ES2535358T3 - Bibliotecas de proteínas de fusión de transferrina - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende una proteína MUC3 humana modificada codificada por el ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 76.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

E12157790

21-04-2015

“transformación genética” se refiere la transferencia e incorporación de ADN, especialmente ADN recombinante, en una célula.

Como se usa en el presente documento, el término “transformante” se refiere a una célula, tejido u organismo que ha experimentado transformación.

Como se usa en el presente documento, el término “transgén” se refiere a un ácido nucleico que está insertado en un organismo, célula huésped o vector de una manera que asegura su función.

Como se usa en el presente documento, el término “transgénico” se refiere a células, cultivos de células, organismos, bacterias, hongos, animales, plantas y progenie de cualquiera de los anteriores, que han recibido un gen extraño o modificado y en particular un gen que codifica una proteína de fusión Tf modificada mediante uno de los diversos procedimientos de transformación, en los que el gen extraño o modificado procede de especies iguales

o diferentes de las especies del organismo que recibe el gen extraño o modificado .

“Variantes o variante” se refiere a un polinucleótido o ácido nucleico que difiere de un ácido nucleico o polipéptido dereferencia, pero que retiene sus propiedades esenciales. En general, las variantes son en conjunto similares y en muchas regiones, idénticas al ácido nucleico o polipéptido de referencia. Como se usa en el presente documento, “variante” se refiere a una parte de de proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina de la invención, que difiere en secuencia de una proteína terapéutica nativa pero que retiene al menos una propiedad funcional y/oterapéutica de la misma como se describe en cualquier parte en el presente documento o se conoce de otra manera en la técnica.

Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere de manera amplia a cualquier plásmido, fagémido o virus que codifica un ácido nucleico exógeno. El término también se considera que incluye compuestos no plásmidos, no fagémidos y no virales que facilitan la transferencia de ácido nucleico en viriones o células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina y similares. El vector puede ser un vector viral que es adecuado como un vehículo de distribución para la distribución del ácido nucleico, o mutante del mismo, a una célula, o el vector puede ser un vector no viral que es adecuado para el mismo propósito. Los ejemplos de vectores virales y no virales para la distribución de ADN a las células y tejidos se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ma et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 94: 12744 -12746). Los ejemplos de vectores virales incluyen, pero no se limitan a, un virus vaccinia recombinante, un adenovirus recombinante, un retrovirus recombinante, un virus adenoasociado recombinante, un poxvirus aviar recombinante y similares (Cranage et al., 1986, EMBO J. 5:3057 -3063; Solicitud de patente Internacional Nº WO94/17810, publicada el 18 de agosto de 1994; Solicitud de patente Internacional Nº WO94/23744, publicada el 27 octubre de 1994. Los ejemplos de los vectores no virales incluyen, pero no se limitan a, liposomas, poliamina derivados de ADN y similares.

Como se usa en el presente documento, el término “tipo natural” se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que es de origen natural.

Como se usa en el presente documento, “proteína de estructura”, “polipéptido de estructura”, o “estructura” se refiere a una proteína a la que se puede fusionar las secuencias de aminoácidos tales como péptidos aleatorios. Los péptidos son exógenos a la estructura.

Como se usa en el presente documento, “secuencia de péptido aleatorio” se refiere a una secuencia de aminoácidos compuesta de dos o más monómeros aminoacídicos y construida mediante un procedimiento estocástico o al azar.Un péptido aleatorio puede incluir restos de marco conservado o de estructura, que pueden comprender secuencias invariantes. Una secuencia de péptido aleatorio puede contener una parte no variante, es decir, aminoácidos no aleatorios.

Como se usa en el presente documento “biblioteca de péptidos aleatorios” se refiere a un conjunto de secuencias de polinucleótidos que codifican un conjunto de péptidos aleatorios y al conjunto de péptidos aleatorios codificados por esas secuencias de polinucleótidos, así como a las proteínas de fusión que contienen los péptidos aleatorios.

Como se usa en el presente documento, el término “pseudoaleatorio” se refiere a un conjunto de secuencias que tienen variabilidad limitada, de manera que por ejemplo, el grado de variabilidad de resto en una posición es diferente del grado de variabilidad del resto en otra posición, pero cualquier posición pseudoaleatoria permite algún grado de variación de resto, sin embargo circunscrita.

Como se usa en el presente documento, el término “marco conservado de secuencia definida” se refiere a un conjunto de secuencias definidas que se seleccionan en una base no aleatoria, en general en base a los datos experimentales o datos estructurales, por ejemplo, un marco conservado de secuencia definida puede comprender un conjunto de secuencias de aminoácidos que se predice que forman una estructura de hoja β o puede comprender un resto de repetición de cremallera en grupos de siete de leucina, un dominio de dedo de cinc, entre otras variaciones. Una “secuencia definida interna” es un conjunto de secuencias que abarcan un alcance limitado de variabilidad. Mientras una secuencia completamente aleatoria de 10-meros de los 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquiera de las (20)10 secuencias y una secuencia pseudoaleatoria de 10-meros de los 20 aminoácidos convencionales puede ser cualquiera de las (20)10 secuencias pero mostrarán un sesgo para ciertos restos en ciertas posiciones y/o en conjunto, una secuencia definida interna es un subconjunto de secuencias que es menor que el número máximo de secuencias potenciales si se permite que cada posición de resto sea cualquiera de los 20aminoácidos convencionales (y/o que permiten amino/iminoácidos no convencionales). Una secuencia interna definida en general comprende posiciones de residuos variantes e invariantes y/o comprende posiciones de residuosvariantes que pueden comprender un residuo seleccionado entre un subconjunto definido de residuos de aminoácidos y similares, o bien de manera segmentada o sobre la longitud completa de la secuencia del miembro de la biblioteca seleccionada individual. Las secuencias internas definidas se refieren a bien las secuencias de aminoácidos o bien las secuencias de polinucleótidos.

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

Como se usa en el presente documento, “engarce” o “espaciador” se refiere a una molécula o grupo de moléculas que conecta dos moléculas, tal como una proteína de unión a ADN y un péptido aleatorio y sirve para colocar las dos moléculas en una configuración deseable, por ejemplo, de manera que el péptido aleatorio se pueda unir a un receptor con mínimo impedimento estérico de la proteína de unión a ADN.

Como se usa en el presente documento, el término “segmento variable” se refiere a una parte de un péptido naciente que comprende una secuencia aleatoria, pseudoaleatoria, o interna definida. Un segmento variable puedecomprender tanto posiciones de resto variantes como invariantes y el grado de variación de resto en una posición de resto variante puede estar limitada; ambas opciones se seleccionan a la discreción del profesional. Típicamente, lossegmentos variables son de aproximadamente 3 a 20 restos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, 8 a 10 aminoácidos de longitud, aunque segmentos variables pueden ser más largos y pueden comprender partes de anticuerpo o proteínas receptoras, tales como un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión a ácido nucleico, una proteína receptora y similares.

Como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a la parte de un antígeno u otra macromolécula capaz de formar una interacción de unión que interactúa con el bolsillo de unión a la región variable de un anticuerpo. De manera típica, tal interacción de unión se manifiesta en forma de un contacto intermolecular con uno o más restos de aminoácidos de una CDR.

Como se usa en el presente documento, el término “receptor,” “diana,” o “agente” se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moléculas de origen natural o sintéticas. Los receptores se pueden emplear en estado no alterado o agregados con otras especies. Los receptores pueden estar unidos, de manera covalente o no covalente, a un miembro de unión, es decir, ligando, bien directamente o bien mediante una sustancia de unión. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, que incluyen anticuerpos monoclonales y reactivos antisueros con determinantes antigénicos específicos (tales como sobre virus, células, u otros materiales), receptores de la membrana celular, antígenos, moléculas que contienen epítopos, carbohidratos complejos y glucoproteínas, enzimas y receptores de hormona.

Como se usa en el presente documento, el término “ligando” o “resto de ligando” se refiere a una molécula, tal como un péptido aleatorio o una secuencia de segmento variable, que se reconoce por un receptor o agente particular.Como los expertos en la técnica reconocerán, una molécula (o complejo macromolecular) puede ser tanto un receptor como un ligando.

Como se usa en el presente documento, “fusionado”, “que forma complejo” o “unido de manera operativa” significa que el péptido aleatorio y la proteína de estructura están unidos conjuntamente, de tal manera que se minimice la interrupción con la estabilidad de la estructura.

Como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo de una sola cadena” se refiere a un polipéptido que comprende un dominio VH y un dominio VL en el enlace de polipéptido, en general unido mediante un péptido espaciador (por ejemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x SEC ID NO: 17) y que puede comprender secuencias adicionales de aminoácidos en los extremos amino-y/o carboxi. Por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena puede comprender un segmento de atadura para unirse al polinucleótido de codificación. Como un ejemplo, un scFv es un anticuerpo de una sola cadena. Los anticuerpos de una sola cadena son en general proteínas que constan de uno o más segmentos de polipéptidos de al menos 10 aminoácidos contiguos codificados sustancialmente por los genes de la superfamilia de inmunoglobulina (por ejemplo, véase The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams y A. N. Barclay, en Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt y T. H. Rabbitts, eds., (1989) Academic Press: San Diego, Calif., p. 361 -387), la mayoría codificada por una secuencia de genes de cadena pesada o ligera de roedor, de primate no humano, aviar, porcino, bovino, ovino, cabra, o humana. Un anticuerpo de una sola cadena funcional en general contiene una parte suficiente de un producto génico de la superfamilia de inmunoglobulina de manera que retenga la propiedad de unirse a una molécula diana, de manera típica un receptor o antígeno (epítopo).

Como se usa en el presente documento, el término “región determinante de complementariedad” y “CDR” se refieren al término reconocido en la técnica como se ejemplifica por las definiciones de CDR de Kabat y Chothia también en general conocidas como regiones hipervariables o bucles hipervariables. Véase Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol.

196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877; E. A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) (1987); y Tramontano et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 175. Los dominios de región variable de manera típica comprenden los aproximadamente 105 -115 aminoácidos amino-terminal de una cadena de inmunoglobulina de origen natural, por ejemplo, aminoácidos 1 -110, aunque los dominios variables algo más cortos o más largos son también adecuados para formar anticuerpos de una sola cadena.

Una región variable de cadena ligera o pesada consta de una región de “marco” interrumpida por tres regiones hipervariables también llamadas CDR. El grado de la región de marco conservado y las CDR se han definido de manera precisa. Véase, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, E. Kabat et al., 4ª Ed., Departamento deSalud y Servicios Humanos, Bethesda, Md. (1987). Las secuencias de las regiones de marco conservado de diferentes cadenas ligeras y pesadas están relativamente conservadas dentro de una especie. Como se usa en el presente documento, una “región de marco humana” es una región de marco que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más, usualmente 90 -95% o más) a la región de marco de una inmunoglobulina humana de tipo natural. La región de marco de un anticuerpo, que es las regiones de marco combinadas de las cadenas ligera y pesada constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son principalmente responsables de la unión a un epítopo de un antígeno.

Salvo que se defina de otra manera, todas las técnicas y términos científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por los expertos en la técnica a los que la invención pertenece. Aunque cualesquiera procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferidos.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

E12157790

21-04-2015

Transferrina y modificaciones de transferrina

Las proteínas de fusión de la presente divulgación incluyen una proteína de transferrina (Tf) o parte de la misma que es capaz de presentar un ligando tal como un péptido aleatorio o CDR a un receptor o agente. El resto Tf está fusionado al extremo N del resto del tallo. La proteína Tf o parte de la misma de la proteína de fusión se puede denominar como una “parte”, “región” o “resto” de Tf de la proteína de fusión. Como se usa en el presente documento, una proteína de fusión de transferrina es una proteína de transferrina o resto fusionado al resto del talloy contiene un miembro de unión a la pared celular y opcionalmente un resto de anclaje, o es una proteína detransferrina o resto fusionado directamente a un anclaje de membrana celular.

Cualquier transferrina se puede usar para preparar las proteínas de fusión Tf modificadas de la invención. Como un ejemplo, una Tf humana de tipo natural (Tf) es una proteína de 679 aminoácidos, de aproximadamente 75 kDa (no responsable de la glucosilación), con dos lóbulos o dominios principales, N (aproximadamente 330 aminoácidos) y C (aproximadamente 340 aminoácidos), que parece originarse a partir de una duplicación génica. Véanse los números de acceso del GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 y S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov), todos las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad, así como las SEC ID NOS: 1, 2 y 3. Los dos dominios han divergido con el tiempo pero mantienen un gran grado de identidad / similitud.

Cada uno de los dominios N y C además se divide en dos subdominios, N1 y N2, C1 y C2. La función de Tf es transportar hierro a las células del cuerpo. Este proceso está mediado por el receptor de Tf (TfR), que se expresa entodas las células, particularmente células que crecen activamente. TfR reconoce la forma de hierro unido de Tf (dos moléculas de las cuales están unidas por el receptor), después se produce endocitosis mediante la cual el complejo TfR/Tf se transporta al endosoma, momento en el que la caída localizada de pH da como resultado la liberación del hierro unido y el reciclado del complejo TfR/Tf a la superficie celular y liberación de Tf (conocida como apoTf en su forma de hierro no unida). La unión del receptor es principalmente a través del dominio C de Tf. Los dos sitios de glucosilación en el dominio C no parecen estar implicados en la unión del receptor ya que Tf unida a hierro no glucosilado no se une al receptor.

Cada molécula de Tf puede llevar dos iones de hierro (Fe3+). Éstos forman complejos en el espacio entre los subdominios N1 y N2, C1 y C2 que dan como resultado un cambio conformacional en la molécula.

En la transferrina humana, los sitios de unión a hierro comprenden al menos los aminoácidos Asp 63 (Asp 82 de la SEC ID NO: 2 que incluye la secuencia de señal natural de Tf), Asp 392 (Asp 411 de la SEC ID NO: 2), Tyr 95 (Tyr 114 de la SEC ID NO: 2), Tyr 426 (Tyr 445 de la SEC ID NO: 2), Tyr 188 (Tyr 207 de la SEC ID NO: 2), Tyr 514 o 517 (Tyr 533 o Tyr 536 SEC ID NO: 2), His 249 (His 268 de la SEC ID NO: 2) e His 585 (His 604 de la SEC ID NO: 2) de la SEC ID NO: 3. Las regiones de articulación comprenden al menos restos de aminoácidos del dominio N 94 96, 245 -247 y/o 316 -318 así como los restos de aminoácidos del dominio C 425 -427, 581 -582 y/o 652 -658 de la SEC ID NO: 3. Los sitios de unión al carbonato comprenden al menos los aminoácidos Thr 120 (Thr 139 de la SEC ID NO: 2), Thr 452 (Thr 471 de la SEC ID NO: 2), Arg 124 (Arg 143 de la SEC ID NO: 2), Arg 456 (Arg 475 de la SEC ID NO: 2), Ala 126 (Ala 145 de la SEC ID NO: 2), Ala 458 (Ala 477 de la SEC ID NO: 2), Gly 127 (Gly 146 de laSEC ID NO: 2) y Gly 459 (Gly 478 de la SEC ID NO: 2) de la SEC ID NO: 3.

En una divulgación, las proteínas de fusión incluyen una transferrina humana modificada, aunque se puede usar cualquier molécula de Tf animal para producir las proteínas de fusión de la invención, incluyendo las variantes Tf humanas, vaca, cerdo, oveja, perro, conejo, rata, ratón, hámster, equidna, ornitorrinco, pollos, rana, gusano cornudo, mono, simio, así como otras especies bovinas, caninas y aviares. Todas estas secuencias de Tf están fácilmente disponibles en GenBank y otras bases de datos públicas. Está disponible la secuencia de nucleótidos de Tf (véanse las SEC ID NOS: 1, 2 y 3 y los números de acceso descritos anteriormente y disponibles en www.ncbi.nlm.nih.gov) y se pueden usar para preparar fusiones genéticas entre Tf o un dominio de Tf y la molécula terapéutica de elección.También se pueden preparar fusiones a partir de moléculas relacionadas tales como lactotransferrina (lactoferrina) GenBank Acc: NM_ 002343) o melanotransferrina.

Lactoferrina (Lf), una proteína de unión a hierro de defensa natural, se ha encontrado que posee actividad antibacteriana, antimicótica, antiviral, antineoplásica y antiinflamatoria. La proteína está presente en secreciones exocrinas que están de manera común expuestas a la flora normal: leche, lágrimas, exudado nasal, saliva, moco bronquial, fluidos gastrointestinales, moco cervico-vaginal y fluido seminal. De manera adicional, Lf es un constituyente principal de los gránulos específicos secundarios de neutrófilos polimorfonucleares circulantes (PMN). La apoproteína se libera tras la desgranulación de los PMN en áreas sépticas. Una función principal de Lf es la de depuración de hierro libre en los fluidos y áreas inflamadas de manera que supriman el daño mediado por radical libre y disminuye la disponibilidad para que el metal invada las células microbianas y neoplásicas. En un estudio que examinó la relación de recambio de 125I Lf en adultos, se mostró que Lf es rápidamente captada por el hígado y la radioactividad persistía durante varias semanas en el hígado y bazo (Bennett et al. (1979), Clin. Sci. (Lond.) 57: 453 -460).

En una divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión de la invención incluye una variante de ayuste de transferrina. En un ejemplo, una variante de ayuste de transferrina puede ser una variante de ayuste de transferrina humana. En una realización específica, la variante de ayuste de transferrina humana puede ser la del nº de accesode Genbank AAA61140.

En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión de la invención incluye una variante de ayuste de lactoferrina. En un ejemplo, una variante de ayuste de lactoferrina de suero humana puede ser una variante de ayuste novedosa de una lactoferrina humana. En una realización específica, la variante de ayuste de lactoferrina neutrófila puede ser la de nº de acceso de Genbank AAA59479. En otra realización específica, la variante de ayuste de lactoferrina neutrófila puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos EDCIALKGEADA (SEC ID NO: 4), que incluye la región novedosa de la variante de ayuste.

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

E12157790

21-04-2015

(continuación)

N

C

C118-C194

C450-C523

C137-C331

C474-C665

C158-C174

C484-C498

C161-C179

C171-C177

C495-C506

C227-C241

C563-C577

C615-C620

En una divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos N terminal de transferrina. En realizaciones adicionales, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos N terminales de transferrina derivada de transferrina de suero humana.

En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye, comprende, o consta de al menos dos lóbulos N terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188 y His249 de la SEC ID NO: 3.

En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión modificada incluye un mutante de lóbulo Nterminal de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID NO: 3.

En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye, comprende, consta esencialmente de, o consta de al menos dos lóbulos C terminales de transferrina. En realizaciones adicionales, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina derivados de transferrina de suero humano.

En una divulgación adicional, el mutante del lóbulo C terminal además incluye una mutación de al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC ID NO: 3 que no permite glucosilación.

En otra divulgación, la parte de transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 e His585 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante retiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC ID NO: 3, en el que el mutante tiene una capacidad reducida de unirse a iones metálicos.En otra divulgación, la parte de transferrina incluye al menos dos lóbulos C terminales de transferrina que tienen una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp392, Tyr426, Tyr517 y His585 de la SEC ID NO:3, en el que el mutante no mantienen la capacidad de unirse a iones metálicos y funciona sustancialmente como un dominio N.

En alguna divulgación, la Tf o parte de Tf tendrá suficiente longitud para incrementar la semivida circulatoria in vivo,estabilidad en suero, estabilidad en solución in vitro o biodisponibilidad del ligando, es decir, será terapéutica, cuando la Tf o parte de Tf y el ligando de la proteína de fusión se escinden del resto de la proteína de fusión comparada con la semivida circulatoria in vivo, estabilidad en suero (semivida), estabilidad in vitro o biodisponibilidaddel ligando en un estado no fusionado, es decir, no fusionado a Tf. Tal incremento en estabilidad, semivida circulatoria in vivo o biodisponibilidad puede ser aproximadamente un 30%, 50%, 70%, 80%, 90% o más de incremento sobre la región del resto de ligando no fusionado. En algunos casos, el resto de ligando que comprende la transferrina modificada muestra una semivida en suero de aproximadamente 1 o más días, 1-2 o más días, 3-5 o más días, 5-10 o más días, 10-15 o más días, 10-20 o más días, aproximadamente 12-18 días o aproximadamente 14-17 días comparado con el ligando en un estado no fusionado.

Cuando el dominio C de Tf es parte de la proteína de fusión, los dos sitios de glucosilación unidos a N, restos de aminoácido que corresponden a N413 y N611 de la SEC ID NO: 3 se pueden mutar para la expresión en un sistemade levadura para evitar la glucosilación o hipermanosilación y ampliar la semivida en suero de la proteína de fusión (para producir asialo-, o en algunos casos, monosialo-Tf o disialo-Tf). Además de los aminoácidos de Tf que corresponde a N413 y N611, mutaciones para los restos dentro de o adyacentes al sitio de glucosilación N-X-S/T evitan o sustancialmente reducen la glucosilación. Véase la Patente de Estados Unidos nº 5.986.067 de Funk et al. Por ejemplo, la invención incluye modificaciones en los aminoácidos S415 y T613. En una realización, el resto de transferrina contiene las modificaciones S415A y T613A. En esta divulgación, las modificaciones de aminoácidos corresponden a S415 y T613 de la SEC ID NO: 3.

También se ha reseñado que el dominio N de Tf expresado en Pichia pastoris llega a estar glucosilado unido a o con una sola hexosa en S32 que también se puede mutar o modificar para evitar tal glucosilación. Además, la glucosilación unida a O se puede reducir o eliminar en una célula huésped de levadura con mutaciones en uno o más de los genes PMT.

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

De acuerdo con lo anterior, en una divulgación, la proteína de fusión incluye una molécula de transferrina modificada en la que la transferrina muestra una glucosilación reducida, que incluye pero no se limita a formas asialomonosialo-y disialo-de Tf. En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye un mutante de transferrina recombinante que se muta para evitar la glucosilación. En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye un mutante de transferrina recombinante que está totalmente glucosilado. En una divulgación adicional, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que está mutado para evitar la glucosilación, en el que al menos uno de Asn413 y Asn611 de la SEC ID NO: 3 está mutado a un aminoácido que no permite glucosilación. En otra realización, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que está mutado para evitar o sustancialmente reducir la glucosilación, en el que las mutaciones pueden estar dentro del sitio de glucosilación N-X-S/T. Además, la glucosilación se puede reducir o evitar mediante mutación del resto de serina o treonina. Por ejemplo, en una divulgación de la invención, la parte de transferrina de la proteína de fusión incluye unmutante de transferrina de suero humana recombinante que está mutado para evitar la glucosilación, en la que al menos uno de Ser415 y Thr613 de la SEC ID NO: 3 está mutado a un aminoácido que no permite la glucosilación.Además, el cambio de X a prolina se sabe que inhibe la glucosilación.

Como se describe en más detalle más adelante, las proteínas de fusión Tf modificadas, que comprenden una Tf modificada, de la invención también se puede modificar por ingeniería genética para unir y/o no unir el hierro al receptor Tf. En otras realizaciones de la invención, la unión del hierro se mantiene y la capacidad de unión al hierro de Tf se puede usar para distribuir una proteína terapéutica o péptido(s) al interior de una célula y/o mediante la barrera hematoencefálica (BBB). El dominio N solo no se une a TfR cuando está cargado con hierro y el hierro unido al dominio C se unirá a TfR pero no con la misma afinidad que la molécula global.

En otra divulgación, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina, incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse a iones metálicos. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más débil para iones metálicos que la transferrina de suero de tipo natural. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina de la proteína de fusión de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte por los iones metálicos que la transferrina de suero tipo natural.

En otra divulgación, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no retiene la capacidad de unirse a al receptor de transferrina. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye a mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad e unión más débil por el receptor de transferrina que la transferrina de suero de tipo natural. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte para el receptor de transferrina que la transferrina de suero de tipo natural.

En otra divulgación, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse a los iones carbonato. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más débil para los iones carbonato que la transferrina de suero de tipo natural. En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina recombinante que tiene una mutación en la que el mutante tiene una afinidad de unión más fuerte para los iones carbonato que la transferrina desuero de tipo natural.

En otra divulgación, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante mantienela capacidad de unir se a iones metálicos. En una divulgación alternativa, un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr514, Tyr517 y His585 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante tiene una capacidad reducida para unirse a iones metálicos. En otra divulgación, un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en al menos un resto de aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp63, Gly65, Tyr95, Tyr188, His249, Asp392, Tyr426, Tyr517 y His585 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante no mantiene la capacidad de unirse a iones metálicos.

En otra divulgación, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más fuerte para los iones metálicos que la transferrina de suero tipo natural humana (véase la Patente de Estados Unidos 5.986.067). En una divulgación alternativa, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante tiene una avidez de unión más débil para los iones metálicos que la transferrina de suero tipo natural humana. En una divulgación adicional, la parte de transferrina incluye un mutante de transferrina de suero humana recombinante que tiene una mutación en Lys206 o His207 de la SEC ID NO: 3, en la que el mutante no se une a iones metálicos.

Se puede usar cualquier técnica disponible para producir la proteína de fusión de la invención, que incluye pero no se limita a técnicas moleculares disponibles comúnmente, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Cuando se llevan a cabo las sustituciones de nucleótidos usando las técnicas para llevar a cabo mutagénesis específica de sitio que se conocen bien en la técnica, los cambios de aminoácidos son preferiblemente de una naturaleza secundaria, esto es, sustituciones de aminoácido conservadoras, aunque también se contemplan otras sustituciones no conservadoras, particularmente cuando se producen una parte de transferrina modificada, por ejemplo, una proteína de fusión modificada que muestra glucosilación reducida, unión a hierro reducida y similares. De manera específica se

E12157790

21-04-2015

contemplan sustituciones de aminoácidos, pequeñas supresiones o inserciones, de manera típica de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; las inserciones entre dominios de transferrina; pequeñas extensiones amino-o carboxilo-terminales, tales como un resto de metionina amino-terminal, o pequeños péptidos de engarce de menos de 50, 40, 30, 20 o 10 restos entre dominios de transferrina o unión de una proteína de transferrina de y proteína o

5 péptido terapéutico, ligando, o una región de anticuerpo variable o región de tallo; o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un espacio de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

Los ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservadoras son sustituciones realizadas dentro del mismo grupo tales como sustituciones dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina, histidina), aminoácidos ácidos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y

10 asparagina), aminoácidos hidrófobos (tales como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina, metionina).

Las sustituciones no conservadoras abarcan sustituciones de aminoácidos de un grupo por aminoácidos de otro grupo. Por ejemplo, una sustitución no conservadora incluiría la sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido polar. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al. (1991),

15 Prot. Exp. Pur. 2: 95 -107. Las sustituciones no conservadoras, supresiones e inserciones son particularmente útiles para producir proteínas de fusión Tf, preferiblemente transcuerpos, de la invención que no muestran unión o muestran unión reducida de hierro y/o no muestran unión o muestran unión reducida de la proteína de fusión al receptor Tf.

En el polipéptido y proteínas de la invención, se sigue el siguiente sistema para designar aminoácidos de acuerdo 20 con la siguiente lista convencional:

TABLA DE AMINOÁCIDOS

AMINOÁCIDO

SÍMBOLO DE UNA LETRA SÍMBOLO DE TRES LETRAS

Alanina

A Ala

Arginina

R Arg

Asparagina

N Asn

Ácido aspártico

D Asp

Cisteína

C Cys

Glutamina

Q Gln

Ácido glutámico

E Glu

Glicina

G Gly

Histidina

H His

Isoleucina

I Ile

Leucina

L Leu

Lisina

K Lys

Metionina

M Met

Fenilalanina

F Phe

Prolina

P Pro

Serina

S Ser

Treonina

T Thr

Triptófano

W Trp

Tirosina

Y Tyr

Valina

V Val

La unión a hierro y/o unión al receptor se puede reducir o interrumpir por mutación, que incluye supresión de, sustitución de o inserción en, restos de aminoácido que corresponden a uno o más de restos de dominio N de Tf 25 Asp63, Tyr95, Tyr188, His249 y/o restos de dominio C Asp 392, Tyr 426, Tyr 514 y/o His 585 de la SEC ID NO: 3. la unión a hierro también puede estar afectada por mutación a los aminoácidos Lys206, His207 o Arg632 de la SEC ID NO: 3. La unión a carbonato se puede reducir o interrumpir por mutación, incluyendo supresión de, sustitución de o

imagen8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

E12157790

21-04-2015

(continuación)

N1

N2

Asp90

Gln184

Gly257

Asp197

Lys280

Lys217

His289

Thr231

Ser298

Cys241

En todavía otra divulgación, el ligando comprende residuos de aminoácidos distribuidos al azar en los residuos de aminoácidos de superficie expuesta sobre la proteína de transferrina. Los residuos de aminoácidos distribuidos al azar se pueden localizar en una región de aminoácidos expuestos de superficie o en una o más región de aminoácidos expuestos de superficie. Por ejemplo, los aminoácidos distribuidos al azar pueden estar contenidos en una o más de las regiones constituidas por aproximadamente 85 residuos de aminoácido a aproximadamente 92 residuos de aminoácido, aproximadamente 276 residuos de aminoácido a aproximadamente 298 residuos de aminoácido, o aproximadamente 207 residuos de aminoácido a aproximadamente 217 residuos de aminoácido de la SEC ID NO: 3. En una divulgación, los residuos de aminoácido distribuidos al azar se localizan en las posiciones Y85, G86, S87, E89, D90 y Q92 de la SEC ID NO: 3. En otra divulgación, los residuos de aminoácido distribuidos al azar se localizan en las posiciones K276, D277, K280, Q283, S286 y D297 y de manera opcional S298 de la SEC ID NO: 3. En todavía otra realización, los residuos de aminoácidos distribuidos al azar se localizan en las posiciones H207, S208, F211, E212 y A215 y de manera opcional N216 y/o K217 de la SEC ID NO: 3.

Aunque el número de restos de aminoácidos distribuidos al azar por región puede variar, preferiblemente al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9 o al menos aproximadamente 10 o más restos de aminoácidos están distribuidos al azar por región.

En una divulgación, el resto de ligando contiene una secuencia de unión de ligando conocida tal como una secuencia de ligando capaz de unirse a una integrina, que incluye, pero no se limita a, una alfa 4 integrina (porejemplo, a4b1 y a4b7). Tales ligandos incluyen, pero no se limitan a, VCAM y MadCAM. Véase Jackson, 2002, Current Pharmaceutical Design. *: 1229 -1253.

Los procesos inflamatorios que conducen a un daño de tejido y enfermedad están mediados en parte por las integrinas alfa 4, a4b1 y a4b7, expresadas sobre la superficie de la célula de leucocitos. Estos receptores de glucoproteína modulan la adhesión de la célula mediante la interacción con sus ligandos primarios, molécula de adhesión de la célula vascular (VCAM) y molécula de adhesión de la célula de adresina mucosal (MAdCAM), expresada en el tejido afectado. Tras la unión, las interacciones de integrina/CAM en la superficie de la célula dancomo resultado la adhesión firme del leucocito al vaso seguida por la entrada en el tejido afectado. La expresión de la molécula de adhesión de la célula (CAM) en diversos órganos está ligada a varias enfermedades autoinmunes. En una realización de la invención, un transcuerpo (es decir, una proteína de fusión que comprende transferrina y un ligando) que contiene uno o más péptidos capaces de unirse a alfa-4 integrinas o sus ligandos CAM se puede administrar a un sujeto para tratar un sujeto a tratar y/o mediar inflamación. En una divulgación, un transcuerpo que contiene uno o más péptidos capaces de unirse a alfa-4 integrinas o sus ligandos CAM se pueden administrar a un sujeto para el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

En otra divulgación, el resto de ligando comprende una secuencia de unión a ligando conocida y restos de aminoácidos distribuidos al azar bien dentro de la secuencia de unión a ligando o bien sobre cualquiera o sobre ambos lados de la secuencia de unión a ligando. Por ejemplo, la invención incluye una proteína de fusión de transferrina que contiene la secuencia de unión a integrina RGD rodeada de restos de aminoácido distribuidos al azar. Tal proteína de fusión se puede insertar en el resto de transferrina, por ejemplo, entre los aminoácidos 289 y 290 de la SEC ID NO: 3. En una realización de la invención, la secuencia de unión a integrina resto de péptido aleatorizado de ligando es CXXXRGDXXXC, en el que X es un resto de aminoácido aleatorizado. En otra divulgación, la secuencia de unión a integrina y resto de péptido aleatorizado de ligando es XXXRGDXXX. La divulgación también incluye, pero no se limita a, la secuencia de unión a integrina KGD rodeada de péptidos distribuidos al azar y la secuencia de unión a integrina LDV rodeada de péptidos distribuidos al azar.

En otra divulgación, el resto de ligando es una región variable de anticuerpo. En esta divulgación, en general, la proteína de fusión de transferrina de la invención puede tener una región derivada de transferrina modificada y una región variable de anticuerpo. Sin embargo, más de una región variable de anticuerpo se puede usar para preparar una proteína de fusión de transferrina de la invención, produciendo por lo tanto una Proteína de fusión Tf multifuncional modificada.

En una divulgación, la proteína de fusión de la invención contiene una región variable de anticuerpo o parte del mismo fusionada a una molécula de transferrina o parte de la misma. En otra divulgación, la proteína de fusión de la invención contiene una región variable de anticuerpo fusionada al extremo N de una molécula de transferrina. En una divulgación alternativa, la proteína de fusión de la invención contiene una región variable de anticuerpo fusionada al extremo C de una molécula de transferrina. En una divulgación adicional, la proteína de fusión de la invención contiene una molécula de transferrina fusionada al extremo N de una región variable de anticuerpo. En una divulgación alternativa, la proteína de fusión de la invención contiene una molécula de transferrina fusionada al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

E12157790

21-04-2015

extremo C de una región variable de anticuerpo.

La presente invención también proporciona una proteína de fusión que contiene una región variable de anticuerpo o parte de la misma fusionada a una molécula de transferrina modificada o parte de la misma.

En otra divulgación, la proteína de fusión de la invención contiene una región variable de anticuerpo fusionada a tanto el extremo N como el extremo C de transferrina modificada. En otra divulgación, la región variable de anticuerpos fusionada a los extremos N-y C-se unen a los mismos antígenos. También, las regiones variables de anticuerpos que se unen al mismo antígeno se pueden derivar de anticuerpos diferentes y de este modo, se unen diferentes epítopos sobre la misma diana. En una divulgación alternativa, la región variable de anticuerpos fusionada a los extremos N-y C-se unen a diferentes antígenos. En otra divulgación alternativa, la región variable de anticuerpos fusionada a los extremos N-y C-se unen a diferentes antígenos que pueden ser útiles para activar dos células diferentes para el tratamiento o prevención de enfermedad, trastorno, o afección. En otra divulgación, la región variable de anticuerpos fusionada a los extremos N-y C-se unen a diferentes antígenos .que pueden ser útiles para unión por puentes de dos antígenos diferentes para el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos que se conocen en la técnica en la técnica que se producen de manera común en pacientes de manera simultánea.

De manera adicional, la proteína de fusión de transferrina de la invención también se puede producir mediante la inserción de la región variable de anticuerpo de interés, por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena que se une auna proteína terapéutica o un fragmento o variante de la misma, en una región interna de la transferrina modificada.Las regiones internas de la transferrina modificada incluyen, pero no se limitan a, las regiones de bucle, el sitio de unión a hierros, las regiones de articulación, los sitios de unión a bicarbonato o el dominio de unión al receptor.

Dentro de la secuencia de proteína de la molécula de transferrina modificada existen un cierto número de bucles o curvas, que están estabilizados por enlaces disulfuro. Estos bucles son útiles para la inserción, o fusión interna, de péptidos terapéuticamente activos, preferiblemente regiones variables de anticuerpos, particularmente las que requieren una estructura secundaria para ser funcionales, o proteínas terapéuticas, preferiblemente región variable de anticuerpos, para generar una molécula de transferrina modificada con actividad biológica específica.

Cuando los ligandos tales como regiones variables de anticuerpos, preferiblemente CDR, se insertan en o reemplazan al menos un bucle de una molécula de Tf, se pueden realizar inserciones dentro de cualquiera de las regiones de bucles expuestas de superficie, además de otros áreas de Tf. Por ejemplo, se pueden realizar inserciones dentro de los bucles que comprenden los aminoácidos 32 -33, 74 -75, 256 -257, 279 -280 y 288 -289 de Tf. Véase Ali et al., supra. Como se ha descrito anteriormente, se pueden realizar inserciones dentro de otras regiones de Tf tal como los sitios para unión a hierro y a bicarbonato, las regiones de articulación y la unión al dominio del receptor como se describe en más detalle más adelante. También se pueden usar bucles en la secuencia de proteína Tf que son responsables de la modificación/reemplazo de la inserción de proteínas o péptidos para el desarrollo de de una biblioteca que se puede seleccionar de inserciones de péptidos aleatorias. Se pueden usar cualesquiera procedimientos para producir inserciones de ácido nucleico para la generación de bibliotecas de péptido, incluyendo sistemas de visualización de fago y bacterianos, antes de clonar en un dominio Tf y/o fusión a los extremos de Tf.

El extremo N de Tf está libre y apunta hacia fuera de la proteína de fusión. Las fusiones de un ligando o ligandos sobre el extremo N de transferrina es una realización de la invención. Tales fusiones pueden incluir una región de engarce, tal como pero sin limitación a un tramo de poli-glicina o un engarce PEAPTD (SEC ID NO: 18) para separar el ligando de Tf.

El extremo C de Tf parece que está enterrado o parcialmente enterrado y asegurado por un enlace disulfuro de 6 aminoácidos del extremo C. En Tf humana, el aminoácido C-terminal es una prolina que, dependiendo de la forma en que esté orientada, bien apuntará una proteína de fusión hacia fuera o bien en el cuerpo de la molécula. Un engarce o resto espaciador en el extremo C se puede usar en algunas realizaciones de la invención. También existe una prolina cerca del extremo N. En una divulgación, la prolina en los extremos N-y/o el C-se puede modificar o sustituir con otro aminoácido. En otra divulgación, el enlace disulfuro C-terminal se puede eliminar para no atar el extremo C.

Resto del tallo

El resto del tallo de la divulgación está fusionado en su extremo N a un resto de transferrina o ligando y puede de manera opcional estar fusionado a un resto de anclaje en su extremo C. Cuando se expresa en una célula de levadura, el extremo C del resto del tallo se localiza dentro de la célula, por ejemplo, dentro de la pared celular. En una realización de la invención, el resto del tallo actúa como un miembro de unión a la pared celular para unir de manera covalente o no covalente la proteína de fusión a la pared celular de una célula de levadura.

El resto del tallo de la presente invención tiene una conformación de tipo bastón o de tipo brocha. Este tipo de conformación es típica de un péptido moderadamente a altamente glucosilado. El resto del tallo de la invención contiene N-glucanos u O-glucanos. Véase el documento U.S. 6.114.147. La presencia de O-glucanos se prefiere sobre los N-glucanos debido a que los O-glucanos permiten que el resto del tallo tome la forma de una más de una conformación extendida, de tipo bastón cuando se compara con los N-glucanos. El resto del tallo también puede contener moderada a alta glucosilación de sitios de glucosilación de serina y treonina.

El resto del tallo de la proteína de fusión de la invención contiene un porcentaje moderado a alto de restos de serina

o treonina. Por ejemplo, la invención incluye un resto del tallo con al menos aproximadamente 5% o más residuos deserina y/o treonina, al menos aproximadamente 10% o más residuos de serina y/o treonina, al menos aproximadamente 20% o más o más residuos de serina y/o treonina, al menos aproximadamente 30% o más o másresiduos de serina y/o treonina, al menos aproximadamente 40% o más o más residuos de serina y/o treonina, al

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

E12157790

21-04-2015

menos aproximadamente 50% o más o más residuos de serina y/o treonina, al menos aproximadamente 60% o más

o más residuos de serina y/o treonina, al menos aproximadamente 70% o más o más residuos de serina y/otreonina, al menos aproximadamente 80% o más o más residuos de serina y/o treonina, o al menos aproximadamente 90% o más o más residuos de serina y/o treonina. En una realización de la invención, el residuodel tallo contiene aproximadamente 20 -30% residuos de serina y/o treonina, aproximadamente 20 -40% residuos de serina y/o treonina, aproximadamente 30 -40% residuos de serina y/o treonina, aproximadamente 20 -50% residuos de serina y/o treonina, aproximadamente 30 -50% residuos de serina y/o treonina, aproximadamente 20 60 residuos de serina y/o treonina o aproximadamente 30 -60% residuos de serina y/o treonina.

El resto del tallo puede contener al menos aproximadamente 5% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 10% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 20% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 30% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 40% o más Nu O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 50% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 60% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 70% o más N-u O-glucanos en peso, al menos aproximadamente 80% o más N-u O-glucanos en peso, o al menos aproximadamente 90% o másN-u O-glucanos en peso. En una realización de la invención, el resto del tallo contiene aproximadamente 20-30% Oglucanos en peso, aproximadamente 20 -40% O-glucanos en peso, aproximadamente 30-40% O-glucanos en peso, aproximadamente 20 -50% O-glucanos en peso, aproximadamente 30-50% O-glucanos en peso, aproximadamente 20 -60% O-glucanos en peso o aproximadamente 30 -60% O-glucanos. En otra realización, la presencia de glucanos, en particular O-glucanos, permite que el resto del tallo se reticule con los beta glucanos presentes en proteínas de la pared celular. Como tal, el resto del tallo de la invención es capaz de funcionar como miembro de unión a la pared celular.

El resto del tallo puede comprender una proteína de mucina o parte de una proteína de mucina, es decir un miembro de las proteínas de tipo MUC. Las mucinas de tipo MUC son una familia de las moléculas relacionadas de manera estructural que están altamente glucosiladas y se expresan en epitelio de los tractos respiratorios, gastrointestinal yreproductor, por ejemplo, MUC1 (GenBank Número de acceso AF125525), MUC2 (GenBank Número de acceso L21998), MUC3 (GenBank Número de acceso AF113616), MUC4 (GenBank Número de acceso AJ000281),MUC5AC (GenBank Número de acceso U83139), MUC5B (GenBank Número de acceso AJ001402), MUC6 (GenBank Número de acceso U97698), MUC7 (GenBank Número de acceso L13283), MUC8 (GenBank Número de acceso U14383), MUC9 (GenBank Número de acceso AW271430). En una divulgación, el resto del tallo contiene hMUC1 o una parte de la proteína hMUC1, por ejemplo, SEC ID NO: 71 codificada por el ácido nucleico de la SEC ID NO: 70 así como el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO: 5. En otra divulgación, el resto del tallo contiene hMUC3 o una parte de la proteína hMUC3. Por ejemplo, la invención incluye el tallo hMUC3 de la SEC ID NO: 69 que está codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO: 68.

La proteína de fusión de la invención también incluye tallos que comprenden variantes tales como análogos y derivados de proteínas de mucina, proteínas de tipo mucina y partes de las mismas. Las variantes se pueden crear para optimizar el despliegue de las proteínas sobre la superficie de una célula. Las variantes se pueden crearmediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes se pueden modificar por ingeniería genética eliminando los restos de aminoácidos repetitivos y/o sometiendo los péptidos a mutagénesis aleatoria y selección.

El resto del tallo de la divulgación también se puede derivar de proteínas glucosiladas diferentes de mucina, que incluyen, pero no se limitan a, AGA1 (por ejemplo, SEC ID NO: 73, codificada por la secuencia de ácido nucleico dela SEC ID NO: 72), MAdCAM-1, GlyCAM-1, CD34; repeticiones de consenso de E-selectina, P-selectina, o Lselectina; o fijación de glucoproteína virales (tales como virus de influenza, herpes simplex, inmunodeficiencia humana, o del mosaico de tabaco) y variantes y fragmentos de los mismos. Véase el documento WO 01/46698, Girard et al. (1995) Immunity 2: 113 -123 y Van Kinken et al. (1998) Anal. Biochem. 265: 103 -116, todas las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. La invención incluye repeticiones de dos omás proteínas glucosiladas o fragmentos de las mismas así como las combinaciones de dos o más tipos de proteínas glucosiladas.

En otra realización de la invención, el tallo se modifica por ingeniería genética para que contenga uno o más restos de cisteína libres. El uno o más restos de cisteína libres son capaces de formar enlaces disulfuro con restos de cisteína libres de proteínas en la pared celular de una célula de levadura. La formación de uno o más enlaces disulfuro dentro de la pared celular representa otro procedimiento que se puede usar para modificar por ingeniería genética un resto del tallo capaz de funcionar como un miembro de unión a la pared celular.

Si la proteína de fusión de la invención se va a expresar en una célula de levadura, el resto del tallo es preferiblemente de suficiente longitud para atravesar la pared celular entera de una célula de levadura. Preferiblemente, el extremo N del resto del tallo se sitúa en el exterior de la pared celular, lo más preferiblemente, se extiende en una configuración de tipo bastón fuera de la célula de levadura para reducir el impedimento estérico entre el resto de transferrina y ligando y la célula de levadura huésped. El resto del tallo debe ser de al menos aproximadamente 25 aminoácidos, de al menos aproximadamente 50 aminoácidos, de al menos aproximadamente 75 aminoácidos, de al menos aproximadamente 100 aminoácidos, de al menos aproximadamente 125 aminoácidos,de al menos aproximadamente 150 aminoácidos, de al menos aproximadamente 175 aminoácidos, de al menos aproximadamente 200 aminoácidos, de al menos aproximadamente 225 aminoácidos, de al menos aproximadamente 250 aminoácidos, de al menos aproximadamente 275 aminoácidos, de al menos aproximadamente 300 aminoácidos, de al menos aproximadamente 325 aminoácidos, de al menos aproximadamente 350 aminoácidos, de al menos aproximadamente 375 aminoácidos, de al menos aproximadamente 400 aminoácidos, de al menos aproximadamente 425 aminoácidos, de al menos aproximadamente 450 aminoácidos, de al menos aproximadamente 475 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 500 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 525 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 550 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 575 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 600 aminoácidos de longitud, de al menos aproximadamente 625 aminoácidos de

imagen9

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

E12157790

21-04-2015

secuencia reconocida por un anticuerpo, de manera típica un anticuerpo monoclonal) tal como señalización de polihistidina, SEAP, o M1 y M2. Véanse Bush et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 13811 -13814, Berger et al. (1988)Gene 66: 1 -10, Patente de Estados Unidos 5.011.912, Patente de Estados Unidos 4.851.341, Patente de Estados Unidos 4.703.004 y Patente de Estados Unidos 4.782.137, todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad. En una realización, el dominio del tallo se ata a un sustrato mediante un anticuerpo de secuencia anti tallo tal como un anticuerpo anti-mucina.

Albúmina

La divulgación también incluye una proteína de fusión que emplea una proteína o fragmento de proteína diferente de transferrina para “presentar” un ligando a una diana. Las proteínas adecuadas son unas que son solubles y de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud o más largas. En una realización de la invención, la proteína o fragmento de proteína contiene una estructura secundaria similar a la de la transferrina.

Es preferible que la proteína o fragmento de la misma sea capaz de incrementar la semivida del ligando cuando se escinde de la parte de tallo de la proteína de fusión y se usa como agente terapéutico. Por ejemplo, la presente divulgación contempla el uso de una proteína de fusión que contiene un resto de albúmina, un resto del tallo y un miembro de unión a la pared celular. La presente invención también contempla el uso de una proteína de fusión que contiene un resto de albúmina y un resto de anclaje. El resto de albúmina es capaz de conferir una semivida incrementada en suero para el ligando, es decir, agente terapéutico, cuando la parte de albúmina y de ligando de laproteína de fusión se escinde del remanente de la proteína de fusión y se administra a un paciente en necesidad del ligando como agente terapéutico.

Una proteína de fusión que contiene un resto de albúmina puede contener una proteína de albúmina, una variante de albúmina o fragmento de la misma. En una divulgación, la proteína de albúmina comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 67 que está codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 66. La invención incluye modificaciones de albúmina que se conocen en la técnica.

Ácidos nucleicos

Las moléculas de ácido nucleico también se proporcionan por la presente invención. Éstas codifican una proteína defusión Tf modificada divulgada que comprende una proteína de transferrina o una parte de una proteína de transferrina unida o acoplada de manera covalente a un resto de ligando. La proteína de fusión puede además comprender una región de enlace, por ejemplo un engarce de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácido. El engarce puede estar de manera covalente a y entre la proteína de transferrina o parte de la misma y la parte de ligando. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar purificadas o no.

También se proporcionan las células huésped y vectores para replicar las moléculas de ácido nucleico y que expresan las proteínas de fusión modificadas. Se pueden usar cualesquiera vectores o células huésped, bien procarióticos o bien eucarióticos, pero se pueden preferir los sistemas de expresión procarióticos, en particular los sistemas de expresión de levadura y sistemas de expresión de mamífero. Muchos vectores y células huésped se conocen en la técnica para tales propósitos. Está también dentro de la experiencia en la técnica seleccionar un conjunto apropiado para la aplicación deseada.

Secuencias de ADN que codifican transferrina, partes de transferrina y proteínas terapéuticas de interés se pueden clonar a partir de una diversidad de bibliotecas genómicas o de ADNc conocidas en la técnica. Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN que usan procedimientos basados en sondas son técnicas convencionales y se bien conocen bien por los expertos en la técnica. Las sondas para aislamiento de tales secuencias de ADN se pueden basar en secuencias de ADN o de proteínas (véase, por ejemplo, Baldwin, G.S. (1993) Comparison of Transferrin SECuences from Different Species. Comp. Biochem. Physiol. 106B/1:203-218). De manera alternativa, se puede usar el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Mullis et al. (Patente de EstadosUnidos Nº 4.683.195) y Mullis (Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202). La elección de biblioteca y selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica.

Como se sabe en la técnica, “similitud” entre dos polinucleótidos o polipéptidos se determina por comparación de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos y sus sustitutos de nucleótidos o aminoácidos de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. Como se conoce en la técnica es “identidad” que significa el grado de relación de secuencia entre dos secuencias de polipéptido o dos de polinucleótidos como se determina por la identidad de la coincidencia entre dos hebras de tales secuencias. Tanto la identidad como la similitud se pueden calcular fácilmente

(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of SECuence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; SECuence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y SECuence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991).

Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad y similitud entre dos secuencias de de polinucleótidos o polipéptidos, los términos “identidad” y “similitud” son bien conocidos por los expertos en la técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos empleados de manera común para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988).

Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

las dos secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad y similitud se codifican en programas de ordenador. Los procedimientos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programa GCG (Devereux, et al., Nucl. AcidRes. 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o identidad mencionado antes se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias, indicandoa menudo una derivación de la primera secuencia de la segunda. El grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico se puede determinar mediante programas de ordenador conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programa GCG (Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 -453 (1970)). Para los propósitos de determinar el grado de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos para la presente invención, GAP se usa con las siguientes situaciones: fallo de creación de GAP de 5,0 y fallo de extensión de GAP de 0.3.

Optimización de codón

La degeneración del código genético permite variaciones de la secuencia de nucleótidos de una proteína de transferrina y/o proteína terapéutica de interés, aunque todavía se esté produciendo un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido codificado por la secuencia de ADN nativo. El procedimiento, conocido como “optimización de codón” (descrito en la Patente de Estados Unidos 5.547.871) proporciona un medio de diseñar tal secuencia de ADN alterada. El diseño de genes de codón optimizado debe tener en cuenta una diversidad de factores, incluyendo la frecuencia de uso de codón en un organismo, lo más cerca de las secuencias vecinas, estabilidad de ARN, el potencial de la formación de la estructura secundaria, la vía de síntesis y las manipulaciones de ADN futuras propuestas de ese gen. En particular, los procedimientos disponibles se pueden usar para alterar los codones que codifican una proteína de fusión dada con los que se reconocen más fácilmente por la levadura cuando se usan los sistemas de expresión en levadura.

La degeneración del código genético permite que la misma secuencia de aminoácidos se codifique y traduzca de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, leucina, serina y arginina están cada una de ellas codificada por seis codones diferentes, mientras que valina, prolina, treonina, alanina y glicina están cada una de ellas codificada por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de tales codones sinónimos varia de genoma en genoma entre eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los patrones de elección de codones sinónimos entre mamíferos son muy similares, mientras que los organismos distantes de manera evolutiva tales como levadura (S. cerevisiae), bacterias (tal como E. coli) e insectos (tal como D. melanogaster) revelan un patrón claramente diferente de frecuencias de uso de codón genómico (Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 8, 49 -62 (1980); Grantham, R., et al., Nucl. Acid Res., 9, 43 -74 (1981); Maroyama, T., et al., Nucl. Acid Res., 14, 151 -197 (1986); Aota, S., et al.,Nucl. Acid Res., 16, 315 -402 (1988); Wada, K., et al., Nucl. Acid Res., 19 Sup., 1981 -1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165 -169 (1991)). Estas diferencias en patrón de elección de codón parecen contribuir a los niveles de expresión global de genes individuales modulando las velocidades de elongación de péptidos. (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165 -169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895 -2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365 -377 (1989); Randall, L. L., et al., Eur. J. Biochem., 107, 375 -379 (1980); Curran, J. F. y Yarus, M., J. Mol. Biol., 209, 65 -77 (1989); Varenne, S., et al., J. Mol. Biol., 180, 549 -576 (1984), Varenne, S., et al., J. Mol, Biol., 180, 549 -576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211 -225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1 -21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389 -409 (1981)).

Las frecuencias de uso de codón para un gen sintético deben reflejar los usos de codón de genes nucleares derivados del genoma exacto (o tan estrechamente relacionados como sea posible) de la célula/organismo que se pretende usar para la expresión de la proteína recombinante, particularmente la de especies de levaduras. Como se ha descrito anteriormente, en una realización la secuencia de Tf humana es de codón optimizado, antes o después de la modificación como se describe en el presente documento para la expresión de levadura como puede ser la(s) secuencia(s) de nucleótidos de proteína(s) terapéutica(s).

Vectores

Las unidades de expresión para uso en la presente invención comprenderán en general los siguientes elementos, unidos de manera operativa en una orientación 5’ a 3’: un promotor transcripcional, una secuencia de señal secretora, una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión Tf modificada que comprende proteína de transferrina o una parte de una proteína de transferrina unida a una secuencia de ADN que codifica una proteína terapéutica o péptido de interés y un terminador transcriptional. Como se ha descrito anteriormente, cualquier disposición de la proteína terapéutica o péptido fusionado a o dentro de la parte Tf se puede usar en los vectores dela invención. La selección de promotores adecuados, secuencias de señal y terminadores se determinarán por la célula huésped seleccionada y será evidente para los expertos en la técnica y se describen más de manera específica más adelante.

Los vectores de levadura adecuados para uso en la presente invención se describen en la Patente de Estados Unidos 6.291.212 e incluyen YRp7 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76: 1035 -1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121 -133, 1979), pJDB249 y pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104 -108, 1978), pPPC0005, pSeCHSA, pScNHSA, pC4 y sus derivados. Los vectores de plásmido de levadura útiles también incluyen pRS403406, pRS413-416 y los vectores de Pichia disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, Estados Unidos. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos que se integran en levadura (YIps) e incorporan los marcadores que se pueden seleccionar de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413~41.6 son plásmidos de centrómero de levadura (YCps).

Tales vectores incluirán en general un marcador que se puede seleccionar, que puede ser uno de cualquier número de genes que muestran un fenotipo dominante para el que existe un ensayo fenotípico para permitir que los transformantes se seleccionen. Los marcadores que se pueden seleccionar preferidos son los que complementan la auxotrofía de la célula huésped de complemento, proporcionan resistencia a antibióticos o permiten que una célula utilice fuentes de carbono e incluyen LEU2 (Broach et al. ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17, 1979), HIS3

imagen10

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

como células de mamífero, de insecto, de hongos, de plantas y de bacterias.

Las células de hongos, que incluyen especies de levadura (por ejemplo, Saccharomyces spp.,Schizosaccharomyces spp., Pichia spp.) se pueden usar como células huésped dentro de la presente invención. Los géneros ejemplares de levadura contemplados que son útiles en la práctica de la presente invención como huéspedes para la expresión de la proteína de fusión de transferrina de la invención son Pichia (incluyendo las especies anteriormente clasificadas como Hansenula), Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Candida, Torulopsis, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Citeromyces, Pachysolen, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Trichoderma, Cephalosporium, Humicola, Mucor, Neurospora, Yarrowia, Metschunikowia, Rhodosporidium,Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis y similares. Son ejemplos de Saccharomyces spp. S. cerevisiae, S. italicus y S. rouxii. Los ejemplos de KIuyveromyces spp. son K. lactis y K. marxianus. Una especie adecuada es T. delbrueckii. Son ejemplos de Pichia (Hansenula) spp. P. angusta (antes H. polimorpha), P. anomala (antes H. anomala) y P. pastoris.

Las células huésped particularmente útiles para producir las proteínas de fusión de Tf de la divulgación son la Pichia pastoris metanoltrófica (Steinlein et al. (1995) Protein Express. Purif. 6:619 -624). Pichia pastoris ha sido desarrollada para ser un huésped destacado para la producción de proteínas extrañas ya que su promotor de la alcohol oxidasa se aisló y se clonó; su transformación se reseñó primero en 1985. P. pastoris puede utilizar metanolcomo una fuente de carbono en ausencia de glucosa. El sistema de expresión de P. pastoris puede usar el promotorde la alcohol oxidasa (AOX1) inducida por metanol, que controla el gen que codifica la expresión de la alcohol oxidasa, la enzima que cataliza la primera etapa en el metabolismo de metanol. Este promotor se ha caracterizado e incorporado en una serie de vectores de expresión de P. pastoris. Ya que las proteínas producidas en P. pastoris están de manera típica plegadas correctamente y secretadas en el medio, la fermentación de P. pastoris modificada por ingeniería genética proporciona una excelente alternativa a los sistemas de expresión de E. coli. Se han producido numerosas proteínas usando este sistema, incluyendo fragmento de toxina de tétanos, pertactina de Bordatella pertussis, albúmina de suero humano y lisozima.

La transformación de F. oxysporum puede, por ejemplo, llevarse a cabo como se describe por Malardier et al. (1989)Gene 78: 147 -156.

Las cepas de la levadura Saccharomyces cerevisiae son otro huésped preferido. En una realización, se usa una célula de levadura, o de manera más específica, una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que contiene unadeficiencia genética en un gen requerido para la glucosilación ligada a asparagina de glucoproteínas. Células huésped de S. cerevisiae que tienen tales defectos se pueden preparar usando técnicas convencionales de mutación y selección, aunque muchas cepas de levadura se han modificado para prevenir o reducir la glucosilación

o hipermanosilación. Ballou et al. (J. Biol. Chem. 255: 5986 -5991, 1980) han descrito el aislamiento de mutantes de la síntesis de mannoproteína que son defectuosos en genes que afectan a la glucosilación asociada a asparagina.Gentzsch y Tanner (Glicobiology 7:481 -486, 1997) han descrito una familia de al menos seis genes (PMT1-6) que codifican las enzimas responsables de la primera etapa en la O-glucosilación de proteínas en levadura. Los mutantes defectuosos en uno o más de estos genes muestran glucosilación ligada a O reducida y/o especificidad alterada de O-glucosilación.

Para optimizar la producción de las proteínas heterólogas, se puede preferir que la cepa huésped lleve una mutación, tal como la mutación S. cerevisiae pep4 (Jones, Genetics 85: 23 -33, 1977), que da como resultado la actividad proteolítica reducida. Las cepas huésped que contienen mutaciones en otras regiones que codifican proteasas son particularmente útiles para producir grandes cantidades de proteínas de fusión de Tf de la invención.

Las células huésped que contienen construcciones de ADN de la presente invención se desarrollan en un medio de crecimiento apropiado. Como se usa en el presente documento, el término “medio de crecimiento apropiado” significa un medio que contiene nutrientes requerido para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento de la célula pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento. El medio de crecimiento en general seleccionará las células que contienen la construcción de ADN, por ejemplo, por selección de fármaco o deficiencia en un medio nutriente esencial que se complementa por el marcador que se puede seleccionar sobre la construcción de ADN o transfectado de manera conjunta con la construcción de ADN. Las células de levadura, por ejemplo, se desarrollan preferiblemente en un medio definido químicamente, que comprende una fuente de carbono, por ejemplo, sacarosa, una fuente de nitrógeno de no aminoácido, sales inorgánicas, vitaminas y suplementos de aminoácidos esenciales.El pH del medio se mantiene preferiblemente a un pH mayor que 2 y menor que 8, preferiblemente a pH 5,5 a 6,5.Los procedimientos para mantener un pH estable incluyen tamponación y control de pH constante, preferiblemente mediante la adición de hidróxido de sodio. Los agentes de tamponación preferidos incluyen ácido succínico y Bis-Tris (Sigma Chemical Co., San Luis, Mo.). Las células de levaduras que tienen un defecto en un gen requerido para la glucosilación ligada a asparagina se desarrollan preferiblemente en un medio que contiene un estabilizador osmótico. Un tal estabilizador osmótico es sorbitol suplementado en el medio a una concentración entre 0,1 M y 1,5 M., preferiblemente a 0,5 M o 1,0 M.

Las células de mamífero cultivadas se desarrollan en general en medios comercialmente disponibles que contienen suero o sin suero. La selección de un medio apropiado para la línea de células particular usada está dentro del nivel de la experiencia ordinaria en la técnica. Las células de mamífero transfectadas se dejan crecer durante un período de tiempo, de manera típica 1 -2 días, para comenzar la expresión de la(s) secuencia(s) de ADN de interés. La selección de fármacos se aplica después para seleccionar el crecimiento de las células que expresan el marcador que se puede seleccionar de una manera estable. Para las células que se han transfectado con un marcador que sepuede seleccionar que se puede amplificar la concentración de fármaco se puede aumentar de una manera por etapas para seleccionar el número de copias incrementado de las secuencias clonadas, incrementando por lo tanto los niveles de expresión.

Los sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos también se pueden usar para producir las proteínas de

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

fusión de Tf modificadas de la invención. El Sistema de expresión de Baculovirus BacPAK™ (BD Biosciences (Clontech)) expresa las proteínas recombinantes a altos niveles en células huésped de insecto El gen diana se inserta en un vector de transferencia, que se transfecta de manera conjunta en células huésped de insecto con el ADN viral de BacPAK6 linealizado. El ADN de BacPAK6 ADN está ausente en una parte esencial del genoma de baculovirus. Cuando el ADN se recombina con el vector, se reestablece el elemento esencial y el gen diana se transfiere al genoma del baculovirus. Después de la recombinación, se recogen unas pocas placas virales y sepurifican y se verifica el fenotipo recombinante. El virus recombinante recientemente aislado después se puede amplificar y usar para infectar los cultivos de células de insecto para producir grandes cantidades de la proteína deseada.

Secuencias de señal secretoras

Los términos “secuencia de señal secretora” o “secuencia de señal” o “secuencia guía de secreción” se usan indistintamente y se describen en, por ejemplo la Patente de Estados Unidos 6.291.212 y la Patente de Estados Unidos 5.547.871, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. Las secuencias de señal secretoras o secuencias de señal o secuencias guía de secreción codifican péptidos secretores.Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína maduro de una célula. Los péptidos secretores están en general caracterizados por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y de manera típica (pero no exclusivamente) se encuentran en los extremos amino de las proteínas recientemente sintetizadas. Muy a menudo el péptido secretor se escinde de la proteína madura durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permiten la escisión del péptido de señal de la proteína madura ya que pasa a través de la ruta secretora. Los sitios de procesamiento pueden estar codificados dentro del péptido de señal o se pueden añadir al péptido de señal, por ejemplo, mutagénesis in vitro.

Los péptidos secretores se pueden usar para dirigir la secreción de proteínas de fusión de Tf modificadas de la invención. Un péptido secretor tal que se puede usar en combinación con otros péptidos secretores es el tercer dominio de la proteína de barrera de levadura. Las secuencias de señal secretoras o secuencias de señal o secuencias guía de secreción se requieren para una serie compleja de etapas de procesamiento después de la traducción de una proteína. Si una secuencia de señal intacta está presente, la proteína que se expresa entra en el lumen del retículo endoplásmico rugoso y después se transporta a través del aparato de Golgi a vesículas secretorasy finalmente se transporta al exterior de la célula. En general, a la secuencia de señal sigue inmediatamente el codón de inicio y codifica un péptido de señal en el extremo amino-terminal de la proteína a secretar. En la mayoría de los casos, la secuencia de señal se retira por escisión mediante una proteasa específica, llamada una peptidasa de señal. Las secuencias de señal preferidas mejoran el procesamiento y eficacia de exportación de la expresión de la proteína recombinante usando vectores de expresión virales, de mamíferos o levaduras. En algunos casos, la secuencia de señal de Tf nativa se puede usar para expresar y secretar las proteínas de fusión de la invención.

Engarces

El resto Tf y el ligando de las proteínas de transferrina de fusión modificadas de la divulgación se pueden fusionar directamente o usando un péptido de engarce de diversas longitudes para proporcionar mayor separación física y permitir más movilidad espacial entre las proteínas fusionadas y de esta manera maximizar la accesibilidad de laregión variable de anticuerpo, por ejemplo, para unirse a su receptor afín. El péptido de engarce puede constar de aminoácidos que son flexibles o más rígidos. Una divulgación incluye un engarce sustancialmente no helicoidal tal como (PEAPTD)n (SEC ID NO: 18). En otra divulgación, la proteína de fusión de la invención contiene un engarce con un tramo poli-glicina. El engarce puede ser de menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, o 10 restos de aminoácido. El engarce se puede unir de manera covalente a y entre la proteína de transferrina o porción de la misma y la región variable de anticuerpo.

También se pueden usar engarces para unir la región variable de anticuerpos dentro de un ligando o ligandos. Los engarces adecuados para unir la región variable de anticuerpos son los que permiten que las regiones variables de anticuerpos se plieguen en una estructura de tres dimensiones que mantiene la especificidad de unión de un anticuerpo completo.

Procedimientos de selección

El número de moléculas diana posible para el que se pueden identificar ligandos mediante la selección de bibliotecas de proteínas de fusión de la presente invención es virtualmente ilimitado. Por ejemplo, la molécula diana, es decir receptor o agente, puede ser un anticuerpo (o parte de unión del mismo) o antígeno. El antígeno al que se une el anticuerpo puede conocerse y quizás incluso secuenciarse, en cuyo caso la divulgación se puede usar para mapear los epítopos del antígeno. Si no se conoce el antígeno, tal como con ciertas enfermedades autoinmunes, por ejemplo, suero, fluidos, tejido, o células de pacientes con la enfermedad se pueden usar en el presenteprocedimiento de selección para identificar péptidos y por consiguiente el antígeno, que provocan la respuesta autoinmune. Una vez se ha identificado un péptido, ese péptido puede servir como, o proporcionar la base para, el desarrollo de una vacuna, un agente terapéutico, un reactivo de diagnóstico, etc. Véase el documento WO 01/46698para una lista de moléculas diana sobre la que se pueden seleccionar los ligandos.

La selección se puede realizar mediante el uso de los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como bioafinidad, FACS o MACS. En una realización de la invención, la selección se realiza para la activación del receptor. La diana puede estar bien purificada y en solución o bien unida a superficie o asociada a célula. La diana puede estar marcada, por ejemplo, con biotina o mediante otros procedimientos conocidos en la técnica.

Los polipéptidos y péptidos que tienen la propiedad deseada se pueden aislar e identificar mediante la secuenciaciónde la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente o mediante secuenciación de aminoácidos o espectrometría de masas. La optimización posterior se puede realizar mediante repetición del reemplazo de las subsecuencias por secuencias diferentes, preferiblemente mediante secuencias aleatorias y la etapa de selección una o más veces.

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

Una vez que se ha construido una biblioteca de péptidos, las células huésped se transforman con los vectores de biblioteca. Los transformantes exitosos se seleccionan de manera típica mediante crecimiento en un medio selectivo

o en condiciones selectivas, por ejemplo, un medio de crecimiento apropiado u otros dependiendo del vector usado.Esta selección se puede hacer sobre medio de crecimiento sólido o líquido. Para el desarrollo de células bacterianas sobre medio sólido, las células se desarrollan a una alta densidad (aproximadamente. 108 a 109 transformantes por m2) sobre una gran superficie de, por ejemplo, L-agar que contiene el antibiótico selectivo para formar esencialmente un césped confluente. Para el desarrollo en cultivo líquido, las células se pueden desarrollar en medio de cultivo L (con selección de antibiótico) a través de aproximadamente 10 o más duplicaciones. El desarrollo en cultivo líquido puede ser más conveniente debido al tamaño de las bibliotecas, mientras el desarrollo sobre medio sólido del mismo proporciona menos oportunidad de desviación durante el procedimiento de amplificación.

Si se va a seleccionar una biblioteca de péptidos de proteína de fusión de transferrina mediante despliegue en la superficie de la células de levadura, las células de levadura se transformarán con el vector de expresión que codifica la proteína de fusión de transferrina. Es consistente una gama completa de procedimientos de mutagénesis con la construcción de biblioteca de despliegue en la superficie de levadura tal como reacción en cadena de la polimerasa propensa a error y recomposición de ADN. Véase Boder et al. (2000) Methods of Enzymology 328: 430 -444. De manera alternativa, el resto de tranferrina de las proteínas de fusión expresadas pueden servir como una estructurapara las secuencias de péptido aleatorio o CDR.

Se conocen en la técnica varios planteamientos para identificar los péptidos deseables una vez que se ha creado una biblioteca de péptidos de proteína de fusión de transferrina de célula de levadura. Por ejemplo, los péptidos se pueden distinguir mediante la unión equilibrada con bajas concentraciones de diana marcada de manera fluorescente, es decir receptor o agente, en los casos de concentraciones de bastante baja afinidad (Kd > nM, o sinafinidad si la biblioteca se está seleccionando para aislar especificidad de unión novedosa). Para las aplicaciones diseñadas para desarrollar proteínas de fuerte unión, pueden ser necesarios grandes volúmenes de soluciones diana diluidas para mantener un exceso molar de ligando, complicando la manipulación de las muestras. En tales casos, las mejoras en la afinidad de unión se pueden aproximar mediante cambios en la cinética de disociación. La competición cinética por una diana estequiométricamente limitante se puede usar para identificar clones mejoradosdentro de la población (Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889); sin embargo, este planteamiento elimina las cantidades predecibles del planteamiento de selección y no se recomienda en general. Véase Boder et al. (2000)Methods of Enzymology 328: 430 -444.

Las dianas pueden estar biotiniladas o marcadas de manera fluorescente, o de manera alternativa, se puede marcar un ligando de interés, es decir un péptido desplegado sobre transferrina. Preferiblemente, las dianas están marcadas. Las dianas marcadas, por ejemplo, dianas biotiniladas, se pueden incubar con una biblioteca de péptidos de proteína de fusión de transferrina. La biblioteca puede tener al menos aproximadamente 104 miembros (es decir péptidos desplegados), al menos aproximadamente 105 miembros, al menos aproximadamente 106 miembros, al menos aproximadamente 107 miembros, al menos aproximadamente 108 miembros, al menos aproximadamente 109 miembros, al menos aproximadamente 1010 miembros, al menos aproximadamente 1011 miembros, al menos aproximadamente 1012 miembros, al menos aproximadamente 1013 miembros, al menos aproximadamente 1014 miembros, al menos aproximadamente 1015 miembros, o al menos aproximadamente 1016 miembros.

Después de la incubación, las células se pueden marcar con una segunda etiqueta tal como anticuerpossecundarios, una molécula marcada con estreptavidina, u otro procedimiento conocido en la técnica. El anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo anti-biotina. Las molécula marcadas con estreptavidina, incluyen, pero no se limitan a, microperlas de estreptavidina-ficoeritrina o estreptavidina.

Se puede usar citometría de flujo para analizar poblaciones de células como se conoce en la técnica. Cuando se hace esto, solamente se analiza la fracción de despliegue de la población. Véase Boder et al. (2000) Methods of Enzymology 328: 430 -444 y Kondo et al. (2004) Appl. Microbiol. Biotechnol. 64: 28 -40, las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad.

De manera alternativa, si se usa un segundo marcado que consiste en perlas marcadas, es decir perlas marcadas con anti-biotina o estreptavidina, la mezcla de ligandos y moléculas diana se pueden aislar usando un protocolo de aislamiento como se describe en Yeung et al. (2002) Biotechnol. Prog. 18: 212 -220. Se puede usar un kit MACS® MicroBeads con este protocolo de selección (Miltenyi Biotec GmbH). El aislamiento magnético se puede usar junto con FACS.

En una divulgación, es deseable caracterizar un solo ligando de interés expresado en una célula de levadura. La proteína expresada se puede seleccionar de una diversidad de formas. Si la proteína tiene una función se puede ensayar directamente. Por ejemplo, los anticuerpos de una sola cadena expresados sobre la superficie de levadura son completamente funcionales y se pueden seleccionar basándose en la unión a un antígeno. Si la proteína no tiene una función detectable que se pueda ensayar fácilmente, la expresión del ligando se puede controlar usando un anticuerpo. Debido a que una célula de levadura es mucho mayor que el fago, se puede usar citometría de flujo para controlar el fenotipo de la proteína sobre una sola célula de levadura.

En otra realización de la presente invención, la unión del resto de ligando con un receptor o agente se realiza mediante medios conocidos en la técnica, distintos del despliegue sobre la superficie de la célula, tal como mediante ELISA, ensayos de unión competitiva cuando se conoce la pareja de unión nativa de la diana, ensayos de sándwich, ensayos de radiorreceptor usando un ligando radiactivo cuyo enlace está bloqueado por la biblioteca de péptido, etc. En estos procedimientos, las células huésped transformadas con la biblioteca de péptidos de la proteína de fusión Tf se lisan. Los péptidos de la proteína de fusión Tf están anclados al sustrato de ensayo mediante un resto de anclaje apropiado tal como, pero no limitado a, un anticuerpo anti-MUC1. El procedimiento de selección implica la reacción de la biblioteca de péptidos de Tf con la diana de interés para establecer un nivel de unión de línea de base contra elque las actividades de unión de las bibliotecas de péptidos posteriores se comparan. La naturaleza del ensayo no es crítica mientras sea suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de unión de péptidos a o

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

competición de unión para la unión a la diana. Las condiciones de ensayo se pueden variar para tener en cuenta las condiciones de unión óptimas para diferentes sustancias de unión de interés u otras actividades biológicas. De este modo, el pH, temperatura, concentración salina, volumen y duración de unión, etc. se pueden usar para lograr la unión del péptido a una diana en condiciones que se parecen a las del ambiente de interés.

Una vez que se determina que la biblioteca de los péptidos de Tf posee un péptido o péptidos que se unen a la diana de interés, los procedimientos de la invención se pueden usar para identificar la secuencia del (de los) péptido(s) en la mezcla. Los péptidos que se despliegan sobre las células que se unen a la diana se pueden aislar de la población general de la biblioteca mediante selección de MACS o FACS. El procedimiento de selección se repite durante 2 a 3 veces sobre los aislamientos iniciales para reducir drásticamente cualesquiera enlaces no específicos. Después se realiza una ronda final de selección mediante aislamiento de FACS basándose en la afinidad de unión. Se recupera el ADN de plásmido a partir de células aisladas y el ADN para la región de la inserción se secuencia para determinar la secuencia de proteínas. Después se pueden determinar los restos comunes entre los aislamientos.

Moléculas de ligando terapéuticas

Los ligandos de la divulgación pueden ser moléculas terapéuticas supuestas o conocidas. Como se usa en el presente documento, una molécula terapéutica es de manera típica una proteína o péptido capaz de ejercer un efecto biológico beneficioso in vitro o in vivo e incluye proteínas o péptidos que ejercen un efecto beneficioso en relación con la homeostasis normal, fisiología o un estado patológico. Las moléculas terapéuticas no incluyen parejas de fusión usadas comúnmente como marcadores o auxiliares de purificación de proteína, tales como galactosidasas (véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 5.986.067 y Aldred et al. (1984) Biochem. Biophys.Res. Commun. 122: 960 -965). Por ejemplo, un efecto beneficioso relacionado con un estado patológico incluyecualquier efecto que es ventajoso para el sujeto tratado, incluyendo prevención de enfermedad, estabilización de enfermedad, la reducción o alivio de los síntomas de enfermedad o una modulación, alivio o cura del defecto subyacente para producir un efecto beneficioso al sujeto tratado.

Se puede fusionar un ligando terapéutico directamente a un resto de transferrina o indirectamente mediante un resto de engarce como se ha descrito previamente. En una divulgación, puede ser deseable escindir la proteína de fusión para separar la parte de transferrina y ligando de la proteína de fusión del remanente de la proteína de fusión. En otra realización, puede ser deseable escindir el ligando del remanente de la proteína de fusión.

El resto de ligando de la proteína de fusión de la invención puede contener al menos un fragmento o variante de una proteína terapéutica, y/o al menos un fragmento o variante de un anticuerpo. En una divulgación adicional, las proteínas de fusión pueden contener fragmentos de péptido o variantes de péptido de proteínas o anticuerpos en las que la variante o fragmento retiene al menos una actividad terapéutica o biológica. Las proteínas de fusión pueden contener proteínas terapéuticas que pueden ser fragmentos de péptido o variantes de péptido de al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, o al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 55, al menos aproximadamente 60 o al menos aproximadamente 70 o más aminoácidos de longitud fusionados a los extremos N y/o C, insertados dentro, o insertados en un bucle de una transferrina modificada.

En otra divulgación, el resto de ligando de la proteína de fusión de la presente invención contiene una parte de proteína terapéutica que puede ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más restos suprimidos del extremo amino de la secuencia de aminoácidos.

En otra divulgación, el resto de ligando de la proteína de fusión de la presente invención contiene una parte de la proteína terapéutica que puede ser fragmentos de una proteína terapéutica que incluyen la proteína de longitud completa así como polipéptidos que tienen uno o más restos suprimidos del extremo carboxi de la secuencia de aminoácidos.

En otra divulgación, el resto de ligando de las proteínas de fusión de la presente invención contienen una parte de la proteína terapéutica que pueden tener uno o más aminoácidos suprimidos de ambos extremos amino y carboxi.

En otra divulgación, la proteína de fusión contiene una parte de proteína terapéutica, es decir resto de ligando, que es al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una proteína terapéutica de referencia establecida en el presente documento, o sus fragmentos. En realizaciones adicionales, las moléculas de fusión de transferrina contienen una parte de la proteína terapéutica que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de las supresiones N-y C-terminal como se ha descrito anteriormente.

En otra divulgación, la proteína de fusión contiene la parte de la proteína terapéutica que es al menos aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, idéntica a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos nativa o de tipo natural de una proteína terapéutica. Los fragmentos, de estos polipéptidos también se proporcionan.

Las proteínas terapéuticas que corresponden a una parte de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina modificada de la invención, tal como la superficie de la célula y proteínas secretoras, se puedenmodificar mediante unión de uno o más grupos oligosacarídicos. La modificación denominada glucosilación, puede afectar de manera significativa a las propiedades físicas de proteínas y puede ser importante en la estabilidad de la proteína, secreción y localización. La glucosilación se produce en localizaciones específicas junto con la estructura central del polipéptido. Existen usualmente dos tipos principales de glucosilación: glucosilación caracterizada por la oligosacáridos ligados a O, que están unidos a restos de serina o treonina; y glucosilación caracterizada por oligosacáridos ligados a N, que están unidos a restos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X

15

25

35

45

55

65

E12157790

21-04-2015

puede ser un aminoácido salvo prolina. Las variables tales como estructura de proteína y tipo de célula influyen en el número y naturaleza de las unidades de carbohidrato dentro de las cadenas en diferentes sitios de glucosilación. Los isómeros de glucosilación son también comunes en el mismo sitio dentro de un tipo de célula dada. Por ejemplo, varios tipos de interferón humano están glucosilados.

Las proteínas terapéuticas que corresponden a una parte de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de la divulgación, así como sus análogos y variantes, se pueden modificar de manera que la glucosilación en uno o mássitios se altera como un resultado de la manipulación(es) de su secuencia de ácido nucleico por la célula huésped en las que se expresan, o debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, se pueden producir los isómeros de glucosilación mediante abolición de o introducción de los sitios de glucosilación, por ejemplo, mediante sustitución o supresión de restos de aminoácido, tales como sustitución de glutamina para asparagina, o proteínas recombinantes no glucosiladas se pueden producir mediante la expresión de las proteínas en las células huésped que no las glucosilarán, por ejemplo, en levadura deficiente en glucosilación. Estos planteamientos se conocen en la técnica.

Las proteínas terapéuticas y sus secuencias de ácido nucleico se conocen bien en la técnica y están disponibles enlas bases de datos públicas tales como las bases de datos de los servicios de los Resúmenes de Química (porejemplo, el Registro CAS), GenBank y GenSEC.

La presente divulgación se refiere además a proteínas de fusión que comprenden fragmentos de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento. Incluso si la supresión de uno o más aminoácidos del extremo Nde una proteína da como resultado la modificación o pérdida de una o más funciones biológicas de la parte de proteína terapéutica, otras actividades y/o actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas, capacidad demultimerizarse, capacidad de unirse a un ligando) se pueden todavía retener. Por ejemplo, la capacidad de los polipéptidos con supresiones N-terminales para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas

o maduras de los polipéptidos en general se retendrán con menos de la mayoría de los restos del polipéptido completo del extremo N. Si un polipéptido particular que carece de los restos N-terminales de un polipéptidocompleto retiene tales actividades inmunológicas se pueden ensayar mediante procedimientos de rutina descritos en el presente documento y conocidos de otra manera en la técnica. No es probable que un mutante con un gran número de residuos de aminoácidos N-terminal suprimidos pueda retener algunas actividades biológicas o inmunogénicas. De hecho, los péptidos compuestos de tan pocos como seis residuos de aminoácidos pueden a menudo inducir una respuesta inmune.

También como se ha mencionado anteriormente, incluso si la supresión de uno o más aminoácidos del extremo N oextremo C de una proteína terapéutica da como resultado la modificación o pérdida de uno o más funciones biológicas de la proteína, otras actividades funcionales, por ejemplo, actividades biológicas, capacidad de multimerizarse, capacidad de unirse a un ligando, y/o actividades terapéuticas todavía se pueden retener. Por ejemplo la capacidad de polipéptidos con supresiones C-terminales para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen las formas completas o maduras del polipéptido en general se retendrán cuando menos de la mayoría de los residuos del polipéptido completo o maduro se eliminan del extremo C. Si un polipéptido particular que carece de los residuos N-terminales y/o, C-terminales de un polipéptido de referencia retiene la actividad terapéutica se puede determinar fácilmente mediante procedimientos descritos en el presente documento y/o de otra manera conocidos en la técnica.

Los fragmentos de péptido de las proteínas terapéuticas pueden ser fragmentos que comprenden, o de manera alternativa, consisten en, una secuencia de aminoácidos que muestra una actividad terapéutica y/o actividad funcional, por ejemplo, actividad biológica, de la secuencia de polipéptidos de la proteína terapéutica de la que la secuencia de aminoácidos es un fragmento.

Otros fragmentos de polipéptido son fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos biológicamente activos son los que muestran actividad similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad de una proteína terapéutica usada en la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada, o una actividad no deseable disminuida.

En general, las variantes de proteínas son en conjunto muy similares y en muchas regiones, idénticas a la secuencia de aminoácidos de la proteína terapéutica que corresponde a una parte de la proteína terapéutica de una proteína de fusión de transferrina de la invención. Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes están también abarcados por la invención.

Además los polipéptidos terapéuticos que se pueden usar en la divulgación son polipéptidos codificados por los polinucleótidos que se hibridan al complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína terapéutica en condiciones de hibridación rigurosas que son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons Inc., Nueva. York. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos están también abarcados por la invención.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% “idéntica” a una secuencia de aminoácidos de investigación de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia de investigación salvo porque la secuencia de polipéptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de investigación. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de investigación, hasta el 5% de los restos de aminoácidos en la secuencia sujeto se pueden insertar, suprimir, o sustituir con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se puede producir en las posiciones amino-o carboxi-terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre las posiciones terminales, entremezclados o bien individuales entre los restos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

Claims (1)

1. imagen1