inóculo de Agrobacteria que comprende una mezcla del primer, segundo y tercer ácido nucleico en una relación de 1:1:1, en el que el primer, segundo y tercer ácido nucleico se expresan transitoriamente en la planta, y la planta es Nicotiana benthamiana.
11. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el primer, segundo, tercer y cuarto ácido nucleico se introducen en la planta, parte de la planta o célula vegetal por agroinfiltración con un inóculo de Agrobacteria que comprende una mezcla del primer, segundo, tercer y cuarto ácido nucleico en una relación de 1:1:1, en el que el primer, segundo, tercer y cuarto ácido nucleico se expresan transitoriamente en la planta, y la planta es Nicotiana benthamiana.
12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el uso de codones de la secuencia de nucleótidos se ajusta al uso de codones humanos preferidos, aumento del contenido de GC, o una combinación de los mismos.
13. El procedimiento según la reivindicación 1 o 4, en el que la primera, segunda y tercera secuencia de nucleótidos están unidas operativamente a un elemento potenciador de la traducción.
14. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el péptido señal no nativo es un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) de la alfalfa.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015128397A (ja) * 2014-01-08 2015-07-16 国立大学法人広島大学 亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、および、当該遺伝子を用いた出芽酵母の選択的培養方法
CN107208072A (zh) * 2015-01-23 2017-09-26 莫迪卡戈公司 在植物中产生轮状病毒样颗粒
EP3981782A1 (en) * 2015-05-21 2022-04-13 Xiamen University Truncated rotavirus vp4 protein and application thereof
US10548970B2 (en) 2015-10-05 2020-02-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human rotavirus G9P[6] strain and use as a vaccine
US11413346B2 (en) 2015-11-09 2022-08-16 Curevac Ag Rotavirus vaccines
MA44722A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Csir Vlp d'orbivirus chimériques produites par des plantes
GB201617480D0 (en) * 2016-10-14 2016-11-30 University Of Cape Town Production of soluble HIV envelope trimers in planta
JP2022521217A (ja) * 2019-02-19 2022-04-06 メディカゴ インコーポレイテッド ロタウイルスｖｐ７融合タンパク質およびそれらを含むロタウイルス様粒子
CN112251461B (zh) * 2020-10-22 2022-08-23 植链(上海)生物科技有限公司 一种采用本氏烟作为生物反应器制备的轮状病毒疫苗及其制备方法和应用
MY205588A (en) * 2021-02-23 2024-10-28 Univ Malaya A process for producing pharmaceutical or other heterologous protein via agrobacterium-mediated transformation of mucuna bracteata
CN114875047A (zh) * 2022-05-27 2022-08-09 江苏三仪生物工程有限公司 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用
CN117866858B (zh) * 2023-11-30 2024-06-21 吉林农业大学 一种表达猪轮状病毒抗原的重组植物乳杆菌及其应用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US4624850A (en) 1984-02-09 1986-11-25 Royal Children's Hospital Research Foundation Live attenuated human rotavirus vaccine
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4636385A (en) 1985-02-15 1987-01-13 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Vaccine, method for its preparation, and use thereof in vaccinating humans against rotavirus infection
US4704275A (en) 1985-08-26 1987-11-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4751080A (en) 1985-08-26 1988-06-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US4927628A (en) 1987-09-21 1990-05-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against rotavirus diseases and method of preparing same
ES2121841T3 (es) 1990-11-16 1998-12-16 Childrens Hosp Medical Center Una vacuna para proporcionar proteccion inmunologica contra enfermedades de rotavirus en humanos.
US6392121B1 (en) 1998-10-07 2002-05-21 Boyce Thompson Institute For Plant Research Gemini virus vectors for gene expression in plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US6867353B2 (en) 2000-02-12 2005-03-15 Exploregen Inc. Production method of recombinant rotavirus structural proteins and vaccine composition
KR100422158B1 (ko) * 2000-02-12 2004-03-10 (주)익스플로젠 재조합 로타바이러스의 구성체 단백질의 생산방법 및 이방법으로 생산된 백신 조성물
FR2806087B1 (fr) * 2000-03-07 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Particules pseudovirales de rotavirus et leur utilisation pour vectoriser des proteines ou des acides nucleiques
JP4698144B2 (ja) 2003-07-31 2011-06-08 富士通セミコンダクター株式会社 半導体装置の製造方法
CN1624141A (zh) * 2003-12-03 2005-06-08 中国农业科学院生物技术研究所 提高轮状病毒vp7或vp4植物表达含量的方法及产品
CN100569939C (zh) * 2004-02-26 2009-12-16 中国人民解放军免疫学研究所 表达人源轮状病毒外壳蛋白的转基因植物产品及其预防婴幼儿腹泻的用途
EP2261364A3 (en) * 2005-05-27 2011-03-30 The University of Central Florida, Chloroplasts engineered to express pharmaceutical proteins
JP2009501001A (ja) * 2005-06-01 2009-01-15 ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド 多価ウイルス様粒子の製造
CN1772902A (zh) * 2005-09-30 2006-05-17 中国农业大学 轮状病毒vp6蛋白的一种编码基因及其应用
EP1969001A2 (en) * 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
MX2010007962A (es) * 2007-11-27 2010-11-10 Medicago Inc Particulas tipo virus de influenza recombinante (vlp) producidas en plantas transgenicas que expresan hemaglutinina.
US9169296B2 (en) * 2008-05-29 2015-10-27 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Expression and assembly of human group C rotavirus-like particles and uses thereof
WO2010025285A1 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University A dna replicon system for high-level rapid production of vaccines and monoclonal antibody therapeutics in plants
US20130295609A1 (en) * 2010-11-04 2013-11-07 Medicago Inc. Plant expression system

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Publication number Publication date
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