ES2597845T3 - Métodos para el análisis de trastornos proliferativos celulares - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar carcinoma colorrectal o de próstata en un sujeto, que comprende detectar la presencia de metilación de TFAP2E en una muestra biológica aislada de dicho sujeto; en donde (i) en el caso de cáncer de próstata la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de tejido prostático, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células obtenidas de la sangre obtenida del sujeto y en orina; y (ii) en el caso de carcinoma de colon, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de tejido de colon, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera y células obtenidas de la sangre obtenida del sujeto; en donde la presencia de metilación de CpG es indicativo de la presencia de dicho trastorno y la ausencia del mismo es indicativo de la presencia de un trastorno proliferativo celular benigno.
Description
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El término "MSP" (PCR específica de la metilación) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Herman y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 9821 -9826, 1996, y en la patente estadounidense No.
5.786.146.
El término "COBRA" (análisis de restricción combinado con bisulfito) se refiere al ensayo de metilación reconocido en la técnica descrito por Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997.
El término "MCA" (amplificación de una isla de CpG metilada) se refiere al ensayo de metilación descrito por Toyota y colaboradores, Cancer Res. 59: 2307-12, 1999, y en el documento WO 00/26401A1.
El término "hibridación" debe entenderse como un enlace de un oligonucleótido con una secuencia complementaria a lo largo de las líneas de los emparejamientos de bases de Watson-Crick en el ADN de la muestra, formando una estructura dúplex.
Las "condiciones de hibridación rigurosas", como se define en el presente documento, implican la hibridación a 68°C en una solución de Denhardt 5x/5x SSC /SDS al 1,0%, y lavado en 0,2x SSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente, o involucra al equivalente del mismo reconocido en la técnica (por ejemplo, las condiciones en las que una hibridación se lleva a cabo a 60°C en regulador 2,5 x SSC, seguido por varias etapas de lavado a 37°C en una concentración baja de regulador, y se mantiene estable). Las condiciones moderadamente rigurosas, como se define en el presente documento, implican la inclusión de lavado en 3x SSC a 42°C, o el equivalente del mismo reconocido en la técnica. Los parámetros de concentración de sal y temperatura se pueden variar para alcanzar el nivel óptimo de identidad entre la sonda y el ácido nucleico objetivo. La orientación con respecto a tales condiciones está disponible en la técnica, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Ausubel y colaboradores. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) en la Unidad
2.10.
Los términos "enzimas de restricción específicas de la metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la metilación" se entiende que se refieren a una enzima que digiere selectivamente un ácido nucleico dependiente del estado de metilación de su sitio de reconocimiento. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento no está metilado o semimetilado, el corte no se llevará a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento está metilado. En el caso de tales enzimas de restricción que cortan específicamente si el sitio de reconocimiento está metilado, el corte no se llevará a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no está metilado. Se prefieren las enzimas de restricción específicas de metilación, la secuencia de reconocimiento que contiene un dinucleótido CG (por ejemplo cgcg o cccggg). También se prefieren para algunas realizaciones enzimas de restricción que no cortan si la citosina en este dinucleótido está metilada en el átomo de carbono C5.
Las "enzimas de restricción específicas cuando no hay metilación" o "enzimas de restricción sensibles a la falta de metilación" son enzimas de restricción que cortan una secuencia de ácido nucleico independientemente del estado de metilación con una eficiencia casi idéntica. También se les llama "enzimas de restricción no específicas de metilación".
En referencia a las secuencias de matriz de material compuesto, la frase "nucleótidos contiguos" se refiere a una región de secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual de la matriz de material compuesto, pero no incluye una región de la secuencia de matriz compuesta que incluye un "nodo" como se definió aquí anteriormente.
El término "TFAP2E" debe entenderse que incluye todas las variantes de transcripción de la misma y todos los elementos promotores y reguladores de las mismas. Por otra parte, ya que se conocen una pluralidad de SNP dentro de dicho gen, debe entenderse que el término incluye todas las variantes de secuencia de las mismas.
El término "precanceroso" y equivalentes del mismo se entiende que significa cualquier trastorno proliferativo celular que está experimentando una transformación maligna. Ejemplos de tales condiciones incluyen, en el contexto de los trastornos proliferativos celulares colorrectales, trastornos proliferativos celulares con un alto grado de displasia y las siguientes clases de adenomas:
Nivel 1: penetración de glándulas malignas a través de la mucosa muscular hacia la submucosa, dentro de la cabeza del pólipo
Nivel 2: la misma invasión submucosa, pero presente en la unión de la cabeza con el tallo
Nivel 3: invasión del tallo
Nivel 4: invasión de la base del tallo en la conexión con la pared del colon (este nivel se corresponde con el estadio de Dukes A)
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De acuerdo con la presente invención, la determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de la SEQ ID NO: 1 tiene utilidad tanto en el diagnóstico como en la caracterización de trastornos proliferativos celulares. En realizaciones preferidas, se determina el estado de metilación de las posiciones de CpG en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 2 son regiones particularmente preferidas de la SEQ ID NO: 1 (es decir, la SEQ ID NO: 1 comprende la SEQ ID NO: 2). La determinación del estado de metilación de secuencias de dinucleótidos CpG dentro de la SEQ ID NO: 2 también tienen utilidad en el diagnóstico y caracterización de trastornos proliferativos celulares.
Procedimientos de ensayo de metilación. Se conocen diversos procedimientos de ensayo de metilación en la técnica, y se pueden utilizar junto con la presente invención. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG (por ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de ADN. Tales ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ADN del ADN tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de la secuencia), análisis de transferencia tipo Southern, y el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación.
Por ejemplo, se ha simplificado la secuenciación genómica para el análisis de los patrones de metilación del ADN y la distribución de 5-metilcitosina usando tratamiento con bisulfito (Frommer y colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA. 89: 1827-1831, 1992). Además, se utiliza la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri y Hornsby (Nucl Acids Res. 24: 5058-5059, 1996), o COBRA (análisis de restricción combinado con bisulfito) (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997).
COBRA. El análisis COBRAMR es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar los niveles de metilación de ADN en los loci de genes específicos en cantidades pequeñas de ADN genómico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997). En resumen, se usa digestión con enzimas de restricción para revelar las diferencias de secuencia que dependen de la metilación en los productos de la PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia que dependen de la metilación se introducen primero en el ADN genómico por tratamiento estándar con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer y colaboradores (Proc Natl Acad Sci USA. 89: 18271831, 1992). Se realiza luego la amplificación por PCR del ADN convertido con bisulfito utilizando cebadores específicos para las islas de CpG de interés, seguido de digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección usando sondas de hibridación marcadas específicas. Los niveles de metilación en la muestra original de ADN se representan por las cantidades relativas de producto de la PCR digerido y no digerido en una forma linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación del ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma confiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido embebidas en parafina microdiseccionadas.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podría encontrar en un kit típico a base de COBRAMR) para el análisis COBRAMR pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para el gen específico (o una secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla de CpG); enzima de restricción y regulador apropiado; oligonucleótido de hibridación génica; oligonucleótido de control de la hibridación; kit de marcación de quinasa para la sonda de oligonucleótido; y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalización del ADN; regulador de desulfonación; reactivos o kits de recuperación del ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); regulador de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
Preferiblemente, se utilizan ensayos tales como las reacciones de "MethyLightMR" (una técnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads y colaboradores, Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999), Ms-SNuPEMR (extensión del cebador en un solo nucleótido sensible a la metilación) (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res 25: 2529-2531, 1997), PCR específica de la metilación ("MSP"; Herman y colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA. 93: 9821-9826, 1996; patente estadounidense No. 5.786.146), y amplificación de la isla de CpG metilada ("MCA"; Toyota y colaboradores, Cancer Res. 59: 2307-12, 1999) solos o en combinación con otro de estos métodos.
El ensayo "HeavyMethylMR", la técnica es un método cuantitativo para la evaluación de diferencias de metilación basado en la amplificación específica de metilación de ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo específicas de metilación (también denominadas en este documento como bloqueadoras) que cubre las posiciones de CpG entre, o cubiertas por los cebadores de amplificación permiten la amplificación selectiva específica de la metilación de una muestra de ácido nucleico.
El término ensayo "HeavyMethylMR MethyLightMR", en la realización del mismo implementado en el presente documento, se refiere a un ensayo HeavyMethylMR MethyLightMR, que es una variación del ensayo MethyLightMR, en donde el ensayo de MethyLightMR se combina con sondas de bloqueo específicas de metilación que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificación. El ensayo HeavyMethylMR también se puede usar en combinación con cebadores de amplificación específicos de metilación.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit típico con base en MethyLightMR) para el análisis HeavyMethylMR puede incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para los genes específicos (o secuencia de ADN
o isla de CpG tratada con bisulfito); el bloqueo de los oligonucleótidos; reguladores y desoxinucleótidos optimizados por PCR; y Taq polimerasa.
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MSP. MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla de CpG, independiente del uso de las enzimas de restricción sensibles a la metilación (Herman y colaboradores. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 9821-9826, 1996; patente estadounidense No. 5.786.146). En resumen, el ADN es modificado con bisulfito de sodio que convierte todas las citosinas no metiladas, pero no las metiladas, en uracilo, y subsecuentemente es amplificado con cebadores específicos para el ADN metilado versus el no metilado. MSP requiere solamente cantidades pequeñas de ADN, es sensible al 0,1% de los alelos metilados de un locus dado de una isla de CpG, y puede realizarse sobre el ADN extraído de las muestras embebidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como puede encontrarse en un kit típico basado en MSP) para el análisis de MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para un gen específico (o secuencia de ADN tratado o isla de CpG), reguladores optimizados de PCR y desoxinucleótidos, y sondas específicas.
MethyLightMR. El ensayo MethyLightMR es un ensayo de metilación cuantitativo de alto rendimiento que utiliza la tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqManMR) que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de la PCR (Eads y colaboradores, Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999). En resumen, el proceso MethyLightMR comienza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción de bisulfito de sodio, en una combinación mixta de diferencias en secuencia que dependen de la metilación de acuerdo con procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo). A continuación se realiza la PCR basada en fluorescencia en una reacción "sesgada" (con cebadores de PCR que se superponen a dinucleótidos CpG conocidos). La discriminación de secuencia puede producirse tanto a nivel del proceso de amplificación como a nivel del proceso de detección de fluorescencia.
El ensayo MethyLightMR puede ser utilizado como una prueba cuantitativa para los patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde se produce discriminación de la secuencia a nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona una amplificación específica de metilación en presencia de una sonda fluorescente que solapa un sitio de metilación particular putativo. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN que entra mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda recubren ninguno de los dinucleótidos CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilación genómica mediante el sondeo de la combinación sesgada de la PCR, ya sea con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethylMR y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.
El proceso MethyLightMR puede utilizarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo "TaqMan®", LightCycler® etc. Por ejemplo, se trata el ADN genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se lo somete a uno de los dos conjuntos de reacciones PCR usando sondas TaqMan®; por ejemplo, con los cebadores de MSP y/o oligonucleótidos bloqueadores HeavyMethyl y la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está marcada doblemente con moléculas "informadoras" e "inactivadoras", y está diseñada para ser específica para una región con un contenido relativamente alto de GC de manera que se funde a una temperatura aproximadamente a 10°C más alta en el ciclo de la PCR que los cebadores directo o inverso. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca hibridada completamente durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. Como la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva cadena durante la PCR, con el tiempo alcanzará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de endonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa desplazará entonces a la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su señal ahora inactivada usando un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit típico basado en MethyLightMR) para el análisis con MethyLightMR pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para el gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); sondas TaqMan® o LightCycler®; reguladores y desoxinucleótidos optimizados para PCR; y Taq polimerasa.
El ensayo QMMR (metilación cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para los patrones de metilación en muestras de ADN genómico, en donde la discriminación de la secuencia ocurre a nivel de hibridación de la sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona para una amplificación no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que solapa un sitio de metilación putativo particular. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda están sobre ninguno de los dinucleótidos CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para metilación genómica mediante el sondeo de la combinación sesgada de PCR, ya sea con oligonucleótidos de control que no "cubren" sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de las técnicas HeavyMethylMR y MSP), o con oligonucleótidos que cubren sitios de metilación potenciales.
El proceso QMMR se puede utilizar con cualquier sonda adecuada, por ejemplo "TaqMan®", LightCycler® etc. en el proceso de amplificación. Por ejemplo, se trata el ADN genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® está doblemente marcada con moléculas "informadoras" e "inactivadoras" fluorescentes, y está diseñada para ser específica para una región con un contenido relativamente alto de GC de manera que se funde a una temperatura aproximadamente 10ºC más alta en el ciclo de PCR que los cebadores directo o inverso. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de la PCR. Como la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva
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cadena durante la PCR, eventualmente alcanzará a la sonda TaqMan® hibridada. La actividad de la Taq polimerasa 5' a 3' endonucleasa desplazará entonces la sonda TaqMan® digiriéndola para liberar la molécula informadora fluorescente para detección cuantitativa de su señal ahora no inactivada usando un sistema de detección de fluorescencia en tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se puede encontrar en un kit típico a base de QMMR) para el análisis con QMMR pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para el gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); sondas TaqMan® o LightCycler®; reguladores optimizados de PCR y desoxinucleótidos; y Taq polimerasa.
Ms-SNuPE. La técnica Ms-SNuPEMR técnica es un método cuantitativo para la evaluación de las diferencias de metilación en sitios específicos de CpG sobre la base de tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por la extensión del cebador de un solo nucleótido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997). En resumen, se hace reaccionar el ADN genómico con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, dejando la 5metilcitosina sin cambios. La amplificación de la secuencia objetivo deseada se realiza luego usando cebadores de PCR específicos para el ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y se utiliza como una plantilla para el análisis de metilación en el(los) sitio(s) de CpG de interés. Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdiseccionadas), y evitar así la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en los sitios de CpG.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como podría encontrarse en un kit típico basado en Ms-SNuPEMR) para el análisis con MS-SNuPEMR pueden incluir, pero no limitarse a: cebadores de PCR para un gen específico (o secuencia de ADN o isla de CpG tratada con bisulfito); reguladores de PCR optimizados y desoxinucleótidos; kit de extracción en gel; cebadores de control positivo; cebadores de Ms-SNuPEMR para el gen específico; regulador de reacción (para la reacción de Ms-SNuPE); y nucleótidos marcados. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalización de ADN; regulador de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); regulador de desulfonación; y componentes de recuperación del ADN.
Se determinó que la secuencia genómica de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 2, y de variantes de las mismas tratadas de origen no natural de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 a la SEQ ID NO: 10, tiene una novedosa utilidad para la detección temprana, clasificación y/o tratamiento de trastornos proliferativos celulares, en particular, trastornos proliferativos celulares colorrectal y/o de próstata.
En una realización de la invención, el método comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto el ADN genómico (preferiblemente aislado a partir de fluidos corporales) obtenido del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro del gen TFAP2E (incluyendo su promotor y regiones reguladoras); y ii) detectar, o detectar y distinguir entre dos o más trastornos proliferativos celulares de colon o de próstata.
El ADN genómico puede ser aislado por cualquier medio estándar en la técnica, incluyendo el uso de kits disponibles en el mercado. En resumen, cuando se encapsula el ADN de interés en una membrana celular, la muestra biológica debe ser cortada y lisada mediante medios enzimáticos, químicos o mecánicos. La solución de ADN puede entonces ser liberada de las proteínas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestión con proteinasa K. El ADN genómico se recupera entonces de la solución. Esto puede llevarse a cabo por medio de una variedad de métodos que incluyen precipitación en solución salina, extracción orgánica o unión del ADN a un soporte de fase sólida. La elección del método se verá afectada por varios factores incluyendo el tiempo, el coste y la cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestras clínicas que comprenden la materia neoplásica o la materia precancerosa son adecuados para uso en el presente método, se prefieren las líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, heces, efluente colónico, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, células aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferida de ADN; particularmente preferida es la orina, ya sea normalmente evacuados o masaje postprostático.
La muestra de ADN genómico se trata luego con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una región objetivo del ADN genómico, en donde la región objetivo comprende, o se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 2, respectivamente, en donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG.
Se prefiere particularmente que dicho reactivo convierta las bases de citosina que están sin metilar en la posición 5' en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en términos de comportamiento de hibridación. Sin embargo, en una realización alternativa dicho reactivo puede ser una enzima de restricción sensible a la metilación.
En donde se trata la muestra de ADN genómico de una manera tal que las bases de citosina que están sin metilar en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que es diferente a la citosina en términos de comportamiento de
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situ en la superficie del portaobjetos. La síntesis de oligonucleótidos in situ implica la adición consecutiva de los nucleótidos apropiados a las manchas sobre los microarreglos; las manchas que no reciben un nucleótido se protegen durante cada etapa del proceso usando máscaras físicas o virtuales. Preferiblemente, dichos ácidos nucleicos sintetizados son ácidos nucleicos bloqueados.
En los experimentos de microarreglos de perfiles de expresión, los moldes de ARN utilizados son representativos del perfil de transcripción de las células o tejidos en estudio. Se aísla primero el ARN de las poblaciones de células o tejidos que se van a comparar. Cada muestra de ARN se utiliza a continuación como molde para generar ADNc marcado de forma fluorescente a través de una reacción de transcripción inversa. La marcación fluorescente del ADNc puede realizarse por cualquiera método de marcación directo o indirecto. Durante la marcación directa, se incorporan directamente los nucleótidos modificados de manera fluorescente (por ejemplo, Cy®3-dCTP o Cy®5-dCTP) en el ADNc durante la transcripción inversa. Alternativamente, la marcación indirecta puede lograrse mediante la incorporación de nucleótidos modificados con aminoalilo durante la síntesis de ADNc y luego conjugación de un colorante de éster de Nhidroxisuccinimida (NHS) al ADNc modificado con aminoalilo después de la reacción de transcripción inversa está completa. Alternativamente, la sonda puede estar sin marcar, pero puede ser detectable mediante la unión específica con un ligando que está marcado, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas y métodos adecuados para marcar ligandos (y sondas) son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos que pueden ser incorporados por métodos conocidos (por ejemplo, traducción de la muesca o tratamiento con quinasa).
Otros marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.
Para realizar el análisis de la expresión génica diferencial, se marca el ADNc generado a partir de diferentes muestras de ARN con Cy®3. Se purifica el ADNc marcado resultante para eliminar los nucleótidos no incorporados, el colorante libre y el ARN residual. Después de la purificación, se hibridan las muestras de ADNc con el microarreglo. La rigurosidad de la hibridación se determina por un número de factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, incluyendo la temperatura, fuerza iónica, período de tiempo y concentración de formamida. Estos factores se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda ed., 1989). El microarreglo se escanea después de la hibridación utilizando un escáner fluorescente de microarreglos. La intensidad de la fluorescencia de cada punto indica el nivel de expresión del gen analizado; los puntos brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras que las manchas oscuras indican expresión débil.
Una vez que se obtienen las imágenes, se debe analizar los datos sin procesar. En primer lugar, la fluorescencia de fondo se debe restar de la fluorescencia de cada mancha. Los datos se normalizaron luego con una secuencia de control, tal como los ácidos nucleicos añadidos exógenamente (preferiblemente ARN o ADN), o un panel de genes de mantenimiento que da cuenta de cualquier hibridación no específica, las imperfecciones del arreglo o la variabilidad en la configuración del arreglo, la marcación del ADNc, la hibridación o el lavado. La normalización de los datos permite comparar los resultados de múltiples arreglos.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un kit para uso en el diagnóstico de cáncer en un sujeto de acuerdo con los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho kit: un medio para medir el nivel de transcripción del gen TFAP2E. En una realización preferida los medios para medir el nivel de transcripción comprenden oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción de TFAP2E.
En una realización más preferida, el nivel de transcripción se determina por técnicas seleccionadas del grupo de análisis de transferencias tipo Northern, PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, protección de ARNasa, y microarreglos. En otra realización de la invención, el kit comprende además un medio para obtener una muestra biológica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende además un recipiente que es lo más preferiblemente adecuado para contener los medios para medir el nivel de la transcripción y la muestra biológica del paciente, y lo más preferiblemente comprende además instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit.
En una realización preferida, el kit comprende (a) una pluralidad de oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripción del gen TFAP2E; (b) un recipiente, preferiblemente adecuado para contener los oligonucleótidos o polinucleótidos y una muestra biológica del paciente, que comprende los productos de transcripción en donde los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de la transcripción, (c) medios para detectar la hibridación de (b); y, opcionalmente, (d) instrucciones para el uso y la interpretación de los resultados del kit.
El kit también puede contener otros componentes, tales como regulador de hibridación (donde los oligonucleótidos se utilizan como una sonda) empacados en un recipiente separado. Alternativamente, cuando se utilizan los oligonucleótidos para amplificar una región objetivo, el kit puede contener, empaquetados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reacción optimizado para la extensión del cebador mediada por la polimerasa, tal como PCR. Preferiblemente, dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Se prefiere además que dicho kit contenga
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más, las muestras de cáncer de próstata representan la clase positiva. Para los propósitos de una aplicación diagnóstica, se analizaron los datos utilizando una clase negativo única compuesta por las 51 muestras de biopsia negativa.
Desempeño de marcador único en orina
5 La Tabla 17 muestra la sensibilidad y especificidad de los marcadores analizados por PCR en tiempo real en orina después de masaje de próstata en pacientes con cáncer de próstata y pacientes con biopsia negativa.
La Figura 31 muestra el desempeño del ensayo único para ensayos por PCR en tiempo real HM en orina después de masaje prostático.
Como se muestra en la Tabla 18, para todos los marcadores de metilación analizados la orina fue el analito más
10 sensible. Por lo tanto, se prefiere particularmente para el diagnóstico de cáncer de próstata que el analito sea orina, ya sea evacuada o después de masaje prostático.
La Tabla 19 proporciona el desempeño de los paneles de marcadores de diagnóstico para detectar cáncer de próstata en pacientes con biopsia negativa en orina.
Tabla 1: secuencias de acuerdo con la presente invención
- SEQ ID genómica NO:
- Gen Secuencia metilada convertida con bisulfito (sentido) Secuencia metilada convertida con bisulfito (antisentido) Secuencia no metilada convertida con bisulfito (sentido) Secuencia no metilada convertida con bisulfito (antisentido)
- 1
- Gen TFAP2E 3 4 7 8
15
Tabla 2: Genes de acuerdo con el Ejemplo 1
- SEQ ID genómico NO:
- Gen Abreviación Secuencias convertidas con bisulfito
- Factor de transcripción AP-2 épsilon (activación de la proteína 2 épsilon que se une al reforzador)
- TFAP2E
- *A menos que se indique lo contrario todas las ubicaciones establecidas se refieren a la base de datos Ensembl v39 (Junio de 2006) ** Base de datos Ensembl v31.35d (8 Julio de 2005)
Tabla 3. Secuencias del cebador, bloqueador y sonda de acuerdo con el Ejemplo 1.
- TFAP2E
- 46 51 56 61 66
38
- GSTP1
- 17 94
- TFAP2E
- 22 100
- Paneles cualitativos:
- RASSF2A+HIST1H4J
- 41 98
- Paneles cuantitativos:
- RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)
- 32 100
- QuadSVM (todos los marcadores, sin PSA)
- 39 96
Tabla 16
- Panel del marcador
- % Sens. cáncer de próstata % Espec. saludables + biopsia (-)
- Marcadores únicos cuantitativos:
- RASSF2A
- 37 91
- HIST1H4J
- 26 88
- GSTP1
- 17 95
- TFAP2E
- 22 92
- Paneles cualitativos:
- RASSF2A+HIST1H4J
- 41 88
- Paneles cuantitativos:
- RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)
- 32 92
- QuadSVM (todos los marcadores, sin PSA)
- 39 94
Tabla 17
- Marcador
- Cáncer de próstata vs. Biopsia (-)
- AUC
- Sens. / Espec. Valor p Wilcoxon
- GSTP1
- 0,69 0,23 / 0,95 6e04
- RASSF2A
- 0,66 0,18 /0,95 0,0043
- HIST1H4J
- 0,64 0,28 / 0,95 0,0126
- TFAP2E
- 0,65 0,21 / 0,95 0,0062
- ***PSA
- 0,56 0,22 / 0,95 0,3098
- ***Pruebas para saber si PSA contiene información adicional más allá de la contribución por la indicación de corte > 4
43
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-
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